Морфо-фенотипическая характеристика миогенных клеток

ВОЕННАЯМЕЛИЦИНЛ
Научно-практический рецензирyемыfi журнал
Зарегистрирован М1,Iнистерством инфорп,rации Республикт,r Беларусь
Свилетельство о регr{страции No 23 от 17.02.2009 г.
Издается с 2006 года
Na 4
Выходlлт4разавгод
(зз) 2014
октябрь-декабрь
жкE:*i*&}i}.iii:::il,i::i:i]i;];]]]:.l];:]-].:.']
Подписные индексы: в каталоге <Бедпочты>
Адрес для писем:
220006, г. Минск,
ул.
Денинградская, 6, каб.2
Тел.:З28-58-92
E-mail: [email protected]
Издатель:
ИООО .Красико-Принт,,
Свидетельство о государственной
регистрацt1и издателя,
изготовителя, распространителя
печатных изланий Nч 1/1_48
от 21-,Ot.2O1,4.
220ОЗ5, Беларусь,
г.
lVинск, ул. Типлирязева,
д, 65б, поlлл, 742
Подписано в печать
с готовых диапозитивов
7.7о.2о\4
г,
Буплага оФсетная
Гарнитура
Frап klinGoth
icBookC
Печать оФсетная
Формат 60х84|r,
Уел, печ. л. 18,6
Тираж 415 экз.
3аказ Ns 411
отпечатано
в оАо "Красноя звезýэл
22оо7З, г. Минск,
1-й 3агородный пер., З
ДП NчO2ЗЗ0/99
от L4.04.2Ot4
@
r.
Белорусский
госуда рственный медицински й
университет,2ОL4
I
l:]
-
7
4
827 , в
катапоге <Роспечати
>
-
36 472
Учредитель
Учреждение образования
"Белорусски й госуАарствен ны й меАи ци нски й ун и верситетu
22О116,
г.
Минск, пр-т !зержинского, 8З
http://www,bsmu.by
Главный редактор
С.Н.Шнитко, д-р мед. наук, проФ., полковник м/с
3ам. главного редактора
А.А.Бова, д-р мед. наук, проФ.
Редакционная колдегия:
В. Б. Дишаков (г. Минск), председатель редколлегии, попковник м/с,
В. Н. Бордаков (г. Минск), д-р мед. наук (секретарь редколлегии), полковник м/с,
С. А, Алексеев (г. Минск), д-р мед. наук, проф.,
В. В, Аничкин (г. Гомель), д-р мед. наук, проф.,
В. Г. Богдан (г. Минск), канд. мед. наук, доц., полковник м/с,
Д. Н. Бисенков (г. Санкт-Петербург), д-р мед. наук, проф.,
П. Г. Брюсов (г, Ir4ocKBa), д-р мед. наук, проф.,
Ю. М. Гаин (г. Минск), д-р мед. наук, проф.,
Ю. И. Галлингер (г, iV'locKBa), д-р мед. наук, проф.,
П. В. Гарепик (г. Гродно), д-р мед. наук, проф,,
И. И. Гунько (г. Минск), д-р мед. наук, проф.,
И. Н. Щенисов (г. Москва), д-р мед. наук, проф., академик PAMIH,
В. И. Щорошевич (г. lVIинск), канд. мед. наук, доц,.
