МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

На правах рукописи
ПАНТЕЛЕЕВ Михаил Александрович
МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
03.01.02 - биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора физико-математических наук
Пущино — 2010
2
Работа выполнена в Гематологическом научном центре РАМН и
Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор
Фазоил Иноятович Атауллаханов
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Евгений Ильич Маевский
доктор физико-математических наук, профессор
Георгий Теодорович Гурия
доктор технических наук, профессор
Михаил Александрович Ханин
Ведущее учреждение:
Институт математических проблем биологии РАН
Защита состоится 24 марта 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании совета Д002.093.01 по
защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук
Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г.
Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу:
142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
Автореферат разослан "
" ______ 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат физико-математических наук
Н.Ф. Ланина
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Свертывание крови представляет собой сложную сеть
ферментативных реакций, основой которой служит каскад последовательно активирующих
друг друга сериновых протеиназ, охваченный многочисленными петлями положительных и
отрицательных обратных связей (Рис. 1). Его основная задача заключается в
предотвращении потери крови при повреждениях сосудистой системы.
Нарушения работы системы свертывания крови являются, прямо или косвенно,
лидирующей причиной смертности и инвалидности в современном мире. Их диагностика и
коррекция затруднены сложностью этого процесса, в котором задействованы десятки белков,
взаимодействующих в сотнях реакций друг с другом, с клетками крови и сосудистой
стенкой. Кроме того, свертывание крови является пространственно неоднородным
процессом, в котором большую роль играют диффузия реагентов и перенос их кровотоком.
Препятствием для создания более совершенных методов диагностики и терапии
свертывания оказывается плохое понимание его регуляции. В связи с этим представляется
актуальным изучение того, как устроена система свертывания крови, и каков вклад каждого
из ее компонентов в общую динамику процесса.
Рис. 1. Основные реакции плазменной системы свертывания крови. Реакции активации и
инактивации факторов свертывания показаны односторонними тонкими черными стрелками. При
этом фигурные стрелки показывают под действием каких именно ферментов происходит эта
активация или инактивация. Обратимые реакции формирования комплексов показаны
двусторонними тонкими черными стрелками. Чтобы избежать перегруженности, на схеме не
показаны: связывание тромбина с тромбомодулином, активация и секреция тромбоцитов,
контактная активация свертывания.
Еще на самых ранних этапах исследования свертывания появлялись гипотезы о
возможных причинах его каскадного устройства (Levine, Science 1966; 152: 651-653). В
последние десятилетия на пути к его пониманию было сделано несколько принципиальных
шагов. В основополагающих теоретических работах М.А. Ханина и сотрудников (J Theor
Biol 1989; 136: 127-134) показана роль положительных обратных связей в формировании
4
порогов в ферментативных каскадах. Другая их функция, регуляция пространственного
распространения свертывания, предложена в серии теоретических и экспериментальных
работ Ф.И. Атауллаханова и сотрудников (Биофизика 1994; 39: 97-106; Thromb Res 1996; 84:
333-344; Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 45-57). Третье возможное следствие наличия
положительных обратных связей, пороговый ответ по скорости кровотока, предсказывалось
Э. Белтрами и Дж. Джести (Math Biosci 2001; 172: 1-13).
Однако, до настоящего момента не предпринималось попыток целиком проанализировать
и понять структуру каскада свертывания, систематически и с единых позиций изучить
функции его частей. Кроме того, почти все перечисленные результаты предсказаны с
помощью сильно упрощенных математических моделей, и предсказания разных
исследователей во многом противоречат друг другу в зависимости от того, какие реакции
включались в такие модели. За редким исключением (Ovanesov et al, Biochim Biophys Acta
2002; 1572: 45-57), эти гипотезы не проверены на детальных моделях или в эксперименте.
Далее, арсенал современных методов системной биологии не содержит стандартных
способов анализа сетей реакций, подобных свертыванию. Существуют хорошо
разработанные подходы — такие, как анализ метаболического контроля или теория
биохимических систем, — для линейных, стационарных, точечных систем реакций. Однако,
методология исследования пространственно-неоднородных и нестационарных систем
разработана значительно хуже.
Таким образом, в настоящий момент существует актуальная проблема исследования
регуляции свертывания крови, решение которой осложняется отсутствием подходящих
системно-биологических подходов.
Цель работы: Выявление и анализ механизмов регуляции свертывания крови.
Задачи исследования:
1. Построение детальной математической модели свертывания крови.
2. Экспериментальное исследование кинетики отдельных реакций и блоков системы
свертывания для тестирования модели.
3. Выявление в каскаде свертывания крови функциональных подсистем и их ролей.
4. Применение полученных результатов к исследованию методов диагностики нарушений
свертывания и механизмов действия лекарственных препаратов.
Научная новизна. Разработана методика анализа сложных сетей биохимических реакций,
основанная на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в
комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе. Построена
математическая модель свертывания крови, превосходящая существующие аналоги
полнотой и корректностью описания биохимических реакций и успешно прошедшая
тестирование сравнением с большим набором экспериментальных данных. С их
использованием выявлен механизм и динамика порогового поведения системы свертывания
крови. Экспериментально показана новая роль фактора VIII в регуляции доставки субстрата
к ферменту в комплексе внутренней теназы. Впервые построена механизменная модель
мембранно-зависимой реакции, катализируемой комплексом внутренней теназы.
Обнаружена что петля положительной обратной связи, обусловленная активацией фактора V
тромбином, формирует триггерный ответ в системе свертывания. Выявлен механизм, с
помощью которого внутренняя теназа регулирует пространственную динамику свертывания
крови. Теоретически предсказана и экспериментально обнаружена локализация
пространственного роста тромба in vitro; показано, что она определяется путем протеина С.
5
Установлено преимущественное связывание компонентов внутренней теназы с малой
субпопуляцией, формирующейся при активации тромбоцитов. С помощью математического
моделирования выявлен новый режим регуляции внешнего пути ингибитором пути
тканевого фактора. С помощью теоретических и экспериментальных исследований влияния
препаратов Агемфил А, Коэйт DVI, НовоСэвен на динамику свертывания крови пациентов с
гемофилией А in vitro установлены зависимости их эффективности от дозы, выявлены
механизмы действия, предложены стратегии по оптимизации терапии. Показано, что в
системе свертывания крови могут быть идентифицированы шесть функциональных модулей
и соответствующих им физиологических задач, выполняемых системой.