Основные аспекты регуляции лептином и грелином клеток
advertisement
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук На правах рукописи Орлова Екатерина Григорьевна ОСНОВНЫЕ АСПЕКТЫ РЕГУЛЯЦИИ ЛЕПТИНОМ И ГРЕЛИНОМ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: Ширшев Сергей Викторович заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Пермь – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. Введение 5 Глава 1. Иммуномодулирующие эффекты лептина и грелина в регуляции основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета 14 (обзор литературы) 1.1. Роль лептина в регуляции клеток врожденного и адаптивного иммунитета 1.1.1. Молекулярные 14 механизмы регуляция лептином функциональной активности моноцитов 1.1.2. Молекулярные механизмы 21 регуляция лептином функциональной активности лимфоцитов 32 1.2. Регуляция грелином функциональной активности основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета 40 1.3. Роль лептина и грелина в контроле репродуктивных процессов 51 1.4. Механизмы формирования иммунной толерантности при физиологически протекающей беременности 55 Глава 2. Материалы и методы исследования 61 2.1. Дизайн исследования 61 2.2. Объекты исследования 64 2.3. Биологически активные вещества 65 2.4. Оценка фагоцитарной активности моноцитов 66 2.5. Оценка окислительной активности моноцитов в реакции 68 люминолзависимой хемилюминесценции 2.6. Определение продукции NO моноцитами 69 2.7. Изучение активности секреторной миелопероксидазы моноцитов 69 2.8. Изучение активности эластазы моноцитов 70 2.9. Определение активности катепсина G моноцитов 71 2.10. Определение активности индоламин-2,3-диоксидазы моноцитов 71 3 2.11. Оценка фенотипа лимфоцитов и тимоцитов 72 2.12. Индукция формирования адаптивных Th17/Treg из наивных 74 CD4+Т-лимфоцитов периферической крови 2.13. Влияние гормонов на формирования естественных Treg, Th17, 76 инвариантных NKT-клеток тимуса 2.14. Модуляция гормонами функциональной активности 78 естественных Treg 2.15. Оценка апоптоза лимфоцитов и тимоцитов 78 2.16. Оценка пролиферации лимфоцитов и тимоцитов 79 2.17. Определение уровня цитокинов в супернатантах клеточных 80 культур 2.18. Оценка внутриклеточной продукции цитокинов лимфоцитами и 80 тимоцитами 2.19. Статистический анализ Глава 3. Молекулярные 81 и клеточные механизмы иммуномодулирующей активности лептина и грелина в регуляции функций клеток врожденного иммунитета 82 3.1. Роль лептина и грелина в регуляции функциональной активности моноцитов периферической крови 82 3.1.1. Механизмы иммуномодулирующей активности лептина в отношении моноцитов 83 3.1.2. Регуляция грелином функциональной активности моноцитов. Роль Са2+-зависимых механизмов. 93 3.1.3. Совместные эффекты лептина и грелина в регуляции интегральных функций моноцитов 103 3.2. Роль лептина и грелина в регуляции фенотипа NK- и NKT-клеток периферической крови 114 Глава 4. Роль лептина и грелина в регуляции функций основных клеток адаптивного иммунитета 133 4 4.1. Роль гормонов в контроле активации зрелых Т-лимфоцитов периферической крови 133 4.2. Роль лептина и грелина в регуляции функциональной активности T-регуляторных клеток (Treg) 143 4.3. Роль лептина и грелина в регуляции дифференцировки CD4 +Тлимфоцитов периферической крови в адаптивные Th17 162 4.4. Молекулярные механизмы регуляции лептином и/или грелином дифференцировки CD4+-T-лимфоцитов в адаптивные субпопуляции Th17/Treg 168 Глава 5. Роль лептина и грелина в регуляции тимического этапа формирования клеток адаптивного иммунитета 179 5.1. Роль лептина и грелина в регуляции фенотипического созревания, пролиферации, апоптоза тимоцитов и продукции ключевых цитокинов 181 5.2. Роль лептина и/или грелина в регуляции тимического этапа формирования естественных Th17 и Treg и контроле их функциональной активности 189 5.3. Роль лептина и/или грелина в регуляции тимического этапа формирования инвариантных NKT-клеток тимуса 202 Заключение 207 Выводы 218 Список сокращений и условных обозначений 221 Список литературы 225 5 ВВЕДЕНИЕ Пептидные гормоны - лептин и грелин, являются функциональными антагонистами, регулирующими энергетический гомеостаз, иммунную и репродуктивную системы [293, 294]. Действуя на уровне гипоталамуса, лептин и грелин оппозитно контролируют чувство голода и аппетит, регулируя потребление пищи, метаболизм жировой ткани, процессы роста и развития [293, 294]. Оба гормона обладают выраженной иммунорегуляторной активностью [110-112, 183, 213, 314]. Рецепторы к лептину и грелину обнаружены на большинстве клеток иммунной системы [110-112, 213, 183, 314]. Основные исследования иммуномодулирующих эффектов лептина и грелина проводились на моделях ожирения и воспаления, когда концентрации гормонов значительно превышают физиологические [109-112, 118, 133, 181]. Лептин является провоспалительным гормоном и способствует преобладанию клеточно-опосредованного иммунного ответа [111, 213]. Грелин проявляет противовоспалительную активность, оказывая антагонистическое действие по отношению к лептину, блокируя лептин-индуцированные провоспалительные реакции [109-112]. Оба гормона способны реципрокно регулировать экспрессию рецепторов друг друга на клетках-мишенях [110-112, 183]. Сочетанное действие лептина и грелина как в клетке, так и на уровне организма приводит к формированию кооперативных эффектов, определяющих энергетический и иммунный гомеостаз [183, 294, 315]. При беременности энергетический обмен, метаболизм жировой ткани и иммуннореактивность организма матери претерпевают существенные изменения, а уровень лептина и грелина в периферической крови значительно нарастает, поскольку оба гормона регулируют имплантацию, активно вырабатываются плацентой, контролируют рост и развитие плода [294]. Однако механизмы реализации иммунорегуляторных эффектов лептина и грелина в физиологических концентрациях и комбинациях, характерных для беременности, практически не исследованы. Изучение роли лептина и грелина в контроле функциональной активности клеток, обеспечивающих 6 неспецифическую резистентность и адаптивный иммунитет, может существенно расширить представления о гормональной регуляции иммунных реакций в целом, формировании толерантности при беременности, опухолевом росте, причинах репродуктивных дисфункций при нарушениях жирового обмена. Цель исследования: изучить иммуномодулирующие эффекты лептина и грелина, а также их физиологических сочетаний в концентрациях, характерных для беременности, в регуляции основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Задачи исследования 1. Изучить влияние лептина и грелина и их комбинаций, на фагоцитарную, окислительную и секреторную активность моноцитов периферической крови. 2. Исследовать эффекты лептина и грелина, и их комбинаций, в регуляции фенотипа NK- и NKT-клеток периферической крови. 3. Оценить роль лептина, грелина, а также их комбинаций в контроле экспрессии активационных маркеров, апоптоза и продукции цитокинов Тлимфоцитами периферической крови. 4. Изучить влияния лептина, грелина, а также их совместные эффекты на формирование регуляторных субпопуляций CD4+Т-лимфоцитов (Treg, Th17) периферической крови, а также роль протеинкиназы А и фосфатидилинозитол3-киназы в реализации эффектов гормонов. 5. Исследовать роль гормонов в регуляции фенотипического созревания, апоптоза и продукции цитокинов тимоцитами. 6. Оценить влияние лептина, грелина и их комбинаций на тимический этап формирования регуляторных клеток (Treg, Th17, инвариантных NKTклеток). Методология и методы исследования. Работа выполнялась на базе лаборатории иммунорегуляции ИЭГМ УрО РАН (зав. лаб., заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Ширшев С.В.) с 2004 по 2014 г.г. Работа 7 проводилась в рамках плана НИР «Механизмы гормональной регуляции иммунной системы» № Государственной регистрации – 0120.0 809371. Работа поддержана грантом Фонда содействия отечественной науке «Выдающиеся ученые. Кандидаты и доктора наук» (2008-2009); именной стипендией Пермского края I категории (2008), грантом РФФИ 11-04-01109 «Роль лептина и грелина в контроле функциональной активности ИЛ17-продуцирующих и Трегуляторных лимфоцитов», грантом РФФИ 11-04-96015-р-урал-а «Изучение гормональной регуляции тимического этапа дифференцировки регуляторных Т-лимфоцитов», грантом РФФИ 13-04-00571 «Роль лептина и грелина в контроле созревания и функций дендритных клеток и их участия в индукции регуляторных Т-лимфоцитов беременности». президиума Часть РАН молекулярных в период исследований «Молекулярная механизмов и физиологически выполнена клеточная в протекающей рамках биология», иммуномодулирующего действия программ «Изучение гормонов репродукции» (2009-2011) и «Клеточные и молекулярные механизмы гормонального контроля функциональной активности иммунной системы в период гестации» (2012-2015). Все представленные в работе исследования проводились согласно Хельсинской Декларации ВМА 2000г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. Для решения поставленных задач в качестве объекта исследования использовали фракционированную суспензию мононуклеарных клеток, а также разные популяции лимфоцитов, выделенные из периферической крови практически здоровых небеременных женщиндобровольцев репродуктивного возраста (от 19 до 37 лет). Критериями отбора доноров являлись: отсутствие хронических, аутоиммунных, аллергических заболеваний, отсутствие приема гормональных, иммуномодулирующих препаратов (по данным словесного опроса), индекс массы тела (ИМТ) менее 25 (нормостеники), информированное согласие на использование биологического материала в научных целях. В соответствии с поставленной целью, исследуемые гормоны использовали в концентрациях, отражающих их 8 содержание в периферической крови по триместрам беременности. Для оценки иммуномодулирующих эффектов лептина и грелина на функции основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета, выделенные клетки культивировали с гормонами в условиях in vitro. Далее в соответствии с поставленными задачами выполнялся комплекс экспериментальных иммунологических исследований. Контролем служили пробы, куда вместо гормонов вносили физиологический раствор, используемый для растворения гормонов. Для исследования влияния гормонов на тимический этап дифференцировки лимфоцитов использовали тимоциты детей до года, которые выделяли из фрагментов тимуса, полученных в ходе сердечно-сосудистых операций в соответствии с существующей хирургической практикой. Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора. Высокий уровень достоверности результатов диссертационной работы, а также обоснованность выводов определяется достаточным числом наблюдений, продуманным методическим и методологическим дизайном исследования, использованием современных иммунологических и лабораторных методов исследования, позволяющих решить поставленные задачи, а также адекватных методов статистического анализа при помощи прикладных компьютерных программ «Statistica for Windows 6.0», «Microsoft Excel 2007». Материалы диссертации представлены и обсуждены на VIII Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в СанктПетербурге» (г. Санкт-Петербург, 2005); III конференции иммунологов Урала (г. Уфа, 2006), VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды. Адаптация. Иммунитет», (г. Пермь – Н.Новгород – Пермь, 2008г.); IV Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (г. Пермь, 2010); IX Российской конференции иммунологов Урала, посвященной 90-летию профессора Л.Я. международным Эберта участием (г. Челябинск, 2011); школе-конференции I Всероссийской молодых с ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», (г. 9 Пермь, 2011), V Российской конференции «Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты» (г. Иваново, 2012); X конференции иммунологов Урала (г. Тюмень, 2012); Объединенном иммунологическом форуме (г. Нижний Новгород, 2013). Личный вклад соискателя составляет более 80% и состоит в непосредственном участии во всех этапах диссертационного исследования. Планирование научной работы выполнено автором совместно с научным консультантом, заведующим лаборатории иммунорегуляции ИЭГМ УрО РАН, заслуженным деятелем науки РФ, д.м.н., профессором Ширшевым С.В. Формулировка цели и задачей диссертационного исследования, определение общей концепции, разработка дизайна и методологии исследования, анализ и систематизация данных литературы, выполнение комплекса иммунологических исследований проведены лично автором. Ряд исследований по изучению функциональной активности моноцитов периферической крови проводилось автором совместно с сотрудниками Лаборатории Иммунорегуляции ИЭГМ УрО РАН д.б.н., с.н.с. Замориной С.А.; к.б.н., н.с. Некрасовой И.В, за что автор выражает им искреннюю благодарность. Статистическая обработка и интерпретация полученных данных, написание и оформление рукописи диссертации выполнены лично соискателем. Подготовка публикаций по теме диссертации осуществлялась автором совместно с научным консультантом. Результаты диссертационной работы представлялись в виде докладов на научных конференциях лично соискателем. Автор благодарит за предоставленную возможность и содействие сотрудников и заведующего ЛЭИ ИЭГМ УрО РАН к.м.н. Бахметьева Б.А. в выполнении исследований методом проточной цитометрии. Автор выражает искреннюю благодарность доценту кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО «Пермского государственного медицинского университета имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России, к.м.н. Логиновой Н.П. за помощь в организации работы по исследованию тимоцитов. 10 Положения, выносимые на защиту 1. Самостоятельные эффекты лептина и грелина на функциональную активность моноцитов имеют разнонаправленный характер и зависят от концентрации гормона, активационного статуса клетки, типа фагоцитируемого объекта. Действие гормонов в комбинациях нивелирует индивидуальные угнетающие эффекты гормонов на фагоцитарную активность в отношении бактериальных объектов, спонтанную и стимулированную продукцию активных форм кислорода. Физиологическое сочетание лептина и грелина, соответствующее I-II триместру беременности, угнетает продукцию окиси азота моноцитами, а во II-III триместрах беременности – усиливает индуцированную активность фермента индоламин-2,3-диоксигеназы моноцитов. 2. Эффекты лептина и грелина на NK-клетки, главным образом, однонаправлены Основные и эффекты сохраняются проявляются при в совместном действии концентрациях и гормонов. комбинациях, характерных для II-III триместров беременности, и приводят к увеличению числа NK-клеток с регуляторным фенотипом. Гормоны преимущественно не влияют на экспрессию молекул CD16/CD56 на NKT-клетках. 3. Лептин и грелин разнонаправлено регулируют функциональную активность Т-лимфоцитов периферической крови. Совместное действие лептина и грелина либо нивелирует самостоятельные эффекты гормонов, либо способствует преобладанию действия одного из них. Лептин снижает уровень активированных Тh-клеток и апоптоз лимфоцитов. Грелин повышает количество активированных Тh-клеток и апоптоз лимфоцитов. Комбинации гормонов не влияют на апоптоз лимфоцитов, но препятствуют апоптозу CD4+Т-лимфоцитов периферической крови. Грелин и комбинация лептина с грелином стимулируют синтез интерлейкина-4 Т-лимфоцитами. 4. Лептин и грелин разнонаправлено регулируют формирование адаптивных регуляторных субпопуляций CD4+Т-лимфоцитов периферической крови. Лептин усиливает формирование Th17, но препятствует образованию 11 Treg. Грелин способствует преобладанию Treg, но угнетает поляризацию в Th17. Реализация регуляторных эффектов лептина и грелина на Th17/Treg девиацию задействует протеинкиназу А и фосфатидилинозитол-3-киназу. Комбинации гормонов либо не влияют, либо усиливают образование Treg. 5. Лептин и грелин не влияют на фенотипическое созревание тимоцитов, но стимулируют продукцию интерлейкина-4 тимоцитами. Исследуемые гормоны угнетают кортикостероид-индуцированный апоптоз тимоцитов, препятствуют образованию Treg в тимусе и оказывают разнонаправленные эффекты на формирование Th17 и инвариантных NKT-клеток. Лептин усиливает, грелин угнетает, а комбинации гормонов не влияют на генерацию Th17 и инвариантных NKT-клеток в тимусе. Научная новизна. Впервые показано, что лептин и грелин, а также их физиологические комбинации, отражающие уровень гормонов в периферической крови при беременности, являются значимыми регуляторами функций основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета. На основании детального изучения влияния гормонов на функциональную активность моноцитов впервые показано, что самостоятельные эффекты лептина и грелина разнонаправлены и зависят от концентрации гормона, активационного статуса клетки, типа фагоцитируемого объекта. Гормональные комбинации нивелируют индивидуальное угнетающее действие гормонов на фагоцитарную и окислительную активность моноцитов. Комбинация лептина и грелина, соответствующая I-II триместру беременности, угнетает продукцию окиси азота моноцитами, а II-III триместру беременности – усиливает индуцированную активность индоламин-2,3-диоксигеназы моноцитов. Основные эффекты гормонов на NK-клетки однонаправлены, сохраняются в комбинациях и приводят к увеличению числа NK-клеток с регуляторным фенотипом. Раскрыты новые механизмы гормональной регуляции Т-клеточного звена иммунитета. Лептин и грелин, смещая направленность иммунных реакций по Тh2-типу путем усиления выработки интерлейкина-4, а также регулируя Treg/Th17 девиацию и апоптоз CD4+Т- 12 лимфоцитов, являются значимыми факторами формирования толерантности. Впервые проанализирована роль фосфатидилинозитол-3-киназы и протеинкиназы А в Th17/Treg девиации под влиянием гормонов на уровне CD4+-лимфоцитов периферической крови. Впервые показано, что гормоны не влияют на фенотипическое созревание тимоцитов, но контролируют формирование регуляторных клеток в тимусе и угнетают стимулированный апоптоз тимоцитов. Исследуемые гормоны стимулируют продукцию интерлейкина-4 и экспрессию рецептора к интерлейкину-7 на тимоцитах. Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане работа расширяет существующие представления о гормональном контроле функций основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Показано, что совместное концентрациях, характерных самостоятельные преобладанию действие эффекты действия для беременности, лептина одного гормонов из и грелина, них. в физиологических либо либо нивелирует способствует Полученные данные о самостоятельных и совместных иммунорегуляторных эффектах лептина и грелина объясняют роль гормонов в перестройке иммунных реакций в аспекте беременности, а также актуальны для анализа причин репродуктивных дисфункций при нарушениях жирового и энергетичекого обмена. Определены механизмы участия лептина и грелина в регуляции функций клеток врожденного и адаптивного иммунитета, ассоциированных с формированием иммунной толерантности. Проанализировано участие гормонов в формировании регуляторных клеток в тимусе и на периферии, имеющих ключевое значение при беременности, аутоиммунных патологиях, онкологических заболеваниях. Выявленные закономерности гормональной регуляции тимического развития лимфоцитов предполагают новый взгляд на процессы, сопровождающие физиологическую инволюцию тимуса. Изученные молекулярные механизмы реализации эффектов лептина и грелина, и их комбинаций открывают манипулирования новые направленности возможности для дифференцировки фармакологического клеток, а также 13 прогнозирования действия других гормонов с учетом их рецепции и внутриклеточной сигнализации. В практическом плане полученные данные по механизмам действия лептина и грелина следует учитывать при клиническом использовании гормонов. Работа открывает новые перспективы для исследований в области нейроэндокринной регуляции иммунитета, а также применения лептина и грелина в качестве иммуномодуляторов. Внедрение результатов исследования в практику. Полученные данные внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Пермского государственного национального исследовательского университета» в программе спецкурсов «Общая эндокринология» и «Иммунология репродукции», а также на кафедре нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Пермского государственного медицинского университета имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России в программе курса «Нормальной физиологии». Публикации. Соискатель имеет более 90 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликованы 44 научные работы общим объемом 7 печатных листов, в том числе 28 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень Российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, 12 работ в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов, 4 статьи в вузовских сборниках. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 261 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, трех глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных сокращений и библиографического указателя, включающего 338 источников, в том числе 44 отечественных, 294 зарубежных. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 60 рисунками. 14 Глава 1. ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ ЛЕПТИНА И ГРЕЛИНА В РЕГУЛЯЦИИ ОСНОВНЫХ КЛЕТОК ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Роль лептина в регуляции клеток врожденного и адаптивного иммунитета Лептин является пептидным гормоном с мол. массой 16 кДа, который синтезируется, главным образом, адипоцитами и циркулирует в крови как в свободной, так и в связанной форме [126]. Основная биологическая роль лептина связана с регуляцией энергетического баланса организма, потребления пищи и ограничением избыточного накопления жировой массы. Содержание лептина в плазме крови прямо коррелирует с количеством жировой ткани, а также варьирует в зависимости от особенностей обменных процессов, изменения концентрации некоторых гормонов и цитокинов [59, 80, 122, 126]. По результатам многочисленных исследований установлено, что содержание лептина в крови у лиц женского пола достоверно выше, чем у мужчин, независимо от возраста, степени ожирения и типа жироотложения [95, 159]. В целом, концентрация лептина у женщин приблизительно на 40% выше, чем у мужчин [257]. Опубликованные нормативные показатели содержания лептина в периферической крови, согласно различным методикам его определения, составляют: у женщин 1,1-27,6 нг/мл, у мужчин – 0,5-13,8 нг/мл. Эти половые различия, вероятно, связаны со стимулирующим эффектом эстрогенов и прогестерона и подавляющим действием андрогенов [88, 159, 257]. Продукция лептина увеличивается при воспалительных и инфекционных заболеваниях (4,2-132 нг/мл), которые сопровождаются анорексией и потерей веса [122, 272]. При ожирении наблюдается значительное повышение концентрации лептина – 16,4-166,1 нг/мл [95]. Среднее содержание лептина в периферической крови в I триместре беременности составляет 10±1,2 нг/мл, а 15 во II-III триместрах – 35±2,5 нг/мл [152]. Данные, приведенные в таблице 1, показывают среднее содержание лептина в периферической крови при различных физиологических состояниях. Таблица 1 – Содержание лептина в периферической крови человека при различных физиологических состояниях Физиологическое состояние В норме Беременность Воспаление Ожирение Концентрация лептина в периферической крови, Источник литературы M±m, У женщин 7,36±3,73 нг/мл; Considine et al., 1996; у мужчин 3,84±1,79 нг/мл Rosenbaum et al., 2001 I триместр 10±1,2 нг/мл; Hardie et al., 1997 II-III триместр 35±2,5 нг/мл Fantuzzi, Faggioni, 2000; 39,2±6,3 нг/мл Sarraf et al., 1997 54,54±29,23 нг/мл Considine et al., 1996 Основные исследования по изучению физиологической роли лептина были проведены на моделях ожирения у мышей гомозиготных линий ob/ob (дефект выработки лептина) и db/db (мутация рецептора к лептину) [59, 80, 122, 126, 335]. У данных животных помимо гиперфагии и ожирения были выявлены гормональный дисбаланс, угнетение репродуктивной функции, гемопоэза и клеточно-опосредованного иммунного ответа [59, 68, 80, 122, 126, 335]. Подобные нарушения были обнаружены и у людей, гомозиготных носителей мутации ob гена, причем, экзогенное введение рекомбинантного лептина полностью предотвращало развитие вышеперечисленных дисфункций [59, 80, 122, 126, 335]. Установлено, что лептин регулирует активность клеток при взаимодействии со специфическими мембранными рецепторами (Ob-R) [50, 66, 71, 129, 135, 254, 272]. На системном уровне основным механизмом регуляции лептином энергетического баланса организма является угнетение продукции нейропептида Y и активация синтеза меланоцитстимулирующего гормона при взаимодействии с Ob-R гипоталамуса, что приводит к снижению аппетита, 16 повышению тонуса симпатической нервной системы и, как следствие, усилению основного обмена в периферических органах и тканях [20, 50, 51, 121, 122, 126]. Помимо этого, на уровне гипоталамуса лептин стимулирует выработку тиреотропного гормона, гонадотропинов, что усиливает секрецию тиреоидных и половых стероидных гормонов, принимающих активное участие в регуляции метаболитических процессов [19, 50, 59, 126]. В то же время повышенный уровень инсулина, половых стероидных и глюкокортикоидных гормонов угнетает секрецию лептина адипоцитами, замыкая отрицательную обратную связь [50, 59, 126]. Участие лептина в регуляции иммунных реакций определяется его непосредственным влиянием на клетки иммунной системы, экспрессирующих Ob-R. Так, помимо центральной нервной системы, клеток легких, печени, почек, поджелудочной железы и гонад [122, 126, 177], трофобласта и фетальных тканей [50, 177], Ob-R экспрессируются моноцитами/макрофагами [206, 330], Т- и В-лимфоцитами [133, 269], нейтрофилами [226, 330, 331] и натуральными киллерами (NK) [335]. Такое широкое представительство Ob-R на лимфомиелоидных клетках объясняется его структурным сходством с представителями семейства цитокиновых рецепторов I класса [129, 141]. Благодаря этому, лептин регулирует формирование не только иммунного ответа и процессы воспаления, но и гемопоэз [134, 214, 294]. Анализ литературы убедительно показывает, что лептин является провоспалительным гормоном, который способствует преобладанию клеточно-опосредованных иммунных реакций, вследствие усиления продукции цитокинов Т-хелпер - 1 (Тh1) типа [214, 267]. Дальнейшая систематизация знаний о молекулярных основах иммуномодулирующего действия лептина необходима для понимания механизмов регуляции иммунных реакций при различных физиологических и патологических состояниях. Ob-R имеют структурное и функциональное сходство с I классом цитокиновых рецепторов, которые включают общий сигнальный белок - gp130 [66, 214]. К этому семейству также относятся рецепторы к интерлейкинам 17 (IL)-2, IL-6, IL-11, IL-12, онкостатину М, гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (G-CSF), гормону роста, пролактину и др. [66, 214]. Ob-R формируют гомодимеры, каждый из которых связывает одну молекулу лептина, в результате чего формируется тетрамерный комплекс, состоящий из 2-х Ob-R и 2-х молекул лептина [66, 214]. Выявлено несколько изоформ Ob-R, образующихся в результате альтернативного сплайсинга и отличающихся по структуре внутриклеточного сигнального домена [66, 214]. Внеклеточный домен Ob-R состоит из 816 аминокислотных остатков и имеет два цитокин-подобных связывающих мотива [285]. По строению внутриклеточного домена выделяют короткую (включает 32-97 аминокислотных остатка), длинную (включает 302 аминокислотных остатка), а также растворимую форму Ob-R [141, 285]. Взаимодействие лептина с короткой формой Ob-R не приводит к активации транскрипционных факторов [71, 141, 285]. Полагают, что короткая форма ObR осуществляет перенос гормона через гематоэнцефалический барьер, тогда как растворимая форма Ob-R транспортирует лептин в сыворотке крови [141, 285]. Подобно другим gp130-содержащим цитокиновым рецепторам, лигирование длинной формы Ob-R инициирует внутриклеточный сигнальный каскад, сходный с таковым для IL-6 [65]. Схематическое изображение трансдукции сигнала с Ob-R представлено на рисунке 1. 18 Рисунок 1 – Схематическое изображение трансдукции сигнала с Ob-R при связывании с лептином [136] Первым этапом в лептин-индуцированной трансдукции сигнала является активация тирозиновых протеинкиназ Janus-семейства (JAK-киназы), ассоциированных с Ob-R [65]. JAK-киназы фосфорилируют остатки тирозина во внутриклеточном домене Ob-R, а также белки сигнальной трансдукции и активаторы транскрипции (STAT-белки) [141, 285]. Активированные STATбелки, в свою очередь, вступают во взаимодействие с фосфорилированными остатками тирозина Ob-R. Лигирование Ob-R приводит к активации различных STAT-белков в разных типах клеток [141, 285]. В мононуклеарных лейкоцитах JAK-киназы фосфорилируют, главным образом, STAT-3 [268]. В цитоплазме активированные STAT-3 образуют димеры путем связывания SH2содержащего домена одной молекулы с остатками фосфорилированного 19 тирозина в другой молекуле [267, 268, 289]. Димерные молекулы STAT-3 приобретают способность проникать в ядро, где связываются с промоторными сайтами ДНК и регулируют транскрипцию определенных генов [66, 268, 285]. Помимо этого, фосфорилированные STAT-протеины могут вступать во взаимодействие с белком, связывающим РНК (Sam68), который, в свою очередь, активирует SH2-содержащие сигнальные молекулы, такие как: фосфолипаза С (РLC), фосфотидилинозитол-3 киназа (РI3-К), протеинкиназа С (РКС) [65, 267, 285]. Взаимодействие Sam68 с мембранным ферментом PLC стимулирует гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата (PIP2) с образованием двух основных вторичных мессенджеров - диацилглицерола (DAG) и инозитол1,4,5-трифосфата (IP3). Первый из них стимулирует PKC, а второй, активируя IP3-зависимые Ca2+-каналы эндоплазматического ретикулума (ЭПР), вызывает приток внутриклеточного Ca2+, который акцептируется кальцинейрином (CaN) [198, 335]. Активированная PKC запускает последовательный каскад митогенактивируемых протеинкиназ (МАРК): RAS, RAF-1, МЕК, ERK-I/II [48, 198, 335]. Следствием взаимодействия Sam68 с РI3-К является РI3-К- индуцированное фосфорилирование PIP2, с образованием ряда продуктов, которые стимулируют ГТФ-азы RНО-семейства, и, как следствие, p38 МАРкиназу и c-Jun-NH2-терминальную протеинкиназу (JNK-киназу) [65, 267, 285]. Заключительным этапом сигнальной трансдукции является активация транскрипционных факторов, наиболее важные из которых - ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов (NFAT), ядерный фактор-kB (NF-kB) и активирующий протеин-1 (АР-1) [14, 73, 267]. PKC является основным активатором для NF-kB. СaN стимулирует NFAT, а ERK и JNK индуцируют транскрипцию онкогенов c-fos и c-jun, продукты которых входят в состав АР-1 [73, 113, 198, 335]. Активированные транскрипционные факторы проникают в ядро и, взаимодействуя с промоторными и/или энхансерными 20 последовательностями определенных генов, контролируют их транскрипцию [73, 113, 198, 335]. Аналогично другим gp130-содержащим цитокиновым рецепторам при лигировании Ob-R помимо передачи активационных сигналов присутствует и негативная регуляция, которая осуществляется супрессором сигнальной трансдукции цитокинов (SOCS-3) [285]. SOCS-3 содержит SH2-домен и способен взаимодействовать с фосфорилированными JAK-протеинами, угнетая передачу сигнала при связывании лептина с Ob-R [285]. Таким образом, основными внутриклеточными посредниками, реализующими эффекты лептина на молекулярном уровне, являются STATбелки и Sam68, которые непосредственно и/или через специфические протеинкиназы определяют фосфорилирование соответствующих факторов транскрипции и реализацию биологических эффектов лептина. Гомологичность структуры лептина, его рецепторов и индуцированного им сигнального каскада с цитокинами предполагает возможность цитокиноподобного действия лептина в регуляции иммунных реакций. 21 1.1.1. Молекулярные механизмы регуляция лептином функциональной активности моноцитов Моноциты, макрофаги и нейтрофилы являются основными эффекторами неспецифической резистентности организма. Их вклад в процессы иммунного реагирования определяется поглощением, деструкцией патогена и презентацией его антигенных детерминант, а также продукцией ряда биологически активных соединений, в том числе и цитокинов, модулирующих направленность развития иммунного ответа. Регуляции лептином функциональной активности моноцитов и макрофагов. Моноциты и макрофаги экспрессируют как короткую, так и длинную форму Ob-R [109, 267]. Среди лейкоцитов мононуклеарные фагоциты имеют наибольшую плотность экспрессии Ob-R [109, 330]. Не активированные моноциты/макрофаги экспрессируют на поверхности лишь 5 25% молекул Ob-R, в то время как большая часть рецепторов составляет внутриклеточный пул [109, 330]. При активации моноцитов/макрофагов количество Ob-R на их мембране значительно увеличивается [234, 330]. Присутствие Ob-R выявлено и на дендритных клетках моноцитарного происхождения [217]. Показано, что лептин способствует созреванию дендритных клеток, усиливая их миграцию, способствуя преобладанию Th1ответа [217]. Связывание лептина с Ob-R мононуклеарных фагоцитов индуцирует экспрессию активационных молекул, таких как: CD25, CD38 (адгезивная молекула), CD69, CD71, а также HLA-DR (молекула главного комплекса гистосовместимости II класса), CD11b (CR3 – рецептор к компонентам комплемента) и CD11c (CR4) [271, 135]. В системе in vitro лептин стимулирует пролиферацию моноцитов, усиливая продукцию гранулоцитарно- макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) [135, 210, 267, 271]. 22 Молекулярные механизмы регуляции лептином фагоцитарной активности мононуклеаров. При изучении влияния лептина на фагоцитарную активность клеток установлено, что гормон участвует в регуляции поглотительной функции моноцитов и макрофагов в отношении различных объектов фагоцитоза [122, 198]. У ob/ob мышей выявлено угнетение фагоцитарной активности макрофагов в отношении Klebsiella pneumoniae, которая восстанавливалась при добавлении лептина [209]. В работах других авторов установлено, что макрофаги ob/ob и db/db мышей не способны поглощать и переваривать рекомбинантного лептина грибки рода восстанавливало [198]. Введение поглотительную функцию Candida фагоцитов у ob/ob, но не db/db мышей [198]. При изучении молекулярных механизмов, ответственных за регуляцию лептином поглотительной активности моноцитов/макрофагов, показано, что эффекты гормона опосредованы, с одной стороны, усилением экспрессии рецепторов, необходимых для адгезии объекта фагоцитоза, например: CR1, CR3, CR4 [134, 271], а с другой, - активацией молекул, контролирующих полимеризацию актина при погружении адгезированной частицы и формировании фагосомы [59, 134]. Во всех эукариотических клетках процессы реорганизации цитоскелета контролируются ГТФ-азами RHO-семейства, наиболее важными из которых являются Rac, Cdc-42 [108, 145]. Как упоминалось ранее, следствием связывания лептина с Ob-R является взаимодействия Sam68 с РI3-К и РI3-Киндуцированное фосфорилирование PIP2 с образованием ряда продуктов, из которых наиболее значимая роль принадлежит фосфатидилинозитол-3,4,5трифосфату (PtdIns(3,4,5)P3) [48, 145]. PtdIns(3,4,5)P3 является основным активатором для ГТФ-аз RHO-семейства Rac1 и Cdc42, которые непосредственно запускают полимеризацию актина [48, 145]. Помимо этого, РКС активирует актиногелин (MARCKS) – белок, перекрестно связывающий актин [108, 145]. Сокращение этого комплекса происходит при участии миозина. Этот процесс контролируется ERKII-индуцированной MLC-киназой 23 (MLCK), активирующей миозин, и ионами Са2+ [48, 145]. В результате вышеупомянутых процессов объект фагоцитоза и вместе с ним часть мембраны фагоцита формируют фагосому, которая погружаются в клетку [48, 145]. Таким образом, можно полагать, что регуляция поглотительной активности фагоцитов вследствие взаимодействия лептина с Ob-R связана с активацией RHO-ГТФ-аз, MLCK, MARCKS, контролирующих полимеризацию актина, поскольку SH2-содержащие молекулы РI3-К, РКС, PLC являются мишенью для стимулирующего действия Sam68 [267]. Поскольку и FcRопосредованный фагоцитоз, и поглощение частиц с участием CR, рецепторов к маннозе (MR) требуют вовлечения RHO-ГТФ-аз [145] в реорганизацию цитоскелета клетки, регуляция лептином фагоцитарной активности моноцитов и макрофагов на молекулярном уровне, по-видимому, зависит от вида рецепторов, взаимодействующих с объектом. Гипотетическая схема, суммирующая возможные механизмы регуляции лептином фагоцитарной активности моноцитов представлена на рисунке 2. 