На сайт 2 этап 1
advertisement
Проект: Создание оптоволоконных нейроинтерфейсов Номер проекта: 14.607.21.0092 Мероприятие ФЦП: 1.3 Руководитель работ: Желтиков Алексей Михайлович Сроки выполнения: 2014-2016 гг. Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 90 млн. руб. Цель проекта, назначение его результатов: Целью проекта является разработка волоконно-оптических нейроинтерфейсов для исследования процессов формирования памяти и обучения живых свободноподвижных животных. В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 21 ноября 2014 года № 14.607.21.0092 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 в период с 1 января по 30 июня 2015 года выполнялись следующие работы: 1 Измерение спектров люминесценции маркерных белков. 2 Исследование спектров автолюминесценции живых тканей и фотостабильности маркерных белков. 3 Исследование влияния мощности излучения накачки на состояние интактности тканей и подбор оптимальной мощности для обеспечения минимальной инвазивности исследований. 4 Исследование путей интегрирования световодных систем в схемы оптической микро- и спектроскопии живого мозга. 5 Исследование возможных стратегий управления количеством нейронов, стимулируемых и регистрируемых нейроинтерфейсом, а также описание способов достижения локальности на уровне одного нейрона. 6 Разработка требований к стендам. 7 Разработка программ и методик испытаний оптоволоконных интерфейсов. 8 Разработка макетов оптоволоконных интерфейсов. 9 Разработка комплектов эскизной конструкторской документации оптоволоконных интерфейсов. 10 Материально-техническое обеспечение проведения экспериментальных работ 11. Подведение итогов этапа и оформление отчетной документации При этом были получены следующие результаты: Проведено измерение спектров люминесценции маркерных белков в мозге взрослых мышей нескольких трансгенных линий мышей: Zif-EGFP, Fos-EGFP, Thy1-Channelrhodopsin-YFP и Brainbow-1.0 (dTomato). Маркерные белки в данных линиях мышей обладали как разными спектральными свойствами, так и различной локализацией в нервной ткани (в зависимости от особенностей трансгенного конструкта). Для каждой из исследованных линий мышей было проведено экспериментальное сравнение спектральной плотности мощности флуоресцентного отклика, собранного в объеме порядка 2·106 мкм3, а также отклика помеченных красителем нейронов. Показано, что проинтегрированная в окне 100 нм спектральная плотность мощности сигнала у мышей линий Zif-EGFP и Thy1-Channelrhodopsin-YFP на два порядка больше чем у мышей линии Fos-EGFP и Brainbow-1.0 (dTomato). Полученные результаты использованы для выбора линий трансгенных мышей: Zif-EGFP и Thy1-Channelrhodopsin-YFP, как линий мышей с наибольшим уровнем отклика в соответствующем спектральном диапазоне для последующего тестирования элементов технических решений разрабатываемых нейроинтерфейсов. Линия Fos-EGFP планируется использовать в дальнейших экспериментах, как образец для оценки нижней границы чувствительности нейроинтерфейса. Проведено измерение спектров автолюминесценции серого вещества в коре и белого вещества в мозолистом теле головного мозга нетрансгенных мышей линии C57Bl/6. Было проведено количественное сравнение уровня мощности автолюминесцентного отклика с измеренном в предыдущем пункте уровнем флуоресцентного отклика серого вещества выбранных линий трансгенных мышей и показано что в зависимости от линии это отношение мощностей лежит в диапазоне от 1 к 1000 до 1 к 10. Установлено, что предельная концентрация флуоресцентно отмеченных нейронов при которой сигнал автолюминесценции не превышает сигнала от маркерного белка при достаточно больших объемах зондирования для мышей линии Fos-EGFP составляет n = 5·10-6 мкм-3; для мышей линии Thy1-Channelrhodopsin-YFP n = 95 мм-3. Таким образом, в случае мышей линии Thy1-Channelrhodopsin-YFP даже один YFP-положительный нейрон обеспечивает достаточную яркость сигнала, превышающую автолюминесцентный фон, при практически любых объемах волоконно-оптического зондирования. В случае же исследования мышей линии Fos-EGFP предполагаемая концентрация EGFPположительных нейронов накладывает требования на конструкцию волоконно-оптического нейроинтерфейса в отношении параметров волокна и области, с которой эффективно собирается флуоресцентный отклик. Были измерены зависимости скорости фотовыгорания флуоресцентных маркерных белков в выбранных линиях трансгенных мышей от мощности накачки, лежащей в диапазоне от 20 до 1000 мкВт в случае волоконнооптического возбуждения и сбора сигнала. Показано, что при фиксированной мощности накачки скорости выгорания маркерных белков EGFP и YFP отличаются незначительно, а скорость выгорания маркерного белка dTomato почти в 3 раза выше. Поэтому для долговременных экспериментов предпочтительнее использовать трансгенные линии мышей Zif-EGFP, FosEGFP и Thy-Channelrhodopsin-YFP с маркерными белками EGFP и YFP. Были исследованы морфологические изменения, которые происходят в ткани мозга после воздействия лазерным излучением с разной мощностью. Было проведено количественное сравнение размера области поражения гиппокампа после воздействия лазерным излучением с мощностью 