Модель коротких теломер и истощения стволовых клеток для

Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
Cell
Модель коротких теломер и истощения
стволовых клеток для мышечной дистрофии
Дюшенна у мышей mdx/mTR
Алессандра Сакко (Alessandra Sacco),1,4,5 Фотейни Муркиоти (Foteini Mourkioti),1,4 Роза Тран (Rose Tran),1 Джинкук Чой (Jinkuk Choi),2 Майкл
Ллевеллин (Michael Llewellyn),3 Пегги Крафт (Peggy Kraft),1 Марина Шкрели (Marina Shkreli),2 Скотт Делп (Scott Delp),3 Джейсон Г. Померанц (Jason H.
Pomerantz),1,6,* Стивен Е. Артанди (Steven E. Artandi)2 и Хелен М. Блау (Helen M. Blau)1,*
1
Лаборатория биологии стволовых клеток Бакстер (Baxter Laboratory for Stem Cell Biology), Департамент микробиологии и иммунологии (Department of
Microbiology and Immunology), Институт биологии стволовых клеток и регенеративной медицины (Institute for Stem Cell Biology and Regenerative
Medicine)
2
Департамент медицины (Department of Medicine), Программа биологии рака (Cancer Biology Program) Медицинской школы Стенфордского
университета (Stanford University School of Medicine), Стэнфорд, Калифорния 94305, США (Stanford, CA 94305, USA)
3
Программа BioX (BioX Program), Центр биомедицинской инженерии и науки Джеймса Г. Кларка (James H. Clark Center for Biomedical Engineering and
Science), Стенфордский университет, Калифорния 94305, США (Stanford University, CA 94305, USA)
4
Эти авторы внесли равный вклад в настоящую работу.
5
Текущий адрес: Программа изучения развития и регенерации мышц, Стенфордский центр исследования детского здоровья, Медицинский
исследовательский институт Sanford-Burnham, 10901 Норс Торрей Пайнс Роуд, Ла Хойя, Калифорния 92037, США (Muscle Development and
Regeneration Program, Sanford Children’s Health Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 10901 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA
92037, USA)
6
Текущий адрес: Департаменты хирургии и челюстно-лицевых заболеваний, Отделение пластической и реконструктивной хирургии, Программа
изучения биологии черепа, лица и мезенхимальных тканей, Центр изучения общих вопросов регенеративной медицины Эли и Эдит, Университет
Калифорнии в Сан-Франциско, Сан-Франциско, Калифорния 94143, США (Departments of Surgery and Orofacial Sciences, Division of Plastic and
Reconstructive Surgery, Craniofacial and Mesenchymal Biology Program, Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine, University of California, San
Francisco, San Francisco, CA 94143, USA)
*Корреспонденцию направлять: [email protected] (H.M.B.), [email protected] (J.H.P.)
DOI 10.1016/j.cell.2010.11.039
КРАТКИЙ ОБЗОР
При мышечной дистрофии Дюшенна (Duchenne muscular dystrophy; DMD), мутации дистрофина приводят к
прогрессирующей дегенерации скелетных мышц со смертельным исходом. По неизвестным причинам, дефицит
дистрофина не приводит к повторению картины DMD у мышей (mdx), имеющих легкие поражения скелетных мышц и
мощную способность к регенерации. Мы предположили, что прогрессирование DMD у человека является результатом
потери функционирующих мышечных стволовых клеток (muscle stem cells; MuSC), и легкое фенотипическое проявление
мутации у мышей mdx является результатом более значительного резерва MuSC, обеспечиваемого более длинными
теломерами. По нашим данным, у мышей mdx, у которых отсутствует РНК компонент теломеразы(mdx/mTR), в
мышечных клетках наблюдается укорочение теломер, и тяжелая мышечная дистрофия, которая с возрастом прогрессивно
ухудшается. Тяжесть мышечной атрофии коррелирует со снижением регенераторной способности MuSC, а
гистологическая картина улучшается после трансплантации MuSC мышей дикого типа. Эти данные показывают, что
прогрессирование DMD, по крайней мере, частично, является результатом неспособности соматических клеток MuSC
поддерживать цикл повреждения-восстановления, инициируемый дефицитом дистрофина. Важная роль MuSC имеет
лечебное применение при DMD.
ВВЕДЕНИЕ
Мышечная дистрофия Дюшенна (Duchenne muscular dystrophy; DMD) является истощающим дегенеративным заболеванием мышц, вызванным
мутацией дистрофина (Hoffman et al., 1987), белка цитоскелета, который необходим для стабильности мембраны многоядерных мышечных волокон в
скелетной мышце (Durbeej и Campbell, 2002). Отсутствие дистрофина вызывает повышенную ломкость сарколеммы, приводя к повреждению при
наличии даже легкой нагрузки (Petrof et al., 1993). Пациенты с DMD страдают от прогрессирующей утраты мышечных функций, приводящих к
параличу и смерти на третьем десятилетии жизни (Emery, 2002). В нормальном состоянии скелетная мышца является относительно статичной тканью,
по сравнению с быстро обновляющимися тканями, такими как кровь и большинство эпителиальных тканей. Тем не менее, скелетная мышца обладает
значительной способностью к регенерации из-за наличия стволовых мышечных клеток взрослых (muscle stem cells; MuSC), известных также как
миосателлитоциты, которые играют главную роль при росте и репарации мышц в постнатальном периоде (Collins et al., 2005; Cornelison et al., 2004;
Kuang et al., 2007; Montarras et al., 2005; Sacco et al., 2008). При DMD непрерывное рецидивирующее повреждение мышечных волокон приводит к
постоянной необходимости в регенерации. В итоге мышечная ткань замещается фиброзной, отложениями солей кальция и скоплениями жира, что
совпадает с появлением клинических проявлений. К настоящему моменту причина наблюдаемых легких эффектов у мышей и смертельных – у человека
при одном и том же генетическом дефекте, отсутствии дистрофина, остается неизвестной. Более того, патофизиологическая причина неэффективного
процесса восстановления мышц у пациентов с DMD, несмотря на явную этиологическую роль дефицита дистрофина, непонятна.
Более двух десятков лет назад, до клонирования гена DMD, мы получили данные, которые позволяют сделать вывод, что мышечные клетки у
пациентов с DMD обладают уменьшенной регенераторной способностью в результате репликативного старения (Blau et al., 1983; Webster и Blau, 1990).
Продемонстрирован тяжелый дефицит пролиферации миобластов людей с DMD in vitro, который становится более заметным по мере старения
пациента, приводя к содержанию миобластов в одном грамме мышечной ткани в 5% от нормы, а пролиферативный потенциал остатка миобластов
сильно нарушен. Однако, этот дефект пролиферации не удавалось отделить от X хромосомы в исследованиях клонов миобластов двойных
гетерозиготных носителей двух X-сцепленных локусов, DMD и средиземноморского гистологически выявляемого термолабильного варианта глюкозо6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД), поэтому он зависел от дополнительных факторов (Webster et al., 1986).
1 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Cell
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
Недавние исследования подтвердили и расширили первоначально полученные данные о том, что миобласты при DMD обладают нарушенным
репликативным потенциалом, и позволяют сделать вывод, что укорочение теломер является общим признаком мышечных клеток при дистрофии при
увеличении возраста пациента. Оно коррелирует с ограничением их способности регенерировать ткани при DMD после трансплантации (Mouly et al.,
2005). Действительно, было отмечено в 14 раз большее укорочение теломер у пациентов с DMD по сравнению со здоровыми лицами (Decary et al.,
2000). Теломеры – это повторы ДНК, которые защищают концы хромосом от неправильной рекомбинации, химеризации и деградации, приводящих к
нестабильности генома (Palm и de Lange, 2008). Длина теломер поддерживается с помощью фермента теломеразы, который добавляет теломерные
повторы к концам хромосомы, обеспечивая их надлежащую репликацию (Greider и Blackburn, 1985). Пролиферация клеток в условиях недостаточной
активности теломеразы приводит к прогрессирующему укорочению теломеры, приводя в конце концов к репликативному старению по мере того, как
нарушается защита концов хромосом в субпопуляции клеток с короткими теломерами (Rodier et al., 2005; Sherr и DePinho, 2000). Укорочение теломер
сопровождает также старение митотически активных быстро обновляющихся тканей человека, включая кровь, ткань печени, кожи, яичек и почек
(Aikataetal., 2000; Friedrich et al., 2000; Lindsey et al., 1991;Takuboetal., 2000; Vaziri et al., 1993). Напротив, анализ теломер в скелетных мышцах во время
старения с помощью анализов, проводимых на цельной ткани, выявляет лишь умеренное укорочение (Decary et al., 1997; Renault et al., 2002),
предположительно, отражающее низкую скорость пролиферации миогенных клеток-предшественников и обновления мышечной ткани во время
нормального старения. В соответствии с этими данными исследования нокаутированных по теломеразе мышей выявляет наличие коротких теломер с
нарушенной функцией, которое глубоко нарушает функцию клеток-предшественников в активно обновляющихся тканях. Это приводит к атрофии и
снижению регенераторного потенциала, тогда как более стабильные ткани с низким обновлением, такие как мышцы, не поражаются (Allsopp et al.,
2003; Lee et al., 1998; Rudolph et al., 1999).
Большой проблемой, замедляющей разработку эффективных методов лечения DMD, было отсутствие животной модели, которая хорошо повторяла бы
прогрессирование заболевания у человека. Наиболее широко используемая животная модель DMD, мыши mdx, демонстрируют лишь легкие
фенотипические проявления дистрофии, хотя, как и у пациентов с DMD, у них не хватает функционально активного дистрофина из-за точечной
мутации в гене дистрофина (Bulfield et al., 1984; Hoffman et al., 1987; Ryder-Cook et al., 1988). Мышцы мышей с mdx, как и мышцы пациентов с DMD,
проходят повторяющиеся циклы дегенерации и регенерации, однако, по неизвестным причинам, у мышей наблюдается лишь преходящая мышечная
слабость, и никогда не развивается глубокая утрата мышечной силы и смертельный исход, наблюдаемые у пациентов с DMD (DiMario et al., 1991;
Straub et al., 1997). В настоящей работе мы проверили гипотезу о том, что видоспецифические различия длины теломер играют роль в различии
способности к пролиферации мышечных клеток, полученных у пациентов с DMD и мышей mdx, и приводят к различиям прогрессирования
заболевания у этих двух видов. Люди обладают относительно короткими теломерами длиной ~5-15 килобаз, по сравненю с инбредными штаммами
лабораторных мышей, которые обычно имеют теломеры длиной > 40 килобаз (Kipling и Cooke, 1990). Такой значительный резерв теломер может
наделять MuSC мышей более длительно сохраняющейся способностью к регенерации и легкими мышечными фенотипическими проявлениями,
несмотря на дефицит дистрофина. В подтверждение этой гипотезы, недостаточное фенотипическое проявление заболевания в мышиных моделях
других человеческих заболеваний, таких как синдром Вернера и синдром атаксии-телеангиоэктазии, было связано с видоспецифическими различиями
длины теломер, поскольку, когда животных с этими моделями скрещивали с мышами с отсутствием теломеразной активности, заболевания
становились явными (Chang et al., 2004; Wong et al., 2003).
