На правах рукописи Воронков Дмитрий Николаевич
advertisement
На правах рукописи Воронков Дмитрий Николаевич МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НЕЙРОНОВ И НЕЙРОГЛИИ В НИГРОСТРИАТНЫХ ОБРАЗОВАНИЯХ МОЗГА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ДИСФУНКЦИИ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва — 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр неврологии» Российской академии медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук Худоерков Рудольф Михайлович Официальные оппоненты: Руководитель группы клеточных взаимодействий ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН доктор медицинских наук, профессор Бархина Татьяна Григорьевна Ведущий научный сотрудник лаборатории клинической нейроморфологии ФГБУ «Научный центр психического здоровья» РАМН доктор медицинских наук Востриков Виктор Михайлович Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России Защита диссертации состоится « ___ » ____________ 2013 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д.3 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН Автореферат разослан « ___ » ___________ 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Михайлова Лилия Петровна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования Дофамин как нейромедиатор участвует в обеспечении двигательных, эмоциональных и когнитивных процессов (Шуваев В.Т., Суворов Н.Ф., 2001, Wise R.A., 2009). Дофаминергические нейроны расположены в среднем мозге, обонятельных луковицах, гипоталамусе и перивентрикулярной области продолговатого мозга (Bjorklund A., Dunnet S., 2007). Проекции нейронов компактной части черной субстанции формируют нигростриатную связывающую черную субстанцию и стриатум, и систему, участвующую, преимущественно, в обеспечении двигательных функций (Базян А.С. и др., 2011). Дисфункции дофаминергической системы выявлены при неврологических и психиатрических заболеваний (Ещенко Н.Д., 2004), ряде что указывает на важность поддержания устойчивого уровня обмена дофамина в мозге, который обеспечивается взаимодействием многих процессов, обеспечивающих синтез медиатора, его хранение, высвобождение, обратный захват и катаболизм (Раевский К.С., 2003; Dunkley P.R., 2004). Среди патологий, связанных с дофаминергической системой, по медицинской и социальной значимости следует выделить болезнь Паркинсона, возникающую вследствие прогрессирующей гибели дофаминергических нейронов, в том числе, в черной субстанции (Крыжановский Г.Н., 2002; Jellinger K.A. 2012). Хотя нейрональные механизмы патогенеза паркинсонизма интенсивно исследуются (Moore D.J., 2005), взаимодействия нейронов и нейроглии при развитии этого заболевания изучены недостаточно. Вместе с тем, известно, что нейроглия, в особенности астроциты, активно взаимодействует с нейронами (Verkhartsky A., Butt A., 2007). При повреждении нервной ткани различными факторами астроциты пролиферируют, причем функциональное значение астроглиоза во многом неясно (Sofroniew M.V., 2010). На различных моделях повреждения черной субстанции и, отчасти, при патолого-анатомических исследованиях, показаны реактивные изменения астроцитов при паркинсонизме (Forno L.S. et al., 1992; Yokoyama H. et al., 2011). Нарушение функций астроцитов 4 может вызывать гибель нигральных нейронов (McGeer P.L., 2008). Однако, остается неизвестным, провоцирует ли развитие паркинсонизма активация глии, или только сопровождает течение заболевания. С другой стороны, обсуждается и нейропротективная роль глии при паркинсонизме (Rappold P.M., Tieu K., 2010). При этом, в литературе глио-нейрональные взаимодействия, как правило, рассматриваются в контексте токсического или защитного действия факторов, продуцируемых глиальными клетками, но значительно меньше внимания уделяется морфо-функциональным перестройкам в комплексе нейрон-глия, вызыванным дисфункцией дофаминовой системы. В то же время показано, что астроциты экспрессируют рецепторы нейромедиаторам, участвуют в их обмене и модулируют ко многим синаптическую и объемную нейротрансмиcсию (Verkhartsky A. et al., 2012). При этом, изменения глии в нигростриатных образованиях мозга при нарушениях обмена дофамина и её влияние на поддержание медиаторного баланса, описаны неполно, а исследования взаимоотношений астроглии и нейронов, выполненные на фармакологических моделях гипофункции нигростриатной системы, в литературе практически не представлены. Количественная оценка иммуноморфологических и нейрохимических показателей нейронов и нейроглии при моделировании дисфункции нигростриатной системы позволит выявить характер изменений и особенности их взаимодействия при нарушениях обмена дофамина. Цель работы: Изучить морфологические и нейрохимические изменения нейронов и нейроглии в нигростриатных образованиях мозга при моделировании дисфункции дофаминовой системы. Задачи исследования: 1. Воспроизвести модели дисфункции дофаминовой системы на крысах Вистар путем введения животным резерпина, галоперидола и L-дофа и модель одностороннего разрушения черной субстанции мозга нейротоксином 6-гидроксидофамином. 