37 мкВт, 107 мкВт или 1170 мкВт, доставленным с помощью оптоволокна. Было показано, что только максимальная из исследованных мощностей (1170 мкВт) приводит к значимым разрушениям ткани мозга. При этом излучение мощностью 37 мкВт и 107 мкВт не приводило к значимым изменениям в морфологии. Таким образом, были определены мощности излучения, которые в дальнейшем могут быть использованы для разработки протокола и подбора оптимальных режимов долговременных измерений нейронной активности. Основным методом интегрирования световодных систем в схемы однофотонной флуоресцентной микро- и спектроскопии является включение волоконно-оптических компонент в качестве зондов для доставки как излучения накачки, так и собранного люминесцентного отклика. Эффективность и чувствительность метода однофотонной флуоресцентной микро- и спектроскопии с интегрированным волокном в качестве зонда не значительно уступает общепринятым схемами однофотонной флуоресцентной микроскопии. В случае методов двухфотонной флуоресцентной спектроскопии включение волоконных компонент в качестве источника коротких импульсов, а также в качестве зонда обеспечивает чувствительность, практически не уступающую общепринятым схемам двухфотонной флуоресцентной спектроскопии. При этом спектральное разрешение обоих методов определяется характеристиками монохроматора и составляло в проведенных экспериментах 1 нм. Выполнены эксперименты по доставке широкополосных линейно чирпированных импульсов по световодам различной архитектуры для проведения когерентной спектроскопии комбинационного рассеяния с высоким разрешением до 15 см-1, что позволило с точностью не хуже 6% восстанавливать концентрации нескольких жидкостей в смеси. Выявлены ограничения накладываемые на разрешающую способность КАРСспектроскопии и протяженности световодов обусловленные нелинейнооптическими и дисперсионными явлениями. Впервые построены зависимости сигнала ВКР на OH-колебания воды от температуры среды с использованием сверхкоротких импульсов, доставленных по световоду. Получены оценки предельной чувствительности методик КАРС- и ВКРмикроскопии. Продемонстрирована возможность получения изображений тканей мозга лабораторной мыши методикой КАРС-микроскопии с использованием фемтосекундной лазерной системы на базе МС световодов и нелинейнооптических кристаллов. Показано, что интеграция надежных и дешевых лазерных систем на базе кристаллов с ионами Yb с микроструктурированными световодами в качестве эффективных преобразователей излучения позволяет проводить безмаркерные исследование морфологии живых биологических тканей. Были рассмотрены две стратегии управления количеством нейронов, стимулируемых и регистрируемых нейроинтерфейсом. Первая из возможных стратегий управления количеством нейронов заключается в варьировании параметров волокна (радиуса сердцевины и числовой апертуры), для достижения различных эффективных объемов зондирования, что при постоянной плотности клеток будет приводить к разному количеству нейронов, регистрируемых нейроинтерфейсом. Вторая связана с возможностью управления плотностью нейронов мозга, помеченных флуоресцентными белками. В рамках первой стратегии посчитаны эффективные объемы возбуждения и сбора флуоресцентного отклика для ряда волоконных компонент и показано что для МС волокна с диаметром сердцевины dcore = 2 мкм и числовой апертурой NA = 0.6 объем, из которого собирается 80% сигнала составляет V80 = 40 мкм3, что заведомо меньше объема одного нейрона мыши и позволяет адресоваться к одному нейрону при любой их плотности. В рамках второй стратегии экспериментально измерена плотность GFPположительных нейронов в различных структурах мозга трансгенной мыши линии Fos-EGFP и показано, что для исследования одного нейрона в таких структурах как соматосенсорная кора, париетальная кора, слуховая кора и моторная кора можно использовать волокно с dcore = 50 мкм и NA = 0.12, тогда как для таких структур как прелимбическая кора, цингулярная кора, зубчатая фасция гиппокампа и миндалина более оптимальным будет волокно с dcore = 105 мкм и NA = 0.12. Разработаны технические требования к стендам: для оптимизации технических решений оптоволоконных нейроинтерфейсов и проверки достижения требуемых технических параметров, в том числе оптимальной длины световода для доставки излучения и для проверки жизнеспособности животного, а также для проверки наличия изменений в поведении и когнитивных функций животного после вживления нейроинтерфейса по стандартной батареи фенотипических тестов, включающий «открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт» и «ротарод». На основании разработанных технических требований разработаны Технические задания на стенды. Разработаны Программы и методики исследовательских испытаний: макета оптоволоконного нейроинтерфейса для мультиплексной долговременной регистрации нейронной активности по отклику функциональных флуоресцентных маркеров в мозге живых свободноподвижных животных и макета оптоволоконного нейроинтерфейса для фотостимуляции нейронной активности в мозге живых свободноподвижных животных в соответствии с Техническим заданием к Соглашению от « 21 » ноября 2014 г. № 14.607.21.0092.