В данной работе мы создали мышей mdx, у которых отсутствовала активность теломеразы, и показал, что дефицит дистрофина в сочетании с
дисфункцией теломер хорошо повторяет тяжелые фенотипические характеристики мышечной дистрофии человека, включая глубокую потерю
мышечной силы, плохую выносливость в нагрузочной пробе на бегущей дорожке, повышение уровня креатинкиназы (КК) сыворотки, развитие
фиброза и накопление отложений солей кальция в тканях скелетных мышц, кифоз и укорочение продолжительности жизни. Мы показали, что тяжесть
заболевания прогрессивно нарастает с возрастом. Более того, MuSC демонстрируют тяжелый дефицит пролиферативной активности как in vitro, так in
vivo, неспособность отвечать на повреждение ткани, а также заметно сниженные энграфтмент и участие в восстановлении мышц. Трансплантация
MuSC от мышей дикого типа мышам mdx с отсутствием активности теломеразы облегчала гистологические проявления фенотипа дистрофии. В
совокупности эти результаты указывают, что комбинация структурного дефекта в виде дефицита дистрофина, который ведет к мышечной дегенерации,
в совокупности с прогрессирующим истощением функционирующих MuSC приводит к развитию фенотипа дистрофии. Эти данные подтверждают
гипотезу о том, что у людей DMD инициируется генетическим дефектом, но, как позволяют предположить наши предыдущие результаты (Blau et al.,
1983; Webster et al., 1986), развитие прогрессирования обусловлено истощением клеток, способных к регенерации.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Мы создали мышей с дистрофией и отсутствием теломеразной активности, скрещивая самок мышей C57Bl6 mdx, гомозиготных по мутации
дистрофина (Im et al., 1996) с мышами C57Bl6, гетерозиготными по РНК компоненту теломеразы Terc (mTR) (Blasco et al., 1997) (Рисунок 1A).
Полученных мышей mdx/mTRHet в дальнейшем скрещивали, чтобы получить мышей mdx с двойной мутацией, с отсутствием дистрофина и
теломеразной активности (обозначаемых в дальнейшем как первое поколение mdx/mTRG1). Мышей mdx/mTRG1, в свою очередь, скрещивали между
собой, чтобы получить второе поколение мышей mdx/mTRG2. Такая стратегия позволила получить ту же самую линию мышей с дистрофией, что и
линия без теломеразы, что является критически важным, поскольку длина теломер у различных линий мышей различается (Hemann et al., 2001).
Дополнительно проводили анализ фенотипа дистрофии у мышей с различными длинами теломер, по мере нарастания их укорочения у мышей mTR в
последовательных поколениях.
Тяжелая мышечная дистрофия у мышей mdx/mTRG2
Для оценки тяжести мышечной дистрофии мы провели три необходимых контрольных эксперимента. Мы сравнивали мышей mdx/mTRG1 и мышей
mdx/ mTRG2 с мышами mdx/mTRHet, поскольку у них отсутствовал дистрофин и одна копия гена Terc, что обеспечивало самый жесткий контроль
однородности линии. В качестве второго контроля мы проводили анализ мышей mTRG2, которые являлись поколением мышей с соответствующим
дефицитом теломеразы, однако несли ген дистрофина дикого типа, что было необходимо для исключения возможности возникновения фенотипа в
результате одного только дефицита теломеразы. И наконец, в наших исследованиях мы ограничивались только самцами мышей, поскольку данное
заболевание является сцепленным с Х-хромосомой, и половые различия могут повлиять на результат.
Мы впервые изучили уровни креатинкиназы (КК), общепризнанного индикатора поражения скелетных мышц у мышей, который является
диагностическим показателем DMD.
2 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
CK serum levels (IU/L)
Treadmill time to exhaustion (min)
Evans Blue positive area (%)
Average specific twitch force (kN/m2)
Average specific twitch force (kN/m2)
Centrally nucleated myofibers (%)
WT
Cell
Уровни КК сыворотки (МЕ/л)
Время до наступления истощения на бегущей дорожке (мин)
Площадь позитивного окрашивания красителем Эванс синий (%)
Средняя специфическая сила рывка (кН/м2)
Средняя специфическая сила рывка (кН/м2)
Волокна с центрально расположенными ядрами (%)
Мыши дикого типа
Рисунок 1. Доказательство тяжелой мышечной дистрофии у мышей mdx/mTRG2
(A) Схема скрещивания мышей.
(B) Уровни КК в сыворотке у 8-недельных самцов. У животных mdx/mTRG2 наблюдалось заметное повышение уровня КК. Данные представлены в виде
среднего значения ± СОС (стандартная ошибка среднего). n ≥10; значения p указаны на графике. См. также Рисунок S1A.
(C) Восьминедельных самцов подвергали нагрузочному тесту на бегущей дорожке, а выносливость измеряли по времени до наступления истощения.
Животные mdx/mTRG2 имели тяжелое поражение мышечной выносливости по сравнению с мышами дикого типа или мышами mdx/mTRHet. Данные
представлены в виде среднего значения ± СОС (стандартная ошибка среднего). n ≥5; значения p указаны на графике. См. также Рисунки S1B и S1C.
(D) Количественное определение захвата красителя Эванс синий мышцей диафрагмы 8-недельных мышей, не подвергавшихся физической нагрузке (%
площади поглощения красителя Эванс синий, EBD+). Данные представлены в виде среднего значения ± СОС (стандартная ошибка среднего). n =30;
значения p указаны на графике. См. также Рисунок S2.
(E) Характерные картины захвата красителя Эванс синий в мышцах диафрагмы животных различных генотипов.
(F и G) Мышечную силу измеряли в латеральной икроножной мышце in vivo у 8-недельных наркотизированных животных при электрической
стимуляции седалищного нерва и выражали относительно площади поперечного сечения (ППС) (P0/ППС, сила на квадратный метр, кН/м2). Данные
представлены в виде среднего значения ± СОС (стандартная ошибка среднего). n ≥4; значения p указаны на графике. См. также Рисунок S1D.
(H) Количественное определение миофибрилл с центрально расположенными ядрами икроножных мышц 8-недельных мышей с указанными
генотипами. Данные представлены в виде среднего значения ± СОС (стандартная ошибка среднего). n =3; значения p указаны на графике.
У восьминедельных самцов mdx/mTRG2 уже имелось заметное повышение сывороточной КК (7594 ± 928 МЕ/л) по сравнению с самцами mdx/mTRHet
(1148 ± 477 МЕ/л) (Рисунок 1B), примерно соответствующее уровням при DMD у человека (6000–8000 МЕ/л у 10-летних пациентов) (Zatz et al., 1991).
Однако, к возрасту 60 недель, уровни КК у мышей mdx/mTRG2 снижались (Рисунок S1A, доступен онлайн), что соответствует достижению пика уровня
КК у пациентов с DMD в возрасте 1–6 лет, когда происходит активная дегенерация мышц, с последующим снижением с возрастом по мере
прогрессивной утраты мышечных тканей (Zatz et al., 1991). У гетерозиготных мышей mdx/mTRHet с увеличением возраста наблюдалось снижение
уровней КК, предположительно из-за более медленного прогрессирования заболевания (Рисунок S1A). Сывороточные уровни КК были неотличимы у
мышей mTRG2 и здоровых мышей дикого типа (Рисунок 1B, p > 0,05), что соответствовало предыдущим исследованиям, показавшим, что дефицит
3 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Cell
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
теломер предпочтительно поражает органы с высокой пролиферативной активностью, но не скелетные мышцы (Allsopp et al., 2003; Artandi, 2006;
Herrera et al., 1999; Lee et al., 1998). Прогрессирование повышения КК, наблюдаемое у животных mdx/mTRG1 и mdx/mTRG2 позволяет сделать вывод, что
поражение мышц нарастает в каждом последующем поколении, что позволяет предположить, что убыль теломер является фактором, способствующим
проявлению заболевания наряду с дефицитом дистрофина.
WT
8 weeks
Gastrocnemius
Diaphragm
Diaphragm Diameter (µm)
Ca deposits
Fibrosis
Мыши дикого типа
8 недель
Икроножная
Диафрагма
Диаметр диафрагмы (мкм)
Отложения солей кальция
Фиброз
Рисунок 2. Гистологические доказательства тяжелой мышечной дистрофии мышц у мышей mdx/mTRG2
(A) Окрашивание гематоксилином и эозином поперечных срезов мышц диафрагмы (вверху) и икроножной (внизу) для указанных генотипов в возрасте 8 недель. Масштабная
метка 120 мкм. См. также Рисунок S2.
(B) Средний диаметр диафрагмы у 8-недельных мышей mdx/mTRKO значимо увеличен. Данные представлены в виде среднего значения ± СОС (стандартная ошибка
среднего). n = 3; p < 0,05.
(C) Окрашивание ализариновым красным с целью визуализации депозитов солей кальция (вверху) и окрашивание по Гомори на отложения коллагена (внизу) поперечных
срезов мышц 8-недельных мышей. Масштабная метка 120 мкм.