2. Изучить изменения морофометрических параметров различных 5 популяций нейронов и нейроглии, выявляемых иммуногистохимически, по локализации: а) тирозингидроксилазы – фермента синтеза дофамина; б) кислого глиофибриллярного белка – компонента цитоскелета астроцитов; в) глутаминсинтетазы – глиального фермента обмена глутамата; г) связывания растительного лектина Griffonia simplicifolia IB4 с клетками микроглии, в условиях экспериментальной дисфункции дофаминергической системы, 3. Спектрофотометрически определить изменения удельной активности ферментов, участвующих в обмене дофамина (тирозингидроксилаза и моноаминоксидаза Б) и глутамата (глутаминсинтетаза), в черной субстанции и хвостатом ядре мозга крыс Вистар при моделировании дисфункции дофаминовой системы. 4. Охарактеризовать особенности нейроморфологических и нейрохимических изменений, а также изменения в соотношении нейронов и нейроглии разных типов в нигростриатных образованиях мозга при дисфункции дофаминергической системы. Научная новизна исследования. Впервые продемонстрированы и сопоставлены количественные особенности иммуноморфологических и нейрохимических изменений глии и нейронов черной субстанции и хвостатого ядра при фармакологическом моделировании дисфункции дофаминергической системы и воспроизведении нейродегенерации черной субстанции. Впервые, путем количественного анализа структурно-функциональных изменений в нигростриатных образованиях мозга, показано, что нарушение дофаминергической передачи является одной из причин, приводящих к реактивным изменениям глиальных клеток. На резерпиновой модели дисфункции дофаминергической системы впервые показаны изменения удельной активности и экспрессии глутаминсинтетазы астроцитов хвостатого ядра, указывающие на их участие в модуляции активности кортикостриатной глутаматергической системы при нарушении обмена дофамина. Показано, что изменения обмена дофамина в нигростриатных 6 образованиях мозга, на использованных фармакологических моделях гипофункции дофаминовой системы, носят фазовый характер, что проявляется первичной активацией компенсаторных синтеза возможностей дофамина и последующим снижением нейронов, а возникающие при этом структурно-функциональные изменения астроглии являются проявлением перестройки глио-нейрональных взаимодействий. Научно-практическая значимость. Данные, полученные в настоящем исследовании могут служить основой для разработки методов фармакологической коррекции нарушений обмена дофамина, направленных на регуляцию функции глиальных клеток и нейронов. Результаты морфометрической оценки клеточного состава нигростриатных образований мозга крыс Вистар при нарушениях обмена дофамина, могут быть использованы при разработке экспериментальных моделей паркинсонизма. Внедрение в практику. Результаты исследования используются в учебном процессе кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, а также в лекционном курсе кафедр патологической физиологии и нормальной физиологии ФГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России. Положения выносимые на защиту: Снижение содержания дофамина в нигростриатной системе, воспроизводимое на экспериментальных моделях путем гибели дофаминовых нейронов или нарушением нейрональных механизмов его синтеза и высвобождения, вызывает активную реакцию разных типов глии, что приводит к перестройке глио-нейрональных взаимоотношений в черной субстанции и хвостатом ядре. Реакция астроцитов хвостатого ядра на моделируемую дисфункцию дофаминовой системы отличается наибольшей активностью, что связано с нарушением обмена нейромедиаторов и, в первую очередь, с изменением регуляции астроцитами взаимодействия дофаминергической и глутаматергической систем. 7 Апробация работы Основные положения и материалы диссертации были доложены и обсуждены на Всероссийских и международных конференциях «Структурнофункциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2007), «Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии и нейропластичности» (Москва, 2008), «XIII международный конгресс по гистохимии и цитохимии» (Гданьск, 2008), «Современные методы микроскопии в биологии и медицине» (С.-Петербург, 2009), «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (С.-Петербург, 2010), «II Национальный конгресс по болезни Паркинсона и расстройствам движений» (Москва, 2011), а также на ежегодных конференциях молодых ученых ФГБУ «НЦН» РАМН ( Москва, 2010, 2011, 2012), на расширенном заседании отдела исследований мозга ФГБУ «НЦН» РАМН (апрель 2012 года). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ в отечественных и зарубежных изданиях, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, иллюстрирована 11 рисунками. Список литературы включает 337 источников, из них 59 русскоязычных. 8 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Экспериментальные животные и план эксперимента. Исследование проводили на 106 крысах Вистар (самцах, массой 180–220г), полученных из питомника «Столбовая». При работе соблюдали “Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных” (приказ Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г.). Стереотаксические операции проводили под нембуталовым наркозом, для взятия материала животных декапитировали под эфирным наркозом при помощи гильотины. Проведение эксперимента было одобрено биоэтической комиссией ФГБУ «НЦН» РАМН (протокол N09/10 от 19.08.2010). В работе использовали следующие модели дисфункции дофаминергической системы : 1) дегенерацию дофаминовых нейронов при одностороннем стереотаксическом введении 6-гидроксидофамина (6-OHDA, 6 мкг) в черную субстанцию правого полушария (AP=4,2; V=1,9; L=7,0), в левое полушарие вводили только растворитель – 0,05% аскорбиновую