24 IgG-опсонизированная частица FcγRIIIА γγ γγ FcγRI С3b L I T A M Ob-R Src JAK ЭПР M MR Syk JAK Sam68 STAT-3 CR3 I T A M PtdIns(3,4,5)P3 PI3-К PLC IP3 RHO-GTP-азы Sam68 DAG ↑Ca2+ PKC Rac1-GTP Cdc42-GTP Sam68 MLCK MARCKS Полимеризация актина, формирование фагосомы Рисунок 2 – Гипотетический механизм модуляции лептином фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов. Перекрестное связывание двух FcγR IgG-опсонизированной частицей на мембране фагоцита активирует тирозинкиназы семейства Src и Syk. Syk-киназа фосфорилирует PLC, PI3-К. PLC гидролизует PIP2, метаболиты которого – DAG и IP3 – активируют, соответственно, РКС и мобилизацию Са2+ из ЭПР. PKC активирует MARCKS и MLCK. РI3-К фосфорилирует PIP2, в результате чего формируется ряд продуктов, в том числе PtdIns(3,4,5)P3, активирующий RHOGTP-азы: Rac1 и Cdc42. Результатом этих событий является реорганизация цитоскелета клетки. Взаимодействие микробных углеводных компонентов (М) с MR и C3b-опсонизированных частиц (C3b) с CR3 также инициирует процессы полимеризации актина с участием RHO-GTP-аз. Связывание лептина (L) с Ob-R усиливает поглотительную функцию клетки вследствие активации RHO GTP-аз, MLCK, MARCKS, поскольку РI3-К, РКС, PLC являются мишенью для стимулирующего действия Sam68. 25 Молекулярные механизмы регуляции лептином генерации активных форм кислорода и азота фагоцитами. Фагоцитоз является начальной стадией в деградации патогена. Для уничтожения поглощенного объекта требуется участие кислородзависимых механизмов микробицидности, в реализации которых ключевую роль играют активные формы кислорода и азота [105]. Стимуляция фагоцитов в процессе фагоцитоза индуцирует кислородный взрыв, что приводит к генерации активных форм кислорода, обладающих высокой окислительной активностью. Чтобы контролировать продукцию этих потенциально опасных для клетки метаболитов, фермент, их генерирующий, NADPН-оксидаза, формируется только при активации клетки [105]. NADPН-оксидаза состоит из мембранного цитохрома b558 (gp 21phox и gp91phox субъединицы) и цитозольных белковых компонентов p47 и p67 [105]. Активация NADPН-оксидазы в процессе фагоцитоза происходит в результате фосфорилирования ее цитозольных компонентов p67 и p47, причем PI3-K фосфорилирует RHO-ГТФ-азу Rac-2 и, как следствие, p67, а РKC, соответственно - p47 [105]. Фосфорилированные цитоплазматические компоненты транслоцируются к мембране и ассоциируются с цитохромом b558, что приводит к созданию функционального комплекса NADPН-оксидазы, в результате чего цитохром переносит электроны с NADPН на О2 с образованием супероксид аниона О2- [105]. Установлено, что лептин усиливает продукцию активных форм кислорода мононуклеарами периферической крови [286]. Анализируя молекулярные механизмы действия лептина, можно полагать, что усиление генерации метаболитов кислорода при взаимодействии гормона с Ob-R обусловлено Sam68-индуцированной стимуляцией РКС и PI3-K, а также увеличением концентрации ионов Са2+ в клетке, и, как следствие, активацией NADPН-оксидазы [73, 105, 285, 286]. Помимо этого, в мононуклеарных фагоцитах лептин активирует фосфолипазу A2 (PLA2), которая также участвует в индукции NADPН-оксидазы [208]. 26 Регуляция лептином микробицидного потенциала фагоцитами обусловлена также его участием в контроле метаболизма азота. Окись азота (NO) играет основную роль в разрушении внутриклеточных паразитов. Генерация NO в клетке происходит при окислении аргинина под действием индуцибельной (i) или конститутивной NO-синтетазы (NOS). Регуляция продукции NO фагоцитами, главным образом, осуществляется на уровне транскрипции iNOS, которая контролируется NF-kB [109, 184, 285]. В ряде работ показано, что лептин усиливает продукцию NO мононуклеарными лейкоцитами периферической крови, инициируя повышение экспрессии iNOS [109, 184, 285]. Причем блокада сигнального каскада Ob-R внесением специфических ингибиторов JAK-киназ, отменяет активирующий эффект лептина на продукцию NO [243]. У ob/ob мышей дефицит лептина сопровождается нарушением продукции NO, что свидетельствует о важной роли гормона в контроле метаболизма азота [129]. Анализ молекулярных механизмов показывает, что лептин- индуцированная продукция NO мононуклеарными клетками блокировалась ингибиторами РКС [109], которая является основным активатором для NF-kB, контролирующего экспрессию iNOS [73, 285]. Как описывалось ранее, взаимодействие лептина с Ob-R фагоцитов инициирует Sam68- индуцированную стимуляцию РКС, которая запускает последовательный каскад МАРК, конечным этапом которого является активация NF-kB. Таким образом, лептин-индуцированное увеличение продукции NO фагоцитами обусловлено усилением экспрессии iNOS, вследствие РКС-зависимой активации NF-kB. В целом, лептин играет значительную роль в модуляции кислородзависимой микробицидности фагоцитов, регулируя экспрессию и функциональную активность NADPН-оксидазы и iNOS. Гипотетическая схема, суммирующая возможные механизмы регуляции лептином микробицидной активности моноцитов представлена на рисунке 3. 27 Ig FcR G Sam68 О2 Активированная оксидаза Sam68 g21 phox р67 Rac-2 NADPН -GTP ЭПР ↑Ca2+ - b558 gp91 phox PLC PI3-К IP3 DAG О2 р47 РКС Sam68 PLA2 + NADP + H ERK-I/II Sam68 STAT-3 NO ↑ FcR NF-kB IgG iNOS Транскрипция генов, контролирующих синтез iNOS ядро фагоцит Рисунок 3 – Гипотетический JAK механизм JAK Ob-R L регуляции лептином микробицидной активности фагоцитов. Активация NADPН-оксидазы в процессе фагоцитоза происходит в результате фосфорилирования ее цитозольных компонентов p67 и p47, которые затем встраиваются в мембрану клетки и взаимодействуют с мембранным цитохромом b558. RHO-GTP-аза Rac-2- активирует p67, а РKC фосфорилирует p47. В процессе фагоцитоза РKC запускает последовательный каскад МАРК, конечным этапом которого является активация NF-kB, контролирующего экспрессию iNOS и продукцию NO. Усиление микробицидной активности фагоцитов при взаимодействии L с Ob-R обусловлено Sam68-индуцированной стимуляцией РКС и PI3-K, PLA2, а также увеличением концентрации ионов Са2+ в клетке, и, как следствие, активацией NADPН-оксидазы. Увеличение продукции NO фагоцитами при лигировании Ob-R, по-видимому, обусловлено усилением экспрессии iNOS, вследствие РКС-зависимой активации NF-kB. 28 Молекулярные механизмы регуляции лептином продукции цитокинов мононуклеарными фагоцитами. Вклад фагоцитов в иммунный ответ определяется не только поглощением и деструкцией патогена, но и продукцией цитокинов, которые модулируют направленность развития иммунного ответа. В зависимости от объекта фагоцитоза и участвующих в процессе поглощения рецепторов, спектр продуцируемых мононуклеарными фагоцитами цитокинов может быть различен. Так, взаимодействие с FcR, MR и CR моноцитов и макрофагов стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов: IL-1, TNF-, IL-6, IL-12 [252]. Поглощение макрофагами клеток, подвергшихся апоптозу, с участием, главным образом, рецепторов- мусорщиков, рецепторов к фибронектину и CD14, напротив, сопровождается уменьшением синтеза провоспалительных цитокинов [117]. В работах ряда авторов показано, что лептин усиливает синтез и продукцию моноцитами и макрофагами ряда провоспалительных цитокинов: IL-1, IL-6, IL-12, TNF-, G-CSF, GM-CSF, относящихся к Тh1 цитокиновому профилю [122, 211, 272, 330]. Нарушение синтеза или рецепции лептина у ob/ob или db/db мышей, соответственно, сопровождается угнетением продукции провоспалительных и усилением секреции противовоспалительных цитокинов [122, 206, 211, 272]. Интересно отметить, что провоспалительные цитокины, такие как IL-1, TNF- и IL-6, непосредственно индуцируют секрецию лептина мононуклеарными фагоцитами, причем выявлена строгая положительная корреляционная взаимосвязь между уровнем провоспалительных цитокинов и содержанием гормона в сыворотке крови [122, 206, 211]. Продукция лептина увеличивается при воспалительных и инфекционных заболеваниях, вследствие чего, по-видимому, развитие этих состояний сопровождается анорексией и потерей веса [118, 272, 330]. Таким образом, с одной стороны, повышение уровня лептина является следствием развития воспалительной реакции в ответ на повышение уровня провоспалительных цитокинов, а с другой стороны, гормон сам выступает фактором, усиливающим воспаление, сдвигая баланс цитокинов, 29 продуцируемых иммунокомпетентными и эффекторными клетками, по Тh1типу и стимулируя клеточно-опосредованный иммунный ответ [122, 135, 198, 211, 330] Анализ молекулярных механизмов показывает, что белковый синтез во всех эукариотических клетках контролируется рядом транскрипционных факторов, наиболее значимые из которых - NF-kB, AP-1, NFАТ [65, 73, 202, 330]. Сайты связывания для вышеупомянутых факторов транскрипции были идентифицированы в промоторных и энхансерных участках генов, кодирующих синтез провоспалительных цитокинов [65, 73]. В покоящихся клетках транскрипционные факторы находятся в неактивном состоянии. Их активация индуцируется при стимуляции целого ряда мембранных белков, в ответ на взаимодействие с цитокинами, бактериальными форболовыми эфирами, вирусами, гормонами, включая продуктами, перекрестное связывание FcR [48]. Как упоминалось ранее, основным стимулятором для NFkB является РКС. РКС запускает активационный каскад с участием молекул различных сигнальных путей: ERKI/II, JNK и ряда других, что вызывает разрушение комплекса NF-kB с его ингибитором, при этом NF-kB приобретает способность транслоцироваться в ядро и инициировать транскрипцию генов, в том числе провоспалительных цитокинов [335]. Активация NFAT требует мобилизации внутриклеточного Ca2+ и CaN [14]. Последний, связываясь с регуляторной субъединицей NFAT, дефосфорилирует этот белок, инициируя его проникновение в ядро [14]. Связывание NFAT с ДНК требует кооперации с АР-1, который формируется гомо- или гетеродимеризацией белков Jun и Fos и индуцируется при инициации внутриклеточного сигнала, включающего ERK и JNK [14, 73]. Транскрипция противовоспалительных (Тh2) цитокинов, напротив, негативно контролируется вышеупомянутыми транскрипционными факторами, что приводит к угнетению гуморального иммунного ответа [14]. Таким образом, регуляция лептином продукции Th1- и Th2- цитокинов через Ob-R связана, по-видимому, с дифференциальной модуляцией активности транскрипционных факторов, контролирующих синтез про- и 30 противовоспалительных цитокинов. Так взаимодействие лептина с Ob-R фагоцитов запускает сигнальных каскад, приводящий к преимущественной активации транскрипционных факторов, контролирующих продукцию провоспалительных цитокинов. Как упоминалось ранее, лигирование Ob-R активирует и STAT-3 взаимодействовать с которые Sam68, промоторными сайтами могут ДНК непосредственно и инициировать транскрипцию генов провоспалительных цитокинов [268, 285]. Наряду с этим, STAT-3 и Sam68, запускают несколько сигнальных путей, молекулы которых, прежде всего, РКС, СaN, p38 MAP, ERK, JNK, являются эффективными индукторами для транскрипционных факторов NF-kB, NFАТ, AP-1 [73, 258, 267, 285, 330]. Установлено, например, что стимуляция лептином продукции TNF- моноцитами обусловлена активацией p38 MAP факторов транскрипции NF-kB и АР-1 [330]. Помимо этого, в некоторых типах клеток STAT-3 непосредственно индуцирует разрушение комплекса NF-kB с его ингибитором [312]. Активированные транскрипционные факторы NF-kB, NFАТ и АР-1 преимущественно взаимодействуют с промоторными и/или энхансерными участками генов провоспалительных цитокинов, и, как следствие, конкурентно подавляют транскрипцию противовоспалительных цитокинов [73, 258, 285]. В целом, лептин стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов моноцитами/макрофагами и, таким образом, усиливает клеточно- опосредованный иммунный ответ. Возможный механизм регуляции лептином продукции цитокинов мононуклеарными фагоцитами представлен на рисунке 4. IgG 31 Fc Syk L Sam68 Ob-R PLC JAK PI3-К JAK STAT-3 ЭПР IP3 DAG ↑Ca2+ PKC PtdIns(3,4,5)P3 Sam68 Rho Cdc42 RAS Sam68 RAF-1 СaN МЕК ERK-I/II NFАТ p38 MAP NF-kB JNK АР-1 STAT-3 Sam68 Транскрипция генов IL-1, IL-6, IL-12, TNF- ядро фагоцит Рисунок 4 – Гипотетический механизм регуляции лептином продукции провоспалительных цитокинов фагоцитами. Результатом взаимодействия FcγR с IgG-опсонизированной частицей на мембране фагоцита является инициация каскадов МАРК (ERK-I/II, JNK, p38 MAP) и активация CaN, необходимых для индукции ядерных транскрипционных факторов, в том числе: NF-kB, NFAT, AP-1. Регуляция L баланса продуцируемых цитокинов опосредована преимущественным взаимодействием STAT-3 и Sam68 с промоторными и/или энхансерными последовательностями генов провоспалительных цитокинов. Помимо этого, связывание L с Ob-R индуцирует Sam68-зависимую активацию молекул, таких как: PLC, РКС, PI3-K, которые инициируют активацию соответствующих МАРК (ERK-I/II, JNK, p38 MAP), и, следовательно, транскрипционных факторов: NF-kB, NFAT, AP-1, контролирующих синтез и продукцию провоспалительных цитокинов. 32 1.1.2. Молекулярные механизмы регуляция лептином функциональной активности лимфоцитов Регуляция лептином функциональной активности Т-лимфоцитов. Как зрелые Т-лимфоциты, так и тимоциты экспрессируют Ob-R [110, 133, 269]. Наличие Ob-R на лимфоидных предшественниках костного мозга определяет участие лептина в регуляции лимфопоэза [92, 156]. Помимо этого, лептин усиливает пролиферативный ответ стволовых гемопоэтических клеток [277]. В ряде работ показано, что нарушение выработки лептина у ob/ob мышей или его рецепции у db/db мышей сопровождается атрофией лимфоидных органов, снижением числа Т- и В-лимфоцитов в периферической крови, нарушением пролиферативного ответа Т-лимфоцитов, провоспалительных цитокинов и угнетением клеточно-опосредованных продукции иммунных реакций [80, 199, 214]. Подобные дисфункции иммунной системы описаны также при голодании [80, 199, 214]. В то же время, введение экзогенного лептина ob/ob мышам предотвращает атрофию лимфоидных органов, а также восстанавливает клеточно-опосредованные иммунные реакции и количество лимфоцитов периферической крови [122]. Тогда как внесение лептина db/db мышам не отменяет уменьшения массы и клеточности лимфоидных органов, а также дисфункций клеточно-опосредованного иммунного ответа [122]. Связывание лептина с Ob-R Т-лимфоцитов увеличивает экспрессию ранних активационных мембранных молекул: CD25 (рецептор к IL-2), CD69 (индуктор активации), CD71 (рецептор к трансферрину) как на CD4+, так и на CD8+ Т-лимфоцитах [211, 214]. В экспериментах in vitro показано, что лептин усиливает митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов человека [211, 267]. Гормон провоспалительных непосредственно цитокинов IL-2 и IFN- стимулирует секрецию Т-лимфоцитами, снижая продукцию противовоспалительного цитокина IL-4 [111] и, следовательно, играет важную роль в регуляции Th1/Th2 баланса. При дефиците лептина, напротив, выявлено угнетение секреции провоспалительных (IL-2, IFN-, IL-18, 33 TNF-) цитокинов и усиление продукции противовоспалительного (IL-4) цитокина СD4+ Т-лимфоцитами в ответ на антигенную стимуляцию [199]. При исследовании молекулярных механизмов реализации эффектов лептина на уровне Т-клеток установлено, что лигирование Ob-R запускает JAK/STAT сигнальный путь, ключевым этапом которого является стимуляция STAT-3 и Sam68 [285]. Последняя, связываясь с SH2-содержащими сигнальными молекулами, такими как PLC, РКС и PI3-K, инициирует другие посредники, вследствие чего изменяется функциональная активность клетки [285]. Так, активированная PLC запускает метаболизм PIP2, что приводит к стимуляции РКС. РКС совместно с PI3-K индуцируют каскады МАРК: ERK, JNK, p38 MAP, которые, в свою очередь, преимущественно активируют факторы транскрипции, цитокинов, такие как контролирующие синтез провоспалительных NF-kB, NFAT, AP-1. Кроме того, указанные транскрипционные факторы играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов IL-2, IL-2R (CD25) [208, 234]. А IL-2, в свою очередь, является аутокринным ростовым фактором Т-лимфоцитов и связывание его с мембранными рецепторами инициирует пролиферацию данных клеток. На уровне тимуса лептин усиливает процессы пролиферации и дифференцировки дубль-позитивных (СD4+СD8+) тимоцитов и предотвращает стероид-индуцированный апоптоз тимоцитов [133]. Известно, что не подвергшиеся селекции тимоциты гибнут в результате индукции глюкокортикоидами запрограммированной клеточной гибели [58, 133]. В экспериментах in vivo и in vitro показано, что атрофия тимуса у ob/ob мышей происходит, главным образом, за счет уменьшения массы и клеточности коры, где преимущественно и находятся СD4+СD8+ тимоциты [39, 133], тогда как пропорция СD4+ и СD8+ лимфоцитов периферической крови не меняется [133]. Введение экзогенного лептина мышам с отсутствием выработки гормона восстанавливает число СD4+СD8+ тимоцитов, предотвращая их апоптоз [133]. Анализ молекулярных механизмов индукции апоптоза тимоцитов показывает, что стероидные гормоны запускают классический апоптотический 34 сигнал, характерный для большинства эукариотических клеток [34, 35]. Он предполагает активацию кислой сфингомиелиназы (aSMase), гидролиз сфингомиелинов с образованием церамидов и индукцией каспаз. Каспазы, в свою очередь, стимулируют эндонуклеазу и участвуют в деградации ядерных белков, и, как следствие, запуске апоптоза. Механизм протективного действия лептина по предотвращению апоптоза тимоцитов обусловлен стимуляцией экспрессии продуктов Bcl-2 гена при лигировании Ob-R [133]. Установлено, что при взаимодействии лептина с Ob-R СD4+СD8+ тимоцитов STAT-3 связывается с промоторным участком Bcl-2 гена и усиливает его транскрипцию [133]. Антиапоптотический фактор Bcl-2 блокирует активацию каспаз и ингибирует церамид-индуцированный апоптоз тимоцитов [133]. Антиапоптотический эффект лептина может приводить к сохранению аутореактивных клонов Т-лимфоцитов и развитию аутоиммунных заболеваний [129]. Возможный механизм модуляции лептином активности Т-лимфоцитов представлен на рисунке 5. функциональной 35 TCR/CD3 CD4/CD8 L lck ZAP Vav PLC Sam68 JAK JAK Sam68 DAG IP3 STAT-3 ЭПР aSMase 2+ ↑Ca PKC церамиды RAS Sam68 СaN RAF-1 каспазы МЕК ERK-I/II JNK Sam68 NFAT NF-kB Bcl-2 Ap-1 апоптоз STAT-3 STAT-3 Транскрипция генов Транскрипция IL-2, IFN- , СD25, CD69,CD71 Bcl-2 гена ядро Т-лимфоцит Рисунок функциональной 5 – Гипотетический активности механизм Т-лимфоцитов. регуляции Сплошная стимулирующий эффект, пунктирная линия - угнетающий эффект лептином линия – 36 Влияние лептина на Т-регуляторные клетки. В настоящее время пристальное внимание исследователей привлекают регуляторные Т-клетки. Согласно современным представлениям одним из значимых механизмов поддержания иммунологической толерантности при беременности является сдвиг баланса регуляторных субпопуляций IL-17-продуцирующих лимфоцитов (Th17)/Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) в сторону увеличения Treg, обладающих иммуносупрессорной активностью [119, 155, 270, 319]. Тreg позиционируются как "истинные супрессоры", угнетающие иммунные реакции, как вследствии контактного взаимодействия с эффекторными клетками, а также вследствие активации индоламин-2,3-диоксигеназы и индукции иммуносупрессорного катаболизма триптофана [61, 224, 279]. Все это вызывает анергию и апоптоз Т-эффекторных клеток и способствует формированию специфической толерантности, что во многом определяет успешное протекание беременности, аллогенной трансплантации, а также эффективный контроль аутоиммунных реакций [61, 262, 279]. Наивные CD4позитивные Т-лимфоциты периферической крови, из которых дифференцируются Тreg и Th17, экспрессируют рецепторы к лептину [197]. Показано, что Тreg играют значимую роль в метаболитических дисфункциях [333]. Эти клетки могут накапливаться в висцеральной жировой ткани и предотвращать развитие ассоциированных с хронических ожирением [333]. воспалительных Однако сам лептин реакций, угнетает пролиферацию TCR-активированных Treg, усиливая проявления рассеянного склероза [213, 215]. Этими же авторами показано, что Тreg продуцируют значительные количества лептина и Ob-R [213, 215]. В работах другой группы исследователей показано, что лептин, в концентрации 100 нг/мл и выше, угнетал пролиферацию Treg, предварительно обработанных рапамицином [199, 248], а блокада рецепторов лептина усиливала пролиферацию Treg in vitro [104]. Эти же авторы показали, что рапамицин снижает количество рецепторов к лептину на Treg [248]. Предполагается, что лептин реализуется свои 37 угнетающие эффекты за счет активации mTOR сигнального пути, однако его эффекты неодназначны и зависят от исходного уровня активации клетки [248]. Субпопуляция регуляторных лимфоцитов - Th17, напротив, инициирует воспалительные, аутоиммунные реакции, а также реакции отторжения трансплантанта, а также способствует формированию и поддержанию хронических воспалительных процессов [55, 203]. При нормально протекающей беременности в периферической крови повышается количество Тreg, а пропорция Th17 падает [195, 197, 270]. Тогда как повышение количества Th17, а также продукции IL-17 в периферической крови на фоне снижения Treg ассоциировано с абортами [197]. В единичных работах показано, что лептин способствует конверсии наивных СD4+ Т-лимфоцитов в Th17 клетки в моделях in vivo и in vitro у мышей и усиливает тем самым выраженность коллаген-индуцированного артрита [107]. Таким образом, лептин, регулирующий метаболизм и основной объем является связующим звеном между энергетическим обменом и иммунным гомеостазом. Регуляция лептином функциональной активности В-лимфоцитов. Показано, что различные субпопуляции B-лимфоцитов экспрессируют рецепторы к лептину [49]. В единичных работах описаны эффекты лептина на функции В-лимфоцитов. Так введение лептина восстанавливает В-лимфопоэз у голодающих животных [287]. Лептин оказывает антиапоптотическое действие в отношении В-лимфоцитов, активируя экспрессию bcl-2 [190], а также усиливает секрецию TNF-α, IL-6, IL-10 B-лимфоцитами через JAK2/STAT3 и p38МАРК/ERK1/2 сигнальные пути [49]. Описаны ассоциированные с возрастом эффекты лептина. Так у стареющих животных по сравнению с молодыми лептин индуцирует значительно большую секрецию TNF-α, IL-6, IL-10 B-лимфоцитами посредством активации STAT3, что объясняет развитие хронических воспалительных процессов у пожилых людей [150]. Регуляция лептином функциональной активности NK-клеток. NK- 38 клетки экспрессируют как короткую, так и длинную форму Ob-R [335]. Угнетение выработки лептина у ob/ob мышей или его рецепции db/db мышей сопровождается уменьшением общего числа NK-клеток в печени, легких, селезенке, периферической крови, а также снижением их базальной и индуцированной цитотоксичности [199, 297]. являются NК-клетки основными эффекторами клеточно- опосредованного иммунного ответа, которые уничтожают пораженные вирусом клетки или опухолевые клетки двумя механизмами: перфоринзависимым цитолизом или апоптозом [335]. В экспериментах in vitro показано, что инкубация NK-клеток с лептином ob/ob мышей усиливает их цитотоксичность, однако на функциональную активность NK-клеток db/db мышей лептин влияния не оказывает [297]. Помимо этого, гормон также активирует IL-15-индуцированную цитотоксичность NK-клеток мышей дикого типа [297]. При исследовании механизма реализации эффектов лептина установлено, что усиление цитотоксичности NK-клеток под действием гормона обусловлено активацией STAT-3, стимулирующего экспрессию генов IL-2 и перфорина [199, 297, 335]. Исследования экспрессирующие последних Ob-R, лет показывают, характеризуются низкой что NK-клетки, экспрессией CD16, молекулы, отвечающей за АЗКЦ [320]. Эти же авторы показали, что инкубация NK-клеток с лептином в течение 18-24ч усиливает выработку IFN- и лизис опухолевых клеток, тогда как длительная инкубация с лептином дает обратный эффект [320]. Таким образом, лептин играет важную роль в дифференцировке и активации NK-клеток. В целом, лептин регулирует функции различных субпопуляций лимфоцитов и NK-клеток, выступая провоспалительным фактором, стимулирующим клеточно-опосредованные иммунные реакции, вследствие сдвига баланса секретируемых цитокинов по Тh1-типу. Таким образом, лептин является гормоном, который, регулируя интенсивность энергетического обмена, определяет функционирование клеток 39 иммунной системы и является важным регулятором неспецифической резистентности организма и адаптивного иммунитета. Модуляция концентрации лептина и экспрессии Ob-R фармакологическими агентами может служить важным инструментом, регулирующим направленность развития иммунных реакций патологических состояниях. при различных физиологических и 40 1.2. Регуляция грелином функциональной активности основных клеток врожденного и адаптивного иммунитета Грелин – пептидный гормон, который был открыт в 1999 году Коджима с соавторами, которые изучали механизм действия малых синтетических молекул, способных соматотрофными стимулировать клетками и продукцию взаимодействующих гормона со роста специальным мембранным рецептором, обозначенным GHS-R (growth-hormone secretagogues receptor), отличным от рецепторов гормона роста и рецепторов соматолиберина [181]. Проводя поиск естественного лиганда для GHS-R, эти авторы выделили из желудка крыс и идентифицировали природный гормон регулятор секреции гормона роста, который получил название «грелин» («ghrelin», как указывают авторы от корневого слова – «ghre» с учетом его способности к высвобождению гормона роста – growth hormone release). Грелин является аминокислотных слизистой ацилированным остатков, оболочкой энергетического который желудка обмена и и полипептидом, продуцируется, выступает метаболизма содержащим главным важнейшим жировой ткани 28 образом, регулятором [181]. В незначительных количествах грелин также вырабатывается в дугообразном ядре гипоталамуса, гипофизе, легких, кишечнике, поджелудочной железе, яичках, плаценте, почках, иммунокомпетентных клетках [56, 148, 181, 321]. Грелин разных видов млекопитающих обладает высокой степенью гомологии [181]. Содержание грелина у человека повышается перед едой и быстро падает после приема пищи [237]. У здоровых худощавых людей выработка грелина подвержена циркадным ритмам, снижается днем и повышается ночью [328]. Концентрации грелина падает при ожирении, и нарастает при голодании, резекции желудка, нервной анорексии [161, 181]. Кроме того, у человека уровень сывороточного грелина повышен в течение первых двух лет жизни, с последующим снижением до окончания полового созревания [280] и 41 наступления старости. Выявлены половые различия в содержании грелина в сыворотке крови [207]. Периферическое введение грелина экспериментальным животным повышает аппетит и приводит к накоплению жировой ткани [160]. Грелин стимулирует адипогенез, угнетает апоптоз адипоцитов и липолиз [175] и играет значимую роль в поддержании гомеостаза глюкозы, регуляции артериального давления [305]. На уровне гипоталамуса грелин действует на нейроны дугообразного ядра и увеличивает продукцию нейропептида Y (NPY) и агути-подобного белка (АПБ), угнетая ПОМК- и кокаин-амфетамин-регулируемый транскрипт содержащие нейроны, усиливая чувство голода, возбуждая аппетит и давая сигнал к началу приема пищи [161, 230]. Существует тесная взаимосвязь между двумя гормонами – лептином и грелином, регулирующими аппетит и энергетический гомеостаз. Содержание грелина в периферической крови нарастает перед едой, когда уровень лептина падает. И наоборот, после еды уровень грелина снижается, а содержание лептина нарастает. Антагонизм гормонов проявляется и на уровне гипоталамуса. Недавние исследования Kohno с соавторами показали, что лептин угнетает индуцированную грелином продукцию нейропептида Y, действуя на уровне нейронов гипоталамуса через фосфатидил-3-киназа и фосфодиэстераза-опосредованные сигнальные пути [179]. Помимо этого, лептин способен индуцировать экспрессию NREBP (негативного регулятора элемент связывающего белка) в GHS-R-позитивных нейронах гипоталамуса, и угнетать трансдукцию сигнала с GHS-R, тем самым, ограничивая эффекты грелина [183]. Грелин проявляет анаболитические свойства, стимулируя выработку СТГ и способствуя усвоению поступивших питательных веществ, используемых для дифференцировки тканей и роста [161, 181]. Следует подчеркнуть, что грелин является единственным гормоном, стимулирующим аппетит при периферическом введении, что, возможно, объясняется его способностью проникать через гематоэнцефалический барьер [161, 305]. 42 Усиление синтеза СТГ под действием грелина происходит путем увеличения продукции соматолиберина в гипоталамусе при взаимодействии грелина с GHS-R, а также при непосредственном связывании грелина с GHS-R на соматотрофных клетках передней доли гипофиза [245]. При этом усиление выработки СТГ под действием грелина не отменяется соматостатинами [161]. Грелин также стимулирует выработку АКТГ, кортизола и пролактина в гипофизе [98]. Регулируя выработку АКТГ, грелин принимает участие в контроле стрессорных реакций, снижая уровень тревожности при стрессе [282]. Содержание грелина в плазме крови прямо коррелирует с уровнем эстрадиола, креатинина, но обратно зависит от уровня соматостатина, инсулина, тироксина, лептина, тестостерона [307]. Грелин-продуцирующие клетки желудка экспрессируют эстрогеновые рецепторы [307]. Тогда как стимуляция андрогеновых рецепторов угнетает выработку грелина [307]. В недавних исследованиях показано, что грелин стимулирует пролиферацию и дифференцировку остеобластов, при участии PI3K и MAPK [106]. Введение грелина улучшает минерализацию костей в период менопаузы [106]. Хотя точный механизм реализации эффектов грелина на разные типы клеток костной ткани не изучен, выявленные феномены открывают перспективы его использование при лечении остеопороза. Лептин выступает антогонистом по отношению к эффектам грелина на метаболизм костной ткани [306]. Грелин усиливает пролиферацию и угнетает апоптоз разных типов клеток: адипоцитов [175], клеток почечной ткани [218], клеток поджелудочной железы [143], клеток кожи [235], мышечной ткани [125]. В отношении опухолевых клеток грелин может как стимулировать, так и угнетать их пролиферацию [278]. Грелин угнетает деление клеток опухоли молочной железы, щитовидной железы, аденокарциномы легких, но усиливает пролиферацию опухолей простаты, печени и коры надпочечников [278]. К настоящему времени накоплено большое количество данных, свидетельствующих о значимой роли грелина в защите органов и тканей от 43 старения. Так грелин отменяет возрастную инволюцию тимуса у стареющих животных, восстанавливая клеточность и архитектуру тимуса [60]. Выявлена положительная взаимосвязь между уровнем грелина, его противовоспалительной активности и длинной теломеров, что является маркером клеточного старения [79]. Подводя итог вышесказанному можно заключить, что грелин, являясь основным регулятором пищевого поведения, играет значимую роль в контроле функций различных органов и тканей, однако особое значение принадлежит грелину в регуляции иммунной и репродуктивной систем [305]. 1.2.1. Структура грелина и его рецепторов Грелин – гормон белковой природы, молекулярной массы 3,3 кДа. Основным продуцентами грелина являются энтероэндокринные клетки слизистой желудка, которые выбрасывают грелин непосредственно в кровь [161, 181]. У человека грелин кодируется геном, содержащим последовательность препрогормона (117 аминокислот) – препрогрелин, из которого в результате альтернативного сплайсинга образуются грелин (28 аминокислот) и обестатин (23 аминокислоты) [334]. Далее молекула грелина подвергается посттрансляционному преобразованию. Фермент грелин-о-ацилтрансфераза (ГОАТ), синтезируемый в клетках слизистой желудка, этерифицирует гидроксильную группу серина в третьем положении октановой кислотой, в результате чего формируется две формы молекулы грелина: ацилированная и неацилированная (или дезацилированной) [162]. Процесс формирования молекулы грелина пердставлен на рисунке 6. 44 Рисунок 6 – Процесс формирования молекулы грелина [106] Предполагалось, что ацилирование грелина играет важную роль в приобретении им биологической активности, поскольку защищает от действия протеаз, наделяя его способностью стимулировать продукцию гормона роста [162], проникать через гематоэнцефалический барьер, взаимодействовать со специфическим рецептором [124, 181, 305]. Позднее из желудка крыс был очищен второй эндогенный лиганд для GHS-R, названный дезацилгрелин (неацилированная изоформа грелина), состоящий из 27 аминокислот [162]. Оказалось, что дезацилгрелин также обладает широким спектром биологической активности [291]. Предположительно, дезацилированный грелин, обладает кардиопротективной и антипролиферативной активностью, регулирует апоптоз, гомеостаз глюкозы, возможно, за счет связывания с особыми подтипами GHS-R [187, 305]. Недавними исследованиями установлено, что в супрафизиологических концентрациях дезацилгрелин также связывается с GHS-R1a [137]. Содержание дезацилгрелина в периферической крови составляет 85-90%, тогда как ацилированной формы – 10-15% [307]. Грелин реализует свои эффекты, связываясь со специфичными рецепторами GHS-R [187]. Известно, GHS-R относятся к суперсемейству рецепторов, ассоциированных с G-белками [187]. GHS-R присутствует в двух 45 формах: GHS-R1a (7 трансмембранных доменов), связывание грелина с которой приводит к мобилизации внутриклеточного кальция, и GHS-R1b (5 трансмембранных доменов), с которым грелин практически не взаимодействует [187]. GHS-R1a, главным образом, сосредоточены в гипоталамо-гипофизарной системе, но присутствуют в незначительных количествах и в других отделах ЦНС, а также в поджелудочной железе, легких, печени, почках, кишечнике, миокарде, селезенке, яичниках, яичках, надпочечниках, жировой и мышечной ткани, желудке, на большинстве клеток иммунной системы [56, 148, 181, 321]. В отличие от GHS-R1a, GHS-R1b экспрессируются во многих периферических органах и тканях, но отсутствуют в гипоталамо-гипофизарной системе [11]. Связывание лиганда с GHS-R1b не приводит к усилению выработки СТГ [187]. Альтернативными лигандами для GHS-R1а являются аденозин и кортистатин [187]. Сам грелин может взаимодействовать также с CD36 – рецептором для гликопротеинов, широко экспрессируемый на клетках крови [187]. Исследования последних лет показали, что при связывании грелина GHS-R1а происходит димеризация GHS-R с привлечением других типов Gсопряженных рецепторов с разными типами α-субъединиц G-белка (αi, αs, αq) [275], например с рецептором соматостатина, меланокортина, дофамина, серотонина [275]. В зависимости от специфичности α-субъединицы G-белка инициируются такие сигнальные каскады, как фосфолипаза С (PLC)зависимый путь с активацией протеинкиназы С (РКС) и повышением уровня внутриклеточного Са2+; аденилатциклаза (Ас) – РКА – зависимый путь [275]. Помимо этого, при лигировании GHS-R происходит диссоциация G-белка на α- и βγ-субъединицы, каждая из которых имеет собственные объекты действия [186]. αq-Субъединица активирует фосфолипазу С и гидролиз фосфатидилинозитола с образованием диацилглицерола (DAG) и инозитол1,4,5-трисфосфатом (IP3). IP3 взаимодействует со специфическими рецепторами эндоплазматического ретикулума, что вызывает высвобождение 46 Са2+ из внутриклеточных депо. DAG активирует протеинкиназу С, которая угнетает мембранные калиевые каналы, что приводит к деполяризации мембраны и открытию медленных потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа с последующим инфлюксом Са2+ [186]. Показано, что βγ-субъединицы G-белка способны активировать и PI3K [62], и Ас [186, 275] с последующей индукцией РКА. Стимуляция РКА также осуществляется комплексом Са2+/кальмодулин, через кальмодулин-зависимую протеинкиназу (CaMKK2) и АМP- активируемую протеинкиназу (АМРК) [90, 220], а также PI3K [62]. Таким образом, РКА играет значимую роль в реализации эффектов грелина, что отмечено в работах ряда авторов [143, 180]. Долгое время считалось, что GHS-R1b является неактивным и не связывается с ацилированной и дезацилированной формой грелина [186]. Однако в недавних исследованиях показано, что GHS-R1b может димеризоваться с GHS-R1а, ограничивая его функциональную активность [193]. GHS-R1b может димеризоваться и с другими типами рецепторов, например с рецепторами нейротензина, нейромедина U [193]. Широкое представительство GHS-R в лимфоидной ткани, а также в тканях фетоплацентарного комплекса свидетельствует о важной роли грелина не только в регуляции процессов роста и развития, но и в функционировании клеток иммунной системы и контроле репродуктивных процессов. 