Поражение скелетных мышц доказывается также по изменению проницаемости мембраны миофибрилл, измеряемой по захвату красителя Эванс синий
(Evans blue dye; EBD) (Straub et al., 1997). Диафрагма и икроножные мышцы 8-недельных самцов мышей mdx/mTRG2 демонстрируют значимое
увеличение процентной доли областей, дающих EBD-положительное окрашивание, по сравнению с мышами mdx/mTRHet или mdx/mTRG1 (Рисунки 1D и
1E и Рисунок S2). Контрольные мыши mTRG2 неотличимы от мышей дикого типа, что подтверждает тот факт, что само по себе отсутствие активной
теломеразы не является достаточными триггером для поражения скелетных мышц. Проницаемость мембран значимо ухудшается с возрастом,
поскольку 60-недельные животные mdx/mTRG2 демонстрируют более высокое включение EBD (Рисунок S2). В совокупности эти данные указывают на
то, что, в отсутствии теломеразы, дефицит дистрофина вызывает у мышей прогрессирующее поражение скелетных мышц.
Для оценки выносливости мы вначале анализировали время до истощения на беговой дорожке. Восьмимесячные мыши mdx/mTRG2 бегали значительно
меньшее время, чем контрольные мыши дикого типа (3,8 ± 0,6 в сравнении с 22,8 ± 2,6 мин), или чем мыши mdx/mTRHet (16,3 ± 3,9 мин). Мышечная
выносливость с возрастом еще более ухудшалась, поскольку 24-недельные мыши mdx/mTRG2 вообще с трудом могли бегать (1,1 ± 0,6 мин) (Рисунок 1C
и Рисунок S1B). Напротив, соответствующие по возрасту мыши mTRG2 были неотличимы от мышей дикого типа в возрасте как 8, так и 24 недель
(Рисунок 1C и Рисунок S1B). Вторым общепризнанным анализом мышечной выносливости является «грид-тест», показатель длительности времени, в
течение которого мышь может удерживать массу своего тела, держать за стержень. Результаты грид-теста у 8-недельных мышей коррелировали с
экспериментами на бегущей дорожке, поскольку мыши mdx/mTRG2 были способны удерживаться на решетке значительно меньшее время, чем
контрольные (Рисунок S1C). В третьих, мы измеряли непосредственно мышечную силу икроножных мышц. Во избежание потенциальных артефактов
из-за истощения мышц, мы исследовали генерирование силы in vivo на интактных мышцах у 8-недельных анестезированных животных (Blaauw et al.,
2008). Сила рывка, сила при тетаническом сокращении и напряжение при тетаническом сокращении латеральной икроножной мышцы были заметно
снижены у мышей mdx/mTRG1 и еще больше снижались у мышей mdx/mTRG2 по сравнению с контрольными мышами дикого типа, мышами mdx/mTRHet
и мышами mTRG2 (Рисунки 1F и 1G и Рисунок S1D), давая прямое доказательство прогрессирующей тяжелой мышечной слабости.
Гистологически, процент мышечных волокон с центрально расположенными ядрами, отличительного признака мышечной регенерации, повышался у
4 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
Cell
мышей mdx/ mTRHet (63% ± 4%) относительно мышей
дикого типа (0,7% ± 0,1%) однако еще более
повышался в мышцах мышей mdx/mTRG1 и mdx/mTRG2
(90% ± 1%) (Рисунок 1H и Рисунок 2A), доказывая
заметное
увеличение
повреждения
ткани
и
регенераторной активности большинства волокон в
возрасте 8 недель. Дополнительные гистологические
исследования диафрагмальной и икроножной мышц 8недельных мышей mdx/mTRG2 выявили заметное
повышение гетероненности диаметра мышечных
волокон, инфильтрацию мононуклеарными клетками,
некроз и общее нарушение структуры ткани в
сравнении с подходящими по возрасту контрольными
животными (Рисунок 2A).
Рисунок 3. Мышечная дистрофия у мышей mdx/ mTRG2 с
возрастом прогрессирует
(A) Изображения всего тела, полученные при однофотонной
эмиссионной компьютерной томографии ОФЭКТ/КТ. Имеются
выраженные скелетные деформации позвоночника (кифоз) у
76-недельных мышей mdx/mTRG2 по сравнению с
соответствующими по возрасту контрольными животными.
(B) Масса тела животных значимо снижена у мышей
mdx/mTRG2 в возрасте 76 недель (вверху). n ≥ 3; p < 0,05.
Указанные мышцы были взяты у мышей различного возраста и
веса. Денные представлены в виде массы ткани по отношению
к общей массе тела, стандартный контроль укорочения теломер
(Lee et al., 1998). Результаты приводятся в виде средних
значений ± СОС (средняя ошибка среднего); n ≥ 3; p < 0,05.
(C) Кривая выживаемости Каплана-Мейера. У мышей
mdx/mTRG2 наблюдается сниженная продолжительность жизни
по сравнению с мышами mdx/ mTRHet и контрольными
мышами дикого типа. n ≥ 12.
(D) Окраска гематоксилином и эозином диафрагмальной
мышцы животных в возрасте 76 недель демонстрирует резкую
атрофию ткани у животных mdx/mTRG2 по сравнению с
контрольными. Масштабная метка 120 мкм. См. также Рисунок
S3.
Важно, что гистологические результаты исследования
мышц контрольных мышей mTRG2 неотличимы от
результатов гистологического исследования мышц
мышей дикого типа. Диаметр диафрагмы у мышей
mdx/mTRHet увеличен по сравнению с диаметром
диафрагмы у мышей дикого дипа, что согласуется с
продолжительными повреждением и восстановлением
ткани (Рисунки 2A и 2B) и еще больше увеличен у
мышей
mdx/mTRG1
и
мышей
mdx/mTRG2,
преимущественно,
вследствие
массивной
инфильтрации клеточными элементами (Рисунки 2A и
2B). Аггрегаты депозитов солей кальция и участки
фиброза были значительно большими в мышцах мышей mdx/mTRG2 (Рисунок 2C) в отличие от мышц мышей mdx/mTRHet и mdx/mTRG1. Следовательно,
хотя у контрольных мышей mdx/mTRHet наблюдалась существенная регенерация мышц, на что указывает относительно высокая частота обнаружения
миофибрилл с центрально расположенными ядрами, результаты гистологического исследования их тканей не опровергались при сравнении с мышами
mdx без теломеразной активности (G1 и G2).
Мышечная дистрофия у мышей mdx/ mTRG2 с возрастом прогрессирует
Прогрессирование тяжести DMD, связанное с возрастом, у мышей mdx не подтверждается. Кифоз позвоночника является классическим проявлением
DMD, обусловленным неравномерным ослаблением мышц туловища и их замещением соединительной тканью и жиром (Oda et al., 1993; Wilkins and
Gibson, 1976). Визуализация при помощи однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ-КТ) показывает, что кифоз в когорте
стареющих мышей значительно более выражен у мышей mdx/ mTRG2, чем в соответствующей по возрасту когорте контрольных мышей mdx/ mTRHet в
возрасте 76 недель (Рисунок 3A).
Мы проанализировали тяжесть истощения мышц с помощью оценки потери как общей массы тела, так и конкретно мышечной массы, обусловленных
атрофией, которая обычно усугубляется по мере взросления пациентов с DMD. Общая масса тела уменьшалась у мышей mdx/mTRG2
диспропорционально по сравнению с контрольными к возрасту 76 недель (Рисунок 3B). При проверке по общей массе тела мыши всех генотипов
проявляли прогрессирующее снижение мышечной массы с возрастом, однако это падение резко ускорялось для мышц мышей mdx/mTRG2 в возрасте
после 60 недель. У 8-недельных мышей диафрагмальная и передняя большеберцовая мышцы мышей mdx/mTRG2 демонстрировали нарастание
мышечной массы относительно общей массы тела (Рисунок 3B), что согласуется с наблюдениями у пациентов с DMD, у которых масса тела временно
повышается в молодом возрасте, однако впоследствии, в более позднем возрасте, снижается из-за атрофии скелетных мышц (McDonald et al., 1995).
Масса ткани яичек контрольных животных, органа с высокой пролиферативной активностью, у животных разных фенотипов значимо не изменилась,
что указывает на специфичность атрофии ткани в отношении мышц (Рисунок S5). Анализ выживаемости по Каплан-Мейеру показал, что у мышей
mdx/mTRG2 наблюдается снижение продолжительности жизни, с началом смерти в возрасте 48 недель, тогда как мыши mdx/mTRHet не демонстрируют
различий по сравнению с животными дикого типа (Рисунок 3C).
WT
Мыши дикого типа
Total Weight (grams)
Общий вес (грамм)
5 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Cell
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
Gastrocnemius/Total weight (x10-3)
Tibialis Anterior/Total weight (x10-3)
Survival (%)
Diaphragm/Total weight (x10-3)
Age (weeks)
76 weeks old
Diaphragm
Икроножная мышца/общий вес (х10-3)
Передняя большеберцовая/общий вес (х10-3)
Выживаемость (%)
Диафрагма/общий вес (х10-3)
Возраст (недели)
Возраст 76 недель
Диафрагма
Рисунок 4. Мышечные стволовые клетки мышей mdx/ mTRG2
демонстрируют нарушение пролиферации in vivo
(A) Восьминедельным мышам без повреждения и с
повреждением NTX проводили однократное введение BrdU за
24 до забора ткани. MuSC выделяли с помощью FACS и
проводили реакцию иммунофлюоресценции с BrdU (зеленый)
и Hoechst (синий). Показаны характерные изображения MuSC
всех генотипов. Стрелками указаны клетки BrdU+. Масштабная
метка 80 мкм. См. также Рисунок S4.
(B) Процент BrdU+ MuSC представлен в виде среднего
значения ± СОС (средняя ошибка среднего). n ≥ 3; значения p
указаны на графике.
(C) Из передних большеберцовых мышц животных указанного
возраста выделяли отдельные волокна и окрашивали на Pax7
(зеленый) и ядра (синий). Типичное изображение,
показывающее отдельное волокно с сателлитной клеткой Pax7+
(стрелка). Масштабная метка 50 мкм (вверху). График
показывает количество Pax7+ сателлитных клеток/волокно. n =
3 животных/группа и 50-100 миофибрилл/животное. Данные
представлены в виде среднего значения ± СОС (стандартная
ошибка среднего) (внизу).
(D) Типичные изображения поперечных срезов икроножных
мышц животных указанных генотипов в возрасте 8 недель с
иммуноокрашиванием на дистрофин (зеленый) и ядра (синий).