кислоту; 2) подавление везикулярного транспорта дофамина под действием резерпина (блокада белка VMAT2); 1,5 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно и длительно (2 недели, ежедневно); 3) блокада дофаминовых D2 рецепторов галоперидолом; 0,5 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно и длительно (2 недели, ежедневно); 4) перегрузка дофаминергической системы путем введения экзогенного L-дофа; 50 мг/кг (в сочетании с бенсеразидом 12,5 мг/кг), внутрибрюшинно, однократно и длительно (4 недели, ежедневно). Всего было выделено 8 экспериментальных групп. В качестве контрольных групп использовали интактных животных (контроль к модели нейродегенерации) или получавших 0,9% NaCl внутрибрюшинно. Методы иммуноморфологического и гистохимического исследования. Исследование проводили на животных длительно получавших резерпин, галоперидол, L-дофа и при введении 6-OHDA. Головной мозг фиксировали в жидкости Карнуа, исследования проводили на серийных фронтальных 9 парафиновых срезах (микротом Leica SR-2000), толщиной 7 мкм, на уровне черной субстанции и хвостатого ядра мозга. В работе применяли следующие иммуногистохимические гистохимические методы: дофаминовые нейроны и их отростки выявляли помощью моноклональных антител к тирозингидроксилазе и с (Sigma), астроцитарную нейроглию – с помощью антител к кислому глиофибриллярному белку GFAP (Sigma), глутаминсинтетазу в клетках астроцитарной нейроглии локализовали при помощи моноклональных антител (Sigma). Микроглию выявляли гистохимическим методом (Rhodes, 1997) по связыванию с биотинилированным лектином IB4 (изолектин B4 Griffonia simplicifolia, Sigma). Препараты окрашивали авидин-пероксидазным методом, для визуализации применяли 3,3-диаминобензидин. Для каждой серии препаратов использовали негативный контроль. Часть препаратов, окрашенных на тирозингидроксилазу и кислый глиофибриллярный белок, подкрашивали крезиловым фиолетовым, для выявления нейронов и глиальных клеток, не содержащих GFAP. Методы морфометрии. Из каждой экспериментальной группы были отобраны срезы мозга на уровне хвостатого ядра и черной субстанции от 6 животных. Количественный анализ микропрепаратов (Худоерков Р.М., Воронков Д.Н. 2010) проводили при помощи микроскопа Leica DMLB, оснащенного системой анализа изображений Leica Qwin и цифровой фотокамерой Leica DC-300 (3,2 Мпкс). При оценке плотности распределения клеточных элементов в каждой экспериментальной группе изучали не меньше 8 срезов с каждого мозга и исследовали не меньше 120 полей зрения (0,022 мм2) на уровне черной субстанции или хвостатого ядра. Размеры нейронов и ядер глиоцитов оценивали на выборках, включающих не менее 500 клеток. Интенсивность окрашивания оценивали в условных единицах (градации яркости, 8 бит). Исследование активности ферментов обмена медиаторов. Исследование проводили на животных однократно и длительно получавших резерпин, галоперидол и L-дофа. Животных декапитировали через 60 минут после последней инъекции. Каждая группа состояла из 8 животных. 10 Удельную активность ферментов исследовали спектрофотометрически (Gilford 250, LKB Ultrospec II), в субклеточных фракциях ткани хвостатых ядер и черной субстанции головного мозга, изолированных методом дифференциального центрифугирования (Ещенко Н.Д., 2004). В митохондриальной фракции (10000g, центрифуга К-70, 20 мин, t = -10ºС) определяли активность моноаминоксидазы Б (МАО Б, КФ 1.4.3.4), используя субстрат п-нитрофенилэтиламин (Горкин В.З., 1967; Li M. et al., 2006), а в супернатанте – активность глутаминсинтетазы (GlnS, КФ 6.3.1.2) по образованию γ-глутамилгидроксамата (Boksha I.S. et al., 2000). Активность тирозингидроксилазы (ТирГд, КФ 1.14.16.2) исследовали в цитоплазматической фракции (20000g, Beckman L8-70, t=0ºС, 15 мин) по окислению метилтетрагидроптерина (Минеева-Вялых М.Ф., 1976). Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури (Lowry O.H, 1951). Удельную активность ферментов вычисляли как отношение между разностью оптической плотности для контрольной и опытной проб, определяемой за единицу времени, к концентрации общего белка в исследуемой фракции (Доведова Е.Л., 2008). Контрольные пробы содержали исследуемую субфракцию и реакционную смесь без субстрата. Статистический анализ данных. Статистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.0. Выборки проверяли на нормальность распределения и проводили однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), о различиях между группами судили по апостериорному тесту Фишера. выборок с отклонением непараметрический тест от нормального Манна-Уитни. распределения Различия при Для использовали p<0,05 считали статистически значимыми. