На сайт 2 этап 1

реклама
Проект: Создание оптоволоконных нейроинтерфейсов
Номер проекта: 14.607.21.0092
Мероприятие ФЦП: 1.3
Руководитель работ: Желтиков Алексей Михайлович
Сроки выполнения: 2014-2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 90 млн. руб.
Цель проекта, назначение его результатов:
Целью
проекта
является
разработка
волоконно-оптических
нейроинтерфейсов для исследования процессов формирования памяти и
обучения живых свободноподвижных животных.
В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении
субсидии от 21 ноября 2014 года № 14.607.21.0092 с Минобрнауки России в
рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по
приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса
России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 в период с 1 января по 30 июня 2015
года выполнялись следующие работы:
1 Измерение спектров люминесценции маркерных белков.
2 Исследование спектров
автолюминесценции
живых
тканей
и
фотостабильности маркерных белков.
3 Исследование влияния мощности излучения накачки на состояние
интактности тканей и подбор оптимальной мощности для обеспечения
минимальной инвазивности исследований.
4 Исследование путей интегрирования световодных систем в схемы
оптической микро- и спектроскопии живого мозга.
5 Исследование возможных стратегий управления количеством нейронов,
стимулируемых и регистрируемых нейроинтерфейсом, а также описание
способов достижения локальности на уровне одного нейрона.
6 Разработка требований к стендам.
7 Разработка программ и методик испытаний оптоволоконных интерфейсов.
8 Разработка макетов оптоволоконных интерфейсов.
9 Разработка комплектов эскизной конструкторской документации
оптоволоконных интерфейсов.
10 Материально-техническое обеспечение проведения экспериментальных
работ
11. Подведение итогов этапа и оформление отчетной документации
При этом были получены следующие результаты:
Проведено измерение спектров люминесценции маркерных белков в
мозге взрослых мышей нескольких трансгенных линий мышей: Zif-EGFP,
Fos-EGFP, Thy1-Channelrhodopsin-YFP и Brainbow-1.0 (dTomato). Маркерные
белки в данных линиях мышей обладали как разными спектральными
свойствами, так и различной локализацией в нервной ткани (в зависимости
от особенностей трансгенного конструкта). Для каждой из исследованных
линий мышей было проведено экспериментальное сравнение спектральной
плотности мощности флуоресцентного отклика, собранного в объеме
порядка 2·106 мкм3, а также отклика помеченных красителем нейронов.
Показано, что проинтегрированная в окне 100 нм спектральная плотность
мощности сигнала у мышей линий Zif-EGFP и Thy1-Channelrhodopsin-YFP на
два порядка больше чем у мышей линии Fos-EGFP и Brainbow-1.0 (dTomato).
Полученные результаты использованы для выбора линий трансгенных
мышей: Zif-EGFP и Thy1-Channelrhodopsin-YFP, как линий мышей с
наибольшим уровнем отклика в соответствующем спектральном диапазоне
для последующего тестирования элементов технических решений
разрабатываемых нейроинтерфейсов. Линия Fos-EGFP планируется
использовать в дальнейших экспериментах, как образец для оценки нижней
границы чувствительности нейроинтерфейса.
Проведено измерение спектров автолюминесценции серого вещества в
коре и белого вещества в мозолистом теле головного мозга нетрансгенных
мышей линии C57Bl/6. Было проведено количественное сравнение уровня
мощности автолюминесцентного отклика с измеренном в предыдущем
пункте уровнем флуоресцентного отклика серого вещества выбранных линий
трансгенных мышей и показано что в зависимости от линии это отношение
мощностей лежит в диапазоне от 1 к 1000 до 1 к 10. Установлено, что
предельная концентрация флуоресцентно отмеченных нейронов при которой
сигнал автолюминесценции не превышает сигнала от маркерного белка при
достаточно больших объемах зондирования для мышей линии Fos-EGFP
составляет n = 5·10-6 мкм-3; для мышей линии Thy1-Channelrhodopsin-YFP n =
95 мм-3. Таким образом, в случае мышей линии Thy1-Channelrhodopsin-YFP
даже один YFP-положительный нейрон обеспечивает достаточную яркость
сигнала, превышающую автолюминесцентный фон, при практически любых
объемах волоконно-оптического зондирования. В случае же исследования
мышей
линии
Fos-EGFP
предполагаемая
концентрация
EGFPположительных нейронов накладывает требования на конструкцию
волоконно-оптического нейроинтерфейса в отношении параметров волокна и
области, с которой эффективно собирается флуоресцентный отклик.
Были измерены зависимости скорости фотовыгорания флуоресцентных
маркерных белков в выбранных линиях трансгенных мышей от мощности
накачки, лежащей в диапазоне от 20 до 1000 мкВт в случае волоконнооптического возбуждения и сбора сигнала. Показано, что при фиксированной
мощности накачки скорости выгорания маркерных белков EGFP и YFP
отличаются незначительно, а скорость выгорания маркерного белка dTomato
почти в 3 раза выше. Поэтому для долговременных экспериментов
предпочтительнее использовать трансгенные линии мышей Zif-EGFP, FosEGFP и Thy-Channelrhodopsin-YFP с маркерными белками EGFP и YFP.
Были исследованы морфологические изменения, которые происходят в
ткани мозга после воздействия лазерным излучением с разной мощностью.