Масштабная метка 100 мкм (вверху). Графики показывают
распределение размера кластеров ревертантных миофибрилл
(пунктирные линии на графиках отражают медиану размера
кластера) (внизу).
И наконец, гистологическое исследование мышц
конечностей животных в возрасте 76 недель выявляет
выраженное поражение тканей у мышей mdx/mTRG2, с
обширным фиброзом и инфильтрацией клетками
иммунной системы (Рисунок S3). Примечательнее
всего, что мышцы диафрагмы у мышей mdx/mTRG2 к
возрасту 76 недель атрофировались до остатков,
намного меньших исходного размера, позволяя
предположить, что причиной их преждевременной
гибели могла быть дыхательная недостаточность
(Рисунок 3D).
Нарушение пролиферации MuSC у мышей mdx/mTRG2
in vivo
Мы предположили, что тяжесть фенотипических
проявлений, наблюдаемых у животных mdx/mTRG2,
обусловлена дефектами функционирования MuSC.
Чтобы проверить эту возможность, мы оценили
пролиферацию MuSC in vivo с помощью анализа не
поврежденных или поврежденных однократным
введением нотексина передних большеберцовых мышц
(Harris and MacDonell, 1981) при внутрибрюшинном
введении
5-бром-2-дезоксиуридина
(bromodeoxyuridine; BrdU) за 24 часа до взятия материала.
MuSC затем выделяли с помощью клеточного сортера с
активацией флюоресценции (Fluorescence Activated Cell
Sorter; FACS) с чистотой > 90% для всех генотипов (Рисунок S4), как описано ранее (Sacco et al., 2008), и определили включение BrdU. У мышей дикого
типа при условии отсутствия повреждения только 0,4% ± 0,2% MuSC были BrdU+ (Рисунки 4A и 4B), что согласуется с предыдущими сообщениями о
том, что у взрослых MuSC находятся преимущественно неактивны в условиях равновесного состояния (Cerletti et al., 2008). Однако, после повреждения
нотексином, MuSC мышей дикого типа активируются и входят в клеточный цикл, и 8,6% ± 2,9% из них становятся BrdU+ (Рисунки 4A и 4B). У мышей
mdx/mTRHet без повреждения 2,5% ± 1,4% MuSC являются BrdU+, что выше, чем у мышей дикого типа, и соответствует постоянной продолжающейся
регенерации ткани из-за дефицита дистрофина. MuSC мышей mdx способны давать надлежащий ответ на острое повреждение, входя в клеточный цикл
(5,1% ±0,6%). Напротив, MuSC мышей mdx/mTRG1 (1,4% ± 0,3%) и мышей mdx/mTRG2 (1,3% ± 0,2%) проявляют заметно сниженную инкорпорацию
BrdU в отсутствии поражения нотексином (Рисунки 4A и 4B), которая не значимо повышается после повреждения у мышей mdx/mTRG1 (1,6% ± 0,1%) и
мышей mdx/mTRG2 (2,5% ± 0,4%), включая тяжелый дефект пролиферации MuSC в ответ на повреждение ткани.
WT
Мыши дикого типа
Uninjured
Без повреждения
Injured 5d NTX
5 дней после повреждения NTX
6 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
Undamaged
5d NTX
BrdU+ MuSCs (%)
Satellite Cell/Fiber (n)
8 weeks
16 weeks
Frequency (%)
Number of revertant myofibers per cluster (n)
Без повреждения
5 дней после NTX
BrdU+ MuSCs (%)
Сателлитные клетки/волокно (n)
8 недель
16 недель
Частота (%)
Количество ревертантных мышечных волокон на кластер (n)
Chromosome with signal free ends (%)
dystrophin
RNA template
Chronic injury
MuSCs (satellite cells)
α7-integrin
Myogenic progenitors
Desmin
Myoblasts
α-MyHC
Myotube
Хромосомы с концами, не дающими сигнала (%)
дистрофин
РНК матрица
Хроническое повреждение
MuSCs (сателлитные клетки)
α7-интегрин
Клетки-предшественники мышечных клеток
Десмин
Миобласты
α-MyHC (тяжелая цепь миозина α)
Мышечная трубочка
Cell
Рисунок 5. FISH-анализ теломер первичных миобластов
(A) Типичные изображения FISH на метафазных пластинках клеток мышей mdx/mTRHet, mdx/mTRG1 и mdx/mTRG2 (красный, теломеры; синий, Hoechst). Стрелками показано
слияние хромосом по типу «конец в конец», указывающее на нестабильность генома.
(B) График показывает количество (процент) хромосом, концы которых не дают сигнала (общее количество проанализированных хромосом показано над каждым столбцом).
p < 0,03. См. также Рисунок S5.
(C) Схема отражает последовательность явления во время регенерации мышц в модели мышей mdx (слева) по сравнению с моделью дистрофии mdx/mTRG2 (справа).
Критическое укорочение теломер и слияния хромосом в мышечных клетках мышей mdx/mTRG2 приводит к нарушению способности поддерживать регенерацию тканей.
Заметим, что пролиферативное поведение MuSC контрольных мышей mTRG2 не нарушено и неотличимо от такового у мышей дикого типа. Эти данные
подчеркивают, что тяжелое нарушение функции MuSC наступает тогда, когда отсутствие дистрофина сочетается с отсутствием теломеразной
активности.
Количество сателлитных клеток Pax7+ на мышечное волокно (8,7 ± 0,6 у мышей дикого типа, 7,7 ± 0,1 у мышей mdx/mTRHet и 8,5 ± 0,8 у мышей
mdx/mTRG2) у разных генотипов статистически не отличается (p > 0,05) (Рисунок 4C), демонстрируя, что наблюдаемое снижение BrdU+ MuSC не
является результатом снижения количества сателлитных клеток, а является, скорее, функциональным дефектом в данном возрасте. Однако, у более
старых мышей (60 недель), количество сателлитных клеток заметно снижено у пожилых мышей mdx/mTRG2 (Рисунок 4C), отражая тяжесть
прогрессирования заболевания.
Другим показателем пролиферативного потенциала MuSC in vivo является изучение кластеров ревертантных мышечных волокон. Ревертантные
мышечные волокна экспрессируют дистрофин в результате компенсаторной мутации в соматических клетках (Hoffman et al., 1990). Если мутация
происходит в MuSC, во время пролиферации эта MuSC будет принимать участие в регенерации мышечных волокон в ее непосредственном окружении,
7 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Cell
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
давая начало кластеру экспрессирующих дистрофин
(дистрофин+)
мышечных
волокон.
Мы
наблюдали
прогрессирующее снижение размера кластера ревертантных
мышечных волокон в последовательных поколениях мышей
mdx/ mTR, с прогрессирующим снижением медианы размера
кластера у мышей mdx/mTRHet, mdx/mTRG1 и mdx/mTRG2
(Рисунок
4D),
соответствующее
прогрессирующему
снижению пролиферативного потенциала MuSC.
Критически укороченные теломеры в миобластах мышей
mdx/mTRG1 и mdx/mTRG2
Анализ теломер проводили с помощью гибридизации
теломеро-специфичного зонда с метофазными хромосомами
путем флуоресцентной гибридизации in situ (fluorescence in
situ hybridization; FISH-анализ теломер). Этот анализ требует
наличия большого количества митотических клеток в
метафазе. Поскольку методов культивирования достаточного
количества MuSC пока нет, мы анализировали производные
MuSC, миобласты, выделенные в соответствии с ранее
описанным методом (Rando и Blau, 1994). Концы хромосом,
на которых отсутствовали доступные обнаружению
теломерные повторы (концы, не дающие сигнала; signal-free
ends [SFEs]) выявлялись с повышенной частотой в 49/893
(5,5%) хромосом мышей mdx/ mTRG1 и в 34/642 (5,3%)
хромосом мышей mdx/mTRG2 в сравнении с 9/602 (1,5%)
хромосом мышей mdx/mTRHet (Рисунки 5A и 5B). 5% частота
SFE, наблюдаемая у мышей mdx/mTRG1 и mdx/mTRG2, не
выявляется даже в органах с высокой пролиферативной
активностью, вплоть до последних поколений мышей с
отсутствием Terc (Blasco et al., 1997), что доказывает, что
такое повышение частоты не вызвано одним только
отсутствием Terc.
Рисунок 6. Мышечные стволовые клетки мышей mdx/ mTRG2
демонстрируют нарушение пролиферации in vitro
(A) Отдельные мышечные волокна изолировали у 8- и 60-недельных
животных и культивировали в течение 96 часов. Типичные
по сравнению с мышцами мышей mdx/mTRHet. Масштабная метка 50 мкм. См.
изображения культур демонстрируют дефект пролиферации в мышцах мышей mdx/mTRG2
также Рисунок S6.
(B) График показывает количественные характеристики пролиферативной способности в виде общего числа клеток, полученных из мышечного волокна через 96 часов.
Результаты приводятся в виде средних значений ± СОС (средняя ошибка среднего); n = 3; p < 0,05.
(C) Типичные изображения иммунофлюоресцентного окрашивания культур волокон на десмин (зеленый) и ядра красителем Hoechst 33258 (синий). Масштабная метка 50
мкм.
(D) График показывает количественный показатель клеток, синтезирующих десмин (десмин+) в культурах, полученных из отдельных мышечных волокон. Результаты
приводятся в виде средних значений ± СОС (средняя ошибка среднего); n = 3; p > 0,05.
(E) Типичные изображения иммунофлюоресцентного окрашивания культур волокон на тяжелую цепь миозина (красный) и ядер красителем Hoechst 33258 (синий).
Масштабная метка 50 мкм.
(F) График показывает количественный показатель клеток, синтезирующих тяжелые цепи миозина (Myosin Heavy Chain; MyHC) (MyHC+) в культурах, полученных из
отдельных мышечных волокон. Результаты приводятся в виде средних значений ± СОС (средняя ошибка среднего); n = 3; p > 0,05.