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Морфохимические изменения в нигростриатной системе мозга при гибели дофаминовых нейронов черной субстанции под действием 6-гидроксидофамина При стереотаксическом введении 6-OHDA в черную субстанцию правого полушария мозга, на четвертой неделе эксперимента наблюдали гибель 11 дофаминовых нейронов на стороне введения. В компактной части черной субстанции на стороне поражения число и размеры ТирГд-позитивных нейронов были значимо снижены, а в хвостатом ядре правого полушария резко уменьшалась интенсивность окрашивания на ТирГд, по сравнению с интактным контролем (Рис. 1, 2). В контралатеральном полушарии эти показатели не отличались от контроля. Дегенерация дофаминовых нейронов сопровождалась активацией клеток глии на всем рострокаудальном протяжении черной субстанции правого полушария (Рис. 1, 2, 3, 4). По сравнению с контролем плотность распределения суммарной нейроглии в черной субстанции увеличивалась вдвое на стороне введения 6-OHDA, а на противоположной стороне – лишь на 12%. Больше всего в черной субстанции увеличивалось число астроцитов. По сравнению с контролем их число возрастало на 69% на стороне введения нейротоксина, а на противоположной стороне – на 38%. Изменения астроцитов характеризовались усилением экспрессии GFAP, гипертрофией их тел, изменениями формы клеток и деформацией отростков. Плотность глиальных клеток, не содержащих GFAP, на стороне введения нейротоксина значимо возрастала на 122% по сравнению контролем, а в противоположном полушарии она не менялась. Эти изменения были преимущественно связаны с активацией микроглии, выявляемой на стороне поражения, при окрашивании лектином IB4, в виде клеток амебоидной формы, образующих розетки вокруг погибших дофаминергических нейронов. При этом интенсивность окрашивания лектином была значимо выше на стороне введения 6-OHDA (Рис. 3В), что свидетельствует об увеличении количества активированной микроглии и усилении гликозилирования ее мембранных белков. Разрушение черной субстанции не влияло на плотность и размеры нейронов хвостатого ядра. При этом, в хвостатом ядре обоих полушарий наблюдали реактивные изменения нейроглии, в большей степени выраженные на стороне введения нейротоксина (Рис. 1). 12 Рис. 1. Изменения плотности распределения нейронов и нейроглии в черной субстанции и хвостатом ядре мозга крыс при одностороннем интранигральном введении нейротоксина 6-OHDA. Примечание: Показатели экспериментальной группы через 4 недели после стереотаксического интранигрального введения 6 мкг 6-OHDA. К – контроль; ЛП – левое полушарие, внутренний контроль – сторона введения растворителя (3 мкл 0,05% аскорбиновой кислоты); 6-OHDA – правое полушарие, сторона введения нейротоксина; ТирГд+ – нейроны, содержащие тирозингидроксилазу; GFAP+ – астроциты, содержащие GFAP; GFAP- – глиальные клетки не содержащие GFAP; Σ глия – суммарная (общая) глия. Данные представлены в виде M±m, где M – среднее число клеток на поле зрения микроскопа (0,022 мм2), m – стандартная ошибка среднего. * – статистически значимые отличия от интактного контроля, ** – статистически значимые отличия от активного контроля (p<0,05, ANOVA, апостериорный тест Фишера). 13 А Б В Рис. 2. Иммуногистохимическое выявление тирозингидроксилазы в компактной части черной субстанции, при одностороннем интранигральном введении 6-гидроксидофамина. Примечание: А – активный контроль, Б – сторона введения нейротоксина; В – изменения интенсивности окрашивания (% от иинтактного контроля) на тирозингидроксилазу в черной субстанции. ЛП – левое полушарие, 6-OHDA – сторона введения нейротоксина. * – p<0,05 по сравнению с контролем, тест Манна-Уитни А Б В Рис. 3. Окрашивание клеток микроглии лектином IB4 в черной субстанции при одностороннем интранигральном введении 6-гидроксидофамина. Примечание: А, Б – как на Рис. 2 В – интенсивность окрашивания (% от контроля) лектином IB4 в черной субстанции, обозначения как на Рис. 2. А Б Рис. 4. Иммуногистохимическое выявление GFAP в черной субстанции мозга крыс, при интранигральном стереотаксическом введении 6-OHDA. Примечание: А, Б – как на Рис. 2 14 На стороне введения нейротоксина (Рис. 1), по сравнению с контролем, статистически значимо увеличивалась плотность распределения астроцитов (на 50%), и в меньшей степени – глиоцитов, не экспрессирующих GFAP (на 25%). В хвостатом ядре левого полушария, реакция глии были выражена в меньшей степени: плотность распределения астроцитов возрастала на 20% от контроля, а плотность глии, не содержавшей GFAP, не менялась. В хвостатом ядре, на стороне введения 6-OHDA отмечали усиление окрашивания GFAP и увеличение числа выявляемых отростков астроцитов, хотя изменения формы астроцитов и их отростков были менее выражены Реакция астроглии также по сравнению с черной субстанцией. сопровождалась статистически значимым увеличением размеров ядер клеток. Таким образом, введение 6-OHDA в черную субстанцию практически полностью разрушает дофаминергические нейроны в компактной части этой структуры на стороне введения. Результаты эксперимента с интранигральным введением нейротоксина 6-OHDA, показывают, что дегенерация дофаминовых нейронов сопровождается активацией глиальных клеток как черной субстанции, так и хвостатого ядра, причем на стороне введения нейротоксина изменения нейроглии проявляются более интенсивно, чем в контралатеральном полушарии. При этом, в хвостатом ядре наиболее выраженной была реакция GFAP-позитивных астроцитов, по сравнению с другими глиальными популяциями. 2. Морфофункциональные изменения нейронов черной субстанции при фармакологическом моделировании дисфункции дофаминергической системы При фармакологическом моделировании дисфункции дофаминовой системы в черной субстанции оценивали размеры и число нейронов, содержащих тирозингидроксилазу (Рис. 5). При длительном введении резерпина и L-дофа плотность дофаминергических нейронов в черной субстанции не менялась, однако, длительное введение галоперидола, статистически значимо снижало их число на 16% по сравнению с контролем. 