1.2.2 Иммуномодулирующая активность грелина К настоящему времени экспрессия GHS-R обнаружена на Т- и Влимфоцитах, моноцитах, макрофагах, тимоцитах, нейтрофилах [111, 153, 204]. Среди клеток иммунной системы, моноциты экспрессируют наибольшее количество GHS-R, число молекул которых значительно увеличивается при активации клеток [111, 204]. Уровень грелина в периферической крови повышается при воспалении, аутоиммунных процессах [170]. Многочисленные литературные данные 47 свидетельствуют о том, что грелин обладает выраженными противовоспалительными эффектами на направленность развития иммунных реакций, подавляя выработку провоспалительных цитокинов IL-1, TNF-, IL6, IL-17, IL-12, GM-CSF активированными Т-лимфоцитами [110-112, 314] посредством угнетения основного транскрипционного фактора, ответственного за их синтез, NF-B [112]. В экспериментальных моделях продемонстрированы противовоспалительные эффекты грелина при панкреатите, сепсисе, артрите, диабетической нефропатии, аутоиммунном колите [106]. Введение грелина в модели экспериментального панкреатита снижало уровень IL-1 и стимулировало пролиферацию клеток поджелудочной железы [106]. В модели индуцированного артрита введение грелина снижало уровень IL-6 и уменьшало выраженность воспалительного процесса [106]. Однократное введение грелина значительно облегчало клиническую и гистологическую картину течения индуцированного колита в модели у мышей, предотвращало потерю веса, диарею и повышало выживаемость животных [139]. Предполагается, что выявленные противовоспалительные эффекты грелина объясняются также угнетением выработки IL-8 и миграции в очаг воспаления эффекторных клеток - нейтрофилов и моноцитов, а также снижением выработки других провоспалительных факторов (TNF-, INF-, IL12, IL-15, IL-17, IL-18), на фоне повышения продукции противовоспалительных цитокинов IL-10 и трансформирующего фактора роста опухоли - 1 (TGF-1) [139]. Другим возможным механизмом противовоспалительных эффектов гормона является усиление формирования и функциональной активности Treg. Показано, что грелин усиливает генерацию IL-10/TGF--продуцирующих Treg из CD4+-лимфоцитов [139]. В условиях in vitro грелин может непосредственно взаимодействовать с Treg, поскольку эти клетки экспрессируют рецепторы к грелину [111]. Также гормон усиливает формирование Treg, действуя на дендритные клетки и угнетая на них экспрессию корецепторных молекул (CD80, 86, 40) [139]. В 48 экспериментальных моделях аутоиммунного энцефаломиелита и рассеянного склероза у мышей введение грелина уменьшало выраженность воспалительного процесса, снижало количество аутореактивных Th1 и Th17 в периферической крови и нервной ткани, и усиливало формирование Treg [281]. В работах Granata с соавторами показано, что грелин угнетает индуцированный IFN-gamma и TNF-alpha апоптоз и NO высвобождение при аутоиммунном диабете в клетках поджелудочной железы через цАМФ/PKA, ERK1/2, PI3K/Akt-зависимые пути [143]. Грелин угнетает ЛПС-индуцированную активацию NF-kB в мышиных макрофагах, но усиливает продукцию IL-10, активируя p38 MAPK [314]. В единичных экспериментах показано, что грелин дозозависимо угнетал продукцию активных форм кислорода полиморфноядерными лейкоцитами человека [116], а также миграцию нейтрофилов и макрофагов в очаг воспаления [307]. Грелин снижал фагоцитарную активность макрофагов крыс, подвергшихся холодовому стрессу [301]. Авторы полагают, что депрессивный эффект грелина реализуется путем угнетения гормоном активности iNOS и снижения продукции NO [301]. Другой группой исследователей было показано, грелин угнетает выработку NO стимулированными макрофагами [142]. Экспрессия самого грелина была выявлена в Т-лимфоцитах, Влимфоцитах, NK-клетках, моноцитах [112]. С возрастом, продукция эндогенного грелина Т-лимфоцитами снижается [112]. Полагают, что выработка эндогенного грелина лимфоцитами играет значимую роль в локальном модуляцию подавлении синтеза активности NF-kB провоспалительных [112]. Угнетение цитокинов грелином через NF-kB продемонстрировано и на эндотелиальных клетках [194]. В работах ряда авторов показано, что грелин играет значимую роль в регуляции функций тимуса. Рецепторы к грелину экспрессируются СD4+СD8+, СD4+СD8-, СD4-СD8- тимоцитами. Причем показано, что СD4+СD8+ экспрессируют в 2 раза больше рецепторов к грелину, чем остальные 49 тимоциты [111, 112]. С возрастом количество рецепторов к грелину на тимоцитах снижается, коррелируя с возратной инволюцией тимуса, и увеличением жировой инфильтрации. Инфузии грелина стареющим, но не молодым мышам восстанавливали клеточность и размеры тимуса, усиливали тимопоэз, снижали жировую инфильтрацию и улучшали структуру тимуса. Показано также, что усиление тимопоэза у стареющих мышей под влиянием грелина было связано с усилением миграции лимфоидных предшественников из костного мозга в тимус. Лептин также способствует усилению тимопоэза у возрастных мышей [111, 112], а также предотвращает стероид- индуцированный апоптоз тимоцитов, усиливая процессы пролиферации и дифференцировки СD4+ и дубль-позитивных (СD4+СD8+) тимоцитов, причем реализация его эффектов связана с преобладанием экспрессии длинной функционально активной формы рецептора к лептину именно на СD4+-клетках [176]. Таким образом, взаимодействие лептина и грелина проявляется и на уровне клеток иммунной системы. Ярким подтверждением тому являются работы Dixit и Waseem с соаторами, где показано, что грелин снижает лептининдуцированную продукцию провоспалительных, но усиливает выработку противовоспалительных цитокинов моноцитами, макрофагами и Т- лимфоцитами человека [111, 314]. Лептин в свою очередь усиливает экспрессию GHS-R на Т-лимфоцитах [111]. Подводя итог вышесказанному, можно заключить, что грелин, главным образом, проявляет противовоспалительную активность. Однако его эффекты исследованы в концентрациях, превышающих физиологические. Беременность сопровождается усилением реакций клеточно-опосредованного иммунитета и формированием состояния толерантности иммунной системы матери к полуаллогенному плоду. При этом жировой обмен и пищевое поведение претерпевают существенные изменения при беременности, что сопровождается повышение выработки как грелина, так и лептина. Поэтому изучение влияния грелина на иммунные реакции при беременности, и 50 особенно в сочетании с лептином, является особенно актуальным. Важность исследования обусловлена и пристальным интересом ученых к созданию фармакологических препаратов, на основе грелина для коррекции выработки гормона роста, лечения кахексии и астенизации, развивающихся при онкологических заболеваниях, синдроме приобретенного иммунодефицита, тяжелой сердечной недостаточности, после тяжелых оперативных вмешательств. Большое внимание привлекают антипролиферативные и гипотензивные эффекты грелина. Интересной кажется идея использования антител против грелина для лечения ожирения. 51 1.3. Роль лептина и грелина в контроле репродуктивных процессов Беременность с точки зрения иммунологии представляет собой феномен полуаллогенной трансплантации с элементами опухолеподобного инвазивного роста [27, 37]. С момента оплодотворения и до родов, зигота, а затем и плацента активно секретирует разнообразные биологически активные соединения, среди которых гормоны занимают наиболее важное место [37]. Во-первых, они определяют рост и развитие фетоплацентарного комплекса и, во-вторых, формируют иммунную привилегированность беременной матки, защищая плод от иммунной атаки матери [37]. При беременности потребность в питательных веществах резко возрастает, происходит физиологичное увеличение массы тела и глубокая перестройка энергетического и жирового обмена, контролируемая гормонами, где ведущая роль принадлежит лептину и грелину [291-294]. Оба гормона синтезируются фетоплацентарной структурой [212, 291-294]. Уровень грелина нарастает в I-II триместрах беременности, но снижается к поздним срокам [131]. А уровень лептина, напротив, повышается, достигая максимума в III триместре беременности [152]. Участие лептина в регуляции репродуктивных процессов обусловлено экспрессией Ob-R яичниками, семенниками, плацентой, эндометрием, эмбрионом [148, 212]. Лептин, усиливая синтез ГнРГ, опосредованно через повышение выработки кисспептина, участвует в инициации полового созревания, запускает секрецию ЛГ, ФСГ [292]. Мыши с ожирением, обусловленным недостаточной секрецией лептина, бесплодны, при этом бесплодие устраняется введением лептина. Лептин играет важную роль в процессе имплантации. Лептин, продуцируемый плацентой, регулирует рост и развитие плода [259, 260], гемопоэз плода [221]. Циркулирующий грелин оказывает общее депрессивное действие на гипоталамо-гипофизарно-гонадную ось: угнетая синтез ГнРГ, и далее ЛГ, влияя на сроки полового созревания, угнетая выработку ХГ, тестостерона, дифференцировку незрелых клеток Лейдига, сперматогенез [148, 229, 233]. В исследованиях ряда ученых показано, что повышенный уровень грелина при 52 голодании препятствует развитию бластоцисты и процессу имплантации, предположительно, чтобы предотвратить избыточное энергетическое потребление при беременности. Причем этот эффект реализуется через GHS-R [78]. Грелин играет значимую роль на всех этапах гестации. Исследователи отмечают высокую концентрацию грелина в экстраворсинчатом трофобласте, особенно на концах ворсин, в первом триместре беременности, предполагая, его участие в процессе инвазии трофобласта [148, 229]. Грелин стимулирует пролиферацию клеток плаценты и угнетает их апоптоз [251]. Грелин ингибирует сокращение эндометрия [154]. Исследователи полагают, что снижение содержания грелина в третьем триместре беременности может быть связано с подготовкой к родам [241]. Грелин матери, проникая через фетоплацентарный барьер, регулирует рост и развитие плода, путем индукции выработки СТГ гипофизом плода, а также стимулируя пролиферацию клеток плода [235]. Плод сам продуцирует фетальный грелин [102]. В экспериментах на животных показано, что иммунонейтрализация грелина матери приводит к угнетению массы плода. В работах Barreiro M.L. и соавт. (2002), Tena-Sempere M. и соавт. (2002) впервые было показано, что грелин продуцируется в клетках Лейдига яичек крыс [64, 292]. Минимальный уровень грелина определяется в допубертатных образцах яичек, наибольшая степень экспрессии наблюдается у взрослых особей грызунов. В исследованиях этих же авторов было доказано наличие в яичках мРНК GHS-R, а так же продемонстрировано, что грелин дозозависимо снижает секрецию тестостерона. Грелин обнаруживается в грудном молоке и молозиве [307]. Подводя итог вышесказанному, можно полагать, что лептин и грелин реципрокные регуляторы пищевого поведения и энергетического баланса, действуя на разных уровнях гипоталамо-гипофизарно-гонадальной оси, проявляют антагонистические свойства в регуляции репродуктивных процессов [21]. Так, лептин является значимым стимулятором пубертатного 53 созревания, а также выработки гонадотропных гормонов. Грелин, напротив, оказывает угнетающее действие на гипоталамо-гипофизарно-гонадальную ось. Однако следует отметить, что нарушения выработки или рецепции лептина сопровождается глубокими пороками полового развития и бесплодием, тогда как нарушения выработки либо рецепции грелина не приводят к серьезным последствиям для репродуктивной функции. На уровне гонад гормоны оказывают синергичное действие, угнетая, например, выработку тестостерона [64, 292]. Таким образом, система взаимодействия лептина и грелина является важным фактором, контролирующим перестройку энергетического обмена для осуществления репродуктивных процессов [21]. Поэтому изучение роли лептина и грелина в регуляции иммунных реакций в аспекте беременности является актуальной проблемой иммунологии репродукции. Эффекты лептина и грелина в регуляции энергетического обмена и репродуктивной функции суммированы на рисунке 7. 54 Лептин и его рецепторы (Ob-R) Грелин и его рецепторы (GHS-R) Экспрессия Жировая ткань (гипоталамус, гипофиз, яичники, семенники, эмбрион, эндометрий, плацента) Слизистая желудка (гипоталамус, гипофиз, яичники, семенники, эмбрион, эндометрий, плацента) Регуляция пищевого поведения и энергетического обмена Уровень нарастает после еды При ожирении уровень нарастает При голодании уровень падает Угнетает аппетит и чувство голода Усиливает симпатическую активность, скорость метаболизма и энергетического обмена Угнетает накопление жировой ткани Уровень нарастает перед едой и снижается после При ожирении уровень снижается При голодании уровень нарастает Усиливает аппетит и чувство голода Усиливает парасимпатическую активность, стимулирует выработку гормона роста и анаболитические процессы Усиливает липогенез, накопление жировой ткани, окисление глюкозы Участие в регуляции репродуктивных процессов Инициирует половое созревание Усиливает выработку ГнРГ Стимулирует синтез ЛГ и ФСГ Способствует имплантации и развитию эмбриона Тормозит половое созревание Угнетает выработку ГнРГ Угнетает синтез ЛГ Угнетает имплантацию и развитие блаcтоцисты Рисунок 7 – Эффекты лептина и грелина в регуляции энергетического обмена и репродуктивной функции 55 1.4. Механизмы формирования иммунной толерантности при физиологически протекающей беременности Беременность представляет собой физиологически обусловленное состояние толерантности иммунной системы матери к полуаллогенному плоду, которое формируется (периферическом) физиологически на системном уровне [25, протекающей 37]. (центральном) Системная беременности и локальном толерантность развивается в при результате сенсибилизации фетальными антигенами за счет проникновения клеток плода в материнскую циркуляцию [25, 27, 37]. Эффекторные клетки матери распознают антигены оплодотворенной яйцеклетки, что подтверждается увеличением регионарных лимфатических узлов при физиологически протекающей беременности, атрофией тимуса, и появлением антител к антигенам отца у матери [25, 37]. Гормоны, продуцируемые плацентой, определяют системные изменения иммунореактивности, угнетая системный цитотоксический иммунный ответ на антигены отца и, напротив, способствуя преобладанию Тh2-иммунного ответа, с повышенной генерацией блокирующих антител и клеток с супрессорной активностью [8, 37]. Локальная (местная) толерантность при беременности формируется в зоне контакта матери и плода, где клетки иммунной системы матери непосредственно взаимодействуют с фетальными антигенами [16, 18, 23]. Основой для формирования периферической толерантности является системное, гуморального опосредованное иммунного гормонами ответа, что плаценты, доминирование сопровождается повышенной выработкой Th2-цитокинов, главным образом, IL-4 и IL-10, при резком снижении IL-2 и IFN- [8, 15, 264]. Преобладание Th2/Th3-цитокинов и влияние гормонов плаценты создает условия для повышенной генерации незрелых (толерогенных) ДК и, как следствие, индукции формирования супрессорных популяций регуляторных Т-клеток (адаптивных Treg, Tr1, Th3, Ts) в маточно-плацентарной зоне [263, 265, 318], а также привлечения 56 супрессорных клеток (nTreg) периферической крови, количество которых при беременности значительно повышается [155,263, 265, 266]. ДК являются основными антиген-презентирующими клетками, которые могут инициировать как развитие иммунного ответа, так и состояния толерантности [146]. При нормально протекающей беременности в периферической крови увеличивается доля толерогенных (незрелых) ДК, не контактировавших с паттернами патогенов, с низкой экспрессией молекул главного комплекса гистосовместимости II класса, костимулирующих молекул (CD40, CD80, CD86), IL-12p70, но усиленной продукцией толерогенных цитокинов IL-10, TGF-β1 [24, 201, 164]. Стабилизировать толерогенные свойства незрелых ДК способны медиаторы с противовоспалительной активностью (IL-10, TGF-β1, GM-CSF и др), угнетающие NF-B в ДК, что препятствует их созреванию, снижая экспрессию костимулирующих молекул CD80 и CD86 [250]. Низкие уровни экспрессии CD80 и CD86 на поверхности ДК способствуют анергии эффекторных клеток, но усиливают супрессорные функции Treg [224]. Генерирование разных субпопуляций регуляторных клеток определяется цитокиновым микроокружением. Незрелые (толерогенные) ДК, продуцируя толерогенные цитокинов (IL-10, TGF-β1) при контакте с наивными CD4+-лимфоцитами, способствуют их трансформации в супрессорные популяции регуляторных клеток (аTreg, Tr1, Th3, Ts) [24, 164, 201]. Помимо этого, толерогенные ДК при взаимодействии с nTreg через CTLA-4 индуцирует активность формированием токсичных IDO и продуктов, метаболизм триптофана с взаимоусиливая супрессорные свойства друг друга [246]. Недавними исследованиями показано, что субпопуляция регуляторных Влимфоцитов (Вreg), благодаря продукции иммуносупрессорных цитокинов (IL-10 и TGF-β1) и контактных взаимодействий, играет ведущую роль в индукции адаптивных Treg, поляризации иммунного ответа и созревании ДК [69]. Вопрос о фенотипических маркерах Вreg остается открытым. Показано, 57 что CD19+CD25high В-лимфоциты продуцируют большие количества IL-10, иммуноглобулинов и костимулирующих молекул по сравнению с CD19+CD25В-клетками [76] и обладают лучшей способностью к презентации антигенов [52]. Показано, что ряд CD19+CD25high В-лимфоцитов экспрессируют FOXP3 [239]. Вreg наряду с Treg играют критическую роль в поддержании аутотолерантности и предотвращении аутоиммунных процессов [325]. Активация Breg происходит, главным образом, через toll-подобные рецепторы, те на более ранних этапах иммунного ответа, чем Treg [222]. Поэтому полагают, что именно Breg являются основными индукторами формирования адаптивных Treg, а также продуцируют хемокины, способствующие привлечению и накоплению Treg [239], усиливают их супрессорные функции, повышая экспрессию FOXP3 и CTLA-4 [173]. В-клеточные дефициты сопровождаются снижением числа периферических, но не тимических Treg [86]. Помимо этого, Breg осуществляют иммуносупрессию, вступая во взаимодействие с CD4+Т-лимфоцитами через молекулы PD1,2, TRAIL, Fas-L, индуцируют их апоптоз [178], угнетают их пролиферацию [196] и продукцию IFN-gamma и IL-17 Th1, Th17 соответственно [85]. В экспериментах in vitro установлено, что Breg угнетают выработку IL-12 и IFN-gamma ДК, препятствуя их созреванию и способствуя Th2-поляризации [85]. Отмечено, что количество Вreg нарастает при беременности, тогда как при спонтанных абортах уровень Вreg ниже, чем у небеременных женщин [255]. Эти же авторы показали, что В-лимфоциты беременных женщин, но не женщин со спонтанными абортами, обладают способностью угнетать продукцию TNF-a T-лимфоцитами. Предполагают, что именно повышение уровня Breg облегчает течение рассеянного склероза при беременности [231]. Таким образом, Вreg являются значимыми эффекторами периферической толерантности при беременности. Сама плацента продуцирует большие количества иммуносупрессорных цитокинов - TGF-1 и IL-10, которые также предопределяют формирование регуляторных популяций Т-клеток с мощной супрессорной активностью - Th3 58 и Tr1 [168]. Если примирование антигена наивным CD4+-лимфоцитам происходит в присутствии IL-10 или TGF-, то они дифференцируются в Tr1или Th3-клетки, соответственно [168]. Tr1 клетки в свою очередь секретируют высокие уровни IL-10 и TGF-1, и незначительные количества IL-2 и IL-4, опосредуя супрессорную функцию через цитокин-зависимый механизм [232]. Th3 клетки, индуцируемые высоким уровнем TGF-1, за счет активной продукции собственного TGF-1, также угнетают различные иммунные ответы [91, 232]. В слизистой децидуальной оболочки постоянно присутствуют Т-клетки, которые при беременности тоже продуцирует Th2/3 цитокины, протектируя процессы гестационного развития [91, 232]. Взаимодействие антигена с Тклеток приводит к секреции IL-10, TGF-1 и угнетению IL-12 и NKактивности, поэтому их идентифицируют как функционально активные Tr1 клетки [91, 232]. Популяция децидуальных NKТ-клеток в основном представлена CD1dрестриктированными (iNKT) клетками, которые принимают участие и в аутоиммунных реакциях, и в формировании толерантности [74], а также имеют важное значение для выживании плода [236, 302]. Молекула CD1d обнаружена на поверхности ворсинчатых и экстраворсинчатых трофобластов, которые непосредственно проникают в ткани материнского организма [216]. Контакт между экстраворсинчатым трофобластом, экспрессирующим СD1d, и iNKT-клетками децидуальной облочки способствует формированию Th2-типа цитокинового окружения и индуцирует толерантность на фетоматеринской границе [74, 216]. Кроме того, CD1d/iNKT-взаимодействия приводят к продукции GM-CSF, который способствует развитию эмбриона [74]. Таким образом, присутствие супрессорных регуляторных Т-клеток, а также iNKT-клеток, Т-лимфоцитов и толерогенных ДК в децидуальной оболочке и регионарных лимфоузлах во время беременности угнетает функциональную активность ЦТЛ, индуцируя состояние периферической 59 толерантности. Важно отметить, что толерантность к антигенам плода на уровне децидуальной оболочки не вызывает общей иммунодепрессии и не препятствует возможности иммунной системы матери отвечать на другие антигены [37]. Формирование локальной толерантности также включает эффекты иммуносупрессорных молекул трофобласта, индуцирующих выработку Th2/Th3-цитокинов (метаболиты триптофана, HLA-C, HLA-G, HLA-E, СD200), препятствующих запуску комплемент-зависимых механизмов (DAF, MCP, CD59, IDO) и вызывающих апоптоз фетореактивных клеток врожденной иммунной системы и адаптивных Т-клеточных клонов (Fas-L, TRAIL, PD-L1/2) [37]. На плаценте выборочно представлены молекулы HLA с ограниченным полиморфизмом, такие как HLA-C, HLA-G, HLA-F и HLA-E, что способствует поддержанию состояния Т-клеточной толерантности, и блокируют цитотоксические эффекты NK-клеток матери [27, 329]. Растворимые и экспонированные на трофобластах молекулы МНС представляют серьезный барьер, препятствующий активации клеток адаптивной и врожденной иммунной системы, формируя условия локальной толератности [329]. Молекулы CD200, экспрессируемые децидуальной оболочкой, взаимодействуют с рецептором - CD200R, выявленном на миелоидных клетках, Т-лимфоцитах, макрофагах и ДК [120, 140]. Связывание CD200 с CD200R запускает активацию фермента IDO и толерогенный путь катаболизма триптофана, что является необходимым условием для формирования специфической толерантности к антигенам плода [120, 140]. Недостаток триптофана в месте взаимодействия Т-лимфоцитов и синцитиотрофобласта, а также продукты метаболизма триптофана, такие как кинуренин, 3-гидроксикинуренин и 3-гидроксиантраниловая приводят к анергии и гибели Т-лимфоцитов [120, 140]. кислота 60 Распознавание антигенов плода на поверхности синцитиотрофобласта может активировать систему комплемента, приводя к гибели клеток трофобласта [138]. Для успешной беременности важно предотвратить активацию системы комплемента, поскольку спонтанная индукция системы комплемента может спровоцировать гибель клеток плаценты [138]. При беременности на плаценте присутствуют молекулы (MCP, DAF и CD59), угнетающие комплемент [138]. Клетки плаценты также экспрессируют на своей поверхности молекулы, индуцирующие апоптоз. Основной молекулой является Fas-L (CD178), которая присутствует и в виде растворимой молекулы (sFas-L) [171]. Система Fas/Fas-L играет решающую роль в активационном апоптозе эффекторных Т-лимфоцитов. Экспрессия Fas-L на клетках трофобласта эффективно контролируется гормонами беременности [171]. Помимо Fas/Fas-L плацента экспрессирует систему TNF/TNF-R [115], которая успешно дополняет Fas/Fas-L-механизм фетальной толерантности. TRAIL гомологичен Fas-L и также эприсутствует на трофобласте [284]. TRAIL и Fas-L запускают общие сигнальные пути, вызывающие гибель иммунных клеток путем апоптоза [284]. Установлено, что TRAIL кооперируется с Fas-L, что угнетает пролиферацию лимфоцитов [284]. Таким образом, Fas-L, TRAIL, и ряд других молекул играют важную роль в обеспечении иммунной толерантности при беременности, индуцируя апоптоз аллореактивных Т-клеток [37]. Все вышеперечисленные факторы определяют специфические условия в зоне контакта матери и плода, необходимые для поддержания беременности при сохранении защитных свойств организма матери. Система взаимодействия лептина и грелина контролирует перестройку энергетического обмена для осуществления репродуктивных процессов. Вышеописанные иммуномодулирующие эффекты лептина и грелина предполагают значимую роль гормонов в регуляции основных клеток иммунной системы – эффекторов периферической толерантности при беременности. 61 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Дизайн исследования Работа выполнена в ФГБУН Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (ИЭГМ УрО РАН) г. Пермь в лаборатории иммунорегуляции, возглавляемой заслуженным деятелем науки РФ, д.м.н., профессором Ширшевым С.В. Иммуномодулирующая активность лептина и грелина оценивалась в модели in vitro. Иммунные клетки выделялись из биологических субстратов доноров, отмывались, а затем культивировались в питательной среде в присутствии гормонов, после чего определяли их функциональная активность в соответствии с поставленными задачами. В контрольные пробы вместо гормонов вносили физиологический раствор, используемый для растворения гормонов. Данный экспериментальный подход широко используется для исследования клеточных и молекудярных механизмов действия биологически активных веществ [28, 276, 320], поскольку позволяет исключить влияние множества факторов, присутствующих в биологических субстратах разных индивидуумов, что неизбежно при исследовании in vivo, и дает возможность вычленить роль конкретного соединения. Все выполненные исследования проводились согласно Хельсинской Декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. В качестве объектов исследования использовались мононуклеарные гепаринизированной клетки, периферической крови которые выделяли практически из здоровых небеременных женщин-добровольцев репродуктивного возраста (от 19 до 37 лет). Критериями отбора доноров являлись: отсутствие хронических, аутоиммунных, аллергических заболеваний, отсутствие приема гормональных, иммуномодулирующих и анаболических препаратов, отсутствие диеты (по данным словесного (нормостеники), опроса), наличие индекс массы информированного тела (ИМТ) согласия менее донора 25 на 62 использование биологического материала в научных целях. ИМТ рассчитывали по формуле "ИМТ = масса тела (кг) ÷ рост2 (м) ". В исследовании приняло участие 142 донора. Забор крови осуществлялся в утренние часы в фолликулярную фазу менструального цикла (2-8 день), поскольку известно, что прогестерон, эффекты которого превалируют в лютеиновую фазу цикла, модулирует экспрессию рецепторов лептина [188] и грелина [290]. Кроме того, уровень грелина у женщин в фолликулярную фазу несколько выше, чем в лютеиновую [100, 283]. В соответствии с поставленной целью работы, исследуемые гормоны использовали в концентрациях, отражающих их содержание в периферической крови по триместрам беременности, что экстраполировать с определенной полученные долей результаты вероятности для позволит характеристики иммуномодулирующей активности гормонов в аспекте беременности, где их роль особенно важна и практически не изучена. Использование в качестве объекта исследования клеток периферической крови небеременных женщин, обусловлено необходимостью вычленения роли конкретно изучаемых гормонов, поскольку в крови беременных эти гормоны уже присутствуют в исследуемых концентрациях, наряду с еще более 200 различными гормонами и биологически активными соединениями, которые продуцируются плацентой при беременности [32, 33, 41, 319, 329, 332]. Тогда как у небеременных женщин концентрация лептина и грелина в периферической крови на порядок ниже, чем у беременных [131, 152]. Использование клеток экспериментальных животных с мутациями соотвествующих генов, отвечающих за синтез или рецепцию лептина и грелина также невозможно, поскольку данные мутации сопровождаются глубокими дефектами репродуктивной функции и бесплодием [59, 80, 122, 126, 335]. Данный экспериментальный подход используется и другими авторами для оценки молекулярных и клеточных механизмов иммуномодулирующих эффектов различных соединений, в том числе и гормонов, для последующей экстраполяции полученных данных для характеристики роли изучаемых соединений в аспекте беременности [24, 276]. 63 Для исследования влияния гормонов на тимический этап дифференцировки лимфоцитов использовали тимоциты детей до года, которые выделяли из фрагментов тимуса, полученных в ходе сердечно-сосудистых операций при коррекции врожденных пороков сердца в соответствии с существующей хирургической практикой. Тимэктомия проводилась в соответствии с существующей хирургической практикой Федерального краевого центра сердечно-сосудистой хирургии г. Перми. Исследования проводили согласно Хельсинской Декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. Критериями включения явилось наличие добровольного согласия на обследование со стороны законных представителей несовершеннолетних. В патогенезе врожденных пороков сердца лежит механизм нарушения системной гемодинамики, зависящий от сложности сердечного порока и вызывающий цианоз слизистых и кожных покровов. По наличию цианоза, включали тимусы детей с белыми пороками сердца, без цианоза слизистых и кожных покровов (с лево-правым сбросом крови, без смешивания артериальной и венозной крови (дефект межжелудочковой перегородки; дефект межпредсердной перегородки). Половой состав не учитывался, поскольку в возрасте до года половые различия, влияющие на функциональную активность тимоцитов, отсутствуют [13, 29]. Всего было проанализировано 16 тимусов. Следует отметить, что данный объект является единственным, позволяющим оценить тимический этап дифференцировки лимфоцитов, поскольку с возрастом происходит инволюция тимуса, что делает невозможным использование тимусов взрослых. А использовать тимоциты экспериментальных животных, также невозможно, поскольку процесс тимической дифференцировки имеет ряд принципиальных отличий у человека и мышей, как наиболее изученных объектов для иммунологических исследований [29, 55]. 64 2.2. Объекты исследования Объектами исследования являлись мононуклеарные клетки (МНЛ) периферической крови практически здоровых добровольцев репродуктивного возраста, небеременных женщин- которые получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (p=1,077 г/см3) («Sigma», США; «Спофа», Чехия, соответственно) по стандартной методике [42]. Полученную суспензию МНЛ (1×106 кл/мл) дважды отмывали раствором бесцветного Хэнкса или средой 199 и инкубировали в полной питательной среде (ППС) (среда RPMI-1640 с добавлением 10 mM HEPES; 2 mM L-глутамина; 100 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)) с гормонами в течение суток при 370С в условиях 5% СО2 и далее оценивали их фенотип и функциональную активность клеток в соответствии с поставленными задачами. Также из суспензии МНЛ выделяли обогащенную популяцию моноцитов. Для этого суспензию МНЛ инкубировали в стеклянных чашках Петри 45 мин при 370С с 5% ЭТС [4]. Далее неприлипшие клетки смывали средой 199, а адгезированные моноциты снимали механическим способом, дважды отмывали средой 199 и стабилизировали инкубированием в течение 45 мин при 40С в растворе бесцветного Хенкса [12]. Чистота выделения моноцитов, контролировалась гистологическим методом на мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, и составляла 75-85%, а также при использовании моноклональных антител к CD14 (Primary Anti-Human CD14; clone 2D-15C, ICN Ph., США) методом проточной цитометрии, где и было показано, что 78-85% выделенных таким образом мононуклеаров, были CD14позитивными. Полученную обогащенную популяцию моноцитов (1х10 6 кл/мл) инкубировали с гормонами в течение 1 ч при 370С, а затем исследовали их функциональную активность в соответствии с решаемыми задами. Целевые субпопуляции Т-лимфоцитов выделяли из суспезии МНЛ методом иммуномагнитной сепарации с использованием коммерческих 65 наборов в соответствии с инструкцией производителя: CD4+Т-лимфоциты (Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells; «Invitrogen», Norway), CD4+CD25+Т-лимфоциты (Dynabeads Regulatory T cell Kit «Invitrogen», Norway). Чистота выделения контролировалась методом проточной цитометрии с помощью моноклональных антител к CD4 (FITC Аnti-Human CD4, OKT-4, «eBioscience», США) и CD25 (PE anti-human CD25, BC96, «BioLegend», США) и составляла 78-85%. После выделения клетки отмывались средой 199 и стабилизировались инкубированием в течение 45 мин при 40С в ППС, после чего они использовались в соответствии с решаемыми задачами. Для оценки влияния гормонов на тимический этап дифференцировки клеток, тимоциты выделяли из фрагментов тимуса путем пипетирования [13]. Клетки трижды отмывали забуференным физиологическим раствором (рН=7,4) и ресуспендировали в RPMI-1640. Полученная суспензия содержала 78-85% кортикальных тимоцитов (CD4+CD8+), что контролировалось методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител к CD4 (PE Аnti-Human CD4, OKT4 «eBioscience», США) и к CD8 (PC5 Аnti-Human CD8, B9.11 «Beckman Coulter», США). Далее тимоциты (1-5х106/мл) инкубировали в плоскодонном 96-луночном планшете в полной питатательнолой среде (среда RPMI-1640, содержащая 10% ЭТС, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5*10-5М2-меркаптоэтанола, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в течение 48-72ч при 370С в условиях 5% СО2 с гормонами, после чего оценивали их функции. Жизнеспособность выделяемых целевых популяций клеток контролировалась в тесте с 0,01% эозином («Sigma», США) по стандартной методике и составляла более 95% [12]. 2.3. Биологически активные вещества 66 Лептин («Sigma», США) в культуры вносили в концентрациях 10 и 35 нг/мл, которые отражают его содержание в периферической крови в I и во IIIII триместрах беременности соответственно [152]. Грелин («Sigma», Израиль) использовали в концентрациях 1,25 и 0,83 нг/мл, сопоставимых с уровнем гормона в периферической крови в I-II и III триместрах беременности [131]. Также для исследования совместных эффектов гормонов, лептин и грелин в культуры вносили одномоментно в сочетаниях, соответствующих их содержанию в I-II (лептин 10 нг/мл + грелин 1,25 нг/мл) и во II-III (лептин 35 нг/мл + грелин 0,83 нг/мл) триместрах беременности. В контрольные пробы вместо гормонов добавляли физиологический раствор, используемый для растворения гормонов. Ряд показателей оценивали только в пробах с теми концентрациями гормонов, где были выявлены статистически достоверные эффекты. Влияние грелина на функциональную активность моноцитов изучали также на фоне блокады GHS-R специфическим антагонистом D-Lys3-GHRP-6 («Sigma», Израиль) в дозе 10-4 M [111, 314], который вносили вместе с гормоном. Для исследования Са2+-зависимых механизмов реализации эффектов грелина в ряд проб вносили блокатор медленных потенциалзависимых Са2+каналов L-типа изоптин («Knoll», Германия) в дозе 0,025 мг/мл [30]. 2.4. Оценка фагоцитарной активности моноцитов Оценку фагоцитарной активности моноцитов проводили методом, основанным на снижении свечения биолюминесценции E. coli lux+. Данный способ разработан и запатентован в Лаборатории иммунорегуляции ИЭГМ УрО РАН [40]. Готовую суспензию бактерий (180 мкл, 5х106/мл) вносили в лунки 96-луночного планшета для люминоскана, инкубировали при 37°С в течение 3-5 мин и снимали фоновый уровень свечения бактерии, затем после внесения клеточной культуры (соотношение клетка/бактерия равно 1/10), 67 измерялась степень гашения биолюминесценции в течение 30 мин, сопровождающая поглощение E. coli luх+ фагоцитирующими клетками (рисунок 8). Рассчитывали индекс фагоцитарной активности клеток (ИФА), отражающий процент гашения биолюминесценции по сравнению с исходным уровнем по формуле: ИФА=((х1-х2)/х1)×100, где х1 – интенсивность биолюминесценции контрольной пробы, х2 – интенсивность биолюминесценции опытной пробы. Интенсивность биолюминесценции оценивали в динамике на приборе люминоскан «Аccent» (Финляндия) и выражали в относительных световых единицах (RLU). а б Индекс фагоцитарной активности (ИФА), % Изменение интенсивности биолюминесценции, отн. световые ед. (RLU) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 мин 10 мин 20 мин Инкубация моноцитов с E.coli lux 30 мин 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 мин 10 мин 20 мин 30 мин Инкубация моноцитов с E. coli lux Рисунок 8 –Динамика интенсивности биолюминесценции (а) и ИФА (б) в культуре моноцитов, оцениваемая по поглощению бактерий E. coli lux+ [40]. В ряде экспериментов для изучения влияния лептина на фагоцитарную активность моноцитов при участии разных типов рецепторов исследовали поглощение частиц полистирольного латекса (1,5 мкм; “ДиаМ”, Россия), неопсонизированных (ФЭБ) и опсонизированных формалинизированных эритроцитов барана (опФЭБ) [6, 7]. Следует отметить, что фагоцитоз частиц полистирольного латекса происходит через неспецифические гидрофобные взаимодействия с мембраной фагоцита, тогда как фагоцитоз ФЭБ и опФЭБ осуществляется при участии тех же молекул клеточной адгезии и опсонизирующих факторов плазмы, что и естественных объектов [145]. 