С. В. Жаворонок (г. Мlинск), первый проректор БГМУ, проф.,
В. В. Жарков (г. Минск), д-р мед. наук, проф.,
К. В, Жданов (г. Санкт-Петербург), д-р.мед. наук, проф., полковникм/с
С, А, Жидков (г, [Vlинск), д-р. мед. наук, проф.,
О. К. Кулага (г. l\4инск), д-р мед. наук, проф,,
Х. Х. Давинский (г. l\4инск). д-р мед. наук, проФ.,
Ю, В. Добзин (г. Санкт-Петербург), д-р мед. наук, проф,, академик РАМН,
И. Б. Максимов (г. Москва), д-р мед. наук, проф., генерал-майор м/с,
М. И. lVlихайлов (г, l\4ocKBa), д-р мед. наук, проф., член-корр. РАМН,
Т. В. Мохорт (г, lVIинск), д-р мед, наук, проф.,
Н. Н. Пилипцевич (г. Минск), д-р мед. наук, проФ.,
А. В. Прохоров (г. lt4инск), д-р N4ед. наук, проф.,
lVL И. Римжа (г. Минск), д-р N/ед. наук, проФ.,
В, В. Руденок (г. Минск), д-р мед. наук, проф.,
Г. П. Рычагов (г. Минск), д-р мед. наук, проф.,
С. Ф. Савицкий (г, Минск), попковник м/с,
А, В. Сикорский (г. Минск), ректор БГМУ,
А. Н. Стожаров (г. IИинск), д-р биоп. наук, проф.,
Е. Д. Трисветова (г. Мlинск), д-р мед. наук, проФ.,
К. Р. Юсиф-заде (г. Баку), д-р мед. наук
Редактор Д. И. Жук
Z__
HoBbLe mехноло?Llч в меёuцuне
Оригинальные научные пубдикации
Жii:ll
функциональной ооновой каtttбиального резерва тканевой системы скелетной мышцы, После серии митозов
в посттравматическоN/l
рабдоплиогенезе
из них формиру-
ется популяция миобластов, которые, сливаясь, образуют новые мышечные симпласты [В], Учитывая высокиЙ
пролиферативный потенциал, способность к экспансии
iп vitro и тканекоммитированность миогенных клетокпредшественников (МКП), разработка методов их транс-
плантации
в
целях восстановления структурно-функци-
ональной целостности мышечной ткани является одним
из перспективных направлений тканевой инженерии [2, 7].
При этом ключевыми вопросами, возникающиNли при разработке технологий клеточной трансплантации, являются
выбор источника ауто/аллогенных клеток и степени их
диФференцированности в миогенном направлении, а так-
il
же определение условий получения. культивирования и наращивания клеточных культур iп vitro |З, 4].
Цель исследования: оценить морфо-фенотипические
особенности
и плиогенный
потенциал
hлеток-предшеот-
венников поперечнополосатой мышечной ткани человека
и лабораторных крыс, а также определить возможность
экспансии клеток iл yitro с целью их дальнейшего использования в клинической практике.
Материалы и методьi
Забор фрагментов поперечнополосатой
плышечной
ткани человека (musculus cremaster или musculus obliquus
externus abdominis) ооуществляли после получения информированного согласия у 5 пациентов о паховой грыжей
в ходе выполнения хирургического вмешательства - герниотомии и пластики пахового канала по Дихтенштейну.
Изолированную ткань объемом 0,В-1,0 смЗ механически
измельчали на фрагменты разN,lером 1,О-1,2 мм2 и подвергали ферплентативному расщеплению в растворе 0,З%
коллагеназы (Sigma, Германия) и О,6% диспазы (Sigma,
Германия) в течение 2-х часов при З7 ОС. Выделенную суспензию клеток в концентрации 2,5-5х107спл2 эксплантировали на адгезивный пластик, дополнительно покрытый
2% желатином и культивировали в среде DI\4EN4 с низким
содержаниеN/ глюкозы (Gibco, Ве,ликобритания), содержащей 75-2О% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС,
HyClone, Великобритания), 2 мМ L-глутамина, 50 ед/мл
бензилпенициллина-натрия, 5О плкг/мл стрептомицина сульфата и 1О0 плкг/мл неоп,,1ицина сульфата (Gibco, Вепикобритания). Замену среды пlэоводили каждые 72-96 часов. Для
снятия клеток с культурального пластика при пересеве
на 1 и 2 пассажи использовали О,25% раствор трипси-
*
на/ЭЩТА (Gibco, Великобритания). Для активации процесса
миогенной дифференцировки и форплирования мышечных
трубочек ЭТС в питательной среде заменяли на лошадиную
сыворотку и понижали ее уровень до 2%.
МКП лабораторных крыс выделяли аналогичным способом из бедренных мышц (п = 8).
Мониторинг клеточного роста и диФФеренцировки осуществляли с использованиеN,4 универсального инвертированного микроскопа Carl Zeiss Axiovert 200 (Германия).