15 Рис. 5 Изменения размеров и числа дофаминергических нейронов в черной субстанции при фармакологически моделируемой дисфункции дофаминергической системы. Примечание: Введение препаратов L-дофа: 4 недели, 50 мг/кг; резерпин: 2 недели, 2,5 мг/кг; галоперидол: 2 недели, 0,5 мг/кг. Результаты представлены в процентах по отношению к контролю. * – p<0,05 по сравнению с контролем. резерпин галоперидол L-дофа Рис. 6. Изменения удельной активности тирозингидроксилазы в нигростриатной системе относительно контроля при однократном и длительном введении резерпина, галоперидола и L-дофа. Примечание: сплошная линия (—) изменения в хвостатом ядре, пунктиром (- -) в черной субстанции; К – животные получавшие 0,9% раствор NaCl, 60 мин – однократное введение; 14 дн, 28 дн – ежедневное введение препарата, дни. * – p<0,05 , ** – p<0,07 по сравнению с контролем; # – p<0,05 по сравнению с однократным введением (ANOVA, апостериорный тест Фишера) 16 Длительное нарушение обмена дофамина на исследуемых моделях статистически значимо снижало размеры дофаминовых нейронов черной субстанции. По сравнению с контролем (средняя площадь профильного поля нейронов в контроле 279 мкм2) длительно вводимый резерпин уменьшал площадь профильного поля нейронов на 12%, галоперидол – на 23%, а препарат L-дофа – на 31% (Рис. 5). Исследование удельной активности тирозингидроксилазы при однократном и длительном введении препаратов выявило статистически значимые изменения как при однократном, так и при длительном введении препаратов (Рис. 6). На разных сроках действия резерпина и галоперидола изменения активности тирозингидроксилазы отличались своей направленностью – удельная активность фермента вначале возрастала, а затем уменьшалась, то есть, первичное усиление обмена дофамина при краткосрочном воздействии, сменялось его подавлением при длительном введении нейролептиков. Действие L-дофа оказывало обратный эффект – при однократном его введении активность тирозингидроксилазы в хвостатом ядре снижалась, а при длительном – отмечалась тенденция к ее возрастанию. Таким образом, изменения активности тирозингидроксилазы в нигростриатных образованиях мозга носили фазовый характер в зависимости от продолжительности воздействия препаратов резерпина, галоперидола и L-дофа, воздействующих на разные звенья функционирования дофаминергической системы. 3. Морфо-функциональные изменения глиальных клеток хвостатого ядра при нарушении везикулярного транспорта дофамина резерпином и при блокаде D2 рецепторов галоперидолом Следующий этап нашего исследования был направлен на выяснение особенностей реакции нейроглии хвостатого ядра в ответ на избирательное нарушение отдельных этапов дофаминергической передачи резерпином (блокада белка VMAT2) и галоперидолом (блокада D2 рецепторов). Размеры нейронов хвостатого ядра и плотность их распределения при 17 длительном введении резерпина и галоперидола значимо не менялись. При этом общая плотность глии в хвостатом ядре крыс, длительно получавших как резерпин, так и галоперидол, возрастала в равной степени, но ее увеличение под влиянием резерпина и галоперидола происходило за счет разных глиальных популяций (Рис. 7). По сравнению с контролем, число GFAP-позитивных астроцитов в хвостатом ядре животных, длительно получавших резерпин, значимо увеличивалась на 49%, а число прочей глии не менялось. Длительное введение галоперидола не влияло на плотность распределения астроцитарной глии, но статистически значимо увеличивало (на 15%) плотность GFAP-негативной глии, вероятно, за счет олигодендроглии. Рис. 7. Изменения плотности распределения глиальных популяций в хвостатом ядре при длительном воздействии резерпина и галоперидола Примечание: Показатели экспериментальных групп через 2 недели после ежедневного введения резерпина (1,5 мг/кг) и галоперидола (0,5мг/кг). К – контроль; Рез – введение резерпина (1,5 мг/кг; 2 недели, ежедневно); Гал – введение галоперидола (0,5 мг/кг; 2 недели, ежедневно); GlnS+ – астроциты, содержащие глутаминсинтетазу в отростках; Остальные обозначения как на Рис. 1 Данные представлены в виде M±m, где M – среднее число клеток на поле зрения микроскопа (0,022 мм2), m – стандартная ошибка среднего. * – статистически значимые отличия от интактного контроля, ** – статистически значимые отличия от активного контроля (p<0,05, ANOVA, апостериорный тест Фишера). 18 КОНТРОЛЬ РЕЗЕРПИН GFAP GlnS Рис. 8. Иммуногистохимическое выявление кислого глиофибриллярного белка (GFAP) и глутаминсинтетазы (GlnS) в хвостатом ядре контрольных животных и длительно получавших резерпин. МАО Б резерпин Глутаминсинтетаза галоперидол Рис. 9. Изменения удельной активности (% от контроля) МАО Б и глутаминсинтетазы при введении резерпина и галоперидола. Примечание: Изменения удельной активности МАО Б в хвостатом ядре обозначены сплошной линией (—), в черной субстанции пунктиром (- -); Изменения глутаминсинтетазы в хвостатом ядре при длительном введении резерпина (штриховка) и галоперидола (серый столбик). Остальные обозначения как на Рис.6 19 Поскольку резерпин не вызывал гибели нейронов, обнаруженная реакция астроглии в хвостатом ядре, очевидно, связана с нарушением медиаторного баланса. Чтобы подтвердить предположение об активной роли астроцитов при дофаминергической дисфункции и выяснить особенности функциональных изменений, связанных с обменом медиаторов, мы оценивали изменения ферментов МАО Б и глутаминсинтетазы. У интактных животных