68 Опсонизацию эритроцитов барана проводили пулом сывороток от 12 здоровых доноров, инкубируя 30 мин при 370С, периодически взбалтывая. Оценку фагоцитоза проводили следующим образом. К 0,1 мл обогащенной суспензии моноцитов (1107/мл) добавляли 0,1 мл отмытых объектов фагоцитоза (латекс, ФЭБ, опФЭБ) в концентрации 1107/мл. Пробы инкубировали в полипропиленовых пробирках 20 мин при 37С, перемешивали и готовили мазок, который фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому. Рассчитывали процент фагоцитоза - количество фагоцитов, захвативших объекты фагоцитоза на 100 подсчитанных моноцитов и фагоцитарный индекс количество объектов фагоцитоза, которое в среднем приходится на одну фагоцитирующую клетку. Для исследования участия scavenger-рецепторов и рецепторов к С3-компоненту комплемента (CR3) в реализации модулирующих эффектов лептина на поглотительную функцию моноцитов в часть проб за 5 мин до внесения объектов фагоцитоза (ФЭБ, опФЭБ) добавляли блокатор scavenger-рецепторов (Poly I:C, 100 мкг/мл, «Sigma», США) [94], либо блокатор рецепторов к С3-компоненту комплемента (CR3) (С3-компонент комплемента, 1 мг/мл, «Sigma», США). Затем оценивали фагоцитоз по вышеописанной методике. 2.5. Оценка окислительной активности моноцитов в реакции люминолзависимой хемилюминесценции В качестве интегрального теста для оценки продукции активных форм кислорода (АФК) фракционированными моноцитами использовали реакцию люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) [101]. Метод основан на способности люминола (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона) к хемилюминесценции при окислении с максимумом интенсивности свечения при 425 нм [54]. Для этого в лунки 96-луночного плоскодонного планшета для люминоскана («Microlite 1, Thermo», Финляндия), вносили 180 мкл раствора бесцветного Хенкса («Биолот», Россия), содержащего люминол (5×10-4 М). 69 После инкубации в течение 3-5 мин при 37˚С и детекции фонового свечения добавляли 20 мкл клеточной суспензии (5×106 кл/мл) и оценивали интенсивность спонтанной ЛЗХЛ, затем в кювету вносили 20 мкл суспензии штамма бактерии E. coli К12, и фиксировали интенсивность стимулированной ЛЗХЛ в динамике на люминоскане «Ассent» (Финляндия). Результаты представляли в отн. ед. свечения (RLU). В ряде экспериментов в качестве стимуляторов использовали зимозан А (“Sigma”, США), опсонизированный пулом сывороток, либо частицы полистирольного латекса (1,5 мкм; “ДиаМ”, Россия). Для этого в пластиковую кювету прибора вносили 0,8 мл раствора, содержащего 110 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, 2,5 мМ MgCl2, 5 мМ глюкозы и 1·10-4М люминола (рН 7,4). После инкубации в течение 3-5 мин при 37С и замера фонового свечения добавляли 0,1 мл клеточной суспензии (1·106/мл) и при непрерывном перемешивании измеряли интенсивность спонтанной ЛЗХЛ. Затем в кювету вносили 0,1 мл опсонизированного зимозана, либо 0,1 мл раствора, содержащего частицы латекса в концентрации 1·107/мл и фиксировали интенсивность стимулированной ЛЗХЛ в течение 20 мин через каждые 5 мин. Анализ проводили на биолюминометре БЛМ-8703М (“Наука”, Россия). Результаты выражали в имп/сек/клетку. 2.6. Определение продукции NO моноцитами Определение продукции NO моноцитами проводили спектрофотометрически по уровню NO2¯ в супернатантах клеточных культур фракционированных моноцитов в микроварианте метода с использованием реактива Грисса [301]. 2.7. моноцитов Изучение активности секреторной миелопероксидазы 70 Активность миелопероксидазы (МПО) секреторной в супернатантах культур фракционированных моноцитов определяли методом спектрофотометрии [1, 12]. Для чего по 0,05 мл клеточных супернатантов вносили в лунки плоскодонного 96-луночного планшета, затем добавляли 0,1 мл субстратной смеси, состоящей из 0,04% ортофенилендиамина и 0,014% Н2О2 на фосфат-цитратном буфере (рН 5,0). После 10-мин инкубации при комнатной температуре останавливали реакцию внесением 0,1 мл 10% Н2SO4. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 492 нм на планшетном многоканальном спектрофотометре Anthos HMTL III (Labtec Instruments, Австрия). Результаты представляли в единицах оптической плотности (E). 2.8. Изучение активности эластазы моноцитов Активность фракционированных помощью фермента моноцитов специфического эластазы в тестировали синтетического супернатантах культур спектрофотометрически субстрата с N-альфа-бензол-L- аргинин-этилового эфира гидрохлорида (N-alpha-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride) (BAEE, «Sigma», США), растворенного в ацетонитриле [17, 242]. В лунки плоскодонного 96-луночного планшета добавляли 20 мкл исследуемого супернатанта, 15 мкл прогретого до 250С трис-буфера (pH 8) и 30 мкл 0,01 М субстратного раствора ВАЕЕ. Затем регистрировали увеличение оптической плотности на планшетном многоканальном спектрофотометре Anthos HMTL III («Labtec Instruments», Австрия) при длине волны 340 нм каждые 5 мин в течение 15 мин. Активность эластазы рассчитывали в условных единицах активности фермента (Е). Одна условная единица равняется 1 нМ гидролизованного субстрата за 1 мин. Активность фермента рассчитывали по формуле, учитывая максимальный прирост оптической плотности: D×К×n/ t×V = Е/мл, где D – нарастание оптической плотности за 1 мин, 71 К – коэффициент пересчета D в 1 нМ гидролизованного субстрата, n – разведение исследуемой пробы, t – время, V - объем пробы (мл). 2.9. Определение активности катепсина G моноцитов Определение активности фермента катепсина G моноцитов проводили в супернатантах культур фракционированных моноцитов спектрофотометрически с применением синтетического субстрата N-альфабензол-L-тирозинэтилового эфира гидрохлорид (N-alpha-Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester hydrochloride) (BТEE, «Sigma», США), растворенного в метаноле. Оптическую плотность фиксировали на многоканальном планшетном спектрофотометре Anthos HMTL III («Labtec Instruments», Австрия) при длине волны 340 нм каждую минуту в течение 10 мин. Активность катепсина G вычисляли по формуле (как для расчета активности эластазы) и представляли в мкмоль гидролизованного субстрата за 1 мин на 1,0 мл супернатанта (мкмоль/мл/мин) [17]. 2.10. Определение активности индоламин-2,3-диоксигеназы моноцитов Активность IDO определяли в супернатантах культур МНЛ спектрофотометрически по изменению концентрации кинуренина - первого стабильного продукта при деградации триптофана [75]. МНЛ активировали добавлением IFN-γ (10 нг/мл, «Вектор Бест», Россия) [167] или ЛПС - 100 нг/мл, («Sigma», США) [169], и инкубировали в растворе Хенкса, в присутствии триптофана 100 мкM («Sigma», США) в течение 4 ч. Далее отбирали 100 мкл клеточного супернатанта и смешивали с 50 мкл 30% трихлоруксусной кислоты, встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 5 мин. Затем в лунки 96-луночного планшета вносили 75 мкл супернатанта и добавляли равный объём реактива Эрлиха (100 мг п- 72 диметилбензальдегида, 5 мл уксусной кислоты ледяной) и оценивали оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре Biohit BP 800 («Bio-Tek Instrumens, Inc.», США) при длине волны 492 нм. Содержание кинуренина рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по пробам с известным содержанием кинуренина («Sigma», США). Принимая во внимание, что IDO синтезируется только в антигенпрезентирующих клетках, полученные результаты отражают синтез и секрецию IDO моноцитами. 2.11. Оценка фенотипа лимфоцитов и тимоцитов Определение фенотипа разных субпопуляций лимфоцитов и тимоцитов проводили методом иммунофлюоресценции на проточном лазерном цитофлюориметре FACSCalibur (“Becton Dickinson”, США) с использованием соответствующих моноклональных антител (МКА). Окрашивание производили согласно инструкции производителя МКА. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции окна использовали соответствующие изотипические контроли. Лимфоцитарный гейт выставляли на основе комбинации прямого и бокового светорассеивания и размера клеток. При учете результатов подсчитывали от 10000 до 100000 клеток. Для оценки влияния гормонов на экспрессию мембранных молекул Тлимфоцитами суспензию МНЛ инкубировали с гормонами 24ч и далее определяли следующие субпопуляции Т-клеток: Th-лимфоциты - CD3+CD4+ (CD3-FITC/CD4-PE, Сaltag, Франция) (Т-хелперы), цитотоксические Tлимфоциты (ЦТЛ) CD3+CD8+ (CD3-FITC/CD8-PE, Caltag, Франция). При изучении экспрессии CD25 на Тh-клетках оценивали количество активированных Th-лимфоцитов - CD3+CD4+CD25dim (FITC Аnti-Human CD4, RPA-T4, «eBioscience», США; PE anti-human CD25, BC96, Biolegend, США) и активированных цитотоксических Т-лимфоцитов CD3+CD8+CD25+ (Antihuman CD8-FITC, «Beckman Coulter, США; PE anti-human CD25, BC96, 73 Biolegend, США»). Экспрессию мембранного рецептора CD95 исследовали на Тh-клетках CD3+CD4+CD95+ (Anti-human CD4-PE, «eBioscience», США; FITC anti-human CD95, BC96, «eBioscience», США) и ЦТЛ: CD3+CD8+CD95+ (Antihuman CD8-PE, «eBioscience», США; FITC anti-human CD95, BC96, «eBioscience», США). Влияние лептина и грелина на количество Treg оценивали после суточной инкубации МНЛ с гормонами. Количество Treg оценивали по коэкспрессии CD25 и транскрипционного фактора FOXP3 [158], как процент CD4+CD25brightFOXP3+ клеток (Anti-Human FOXP3- Alexa Fluor® 488, 206D) в гейте CD4+CD25bright лимфоцитов (PE/Cy5 anti-human CD4, OKT4; PE antihuman CD25, BC96, «Biolegend», США). Также после суточной инкубации с гормонами определяли уровень NKклеток с фенотипом CD3-CD16+CD56+ и NKT-клеток с фенотипом CD3+CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16,56-PE, «Caltag», Франция). Для исследования участия лептина и грелина в изменении фенотипа NK-лимфоцитов с цитотоксического на регуляторный, а также в экспрессии хемокиновых молекул, МНЛ инкубировали с гормонами 72 ч в ППС и далее исследовали экспрессию поверхностных маркеров. Поскольку маркеры NK-клеток экспрессируются также на других типах лейкоцитов, наиболее важной для идентификации данных клеток молекулой является NKp46 (Anti-human CD335-PC5, «Beckman Coulter», США), конститутивно экспрессирующаяся только на NK-клетках [298]. Определяли маркеры активации NK-клеток – по экспрессии активационной молекулы NKG2D (Antihuman CD314-FITC, «eBioscience», США) и ингибиторных - LILRB1 (Antihuman CD85j-PE, «Beckman Coulter», США) и NKG2А (Anti-human CD159-PE, «Beckman Coulter», США). Для оценки хоминга NK-клеток оценивали экспрессию CCR7 (Anti-human CD197-FITC, «eBioscience», США) и Lселектина (Anti-human CD62L-FITC, «Beckman Coulter», США). Также производили оценку степени экспрессии маркера CD56 (Anti-human CD56-PE, «Beckman Coulter», США) на NKp46+ клетках. 74 Влияние гормонов на фенотипическое созревание тимоцитов, оценивали по изменению коэкспрессии молекул CD4/CD8, и переходу незрелых CD4+CD8+ - тимоцитов в более зрелые CD4+CD8- /CD4-CD8+- клетки. Для этого в гейте тимоцитов подсчитывали число CD4+CD8+; CD4+CD8-; CD4CD8+; CD4-CD8--клеток (PE Аnti-Human CD4, OKT4; PC5 Аnti-Human CD8, «eBioscience», США) методом проточной цитометрии. Поскольку известно, что основным тимопоэтическим фактором, поддерживающим рост и развитие тимоцитов, является IL-7 [43], исследовали влияние гормонов на экспрессию рецептора к IL-7 (CD127) на поверхности тимоцитов. Оценивали количество CD4+CD127+тимоцитов (FITC Аnti-Human CD4, OKT4; РЕ Аnti-Human CD127, eBioRDR5, «eBioscience», США). 2.12. Индукция формирования адаптивных Th17/Treg из наивных CD4+лимфоцитов периферической крови Влияние (индуцибельных) гормонов на индукцию Th17/Treg оценивали в формирования культурах адаптивных CD4+-лимфоцитов периферической крови. Для индукции формирования Th17 из CD4+Тлимфоцитов в культуры вносили IL-1β (10 нг/мл, «eBioscience», США) и IL-6 (10 нг/мл, «eBioscience», США), поскольку по данным литературы именно эти цитокины стимулируют экспрессию орфанового ядерного рецептора RORgamma-t (RORt) и дальнейшую продукцию IL-17A [47]. А для инициации формирования Тreg в культуры добавляли трансформирующий фактор роста опухоли - 1 (TGF-1) (5 нг/мл, «GIBCO») [298]. CD4+-лимфоциты инкубировали в плоскодонном 96-луночном планшете (105кл/мл - 5*106/мл) в полной питательной среде (среда RPMI-1640, содержащая 10% ЭТС, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5 х 10-5М2-меркаптоэтанола, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в течение 72 ч при 370С в условиях 5% СО2 с гормонами. Помимо этого во все культуры добавляли магнитные 75 частицы с нанесенными анти-CD3/CD28 МКА (Dynabeads Human T-activator CD3/CD28, «Invitrogen», Norway), имитирующими активацию лимфоцитов при контакте с антиген-презентирующими клетками, а также нейтрализующие анти-IFN и анти-IL-4 МКА (10 мкг/мл, «eBioscience»). После 72 ч инкубации с гормонами снимали супернатант, удаляли магнитные частицы, и оценивали фенотип лимфоцитов методом проточной цитометрии. Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 72 ч инкубации с гормонами, составляла 92-98%. Окрашивание поверхностных и внутриклеточных маркеров осуществляли согласно методике производителя МКА. Поскольку экспрессия транскрипционного фактора FOXP3 является основным маркером Treg [256], их количество оценивали как процент CD4+FOXP3+ клеток (Anti-Human FOXP3-Per-Cy5, PCH101; FITC Аnti-Human CD4, RPA-T4) в гейте CD4+-лимфоцитов. Для анализа гормональных механизмов регуляции функциональной активности Treg исследовали экспрессию CTLA-4 (CD152) (PE anti-human CD152, 14D3, “eBioscience”) и GITR - (индуцируемый глюкокортикоидами TNF-рецептор) (PE anti-human GITR, eBioAITR, “eBioscience”), GARP - (PE anti-human GARP, TNFRSF18, “eBioscience”) как на Treg, так и на CD4+тимоцитах. Число Th17 оценивали как процент CD4+-лимфоцитов (FITC Anti-Human CD4, RPA-T4), экспрессирующих транскрипционный фактор RORt (AntiMouse/Human ROR-gamma-t-PE, AFKJS-9, “eBioscience”) и IL-17А (AntiHuman IL17A-PerCP-Cy5.5, eBio64Dec17, “eBioscience”) в гейте CD4+лимфоцитов. Окрашивание наружных и внутриклеточных маркеров проводили согласно инструкции производителя моноклональных антител. В супернатантах культур CD4-позитивных Т-лимфоцитов, примированных IL-1β и IL-6, оценивали продукцию IL-17А методом иммуноферментного анализа согласно методике производителя («eBioscience», США). В отношении функциональной активности Th17 исследована экспрессия хемокинового рецептора CCR6 (PE anti-human CCR6, R6H1, 76 “eBioscience”) на CD4+IL17A+ лимфоцитах. Известно, что Th17 конститутивно экспрессируют CCR6, которые, по мнению ряда авторов, необходимы для трансэндотелиальной миграции Th17 в ткани [55]. В ряде случаев для оценки молекулярных механизмов реализации эффектов гормонов проводили ингибиторный анализ. Все фармакологические агенты вносили в концентрациях, которые наиболее эффективно по данным литературы блокируют специфические сигнальные пути и сигнальные молекулы. Поскольку индукция формирования Th17/Treg определяется, главным образом, конкурентной активацией транскрипционных факторов RORt или FOXP3 – где, по данным литературы, ведущая роль принадлежит цАМФ-зависимым механизмам [295] и фосфатидилинозитол-3киназа (PI3K)-зависимому сигнальному пути [103], исследовали роль гормонов на фоне внесения Н-89 (ингибитор протеинкиназы А, 1 мкг/мл, RD, UK) [295], и вортманнина - (ингибитора PI3K, 100 нМ, RD, UK) [103]. Ингибиторы добавляли за 1ч до внесения гормонов. Контролем служили пробы только с ингибиторами. 2.13. Влияние гормонов на формирования естественных Treg, Th17, инвариантных NKT-клеток тимуса Тимоциты инкубировали в плоскодонном 96-луночном планшете (105кл/мл - 5*106/мл) в полной питательной среде (среда RPMI-1640, содержащая 10% ЭТС, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5 х 10-5М2меркаптоэтанола, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в течение 72 ч при 370С в условиях 5% СО2 с гормонами. Формирование Th17 из CD4-позитивных тимоцитов стимулировали внесением в культуры IL-1β (10 нг/мл, “eBioscience”, США) и IL-6 (10 нг/мл, “eBioscience”, США) [47]. А для индукции формирования Тreg в культуры добавляли TGF-1 (5 нг/мл, “GIBCO”) [166]. Формирование инвариантных NKT-клеток стимулировали внесением IL-2 (100 U/мл, “eBioscience”) [99]. Помимо этого во все культуры 77 добавляли магнитные частицы с нанесенными анти-CD3/CD28 МКА (Dynabeads Human T-activator CD3/CD28, “Invitrogen”) и нейтрализующие анти-IFN- и анти-IL-4 МКА (10 мкг/мл, “eBioscience”) [47]. После 72ч инкубации с гормонами снимали супернатант, удаляли магнитные частицы, и оценивали фенотип тимоцитов методом проточной цитометрии на цитофлюориметре (“Becton Dickinson”, США). Жизнеспособность тимоцитов, определяемая в тесте с эозином, после 72 ч инкубации с гормонами составляла 95-98%. Для количественной оценки инвариантных NKT-клеток использовали антитела к инвариантной α-цепи Т-клеточного рецептора (антиVα24Jα18-TCR-PE, 6B11,“eBioscience”) в комбинации с анти-CD3-(PE-Cy5, UCHT1, “eBioscience”). Оценивали количество Vα24Jα18-позитивных клеток в гейте CD3+тимоцитов. Количество Treg оценивали как процент CD4+CD25brightFOXP3+ клеток (Anti-Human FOXP3-Per-Cy5, PCH101; FITC anti-human CD4, RPA-T4; PE antihuman CD25, BC96, “eBioscience”) в гейте CD4+CD25brightтимоцитов. Для анализа гормональных механизмов регуляции функциональной активности Treg исследовали экспрессию CTLA-4 (CD152) (PE anti-human CD152, 14D3, “eBioscience”) и GITR - (индуцируемый глюкокортикоидами TNF-рецептор) (PE anti-human GITR, TNFRSF18, “eBioscience”) на CD4+тимоцитах. Поскольку субпопуляция Th17 очень немногочисленна, при изучении влияния гормонов на индукцию Th17 в культурах IL-1β- и IL-6примированных тимоцитов, количество Th17 клеток оценивали как процент CD4+CD161+IL-17A+ (FITC anti-human CD4, RPA-T4; PE anti-human CD161, HP-3G10; Anti-Human IL17A-PerCP-Cy5.5, eBio64Dec17, “eBioscience”) в субпопуляции CD4+CD161+тимоцитов, а также как количество CD4+тимоцитов, экспрессирующих ROR-gamma-t+, IL-17A+ (Anti-Mouse/Human ROR-gamma-tPE, AFKJS-9; Anti-Human IL17A-PerCP-Cy5.5, eBio64Dec17; “eBioscience”). 78 2.14. Модуляция гормонами функциональной активности естественных Treg Для оценки модуляции гормонами функциональной активности естественных Treg CD4+CD25bright (nTreg) их выделяли из суспензии МНЛ методом иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Regulatory CD4+CD25+ Tcell Kit; Invitrogen). Полученную клеточную суспензию (1*105кл/мл - 5*106/мл) инкубировали в плоскодонном 96-луночном планшете, в ППС в течение 3 сут при 370С, в условиях 5% СО2 с гормонами. Исследовали влияние гормонов на пролиферацию, апоптоз и экспрессию CTLA-4 и GITR, GARP. Рассчитывали процент CD4+CD152+FOXP3+ и CD4+GITR+FOXP3+, CD4+GARP+FOXP3+ в гейте CD4+FOXP3+ лимфоцитов (PE anti-human CD152, 14D3; PE anti-human GITR, TNFRSF18; PE anti-human GARP, 14D3, “eBioscience”, США). 2.15. Оценка апоптоза лимфоцитов и тимоцитов Апоптоз оценивали методом проточной цитофлюориметрии на проточном цитометре FACSCalibur (“Becton Dickinson”, США) путем окрашивания проб аннексином-V (AnV-FITC) и йодистым пропидием (PI) с использованием коммерческого набора Annexin V – FITC Kit (IMMUNOTECH, Франция) согласно инструкции производителя. Используемый метод позволяет идентифицировать клетки, подвергшиеся раннему (обратимому) (AnV+/PI-) и позднему (необратимому) (AnV+/PI+) апоптозу [22]. Для индукции апоптоза лимфоцитов использовали анти-CD3 МКА (5 мкг/мл, «Медбиоспектр», Россия), которые вносили в культуры вместе с гормонами [70]. После суточной инкубации МНЛ с гормонами производили окрашивание и регистрировали количество лимфоцитов, находящихся в ранней и поздней стадии апоптоза. Для индукции апоптоза тимоцитов использовали дексаметазон (10-6 М, «KRKA», Словения) который добавляли в культуры перед гормонами, далее 79 инкубировали 48ч и оценивали апоптоз [313]. Контролем служили пробы, в которые добавляли только индуктор апоптоза. Апоптоз nTreg оценивали вышеописанным методом после 72ч инкубации с исследуемыми гормонами. 2.16. Оценка пролиферации лимфоцитов и тимоцитов Пролиферация клеток (Treg, тимоцитов) оценивалась по окрашиванию витальным красителем CFSE с использованием CellTracetm CFSE Cell proliferation Kit («Invitrogen», США) согласно инструкции производителя. Детекция результатов производилась методом иммунофлюоресценции на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (“Becton Dickinson”, США). Клеточную суспензию (1х105 кл на пробу) отмывали в 0,1% BSA/PBS-буфере, окрашивали CFSE, согласно инструкции к набору, инкубировали 10 мин при 370С, затем дважды отмывали в холодной RPMI 1640, содержащей 10% ЭТС. После чего ресуспендировали в ППС, и вносили стимулятор, с которым клетки преинкубировались в течение 1ч, далее клетки отмывались средой RPMI-1640, вносились в 96-луночный планшет и инкубировались с гормонами с добавлением анти-CD3/CD28 моноклональных антител 72 ч в условиях 370С и 5% СО2. После инкубации клетки отмывали в растворе Хэнкса и подвергали подсчету на проточном цитофлуориметре. При оценке пролиферации Treg в качестве стимулятора использовали рапамицин (100nM, InvivoGen, США), с которым клетки преинкубировались в течение 1ч [248, 249]. При оценке пролиферации тимоцитов в качестве стимулятора использовали – ФГА (PHA, 5 мкг/ml, «Sigma», США) и ИЛ-2 (100 МЕ/мл, «Sigma», США) [104]. 80 2.17. Определение уровня цитокинов в супернатантах клеточных культур Определение количества цитокинов в супернатантах клеточных культур (TNF-, IFN-, IFN-, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17А, TGF-β1) проводили иммуноферментным методом (ИФА) с использованием коммерческих наборов (ООО «Цитокин», Россия; ООО «Протеиновый контур», Россия; ЗАО «ВекторБест», Россия; «eBioscience», США) согласно методике производителя. Контролем служили пробы, в которые вместо гормонов вносили равное количество ППС. Продукцию цитокинов моноцитами исследовали в супернатантах культур после 24 ч инкубации с гормонами. Выработка цитокинов разными популяциями Т-лимфоцитов оценивалась в супернатантах их культур после 24-72 ч инкубации с гормонами. В ряде экспериментов уровень цитокинов оценивали на фоне стимуляции ЛПС (E.coli; 026:B6; «Sigma», США, 100 нг/мл) [227]. Продукцию IFN- и IL-4 тимоцитами оценивали в супернатантах культур тимоцитов (10 6/мл) после 48 ч инкубации исследуемыми гормонами. 2.18. Оценка внутриклеточной продукции цитокинов лимфоцитами и тимоцитами Для изучения роли гормонов в индукции внутриклеточного синтеза IFN и IL-4, выделенные клетки (МНЛ, тимоциты) (105/мл - 5*106/мл) инкубировали с гормонами в круглодонном 96-луночном планшете в ППС в течение 24ч-48ч внутриклеточного при 370С синтеза в условиях цитокинов, 5% СО2. Для в культуры активации добавляли форболмиристатацетат и иономицин, а также блокаторы внутриклеточного транспорта брефелдин А и моненсин производителя (Cell Stimulation в соответствии с методикой Cockteil, «eBioscience»). Детекцию внутриклеточной выработки цитокинов проводили методом проточной 81 цитометрии с использованием соответствующих МКА к поверхностным (CD4, CD8) и внутриклеточным молекулам (INF-, IL-4) согласно методике производителя (Anti-Human - INF- Alexa Fluor® 488, 4S.B3, «eBioscience»; Anti-Human - IL-4 Alexa Fluor® 488, 8D4-8, «eBioscience»; PE Anti-human CD4, OKT-4, BioLegend; PC5 Аnti-Human CD8, В9.11, «Beckman Coulter»). 2.19. Статистический анализ Полученный материал обрабатывали с помощью методов вариационной статистики. Результаты во всех таблицах и рисунках представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (Мm). Достоверность различий между группами оценивали по t-критерию Стьюдента для непарных и парных данных с учетом величины F-отношения [2, 3]. Различия считались значимыми при p<0,05. Для преодоления проблемы множественных сравнений применяли поправку Бонферрони [3]. В ряде случаев использовали корреляцию Пирсона (r) и Cпирмена (R). Сортировку и обработку данных проводили на компьютере IBM PC с использованием программного обеспечения Microsoft Office при помощи прикладных компьютерных программ «Statistica for Windows 6.0», «Microsoft Excel 2007». 82 Глава 3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЛЕПТИНА И ГРЕЛИНА В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ КЛЕТОК ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В настоящее время показано, что важная роль в обеспечении выживания плода принадлежит клеткам врожденного иммунитета. Моноциты, NK, NKTклетки периферической неспецифической крови резистентности являются организма, ведущими эффекторами участвующими как в поддержании иммунореактивности организма матери к патогенам, так и в формировании механизмов толерантности гормональной к полуаллогенному регуляции плоду. функциональной Изучение активности вышеуказанных клеток является значимой проблемой иммунобиологии беременности. Актуальность закономерностями исследования изменения подтверждается иммунореактивности сходными организма при беременности и опухолевом росте. Выбор эффекторных популяций клеток обусловлен высокой экспрессией рецепторов к изучаемым гормонам. 3.1. Роль лептина и грелина в регуляции функциональной активности моноцитов периферической крови Известно, что среди лейкоцитов мононуклеарные фагоциты имеют наибольшую плотность экспрессии Ob-R, количество которых значительно увеличивается при активации клетки [330]. Не активированные моноциты/макрофаги экспрессируют на поверхности лишь 5 - 25% молекул Ob-R, в то время как большая часть рецепторов составляет внутриклеточный пул [127, 272]. Моноциты имеют важное значение в течение всей беременности. Благодаря специфическому стероидному фону моноциты накапливаются в децидуальнoй оболочке и эффективно контролируют имплантацию и плацентацию [165]. При беременности моноциты и формирующиеся из них миелоидные дендритные клетки [63] регулируют 83 направленность иммунных реакций, способствуя Th-2 девиации [253]. Помимо этого, моноциты/макрофаги фагоцитируют патогены, клеточный детрит, апоптотические тельца [46]. Поэтому изучение регуляции гормонами функциональной активности моноцитов в аспекте беременности является актуальным. 3.1.1. Механизмы иммуномодулирующей активности лептина в отношении моноцитов Регуляция лептином фагоцитарной активности моноцитов. Поскольку по данным литературы лептин регулирует фагоцитарную активность моноцитов/макрофагов, опосредованную различными типами рецепторов [134, 271], представлялось важным оценить модулирующие эффекты лептина в концентрациях при беременности на фагоцитоз разных типов объектов. При поглощении латекса контакт частицы с клеткой происходит преимущественно за счет гидрофобных взаимодействий, а также скавенджер-рецепторов [145]. Установлено, что лептин в концентрации I триместра беременности угнетает поглощение латексных частиц моноцитами, тогда как в концентрации II-III триместра беременности гормон не оказывает влияния на фагоцитоз латекса моноцитами (таблица 2). Таблица 2 – Влияние лептина на фагоцитарную активность моноцитов периферической крови женщин в отношении частиц латекса (n=7) Экспериментальное Процент фагоцитоза Фагоцитарный индекс воздействие Контроль 53,62±2,65 3,36±0,12 Лептин, 10 нг/мл 45,57±0,83* 2,92±0,15* Лептин, 35 нг/мл 55,73±1,89 3,06±0,12 Примечание: - p < 0,05 в сравнении с контролем по парному t-критерию Стьюдента; здесь и далее во всех таблицах и рисунках n –количество исследований в группе 84 Процесс поглощения бактериальных объектов E.coli фагоцитоза исследовали в динамике, поскольку E.coli является наиболее физиологичным объектом и ближе отражает сущность процесса, происходящего в организме. Так лептин в концентрации, характерной для I триместра беременности, снижал фагоцитарную активность моноцитов в отношении E.coli только на 5-й мин (таблица 3). Тогда как в высокой концентрации лептин оказывает более глубокое депрессивное влияние на поглотительную активность моноцитов в отношении бактериальных объектов. ИФА был достоверно снижен, начиная с 5-й минуты и до конца исследования. Таким образом, лептин в концентрациях, характерных для беременности, угнетает поглотительную активность моноцитов в отношении бактериальных объектов фагоцитоза и частиц латекса. Таблица 3 – Модуляция лептином фагоцитарной активности (ИФА) моноцитов периферической крови женщин, стимулированных бактериями E. coli (n=8) Исходный 10 15 20 25 30 5 мин уровень мин мин мин мин мин 53,72± 58,34± 58,08± 64,39± 70,71± 78,68± 84,45± Контроль 5,54 4,59 5,46 4,77 4,06 2,74 2,09 Лептин, 10 35,26± 38,87± 52,20± 59,92± 69,00± 77,09± 83,08± нг/мл 4,30* 4,58* 8,14 7,44 5,38 3,16 1,67 Лептин, 35 33,88± 38,76± 35,04± 45,48± 54,65± 69,23± 79,15± нг/мл 2,56* 5,69* 4,83* 5,40* 4,29* 2,31* 1,58* Примечание: - p < 0,05 в сравнении с контролем по парному t-критерию Стьюдента Время Для изучения влияния лептина на фагоцитарную активность моноцитов при участии разных опсонизированных и типов рецепторов неопсонизированных исследовали ФЭБ. Лептин поглощение в обеих концентрациях статистически значимо повышает фагоцитарную активность мононуклеарных клеток как в отношении опсонизированных, так и неопсонизированных ФЭБ. При этом статистически достоверных отличий 85 между стимулирующим влиянием гормона в концентрации I триместра (10 нг/мл) и II-III триместра (35 нг/мл) не выявлено (таблица 4). Таблица 4 – Модуляция лептином фагоцитарной активности моноцитов периферической крови женщин по поглощению ФЭБ и опФЭБ (n=8) Экспериментальные показатели Контроль ФЭБ опФЭБ Лептин 10 нг/мл Лептин 35нг/мл ФЭБ опФЭБ ФЭБ опФЭБ Моноциты 0,58 0,81 0,82 0,51 0,74 0,59 ФЧ 0,03 0,04 0,08 0,03 0,04 0,05 43,75 49,5 51,12 39,88 44,75 43,37 ПФ 2,65 2,44 4,78 1,25 4,16 3,02 Моноциты (на фоне блокады scavenger-рецепторов) 0,42 0,44 0,42 ФЧ 0,02 0,05 0,03 33,25 33,88 34,87 ПФ 5,43 4,94 3,91 Моноциты (на фоне блокады рецепторов к С3b-компоненту комплемента) 0,67 0,6 0,58 ФЧ 0,03 0,03 0,02 39,37 36,75 35,75 ПФ 1,63 3,18 1,76 Примечание: - p < 0,05 в сравнении с контролем по парному t-критерию Стьюдента; -p < 0,05 в сравнении с контролем без внесения ингибитора соответствующего рецептора по парному t-критерию Стьюдента; ФЧ-фагоцитарное число, ПФ-процент фагоцитоза Учитывая то, что лептин усиливает экспрессию CD11 на моноцитах (рецепторов к С3b-компоненту комплемента) [65], для выяснения механизмов его модулирующего действия использовали блокаду CR3, которая полностью отменяет активирующий эффект гормона на фагоцитоз моноцитами опФЭБ (таблица 4). Полученные данные свидетельствуют об участии лептина в регуляции поглощения моноцитами опсонизированных объектов фагоцитоза, опосредованного молекулами CR3. Фагоцитоз моноцитами неопсонизированных ФЭБ происходит, главным образом, при участии scavenger-рецепторов, поскольку формалинизированные эритроциты экспонируют на своей поверхности сайты формальдегида [5, 6]. Блокада 86 scavenger-рецепторов отменяет стимулирующее влияние лептина в низкой концентрации (таблица 4). Таким образом, несмотря на то, что по данным литературы в высоких концентрациях лептин стимулирует поглотительную функцию моноцитов и макрофагов в отношении различных объектов фагоцитоза [122, 198], в концентрациях, характерных для беременности, лептин оказывает разнонаправленное влияние на поглощение объектов разной природы, что, повидимому, зависит от вовлеченных в процесс рецепторов на моноцитах, а также от взаимодействия эффекторных молекул индуцируемых сигнальных путей, что также может зависеть и от концентрации индуктора. Не исключено, что реализация гормональных эффектов происходит путем усиления экспрессии данных рецепторов, адгезирующих объекты фагоцитоза. Регуляция лептином ЛЗХЛ моноцитов. В качестве интегрального теста для определения микробицидной активности моноцитов исследовали ЛЗХЛ. Анализ спонтанной ЛЗХЛ выявил разнонаправленную дозозависимую модулирующую активность лептина. Установлено, что в концентрации I триместра гормон не влиял, а в концентрации II-III угнетал спонтанную ЛЗХЛ моноцитов (таблица 5, 6). Таким образом, действие гормона при беременности значимо для защиты собственных тканей от повреждения активными кислородными метаболитами и предупреждения развития антизиготных реакций. На молекулярном уровне угнетающий эффект лептина, возможно, реализуется посредством активации аденилатциклазной системы – основного ингибитора NADP-комплекса. Тогда как при стимуляции моноцитов разными объектами, лептин оказывает разнонаправленные эффекты на ЛЗХЛ (таблица 5, 6). В индуцированном бактериями E.coli варианте ЛЗХЛ гормон оказывает угнетающее действие на окислительную активность моноцитов. Так, под влиянием концентрации гормона, характерной для I триместра, максимум снижения стимулированной ЛЗХЛ отмечался на 10-й и 25-й мин. Под действием высокой концентрации лептина, характерной для II-III триместра 87 лептина угнетение ЛЗХЛ, регистрировалось начиная с 10-й мин и вплоть до 25-й мин исследования (таблица 5). Таблица 5 – Модуляция лептином ЛЗХЛ моноцитов периферической крови женщин, стимулированных бактериями E. coli in vitro (n=8) Время Исходный уровень 5 мин 10 мин 15 мин 20 мин 25 мин 30 мин Влияние лептина на ЛЗХЛ моноцитов, RLU Экспериментальное воздействие Спонтанный Стимулированный вариант вариант 0,008± 0,019± 0,028± 0,033± 0,039± 0,031± 0,027± Контроль 0,001 0,009 0,003 0,005 0,005 0,002 0,003 0,008± 0,015± 0,018± 0,027± 0,029± 0,024± 0,032± Лептин, 10 нг/мл 0,001 0,002 0,002* 0,004 0,004 0,002* 0,005 0,006± 0,007± 0,017± 0,019± 0,026± 0,014± 0,025± Лептин, 35 нг/мл 0,001* 0,003 0,004* 0,002* 0,004* 0,004* 0,003 Примечание: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю При стимуляции латексом низкая концентрация лептина, характерная для I триместра беременности (10 нг/мл) не влияет на продукцию АФК (таблица 6), тогда как высокая концентрация гормона, характерная для II-III триместра (35 нг/мл), напротив, угнетает продукцию активных кислородных метаболитов в стимулированном латексом варианте ЛЗХЛ (таблица 6). В тоже время, в зимозан-индуцированном варианте ЛЗХЛ гормон оказывал дозозависимое стимулирующее действие на окислительную активность моноцитов. Так, при стимуляции опсонизированным зимозаном максимум активации ЛЗХЛ под действием лептина в концентрации, характерной для I триместра беременности, отмечался на 5-й мин (таблица 6). Под действием высокой дозы лептина (характерной для II-III триместра беременности) максимум активации ЛЗХЛ регистрировался на 10-й мин (таблица 6). 