Экспрессию миогенных маркеров в полученных культурах МКП оценивали методом иммуноцитохимии с использованиеN/,l моноклональных антител к capKoMepНolvy
G-актинину (разведение 1:1ОО, Sigma, Германия), гладкомышечному 0-актину (о Sl\4A, 1:1О, R&D Systems, Канада),
тяжелым цепям миозина (1:10, R&D Systems, Канада), колпагену lll типа (1:5О, R&D Systems, Канада). ffпя визуапизации образовавшихся комплексов антиген-антитело использовали
систеп,lу иI\лмунопероксидазного
окрашивания
LSAB+System,HRP (Dako, США). Ядра клеток окрашивали
гематоксилином по стандартной методике. Экспрессию
маркеров оценивали с использованием инвертированного микроскопа Carl Zeiss Axiovert 200 (Герплания)"
Результаты и обсух<дение
Полученные первичные культуры МКП человека и лабораторных животных, отличались морфологической гетерогенностью и включали два типа клеток: п/]елкие клетки
округпой морфологии с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, небольшим ядроNл и конденсированным
интерфазным хроматином, что характерно для клеток-сателлитов, и биполярные веретеновидные более дифференцированные миогенные предшественники (рис. 1). Сред-
ний период прикрепления клеток ооставил2-3 дня. Щополнительное покрытие культурального пластика желатином
увеличивало концентрацию адгезивных клеток в 4-5 раз.
Купьтуры lVlКП, попученные из тканей животных, достигапи конфлюэнтности к концу 2-й недели культивирования,
в отличие от культур клеток из поперечнополосатых мышц
человека, которые при аналогичной концентрации посева
образовывали монослой лишь на 4-6 неделе. Медленные
темпы роста МlКП человека обусловливают необходимость
дополнительной активации клеток за счет включения
в питательную среду активаторов клеточного деления
(факторов роста), которые в условиях iп vivo при повреждении мышечной ткани вызывают пролиферацию миосателлитов, находящихся в митотически неактивной
фазе Go [4,81.
Рис. 1. Морфопогия первичных культур МКП поперечнополосатой мышечной ткани на желатиновом покрытии лластика, увеличение 4ОО.
А МКП человека, 4-е сутки культивирования. Б l\4КП крыс, 6-е сутки культивирования
в1
I
6.
Зак,41 l
ft
Оригинадьные наулные публикации
1;'iiýffiЮ
HoBbrc mехнолоzuu в меёuцuне
Рис. 2. Морфология культур 1-го пассажа l\4КП поперечнополосатой мышечной ткани человека, 4 суlки культивирования. Д - увеличение 400. Б - увеличение 100
При пересеве МКП на 1-2 пассаже NilорФологическая
гетерогенность культур сохранялась за счеI ассиметричного деления миосателлитов, в результате которого происхо-
дило восполнение собственного пула клеток и образование более диФФеренцированных миогенных клеток-предшественников (рис. 2). С одной стороны, ассиметричное
деление клеток-сателлитов дает возможность долгосрочноЙ пропиферации МКП и создает благоприятные условия
для экспансии культур и наращивания клеточной биоплассы. В тоже время, ассиметричное деление может стать
барьером для клеточного роста в культуре. В результате
продолжающего деления транзиторных дочерних клеток
может происходить нарастание числа неделящихся клеток
без соразмерного увеличения числа миосателлитов [5].
Коплмитированность полученных клеток в миогенном
направлении подтверждалась их дифференцировкой в миобласты и способностью к слиянию с образованием многоядерных миотуб,
В первичных культурах l\4КП пабораторных животных
через 8-12 дней купьтивирования в присутствии L5-2Oo/o
ЭТС отмечалось спонтанное слияние одноядерных шлиобластов и первые признаки формирования двуядерных клеток,
а впоследствии I\лногоядерных l\ilышечных миотуб (рис. З).
Процесс диФФеренцировки в миогенноN,l направлении
значительно усиливался при снижении процента ЭТС до 2О/о
и замены ее на лошадиную сыворотку. В культурах МКП
поперечнополосатых мышц человека спонтанноЙ диФФеренцировки не набпюдапось. Слияние клеток активировалось лишь при соответствующем изменении концентра-
ции сыворотки в среде через 4-5 дней культивирования,
Миогенный потенциал клеток сохранялся и в последующих
пассажах (1-2 пассаж).
Большинство исследователей отмечают, что для запу-
ска миодиФФеренцировки клеток-предшественников
не-
обходимо изменение условий культивирования (снижение
уровня сывороточных белков, использование специально-
го покрытия культурального пластика и др.) и/или добавление индукторов слияния кпеток (ионофоры кальция и др.).