глутаминсинтетаза в хвостатом ядре локализовалась в цитоплазме и отростках астроцитов, при этом, число выявляемых астроцитов было выше, по сравнению с числом GFAP-позитивной глии (Рис 7,8). Резерпин снижал интенсивность окрашивания на глутаминсинтетазу в отростках астроцитов. По сравнению с контролем, в хвостатом ядре животных, длительно получавших резерпин, число астроцитов, содержащих глутаминсинтетазу в отростках, снижалось на 23%, тогда как галоперидол не менял их плотность распределения. Удельная активность глутаминсинтетазы хвостатого ядра статистически значимо снижалась (на 14% от контроля) под действием резерпина, тогда как галоперидол не влиял на активность фермента (Рис. 9). Как резерпин, так и галоперидол при длительном введении значимо подавляли активность МАО Б в нигростриатной системе, по сравнению с однократным введением (Рис. 9). Однако, при длительном введении резерпина уменьшение удельной активности МАО Б хвостатого ядра было выражено в большей степени (снижение на 30% от контроля), тогда как при длительном введении галоперидола активность фермента снижалась лишь до контрольных значений. Следовательно, длительная блокада D2 рецепторов галоперидолом не вызывала значимых изменений исследуемых показателей астроцитарной глии в хвостатом ядре, тогда как нарушение высвобождения и хранения медиатора под действием резерпина, приводило к увеличению количества астроцитов, но выраженному подавлению активности МАО Б, активности глутаминсинтетазы. снижению экспрессии и 20 ОБСУЖДЕНИЕ Результаты исследования показали, что при дисфункции дофаминергической системы, первичным ответом является компенсаторное изменение синтеза медиатора в телах нейронов и их отростках. Известно, что регуляция активности поддерживающих ферментных баланс систем медиаторов в – один из механизмов, нигростриатных структурах (Базян А.С., 2006). В частности, регуляция синтеза дофамина, обеспечивается в том числе изменениями экспрессии тирозингидроксилазы, стабильности ее мРНК, фосфорилированием фермента (Tokuoka Н. et al., 2011; Daubner S.C., 2011). Активация синтеза дофамина при однократном введении резерпина и галоперидола в нашем эксперименте, по-видимому, опосредована снижением активации D2 ауторецепторов и увеличением фосфорилирования тирозингидроксилазы (Hakansson K. et al., 2004). Однократное введение L-дофа, очевидно, вызывало обратные изменения. Разная степень увеличения активности тирозингидроксилазы в черной субстанции и хвостатом ядре при введении галоперидола, отражает особенности регуляции синтеза дофамина в телах и отростках нейронов, что также отмечено в литературе (Угрюмов М.В., 2010; Salvatore M.F., Pruett B.S., 2012). В отличие от первичной компенсаторной активации синтеза дофамина, при длительном введении исследуемых препаратов наблюдали снижение активности тирозингидроксилазы и уменьшение размеров дофаминовых нейронов черной субстанции, что вызвано снижением их компенсаторных возможностей и нарастающей дизрегуляцией обмена дофамина. Кроме того, в эксперименте с галоперидолом была выявлена гибель нигральных нейронов, что дополняет исследования, демонстрирующие его возможное нейротоксическое действие (Mazurek M.F. et al, 1998; Reynolds K.B. et al., 2011). На начальных сроках моделируемой дисфункции, наблюдали активацию катаболизма дофамина, что отражает общее увеличение оборота медиатора (Доведова Е.Л. и др., 2008). В то же время, длительное введение как галоперидола, так и резерпина приводило к снижению активности МАО Б в 21 нигростриатной системе в целом, что подтверждается литературными данными (Chertkow Y. et al., 2007) и может рассматриваться как компенсаторная реакция, направленная на поддержание внеклеточного уровня дофамина. Предполагается, что у крыс участие МАО Б в катаболизме дофамина в черной субстанции выше, чем в стриатуме (Gesi M. et al., 2001), что согласуется с результатами нашего эксперимента с резерпином, в котором активность фермента вначале снижалась в черной субстанции и лишь при длительном введении препарата – в хвостатом ядре. Важно, что астроциты способны захватывать дофамин (Inazu M. et al., 2003), а МАО Б обнаруживается в хвостатом ядре преимущественно в клетках астроглии (Westlund K.N. et al., 1988; Ekblom J. et al., 1993). Следовательно, полученные результаты позволяют предположить, что астроциты при гипофункции дофаминергической системы поддерживают внеклеточную концентрацию дофамина, регулируя его катаболизм. Нейротоксин 6-OHDA избирательно повреждающий дофаминовые нейроны, широко используется при моделировании паркинсонизма (Буреш Я. и др., 1991; Grealish S. et al., 2010). Дегенерация дофаминовых нейронов черной субстанции вызывала активацию глиальных популяций в нигростриатной системе. Действительно, ранее неоднократно отмечалось, что 6-OHDA вызывает усиленную пролиферацию астроцитов и NG2-позитивной глии (Wachter B. et al., 2010). Известно, что астроглиоз является типичным ответом на повреждение ткани мозга токсинами (Sofroniew M.V., 2010), и сопровождается активацией микроглии (Berry M., Logan A., 1999), что подтверждает результаты проведенного нами исследования. Очевидно, что развитие глиоза в черной субстанции под действием 6-OHDA связано с гибелью нейронов, нарушением структуры нервной ткани и направлено на ее перестройку и изоляцию области локального повреждения. В то же время, наблюдаемая в хвостатом ядре реакция астроцитарной