88 Таблица 6 – Модуляция лептином ЛЗХЛ моноцитов периферической крови женщин in vitro, стимулированных разными объектами Интенсивность Интенсивность ЛЗХЛ, Экспериментальное ЛЗХЛ, имп/сек/клетку, воздействие имп/сек/клетку, стимулятор латекс стимулятор зимозан (n=8) (n=10) Спонтанный вариант Контроль гормона 5,75±0,50 4,09±0,32 Лептин, 10 нг/мл 5,67±0,36 3,48±0,48 Лептин, 35 нг/мл 5,16±0,49 2,54±0,40* Стимулированный вариант, 5 мин Контроль гормона 41,91±0,73 7,48±0,54 Лептин, 10 нг/мл 48,82±2,18* 5,92±0,92 Лептин, 35 нг/мл 45,95±4,96 5,41±0,83* Стимулированный вариант, 10 мин Контроль гормона 38,19±1,56 6,94±0,56 Лептин, 10 нг/мл 38,24±3,60 5,94±0,97 Лептин, 35 нг/мл 45,73±2,14* 5,29±0,77 Стимулированный вариант, 15 мин Контроль гормона 25,67±2,42 6,19±0,51 Лептин, 10 нг/мл 27,14±1,71 5,31±0,77 Лептин, 35 нг/мл 28,86±2,54 4,30±0,53* Стимулированный вариант, 20 мин Контроль гормона 12,82±0,84 4,49±0,48 Лептин, 10 нг/мл 15,34±1,14 5,11±0,72 Лептин, 35 нг/мл 10,89±0,76 3,04±0,40* Примечание: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю гормона на данный момент исследования; Анализируя возможные механизмы реализации эффектов лептина, следует отметить, что стимуляция разными объектами вовлекает разные каскады внутриклеточных событий. Так связывание моноцитов с опсонизированными объектами (опсонизированные E.coli, опсонизированный зимозан), задействует в первую очередь FcR рецепторы, трансдукция сигнала 89 через которые, главным образом, активирует сборку NADP-комплекса и усиливает продукцию АФК [145]. Однако Src-киназы, активированные при связывании опсонизированного объекта с FcR, одновременно управляют несколькими сигнальными путями, и в том числе способны индуцировать ITIM-мотиф угнетающий FcRIIB, Помимо NADPН-оксидазу. этого, взаимодействие сигнальных путей, инициируемых объектами разной природы, может индуцировать цАМФ-зависимые каскады, что подавляет генерацию АФК [128]. Видимо, именно этот путь превалирует при угнетении лептином ЛЗХЛ моноцитов, индуцированных опсонизированными E.coli. Очевидно, что сходные механизмы регуляции задействуются и при контакте с латексом. Таким образом, хотя в концентрациях, характерных для ожирения и воспаления, лептин мононуклеарами отражающих усиливает продукцию активных форм кислорода периферической уровень гормона крови при [286], но беременности, в концентрациях, гормон оказывает разнонаправленные эффекты на стимулированную продукция АФК, очевидно в зависимости от природы активирующего объекта и задействованных сигнальных путей, и угнетает, либо не влияет на спонтанную ЛЗХЛ моноцитов. Регуляция лептином активности эластазы, катепсина G и МПО моноцитов. Влияние лептина на микробицидный потенциал оценивали по активности ферментов, секретируемых моноцитами: эластазы, катепсина G и МПО, которые определялись в клеточных супернатантах. Секреция лизосомальных сериновых протеиназ, МПО, а также продукция активных кислородных метаболитов являются важнейшими факторами бактерицидности моноцитов, обеспечивающими не только антимикробную резистентность организма, но и участвующими в процессах ремоделирования тканей при физиологически протекающей беременности [46, 63, 82]. Установлено, беременности, что лептин разнонаправлено в концентрациях, модулирует характерных активность для нейтральных протеиназ, продуцируемых моноцитами. Так, гормон вне зависимости от 90 концентрации стимулирует активность эластазы в супернатантах клеточных культур моноцитов, одновременно угнетая активность катепсина G (таблица 7). Усиление активности эластазы моноцитов под действием лептина, значимо с позиции роли фермента в процессе ремоделирования тканей, т.к. моноциты активно инфильтруют децидуальную оболочку и участвуют в инвазивном росте синцитиотрофобласта. Тогда как, катепсин G усиливает экспрессию провоспалительных цитокинов моноцитами [82, 228] и, таким образом, обуславливает запуск клеточно-опосредованных иммунных реакций, активация которых в фетоплацентарной зоне может иметь фатальные последствия для плода. Выявленный угнетающий эффект гормона на секрецию катепсина G имеет важное значение в контексте беременности для предупреждения развития антизиготных реакций и сохранения плода. Таблица 7 – Влияние лептина на активность сериновых протеиназ и МПО, продукцию NO в супернатантах культур моноцитов (n=8) Экспериментальное воздействие Контроль Лептин, 10 нг/мл Лептин, 35 нг/мл Эластаза, Катепсин G, нМ/106 кл в мин мкмол/мл в мин МПO (Е) NO, мкМ 0,429±0,065 1,667±0,070 0,202±0,009 6,89±0,57 0,839±0,102* 1,461±0,032* 0,234±0,013* 7,27±0,44 0,834±0,118* 1,503±0,029 0,236±0,011* 6,32±0,34 Примечание: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Учитывая, что биоцидное действие моноцитов, направленное на внеклеточную деструкцию патогенов, осуществляется за счет выброса АФК, с последующей их трансформацией МПО в перекись водорода и галогеноиды [128], экстрацеллюлярная окислительная активность моноцитов оценивалась 91 как по продукции активных форм кислорода, так и по активности секретируемой МПО. Установлено, что лептин в концентрациях, характерных для беременности, стимулировал активность МПО, секретируемой моноцитами, в супернатантах клеточных культур (таблица 7). Статистически достоверной разницы в эффектах изучаемых концентраций гормона выявлено не было. Выявленный стимулирующий эффект гормона, дает основания полагать, что продуцируемый плацентой лептин, действуя на моноциты децидуальной оболочки, способствует формированию высокого уровня их бактерицидности в маточном компартменте. Регуляция лептином микробицидного потенциала моноцитами обусловлена также его участием в контроле метаболизма азота. NO играет основную роль в разрушении внутриклеточных паразитов [46, 63, 165]. В ряде работ показано, что в патофизиологических концентрациях лептин усиливает продукцию NO мононуклеарными лейкоцитами периферической крови, инициируя повышение экспрессии исследованиях установлено, что iNOS [109, 184, 272]. В наших в концентрациях, характерных для беременности, лептин не оказывает значимых эффектов на синтез NO моноцитами (таблица 7). Регуляция лептином продукции цитокинов моноцитами. Установлено, что лептин в концентрациях, характерных для беременности, стимулирует выработку провоспалительных цитокинов TNF- и IL-6 и не влияет на секрецию IL-2, IL-4 и IL-10 мононуклеарными лейкоцитами (таблица 8). Помимо этого, в концентрации, сопоставимой с уровнем лептина в I триместре беременности, гормон повышает продукцию IFN-. Известно, что избыточная продукция цитокинов воспаления индуцирует развитие цитотоксических реакции иммунной системы матери, направленных против аллогенных клеток плода [37]. Однако при физиологически протекающей беременности Тh1-цитокины необходимы для успешной имплантации, способствуют инвазивному росту синцитиотрофобласта и 92 участвуют в процессах ремоделирования тканей [37, 264], что объясняет критическую роль гормона в процессе имплантации. Таблица 8 – Модуляция лептином продукции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови женщин in vitro (n=8) Исследуемый Контроль показатель Лептин, Лептин, 10 нг/мл 35 нг/мл IL-2, пг/мл 6,98±0,18 8,77±1,37 6,53±0,14 TNF-, пг/мл 1,33±0,07 3,77±0,94* 4,38±0,93* IFN-, пг/мл 3,58±0,55 6,07±0,59* 4,45±0,57 IL-4, пг/мл 2,52±0,11 4,02±0,78 4,68±1,89 IL-6, пг/мл 66,55±9,46 IL-10, пг/мл 5,33±0,09 4773,01±1344,01* 1463,59±364,67*# 5,88±0,43 5,43±0,13 Примечание:* p < 0.05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю; # p < 0.05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к пробе с внесением лептина в концентрации 10 нг/мл. Рассуждая о значимости регуляции лептином фагоцитарной активности моноцитов и продукции АФК следует подчеркнуть, что разнонаправленность эффектов гормона скорее является ожидаемой и физиологически обусловленной, поскольку стойкий активирующий эффект приводил бы к стимуляции воспалительных реакций и создавал угрозу прерывания беременности. Известно также, что нейтрофилы и моноциты периферической крови способны к образованию внеклеточных ловушек для микроорганизмов, что наряду с фагоцитозом является эффективным механизмом киллинга микроорганизмов [5, 36, 130, 316]. 93 3.1.2. Регуляция грелином функциональной активности моноцитов. Роль Са2+-зависимых механизмов Широкое представительство GHS-R в лимфоидной ткани, а также в тканях фетоплацентарного комплекса свидетельствует о важной роли грелина не только в регуляции процессов роста и развития, но и в функционировании клеток иммунной системы и контроле репродуктивных процессов [110, 111, 112]. Немногочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что грелин обладает противовоспалительными эффектами на направленность развития иммунных реакций [111, 110, 314]. Среди клеток иммунной системы, моноциты являются экспрессируют важнейшей большое мишенью количество GHS-R, для грелина, число молекул поскольку которых значительно увеличивается при активации клеток [111, 204]. Особый интерес представляет изучение роли грелина в контроле функциональной активности моноцитов в аспекте беременности, поскольку беременность сопряжена с существенными изменениями энергетического и жирового обмена и, в целом, эндокринного зеркала организма женщины [37, 39]. Подтверждением чему является и изменение концентрации грелина в динамике беременности [131]. Гормон реализует свои эффекты, связываясь с GHS-R моноцитов [111]. Известно, GHS-R относятся к суперсемейству рецепторов, связанных с Gбелками, лигирование которых приводит к повышению внутриклеточного Ca2+ [187]. Однако исследования последних лет показали, что при связывании грелина с GHS-R1а происходит димеризация GHS-R с привлечением других типов G-сопряженных рецепторов с разными типами α-субъединиц G-белка (αi; αs; αq) [275], например с рецептором соматостатина, меланокортина, дофамина, серотонина [275], и в зависимости от специфичности αсубъединицы G-белка инициируются различные сигнальные каскады. Поэтому представлялось важным оценить роль GHS-R и Са2+-зависимых механизмов как ключевых факторов взаимодействия грелина с клеткой, в регуляции основных фукций моноцитов. 94 Регуляция грелином фагоцитарной активности моноцитов. Установлено, что грелин в концентрациях, сопоставимых с уровнем гормона в периферической крови при беременности, снижает поглотительную активность моноцитов в отношении E.coli (рисунок 9а), но не влияет на стимулированную этими бактериями ЛЗХЛ (рисунок 9б), а также спонтанную ЛЗХЛ моноцитов (рисунок 10). Сходные результаты были получены в работе Tümer с соавторами, показавшими, что грелин в физиологических концентрациях угнетает фагоцитарную активность макрофагов крыс при остром стрессе [301]. 95 ИФА, % а 90 К 80 * 70 60 * 50 * 40 2 1 * * * время, мин 30 0 5 10 15 20 25 30 35 б RLU 0,06 0,05 0,04 2 0,03 К 1 0,02 0,01 0 время, мин 0 5 10 15 20 25 30 35 Рисунок 9 – Влияние грелина на фагоцитарную активность (а) и стимулированную продукцию активных форм кислорода (б) моноцитами (n=8). К – контроль (маркер на линии – квадрат); 1 – грелин в концентрации 1,25 нг/мл (маркер на линии – круг); 2 – грелин в концентрации 0,83 нг/мл (маркер на линии – треугольник); здесь и далее RLU – относительные световые единицы; * - p < 0.05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю 96 0,01 RLU 0,008 0,006 * * * * * * 0,004 Г1+И Изоптин, 0,025 мг/мл И + грелин (0,83 нг/мл) Г1+бл Г2+бл Изоптин, 0,025 мг/мл + грелин (1,25 нг/мл) бл Изоптин, 0,025 мг/мл Г2 D-Lys3-GHRP-6, (10-4 M) + грелин (1,25 нг/мл) Г1 D-Lys3-GHRP-6, (10-4 M) + грелин (1,25 нг/мл) К D-Lys3-HRP-6 (10-4 M) К Грелин 0,83 нг/мл 0 Грелин 1,25 нг/мл 0,002 Г2+И Рисунок 10 – Влияние грелина на спонтанную ЛЗХЛ моноцитов. Примечание: по оси абсцисс – экспериментальное воздействие; по оси ординат – интенсивность спонтанной ЛЗХЛ; (n=8) Блокада GHS-R специфическим антагонистом D-Lys3-GHRP-6 отменяет депрессивное действие обеих концентраций гормона на ИФА моноцитов (рисунок 11а), при этом сам антагонист GHS-R эффекта не оказывает. Гормон на фоне блокады GHS-R не влияет на стимулированную ЛЗХЛ (рисунок 11б), но угнетает спонтанную окислительную активность моноцитов (рисунок 10). Таким образом, грелин оказывает специфичный ингибирующий эффект на фагоцитарную активность моноцитов через GHS-R. Тогда как модуляция грелином активности NADPH-оксидазы происходит, вне зависимости от функциональности GHS-R, что согласуется с результатами, полученными и другим автором [142]. Данное предположение легко объясняется тем, что лигирование GHS-R приводит к активации множества сигнальных каскадов, в зависимости от типа вовлекаемого Gбелка [275]. 97 ИФА, % a 90 К 1 2 80 70 60 50 время, мин 40 0 10 RLU 20 30 б 0,06 0,05 0,04 2 К 1 0,03 0,02 * 0,01 время, мин 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Рисунок 11 – Влияние грелина на фагоцитарную активность (а) и продукцию активных форм кислорода (б) моноцитами на фоне блокады GHSR; (n=8). Примечание: пунктирная линия – проба с внесением антагониста GHS-R D-Lys3-GHRP-6 (10-4 M); 1 – грелин в концентрации 1,25 нг/мл на фоне блокады GHS-R (маркер на линии – круг); 2 – грелин в концентрации 0,83 нг/мл на фоне блокады GHS-R (маркер на линии – треугольник) 98 В исследованиях ряда авторов показано, что связывание грелина с GHS-R ассоциировано с увеличением концентрации кальция в клетке, как посредством высвобождения из эндоплазматического ретикулума, так и поступления через мембранные потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа [53, 186]. Поэтому для изучения Са2+-зависимых механизмов регуляции грелином функциональной активности моноцитов использовали блокатор плазматических потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа изоптин. Показано, что как сама блокада потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа изоптином, так и гормон на фоне блокады этих каналов оказывают однонаправленное действие на ИФА и ЛЗХЛ моноцитов, а именно угнетают спонтанную (рисунок 10) и стимулированную ЛЗХЛ, а также поглотительную активность моноцитов на первых минутах исследования (рисунок 12а,б). Далее фагоцитарная активность моноцитов восстанавливается до контрольных значений (рисунок 12а). Таким образом, регуляция грелином фагоцитарной активности и ЛЗХЛ моноцитов не связана с работой потенциалзависимых плазматических Са2+-каналов L-типа, а, по-видимому, опосредована другими системами вторичных мессенджеров. 99 ИФА, % а * 90 90 К 80 80 2 1 70 70 # 60 60 # 50 50 # 40 40 * * время, мин 30 30 00 55 10 10 15 15 20 20 25 25 30 30 35 35 б RLU 0,05 0,04 * * 1 К 2 0,03 * 0,02 * * * 0,01 время, мин 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Рисунок 12 – Влияние грелина на фагоцитарную активность (а) и продукцию активных форм кислорода (б) моноцитами на фоне блокады Са2+каналов изоптином (0,025 мг/мл) (n=8). Примечание: пунктирная линия – проба с внесением изоптина (0,025 мг/мл); 1 – грелин в концентрации 1,25 нг/мл на фоне внесения изоптина (маркер на линии – круг); 2 – грелин в концентрации 0,83 нг/мл на фоне внесения изоптина (маркер на линии – треугольник), # - p < 0.05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к пробе с внесением изоптина 100 Установлено, что грелин в концентрациях, характерных для беременности, не влиял на активность МПО, секретируемой моноцитами, в супернатантах клеточных культур (рисунок 13). Блокада GHS-R, а также потенциалзависимых плазматических Са2+-каналов L-типа изоптином не оказывала значимых эффектов на направленность действия грелина. E Изоптин, 0,025 мг/мл + грелин (0,83 нг/мл) Изоптин, 0,025 мг/мл + грелин (1,25 нг/мл) Изоптин, 0,025 мг/мл D-Lys3-GHRP-6, (10-4 M) + грелин (0,83 нг/мл) D-Lys3-GHRP-6, (10-4 M) + грелин (1,25 нг/мл) D-Lys3-HRP-6 (10-4 M) Грелин 0,83 нг/мл К Грелин 1,25 нг/мл МПО Рисунок 13 – Влияние грелина на активность МПО моноцитов (n=8). Примечание: по оси абсцисс - экспериментальное воздействие; по оси ординат – активность МПО (Е); К – контроль При изучении влияния грелина на секрецию NO моноцитами установлено, что гормон в концентрации, характерной для I-II триместров беременности, угнетает продукцию NO. Блокада GHS-R не влияет на секрецию NO моноцитами, но усиливает угнетающее действие грелина на выработку NO, что свидетельствует о том, что грелин реаклизует угнетающее действие минуя GHS-R. Блокада потенциалзависимых плазматических Са2+-каналов L-типа изоптином отменяет угнетающее влияние грелина на секрецию NO моноцитами (рисунок 14). Полученные 101 результаты подтверждаются данными литературы о том, что грелин снижает активность индуцибельной NO-синтетазы (iNOS) моноцитов [77, 142]. Повидимому, регуляция грелином активности iNOS реализуется на уровне потенциалзависимых плазматических Са2+-каналов L-типа, но минуя GHS-R. 10,0 мкМ * 6,0 *^ *^ 4,0 2,0 Г2+И Изоптин, 0,025 мг/мл Г1+И + грелин (0,83 нг/мл) И Изоптин, 0,025 мг/мл + грелин (1,25 нг/мл) Блокатор Блокатор Блокатор + грелин + грелин 1,25 0,83 нг/мл нг/мл Изоптин, 0,025 мг/мл D-Lys3-GHRP-6, (10-4 M) + грелин (0,83 нг/мл) Г2 D-Lys3-HRP-6 (10-4 M) Г1 Грелин 0,83 нг/мл Кк D-Lys3-GHRP-6, (10-4 M) + грелин (1,25 нг/мл) 0,0 Грелин 1,25 нг/мл мкМ 8,0 Рисунок 14 – Влияние грелина на продукцию NO моноцитами. Примечание: по оси абсцисс - экспериментальное воздействие; по оси ординат – концентрация NO (мкМ); К – контроль; ^ - p<0,05 по непарному tкритерию Стьюдента по отношению к пробе с внесением антагониста GHS-R (n=8) В целом, грелин, в концентрациях, характерных для беременности, не влияя на продукцию активных форм кислорода и активность МПО, угнетает поглотительную активность моноцитов в отношении E. coli, а также продукцию NO. Причем специфичный ингибирующий эффект грелина на фагоцитарную активность моноцитов реализуется через GHS-R, однако не связан с работой мембранных потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа. В то время как, регуляция грелином продукции NO происходит при участии потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа. 102 Полученные результаты показывают, что грелин является потенциальным фактором регуляции функциональной активности моноцитов в аспекте беременности, оказывая преимущественно противовоспалительные эффекты, а Са2+-зависимые механизмы играют значимую роль в контроле грелином секреции NO моноцитами. В заключении следует отметить, что снижение фагоцитарной активности и продукции NO моноцитами под влиянием грелина, можно рассматривать как протективный эффект, направленный на защиту собственных тканей от повреждения, способствующий сохранению беременности. При этом действие грелина не затрагивает процессы генерации АФК, необходимые для киллинга фагоцитированных микроорганизмов, что важно для поддержания защитных свойств организма матери. Таким образом, полученные данные открывает новые перспективы в исследовании гормональной регуляции иммунных процессов, ассоциированных с беременностью. Полученные результаты необходимо учитывать при клиническом использовании грелина. Возможные механизмы реализации Са2+-зависимых регуляторных эффектов грелина на уровне моноцитов представлены на рисунке 15. 103 Ca2+ K+ Грелин PIP2 GHS-R DAG Деполяризация мембраны PKC PLC Gq αq IP3 β γ Ca2+ Ca2+ ЭПР Кальмодулин Ac ATP cAMP↑ iNOS PKА Угнетение фагоцитарной активности ↓NO Рисунок 15 – Возможный механизм реализации Са2+-зависимых регуляторных эффектов грелина на уровне моноцитов. Примечание: Gq - Gбелок; αq - субъединица G-белка; β,γ - β- и γ-субъединицы G-белка; PLC фосфолипаза С; PIP2 – фосфатидилинозитол; ЭПР - эндоплазматический ретикулум; РКС - протеинкиназа С; сАМР - циклический аденозинмонофосфат. 3.1.3. Совместные эффекты лептина и грелина в регуляции интегральных функций моноцитов При исследовании совместного действия лептина и грелина установлено, что гормоны в комбинациях, характерных для беременности, не оказывают модулирующих эффектов на поглощение моноцитами E. coli (рисунок 16). Следовательно, совместное действие гормонов нивелирует самостоятельный угнетающий эффект лептина на фагоцитарную активность моноцитов в отношении бактериальных объектов. 104 90 К 1 2 80 ИФА 70 60 50 * 40 * 30 20 0 5 10 15 20 25 30 35 время инкубации, мин Рисунок 16 – Совместные эффекты лептина и грелина в регуляции фагоцитарной активности моноцитов по поглощению E.coli. (n=8) Примечание: по оси абсцисс – время, мин; К – контроль (маркер на линии – ромб); 1 – комбинация лептина и грелина в концентрациях, отражающих содержание гормонов в периферической крови в первой половине беременности (маркер на линии – квадрат); 2 – комбинация лептина и грелина в концентрациях, отражающих содержание гормонов в периферической крови во второй половине беременности (маркер на линии – треугольник); * - p < 0.05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю При исследовании совместного действия лептина и грелина в регуляции ЛЗХЛ моноцитов установлено, что, несмотря на то, что гормоны, действуя самостоятельно, оказывают разнонаправленные эффекты, комбинация лептина и грелина не оказывает влияния на спонтанную (рисунок 17) и стимулированную E.coli ЛЗХЛ моноцитов (рисунок 18). 105 спЛЗХЛ интенсивность ЛЗХЛ (RLU) 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000 контроль Л1+Г1 Л2+Г2 экспериментальное воздействие Рисунок 17 – Модуляция лептином и грелином спонтанной ЛЗХЛ моноцитов, (n=8). Примечание: по оси абсцисс – экспериментальное воздействие; Л1+Г1 – комбинация лептина и грелина в концентрациях, отражающих содержание гормонов в периферической крови в первой половине беременности; Л2+Г2 – комбинация лептина и грелина в концентрациях, отражающих содержание гормонов в периферической крови во второй половине беременности. По оси ординат – интенсивность спонтанной ЛЗХЛ; RLU – относительные световые единицы 106 0,06 интенсивность ЛЗХЛ ( RLU) 0,05 0,04 0,03 * 0,02 * К 1 0,01 2 0,00 5 10 15 20 25 30 35 40 Рисунок 18 – Совместные эффекты лептина и грелина в регуляции продукции активных форм кислорода моноцитами в стимулированном бактериями E.coli варианте ЛЗХЛ, (n=8). Примечание: по оси абсцисс – время, мин; К – контроль (маркер на линии – ромб); 1 – сочетание лептина и грелина в концентрациях, отражающих содержание гормонов в периферической крови в первой половине беременности (маркер на линии – квадрат); 2 – комбинация лептина и грелина в концентрациях, отражающих содержание гормонов в периферической крови во второй половине беременности (маркер на линии – треугольник); * - p < 0.05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Предполагая возможные механизмы реализации совместных эффектов лептина и грелина в комбинациях на моноциты, следует отметить, что фагоцитоз и индукция респираторного взрыва фагоцитов сопровождается повышением уровня cАМP, которое нарастает со временем и считается одним из механизмов постепенного затухания генерации АФК, что защищает саму клетку от разрушения [128]. Взаимодействие лептина со специфическим рецептором (Ob-R) на моноцитах, запускает несколько сигнальных путей [248, 249], основной из которых аналогичен таковому для IL-6, и включает Jak2 и далее STAT3 [248, 249]. Помимо этого, лептин, связываясь с Ob-R, стимулирует ERK1/2, а также ряд других сигнальных путей с активацией 107 PLC, PKC, PI3K [65], что и объясняет возможность разнонаправленных действий лептина на фагоцитоз и генерацию АФК моноцитами в зависимости от концентрации гормона и типа фагоцитируемого объекта. Повидимому, угнетающий эффект лептина в концентрациях, характерных для беременности, обусловлен тем, гормон активирует сигнальные каскады и молекулы, способные пролонгировать действие цАМФ, например, активируя РКА. Данный механизм описан при действии лептина в сходных концентрациях на другие типы клеток [323]. Другими авторами показано, что лептин в сходных концентрациях угнетает стимулированную бактериями E.coli продукцию АФК нейтрофилами, реализуя угнетающее действие через PI3K/Akt-зависимый путь [93]. Совместное действие лептина с грелином приводит к перекрестному взаимодействию сигнальных путей и отменяет самостоятельный угнетающий эффект лептина. Анализируя возможный механизм, можно предположить, что грелин, связываясь с GHS-R, через Giпротеины запускает MAPK-ассоциированные сигнальные каскады [275], оказывающие альтернативное действие РКА [174] и угнетающему влиянию лептина. Учитывая, что генерация АФК имеет важнейшее значение для синтеза и биологического разнонаправленность эффектов действия лептина медиаторов на продукцию воспаления, АФК также предполагает возможность различных эффектов лептина на выработку провоспалительных цитокинов. Изучение совместных эффектов лептина и грелина на активность секреторной МПО моноцитов значимых эффектов не выявило (рисунок 19). Следовательно, совместное действие гормонов отменяет стимулирующий эффект лептина на активность МПО моноцитов. Отсутствие модулирующих эффектов комбинации гормонов на активность МПО, очевидно, можно рассматривать как протективный фактор, способствующий сохранению защитных свойств организма матери. 108 Е, оптические единицы MПО 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 контроль Л1+Г1 Л2+Г2 экспериментальное в оздейств ие Рисунок 19 – Модуляция лептином и грелином продукции МПО моноцитами, (n=8) Примечание: по оси абсцисс – экспериментальное воздействие; Л1+Г1 – сочетание лептина и грелина в концентрациях, отражающих содержание гормонов в периферической крови в первой половине беременности; Л2+Г2 – сочетание лептина и грелина в дозах, отражающих содержание гормонов в периферической крови во второй половине беременности При изучении продукции NO моноцитами установлено, что лептин не влияет, грелин в концентрации, характерной для I-II триместров беременности, угнетает секрецию NO. При совместном внесении гормонов в комбинации, характерной для I-II триместров беременности, выявлено угнетение продукции NO моноцитами (рисунок 20). Во второй половине беременности гормоны при совместном внесении не влияли на продукции NO моноцитами. Преобладание модулирующих эффектов грелина при совместном внесении гормонов в отношении продукции NO, по-видимому, обусловлено участием потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа в регуляции грелином выработки NO. Поскольку сигналинг с рецептора лептина не затрагивает работу потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа на моноцитах, поэтому реализуются только эффекты грелина. В работе McCord с соавт. показано, что при нормально протекающей беременности продукция NO моноцитами периферической крови не претерпевает существенных 109 изменений, несмотря на значимые изменения экспрессии iNOS [219]. Однако угнетение выработки NO моноцитами при беременности можно рассматривать как фетопротективный фактор, поскольку известно, что усиление генерации NO• способствует выработке провоспалительных цитокинов и стимулирует Th1-иммунному ответу [219]. NO Е, оптические единицы мкМ 8,0 * 6,0 4,0 2,0 0,0 контроль Л1+Г1 Л2+Г2 экспериментальное воздействие Рисунок 20 – Модуляция лептином и грелином продукции NO моноцитами, (n=8) Примечание: по оси абсцисс – экспериментальное воздействие; Л1+Г1 – комбинация лептина и грелина в концентрациях, отражающих содержание гормонов в периферической крови в первой половине беременности; Л2+Г2 – комбинация лептина и грелина в концентрациях второй половины беременности, по оси ординат – концентрация NO (мкМ) Таким образом, лептин и грелин являются значимыми регуляторами функциональной активности моноцитов при беременности. В целом, на уровне моноцитов – как ведущих эффекторов неспецифической резистентности организма матери, совместные эффекты гормонов в регуляции поглощения и деструкции патогенов, по-видимому, способствуют сохранению исходного уровня иммунореактивности, что значимо и для фетопротекции, и для защиты организма матери. Снижение выработки NO моноцитами в первой половине беременности можно рассматривать как 110 фетопротективный фактор, поскольку известно, что усиление продукции NO• стимулирует синтез провоспалительных цитокинов и Th1-иммунный ответ [219]. Роль лептина и грелина в регуляции активности индоламин-2,3диоксигеназы моноцитов как фактора формирования периферической толерантности. Согласно современным представлениям одним из наиболее значимых механизмом формирования иммунной толерантности является усиление активности фермента IDO, как при контакте с T-регуляторными клетками, так и под действием других стимулов [224]. IDO, экспрессируемый в антигенпрезентирующих клетках (дендритных клетках, макрофагах, а также моноцитах), катаболизирует триптофан, что приводит к гибели цитотоксических лимфоцитов, вследствие дефицита необходимой для их активности аминокислоты и выделения токсичных продуктов ее деградации, как кинуренин [224]. Снижение активности IDO моноцитов при беременности ассоциировано со спонтанными абортами [182]. Таким образом, для понимания механизмов гормональной регуляции функциональной активности моноцитов и их роли в формировании иммунной толерантности важно было оценить роль лептина и грелина в индукции IDO моноцитов. Установлено, что лептин в концентрации, характерной для II-III триместров беременности, усиливал, а грелин в исследуемых концентрациях не влиял на ЛПС-индуцированную активность IDO моноцитов. На фоне активации моноцитов INF-γ, значимых эффектов гормонов не выявлено (таблица 9). При совместном внесении лептина и грелина в концентрациях, характерных для второй половины беременности, выявлено увеличение ЛПС-индуцированной активности IDO моноцитов. Таким образом, можно полагать, что лептин в концентрации, сопоставимой с его уровнем во второй половине беременности, является значимым регулятором активности IDO моноцитов. Поскольку активирующий эффект лептина проявляется только совместно с ЛПС, можно предположить, что гормон усиливает, в основном, 111 NF-κB-зависимый (ядерный фактор κB) путь активации IDO моноцитов [169]. Таким образом, несмотря на то, что лептин угнетает формирование аTreg в периферической крови, повышение активности IDO моноцитов определяет его роль в формировании иммунной толерантности при беременности с участием моноцитов. При совместном внесении гормонов доминирует влияние лептина. Это, очевидно, связано с тем, что для индукции IDO необходима экспрессия провоспалительных транскрипционных факторов, которые активируются лептином, но не грелином. Таблица 9 – Влияние лептина и грелина на активность IDO моноцитов периферической крови (n=8) Концентрация кинуренина, мкМ Гормональное воздействие Стимулятор ЛПС Стимулятор IFN-γ Контроль 1,970,58 2,030,54 Лептин - 10 нг/мл 2,810,78 2,910,23 Лептин – 35 нг/мл 6,062,22* 2,040,37 Грелин - 1,25 нг/мл 4,971,53 3,430,36 Грелин - 0,83 нг/мл 4,641,58 2,730,44 Лептин 10 нг/мл +Грелин 1,25 нг/мл 5,111,38 3,100,46 Лептин 35 нг/мл +Грелин 0,83 нг/мл 6,131,31* 3,030,54 Примечание:* p < 0.05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю 112 ВЫВОДЫ по главе 3.1 1. Лептин оказывает разнонаправленное влияние на фагоцитарную активность моноцитов в зависимости от объекта фагоцитоза. Лептин усиливает поглощение моноцитами опсонизированных и неопсонизированных ФЭБ. Наибольший стимулирующий эффект лептина обнаружен в отношении опсонин-зависимого фагоцитоза ФЭБ. Блокада рецепторов к С3b-компоненту комплемента отменяет активирующий эффект гормона на поглощение моноцитами опФЭБ. Связывание scavengerрецепторов с лигандом также отменяет стимулирующее действие лептина по поглащению ФЭБ. Лептин исследуемых концентрациях угнетает фагоцитарную активность моноцитов в отношении E. coli. 2. Грелин, в концентрациях, характерных для беременности, снижает фагоцитарную активность моноцитов в отношении E. coli. Ингибирующий эффект грелина на фагоцитарную активность моноцитов реализуется через GHS-R, однако не связан с работой мембранных потенциалзависимых Са 2+каналов L-типа. 3. Результатом совместного действия лептина и грелина является отмена угнетающего действия гормонов на фагоцитарную активность моноцитов в отношении E. coli. 4. Лептин в концентрации, характерной для I триместра беременности, не влияет, а в концентрации, сопоставимой со II-III триместром, угнетает спонтанную ЛЗХЛ моноцитов. Грелин в исследуемых концентрациях, как и исследуемые комбинации грелина с лептином не влияют на спонтанную ЛЗХЛ моноцитов. 5. Лептин в зависимости от индуктора оказывает разнонаправленное влияние на стимулированную ЛЗХЛ моноцитов. В латекс-индуцированном варианте ЛЗХЛ гормон в концентрации, характерной для I триместра, не влиет, а в концентрации II-III триместра, угнетает окислительную активность моноцитов. При стимуляции зимозаном лептин в исследуемых концентрациях усиливает ЛЗХЛ моноцитов. В индуцированном бактериями 113 E.coli варианте ЛЗХЛ лептин в исследуемых концентрациях угнетает окислительную активность моноцитов. Грелин в исследуемых концентрациях, а также сочетания грелина с лептином не влияют на стимулированную бактериями E.coli ЛЗХЛ моноцитов. 6. Лептин в исследуемых концентрациях не влияет, грелин в концентрации, характерной для I-II триместров беременности, угнетает секрецию NO. Регуляция грелином продукции NO происходит при участии потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа. При совместном внесении гормонов в комбинации I-II триместров, выявлено угнетение продукции NO моноцитами. 7. Лептин в исследуемых концентрациях усиливает активность МПО и эластазы, но в концентрации, характерной для I-II триместров беременности, угнетает активность катепсина G. Грелин, а также комбинации грелина с лептином, не влияют на активность МПО моноцитов. 8. Лептин в исследуемых концентрациях усиливает, а грелин не влияет на ЛПС-индуцированную активность IDO моноцитов. При сочетанном внесении лептина и грелина выявлено усиление ЛПС-индуцированной активности IDO моноцитов. 114 3.2. Роль лептина и грелина в регуляции фенотипа NK- и NKTклеток периферической крови В период ранней беременности натуральные киллеры (NK-клетки) являются преобладающей популяцией среди лимфоидных клеток, локализованных в децидуальной оболочке [303]. NK-клетки обеспечивают как прямую, так и антителозависимую цитотоксичность (АЗКЦ), и играют важную роль на протяжении всей беременности. Кроме того, NK-клетки потенцируют индукцию T-регуляторных лимфоцитов, что приводит к формированию иммунной толерантности в период беременности [91, 185, 338]. Циркулирующие зрелые NK-клетки идентифицируют как CD3CD16+CD56+ [26]. Более 80-90% периферических зрелых NK-клеток имеют фенотип CD16+CD56dim и проявляют большую цитотоксичность по сравнению с CD16low/negCD56bright [96, 97, 185, 223]. Антиген CD16 является низкоаффинным рецептором к IgG и необходим для реализации АЗКЦ. За цитотоксическую активность NK-клеток, кроме молекул CD16 отвечают активационные рецепторы NKG2D и NKp46, причем последний конститутивно экспрессируется на всей популяции NK-клеток и служит одним из основных маркером для их идентификации. При беременности литический потенциал NK-клеток снижается за счет уменьшения процента CD16+CD56dimлимфоцитов. Повышение содержания CD16+56dimNK-клеток в периферической крови у женщин ассоциировано с привычным невынашиванием беременности [18]. Предполагается, что децидуальные NKклетки созревают из периферических CD16low/negCD56bright лимфоцитов, мигрирующих в матку [185]. CD16low/negCD56brightNK секретируют цитокины и обладают низкой цитолитической активностью [96]. Маточные CD16low/negCD56brightNK-клетки принимают непосредственное участие в имплантации, ангиогенезе и поддержании беременности [261]. При нормальной беременности NK-клетки способствуют замещению клеток эндотелия в спиральных артериях клетками трофобласта, что позволяет 115 спиральным артериям обеспечивать все возрастающие потребности в кровотоке. В отличие от NK периферической крови, NK-клетки эндометрия не обладают цитотоксической активностью, особенно по отношению к клеткам трофобласта (эмбриона), однако продуцируют высокие уровни цитокинов IFN-γ, IL-10, GM-CSF, TNF. На клетках трофобласта человека отсутствуют так называемые классические молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса - HLA-А и HLA-B, которые являются мишенью для цитотоксического действия NK-клеток периферической крови. В то же время клетки трофобласта экспрессируют HLA-С, HLA-E, HLA-G, которые взаимодействуют с NK-клетками эндометрия и децидуальной ткани, и участвуют в процессах развития беременности. Поэтому представлялось важным исследовать участие лептина и грелина в изменении фенотипа NKлимфоцитов с цитотоксического на регуляторный, а также в экспрессии хемокиновых молекул, способствующих миграции этих клеток в матку и дренирующие лимфатические узлы. Поскольку NK-клетки конститутивно экспрессируют CD56, а присутствие CD16 варьирует в зависимости от зрелости и функциональной активности, исследовали влияние гормонов на общее содержание 56+NKклеток периферической крови, экспрессирующих CD16. Гистограммы, отражающие оценку количества CD3-CD16+CD56+-клеток (NK-клетки) и CD3+CD16+CD56+-клеток (NKТ-клеток) в 24 ч культуре МНЛ методом проточной цитометрии на примере одного эксперимента представлены на рисунке 21. 