Было проведено количественное сравнение размера области поражения
гиппокампа после воздействия лазерным излучением с мощностью 37 мкВт,
107 мкВт или 1170 мкВт, доставленным с помощью оптоволокна. Было
показано, что только максимальная из исследованных мощностей (1170
мкВт) приводит к значимым разрушениям ткани мозга. При этом излучение
мощностью 37 мкВт и 107 мкВт не приводило к значимым изменениям в
морфологии. Таким образом, были определены мощности излучения,
которые в дальнейшем могут быть использованы для разработки протокола и
подбора оптимальных режимов долговременных измерений нейронной
активности.
Основным методом интегрирования световодных систем в схемы
однофотонной флуоресцентной микро- и спектроскопии является включение
волоконно-оптических компонент в качестве зондов для доставки как
излучения накачки, так и собранного люминесцентного отклика.
Эффективность и чувствительность метода однофотонной флуоресцентной
микро- и спектроскопии с интегрированным волокном в качестве зонда не
значительно
уступает
общепринятым
схемами
однофотонной
флуоресцентной микроскопии. В случае методов двухфотонной
флуоресцентной спектроскопии включение волоконных компонент в
качестве источника коротких импульсов, а также в качестве зонда
обеспечивает чувствительность, практически не уступающую общепринятым
схемам двухфотонной флуоресцентной спектроскопии. При этом
спектральное разрешение обоих методов определяется характеристиками
монохроматора и составляло в проведенных экспериментах 1 нм.
Выполнены эксперименты по доставке широкополосных линейно
чирпированных импульсов по световодам различной архитектуры для
проведения когерентной спектроскопии комбинационного рассеяния с
высоким разрешением до 15 см-1, что позволило с точностью не хуже 6%
восстанавливать концентрации нескольких жидкостей в смеси. Выявлены
ограничения накладываемые на разрешающую способность КАРСспектроскопии и протяженности световодов обусловленные нелинейнооптическими и дисперсионными явлениями. Впервые построены
зависимости сигнала ВКР на OH-колебания воды от температуры среды с
использованием сверхкоротких импульсов, доставленных по световоду.
Получены оценки предельной чувствительности методик КАРС- и ВКРмикроскопии.
Продемонстрирована возможность получения изображений тканей
мозга лабораторной мыши методикой КАРС-микроскопии с использованием
фемтосекундной лазерной системы на базе МС световодов и нелинейнооптических кристаллов. Показано, что интеграция надежных и дешевых
лазерных
систем
на
базе
кристаллов
с
ионами
Yb
с
микроструктурированными
световодами
в
качестве
эффективных
преобразователей
излучения
позволяет
проводить
безмаркерные
исследование морфологии живых биологических тканей.
Были рассмотрены две стратегии управления количеством нейронов,
стимулируемых и регистрируемых нейроинтерфейсом. Первая из возможных
стратегий управления количеством нейронов заключается в варьировании
параметров волокна (радиуса сердцевины и числовой апертуры), для
достижения различных эффективных объемов зондирования, что при
постоянной плотности клеток будет приводить к разному количеству
нейронов, регистрируемых нейроинтерфейсом. Вторая связана с
возможностью управления плотностью нейронов мозга, помеченных
флуоресцентными белками.
В рамках первой стратегии посчитаны эффективные объемы
возбуждения и сбора флуоресцентного отклика для ряда волоконных
компонент и показано что для МС волокна с диаметром сердцевины dcore =
2 мкм и числовой апертурой NA = 0.6 объем, из которого собирается 80%
сигнала составляет V80 = 40 мкм3, что заведомо меньше объема одного
нейрона мыши и позволяет адресоваться к одному нейрону при любой их
плотности.
В рамках второй стратегии экспериментально измерена плотность GFPположительных нейронов в различных структурах мозга трансгенной мыши
линии Fos-EGFP и показано, что для исследования одного нейрона в таких
структурах как соматосенсорная кора, париетальная кора, слуховая кора и
моторная кора можно использовать волокно с dcore = 50 мкм и NA = 0.12,
тогда как для таких структур как прелимбическая кора, цингулярная кора,
зубчатая фасция гиппокампа и миндалина более оптимальным будет волокно
с dcore = 105 мкм и NA = 0.12.
Разработаны технические требования к стендам: для оптимизации
технических решений оптоволоконных нейроинтерфейсов и проверки
достижения требуемых технических параметров, в том числе оптимальной
длины световода для доставки излучения и для проверки жизнеспособности
животного, а также для проверки наличия изменений в поведении и
когнитивных функций животного после вживления нейроинтерфейса по
стандартной батареи фенотипических тестов, включающий «открытое поле»,
«приподнятый крестообразный лабиринт» и «ротарод». На основании
разработанных технических требований разработаны Технические задания на
стенды.
Разработаны Программы и методики исследовательских испытаний:
макета
оптоволоконного
нейроинтерфейса
для
мультиплексной
долговременной регистрации нейронной активности по отклику
функциональных
флуоресцентных
маркеров
в
мозге
живых
свободноподвижных животных и макета оптоволоконного нейроинтерфейса
для
фотостимуляции
нейронной
активности
в
мозге
живых
свободноподвижных животных в соответствии с Техническим заданием к
Соглашению от « 21 » ноября 2014 г. № 14.607.21.0092.
Скачать