Так как N/иодифФеренцировка клеток * Са2--зависимый
процесс, присутствие этих ионов в составе культурапьной
среды Dl\4EM обуспавливает возможность спонтанного
слияния клеток, что необходимо учитывать при разработке
методов экспансии l\4КП для получения большой биомассы клеток, Кроме того, на дифференцировочные свойства
lVlКП влияет и контакт с компонентап/tи экстрацеллюлярного матрикса. Нами показано, что частота спонтанного
и индуцированного (в среде с 2% пошадиной сыворотки)
образования миотуб в первичной культуре клеток на желатиновом покрытии была выше, чем на пластике.
На рисунке 4 представлен цитологический препарат l\4ПК, культивируеплых в дифференцировочной среде,
окрашенный гематоксилином. По мере форплирования сократительного аппарата многочисленные ядра из центра
трубочек смещались и выстраивались по периферии образованной сlруктуры (рис, 4). Следует отметить, что происходило окрашивание гематоксилином не только ядер, но
и цитоплазN/ы миотуб, которое пложет быть обусловлено
присутствием РНКlДНК-содержащих структур, ýпя мы-
Рис. 3. Спонтанное и индуцированное (в присутствии 2% пошадиной сыворотки) образование миотуб, ув. 100. д _ 15-е сутки культивирования, спонтанное с^ияние плиоблаотов. Б - 18-е сутки культивирования, образование мышечных трубочек в дифференцировочной среде
в2
I
I
*op'"'нaльньIeHаyчньIепyбликации::]1#ffiЮHoвьrcmехнoлo?l,luвмeduцuнe
тельность жизни клеток необходимо присутствие естественных факторов микроокружения, таких как сигналы
ростовых Факторов, контакты с компонентами экстрацеллюлярного лчlатрикса, межклеточное взаимодействие и др,
4. Полученные результаты исследования, касающиеся
морфо-фенотипических и дифФеренцировочных особенностей миогенных клеток-предшественников, могут быть
использованы в качестве альтернативы другим типам
клеток, используемым для регенерации мышечной ткани
(мезенхимальные стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки), с целью выбора наиболее перспективного
варианта клеток и оптимизации усповий их hультивирования и последующего клинического использования.
Дитература
1. ОАинцова. И. А. Проблепла камбиальности скелетной ткани
в регенерационном гистогенезе / И, Л. Oдинцова // Вопросы мор-
Фологии XXl века.
- 2009. -
Nq 2.
2, Characterization of human myoblast cultures for t;SSUe engineering / J. Stern-Straete |et аl.] // lnternational JoUrna l of MolecU lar
I\4edicine. 2008. - Vol. 21. - Р 49-56.
З, LaWSon, l\4. А. Differentiation of myoblaStS in Serum-free media: effects of modified media are сеll line-Specific / l\4. А. Lawson,
Р. Р. Purslow// Cells tissues organs. - 200О" - Vol. 167, - Р. 1З0-1З7,
4. Lопg Term Se]f-Renewal of Postnatal MUScle derived Stem celis /
в. N,4. Deasy |ela|,]// lvвс, _ 2005. _ Vol. 16. _ N9 7. - р зз2з_зЗзз.
5. Molecular Signature of qUiescent Satellite cellS in adult Ske-
letal muscle / S. Fukada |ela1.1 // Stem cells. - 2ООТ, Vol. 25. -
р.244а 2459.
6. Regu/atlon and Function of Skeletal Muscle Stem cells /
М. cerletti Lеit a1.1 // Cold spring harbor symposia оп quantitative
biology. 2008. - Vol. LXX|li. - Р.З77-З22.
7. Relaix, F. Satellite cells аrе essential for skeletal muscle
regeneration: the celi on the edge retUrnS centre Stage / F. RelaiX,
Р. S. Zammit // Development. - 2О12. - Vol. 1З9, , Р. 2845-2856,
F.
8. Yiп, Н. Satellite cells and the muScle Stem сеll niche/ Н. Yin,
Price, l\4. А. Rudnicki// Physiol. Rev. - 2О7З. - Vol. 9З. - Р.2З-6Т,
- P.147-L52.
П
осту
п и
ла 16.О6. 2О14
г,
[. Беззубuк', В. А. ЧеканЗ
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ НА КОСТНУЮ ТКАНЬ
НИЗКОЧАСТОТНОГО УЛЬТРАЗВУКА И НИЗКОЧАСТОТНОГО
С. В. Иваlценко1, А. А. Осmаповuчl, С.