116 Контроль 7,91% 1,58% Лептин, 10 нг/мл 9,68% 2,32% Грелин, 1,25 нг/мл 8,11% 2,05% Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 11,28% 2,55% Лептин, 35 нг/мл 5,22% 2,87% Грелин, 0,83 нг/мл 9,11% 2,55% Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 12,09% 2,65% Рисунок 21 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на количество NK и NKТ-клеток в 24ч культуре МНЛ (по данным одного эксперимента). По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат - по каналу FL2 (окрашивание PE). NK-клетки (CD3-CD16+/CD56+) – левый верхний квадрант, NKТ-клетки (CD3+CD16+/CD56+) – правый верхний квадрант 117 Установлено, что лептин в концентрации, сопоставимой с I триместром, повышает количество CD16+56+NK-клеток (таблица 10), что коррелировало с увеличением продукции IFN- мононуклеарными фагоцитами под влиянием лептина (по данным корреляционного анализа R = 0.76; p < 0.05). Тогда как в концентрации, характерной для II-III триместра беременности, лептин, напротив, снижает количество CD16+56+NK-клеток. Рассуждая о механизмах реализации разнонаправленных эффектов лептина, можно полагать, что гормон действует как непосредственно, связываясь с Ob-R на NK-клетках [87, 297], так и опосредовано, путем активации продукции IFN- мононуклеарными фагоцитами. По данным литературы, лептин при связывании с Ob-R способен усиливать цитотоксичность NK-клеток путем стимуляции фосфатидилхолин-специфичной PLC, что увеличивает трафик CD16 из цитоплазматических гранул аппарата Гольджи на мембрану NKклеток [87, 297]. По-видимому, в I триместре беременности, совместное воздействие лептина и IFN- на NK-клетки повышает экспрессию CD16. Тогда как во II-III триместрах беременности самостоятельного действия лептина не достаточно для стимуляции экспрессии CD16, либо оно направлено в большей степени на стимуляцию экспрессии CD56 и повышает количество CD56bright NK-клеток. Что касается снижения экспрессии CD16 под влиянием высокой концентрации лептина, следует отметить, что подобная конверсия CD56+CD16+NK в CD56brightCD16-NK-клетки периферической крови отмечена и другими авторами при культивировании in vitro выделенных из периферической крови CD56+CD16+NK c TGF-1, либо с клетками децидуальной стромы [172]. Также было показано, что и другие продукты стромальных децидуальных клеток способны индуцировать подобную конверсию, причем механизмы зависят от совокупности действующих факторов [172]. Грелин, в исследуемых концентрациях, не влияет на количество CD16+56+NK-клеток. При совместном внесении гормонов, в комбинации, характерной для I-II триместров беременности, гормоны не влияют на 118 процент CD16+CD56+NK. Тогда как в сочетании, характерном для II-III триместра, гормоны повышают содержание CD16+CD56+NK-клеток (таблица 10). Хотя прямых литературных данных о наличии рецепторов к грелину на NK- и NKТ-клетках нет, выявленные эффекты свидетельствуют об участии гормона в регуляции фенотипа NK-клеток как непосредственно, так и опосредованно, возможно, путем регуляции количества рецепторов к лептину, либо реализации эффектов гормона через другие типы рецепторов, как это показано для других субпопуляций лимфоцитов [110, 111, 153]. Таблица 10 – Влияние гормонов на экспрессию CD16 на NK (CD3CD56+-клетках) и степень экспрессии CD56 на NK (NKp46+-клетках) (n=12) Исследуемый показатель CD3NKp46+CD56bright, CD16+CD56+, % % NKp46+CD56dim, % Контроль 7,29±0,95 1,67±0,524 98,84±0,348 Лептин, 10 нг/мл 9,14±0,87* 3,45±0,986 97,70±1,972 Лептин, 35 нг/мл 5,55±0,79*^ 3,38±0,089* 96,04±1,520 Грелин, 1,25 нг/мл 9,32±1,14 2,06±0,981 96,83±0,495 Грелин, 0,83 нг/мл 9,67±1,17 3,05±0,739* 95,01±1,794* 11,12±0,99 нд нд 3,08±0,81* 95,57±1,56* Лептин, 10 нг/мл + Грелин 1,25нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 11,98±0,85* Примечание: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю; ^ по парному t-критерию Стьюдента по отношению к пробе с внесением того же гормона (комбинации гормонов) в концентрации, характерной для I триместра беременности; нд – нет данных. Для исследования участия лептина и грелина в изменении фенотипа NK-лимфоцитов с цитотоксического на регуляторный, МНЛ инкубировали с гормонами 72 ч в ППС и далее исследовали экспрессию поверхностных 119 маркеров. NK-клетки идентифицировали как NKp46+ [298]. Пример оценки степени экспрессии CD56 на NK-клетках методом проточной цитометрии прдставлен на рисунке 22. Контроль Лептин, 35 нг/мл CD56bright 3,31 % NKp46-PC5 CD56bright 1,89 % CD56dim 98,89 % CD56-PE CD56dim 96,69 % CD56-PE Грелин, 0,83 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл NKp46-PC5 CD56bright 3,03 % CD56bright 3,12 % CD56dim 96,97 % CD56-PE CD56dim 96,88 % CD56-PE Рисунок 22 – Гистограммы, отражающие влияние гормонов на степень экспрессии CD56 на NK-клетках (NKp46+) в 72ч культуре МНЛ (на примере одного эксперимента). По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание РЕ); по оси ординат - по каналу FL3 (окрашивание PС5). 120 Установлено, что как лептин, так и грелин в концентрациях, соответствующих II-III триместру беременности, увеличивают количество CD56brightNK-клеток (таблица 10). Грелин в этой же концентрации еще и снижает уровень CD56dimNK-клеток. Действуя совместно, в физиологическом сочетании, характерном для второй половины беременности, лептин и грелин увеличивают число CD56brightNK-клеток, уменьшая количество CD56dimNKклеток. Очевидно, это и является объяснением повышения общего содержание CD16+56+NK-клеток под действием лептина и грелина в комбинации характерной для второй половины беременности. Таким образом, гормоны в исследуемых концентрациях способны регулировать уровень экспрессии CD16 и CD56 на NK-клетках, модулируя их цитотоксический и регуляторный потенциал. В свою очередь, CD16-(low)CD56brightNK-клетки экспрессируют активационные - NKG2D+ и ингибиторные рецепторы, такие как NKG2A и LILRB, что позволяет им реализовать иммунотрофическую функцию вместо цитолитической [157, 261]. Влияние гормонов на экспрессию активационной молекулы NKG2D, и ингибиторной – LILRB на NKp46+NK-клетках на примере одного эксперимента показано на рисунках 23, 24. Установлено, что лептин в концентрации, соответствующей II-III триместру беременности, угнетает экспрессию активационной молекулы NKG2D, и ингибиторной – LILRB на NKp46+NK-клетках (таблица 11). Грелин в исследуемых концентрациях, не влияет на экспрессию активационных/ингибиторных мембранных молекул NK-клетками. При совместном внесении гормонов, в сочетании, характерном для второй половины беременности, лептин и грелин угнетают активационных/ингибиторных молекул NK-клетками. экспрессию 121 NKp46-PC5 Контроль 4,51 % LILRB-PE NKp46-PC5 Грелин, 0,83 нг/мл 2,31 % LILRB-PE Лептин, 35 нг/мл 2,75 % LILRB-PE Лептин 1,25 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 2,44 % LILRB-PE Рисунок 23 – Гистограммы, отражающие влияние гормонов на экспрессию ингибиторной молекулы LILRB на NK-клетках (NKp46+) в 72ч культуре МНЛ (на примере одного эксперимента). По оси абсцисс интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание РЕ); по оси ординат - по каналу FL3 (окрашивание PС5). 122 NKp46-PC5 Контроль 0,91 % NKG2D+-FITC NKp46-PC5 Грелин, 0,83 нг/мл 0,77 % NKG2D+-FITC Лептин, 35 нг/мл 0,51 % NKG2D+-FITC Лептин 1,25 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 0,58 % NKG2D+-FITC Рисунок 24 – Гистограммы, отражающие влияние гормонов на экспрессию активационной молекулы NKG2D на NK-клетках (NKp46+) в 72ч культуре МНЛ (на примере одного эксперимента). По оси абсцисс интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат - по каналу FL3 (окрашивание PС5). 123 Таблица 11 – Влияние гормонов на экспрессию активационных и ингибиторных молекул интактными NKp46+NK-клетками NKG2D+ NKG2A+ LILRB+ (n=14) (n=7) (n=6) Контроль 0,88±0,096 5,01±0,558 4,04±0,685 Лептин,10 нг/мл 0,73±0,090 4,11±0,781 4,05±0,781 Лептин, 35 нг/мл 0,55±0,093# 4,77±0,761 2,93±0,458* Грелин, 1,25 нг/мл 0,89±0,085 4,86±0,099 4,87±0,832 Грелин, 0,83 нг/мл 0,82±0,143 5,36±0,947 2,28±0,534* 0,69±0,083# 4,23±0,83 2,72±0,41* Экспериментальное воздействие Лептин, 35 нг/мл+ Грелин, 0,83 нг/мл Примечание: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю; # - p < 0,05 по непарному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Для оценки гормонального контроля процессов, влияющих на хоминг NK-клеток, исследовали присутствие CCR7 на NKp46+NK-клетках и экспрессию L-селектина на CD56bright и CD56dimNK-клетках. Пример детекции экспрессии CCR7 на NK-клетках и L-селектина на CD56bright NK-клетках представлен на рисунках 25 и 26 соответственно. 124 Контроль Лептин, 35 нг/мл нг. 0,52% NKp46+ 0,91% Грелин, 0,83 нг/мл нг. 0,49% Лептин, 35 нг/мл + грелин 0,83 нг/мл 0,44% CCR7+ Рисунок 25 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на экспрессию CCR7+ NKp46+NK-клетками в 72ч культуре МНЛ (по данным одного эксперимента). По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат - по каналу FL3 (окрашивание PC5). NK-клетки (NKp46+CCR7+) – правый верхний квадрант 125 NKp46+CD56brightCD62L 1,31% CD56dim 97,92 % CD56-PE NKp46-PC5 CD56bright 2,08 % CD56-PE CD62L-FITC Рисунок 26 – Гистограммы, отражающие оценку количества NKp46+ CD56bright-клеток и NKp46+CD56brightCD62L-клеток (L-селектин+) в 72ч культуре мононуклеаров под влиянием гормонов по данным одного эксперимента. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC) и по каналу FL2 (окрашивание PE); по оси ординат - по каналу FL3 (окрашивание PC5) и по каналу FL2 (окрашивание PE); Показано, что CD56brightклетки в основном мигрируют во вторичные лимфоидные органы, в то время как субпопуляция CD56dim – в очаги острого воспаления [81]. Высокий уровень экспрессии молекул CCR7 на CD56brightNK-клетках ассоциирован с хомингом к лимфатическим узлам [205], а L-селектина с их повышенным присутствием в плаценте во время беременности [225]. Установлено, что лептин и грелин в концентрациях, соответствующих II-III триместрам беременности, действуя как самостоятельно, так и совместно, угнетают экспрессию хемокинового рецептора CCR7 на NKp46+NK-клетках (таблица 12). При оценке экспрессии L-селектина показано, что лептин в концентрации, соответствующей II-III триместру беременности, а также лептин совместно с грелином в комбинации, соответствующей второй 126 половине беременности, усиливают экспрессию L-селектина на CD56brightNKклетках. Тогда как, действую самостоятельно, грелин не оказывает статистически достоверных эффектов (таблица 12). Несмотря на то, что на CD56dimNK-клетках L-селектин экспрессируется в большей степени, чем на CD56brightNK-клетках, статистически значимого действия гормонов на данный показатель не выявлено. Анализируя полученные результаты, следует отметить, что по данным литературы, снижение экспрессии CCR7 на CD56brightNK-клетках ассоциировано с усилением их цитолитической активности у больных СПИДом [157]. Можно полагать, что исследуемые гормоны, угнетая экспрессию CCR7, также способствуют сохранению цитолитического потенциала NK-клеток, тогда как усиление экспрессии Lселектина на NK-клетках во второй половине беременности необходимо для их миграции в плаценту. Таблица 12 – Влияние гормонов на экспрессию хоминговых молекул и молекул адгезии интактными NKp46+ клетками (n=7) Экспериментальное NKp46+CCR7+ воздействие NKp46+CD56bright NKp46+CD56dim CD62L+ CD62L+ Контроль 0,81±0,104 1,26±0,125 15,56±2,599 Лептин (10 нг/мл) 0,73±0,194 2,88±0,897 15,05±3,167 Лептин (35 нг/мл) 0,53±0,062* 2,10±0,322* 18,65±3,016 Грелин (1,25 нг/мл) 0,81±0,201 2,74±0,891 14,95±3,185 Грелин (0,83 нг/мл) 0,49±0,079* 2,18±1,014 15,40±2,026 0,41±0,063* 2,40±0,25* 13,07±2,45 Лептин (35нг/мл)+ Грелин (0,83 нг/мл) Примечание: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Несмотря на немногочисленность NKТ-клеток в периферической крови, они играют важную роль в иммунорегуляции при беременности [314]. NKTклетки составляют субпопуляцию регуляторных Т-лимфоцитов, которые при 127 активации способны быстро секретировать сразу большие количества как IFN-, так и IL-4, и наряду с дендритными клетками играют ведущую роль в Тh1/Th2 девиации и формировании периферической толерантности [74, 304]. В ряде работ показано, что NKT-клетки периферической крови в период имплантации индуцируют цитокиновое окружение Th2-типа, содержащее высокие концентрации IL-4 [74]. При анализе модуляции лептином функциональной активности CD16+CD56+ NKT-клеток установлено, что в концентрации, характерной для I триместра беременности, гормон не влияет, а в концентрации, сопоставимой с его уровнем во II-III триместре, увеличивает процент NKTклеток, экспрессирующих CD16 и CD56 (таблица 13). Таблица 13 – Влияние лептина и грелина на экспрессию CD16+ NKТклетками (CD3+CD56+) периферической крови (n=12) Исследуемый показатель NKТ-клетки CD3+CD16+CD56+, % Контроль 1,64±0,52 Лептин (10 нг/мл) 2,21±0,68 Лептин (35 нг/мл) 2,98±0,41* Грелин (1,25 нг/мл) 2,69±0,97 Грелин (0,83 нг/мл) 3,18±0,91 Лептин (10 нг/мл) + Грелин (1,25 нг/мл) 2,48±0,79 Лептин (35 нг/мл) + Грелин (0,83 нг/мл) 2,98±0,86 Примечание: * - p < 0,05 парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Грелин, а также лептин в сочетании с грелином, в исследуемых комбинациях, не оказывают значимых эффектов на содержание CD16+CD56+ NKT-клеток. Выявленная положительная корреляция между увеличением содержания CD16+CD56+ NKT-клеток и повышением концентрации Тh1- 128 цитокинов TNF- (R=0.857; p < 0.05) и IFN- (R=0.96; p < 0.05), продуцируемых МНЛ, свидетельствует о возможной реализации эффектов гормона на путем NKT-клетки индукции синтеза вышеупомянутых цитокинов моноцитами периферической крови. Увеличение процента CD16+CD56+NKT-клеток под действием лептина в поздние сроки гестации, по-видимому, можно рассматривать как индукцию гормоном фенотипического созревания NKT-клеток, поскольку формирование такого фенотипа является терминальной стадией активации NKT-клеток и ассоциировано с приобретением наибольшей цитотоксической активности [304]. Таким образом, гормоны в исследуемых концентрациях принимают активное участие в контроле экспрессии поверхностных молекул на NK- и что, NKT-клетках, функциональной отношении очевидно, активности. NK-клеток ассоциировано Основные гормоны с регуляцией модулирующие оказывают во эффекты второй их в половине беременности. Так в I триместре беременности лишь лептин повышает количество CD16+56+NK-клеток, что, учитывая их функциональную гетерогенность, важно, как для защиты матери и плода от микробной атаки, так и для увеличения пула CD16+CD56+NK-клеток периферической крови в связи с последующей их миграцией в децидуальную оболочку [172]. Во второй половине беременности гормоны, действуя как самостоятельно, так и совместно, в исследуемых комбинациях повышают количество CD56brightNKклеток, экспрессию хемокинового на них рецептора L-селектина, CCR7, но активационной снижают присутствие молекулы NKG2D, ингибиторной молекулы LILRB+ на NK-клетках. Перечисленные эффекты дают основания полагать, что комбинированное действие лептина и грелина способствует формированию регуляторного фенотипа NK-клеток и их миграции в эндометрий. Самостоятельные эффекты гормонов сохраняются при их совместном внесении. 129 ВЫВОДЫ по главе 3.2 1. Лептин в концентрациях, характерных для беременности, оказывает разнонаправленное дозозависимое действие на экспрессию поверхностных молекул NK-клетками. В концентрации, сопоставимой с I триместром, гормон повышает количество CD16+56+NK-клеток периферической крови. В концентрации, характерной для II-III триместра беременности, лептин, напротив, снижает уровень CD16+56+NK-клеток, угнетая экспрессию активационной молекулы NKG2D, ингибиторной – LILRB и хемокинового рецептора CCR7 на них, но увеличивает количество CD56brightNK-клеток и экспрессию L-селектина на них, повышает процент CD16+56+NKT-клеток. 2.Грелин в концентрации, характерной I-II триместра, не оказывает эффектов на фенотип NK-клеток. В концентрации, соответствующей II-III триместру беременности, увеличивает количество CD56brightNK-клеток, но угнетает экспрессию хемокинового рецептора CCR7 на NKp46+NKклетках. 3. При совместном внесении гормоны оказывают значимые эффекты лишь в комбинации, характерной для II-III триместра беременности. Так в сочетании, сопоставимом со II-III триместром беременности, гормоны повышают количество CD16+56+NK, увеличивая число CD56brightNK-клеток и экспрессию L-селектина на них, но снижая количество CD56dimNKклеток, и экспрессию активационной молекулы NKG2D, ингибиторной – LILRB, хемокинового рецептора CCR7 на NK-клетках. 130 РЕЗЮМЕ В целом, полученные данные свидетельствуют о том, при беременности грелин и лептин являются значимыми регуляторами функций клеток врожденного иммунитета, не только сохраняя иммунореактивность организма матери, но и способствуя фетопротекции и фетостимуляции. Несмотря на разнонаправленные самостоятельные эффекты каждого гормона на изученные функции моноцитов, сочетанное влияние лептина и грелина нивелирует самостоятельное действие каждого гормона на фагоцитарную активность в отношении E.coli, продукцию активных форм кислорода. Исключением является угнетение синтеза NO в результате совместного действия гормонов в первой половине беременности, а во второй - усиление активности IDO моноцитов. Снижение выработки NO моноцитами в первой половине беременности можно рассматривать как протективный фактор, способствующий сохранению беременности, поскольку известно, что усиление продукции NO• стимулирует синтез провоспалительных цитокинов и Th1-иммунный ответ [219]. Во второй половине беременности активация IDO является важным фактором толерантности, поскольку известно, поддержания состояния иммунной что снижение активности IDO моноцитов при беременности ассоциировано со спонтанными абортами [182]. На уровне NK-клеток эффекты гормонов, главным образом, синергичны друг другу и однонаправлены c их совместным действием. Основные эффекты гормонов реализуются во второй половине беременности и способствует увеличению NK-клеток с регуляторным фенотипом и их способности к миграции в эндометрий. Совместные эффекты гормонов в регуляции функциональной активности суммированы на рисунках 27 и 28. моноцитов и NK-клеток 131 L Ob - R Ghrelin Совместные эффекты GHS-R IDO + MPO MP ClO NADPHоксидаза O2 NO Фагоцитарная активность IDO HClO Н 2 О 2 Гипохлориды, Окисленные галогены E. coli O2 моноцит Рисунок 27 – Гипотетическая схема, суммирующая совместные эффекты лептина и грелина в регуляции функциональной активности моноцитов - 132 Leptin Ghrelin Ob-R GHS-R Совместные эффекты + + dim CD56 CD56bright L-селектин CCR7 NKG2D LILRB Рисунок 28 – Гипотетическая схема реализации совместных эффектов лептина и грелина в регуляции NK-клеток 133 Глава 4. РОЛЬ ЛЕПТИНА И ГРЕЛИНА В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ОСНОВНЫХ КЛЕТОК АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА Исследование регуляции лептином и грелином адаптивного иммунитета включало оценку основных процессов, сопровождающих активацию зрелых Т-лимфоцитов периферической крови – экспрессию поверхностых маркеров, апоптоз, продукцию основных цитокинов, участвующих в поляризации иммунного ответа, формирование адаптивных субпопуляций регуляторных Т-клеток. Глава 4.1. Роль лептина и грелина в контроле активации зрелых Тлимфоцитов периферической крови Учитывая, что активация Т-клеток играет ключевую роль в формировании эффекторных популяций и поляризации иммунного ответа, а IL-2 является основным аутокринным регулятором дифференцировки и пролиферации Т-лимфоцитов, исследование гормональной регуляции Тклеточного звена иммунитета включало анализ экспрессии CD25 (высокоаффинного рецептора к ИЛ-2) на Тh-клетках и ЦТЛ. В результате проведенных исследований установлено, что грелин в концентрациях, характерных для беременности, дозозависимо регулирует экспрессию молекулы CD25 Тh-клетками. Высокая концентрация гормона, характерная для I-II триместра беременности, увеличивает, а низкая (III триместр) не влияет на процент активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25dim. Лептин в исследуемых концентрациях, напротив, снижает количество CD4+CD25dim Т-клеток. Совместное внесение гормонов в комбинации, характерной для I-II триместра беременности, нивелирует самостоятельные эффекты как лептина, так и грелина на экспрессию CD25 Тh-клетками. Тогда как, в сочетаниях, сопоставимых со II-III триместром 134 беременности, гормоны увеличивают процент CD4+CD25dim Т-клеток (таблица 14). Гормоны не оказывают значимых эффектов на экспрессию CD25 на ЦТЛ. Лишь лептин в концентрации, характерной для II-III триместров беременности, достоверно усиливает экспрессию CD25 ЦТЛ по сравнению с его эффектами в первой половине беременности (таблица 14), проявляя свои провоспалительные свойства. Таблица 14 – Модуляция лептином и грелином экспрессии CD25 на ЦТЛ (CD3+CD8+) и Тh (CD3+CD4+) in vitro (n=22) Исследуемый показатель Активированные Активированные ЦТЛ Тh-клетки (CD3+CD8+CD25+), % (CD3+CD4+CD25dim), % Контроль 57,94±21,85 51,99±5,77 Грелин, 1,25 нг/мл 31,86±12,03 69,21±6,17* Грелин, 0,83нг/мл 48,84±14,26^ 52,24±8,09^ Лептин, 10 нг/мл 65,42±15,70 36,06±5,25* Лептин, 35 нг/мл 69,43±22,80 35,89±5,17* 57,01±18,13 45,15±10,26 39,95±14,43 69,94±6,69* Лептин,10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83нг/мл Примечание: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю; ^ - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к пробе с внесением того же гормона в концентрации, характерной для первой половины беременности 135 Активации Т-клеток может инициировать их апоптоз, что является одним из механизмов элиминации эффекторных клеток [31]. Поэтому исследовали влияние гормонов на апоптоз лимфоцитов периферической крови. Пример оценки апоптоза лимфоцитов представлен на рисунке 29. Контроль Лептин, 10 нг/мл 47,6% 62,1% 19,1% 22,2% 48,1% 24,5% Грелин, 0,83 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл PI+ Лептин, 35 нг/мл 69,8% 62,1% 22,6% 19,2% Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 58,4% 59,3% 25,4% 24,9% AnV+-FITC Рисунок 29 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на апоптоз лимфоцитов (на примере одного донора). По оси абсцисс интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (AnV+-FITC); по оси ординат по каналу FL2 (PI+); правый верхний квадрант (AnV+/PI+) – процент лимфоцитов, находящихся в поздней стадии апоптоза; правый нижний квадрант (AnV+/PI-) – процент лимфоцитов, в ранней стадии апоптоза 136 Установлено, что грелин в концентрации, характерной для I-II триместра беременности, увеличивает процент CD3+-лимфоцитов, находящихся в поздней стадии апоптоза (AnV+/PI+) (таблица 15), а также в концентрации, характерной для II-III триместра беременности усиливает экспрессию маркера готовности клетки к вступлению в апоптоз - CD95 как на Т-хелперах (CD3+CD4+95+), так и на ЦТЛ (CD3+CD8+95+) (таблица 16). Лептин, напротив, в исследуемых концентрациях проявляет антиапоптотическое действие, снижая количество AnV+/PI+ лимфоцитов и не влияет на экспрессию апоптотического маркера CD95 на Т-лимфоцитах. Результатом совместного действия лептина и грелина в исследуемых комбинациях является отмена самостоятельных модулирующих эффектов гормонов на апоптоз лимфоцитов (таблица 15, 16), на фоне усиления экспрессии CD95 на T-хелперах. Таблица 15 – Модуляция грелином и лептином апоптоза лимфоцитов периферической крови женщин in vitro (n=7) Грелин (1,25 нг/мл) Процент лимфоцитов, находящихся в ранней стадии апоптоза 24,55±4,26 (AnV+/PI-) 19,78±2,59 Процент лимфоцитов, находящихся в поздней стадии апоптоза 62,88±5,62 (AnV+/PI+) 71,06±3,97* Грелин (0,83 нг/мл) 22,2±4,03 68,71±4,46 Лептин (10 нг/мл) 26,38±6,78 49,92±11,28* Лептин (35 нг/мл) 25,13±5,93 48,94±11,79* 26,97±9,06 59,39±12,54 21,83±5,68 59,44±15,95 Исследуемый показатель Контроль Лептин (10 нг/мл) + Грелин (1,25 нг/мл) Лептин (35 нг/мл) + Грелин (0,83 нг/мл) Примечание: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю 137 Таблица 16 – Модуляция грелином и лептином экспрессии мембранной молекулы CD95 на CD3+CD4+ и CD3+CD8+ - лимфоцитах периферической крови женщин in vitro (n=13) Исследуемый показатель CD3+CD4+95+, % CD3+CD8+95+, % Контроль 15,58±4,73 11,71±1,34 Грелин, 1,2 нг/мл 22,23±5,42 20,90±6,91 Грелин, 0,83 нг/мл 22,59±2,82* 21,03±4,7* Лептин, 10 нг/мл 14,34±5,29 14,58±3,49 Лептин, 35 нг/мл 17,09±3,65 14,08±2,91 Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,2 нг/мл 26,05±3,88* 15,24±0,99 Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 30,06±5,01* 17,08±2,03 Примечание: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Одним из наиболее важных механизмов формирования иммунологической толерантности при беременности является смещение акцента иммунных реакций по Тh2-типу [37, 89, 195]. IFN- и IL-4 являются ключевыми цитокинами, продуцируемыми Т-хелперами, и определяющими девиацию иммунного ответа по Тh1 или Тh2-типу [89, 195]. Поэтому для понимания роли гормонов в Th-девиации особенно в аспекте беременности представлялось важным изучить влияния лептина и грелина на продукцию IFN- и IL-4 в культурах лимфоцитов периферической крови. При изучении продукции цитокинов в супернатантах культур МНЛ периферической крови после суточной инкубации с гормонами показано, что лептин в исследуемых концентрациях усиливал продукцию IFN- интактными/ЛПС-активироваными лимфоцитами, но не влиял на выработку IL-4 интактными (таблица 17). Грелин, напротив, не оказывал статистически значимых эффектов на выработку IFN-, а в концентрации, сопоставимой с I- 138 II триместром беременности, повышал уровень IL-4 только в культурах без ЛПС. При совместном внесении гормонов в концентрациях, характерных для I-II триместров беременности, выявлено снижение продукции IFN- в культурах без ЛПС. Исследуемые комбинации гормонов не оказывали влияния на продукцию IL-4. Таблица 17 – Влияние лептина и грелина на синтез IFN- и IL-4 в культуре МНЛ периферической крови в модели in vitro (n=5) Концентрация цитокинов Экспериментальное в супернатантах культур МНЛ, пг/мл Без ЛПС воздействие IL-4 IFN- Контроль Лептин, 10 нг/мл Лептин, 35 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл Грелин, 0,83 нг/мл Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл c ЛПС IFN- IL-4 44,2±21,8 5,14±0,78 24,4±8,7 5,18±0,84 89,14±18,18 4,15±0,99 95,4±28,7* 6,12±1,22 99,04±15,35* 5,78±0,69 110,18±36,7* 6,78±1,01 50,14±28,18 7,09±0,92* 15,1±7,26 5,8±0,31 20,21±14,0 5,68±1,05 13,8±5,52 5,35±0,96 8,9 ±0,83* 5,42±1,04 10,65±8,06 4,94±1,15 17,6±5,08 5,31±0,68 29,2±22,9 4,98±1,2 Примечание: * - различия достоверны (p < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Таким образом, можно полагать, что при беременности лептин на уровне Т-лимфоцитов стимулирует выработку IFN- как на фоне исходного уровня активации клеток, так и при дополнительной стимуляции ЛПС. Грелин, повышая выработку IL-4, оказывает противовоспалительное действие, которое, однако, отсутствует на фоне внесения ЛПС, что важно для понимания возможности использования гормона в терапевтических целях. Совместное действие лептина и грелина в комбинации I-II триместров беременности приводит к формированию новых кооперативных эффектов 139 гормонов, отличных от их самостоятельных эффектов. Тогда как в комбинации II-III триместров беременности гормоны нивелируют самостоятельные эффекты. Далее исследовали внутриклеточную продукцию вышеупомянутых цитокинов CD4+- и CD8+Т-лимфоцитами. Пример оценки внутриклеточной продукции IL-4 CD4+- и CD8+Т-лимфоцитами представлен на рисунке 30. IL-4 Контроль 1,4 % Лептин, 10 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл 1,7 % 4,0 % Лептин, 10 нг/мл+ Грелин, 1,25 нг/мл 3,8 % CD4 1,7 % 2,1 % 4,3 % 3,9 % CD8 Рисунок 30 – Гистограммы, характеризующие лептина и грелина на внутриклеточный синтез IL-4 CD4+- и CD8+Т-лимфоцитами периферической крови (на примере одного донора). По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (CD4-PE); интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (CD8-PC5); по оси ординат - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (IL-4 - Alexa Fluor® 488) Установлено, что грелин не влиял на процессы трансляции IFN-, но стимулировал внутриклеточный синтез IL-4 CD3+-клетками (таблица 18), причем как Т-хелперами (CD4+Т-лимфоцитами), так и цитотоксическими 140 CD8+Т-лимфоцитами (таблица 19). Лептин в исследуемых концентрациях не оказывал влияния на синтез изучаемых цитокинов Т-лимфоцитами. При совместном внесении гормонов выявлялся только стимулирующий эффект грелина в отношении синтеза IL-4 CD3+-лимфоцитами, причем как CD4+-, так и CD8+Т-клетками (таблица 19). Таблица 18 – Влияние лептина и грелина на внутриклеточный синтез IFN- и IL-4 Т-лимфоцитами периферической крови в модели in vitro (n=6) Процентное содержание Экспериментальное воздействие Т-лимфоцитов, продуцирующих IFN- или IL-4 CD3+IFN-+ CD3+IL-4+ Контроль 3,051,07 2,860,58 Лептин (10 нг/мл) 4,131,65 3,750,97 Лептин (35 нг/мл) 2,770,76 4,160,86 Грелин (1,2 нг/мл) 4,560,92 5,211,77* Грелин (0,83 нг/мл) 5,421,56 6,91,94* 5,382,48 6,992,5* 4,511,65 5,681,46* Лептин + Грелин (10 нг/мл + 1,2 нг/мл) Лептин + Грелин (35 нг/мл + 0,83 нг/мл) Примечание: * - различия достоверны (p < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю 141 Таблица 19 – Влияние лептина и грелина на внутриклеточный синтез INF- и IL-4 CD4+- и CD8+- лимфоцитами периферической крови in vitro (n=6) Процентное содержание Т-лимфоцитов, Экспериментальное воздействие продуцирующих INF- или IL-4 CD4+IL-4+ CD8+INF-+ CD8+IL-4+ Контроль 1,5230,605 1,3360,31 1,5280,47 1,8410,62 Лептин (10 нг/мл) 2,3110,909 1,9330,506 1,8190,744 2,4450,991 Лептин (35 нг/мл) 1,3960,572 2,7860,964 1,3760,362 2,7180,905 Грелин (1,2 нг/мл) 2,8051,161 3,4531,09* 1,7560,93 3,6040,876* Грелин (0,83 нг/мл) 2,9931,537 4,5451,711* 2,430,856 4,9180,729* 2,6481,827 4,2531,006* 2,740,883 3,541,25* 1,690,54 2,8680,692* 2,821,11 2,7410,682 Лептин + Грелин (10нг/мл + 1,25 нг/мл) Лептин + Грелин (35нг/мл + 0,83 нг/мл) CD4+INF-+ Примечание: * p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Таким образом, в концентрациях, характерных для беременности, грелин и лептин проявляют реципрокные регуляторные эффекты на экспрессию CD25, CD95 на CD4+Т-клеткахи апоптоз Т-лимфоцитов. Так, грелин, в концентрациях, отражающих его уровень в разные триместры беременности, стимулирует экспрессию CD25 и апоптоз зрелых Тлимфоцитов. Лептин, в свою очередь, снижает количество активированных Тh-клеток и апоптоз лимфоцитов. Сочетанное действие грелина и лептина на исследуемые показатели на уровне Т-лимфоцитов в зависимости от триместра беременности либо нивелирует самостоятельные эффекты каждого гормона, либо способствует проявлению эффектов грелина. Так 142 грелин, а также комбинации лептина с грелином стимулируют синтез ИЛ-4 и смещают направленность иммунных реакций по Тh2-типу, оказывая фетопротективное действие. При совместном действии на Т-лимфоциты отмена самостоятельных эффектов гормонов, либо превалирующее действие грелина можно объяснить антагонизмом внутриклеточных сигнальных путей, вовлекаемых гормонами, а также модуляцией экспрессии грелином Ob-R и/или увеличения продукции эндогенного грелина [111]. ВЫВОДЫ по главе 4.1 1. Лептин в исследуемых концентрациях снижает уровень CD4+CD25dim Тклеток, угнетает апоптоз зрелых Т-лимфоцитов, не влияя на экспрессию CD95 на них. В исследуемых концентрациях гормон не оказывает влияния на синтез IFN- и IL-4 Т-лимфоцитами, но усиливает продукцию IFN- в культуре МНЛ. 2. Грелин в концентрации, характерных для I-II триместра беременности, повышает количество активированных Т-клеток (CD4+CD25dim) и апоптоз Т-лимфоцитов. В концентрации, соответствующей III триместру – не влияет на количество активированных Т-клеток (CD4+CD25dim) и апоптоз Т-лимфоцитов, но усиливает экспрессию CD95 на них. Грелин не влияет на процессы трансляции IFN-, но стимулирует внутриклеточный синтез IL-4 как CD4+Т-лимфоцитами, так и цитотоксическими CD8+Т- лимфоцитами. 3. При совместном внесении лептин и грелин не влияют на апоптоз Тлимфоцитов, но усиливают экспрессию молекулы CD95 на них, стимулируют синтез IL-4 как CD4+-, так и CD8+Т-клетками. В комбинации I-II триместров беременности гормоны не влияют, а в сочетании характерном для II-III триместра увеличивают количество активированных Т-клеток (CD4+CD25dim). 4. Исследуемые гормоны не влияют на экспрессию CD25 на ЦТЛ (CD3+CD8+) периферической крови. 143 4.2. Роль лептина и грелина в регуляции функциональной активности Т-регуляторных клеток (Treg) Одним из ведущих механизмов обеспечения феномена иммунной толерантности, как при беременности, так и при опухолевом росте, является повышение числа Treg периферической крови при снижении уровня Th17 [155, 158, 195, 196]. Тreg позиционируются как "истинные супрессоры", угнетающие иммунные реакции вследствие усиления активности фермента IDO при контакте с АПК и индукции иммуносупрессорного катаболизма триптофана, что приводит к формированию специфической толерантности и во многом определяет успешное протекание беременности, аллогенной трансплантации, а также эффективный контроль аутоиммунных реакций [265. 273]. Субпопуляция Th17, напротив, инициирует воспалительные, аутоиммунные реакции, а также реакции отторжения трансплантанта [9, 55, 322]. Установлено, что при спонтанных абортах пропорция Th17, а также продукция IL-17А в периферической крови значительно повышается [195, 196]. Известно, что увеличение числа Treg в периферической крови при беременности происходит как Treg (aTreg), (индуцибельных) транскрипционного периферической фактора крови, за счет путем FOXP3 так и в индукции адаптивных инициации экспрессии CD4+CD25--лимфоцитах за счет пролиферации естественных (CD4+CD25brightFOXP3+) или натуральных Treg (nTreg), формирующихся в тимусе [158, 155]. Причем в зависимости от воздействующих стимулов наивные CD4+T-хелперные клетки периферической крови могут трансформироваться в адаптивные субпопуляции как aTreg, так и aTh17. TGF-1, а также ряд других стимулов (гормоны, цитокины) индуцируют экспрессию FOXP3 и формирование aTreg из CD4+CD25--лимфоцитов периферической крови [47]. Тогда как IL-1 и IL-6 вызывает экспрессию орфановый ядерного рецептора ROR-gamma-t (RORt) и транскрипцию 144 кодирующих IL-17 генов в CD4+T-хелперных клетках, что приводит к формированию Th17 [55]. Наивные CD4-позитивные Т-лимфоциты периферической крови, из которых дифференцируются Тreg и Th17, экспрессируют рецепторы как к лептину [195, 196], так и к грелину [131]. Поскольку нарушения жирового обмена (ожирение, дистрофия) сопровождаются глубокими дефектами репродуктивной функции [59, 80, 122, 126, 335], основной причиной которых является срыв состояния толерантности, важно оценить влияние исследуемых гормонов на формирование и функции регуляторных Т-клеток (Treg и Th17). Dujardin H.C. с соавторами (2004) показали, что субпопуляция CD4+CD25+FOXP3+ Treg пополняется в периферическом отделе иммунной системы за счет их развития из CD4+CD25Т-клеток (конверсия Тh-клеток в регуляторные Т-клетки) вследствие межклеточных взаимодействий с участием костимулирующих молекул при действии TGF-1 и в присутствии толерогенных дендритных клеток [114, 311]. Проявлением конверсии является экспрессия молекулы FOXP3 внутри клетки, а также молекул CD25 и CTLA-4 на её поверхности [155, 158, 265, 288]. 4.2.1. Роль лептина и грелина в регуляции формирования и функций аTreg Для оценки влияния гормонов на формирование аTreg, суспензию мононуклеарных клеток периферической крови инкубировали с гормонами в течение суток, а затем определяли количество CD4+CD25brightFOXP3+лимфоцитов (рисунок 31). Инкубация с гормонами в течение 24-72ч дает возможность оценить только экспрессию транскрипционного фактора FOXP3 CD4+CD25--лимфоцитами периферической крови, т.е. формирование аTreg, поскольку для оценки пролиферации nTreg необходима более длительная инкубация (4 - 7 суток) [199, 248]. Показано, что лептин и грелин проявляют разнонаправленные регуляторные эффекты в отношении формирования 145 аTreg периферической крови. Так лептин в концентрации, характерной для I триместра беременности, снижает процент аTreg, тогда как грелин, напротив, в концентрации, сопоставимой с уровнем гормона во II-III триместре беременности, увеличивает количество экспрессирующих FOXP3 CD4+CD25brightT-лимфоцитов (таблица 20). Совместное действие лептина и грелина в концентрациях, характерных для беременности, увеличивает количество аТreg, что, очевидно, свидетельствует о преобладании эффектов грелина. Контроль 4,65% dim 51,93% FOXP3 Alexa Fluor® 488 1,75 % bright CD25-PE 2,78% CD4+CD25brightFoxp3+ 85 % FOXP3 Alexa Fluor® 488 38,89% CD4-PE/Cy5 Лептин, 10 нг/мл CD4+CD25brightFoxp3+ 66,2 % CD4-PE/Cy5 Лептин 10 нг.