глии, по-видимому, носит функционально иное значение, что подтверждается менее резкими изменениями астроглии и данными литературы, указывающими на их транзиторный характер (Stanic D. et al., 2004). Это предположение дополняет 22 ряд исследований – отмечено, что гипертрофия отростков астроцитов может быть направлена на увеличение числа «обслуживаемых» ими нейронов (Wilhelmsson U. et al., 2006; Villalba R.M., Smith Y., 2011). Увеличение плотности астроцитов в хвостатом ядре, может происходить за счет разных источников: миграции из перивентрикулярной зоны, дифференцировки не экспрессирущих GFAP глиоцитов, пролиферации астроцитов (Wachter B. et al., 2010). Эксперимент с резерпином показал, что при нарушении обмена дофамина наиболее активно реагируют астроциты, а причиной развития астроглиоза в нигростриатной системе может служить снижение дофаминергической передачи. Данные литературы указывают, что астроциты имеют рецепторы к дофамину (Zanassi P. et al., 1999; Khan Z.U. et al., 2001) и изменения его внеклеточной концентрации напрямую влияют на их пролиферацию и дифференцировку (Luo X. et al., 2009; Kim Y. et al., 2010). При этом, в экспериментах с разрушением черной субстанции и с введением резерпина мы обнаружили реактивные изменения астроглии, тогда как введение галоперидола их не вызывало, следовательно, реакция астроцитов зависит в том числе, от вовлеченного типа дофаминовых рецепторов. Эти результаты согласуются с исследованиями, в которых блокада D2 рецепторов галоперидолом не влияла на уровень кальция в астроцитах, в отличие от действия других нейролептиков, отличающихся меньшей рецепторной специфичностью (Quincozes-Santos A. et al., 2010). В то же время, длительное введение галоперидола увеличивало плотность других глиальных популяций, что дополняет данные о влиянии дофамина на процессы дифференцировки олигодендроглиоцитов и их пролиферацию (Wang H. et al., 2010). Известно, что дофамин модулирует активность кортикостриатной глутаматергической системы (Bamford N.S. et al., 2004), также показана активная роль астроглии в глутаматергической нейротрансмиссии (Araque A. et al., 1999). Проведенное исследование выявило снижение экспрессии и активности астроцитарного фермента глутамин-глутаматного цикла, глутаминсинтетазы, под действием резерпина, что указывает на участие астроцитов в регуляции 23 обмена глутамата при дисфункции дофаминергической системы. Обнаруженное нами снижение активности глутаминсинтетазы может быть причиной повышения содержания внеклеточного глутамата в стриатуме, отмеченного в литературе при повреждении нигростриатного пути (Таланов С.А. и др., 2006) и дополняет данные о снижении экспрессии транспортера и рецепторов глутамата астроцитами хвостатого ядра при разрушении черной субстанции (Chung E.K. et al., 2008). Кроме того, обнаружено, что снижение экспрессии глутаминсинтетазы усиливает миграцию астроцитов (Zou J. et al., 2011), что указывает на связь между снижением активности этого фермента и развитием астроглиоза в нашем эксперименте. Следовательно, морфо-функциональные изменения астроцитов при дисфункции дофаминергической системы медиаторных систем хвостатого ядра. работами, демонстрирующими, что влияют на взаимодействие Это предположение согласуется с изменения отростков астроцитов, окружающих глутаматергические синапсы в хвостатом ядре, могут служить структурной основой глио-нейрональной пластичности при паркинсонизме (Smith Y. et al., 2009). Обобщая полученные результаты и данные литературы, можно заключить, что реактивные изменения глиальных клеток при экспериментальной дисфункции дофаминергической системы происходят под действием ряда факторов: нейродегенерации в черной субстанции, снижения дофаминергической передачи и нарушения баланса между активностью кортикостриатной и нигростриатной системы. Таким образом, проведенное исследование показало, что нарушение компенсаторных возможностей дофаминовых нейронов при дисфункции дофаминергической изменениями системы нейроглии, в сопровождается особенности – перестройку глио-нейрональных отношений взаимодействие медиаторных систем стриатума. морфо-функциональными астроцитов, что вызывает и оказывает влияние на 24 ВЫВОДЫ 1. Дегенерация дофаминовых нейронов черной субстанции приводит к развитию глиоза не только непосредственно в области повреждения, но и к увеличению плотности распределения нейроглии в хвостатом ядре, функционально связанном с черной субстанцией. 2. Плотность распределения глиальных клеток при моделировании дисфункции дофаминергической системы увеличивается за счет разных популяций (астроцитов, олигодендроглиоцитов и микроглии), причем их количественное соотношение меняется в зависимости от характера экспериментального воздействия. 3. Астроциты по сравнению с другими глиальными клетками наиболее активно реагируют на дисфункцию нигростриатной системы, как при гибели дофаминовых нейронов, так и при нарушении везикулярного транспорта дофамина, что проявляется их гипертрофией, пролиферацией и увеличением экспрессии GFAP. 4. Перестройка глио-нейрональных взаимодействий в хвостатом ядре мозга, возникающая при нарушении дофаминергической передачи под действием резерпина затрагивает функции астроцитов, связанные с регуляцией обмена медиаторов, что проявляется в снижении активности ферментов обмена дофамина (моноаминоксидазы Б) и глутамата (глутаминсинтетазы). 