ИМ ПУЛ
Ь
СНОГО УЛ ЬТРАФ ОНО
УО
<
Ф
ОРЕЗА АСКОРБИ НОВ
О
Й КИСПО ТЫ
кuй 2 о су ё ар сm в еннь lй м е а uцuн с кuй у нu в ер с um
ГУ РНПЦ невропоzuu u нейрохuрурзuu МЗ РБ, Мuнск2,
Г НУ Ин сmumу m п о р о u,tKo в о й м е m а ппу р е uu, MllH скЗ
Б е ло р у
сс
еm
>>1,
Леченuе l1ацuенmов с зубочелюсmньlмu аномалuялlll u ёеформацuямu в сформuрованном прuкусе заmруёнено,
mак как косmная mкань в обласmч пеРемеч.\аемьLх зубов пересmраuваеmся меDпенно. !ля повьtluенuя эффекmuвНосmu оРmоёонmuческоZо леченuя взрослL,Lх пацuенmов разрабоmаньl разлuчньlе ллеmоёьL локально?о снuженuя
ПЛОmНОСmu КосmноЙ mканu u повьlцlенuя её пласmччносmu, Но не все онч уdовлеmворяюm спецuалuсmов u паL\LleHlпoB в полном объёмс в сuлу разпччньLх прччuн. Авmорамu преdсmавлено сосmоянuе косmноЙ mканч после
возёейсmвuя нuзкочасmоmнlllм uмпульсным ч моёулuрованньtм улLlmразвуком, а mак же нuзкочасmопlньLjrl uмПУЛtэСНЬLл4
ульmРафонофоРезом
аскоРбuновоЙ кuслопtьL, Прuвеёена сравнumельная оценка резупьmаmов опыmов,
Кпючевые спова: uл,tпульсньLй нuзкочасlпопlньLй ульmразвук, моёулtlрованньtй нLlзкочасmоmньtй ульmраз-
вук, ульmрафонофорез, аскорбuновая кuслопlа, косmная mкань.
S. V. Ivаshепkо, А. Д, Ostapovich, S. D, Bezzubik, V, А. Сhеkап
COMPARISON ОF ТНЕ INFLUENCE ОF LOW-FREQUENCY ULTRASOUI,{D
AND LOW-FREQUENCY PULSED PHONOPHORESIS ОF ASCORBIC ACID ON BONE TISSUE
Тrеаtmепt oJ patieпts with mаlоосlusiоп iп the formed bite is ltlпg апd dfficult because the Ьопе аrоuпd teeth rebuilt
very slowly. Various methods of local decreasiпg of Ьопе deпsity апd iпсrеаsiпg of its plasticity were developed to iпprtlt,e
the фсiепсу of orthodoпtic treatmeпt of adult patieпts. But поt all of this methods satisfy professioпals апd patiertts
because of differeпt rеаsопs, The structure апd сhапgеs of the Ьопе tissue arter afrect Ьу low frеquепсу pulsed ultrasotmd,
Ьу low frеquепсу rпodulated ultrаsоuпd апd Ьу low frесluепсу pulsed phoпophoresis of ascorbic acid is preseпted iп article.
The соmраrisоп of this a.ffects is givеп.
Кеу words: Pulsed low frеquепсу ultrаsоuпd, modulated low frеquепсу ultrasouпd, phoпophoresis, ascorbic clcid, Ьопе tissue.
из актуальных пробпем современной стоNла\ч.fтологии является лечение пациентов с зубочелюст-
/')аноИ
ными аномалия\ли и деформациями в сформированноп/]
прикусе. так как распространённость их остаётся высокой
[9]. Своевременно не устранённые зубочепюстные аномалии с возрастом усугубляются, способствуют развитию
заболеваний периодонта и височно-нижнечелюстного сустава. Вторичные деформации зубных рядов затрудняют
84
__l
протетические мероприятия. Дечение таких пациентов
длительное и часто не приводит к ожидаемым результатам.
Это связано с тем, что с возрастом в организме ослабевают обменные процессы, в кости увеличивается содержание кальция и фосфора, из-за чего она становится более
плотной и менее пластичной, медленно перестраивается.
Поэтому, для оптимизации ортодонтического лечения пациентов с зубочелюстными аномалиями и деформациями
_l