мл + Грелин, 0,83 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл + bright + CD4 CD25 Foxp3 90,2% CD4+CD25brightFoxp3+ 90,8% CD4-PE/Cy5 Рисунок 31 – Гистограммы, отражающие детекцию Тreg по коэкспрессии CD25 и FOXP3 (по данным одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание PE/Cy5); по оси ординат –по каналу FL2 (окрашивание PE) и FL1 (окрашивание Alexa Fluor® 488) 146 Таблица 20 – Влияние гормонов на количество CD4+CD25brightFOXP3+Т-лимфоцитов (n=8) CD4+CD25brightFOXP3+ Гормоны Т-лимфоциты, % Контроль 82,73,3 Лептин, 10 нг/мл 66,45,4* Лептин, 35 нг/мл 81,64,5 Грелин, 1,25 нг/мл 85,94,5 Грелин, 0,83 нг/мл 89,35,2* Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 89,33,6* Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 89,83,6* Примечание: * - p<0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Для выяснения механизмов модулирующих эффектов гормонов, формирование аTreg исследовали в модели, создающей условия для преимущественной дифференцировки наивных CD4+Т-лимфоцитов в аTreg (путем внесения TGF-1). Формирование аTreg оценивали по экспрессии FOXP3 CD4+Т-лимфоцитами (рисунок 32). Функциональную активность образующихся аTreg определяли по экспрессии поверхностных молекул CTLA-4 (рисунок 34), GITR и продукции IL-10 в супернатантах культур. CTLA-4 (CD152) – гомолог CD28, негативный регулятор Т-клеточной активации, конститутивно высоко экспрессируется на Treg, и определяет их супрессорную активность в отношении Т-эффекторных клеток [72, 338]. GITR - (индуцируемый глюкокортикоидами TNF-рецептор) также конститутивно экспрессируется на Treg [45]. Связывание его с лигандом на эффекторных клетках блокирует их пролиферацию, таким образом, регуляция экспрессии GITR и CTLA-4 тесно вовлечена в реализацию супрессорной активности Treg [45]. IL-10 – противовоспалительный цитокин, 147 который подавляет активность эффекторных Т-клеток, макрофагов и развитие воспаления [44]. Лептин, 10 нг/мл 9,78% Лептин, 35 нг/мл 9,08% FOXP3-Per-Cy5 Контроль 12,2% 17,1% Грелин, 0,83 нг/мл 14,2% FOXP3-Per-Cy5 Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 10 нг/мл+ Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл+ Грелин, 0,83 нг/мл 13,5% FOXP3-Per-Cy5 16,7% CD4 - FITC Рисунок 32 – Гистограммы, отражающие влияние гормонов на индукцию аТreg (процент CD4+FOXP3+-лимфоцитов в гейте CD4+Тлимфоцитов) из TGF-1-премированных CD4+Т-лимфоцитов периферической крови (по данным одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание Per-Cy5) 148 Установлено, что грелин (I-II триместр) усиливает дифференцировку TGF-1-премированных CD4+Т-лимфоцитов в аTreg (CD4+FOXP3+) (рисунок 33), и экспрессию на них CTLA-4 (CD4+CD152+FOXP3+) (рисунок 35). Лептин в концентрации, характерной для I-II триместра беременности, не влияет, а в концентрации, сравнимой с III триместром беременности, угнетает формирование аTreg из TGF-1-премированных CD4+-лимфоцитов (рисунок 33) и количество аTreg, несущих CTLA-4 (рисунок 35). Совместное действие лептина и грелина усиливает дифференцировку CD4+Т-лимфоцитов в аTreg только в комбинации, характерной для I-II триместров беременности (рисунок 33), и не влияет на экспрессию CTLA-4 (рисунок35). 20 % * * 15 * * 10 5 0 К Л1 Л2 Л1+Г1 Л2+Г2 Г1 Г2 Рисунок 33 – Влияние лептина и грелина на индукцию аТreg (CD4+FOXP3+Т-лимфоцитов) из TGF-1-премированных CD4+Т-лимфоцитов периферической крови в системе in vitro (n=8). Примечание: здесь и на рисунке 35 по оси ординат – процент клеток; по оси абсцисс – экспериментальное воздействие; К - контроль; Л1 – лептин, 10 нг/мл; Л2 – лептин, 35 нг/мл; Л1+Г1 – лептин + грелин (10 нг/мл + 1,25 нг/мл); Л2+Г2 – лептин + грелин (35 нг/мл + 0,83 нг/мл); Г1 – грелин, 1,25 нг/мл; Г2 - грелин, 0,83 нг/мл; серые столбики – процент Тreg (CD4+FOXP3+-лимфоцитов) в гейте CD4+Т-лимфоцитов; * - p < 0.05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю 149 CD4+FOXP3+ 12,2% CD4+FOXP3+CTLA-4+ 80% Контроль FOXP3-Per-Cy5 CTLA-4-PE Контроль CD4 - FITC FOXP3-Per-Cy5 Лептин, 35 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл CD4+FOXP3+CTLA-4+ 84,4% CTLA-4-PE CTLA-4-PE CD4+FOXP3+CTLA-4+ 66,8% FOXP3-Per-Cy5 FOXP3-Per-Cy5 Рисунок 34 – Гистограммы, отражающие оценку влияния гормонов на экспрессию CTLA-4 на CD4+FOXP3+-лимфоцитах в гейте CD4+Т- лимфоцитов (по данным одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC), интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание Per-Cy5); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание PerCy5); интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание PE); 150 + + + CD4 CD152 FoxP3 , % 100 * 80 * 60 40 20 0 К Л1 Л2 Л1+Г1 Л2+Г2 Г1 Г1 Рисунок 35 – Влияние лептина и грелина на количество CD4+CTLA-4+ FOXP3+Т-лимфоцитов, индуцированных из CD4+Т-лимфоцитов периферической крови, премированных TGF-1, в системе in vitro (n=11). Примечание: по оси ординат – процент аТreg (CD4+CD152+FOXP3+лимфоцитов) в гейте CD4+FOXP3+Т-лимфоцитов. Лептин и грелин в исследуемых концентрациях не влияют на продукцию IL-10 в культурах CD4+Т-лимфоцитов, премированных TGF-1 (таблица 21). Можно полагать, что формируемые под действием грелина Treg не относятся к популяции Tr1 (Treg, продуцирующие IL-10). Таблица 21 – Влияние лептина и грелина на продукцию IL-10 в культуре TGF-1-премированных CD4+Т-лимфоцитов человека в системе in vitro (n=6) Экспериментальное воздействие Контроль Лептин, 10 нг/мл IL-10, пг/мл Лептин, 35 нг/мл 965,1±129,4 Грелин, 1,25 нг/мл 1012,2±121,7 Грелин, 0,83 нг/мл 990,2±124,4 Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1.25 нг/мл 1200,92±208,1 Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0.83 нг/мл 1095,4±165,3 952,3±117,6 880,9±138,6 151 Таким образом, лептин в исследуемых концентрациях, действуя как на суспензию МНЛ, так и на TGF-1-примированные CD4+-лимфоциты, на разных сроках инкубации угнетает, а грелин, напротив, формирование аTreg, экспрессирующих CTLA-4. Совместное действие гормонов также приводит к преимущественному формированию аTreg, причем по данным корреляционного анализа этот эффект обусловлен именно влиянием грелина, поскольку была выявлена положительная корреляционная связь между увеличением аTreg под действием грелина в дозе, характерной для I-II триместров беременности, и грелина в сочетании с лептином в комбинации, характерной для I-II триместров беременности (r=0.75; p0.05). Для характеристики гормональных механизмов, влияющих на формирование аTreg, важно было оценить действие гормонов на апоптоз предшественников аTreg - CD4+25-Т-лимфоцитов. Оценка апоптоза CD4+25Т-лимфоцитов методом проточной цитометрии представлена на рисунке 36. Показано, что лептин в концентрации, сопоставимой с уровнем гормона во II-III при беременности, не влияет на количество CD4+25 –Тлимфоцитов в ранней стадии апоптоза, но снижает уровень CD4+25-лимфоцитов, находящихся в поздней стадии апоптоза (таблица 22), а также общий процент апоптотирующих CD4+25-Т-лимфоцитов. Грелин в концентрации, отражающей уровнь гормона во I-II триместрах беременности, а также исследуемая комбинация грелина с лептином, не влияют на ранний (обратимый) и поздний (необратимый) апоптоз CD4+25-Т-лимфоцитов периферической крови (таблица 22). В отношении общего числа CD4+25- Тлимфоцитов, лептин в комбинации с грелином, снижают общий процент CD4+25- Т-лимфоцитов, вступивших в апоптоз. Учитывая, что лептин угнетает формирование аTreg, можно полагать, что его антиапоптотический эффект в отношении CD4+25--лимфоцитов, способствует сохранению пула предшественников аTreg, что весьма важно в контексте беременности. Причем этот эффект лептина преобладает и при совместном действии гормонов. 152 Лептин, 35 нг/мл Контроль CD4+25-AnV+PI+ 5,1 % CD4+25-AnV+PI+ 8,2 % + CD4+25AnV+PI4,2 % - PI CD4 25 AnV+PI5,4 % Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл CD4+25-AnV+PI+ 6,6 % CD4+25-AnV+PI+ 8,8 % CD4+25AnV+PI5,8 % CD4+25-AnV+PI4,8 % AnnV-FITC Рисунок 36 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на апоптоз CD4+25-Т-лимфоцитов (по данным одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (PI) 153 Таблица 22 – Влияние лептина и грелина на апоптоз CD4+25-лимфоцитов in vitro (n=12) Гормональное CD4+25-AnV+PI- - CD4+25-AnV+PI+ CD4+25-AnV+ - воздействие лимфоциты, % - лимфоциты, % лимфоциты, % Контроль 4,83±2,19 7,1±2,5 12,19±3,25 Лептин, 35 нг/мл 4,06±2,02 4,6±1,29* 8,54±2,47* Грелин, 1,25 нг/мл 4,48±1,99 7,66±2,61 11,88±2,44 3,9±1,46 5,22±1,29 8,78±1,51* Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл Примечание: * - различия достоверны (p < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Таким образом, несмотря на то, что каждый из гормонов в исследуемых концентрациях оказывает диаметрально противоположные самостоятельные эффекты, можно полагать, что при нормально протекающей беременности, действуя совместно, лептин и грелин усиливают формирование аTreg и препятствуют апоптозу их предшественников, что особенно важно в I-II триместрах, которые характеризуются высоким риском спонтанных абортов [83]. Гормоны, действуя самостоятельно, модулируют иммуносупрессорную активность аTreg, оцениваемую по экспрессии CTLA-4, но не влияют на выработку IL-10. Тогда как при совместном внесении, несмотря на преобладание эффектов грелина, гормоны не оказывают действия на функциональную активность формирующихся под их влиянием аTreg. Таким образом, выявлен возможный механизм участия лептина и грелина в формировании иммунной толерантности, что в аспекте беременности объясняет репродуктивные потери у лиц с нарушениями жирового обмена (ожирение, истощение). 154 4.2.2 Роль лептина и грелина в регуляции функциональной активности nTreg Известно, что увеличение пула Treg в периферической крови возможно за счет индукции аTreg и путем усиления пролиферации nTreg (CD4+CD25brightFOXP3+) [155, 158], поэтому важно было оценить влияние лептина и грелина на функциональную активность nTreg. Для анализа гормональных механизмов регуляции функциональной активности nTreg исследовали пролиферацию, апоптоз и экспрессию CTLA-4, GITR, GARP на выделенной nTreg. Исследуемая популяция клеток, выделенная из периферической крови, имеет фенотип CD4+CD25brightFOXP3+, что дает основания полагать, что эти клетки являются nTreg. Реализация супрессорной функции Treg осуществляется путем непосредственного взаимодействия мембранных молекул Treg (CTLA-4, GITR, GARP и др.) со своими лигандами на эффекторных клетках, а также путем продукции иммуносупрессорных цитокинов (IL-10, TGF-β1) [247, 327, 338]. CTLA-4 обладает высокой авидностья к CD80/86, блокирует костимулирующий сигнал, вызывая анергию Т-эффекторных клеток [247, 338]. Активация самих Treg через CTLA-4 приводит к усилению выработки TGF-β1 [247, 338]. GITR (индуцируемый глюкокортикоидами TNF-рецептор) также конститутивно присутствует на Treg и его связывание с лигандом на эффекторных клетках блокирует их пролиферацию [45, 247, 338]. Тогда как активация самих Treg через GITR стимулирует NF-kB-путь, с последующей индукцией супрессивных молекул и усилением контактной супрессии [45]. GARP (Glycoprotein A repetitions predominant) рецептор для низкоаффинного (latent) TGF-β1, экспрессируется на Treg и способствует сохранению их регуляторного фенотипа [151]. TGF-β1, связываясь с GARP на наивных CD4+Т-клетках, фосфорилирует Smad2/3, что препятствует их дифференцировке в эффекторные клетки, но усиливает формирование аTreg [151]. 155 В отличие от аTreg, nTreg осуществляют супрессию, главным образом, путем непосредственного взаимодействии с эффекторными клетками [327], поэтому изучение экспрессии поверхностных молекул является важной характеристикой их функциональной активности. Оценка экспрессии GITR, GARP на CD4+CD25brightFOXP3+ методом проточной цитометрии представлен на рисунке 37. Контроль Лептин, 35 нг/нгмл CD4+GITR+ 74,2% CD4+GITR+ 93,5% GITR+ А CD4+ Б Грелин, 1,25 нг/мл Контроль CD4+GARP+ 93,7% GARP + CD4+GARP + 97,7% CD4+ Рисунок 37 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на экспрессию GITR (А) и GARP (Б) на nTreg (CD4+CD25brightFOXP3+) (по данным одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание PE) 156 В результате проведенных исследований установлено, что лептин и грелин, а также их комбинация не оказывают значимых эффектов на количество nTreg, несущих CTLA-4 (таблица 23). Ранее нами показано, что лептин снижает, а грелин повышает число аTreg, экспрессирующих CTLA-4. Различия в эффектах гормонов на nTreg и aTreg, возможно, обусловлены тем, что присутствие CTLA-4 не является обязательным условием для формирования nTreg [336], и для модуляции его экспрессии необходимы костимулирующие необходима для сигналы. Тогда как индукции FOXP3 в высокая экспрессия CTLA-4 наивных CD4+Т-клетках при формировании аTreg и осуществления ими супрессорной функции [336]. Лептин, в беременности, концентрации, усиливает характерной экспрессию GITR для на II-III nTreg, триместров а грелин в концентрации, отражающей его уровень в крови в I-II триместрах беременности, повышает экспрессию GARP на nTreg (таблица 23). Совместное действие лептина и грелина нивелирует самостоятельное влияние каждого из гормонов на присутствие GITR и GARP на мембране nTreg. Таблица 23 – Влияние гормонов на экспрессию CTLA-4 (CD152), GITR (CD357), GARP на nTreg (CD4+CD25brightFOXP3+) (n=6) Гормоны Контроль Лептин, 10 нг/мл Лептин, 35 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл Грелин, 0,83 нг/мл Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл CTLA-4+, % GITR+, % GARP+, % 64,617,1 60,215,3 62,819,8 72,519,3 71,412,9 70,816,9 72,3710,47 нд 90,958,41* 82,064,68 нд нд 94,265,73 нд 94,255,74 96,693,3* нд нд 66,915,3 80.278.86 91,818,18 Примечание: * - различия достоверны (p < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю 157 Обсуждая полученные результаты, следует отметить, что лептин оказывает оппозитные эффекты, угнетая формирование аTreg, но усиливая экспрессию GITR на nTreg, т.е. способствуя повышению их супрессорного потенциала. Причем, стимулируя экспрессию GITR, через NF-kB-путь, лептин, возможно, будет способствовать индукции и других супрессорных молекул на nTreg. Грелин действует однонаправлено на обе субпопуляции Treg, усиливая формирование аTreg, экспрессирующих CTLA-4, и присутствие GARP на nTreg. Причем, возможно, увеличение экспрессии GARP является одним из механизмов, объясняющим преимущественное формирования аTreg под действием грелина [151]. При изучении влияния лептина и грелина на продукцию цитокинов TGF-β1 и IL-10, в культурах nTreg, модулирующих эффектов гормонов выявлено не было (таблица 24). По-видимому, это обусловлено тем, что выработка иммуносупрессорных цитокинов не является ведущим механизмом реализации супрессорной активности nTreg. Так же ряд авторов отмечает характерную особенностью nTreg, проявлять слабую функциональную активность in vitro [296]. Таблица 24 – Влияние лептина и грелина на продукцию цитокинов CD4+ CD25brightFOXP3+ -лимфоцитами Гормональное TGF-1, нг/мл (n=10) IL-10, нг/мл (n=6) Контроль 26,30±13,95 8,38±2,66 Лептин, 35 нг/мл 29,36±16,38 9,62±6,14 Грелин, 1,25 нг/мл 22,34±9,01 7,89±2,96 Лептин, 35 нг/мл + 20,55±17,95 8,18±2,62 воздействие Грелин, 0,83 нг/мл Известно, что Treg в условиях in vitro характеризуются низкой пролиферативной активностью [248, 296]. Добавление рапамицина в 158 культуры усиливает пролиферацию nTreg in vitro, за счет угнетения mTOR сигнального пути [248]. В работах ряда авторов показано, что лептин, в концентрации 100 нг/мл и выше, угнетал пролиферацию Treg, предварительно обработанных рапамицином [248], а блокада рецепторов лептина усиливала пролиферацию Treg in vitro [104]. Эти же авторы показали, что рапамицин снижает количество рецепторов к лептину на Treg [248]. Предполагается, что лептин реализуется свои угнетающие эффекты за счет активации mTOR-сигнального пути, однако эти эффекты неодназначны и зависят от исходного уровня активации клетки [248]. В наших исследованиях показано, что в концентрациях, характерных для беременности, исследуемые гормоны, а также их комбинации не влияют на пролиферацию nTreg, предварительно обработанных рапамицином (таблица 25). Таблица 25 – Влияние лептина и грелина на пролиферацию nTreg в системе in vitro (n=3) Экспериментальное воздействие Общий процент пролиферирующих CD4+FOXP3+CFSE+, % Контроль без рапамицина Рапамицин (100 nM) 4,56±0,55 11,61±5,59# Лептин, 10 нг/мл+ Рапамицин (100 nM) 7,59±2,21 Лептин, 35 нг/мл+ Рапамицин (100 nM) 5,84±1,28 Грелин, 1,25 нг/мл+ Рапамицин (100 nM) 10,28±3,93 Грелин, 0,83 нг/мл+ Рапамицин (100 nM) 12,29±4,67 Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 8,96±3,55 + Рапамицин (100 nM) Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 7,48±2,26 + Рапамицин (100 nM) Примечание: # - различия достоверны (p < 0,05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю без рапамицина 159 Далее оценивали влияние гормонов на апоптоз nТreg (CD4+25brightFOXP3+) (рисунок 38). Установлено, что лептин снижает процент nTreg, вступивших в ранний апоптоз (таблица 26). Грелин в концентрациях, характерных для беременности, не оказывает значимых эффектов на апоптоз nTreg. При совместном действим лептина и грелина в комбинации, характерной для беременности, является снижение числа nTreg в позднем апоптозе и общего числа апоптотирующих nTreg. PI Контроль Лептин, 35 нг/мл 27,4% 25,3% 6,1% 2,3% Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 26,9% 14,4% 2,7% 6,5% AnnV+-FITC Рисунок 38 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на апоптоз CD4+25brightFOXP3+Т-лимфоцитов (по данным одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (PI) 160 Таблица 26 – Влияние лептина и грелина на апоптоз CD4+25brightFOXP3+Т-лимфоитов (n=10) AnV+PI-- AnV+PI+- AnV+- лимфоциты, % лимфоциты, % лимфоциты, % Контроль 5,76±2,79 26,07±8,55 34,83±7,08 Лептин, 35 нг/мл 2,76±1,66* 27,46±11,46 33,42±12,28 Грелин, 1,25 нг/мл 2,91±1,41 25,06±12,96 31,55±12,26 4,89±1,95 13,50±3,11* 20,46±4,77* Гормональное воздействие Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл Примечание: * - различия достоверны (p < 0,05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Суммируя эффекты гормонов на функциональную активность nTreg, можно заключить, что, несмотря на разнонаправленное влияние лептина и грелина на аTreg, на nTreg гормоны действуют однонаправленно, усиливая экспрессию GITR и GARP, угнетая их апоптоз, что способствует поддержанию количества и иммуносупрессорного фенотипа nTreg, но не влияют на выработку цитокинов и пролиферацию. Результатом совместного действия гормонов в исследуемых концентрациях является угнетение апоптоза nTreg. Остальные самостоятельные эффекты гормонов нивелируются при их совместном внесении. Таким образом, подводя итог изучению влияния гормонов на Трегуляторные клетки периферической крови, можно заключить, что лептин, действуя самостоятельно, угнетает формирование аTreg и экспрессию на них CTLA-4, но усиливает эксперссию GITR nTreg. Лептин препятствует апоптозу nTreg и предшественников aTreg (CD4+25-Т-лимфоциты). Грелин в исследуемых концентрациях усиливает формирование аTreg и экспрессию на них CTLA-4, а также экспрессию GARP на nTreg. 161 Физиологическая комбинация гормонов, соответвующая беременности, усиливает образование aTreg периферической крови, не влияет на изученные показатели функциональной активности aTreg и nTreg, но оказывает антиапоптотическое действие на nTreg и предшественников адаптивных регуляторных Т-клеток (CD4+25-Т-лимфоцитов), тем самым, способствуя сохранению общего пула Treg периферической крови. ВЫВОДЫ по главе 4.2 1. Лептин в исследуемых концентрациях угнетает формирование аTreg периферической крови. В концентрации, характерной для II-III триместра беременности, снижает экспрессию CTLA-4 на аTreg. Лептин оказывает антиапоптотическое действие в отношении nTreg и предшественников адаптивных регуляторных Т-клеток (CD4+25-Т-лимфоцитов). Гормон в концентрации, характерной для II-III триместра беременности, усиливает экспрессию GITR на nTreg. 2. Грелин, в исследуемых концентрациях, усиливает формирование аTreg периферической крови. Гормон в концентрации, сопоставимой с I-II триместром беременности, увеличивает экспрессию CTLA-4 на аTreg. Гормон не влиет на апоптоз nTreg и предшественников адаптивных регуляторных Т-клеток(CD4+25-Т-лимфоцитов). Гормон в концентрации, характерной для I-II триместра беременности, усиливает экспрессию GARP на nTreg. 3. Совместное действие лептина и грелина в концентрациях, характерных для беременности, повышает процент аTreg, а также оказывает антиапоптотическое действие в отношении nTreg и предшественников адаптивных регуляторных Т-клеток, а также нивелирует самостоятельное влияние каждого из гормонов на присутствие GITR и GARP на мембране nTreg. 4. Исследуемые гормоны, а также их сочетания, не влияют на продукцию IL-10 аTreg, пролиферацию и продукцию цитокинов (IL-10, TGF-1) nTreg. 162 4.3. Роль лептина и грелина в регуляции дифференцировки CD4+Тлимфоцитов периферической крови в адаптивные Th17 В зависимости от воздействующих стимулов наивные CD4+Tхелперные клетки периферической крови могут трансформироваться в адаптивные субпопуляции как Treg, так и Th17. IL-1 и IL-6, а также ряд других стимулов вызывают экспрессию орфановый ядерного рецептора ROR-gamma-t (RORt) и транскрипцию кодирующих IL-17 генов в CD4+Tхелперных клетках, что приводит к формированию Th17 [55, 240]. Th17 инициирует воспалительные, аутоиммунные реакции, а также реакции отторжения трансплантата [55]. При спонтанных абортах количество Th17, а также продукция IL-17А в периферической крови значительно повышается [195]. Поэтому важно было оценить роль лептина и грелина в исследуемых концентрациях в индукции формирования аTh17. Для этого в модели in vitro создавали условия для преимущественной дифференцировки наивных CD4+Т-лимфоцитов в Th17 путем добавления IL1 и IL-6. Количество Th17 определяли как процент IL17A+- экспрессирующих Т-лимфоцитов в гейте CD4+Т-лимфоцитов (рисунок 39), а также как процент коэкспрессирующих RORt+ и IL17A+-лимфоцитов в гейте CD4+Т-лимфоцитов (рисунок 41). Для оценки флияния гормонов на функциональную активность Th17 исследовали экспрессию CCR6. Молекула CCR6 присутствует на большинстве Th17 и, по мнению ряда авторов, необходим для трансэндотелиальной миграции Th17 [55], что вместе с продукцией IL-17А отражает провоспалительный потенциал этих клеток. 163 Контроль Лептин, 35 нг/мл CD4+IL17A+ 1,68% IL17A+- PerCP5 CD4+IL17A+ 0,71% Лептин, 35 нг/мл + Грелин 0,83 нг/мл + Грелин 1,25 нг/мл CD4+IL17A+ 0,32% + CD4 IL17A 0, 65% CD4+-FITC Рисунок 39 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на формирование Th17 (процент CD4+IL17A+-лимфоцитов в гейте CD4+Тлимфоцитов). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание PerCP5) Установлено, что лептин в концентрации, характерной для I-II триместров беременности, не влияет, а в концентрации, сопоставимой с III триместром беременности, усиливает дифференцировку CD4+Т-лимфоцитов в аTh17 (CD4+IL17A+) (рисунок 40), (CD4+RORt+IL17A+) (рисунок 42) и повышает экспрессию (CD4+CCR6+IL17A+) на (рисунок них хемокинового 43), а также рецептора продукцию CCR6 IL-17А в 164 супернатантах культур (таблица 27). Грелин в концентрации, характерной для триместров I-II беременности, угнетает формирование Th17 (CD4+IL17A+) (рисунок 40), (CD4+RORt+IL17A+) (рисунок 42) и продукцию IL-17А (таблица 27) и вне зависимости от дозы снижает количество CD4+CCR6+IL17A+-лифоцитов (рисунок 43). Совместное действие лептина и грелина не влияет на формирование из Th17 CD4+Т-лимфоцитов периферической крови, но второй половине беременности (II-III триместр) повышает продукцию IL-17А в культурах CD4+Т-лимфоцитов (таблица 27). Причем данные корреляционного анализа показывают, что именно грелин препятствует увеличению количества Th17, поскольку была выявлена положительная корреляция между снижением уровня Th17 под действием только грелина и грелина в сочетании с лептином в концентрациях, характерных для II-III триместров беременности (r=0.95; p0.05). CD4Fitc-IL17APerCP, % 2,4 * 2 1,6 1,2 0,8 * 0,4 0 К Л1 Л2 Л1+Г1 Л2+Г2 Г1 Г2 Рисунок 40 – Влияние лептина и грелина на дифференцировку CD4+Тлимфоцитов периферической крови, премированных IL1-/IL-6, и формирование Th17 в системе in vitro (n=9). Примечание: по оси ординат – процент CD4+IL17A+-лимфоцитов в гейте CD4+Т-лимфоцитов; по оси абсцисс здесь и на рисунке 42, 43 – экспериментальное воздействие – процент; К- контроль; Л1 – лептин, 10 нг/мл; Л2 – лептин, 35 нг/мл; Л1+Г1 – лептин + грелин (10 нг/мл + 1,25 нг/мл); Л2+Г2 – лептин + грелин (35 нг/мл + 0,83 нг/мл); Г1 – грелин, 1,25 нг/мл; Г2 - грелин, 0,83 нг/мл; * - p < 0.05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю 165 Контроль Лептин, 35 нг/мл IL17A+- PerCP5 CD4+RORt+IL17A+, 0,59% Грелин 0,83 нг/мл +Лептин, 35 нг/мл CD4+RORt+IL17A+, 0,81% Грелин 1,25 нг/мл CD4+RORt+IL17A+, 0,19% CD4+RORt+IL17A+, 0,65% RORt-PE Рисунок 41 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на формирование Th17 в культуре CD4+Т-лимфоцитов периферической крови (процент CD4+RORt+IL17A+-лимфоцитов в гейте CD4+Т-лимфоцитов). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание PE); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание PerCP5) 166 1 CD4+RORt+IL17A+, % * 0,8 0,6 0,4 * 0,2 0 К Л1 Л2 Л1+Г1 Л2+Г2 Г1 Г2 Рисунок 42 –Влияние лептина и грелина на индукцию Th17 из CD4+Тлимфоцитов периферической крови в системе in vitro (n=9). Примечание: по оси ординат белые столбики – процент Th17 (CD4+RORt+IL17A+лимфоцитов) в гейте CD4+-лимфоцитов CD4Fitc-CCR6PE-IL17APerCP, % 100 * 80 60 * 40 * 20 0 К Рисунок 43 Л1 – Влияние CD4+CCR6+IL17A+-лимфоцитов, Л2 Л1+Г1 лептина и индуцируемых Л2+Г2 Г1 грелина из на Г2 количество CD4+Т-лимфоцитов периферической крови, премированных IL1-/IL-6, в системе in vitro (n=9). Примечание: по оси ординат – процент на CD4+CCR6+IL17A+-лимфоцитов в гейте CD4+IL17A+-лимфоцитов 167 Таблица 27 – Влияние лептина и грелина на продукцию IL-17A в культуре CD4+-лимфоцитов, премированных IL-1β/IL-6 человека в системе in vitro (n=6) Экспериментальное воздействие IL-17A, пг/мл Контроль 226,05±28,78 Лептин, 10 нг/мл 234,07±59,616 Лептин, 35 нг/мл 252,20±31,96* Грелин, 1,25 нг/мл 204,65±19,76* Грелин, 0,83 нг/мл 211,66±51,93 Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 232,92±25,39 Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 273,63±16,53* Примечание: * - различия достоверны (p < 0,05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю ВЫВОДЫ по главе 4.3 1. Лептин в концентрации, характерной для II-III триместров беременности усиливает дифференцировку CD4+Т-лимфоцитов в Th17 (CD4+RORt+), повышая также экспрессию хемокинового рецептора CCR6 на Th17 (CD4+CCR6+IL-17A+) и продукцию интерлейкина-17А (IL-17A). 2. Грелин в концентрации, характерной для I-II триместров беременности, угнетает поляризацию в Th17 (CD4+IL-17A+) и экспрессию CCR6 на Th17 (CD4+CCR6+IL-17A+), а также продукцию IL-17А. 3. Совместное действие лептина и грелина не влияет на дифференцировку CD4+Т-лимфоцитов в Th17, но в комбинации второй половины беременности усиливает продукцию IL-17А. 168 4.4. Молекулярные механизмы регуляции лептином и/или грелином дифференцировки CD4+-T-лимфоцитов в адаптивные субпопуляций Трегуляторных клеток Для объяснения молекулярных механизмов влияния лептина и грелина на направленность дифференцировки наивных CD4+-T-лимфоцитов в адаптивные субпопуляции Т-регуляторных клеток использовали Н-89 (ингибитор РКА) - и W (ингибитор PI3K), поскольку именно РКА и PI3K являются ключевыми для индукции транскрипции FOXP3 или RORt в CD4+Т-лимфоцитах [249]. Установлено, что Н-89 (ингибитор РКА) угнетает дифференцировку CD4+Т-лимфоцитов как в аTh17 (CD4+RORt+), так и в аTreg (CD4+FOXP3+) (рисунок 44, 45), что подтверждает значимую роль РКА. Очевидно, что ингибирование РКА препятствует активации СREB (cAMP response element binding protein), необходимого для экспрессии FOXP3 и формирования аTreg [144]. Тогда как, снижение образования аTh17 при внесении Н-89 можно объяснить ингибированием другой его мишени - MSK1 (mitogen- and stressactivated protein kinase 1), активирующей NF-kB (ядерный фактор κB) и экспрессию RORt [57, 103]. Добавление W (ингибитора PI3K) не влияет на формирование аTh17, но усиливает образование аTreg (рисунок 44, 45). Активирующее действие W на индукцию аTreg, очевидно, обусловлено тем, что W отменяет способность PI3K, через Akt (протеинкиназа В) стимулировать mTOR (Mammalian Target of Rapamycin), что угнетает экспрессию FOXP3 [103, 274]. При изучении действия гормонов на фоне внесения ингибиторов установлено, что стимуляция лептином дифференцировки CD4+Т- лимфоцитов преимущественно в аTh17 реализуется при участии PI3K (рисунок 44), поскольку внесение W отменяет лептин-индуцированное усиление формирования аTh17. Тогда как депрессивный эффект лептина на индукцию аTreg не связан с активностью ни PI3K, ни РКА (рисунок 45). 169 1,6 CD4+RoRgt +, % # 1,4 ^ 1,2 1 * 0,8 0,6 0,4 * 0,2 * Грелин+W Лептин+Грелин+W Лептин+W W Грелин+Н89 Лептин+Грелин+Н89 Лептин+Н89 Н89 Грелин Лептин+Грелин Лептин К 0 Рисунок 44 – Дифференцировка CD4+Т-лимфоцитов, премированных IL1-/IL-6, и формирование адаптивных Th17 под действием лептина и грелина на фоне внесения ингибитора РКА (Н-89) и ингибитора PI3K (W) в системе in vitro (n=6). Примечание: по оси ординат – процент Th17 (CD4+RORt+ -лимфоцитов) в гейте CD4+Т-лимфоцитов; по оси абсцисс здесь и на рисунке 45 – экспериментальное воздействие: К-контроль, лептин лептин, 35 нг/мл; лептин + грелин – лептин, 35 нг/мл + грелин, 0.83 нг/мл; грелин – грелин, 1.25 нг/мл; Н-89 – пробы с внесением Н-89, 1 мкг/мл; W – пробы с внесением вортманнина, 100 нМ; * - р 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по сравнению с контролем, # - р 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по сравнению c пробой, куда вносили только H-89; ^ - р 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по сравнению c пробой, куда вносили только вортманнин 170 CD4+FOXP3+, % CD4+Foxp3+, % * * 20 ^ 15 ^ 5 * # # Лептин+Грелин+Н89 10 Лептин+Н89 * Н89 25 Грелин+W Лептин+Грелин+W Лептин+W W Грелин+Н89 Грелин Лептин+Грелин Лептин К 0 Рисунок 45 – Дифференцировка CD4+Т-лимфоцитов, примированных TGF-1, и формирование адаптивных Treg под действием лептина и грелина на фоне внесения ингибитора РКА (Н-89) и ингибитора PI3K (W) в системе in vitro (n=8). Примечание: по оси ординат – процент Тreg (CD4+FOXP3+лимфоцитов) в гейте CD4+ Т-лимфоцитов. 171 Предполагая возможные молекулярные механизмы реализации регуляторных эффектов гормонов на поляризацию CD4+Т-лимфоцитов в Treg/Th17, следует отметить, что взаимодействие лептина со специфическим рецептором (Ob-R) на лимфоцитах, запускает несколько сигнальных путей [248, 249], основной из которых аналогичен таковому для IL-6, и включает Jak2 (янус-киназа) и далее STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) - ключевой индуктор RORt [238, 248, 249]. Помимо этого, лептин, связываясь с Ob-R, стимулирует (экстраклеточно- ERK1/2 регулируемая протеинкиназа), с последовательным фосфорилированием Akt, и, как следствие, высвобождением NF-κB [200, 300], который инициирует транскрипцию генов провоспалительных цитокинов, в том числе, и RORt. Следовательно, преобладание дифференцировки CD4+Т-лимфоцитов в Th17 под действием лептина объясняется преимущественной активацией гормоном RORt. Принципиальная роль PI3K для экспрессии RORt, повидимому, заключается в том, что взаимодействие лептина с Ob-R индуцирует PI3K-зависимую активацию фосфодиэстеразы (PDE) [179], что поддерживает низкий уровень cAMP в клетке, поскольку повышение его уровня угнетает транскрипцию генов провоспалительных факторов [38] и RORt. Преимущественная активация лептином RORt в CD4+Т-лимфоцитов является причиной угнетения гормоном дифференцировки CD4+Т- лимфоцитов в аTreg, так как по данным литературы, и mTOR [249], и STAT3 эффективно [191] подавляют экспрессию FOXP3 в CD4+Т-клетках независимо от активности РКА и PI3K. Гипотетическая схема, суммирующая молекулярные механизмы реализации регуляторных эффектов гормонов на поляризацию CD4+Т-лимфоцитов представлена на рисунке 46. При изучении молекулярных механизмов действия грелина показано, что блокада РКА нивелирует регуляторные эффекты гормона на формирование аTh17 и аTreg (рисунок 44, 45). При внесении W (ингибитора PI3K) эффекты гормона меняются на противоположные: грелин стимулирует синтез аTh17 и угнетает формирование аTreg (рисунок 44, 45). 172 Следовательно, действие грелина на CD4+Т-лимфоцитов девиацию опосредовано и через РКА-; и через PI3K, однако ведущая роль в активации грелином экспрессии FOXP3 и подавлении RORt принадлежит PI3K. Исследования последних лет показали, что при связывании грелина со своим рецептором (GHS-R) происходит димеризация GHS-R с привлечением других типов G-сопряженных рецепторов с разными типами α-субъединиц G-белка [275]. В зависимости от специфичности α-субъединицы G-белка инициируются такие сигнальные каскады, как фосфолипаза С (PLC)зависимый путь с активацией протеинкиназы С (РКС) и повышением уровня внутриклеточного Са2+; аденилатциклаза (Ас) – РКА – зависимый путь [275]. Помимо этого, при лигировании GHS-R происходит диссоциация G-белка на α- и βγ-субъединицы, каждая из которых имеет собственные объекты действия [186]. Показано, что βγ-субъединицы G-белка способны активировать и PI3K [62], и Ас [186, 275], с последующей стимуляцией РКА. Стимуляция РКА также осуществляется комплексом Са2+/кальмодулин, через кальмодулин-зависимую протеинкиназу (CaMKK2) и АМP-активируемую протеинкиназу (АМРК) [90, 220], а также PI3K [62]. Таким образом, РКА играет значимую роль в реализации эффектов грелина, что отмечено в работах и других авторов [143, 180]. Ключевая роль РКА в усилении грелином формирования Treg обусловлена, по-видимому, РКА-зависимой активацией CREB – основного стимулятора для FOXP3. Индукция FOXP3 подавляет экспрессию RORt, поскольку FOXP3 непосредственно связывается с промотором RORt, блокируя его активацию [166], что и является возможной причиной угнетения грелином дифференцировки CD4+Т-лимфоцитов в Th17. Помимо этого, АМРК, активируемая через GHSR - PLC - Са2+-путь, угнетает mTOR [220], что также способствует превалированию экспрессии FOXP3. Что касается принципиальной роли PI3K в реализации эффектов грелина, следует отметить, что по данным литературы активация GHS-R вызывает как угнетение PI3K через Gαq-субъединицу [62], так и стимуляцию PI3K через 173 βγ-субъединицы G-белка [275]. Поэтому определение точной роли PI3K в поляризирующих эффектах грелина требует дальнейших исследований. Учитывая, что блокада PI3K меняет направленность действия грелина, можно предположить, что PI3K регулирует экспрессию ключевых транскрипционных факторов, таких как Smad3 (фактор транскрипции TGF-), NF-AT (ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов), NF-κB и АР1(активирующий протеин-1), поскольку формирование комплексов между ними приводит к преобладанию экспрессии либо FOXP3, либо RORt [299]. Другим возможным механизмом, объясняющим ключевую роль PI3K в грелин-опосредованной регуляции дифференцировки CD4+Т-лимфоцитов, является участие PI3K в контроле локальной продукции и деградации внутриклеточного cAMP, который реципрокно, инициируя/угнетая разные сигнальные пути, активирует либо FOXP3, либо RORt. Анализ совместных эффектов гормонов показывает, что ингибирование РКА и PI3K не влияет на сочетанное действие лептина и грелина на индукции aTh17 (рисунок 44), а внесение H-89 отменяет стимулирующий эффект комбинации лептина и грелина на индукцию aTreg (рисунок 45). Можно полагать, что характерное для I-II триместров беременности повышение числа аTreg периферической крови обусловлено преимущественно эффектами грелина, реализуемыми через РКА. При одномоментном связывании лептина и грелина с клеткой, за счет грелинопосредованного повышения внутриклеточного cAMP, реализуются, главным образом, РКА-зависимый эффект грелина, что приводит усилению формирования аTreg. По-видимому, РКА является ключевым фактором кооперации лептина и грелина при поляризации CD4+Т-лимфоцитов, что характерно и для других типов клеток [123, 180]. Гипотетический механизм реализации совместных эффектов лептина и грелина суммирован на рисунке 47. Можно предполагать, что экспрессии FOXP3 в ответ на активацию CD4+клетки является необходимы доминирующей, дополнительные тогда стимулы, как для экспрессии например, RORt связывание с 174 провоспалительными цитокинами. Так генетически-обусловленное повышение экспрессии рецепторов к лептину, характерное для некоторых народностей, объясняет увеличение у них частоты аутоиммунных патологий, хронических воспалительных процессов. Это также объясняет высокую частоту прерывания беременности у женщин, страдающих ожирением, когда концентрация лептина в периферической крови резко возрастает [215]. Таким образом, определена важная роль лептина и грелина в регуляции дифференцировки CD4+Т-лимфоцитов периферической крови в аTreg и аTh17, соотношение которых имеет ключевое значение при беременности, аутоиммунных патологиях, онкологических заболеваниях. Изученные молекулярные механизмы взаимодействия лептина и грелина открывают новые возможности для фармакологического манипулирования направленности дифференцировки клеток. ВЫВОДЫ по главе 4.4: 1. Лептин в концентрации, характерной для II-III триместров беременности усиливает дифференцировку CD4+Т-лимфоцитов в аTh17 при участии PI3K. 2. Реализация регуляторных эффектов грелина на формирование аTh17, аTreg задействует PI3K и PKA. 3. Совместное действие лептина и грелина приводит к РКА-зависимому усилению образования аTreg. 