5. Дисфункция гипофункции дофаминергической (введение животным системы, воспроизводимая резерпина и в виде галоперидола) или гиперфункции (введение L-дофа) характеризуется фазовыми изменениями удельной активности тирозингидроксилазы и моноаминоксидазы Б, участвующих соответственно в синтезе и катаболизме дофамина. 6. Первичная реакция дофаминовых нейронов черной субстанции на моделируемую гипофункцию – это компенсаторная активация синтеза дофамина, которая в дальнейшем сменяется снижением активности тирозингидроксилазы и уменьшением размеров нейронов, что отражает снижение их компенсаторных возможностей. 25 СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Худоерков Р. М., Доведова Е. Л., Воронков Д. Н. Структурно-функциональные и биохимические изменения, возникающие в мозге крыс при моделировании дисфункции дофаминовой системы // Бюл. эксп. биол. и мед.–2007.– Т.144, №7.– С. 39-41. 2. Доведова Е. Л., Воронков Д. Н., Худоерков Р. М. Краткосрочное воздействие галоперидола и резерпина на обмен дофамина в нигростриарной системе мозга крыс // Бюл. эксп. биол. и мед.– 2010.–Т. 150, №8.–C. 151-154. 3. Воронков Д. Н., Доведова Е. Л., Худоерков Р. М. Особенности взаимодействия нейромедиаторных систем в нигростриатных образованиях мозга крыс при длительном введении резерпина и галоперидола // Нейрохимия.– 2012.– Т. 29, №2.–С. 134–138. 4. Худоерков Р. М., Воронков Д. Н., Ямщикова Н. Г. Иммуногистохимические и морфологические изменения нейронов и нейроглии в нигростриарных структурах мозга при моделировании нейродегенерации черной субстанции // Бюл. эксп. биол. и мед.–2012.– Т. 153, №6.–C. 876-880. 5. Худоерков Р. М., Воронков Д. Н. Влияние длительного введения L-дофа на морфометрические показатели нейронов и нейроглии в нигростриарных образованиях мозга крыс Вистар // Мат-лы конф. "Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга".– М.:Икар, 2007.– С. 665-670. 6. Худоерков Р. М., Доведова Е. Л., Хрусталев Д. А., Воронков Д. Н. Особенности влияния амфетамина и леводопа на показатели обмена дофамина в структурах мозга крыс Вистар // Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга: Тез. докл. конф. с междунар. участием.– СПб.Колтуши, 2008.– С. 154-155. 7. Khudoerkov R., Voronkov D. Immunohistochemical changes of tyrosine hydroxylase expression in substantia nigra and VTA rat brain nuclei under dopaminergic hyperfunction // Folia Histochemica et Cytobiologica.–2008.–Vol.46, Suppl.2.– P. 109. 8. Худоерков Р. М., Воронков Д. Н. Особенности иммуногистохимических изменений тирозингидроксилазы в дофаминергических структурах среднего мозга крыс Вистар при моделировании гипер- и гипофункции обмена дофамина // В сб.: "Актуальные вопросы функциональной межполушарной асимметрии и нейропластичности".– М.:"Научный мир", 2008.– С. 652-55. 9. Воронков Д.Н, Худоерков Р. М., Доведова Е. Л. Влияние краткосрочного введения резерпина на тирозингидроксилазу дофаминергических структур среднего мозга крысы // Мат-лы III Межд.конф. "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины" г.Ростов-на-Дону .– Ростов н/Д.: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2009 .– C. 77-78. 10. Воронков Д. Н., Худоерков Р. М., Доведова Е. Л. Особенности длительного воздействия галоперидола и резерпина на медиаторный обмен в хвостатом ядре // ХХI Съезд Физиологического общества им. И. П. Павлова. Тез. докл.– М.–Калуга: Типография ООО "БЭСТ-принт", 2010.– С. 128-129. 11. Доведова Е. Л., Воронков Д. Н. Сравнительная характеристика ферментных систем метаболизма биогенных аминов в различные сроки введения галоперидола и резерпина как отражение морфо-химической пластичности мозга // Мат-лы конф.: 26 "Современные направления исследований функциональной межполушарной асимметрии и пластичности мозга".– М.:Научный мир, 2010.– С. 364-367. 12. Худоерков Р. М., Воронков Д. Н., Сивухин А. А., Ставровская А. В., Брыксина З. Г. Особенности морфохимических изменений нейронов и нейроглии хвостатого ядра при моделировании нейродегенерации черной субстанции // Мат-лы конф.: "Современные направления исследований функциональной межполушарной асимметрии и пластичности мозга".– М.:Научный мир, 2010.– С.511-515. 13. Воронков Д. Н., Сивухин А. А. Изменения нейроглии хвостатого ядра при экспериментальном разрушении черной субстанции // Медицинский академический журнал.– 2010.– Т10, №5.– C. 118. 14. Воронков Д. Н., Худоерков Р. М. Иммуногистохимическое исследование реакций астроцитов и микроглии при экспериментальной нейродегенерации черной субстанции мозга крысы // В сб.: Болезнь Паркинсона и расстройства движений.– М.:2011.– C. 377-378. 15. Худоерков Р. М., Воронков Д. Н., Шугалев Н. П. Особенности морфохимических изменений нейронов и глии при моделировании гипофункции дофаминовой системы // В сб.: Болезнь Паркинсона и расстройства движений .– М.:2011.– C.164-68. 16. Воронков Д. Н.,Худоерков Р. М. Анализ пространственного распределения разных типов нейроглии в хвостатом ядре мозга крысы // Мат-лы V Всерос. науч-практ. конф. "Цитоморфометрия в медицине и биологии".– М.: 2012.– C.22-24. ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 6-OHDA МАО Б п.з. ТирГд GFAP GlnS IB4 VMAT2 – – – – – – – – 6-гидроксидофамин моноаминоксидаза Б поле зрения микроскопа тирозингидроксилаза кислый глиофибриллярный белок глутаминсинтетаза растительный изолектин B4 из Griffonia simplicifolia везикулярный транспортер моноаминов