Кроме того, на метафазных пластинках миобластов мышей mdx/mTRG1 и mdx/mTRG2 были обнаружены слияния хромосом по типу «конец в конец»,
(Рисунок 5A, стрелки), указывающие, что укорочение теломер в этих клетках приводит к нестабильности генома. Это заметно отличает их от 602
хромосом, проанализированных на метафазных пластинках миобластов мышей mdx/ mTRHet, среди которых не было обнаружено слияний по типу
«конец в конец». SFE представляют собой концы хромосом с самыми короткими теломерами; они коррелируют с повышенной частотой слияния
хромосом и дисфункции ткани in vivo у нокаутированных по теломеразе мышей (Chang et al., 2004). Этот результат весомо подтверждает нашу гипотезу
о том, что истощение пролиферативного потенциала MuSC при дистрофии, путем нарушения функции теломер, является непосредственной причиной
прогрессирования мышечной дистрофии.
Исследование селезенки и яичек показало, что два этих органа с высокой пролиферативной активностью в проанализированных поколениях животных
не поражаются (Рисунок S5), что является аргументом, опровергающим возможность того, что наблюдаемые эффекты обусловлены только отсутствием
Terc и свидетельствуют в пользу причины, специфичной в отношении мышц. Схема изображает воздействия утраты Terc на возникновение DMD
(Рисунок 5C).
Нарушенный потенциал пролиферации в культуре MuSC мышей mdx/mTRG2
Чтобы глубже изучить, вызываются ли изменения соматических клеток мышечной ткани снижением пролиферативного потенциала MuSC у мышей
mdx/mTRG2, мы изучили их поведение in vitro. Отдельные мышечные волокна изолировали из передних большеберцовых мышц 8-недельных животных,
и после 4 дней культивирования анализировали пролиферативный потенциал развившихся из MuSC мышечных волокон. Сателлитные клетки,
полученные из мышечных волокон mdx/mTRG2, демонстрировали сниженный пролиферативный потенциал (261 ± 54 клеток/ волокно) по сравнению с
мышечными волокнами мышей mdx/mTRHet (586 ±157 клеток/волокно) (Рисунки 6A и 6B). Как описано выше (Рисунок 4C), количество сателлитных
клеток на волокно в этом возрасте не нарушалось, указывая, что наблюдаемые различия количества клеток возникают в результате дефекта
пролиферации соматических клеток в MuSC мышей mdx/mTRG2, вызванного дисфункцией теломер. Снижение пролиферации сателлитных клеток
сохранялось с возрастом; к 60 неделе сателлитные клетки мышей mdx/mTRG2 при выращивании давали только 40% количества клеток (307 ± 47) по
сравнению с контролем (707 ± 37) (Рисунок 6B).
Чтобы оценить, следует ли за снижением пролиферативной способности изменение эффективности дифференцировки, in vitro было произведено
окрашивание на десмин и тяжелую цепь миозина, два общепризнанных маркера мышечных клеток. Процент десмин-синтезирующих (десмин+) у
мышечных волокон мышей mdx/mTRHet (47% ± 8%) и мышей mdx/mTRG2 (40% ± 21%) значимо не отличался, указывая, что у сателлитных клеток
8 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
Cell
мышей mdx/mTRG2 отсутствуют какие-либо нарушения дифференцировки при превращении в миобласты (Рисунки 6C и 6D). Примечательно, что с
возрастом миогенный потенциал (экспрессия десмина) значимо снижался у животных обоих генотипов (Рисунок 6D), что согласуется с
предшествовавшими исследованиями, в которых отмечался сниженный миогенный потенциал мышечных клеток у мышей с дистрофией и старых
мышей (Bockholdetal., 1998; Brack etal., 2007). Изучение экспрессии тяжелых цепей миозина показало, что спонтанная терминальная дифференцировка
у клеток молодых и старых мышей mdx/mTRHet и mdx/mTRG2 значимо не отличалась (Рисунки 6E и 6F). Эти данные подтверждают, что свойства
дифференциации у этих сателлитных клеток не отличаются, а пролиферативная функция различна. С увеличением возраста абсолютное число MuSC
снижается (Рисунок 4C), внося вклад в дефект пролиферации и приводя к еще более выраженному дефициту клеток, которые могут использоваться для
восстановления мышц.
Cells proliferated from single fibers (n)
Клеток, возникших из отдельных волокон (n)
8 weeks
8 недель
16 weeks
16 недель
Desmin+ cells (%)
Клетки, экспрессирующие десмин (десмин+; %)
8 weeks
8 недель
16 weeks
16 недель
MyHC+ cells (%)
Клетки, синтезирующие тяжелые цепи миоглобина (MyHC+)s (%)
8 weeks
8 недель
16 weeks
16 недель
У мышей mdx/mTRG2 нарушен энграфтинг MuSC после их трансплантации
Чтобы проверить сочетание эффектов мутации mdx и дисфункции теломер на функцию MuSC in vivo, мы оценили способность очищенных MuSC к
энграфтингу (приживляемости) и пролиферации после трансплантации мышам-реципиентам. Свежевыделенные MuSC (Sacco et al., 2008)
инфицировали лентивирусом, экспрессирующим GFP (зеленый флуоресцирующий протеин), и трансплантировали в дозе 3000 клеток в облученные
передние большеберцовые мышцы мышей NOD/SCID с иммунодефицитом (Рисунок 7A). Эффективность инфицирования составляла около 90%, и
статистически значимо не различаясь в различных образцах (Рисунок 7B, p > 0,05). Через три недели после трансплантации MuSC мышей mdx/mTRHet
вызвали образование, в среднем, 200 ± 30 мышечных волокон, экспрессирующих зеленый флуоресцирующий белок (GFP+) (Рисунок 7C). В отличие от
них, MuSC, выделенные у мышей mdx/mTRG2, имели значимо нарушенную способность к приживлению, что вносило свой вклад в значимо меньшее
количество мышечных волокон, 81 ± 22 (Рисунок 7C). Эти данные подтверждают наши исследования in vitro и показывают, что MuSC, взятые у мышей
mdx/mTRG2, обладают соматическим дефектом пролиферации, который нарушает их способность создавать новые мышечные волокна in vivo. Для
изучения возможного влияния разрушения теломер на дегенерацию мышечных волокон мы индуцировали острое повреждение с помощью инъекции
нотексина 8-недельным животным и провели гистологическое исследование на 3 день после повреждения. Степень повреждения мышц у мышей
mdx/mTRHet и mdx/mTRG2 была сравнимой, в том числе в том, что мыши mdx/mTRG2 не были более чувствительными к данному типу повреждения
ткани (Рисунок S6). Кроме того, инфильтрация гемопоэтическими клетками (CD45+ клетки), макрофагами (CD11b) и лимфоцитами (B220) были
одинаково представлены у мышей mdx/mTRHet и mdx/mTRG2 (Рисунок S6). Эти результаты указывают, что мыши mdx/mTRG2 способны к
воспалительному ответу на повреждение ткани и обеспечивают прямое доказательство того, что гемопоэтический компартмент у этих мышей не
нарушен. Наконец, мезенхимальные интерстициальные клетки Sca1+ и эндотелиальные клетки CD31+ в мышцах у мышей mdx/mTRHet и mdx/mTRG2
присутствовали также в равных количествах , позволяя сделать вывод о том, что фенотип тяжелой дистрофии является мышечно-специфичным и не
является результатом функциональных дефектов в клетках других типов.
Облегчение фенотипа дистрофии после трансплантации MuSC мышей дикого типа
Чтобы проверить, не возникает ли фенотип дистрофии у мышей mdx/mTRG2 в результате уменьшенного резерва MuSC, мы провели эксперименты по
трансплантации MuSC в пораженные дистрофией мышцы мышей mdx/mTRG2. Свежевыделенные MuSC мышей либо дикого типа, либо mdx/mTRG2,
инфицировали лентивирусом, экспрессирующим GFP (зеленый флуоресцирующий протеин), и трансплантировали в дозе 5000 клеток в облученные
передние большеберцовые мышцы мышей mdx/mTRG2 (Рисунок 7D). Эффективность инфицирования составила около 95% и была сравнимой в
различных группах (p > 0,05; данные не приводятся). Через три недели после трансплантации MuSC мышей дикого типа эффективно приживались в
мышцах реципиента и вызывали образование в среднем 299 ± 29 мышечных волокон, экспрессирующих зеленый флуоресцирующий протеин (GFP+)
(Рисунки 7E и 7F и Рисунки S7F–S7J), тогда как MuSC мышей mdx/mTRG2 приводили к образованию существенно меньшего количества мышечных
волокон GFP+, 118 ± 17 (Рисунки 7E и 7F и Рисунки S7A–S7E). Измерения площади поперечного сечения волокон показывают, что MuSC мышей
дикого типа приводят к образованию больших мышечных волокон по сравнению с клетками мышей mdx/mTRG2 (Рисунок 7G), указывая на способность
к более существенному вкладу в рост мышцы после трансплантации. Дальнейший гистологический анализ выявил, что количественные показатели
воспалительной инфильтрации в участке мышцы, в который инъецировали MuSC мышей дикого типа, значимо снижались по сравнению с mdx/mTRG2,
что доказывается низким количеством гемопоэтических клеток CD45+ и общим улучшением тканевой архитектуры, явно видным на срезах,
окрашенных гематоксилин-эозином (Рисунки S7K и S7L). Регенераторный потенциал MuSC, трансплантированных от контрольных мышей mTRG2
животным mdx/mTRG2 аналогичен потенциалу, наблюдаемому для MuSC мышей дикого типа (данные не приводятся). В совокупности эти результаты
обеспечивают веские доказательства того, что фенотип тяжелой дистрофии, наблюдаемый у мышей mdx/mTRG2, возникает в результате утраты
регенераторного потенциала эндогенных MuSC. Хотя мы не можем полностью исключить возможность дефектов клеток других типов, или прямого
влияния на сами мышечные волокна в качестве возможного сопутствующего фактора, эти результаты показывают, что прогрессирующая утрата
резерва MuSC играет главную роль в определении тяжести фенотипа дистрофии.
ОБСУЖДЕНИЕ
Отсутствие мышиной модели DMD, который достоверно имитирует ключевые особенности заболевания у человека, ограничивает наши возможности
понимания ее патофизиологии и проверки возможных методов лечения. Долгое время оставалось загадкой, почему люди с мутацией в гене белка
дистрофина страдают от столь тяжелого истощения мышц, тогда как мыши с такой же мутацией – нет. Важным различием между человеком и мышью
является длина их теломер, которые у людей значительно короче. Уменьшение длины теломеры в MuSC может сильно ограничить пул стволовых
клеток, способных со временем участвовать в восстановлении мышц. В данной работе мы показали, что новая мышиная модель, мыши mdx с
отсутствием теломеразной активности (mdx/mTR), более точно повторяют фенотип DMD, чем описанные к настоящему времени мышиные модели, что
доказывается характерной тяжелой прогрессирующей утратой структуры и функции мышц.
Мы постулируем, что фенотип тяжелого мышечного истощения, наблюдаемый в данной мышиной модели, обусловлен нарушением функции MuSC,
необходимых для восстановления повреждений. Нами исключены другие возможные причины, связанные со стволовыми клетками, такие как
преждевременная дифференцировка MuSC или снижение количества MuSC на мышечное волокно во время начала заболевания. Мы установили,
напротив, как in vitro, так и in vivo, что MuSC мышей mdx/mTRG2 поражены тяжелыми дефектами, связанными с их пролиферацией. In vivo MuSC
проявляют сниженную способность к делению (включение метки BrdU), меньшие размеры ревертантных клонов, неспособность отвечать на
повреждение тканей, а также заметно сниженный энграфтинг после трансплантации мышам. In vitro дефект пролиферации проявляется заметным
9 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Cell
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
снижением количества клеток, получаемых из отдельных волокон.
Такой пролиферативный дефект коррелирует с увеличением
количества
концов
хромосом,
не
дающих
сигнала,
и
доказательствами слияний хромосом, в нормальных условиях не
наблюдаемых в тканях с низкой скоростью обновления, таких как
мышцы. Со временем наблюдается снижение количества MuSC на
мышечное волокно. Предположительно, снижение количества MuSC
у старых мышей с дистрофией и нулевой активностью теломеразы
отражает, в итоге, неспособность стволовых клеток к
самообновлению популяции. Снижение количества MuSC усугубляет
уже нарушенную регенерацию, возникающую вследствие сниженной
пролиферативной способности оставшихся MuSC.
Мы предполагаем, что способность MuSC к репликации играет
определенную роль в гомеостазе мышечной ткани у мышей,
преодолевает дефект, наблюдаемый в мышцах человека, в которых
отсутствует дистрофин. Мы в данной работе подтвердили эту
гипотезу путем объединения отсутствия теломеразы и постоянного
элиминационного давления на пролиферацию и регенерацию
мышечных клеток, вызванного мутацией mdx.
Рисунок 7. Мышечные стволовые клетки мышей mdx/ mTRG2 демонстрируют
нарушение энграфтмента после трансплантации в мышцы мышей
(A) Схема трансплантации мышам NOD/SCID.
(B) Типичные изображения инфицированных лентивирусом MuSC.
Масштабная метка 80 мкм (слева). График демонстрирует количественное
определение эффективности инфицирования, выраженное в процентах клеток,
экспрессирующих зеленый флуоресцирующий протеин (GFP+). Результаты
приводятся в виде средних значений ± СОС (средняя ошибка среднего). p >
0,05.
(C) Через три недели после трансплантации мышцы забирали, готовили срезы и
проводили иммунологическое окрашивание на зеленый флуоресцирующий
протеин GFP (зеленый), ламинин (красный) и ядра красителем Hoechst (синий).
Характерные изображения мышц, в которые произведена трансплантация.
Масштабная метка 120 мкм (слева). График показывает общее количество
мышечных волокон GFP+, рассчитанное на мышцу. Результаты приводятся в
виде средних значений ± СОС (средняя ошибка среднего); n ≥ 5; p < 0,01
(справа).
(D) Схема трансплантации мышам mdx/mTRG2.
(E) Через три недели после трансплантации мышцы забирали, готовили срезы и
проводили иммунологическое окрашивание на зеленый флуоресцирующий
протеин GFP (зеленый), ламинин (красный) и ядра красителем ДАПИ (синий).
Характерные изображения мышц, в которые произведена трансплантация.
Масштабная метка 100 мкм.
(F) График показывает общее количество мышечных волокон GFP+ на мышцу.
Результаты приводятся в виде средних значений ± СОС (средняя ошибка
среднего); n = 5; p < 0,05.
(G) Исследование площади поперечного сечения мышечных волокон GFP+
после трансплантации показывает, что MuSC мышей дикого типа дают начала
более крупным мышечным волокнам по сравнению с MuSC mdx/mTRG2.
mdx/mTRHet or mdx/mTRG2
α7integrin
CD34 MuSC Isolation
GFP Lentiviral infection
Transplantation into muscle
Infection Efficiency (%)
GFP+ myofibers (n)
WT or mdx/mTRG2
WT MuSC
laminin
GFP
DAPI
Merge
GFP+ myofibers (n)
WT
GFP+ fibers (n)
mdx/mTRHet или mdx/mTRG2
α7интегрин
Выделение CD34 MuSC
Инфицирование лентивирусом с GFP
Трансплантация в мышцу
Эффективность инфицирования (%)
Мышечные волокна GFP+ (n)
Мыши дикого типа или mdx/mTRG2
MuSC мышей дикого типа
ламинин
GFP (зеленый флуоресцирующий протеин)
ДАПИ
Объединенное изображение
Мышечные волокна GFP+ (n)
Мыши дикого типа
Волокна GFP+ (n)
10 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
WT
Fiber CSA (µm2)
Cell
Мыши дикого типа
ППС волокна (мкм2)
Результатом явилась мышиная модель mdx/mTRG2, которая близко имитирует заболевание человека. По сообщениям мышцы пациентов с DMD имеют
более короткие теломеры, чем теломеры здоровых лиц (Decary et al., 2000; Mouly et al., 2005). Аналогичное критическое укорочение теломер было
выявлено в рамках настоящей работы в культивируемых клетках-предшественниках мышечной ткани, выделенный у мышей mdx/mTRG2 с фенотипом
мышечной дистрофии. Создание мышиных моделей с отсутствием теломеразной активности, нокаутированных по TERT и Terc мышей (Blasco et al.,
1997; Liu et al., 2000), ранее привело к демонстрации критически важной роли теломеразы в самообновлении популяции стволовых клеток взрослых
организмов в тканях с высокой скоростью обновления, таких как кровь, печень, кожа и яички (Allsopp et al., 2003; Lee et al., 1998). В отличие от них
скелетные мышцы являются стабильной тканью, а фенотип дистрофии у мышей с отсутствием TERT и Terc никогда не был описан. Даже в условиях
непрерывного повреждения в модели mdx проявляется лишь легкая степень фенотипа мышечной дистрофии, а доказательства укорочения теломер в
миобластах этих мышей отсутствуют. Напротив, в данной работе мы показали, что мышиные MuSC, происходящие от мышей с отсутствием и
дистрофина и теломеразы, демонстрируют более высокую частоту появления хромосом с концами, не дающими сигнала (хромосомы с критическим
укорочением теломер) по сравнению с контрольными мышами mdx/mTRHet, указывая на то, что постоянная потребность в пролиферации MuSC in vivo
ведет к укорочению теломер, с последующими процессами, сходными с процессом старения, и к дегенерации ткани. Эти результаты представляют
четкие доказательства того, что теломараза играет критически важную роль для функционирования MuSC in vivo. Хотя мы не можем полностью
исключить влияние отсутствия теломеразы на другие типы клеток или на зрелые мышечные волокна, эти результаты подчеркивают роль соматического
или внутреннего ограничения в отношении торможения функционирования MuSC.
Наши данные о дефектах соматических стволовых клеток важно рассматривать в свете недавних исследований, которые указывают на первичную роль
микроокружения в поддержании функции сохранения ниши и жизнеспособности стволовых клеток. Действительно, эти исследования показали, что
стволовые клетки молодых и старых мышей, при воздействии на них системных факторов молодых мышей при парабиозе ведут себя аналогичным
образом (Brack et al., 2007; Conboy et al., 2005). Наши результаты показывают, что внутренние характеристики, такие как укорочение теломер, также
являются кринически важными для регенерации мышц, и их необходимо учитывать при предсказании эффектов модулирования микроокружения на
функции MuSC человека из старых или страдающих дистрофией мышц.
Причина фиброза, наблюдаемого при DMD, остается неизвестной. В настоящей работе мы наблюдали, что, когда MuSC мышей дикого типа
трансплантируют в мышцы мышей, страдающих дистрофией, наблюдается минимальный фиброз, тогда как при трансплантации MuSC мышей
mdx/mTRG2 с нарушенной пролиферацией развивается обширный фиброз. Эти результаты аналогичны результатам, наблюдавшимся при хроническом
циррозе печени, при котором имеется корреляция между фиброзом и укорочением теломер (Kitada et al., 1995; Rudolph et al., 2000; Wiemann et al.,
2002). Эти данные позволяют предположить интересную возможность того, что в тканях, подверженных хроническому повреждению, фиброз является
вторичным по отношению к потере клеток, а не первичным конкурирующим процессом, который противодействует восстановлению.
В целом, мы представили доказательства того, что укорочение теломер является результатом непрерывной пролиферации в дегенерирующей
дистрофической мышце, и описали создание новой мышиной модели DMD, которая более точно воспроизводит прогрессирование заболевания у
людей. Эта модель окажется полезной при прояснении патофизиологии DMD и для тестирования возможных терапевтических подходов при этом и
других заболеваниях, связанных с дегенеративными заболеваниями мышц, которые были ограничены легкими фенотипическими проявлениями,
типичными для имеющихся в настоящее время мышиных моделей. Наши результаты показывают, что DMD, мышечное дегенеративное заболевание,
является результатом многофакторного процесса, как структурного дефекта ткани, так и прогрессирующего истощения ее регенераторного потенциала.
Чтобы преодолеть вышеуказанные ограничения следует рассматривать терапевтические вмешательства как в отношении длины теломеры, так и в
отношении миогенного потенциала источника клеток для регенерации (Gussoni et al., 1992). В совокупности эти данные документально подтверждают
значение теломеразы для гомеостаза мышечной ткани и предоставляют первое прямое экспериментальное доказательство того, что прогрессирование
DMD, хотя и инициируется и поддерживается дефицитом дистрофина, в конечном счете является болезнью стволовых клеток.
ПРОЦЕДУРЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
Животные
Все протоколы были одобрены Административным советом Стенфордского университета по вопросам использования лабораторных животных. Для создания животных с
двойной мутацией использовались мыши C57Bl6 mdx (приобретенные у компании Jackson Laboratories) и мыши C57Bl6 mTRHet (любезный дар Рона ДеПинхо [Ron
DePinho]). Мыши NOD/SCID с иммунодефицитом были приобретены в компании Jackson Laboratories.
Выделение отдельного волокна и окрашивание сателлитных клеток
Отдельные мышечные волокна выделяли из передних большеберцовых мышц у животных всех генотипов в соответствии с ранее описанным методом (Collins et al., 2005).
Подробное описание процедуры см. Расширенное описание процедур экспериментов.
Измерения силы
Проводили наркотизацию мышей в возрасте восьми недель и определяли силу латеральной икроножной мышцы in vivo на наркотизированных животных в соответствии с
руководствами Стенфордского университета. Подробное описание процедуры см. Расширенное описание процедур экспериментов.
Нагрузочный тест на бегущей дорожке
Нагрузочный тест на бегущей дорожке проводили с помощью аппарата Exer3/6 (компании Columbus Instruments). Перед проведением теста мышей трехкратно обучали бегу
на бегущей дорожке (через день). Мыши бежали по бегущей дорожке с уклоном 20 градусов, с начальной скоростью 10 метров/мин. Через 3 минуты скорость начинали
повышать, добавляя по 1 метру в минуту, до заключительной скорости 20 метров/мин. Истощение определяли как неспособность животного удерживаться на бегущей
дорожке, несмотря на электрическую стимуляцию.
Визуализационное исследование животных с помощью ОФЭКТ/КТ
Наркотизированных (3% изофлураном) животных помещали в сканер ОФЭКТ-КТ (Gamma-Medica-Ideas Pre-clinical Imaging) с детекторами разрешения высоких энергий из
теллурида цинка-кадмия (CZT) и многоканальными точечными коллиматорами. Подробное описание процедуры см. Расширенное описание процедур экспериментов.
Облучение, трансплантация клеток и повреждение тканей нотексином
Мышей NOD/SCID и mdx/mTRG2 наркотизировали и экранировали свинцовым колпаком таким образом, чтобы воздействию источника излучения подвергались только лапы.
На ноги воздействовали излучением в дозе 18 Грей, а трансплантацию клеток проводили в тот же день. Инфицированные лентивирусом MuSC ресуспендировали в
фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и вводили внутримышечно 10 мл суспензии в передние большеберцовые мышцы мышей-реципиентов. При индукции местного
повреждения тканей мышей анестезировали изофлураном и проводили однократную инъекцию 10 мл нотексина (10 мг/мл, Latoxan, Франция) в передние большеберцовые
мышцы мышей.
Введение метки BrdU in vivo
Мышей наркотизировали изофлураном и взвешивали, затем внутрибрюшинно вводили однократную дозу BrdU в ФСБ (100 мг/кг массы тела). Через двадцать четыре часа
мышей умерщвляли и выделяли MuSC по ранее описанному методу (Sacco et al., 2008). После обогащения FACS MuSC отделяли путем центрифугирования клеток на
слайды, фиксировали и окрашивали, используя маркировку BrdU и набор для выявления (компании «Рош»).
Флуоресцентная гибридизация теломер in situ
Для измерения теломер вначале выделяли миобласты в соответствии с ранее описанным методом (Rando и Blau, 1994) и содержали в культуре в среде (модифицированная
Дульбекко среда Игла с субстратом Хэма F10 + 15% ФСБ+основной фактор роста фибробластов [F10/DMEM + 15%FBS+βFGF]). Подробное описание процедуры см.
Расширенное описание процедур экспериментов.
Лентивирусная инфекция
11 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Cell
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
Использованные в данной работе пять плазмидных систем и протокол инфицирования были описаны ранее (Westerman et al., 2007). Подробное описание процедуры см.
Расширенное описание процедур экспериментов.
Культура клеток
Клетки выделяли из мышечной ткани с помощью ферментативной диссоциации клеток, как описано выше. Клетки помещали монослоем на чашки петри, покрытые
ламинином (компании «Рош») в среде (модифицированная Дульбекко среда Игла с субстратом Хэма F10 (50/50)+ 15% ФСБ + 2,5 нг/мл основного фактора роста
фибробластов (GM) [F10/DMEM (50/50) + 15%FBS + 2.5ng/ml βFGF (GM)]) для пролиферации и в модифицированной Дульбекко среде Игла + 2% лошадиной сыворотки
(DM) для дифференцировки.
Получение иммунофлуоресцентных и гистологических изображений
Изображения поперечных срезов мышц получали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (Axioplan2, компании Carl Zeiss MicroImaging, Inc.), линзового объектива
Fluar 20X/0,75 и цифровой камеры (ORCA-ER C4742-95; Hamamatsu Photonics). Для получения изображения использовалось программное обеспечение OpenLab 4.0.2
(Improvision). Изображения культур клеток получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (LSM510, компании Carl Zeiss MicroImaging, Inc.),
используя линзовые объективы Plan NeoFluar 103/0,3 и 203/0,75 и максимальные оптические срезы с программным обеспечением LSM. Все изображения компоновали и
редактировали в программе Photoshop 7.0 (компании Adobe). С помощью коррекции яркости и контраста затушевывали фон, а для усиления цветов проводили
цветокоррекцию с помощью баланса цветов. Все модификации применяли ко всему изображению в целом с помощью программного обеспечения Photoshop 7.0 (компании
Adobe).
Статистический анализ
Данные представлены в виде: среднее значение ± СОС (стандартная ошибка среднего). Для сравнений между группами использовали критерий t Стьюдента, исходя из
предположения двусторонних распределений с уровнем альфа 0,01 – 0,05.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Дополнительная информация включает Расширенное описание процедур экспериментов и семь рисунков; его можно найти вместе с этой статьей он-лайн по адресу
doi:10.1016/j.cell. 2010.11.039.
БЛАГОДАРНОСТИ
Мы благодарим Кесси Колекар (Kassie Koleckar) за отличную техническую поддержку; Фабио Росси (Fabio Rossi) за предоставление конъюгированных с фикоэритрином
антител против мышиного α7-интегрина (α7-integrin-PE-conjugated antibody); Джеки Кустан (Jackie Kustan) за помощь в поддержании порядка; и Фрежи Габте (Frezghi Habte)
из Стенфордского центра малых изображений за помощь с КТ сканированием. Эта работы была проведена на средства гранта на развитие науки Американской ассоциации
по изучению заболеваний сердца 10SDG3510024 для F.M.; грантов Национального института здравоохранения (NIH) AG009521 и AG020961; гранта Ассоциации мышечной
дистрофии 4320 и Фонда Бакстер для H.M.B.
A.S., J.H.P. и H.M.B. разработали данное исследование, A.S. и F.M. провели большинство экспериментов, P.K. ухаживал за мышами и проводил эксперименты на бегущей
дорожке, M.L. проводил эксперименты по измерению силы, а S.D. анализировал данные. R.T. проводил инфицирование лентивирусом и выделение отдельных волокон, M.S.
и J.C. проводили FISH-анализ теломер, а S.A. анализировал данные. A.S. анализировал данные. A.S., F.M., J.H.P., S.A. и H.M.B. обсуждали результаты и написали статью.
Получена: 18 мая 2010 года. Пересмотрена: 18 сентября 2010 года. Принята: 2 ноября 2010 года. Опубликована онлайн: 09 декабря 2010 года
ССЫЛКИ
Aikata, H., Takaishi, H., Kawakami, Y., Takahashi, S., Kitamoto, M., Nakanishi, T., Nakamura, Y., Shimamoto, F., Kajiyama, G., and Ide, T. (2000). Telomere
reduction in human liver tissues with age and chronic inflammation. Exp. Cell Res. 256, 578–582.
Allsopp, R.C., Morin, G.B., DePinho, R., Harley, C.B., and Weissman, I.L. (2003). Telomerase is requiredto slow telomere shortening and extend replica-tive lifespan of HSCs during
serial transplantation. Blood 102, 517–520.
Artandi, S.E. (2006). Telomeres, telomerase, and human disease. N. Engl. J. Med. 355, 1195–1197.
Blaauw, B., Mammucari, C., Toniolo, L., Agatea, L., Abraham, R., Sandri, M., Reggiani, C., and Schiaffino, S. (2008). Akt activation prevents the force drop induced by eccentric
contractions in dystrophin-deficient skeletal muscle. Hum. Mol. Genet. 17, 3686–3696.
Blasco, M.A., Lee, H.W., Hande, M.P., Samper, E., Lansdorp, P.M., DePinho, R.A., and Greider, C.W. (1997). Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking
telomerase RNA. Cell 91, 25–34.
Blau, H.M., Webster, C., and Pavlath, G.K. (1983). Defective myoblasts identified in Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4856–4860.
Bockhold, K.J., Rosenblatt, J.D., and Partridge, T.A. (1998). Aging normal and dystrophic mouse muscle: analysis of myogenicity in cultures of living single fibers. Muscle Nerve 21,
173–183.
Brack, A.S., Conboy, M.J., Roy, S., Lee, M., Kuo, C.J., Keller, C., and Rando, T.A. (2007). Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis.
Science 317, 807–810.
Bulfield, G., Siller, W.G., Wight, P.A., and Moore, K.J. (1984). X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1189–1192.
Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C.A., Hirshman, M.F., Shadrach, J.L., Good-year, L.J., and Wagers, A.J. (2008). Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in
dystrophic muscles. Cell 134, 37–47.
Chang, S., Multani, A.S., Cabrera, N.G., Naylor, M.L., Laud, P., Lombard, D., Pathak, S., Guarente, L., and DePinho, R.A. (2004). Essential role of limiting telomeres in the
pathogenesis of Werner syndrome. Nat. Genet. 36, 877–882.
Collins, C.A., Olsen, I., Zammit, P.S., Heslop, L., Petrie, A., Partridge, T.A., and Morgan, J.E. (2005). Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the
adult muscle satellite cell niche. Cell 122, 289–301.
Conboy, I.M., Conboy, M.J., Wagers, A.J., Girma, E.R., Weissman, I.L., and Rando, T.A. (2005). Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment.
Nature 433, 760–764.
Cornelison, D.D., Wilcox-Adelman, S.A., Goetinck, P.F., Rauvala, H., Rapraeger, A.C., and Olwin, B.B. (2004). Essential and separable roles for Syn-decan-3 and Syndecan-4 in skeletal
muscle development and regeneration. Genes Dev. 18, 2231–2236.
Decary, S., Mouly, V., Hamida, C.B., Sautet, A., Barbet, J.P., and Butler-Browne, G.S. (1997). Replicative potential and telomere length in human skeletal muscle: implications for
satellite cell-mediated gene therapy. Hum. Gene Ther. 8, 1429–1438.
Decary, S., Hamida, C.B., Mouly, V., Barbet, J.P., Hentati, F., and Butler-Browne, G.S. (2000). Shorter telomeres in dystrophic muscle consistent with extensive regeneration in young
children. Neuromuscul. Disord. 10, 113–120.
DiMario, J.X., Uzman, A., and Strohman, R.C. (1991). Fiber regeneration is not persistent in dystrophic (MDX) mouse skeletal muscle. Dev. Biol. 148, 314–321.
Durbeej, M., and Campbell, K.P. (2002). Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 349–
361.
Emery, A.E. (2002). The muscular dystrophies. Lancet 359, 687–695.
Friedrich, U., Griese, E., Schwab, M., Fritz, P., Thon, K., and Klotz, U. (2000). Telomere length in different tissues of elderly patients. Mech. Ageing Dev. 119, 89–99.
Greider, C.W., and Blackburn, E.H. (1985). Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell 43, 405–413.
12 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна
Просим цитировать данную статью в публикациях следующим образом: Sacco et al., Short Telomeres and Stem Cell Exhaustion Model
Duchenne Muscular Dystrophy in mdx/mTR Mice, Cell (2010), doi:10.1016/j.cell.2010.11.039
Cell
Gussoni, E., Pavlath, G.K., Lanctot, A.M., Sharma, K., Miller, R.G., Steinman, L., and Blau, H.M. (1992). Normal dystrophin transcripts detected in DMD patients after myoblast
transplantation. Nature 356, 435–438. Harris, J.B., and MacDonell, C.A. (1981). Phospholipase A2 activity of notexin and its role in muscle damage. Toxicon 19, 419–430.
Hemann, M.T., Rudolph, K.L., Strong, M.A., DePinho, R.A., Chin, L., and Greider, C.W. (2001). Telomere dysfunction triggers developmentally regulated germ cell apoptosis. Mol.
Biol. Cell 12, 2023–2030. Herrera, E., Samper, E., and Blasco, M.A. (1999). Telomere shortening in mTR-/- embryos is associated with failure to close the neural tube. EMBO J. 18,
1172–1181.
Hoffman, E.P., Brown, R.H., Jr., and Kunkel, L.M. (1987). Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51, 919–928. Hoffman, E.P., Morgan, J.E.,
Watkins, S.C., and Partridge, T.A. (1990). Somatic reversion/suppression of the mouse mdx phenotype in vivo. J. Neu-rol. Sci. 99, 9–25.
Im, W.B., Phelps, S.F., Copen, E.H., Adams, E.G., Slightom, J.L., and Chamberlain, J.S. (1996). Differential expression of dystrophin isoforms in strains of mdx mice with different
mutations. Hum. Mol. Genet. 5, 1149–1153. Kipling, D., and Cooke, H.J. (1990). Hypervariable ultra-long telomeres in mice. Nature 347, 400–402.
Kitada, T., Seki, S., Kawakita, N., Kuroki, T., and Monna, T. (1995). Telomere shortening in chronic liver diseases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 33–39.
Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., and Rudnicki, M.A. (2007). Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell 129, 999–1010.
Lee, H.W., Blasco, M.A., Gottlieb, G.J., Horner, J.W., 2nd, Greider, C.W., and DePinho, R.A. (1998). Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature 392, 569–
574.
Lindsey, J., McGill, N.I., Lindsey, L.A., Green, D.K., and Cooke, H.J. (1991). In vivo loss of telomeric repeats with age in humans. Mutat. Res. 256, 45–48. Liu, Y., Snow, B.E., Hande,
M.P., Yeung, D., Erdmann, N.J., Wakeham, A., Itie, A., Siderovski, D.P., Lansdorp, P.M., Robinson, M.O., and Harrington, L. (2000). The telomerase reverse transcriptase is limiting
and necessary for telomerase function in vivo. Curr. Biol. 10, 1459–1462. McDonald, C.M., Abresch, R.T., Carter, G.T., Fowler, W.M., Jr., Johnson, E.R., Kilmer, D.D., and Sigford,
B.J. (1995). Profiles of neuromuscular diseases. Duchenne muscular dystrophy. Am. J. Phys. Med. Rehabil. 74(5, Suppl), S70–S92.
Montarras, D., Morgan, J., Collins, C., Relaix, F., Zaffran, S., Cumano, A., Partridge, T., and Buckingham, M. (2005). Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.
Science 309, 2064–2067. Mouly, V., Aamiri, A., Bigot, A., Cooper, R.N., Di Donna, S., Furling, D., Gidaro, T., Jacquemin, V., Mamchaoui, K., Negroni, E., et al. (2005). The mitotic
clock in skeletal muscle regeneration, disease and cell mediated gene therapy. Acta Physiol. Scand. 184, 3–15.
Oda, T., Shimizu, N., Yonenobu, K., Ono, K., Nabeshima, T., and Kyoh, S. (1993). Longitudinal study of spinal deformity in Duchenne muscular dystrophy. J. Pediatr. Orthop. 13, 478–
488.
Palm, W., and de Lange, T. (2008). How shelterin protects mammalian telo-meres. Annu. Rev. Genet. 42, 301–334.
Petrof, B.J., Shrager, J.B., Stedman, H.H., Kelly, A.M., and Sweeney, H.L. (1993). Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90, 3710–3714. Rando, T.A., and Blau, H.M. (1994). Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell
Biol. 125, 1275–1287.
Renault, V., Rolland, E., Thornell, L.E., Mouly, V., and Butler-Browne, G. (2002). Distribution of satellite cells in the human vastus lateralis muscle during aging. Exp. Gerontol. 37,
1513–1514.
Rodier, F., Kim, S.H., Nijjar, T., Yaswen, P., and Campisi, J. (2005). Cancer and aging: the importance of telomeres in genome maintenance. Int. J. Biochem. Cell Biol. 37, 977–990.
Rudolph, K.L., Chang, S., Lee, H.W., Blasco, M., Gottlieb, G.J., Greider, C., and DePinho, R.A. (1999). Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell
96, 701–712.
Rudolph, K.L., Chang, S., Millard, M., Schreiber-Agus, N., and DePinho, R.A. (2000). Inhibition of experimental liver cirrhosis in mice by telomerase gene delivery. Science 287, 1253–
1258.
Ryder-Cook, A.S., Sicinski, P., Thomas, K., Davies, K.E., Worton, R.G., Barnard, E.A., Darlison, M.G., and Barnard, P.J. (1988). Localization of the mdx mutation within the mouse
dystrophin gene. EMBO J. 7, 3017–3021.
Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., and Blau, H.M. (2008). Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature 456, 502–506.
Sherr, C.J., and DePinho, R.A. (2000). Cellular senescence: mitotic clock or culture shock? Cell 102, 407–410.
Straub, V., Rafael, J.A., Chamberlain, J.S., and Campbell, K.P. (1997). Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J. Cell Biol. 139, 375–
385.
Takubo, K., Nakamura, K., Izumiyama, N., Furugori, E., Sawabe, M., Arai, T., Esaki, Y., Mafune, K., Kammori, M., Fujiwara, M., et al. (2000). Telomere shortening with aging in
human liver. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, B533–B536.
Vaziri, H., Scha¨ chter, F., Uchida, I., Wei, L., Zhu, X., Effros, R., Cohen, D., and Harley, C.B. (1993). Loss of telomeric DNA during aging of normal and trisomy 21 human
lymphocytes. Am. J. Hum. Genet. 52, 661–667.
Webster, C., and Blau, H.M. (1990). Accelerated age-related decline inreplica-tive life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat.
Cell Mol. Genet. 16, 557–565.
Webster, C., Filippi, G., Rinaldi, A., Mastropaolo, C., Tondi, M., Siniscalco, M., and Blau, H.M. (1986). The myoblast defect identified in Duchenne muscular dystrophy is not a primary
expression of the DMD mutation. Clonal analysis of myoblasts from five double heterozygotes for two X-linked loci: DMD and G6PD. Hum. Genet. 74, 74–80.
Westerman, K.A., Ao, Z., Cohen, E.A., and Leboulch, P. (2007). Design of a trans protease lentiviral packaging system that produces high titer virus. Retrovirology 4, 96.
Wiemann, S.U., Satyanarayana, A., Tsahuridu, M., Tillmann, H.L., Zender, L., Klempnauer, J., Flemming, P., Franco, S., Blasco, M.A., Manns, M.P., and Rudolph, K.L. (2002).
Hepatocyte telomere shortening and senescence are general markers of human liver cirrhosis. FASEB J. 16, 935–942.
Wilkins, K.E., and Gibson, D.A. (1976). The patterns of spinal deformity in Duchenne muscular dystrophy. J. Bone Joint Surg. Am. 58, 24–32.
Wong, K.K., Maser, R.S., Bachoo, R.M., Menon, J., Carrasco, D.R., Gu, Y., Alt, F.W., and DePinho, R.A. (2003). Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ
homeostasis and accelerates ageing. Nature 421, 643–648.
Zatz, M., Rapaport, D., Vainzof, M., Passos-Bueno, M.R., Bortolini, E.R., Pavanello, Rde.C., and Peres, C.A. (1991). Serum creatine-kinase (CK) and pyruvate-kinase (PK) activities in
Duchenne (DMD) as compared with Becker (BMD) muscular dystrophy. J. Neurol. Sci. 102, 190–196.
13 Cell 143, 1–13, 23 декабря, 2010 года ª2010 Эльзевир Инк.
http://www.parentprojectmd.org/site/DocServer/Dec_10_MDX.pdf?docID=10441
Перевод осуществлён: www.mymio.org – мышечная дистрофия Дюшенна