175 грелин лептин αq/i/s JAK2 2 CD4+ JAK2 PLC STAT-3 Ca2+ γβ Ас DAG cAMP CaMKK2 PI3K PDE сAMP AMPK PKА PKC PI3K ERK1/2 CREB Akt mTOR STAT-3 NF-kB RORt ERK1/2 Akt NF-AT AP-1 NF-kB FOXP3 ИЛ-17А aTh17 aTreg Рисунок 46 – Гипотетическая схема реализации самостоятельных эффектов лептина и грелина в регуляции дифференцировки CD4+Тлимфоцитов периферической крови и формирования аTh17 и аTreg. Примечание: толстые стрелки – стимулирующий эффект, пунктирные – ингибирующий эффект 176 грелин PLC лептин JAK2 2 АC cAMP PI3K PDE JAK2 STAT-3 cAMP cАМР 5АМР PKА CREB FOXP3 RORt aTreg Рисунок 47 – Гипотетическая схема реализации совместных эффектов лептина и грелина в регуляции дифференцировки CD4+Т-лимфоцитов периферической крови и формирования аTh17 и аTreg 177 РЕЗЮМЕ Суммируя полученные данные, можно полагать, что лептин и грелин в физиологических концентрациях, отражающих уровень гормонов при беременности, являются значимыми регуляторами Т-клеточного звена иммунитета. Лептин и грелин проявляют реципрокные модулирующие эффекты на формирование функциональную активность зрелых регуляторных субпопуляций Th17 Т-лимфоцитов и и Лептин Treg. способствует преобладанию аTh17, т.е. является абортогенным фактором, поскольку повышение Th17 в периферической крови ассоциировано со спонтанными абортами. Тогда как грелин, напротив, усиливает формирование aTreg. Возможно, что нарастание уровня грелина в сыворотке крови в I-II триместрах беременности обусловлено [131], в том числе, и необходимостью увеличения пула Treg в периферической крови в это период, сопряженный с высоким риском спонтанных абортов. Совместное действие лептина и грелина в зависимости от триместра беременности и исследуемой функции либо нивелирует самостоятельные эффекты каждого из гормонов, либо способствует преобладанию эффектов одного из гормонов. Однако возможно и проявления новых кооперативных эффектов, отличных от индивидуального действия каждого из гормонов. В целом, лептин и грелин, в исследуемых комбинациях, действуя совместно на уровне Т-лимфоцитов, стимулируют синтез IL-4 как CD4+-, так и CD8+Т-клетками, способствуя смещению направленности иммунных реакций по Тh2-типу; усиливают формирование аTreg в первой половине беременности, опосредуя модулирующее действие через РКА; не влияют на апоптоз зрелых Т-лимфоцитов, но оказывают антиапоптотическое действие в отношении nTreg периферической крови и предшественников аTreg. Таким образом, раскрыты новые механизмы гормональной регуляции Т-клеточного звена иммунитета. Лептин и грелин, смещая направленность иммунных реакций по Тh2-типу путем усиления выработки IL-4, а также 178 регулируя количество адаптивных и естественных Treg, как посредством апоптоза, так и индукции образования из наивных CD4+Т-клеток периферической крови, являются значимыми участниками формирования иммунной толерантности. 179 Глава 5. РОЛЬ ЛЕПТИНА И ГРЕЛИНА В РЕГУЛЯЦИИ ТИМИЧЕСКОГО ЭТАПА ФОРМИРОВАНИЯ КЛЕТОК АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА Иммунная система испытывает значительное модулирующее влияние со стороны эндокринной системы. Потенциальной мишенью для гормональной регуляции является тимический этап дифференцировки Тлимфоцитов, который связан с формированием основных Т-клеточных субпопуляций и определяет, в конечном счете, стратегию адаптивного иммунитета [29, 43, 44]. Несмотря на то, что еще в 80-х годах были выявлены существенные изменения структуры и функции тимуса при различных физиологических и патологических состояниях, механизмы этих изменений в настоящее время практически не изучены, а анализ гормонального влияния на тимус ограничивается, главным образом, оценкой его массы, клеточности или секреторной функции и не затрагивает собственно процессов дифференцировки. В работах ряда авторов показано, что лептин и грелин играют значимую роль в регуляции функций тимуса [111, 112, 176]. Рецепторы к лептину и грелину экспрессируются СD4+СD8+, СD4+СD8-, СD4-СD8тимоцитами [111, 133, 163]. Причем показано, что СD4+СD8+ экспрессируют в 2 раза больше рецепторов к грелину, чем остальные тимоциты [111, 112]. С возрастом количество рецепторов к грелину на тимоцитах снижается, коррелируя с возрастной инволюцией тимуса, и увеличением жировой инфильтрации. Инфузии грелина стареющим, но не молодым мышам восстанавливали клеточность и размеры тимуса, усиливали тимопоэз, снижали жировую инфильтрацию и улучшали структуру тимуса. Показано также, что усиление тимопоэза у стареющих мышей под влиянием грелина было связано с усилением миграции лимфоидных предшественников из костного мозга в тимус. Лептин также способствует усилению тимопоэза у возрастных мышей [111, 112], а также предотвращает стероид- индуцированный апоптоз тимоцитов, усиливая процессы пролиферации и 180 дифференцировки СD4+ и дубль-позитивных (СD4+СD8+) тимоцитов, причем реализация его эффектов связана с преобладанием экспрессии длинной функционально активной формы рецептора к лептину именно на СD4 +клетках [133, 176]. Также выявлена высокая экспрессия Ob-R на эпителиальных клетках тимуса [147], играющих ведущую роль в созревании тимоцитов [13]. Также было отмечено, что усиление тимопоэза под влиянием лептина наблюдалось только у мышей, с нарушением выработки или рецепции лептина, тогка как у обычных животных этот эффект отсутствовал, либо выявлялся под действием супрафизиологических доз гормона [156]. Как было описано ранее, лептин и грелин играют важную роль в регуляции репродуктивной функции и контроле иммунных реакций на всех этапах гестации. Также вышеупомянутые гормоны модулируют формирование и функции aTreg/aTh17 периферической крови небеременных женщин и nTreg периферической крови. Поэтому важно было оценить влияние исследуемых гормонов на тимический этап формирования основных эффекторов адаптивного иммунитета. 181 5.1. Роль лептина и грелина в регуляции фенотипического созревания, пролиферации, апоптоза тимоцитов и продукции ключевых цитокинов В проведенных нами исследованиях установлено, что в концентрациях, сопоставимых с содержанием гормонов в периферической крови по триместрам беременности, лептин и грелин, а также их комбинации по триместрам беременности, не оказывают статистически значимых эффектов на фенотипическое созревание тимоцитов (таблица 28). Фенотипическое созревание тимоцитов оценивалось по изменению коэкспрессии CD4/CD8 и переходу незрелых CD4+CD8+ - тимоцитов в более зрелые CD4+CD8- /CD4CD8+- клетки (рисунок 48). Таблица 28 – Фенотипические изменения в культуре тимоцитов под влиянием лептина и грелина (n=10) Гормональное воздействие CD4+CD8+- CD4+CD8- - CD4-CD8+- CD4-CD8- - тимоциты, % тимоциты, % тимоциты, % тимоциты, % Контроль 86,64±2,28 8,64±2,62 3,43±1,65 1,28±0,72 Лептин, 10 нг/мл 86,66±3,13 9,87±2,73 2,57±1,16 0,88±0,46 Лептин, 35 нг/мл 85,86±4,41 10,32±3,15 2,84±1,35 0,96±0,51 Грелин, 1,25 нг/мл 85,69±3,99 10,87±3,21 2,61±2,00 0,82±0,62 Грелин, 0,83 нг/мл 84,64±5,54 12,48±4,67 1,90±0,58 0,97±0,51 86,49±4,58 10,17±3,90 2,53±1,30 0,79±0,43 85,95±4,20 10,20±3,43 3,02±1,65 0,81±0,51 Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 182 Контроль Лептин, 35 нг/мл CD8- PC5 2,04 89,15 0,69 8,12 2,02 87,65 0,58 9,76 Лептин, 35 нг/мл + Грелин 0, 83 нг/мл Грелин 0, 83 нг/мл 2,18 89,80 0,53 7,50 1,94 88,39 0,59 9,08 CD4-PE Рисунок 48 – Гистограммы, характеризующие фенотипические изменения в культуре тимоцитов под влиянием лептина и грелина, оцениваемые по экспрессии CD4 и CD8 (по данным одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание PE); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание PC5) Поскольку известно, что основным тимопоэтическим фактором, поддерживающим рост и развитие тимоцитов, является IL-7 [43, 44, 147], мы исследовали также влияние гормонов на экспрессию рецептора к IL-7 (IL-7R) на поверхности тимоцитов (рисунок 49). 183 Контроль + CD4 CD127 12, 9% Лептин, 10 нг/мл + + CD4 CD127 33, 5% CD127+-PE Лептин, 10 нг/мл + грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + CD4+CD127+ 30,0% Лептин, 35 нг/мл + грелин, 0,83 нг/мл CD4+CD127+ 32, 4% CD4+CD127+ 26, 1% Грелин, 1,25 нг/мл Грелин, 0,83 нг/мл CD4+CD127+ 18,5% CD4+CD127+ 18, 7% CD4+-FITC Рисунок 49 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на экспрессию CD127 на CD4+-тимоцитах в культуре (на примере одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание PE) 184 Показано, что лептин в концентрации, характерной для II-III триместров беременности, и комбинация лептина с грелином, отражающая уровень гормонов в I-II триместрах беременности, усиливали экспрессию IL7R (CD127) на поверхности CD4+-тимоцитов (таблица 29). Другими авторами было показано, что лептин усиливает выработку IL-7 эпителиальными клетками тимуса [147]. Суммируя эти данные, можно полагать, что возможным механизмом тимопоэтического действия лептина является усиление выработки IL-7 эпителиальными клетками тимуса, на фоне повышения экспрессии IL-7R на CD4+тимоцитах. Таблица 29 – Влияние гормонов на экспрессию IL-7R (CD127) на CD4+ тимоцитах (n=10) Гормоны CD4+CD127+тимоциты, % Контроль 17,315,11 Лептин, 10 нг/мл 23,4710,01 Лептин, 35 нг/мл 25,745,32* Грелин, 1,25 нг/мл 17,293,09 Грелин, 0,83 нг/мл 18,563,38 Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 32,514,79* Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 25,716,48 Примечание: * - различия достоверны (p < 0,05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Известно, что при беременности происходит инволюции тимуса, причиной чему является индуцированный стероидами апоптоз тимоцитов. Учитывая, что лептин проявляет антиапоптотические эффекты [133], а грелин предотвращает возрастную инволиции тимуса [111, 112], исследовали роль лептина и грелина, в концентрациях, характерных для беременности, в 185 регуляции стероид-индуцированого апоптоза тимоцитов. Оценка апоптоза тимоцитов методом проточной цитометрии представлена на рисунке 50. Контроль Лептин, 35 нг/мл 24,1% 44,1% 32,1% PI 35,5% Лептин, 35 нг/мл + Грелин 0,83 нг/мл Грелин 0,83 нг/мл 39,1% 35,9% 41,3% 44,1% AnnV-FITC Рисунок 50 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на апоптоз тимоцитов (по данным одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (PI) Установлено, что и лептин, и грелин, а также сочетания гормонов обладают выраженным антиапоптотическим действием, снижая количество тимоцитов, находящихся в апоптозе (таблица 30). Ранее, в работах других 186 авторов было показано, что лептин проявляет антиапоптотическое действие в отношении тимоцитов [133]. Таблица 30 – Влияние лептина и грелина на апоптоз тимоцитов (n=10) Экспериментальное воздействие AnV+тимоциты, % Проба без внесения дексаметазона 24,67±8,26* Контроль 82,41±7,01 Лептин, 10 нг/мл 60,81±22,14* Лептин, 35 нг/мл 64,47±15,33* Грелин, 1,25 нг/мл 65,36±18,51 Грелин, 0,83 нг/мл 66,93±16,69* Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 61,33±19,91* Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 67,83±17,92* Примечание: * - различия достоверны (p < 0,05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю На пролиферацию тимоцитов гормоны оказывают разнонаправленные эффекты. Лептин, в концентрации, сопоставимой со II-III триместром беременности, усиливает пролиферацию тимоцитов, тогда как грелин, напротив, в концентрации, сопоставимой с уровнем гормонов III триместром беременности, оказывает антипролиферативное действие (таблица 31). При совместном внесении гормонов модулирующие эффекты отсутствуют. В работах других авторов показано, что лептин в концентрациях, превышающих физиологические, усиливает пролиферацию только CD4+тимоцитов мышей [176]. Тогда как влияние грелина на пролиферацию и апоптоз тимоцитов, а также грелина в сочетании с лептином, практически не изучено, поэтому выявленные эффекты требуют более глубокого анализа. 187 Таблица 31 – Влияние лептина и грелина на пролиферацию тимоцитов в системе in vitro (n=8) Экспериментальное 0 делений, 1-2 3-4 воздействие % деления, % деления, % Контроль 63,5±11,6 28,33±9,52 8,16±3,04 Лептин, 10 нг/мл 63,17±6,96 28,17±5,36 10,17±1,84 Лептин, 35 нг/мл 59,67±10,16* 29,50±9,76 10,83±2,80* Грелин, 1,25 нг/мл 64,17±6,16 31,00±5,92 4,83±0,64 Грелин, 0,83 нг/мл 69,33±3,04 28,17±3,84 2,50±1,52* Лептин, 10 нг/мл + 62,17±8,96 29,83±8,96 8,00±4,08 63,50±9,92 29,00±8,96 7,50±1,44 Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл Примечание: * - различия достоверны (p < 0,05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Известно, что успешная беременность ассоциирована с Th2-девиацией, формирование которой на периферии модулируется гормонами. Клетки тимуса всех типов способны вырабатывать цитокины, однако природа стимулов, индуцирующих их секрецию в этом органе, изучена недостаточно [29, 43]. При изучении регуляции гормонами продукции IL-4 и IFN-gamma тимоцитами установлено, что лептин повышал продукцию IL-4 тимоцитами лишь в концентрации 35 нг/мл, соответствующей II-III триместру беременности, в то время как грелин повышал уровень IL-4 независимо от концентрации. В отношении продукции IFN-gamma показано, что грелин не оказывал статистически значимого эффекта, в то время как лептин повышал продукцию данного цитокина в концентрации 10 нг/мл, соответствующей I триместру беременности (таблица 32). 188 При совместном внесении гормонов, лептин и грелин усиливали продукцию IL-4 тимоцитами, независимо от концентрации, что дает возможность полагать, что реализуются, главным образом, эффекты грелина. Поскольку продукция цитокинов на уровне тимуса играет главным образом трофическую функцию [29, 43], исследуемые гормоны, можно рассматривать как лимфопоэтические факторы. Таблица 32 – Модуляция гормонами продукции IFN-gamma и IL-4 тимоцитами (n=8) Гормональное Концентрация цитокинов, пг/мл воздействие IL-4 IFN-gamma Контроль 4,061,29 5,56±1,36 Лептин, 10 нг/мл 4,640,79 19,831,47* Лептин, 35 нг/мл 40,259,98* 8,943,57 Грелин, 1,25 нг/мл 76,2611,24* 5,652,14 Грелин, 0,83 нг/мл 76,1810,04* 5,111,52 64,1922,15* 8,213,89 59,2815,25* 7,543,35 Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл Примечание: * - различия достоверны (p < 0,05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю Таким образом, корецепторных лептин молекул и грелин, CD4/CD8 на не влияя на экспрессию тимоцитах, оказывают антиапоптотическое действие в модели кортикостероид-индуцированного апоптоза тимоцитов, и дозозависимо стимулируют пролиферацию тимоцитов. Лептин, возможно, опосредует свои антиапоптотические и пролиферативные эффекты путем увеличения экспрессии рецептора к IL-7 на CD4+тимоцитах. 189 5.2 Роль лептина и грелина в регуляции тимического этапа формирования естественных Th17 и Treg и контроле их функциональной активности. Th17 клетки представляют субпопуляцию регуляторных CD4+Тлимфоцитов, которые инициируют воспалительные, аутоиммунные реакции, а также реакции отторжения трансплантанта [55]. Образование Th17 происходит из наивных CD4+CD161+Т-лимфоцитов в тимусе и пуповинной крови под воздействием IL-1 и IL-6 (или IL-23), что активирует транскрипцию RORt и кодирующих IL-17 генов [55]. Th17 клетки конститутивно экспрессируют CD161, а также хемокиновый рецептор CCR6, которые, по мнению ряда авторов, необходимы для трансэндотелиальной миграции Th17 в ткани [55]. Поскольку субпопуляция Th17 очень немногочисленна, при изучении влияния гормонов на индукцию Th17 в культурах IL-1β- и IL-6примированных тимоцитов количество Th17 клеток оценивали как процент CD4+CD161+IL-17A+ в субпопуляции CD4+CD161+тимоцитов (рисунок 51), а также как количество CD4+тимоцитов, экспрессирующих RORt+ и IL-17A+ (рисунок 52). В результате проведенных исследований установлено, что лептин не влиял на генерацию CD4+CD161+IL17A+-клеток в культурах IL-1β- и IL-6примированных тимоцитов (таблица 33). Грелин в концентрации характерной для второй половины беременности угнетал образование CD4+CD161+IL17A+-клеток. Комбинация лептина и грелина, характерная для первой половины беременности снижала уровень Th17 (CD4+CD161+IL17A+) клеток. При анализе индукции экспрессии специфического для Th17 транскрипционного фактора RORt в CD4+-тимоцитах статистически значимых эффектов лептина и грелина, а также их сочетаний выявлено не было (таблица 33). При изучении влияния лептина и грелина на экспрессию IL-17A в тимоцитах установлено, что лептин в концентрации, характерной 190 для II-III триместра беременности, повышает количество CD4+RORt+IL17A+тимоцитов. Грелин, напротив, в концентрации, характерной для I-II триместра беременности (1,25 нг/мл) снижает их количество (таблица 33). При совместном внесении лептин и грелин в исследуемых концентрациях нивелируют эффекты друг друга. CD4+-FITC CD4+CD161+ CD4+-FITC CD161+-PE Грелин, 1,25 нг/мл CD4+-FITC CD4+CD161+IL-17А+ 69% CD161+-PE CD4+CD161+IL-17А+ 41% CD161+-PE CD4+CD161+ CD161+-PE IL17A+-PE-CY5 Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл IL17A+-PE-CY5 CD161+-PE CD4+CD161+ IL17A+-PE-CY5 CD4+CD161+IL-17А+ 65% CD161+-PE CD4+CD161+ Лептин, 35 нг/мл IL17A+-PE-CY5 CD161+-PE Контроль CD4+CD161+IL-17А+ 49% CD161+-PE CD4+-FITC Рисунок 51 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на формирование CD4+CD161+IL17A+тимоцитов в культуре (процент CD4+CD161+IL17A+тимоцитов в гейте CD4+CD161+тимоцитов; на примере одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание CD4+-FITC); интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание CD161+-РЕ); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание CD161-РЕ); интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание IL17A+-PE-CY5) 191 Контроль CD4+ RORt+IL17A+ 0,52% CD4+ RORt+IL17A+ 0,78% CD4+ RORt+ 0,61% CD4+ RORt+ 0,44% IL17A-PE-Cy5 Лептин, 35 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл CD4+RORt+IL17A+ 0,27% CD4+RORt+IL17A+ 0,51% CD4+RORt+ 0,39% CD4+RORt+ 0,11% RORt-PE Рисунок 52 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на индукцию формирования CD4+RORt+IL17A+тимоцитов в культуре (процент CD4+RORt+IL17A+тимоцитов в гейте CD4+тимоцитов; на примере одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание PE); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание РЕ-Cy5) 192 Таблица 33 – Влияние гормонов на генерацию Th17 в культурах тимоциты, % (n=8) CD4+RORt+IL17A+ тимоциты, % (n=8) CD4+RORt+ Гормоны тимоциты, % (n=6) CD4+CD161+IL17A+ IL-1β- и IL-6-примированных тимоцитов Контроль 70,0917,31 0,402±0,18 0,530,16 Лептин, 10 нг/мл 69,839,74 0,293±0,057 0,640,21 Лептин, 35 нг/мл 63,7857,92 0,506±0,295 0,760,06* Грелин, 1,25 нг/мл 44,837,37 0,206±0,004 0,210,02* Грелин, 0,83 нг/мл 38,603,49* 0,276±0,062 0,360,16 41,3418,39* 0,237±0,088 0,650,38 47,037,43 0,28±0,013 0,610,21 Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контролем по парному t-критерия Стьюдента Однако, при анализе продукции IL-17A, определяемой по концентрации IL-17A в супернатантах культур IL-1β- и IL-6-примированных тимоцитов, показано, что лептин, в концентрации, сопоставимой с уровнем гормона в I триместре беременности, угнетает продукцию IL-17A (таблица 34). Грелин, а также его комбинации с лептином значимых эффектов не оказывали. 193 Таблица 34 – Влияние гормонов на продукцию IL-17A в супернатантах культур IL-1β- и IL-6-примированных CD4+ тимоцитов (n=8) IL17A, пг/мл Гормоны Контроль 5,872,57 Лептин, 10 нг/мл 2,421,14* Лептин, 35 нг/мл 2,691,36 Грелин, 1,25 нг/мл 6,534,35 Грелин, 0,83 нг/мл 6,023,44 Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 3,712,18 Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 3,311,49 Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контролем по парному t-критерия Стьюдента Подводя итог вышесказанному, можно полагать, что грелин в исследуемых концентрациях угнетает формирование Th17 в тимусе, но не влияет на продукцию IL-17A тимоцитами. При совместном внесении гормоны либо не влияют (CD4+RORt+IL17A+), либо угнетают генерацию Th17 (CD4+CD161+IL17A+), но не оказывают действия на продукцию IL17A тимоцитами. Лептин же в изучаемых концентрациях оказывает разнонаправленные эффекты: лептин не влияет на количество CD4+CD161+IL17A+ и CD4+RORt+, но снижает продукцию IL17A в супернатантах культур тимоцитов в первой половине беременности; а во второй половине Выявленная - гормон повышает разнонаправленность число эффектов CD4+RORt+IL17A+. лептина, возможно, обусловлена тем, что в тимусе RORt и IL17A экспрессируются не только Th17 клетками, но и другими минорными субпопуляциями CD4+тимоцитов, например CD4+RORt+FOXP3+IL17A+ [310], что требует дальнейшего изучения. 194 Предшественниками nTreg в тимусе являются CD4+тимоциты, которые характеризуются высокой экспрессией CD25 и FOXP3 (CD4+CD25brighFOXP3+) [132, 192]. Известно, что Treg-клетки с фенотипом CD4+CD25brighFOXP3+ «обучаются» в тимусе на этапе негативной селекции и покидают тимус как популяция естественных Treg, обладающая максимальной супрессорной активностью [132, 192]. Для анализа роли гормонов в формировании естественных Treg в тимусе оценивали количество CD4+CD25brightFOXP3+-клеток CD4+FOXP3+-клеток (рисунок 54) в (рисунок культуре 53) и тимоцитов, культивируемых в присутствии гормонов, а также факторов, создающих преимущественные условия для формирования Treg (TGF-β1). Установлено, что лептин независимо от концентрации, снижает формирование nTreg в культурах TGF-β1-примированных тимоцитов (таблица 35). Грелин в исследуемых концентрациях эффекта не оказывает. Совместное действие лептина и грелина в концентрациях, характерных для первой половины беременности, угнетает экспрессию FOXP3+ CD4+тимоцитами, а в комбинации, соответствующей второй половине беременности – снижают количество CD4+CD25brightFOXP3+ в культурах TGF-β1-примированных тимоцитов. 195 Контроль CD4+FOXP3+ 4,91% Лептин, 10 нг/мл Лептин, 35 нг/мл CD4+FOXP3+ 3,52% Грелин, 1,25 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл CD4+FOXP3+ 6,74% FOXP3+-PE-Cy5 CD4 FOXP3 5,35% + CD4+FOXP3+ 2,73% Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл CD4+FOXP3+ 2,95% CD4+FOXP3+ 3,87% CD4+-FITC Рисунок 53 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на индукцию формирования CD4+FOXP3+тимоцитов в культуре (процент CD4+FOXP3+тимоцитов в гейте CD4+тимоцитов; на примере одного эксперимента). Примечание: по оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL1 (окрашивание FITC); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание РЕ-Cy5) 196 Контроль CD4+25brightFOXP3+ 53,67% CD4+25dim FOXP3+-PE-Cy5 CD25-PE CD4+25bright CD4-FITC CD25-PE Лептин, 35 нг/мл CD4+25brightFOXP3+ 36,89% CD4+25dim FOXP3+-PE-Cy5 CD25-PE CD4+25bright CD4- FITC CD25-PE Грелин, 1,25 нг/мл CD4+25brightFOXP3+ 50,56% CD4+25dim FOXP3+-PE-Cy5 CD25-PE CD4+25bright CD4- FITC CD25-PE + CD25-PE CD4 25 bright CD4+25dim CD4-FITC FOXP3+-PE-Cy5 Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл CD4+25brightFOXP3+ 42,35% CD25-PE Рисунок 54– Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на формирование CD4+CD25brightFOXP3+тимоцитов в культуре (процент CD4+CD25brightтимоцитов, экспрессирующих FOXP3+, в гейте + bright CD4 CD25 тимоцитов; на примере одного эксперимента) 197 Таблица 35 – Влияние гормонов на формирование Treg в культурах TGF-β1-примированных тимоцитов (n=7) CD4+CD25brightFOXP3+ CD4+FOXP3+ тимоциты, % тимоциты, % Контроль 57,7129,81 4,971,52 Лептин, 10 нг/мл 36,274,34* 4,011,05 Лептин, 35 нг/мл 40,312,59* 2,950,94* Грелин, 1,25 нг/мл 35,879,84 5,712,16 Грелин, 0,83 нг/мл 61,3313,97 5,512,11 Лептин, 10 нг/мл + 48,8912,53 3,271,05* 43,692,14* 4,551,34 Гормоны Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контролем по парному t-критерия Стьюдента Для анализа гормональных механизмов регуляции функциональной активности nTreg исследовали экспрессию молекул CTLA-4 и GITR, тесно вовлеченных в реализацию иммуносупрессорной функции Treg. Гистограммы, характеризующие оценку влияния гормонов на экспрессию CTLA-4 и GITR на Treg представлены на рисунках 55 и 56 соответственно. 198 Контроль GITR-PE FOXP3+-PE-Cy5 CD4+GITR+FOXP3+ 37,42% CD4-FITC GITR-PE Лептин, 35 нг/мл GITR-PE FOXP3+-PE-Cy5 CD4+GITR+FOXP3+ 29,98% CD4-FITC GITR-PE Грелин, 1,25 нг/мл GITR-PE FOXP3+-PE-Cy5 CD4+GITR+FOXP3+ 26,16% CD4-FITC GITR-PE Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл GITR-PE FOXP3+-PE-Cy5 CD4+GITR+FOXP3+ 24,67% CD4-FITC GITR-PE Рисунок 55 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на формирование CD4+GITR+FOXP3+тимоцитов CD4+GITR+тимоцитов, экспрессирующих CD4+GITR+тимоцитов; на примере в культуре FOXP3+, одного (процент в гейте эксперимента) 199 Контроль CD4+D152+FOXP3+ 51,1% CD152+-PE FOXP3+-PE-Cy5 CD4+CD152+ 21,67% CD152+-PE CD4-FITC Лептин, 35 нг/мл CD4+D152+FOXP3+ 68,9% FOXP3+-PE-Cy5 CD152+-PE CD4+CD152+ 23,46% CD152+-PE CD4-FITC CD4+D152+FOXP3+ 43,43% CD4+CD152+ 12,34% FOXP3+-PE-Cy5 CD152+-PE Грелин, 1,25 нг/мл CD152+-PE CD4-FITC Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл CD4+D152+FOXP3+ 52,56% FOXP3+-PE-Cy5 CD152+-PE CD4+CD152+ 10,56% CD152+-PE CD4-FITC Рисунок 56 – Гистограммы, характеризующие влияние гормонов на формирование CD4+CD152+FOXP3+тимоцитов в культуре (процент CD4+ CD152+тимоцитов, CD4+CD152+тимоцитов; экспрессирующих на примере FOXP3+, одного в гейте эксперимента) 200 Установлено, что лептин и грелин не оказывают значимых эффектов на экспрессию CTLA-4 и GITR на Treg в тимусе. Таким образом, хотя исследуемые гормоны угнетают генерацию Treg на тимическом этапе, но не влияют на их супрессорный потенциал. При этом, лептин в концентрации, характерной для II-III триместра беременности, усиливает экспрессию CTLA4 на CD4+тимоцитах, тогда как комбинации гормонов, характерные для беременности, снижают уровень CD4+CTLA-4+тимоцитов (таблица 36). Таблица 36 – Влияние гормонов на экспрессию CTLA-4 и GITR на (n=3) CD4+GITR+FOXP3+, % (n=4) CD4+CTLA-4+FOXP3+, % (n=3) CD4+CTLA-4+, % Гормоны CD4+ тимоцитах Контроль 18,14,92 59,61514,5 32,577,17 Лептин, 10 нг/мл 20,370,37 61,6417,69 30,907,50 Лептин, 35 нг/мл 22,504,99* 73,5610,88 31,006,05 Грелин, 1,2 нг/мл 10,111,52 60,810,69 23,916,71 Грелин, 0,83 нг/мл 13,712,94 51,9813,90 25,784,99 Лептин, 10 нг/мл + 11,423,13* 65,02510,31 28,9511,30 9,732,36* 62,9914,41 20,455,66 Грелин, 1,25 нг/мл Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контролем по парному t-критерия Стьюдента 201 По данным литературы CTLA-4 усиливает активацию дубль- позитивных тимоцитов, способствуя их делеции, но негативно влияет на активацию CD4+CD8-/CD4-CD8+тимоцитов [189]. Можно полагать, что модуляция исследуемыми гормонами экспрессии CTLA-4 на тимоцитах является одним из возможных механизмов участия лептина и грелина в регуляции созревания тимоцитов. Таким образом, исследуемые гормоны играют значимую роль на тимическом этапе дифференцировки Treg/Th17. В исследуемых концентрациях лептин преимущественно угнетает генерацию Treg, тогда как грелин, главным образом, снижает формирование Th17. Совместное действие гормонов снижает формирование Th17 в комбинации первой половины беременности и угнетает образования Treg в комбинации второй половины беременности. При этом в исследуемых концентрациях гормоны не влияют на супрессорный потенциал Treg, формирующихся из тимоцитов. В целом, эффекты лептина и грелина на тимическом этапе сходны по направленности с влиянием этих гормонов на образование Treg из зрелых CD4+Т-клеток периферической крови. Однако в отличие от влияния на зрелые Т-лимфоциты, в тимусе реализуется преимущественно угнетающее действие гормонов на образование Treg, а стимулирующее влияние грелина, выявленное в периферической крови, в тимусе отсутствует. Возможно, это связано с незрелостью самих тимоцитов. Таким образом, можно полагать, что в аспекте беременности эффекты изучаемых гормонов на уровне тимуса обусловлены необходимостью сохранения защитных свойств организма матери, подготавливая иммунную систему матери для выхода из состояния толерантности на системном уровне. 202 5.3. Роль лептина и/или грелина в регуляции формирования инвариантных NKT-клеток в тимусе NKT-клетки (Т-лимфоциты с функциями естественных киллеров) являются эффекторами цитотоксической и врожденного иммунитета, иммунорегуляторной обладающими активностью [67]. Дифференцировка NKT-клеток происходит в тимусе из дубль-позитивных (СD4+СD8+) тимоцитов [67]. У человека популяция NKT-клеток в основном представлена инвариантными (i) NKT-лимфоцитами, экспрессирующими в отличие от неинвариантных (минорная субпопуляция) Т-клеточный рецептор (TCR), имеющий только один вариант V-домена α-цепи (Vα24-JαQ), комплексированный с Vβ11. TCR iNKT-клеток распознает гликолипиды, представленные CD1d, подобной молекулам главного комплекса гистосовместимости [67]. Известно, что во время беременности молекулы CD1d экспрессируются на ворсинчатых и экстраворсинчатых трофобластах [74], которые контактируют с материнскими клетками иммунной системы. Показано, что при нормально протекающей беременности количество iNKTклеток в периферической крови снижается, а повышение их числа ассоциировано со спонтанными абортами и преэклампсией [302, 304]. Несмотря на небольшое количество iNKT-клеток в периферической крови (до 1,2% от общего числа Т-клеток), они способны к быстрой и массивной продукции цитокинов, что определяет их роль в регуляции иммунных реакций [67, 74]. Ранее нами показано, что лептин и грелин регулируют экспрессию поверхностных маркеров NKT-клеток периферической крови, а также обладают собственными дифференцировочными и ростовыми эффектами в отношении интактных тимоцитов. Известно, что лептин предотвращает стероид-индуцироанный апоптоз тимоцитов, усиливая пролиферацию СD4+СD8+тимоцитов [176], а грелин препятствует возрастной инволюции тимуса [111, 112]. У мышей с дефектом выработки лептина (ob/ob) выявлено 203 снижение содержания NKT-клеток в печени [149]. Таким образом, проблема гормональной регуляции тимического этапа дифференцировки iNKT-клеток в контексте фетоматеринских иммунных взаимодействий является важной и актуальной. Количество iNKT-клеток оценивали как процент Vα24Jα18позитивных клеток в гейте CD3+тимоцитов (рисунок 57). Лептин, 35 нг/мл Контроль Vα24Jα18-TCR-PE CD3+Vα24Jα18+0,95% CD3+Vα24Jα18+1,25% Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл Грелин, 1,25 нг/мл CD3+Vα24Jα18+0.64% CD3+Vα24Jα18+0,98% CD3-Per-Cy5 Рисунок 57– Гистограммы, характеризующие модуляцию гормонами количества iNKT-лимфоцитов в культуре тимоцитов (процент количество Vα24Jα18-позитивных клеток в гейте CD3+тимоцитов; на примере одного эксперимента). По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции по каналу FL3 (окрашивание Per-Cy5); по оси ординат – интенсивность флуоресценции по каналу FL2 (окрашивание РЕ) 204 Установлено, что инкубация тимоцитов с грелином в концентрациях, характерных для III триместра беременности, снижает количество iNKTклеток в клеточной культуре (таблица 37). Лептин в концентрации, сопоставимой с уровнем гормона в периферической крови во II-III триместрах беременности, напротив, статистически значимо повышает число iNKT-клеток в 72 ч культуре тимоцитов. При совместном внесении лептин и грелин нивелируют оппозитные эффекты друг друга и не оказывают значимого действия на количество iNKT-клеток в тимусе. Таблица 37 – Модуляция гормонами количества iNKT-клеток в тимусе (n=8) Гормональное воздействие CD3+Vα24+- тимоциты, % Контроль 0,93±0,12 Лептин, 10 нг/мл 0,82±0,15 Лептин, 35 нг/мл 1,31±0,22* Грелин, 1,25 нг/мл 0,65±0,21 Грелин, 0,83 нг/мл 0,65±0,11* Лептин, 10 нг/мл + Грелин, 1,25 нг/мл 0,88±0,11 Лептин, 35 нг/мл + Грелин, 0,83 нг/мл 0,90±0,21 Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контролем по парному t-критерия Стьюдента Учитывая, что для начальных стадий развития и дифференцировки iNKT-клеток важна экспрессия транскрипционного фактора RORt СD4+СD8+тимоцитами [55], можно предположить, что обнаруженные эффекты гормонов репродукции связаны с экспрессией RORt. Так, известно, что взаимодействие лептина со специфическим рецептором, экспрессируемым на тимоцитах, запускает сигнальный путь, аналогичный таковому для IL-6, который является основным индуктором экспрессии 205 RORt [66]. Не исключено, что данный механизм дополняется активирующим действием лептина на пролиферацию СD4+СD8+тимоцитов. В то же время, как грелин усиливает экспрессию транскрипционного фактора FOXP3, являющегося ингибитором экспрессии RORt [166]. Важно отметить, что все исследуемые гормоны реализуют свои эффекты в концентрациях, которые наблюдаются во второй половине беременности. По-видимому, снижение содержания iNKT-клеток в периферической крови при беременности [74] может быть обусловлено влиянием гормонов, как на общий пул NKT-клеток периферической крови, так и на тимический этап формирования iNKT-клеток. Данный механизм можно рассматривать как физиологический и адаптационный, лептин в данном случае, по-видимому, выступает в качестве «негативного» регулятора, замыкающего обратную связь. Доминирование лептина у женщин с избытком веса, может, в определенной мере, быть одной из причин высокой частоты спонтанных абортов у этой категории беременных [176]. РЕЗЮМЕ Показано, что гормоны в исследуемых концентрациях не оказывают значимого влияния на фенотипическое созревание тимоцитов. При изучении модуляции гормонами индукции формирования Th17/Treg в тимусе установлено, что грелин, главным образом, препятствует формированию Th17, лептин преимущественно угнетает генерацию Treg, при этом как лептин, так и грелин не влияют на супрессорный потенциал Treg, генерированных из тимоцитов. При изучении индукции iNKT-клеток в тимусе установлено, что лептин, в исследуемых концентрациях усиливает, а грелин угнетает формирование iNKT-клеток. При этом исследуемые гормоны усиливают выработку IL-4, и не влияют на продукцию IFN-gamma тимоцитами. Исследуемые гормоны оказывают антиапоптотическое действие в модели кортикостероид-индуцированного апоптоза тимоцитов. Лептин увеличивает экспрессию рецептора к IL-7 на CD4+тимоцитах. Таким образом, лептин и грелин являются значимыми регуляторами тимического этапа дифференцировки регуляторных Т-лимфоцитов, и их функциональной активности тимоцитов в целом. 207 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Беременность является одним из ярких феноменов, характеризующих значимость взаимодействия лептина и грелина в регуляции энергетического гомеостаза и функционированием репродуктивной и иммунной систем. Беременность сопровождается глубокими изменениями энергетического обмена, физиологическим накоплением жировой ткани и увеличением потребления питательных веществ. При беременности уровень лептина и грелина в периферической крови значительно нарастает, так как оба гормона активно вырабатываются плацентой, контролируют рост и развития плода [293]. Лептин играет важную роль на всех этапах гестации: инициирует половое созревание, стимулирует выработку ЛГ и ФСГ, необходим для имплантации и развития эмбриона, усиливает основной обмен, стимулирует липолиз. Уровень лептина в периферической крови особенно повышается во II-III триместрах. Однако в период беременности на уровне гипоталамуса «чувствительность» к повышенному уровню лептина снижается, за счет уменьшения экспрессии Ob-R, что объясняет отсутствие эффектов, свойственных для физиологического повышения уровня лептина (угнетение продукции нейропептида Y и активация синтеза МСГ, снижение аппетита, повышению тонуса симпатической нервной системы и, как следствие, усилению основного обмена в периферических органах и тканях). У тучных людей повышенный уровень лептина приводит к преобладанию клеточноопосредованных иммунных реакций, и увеличению частоты развития хронических воспалительных, аутоиммунных и инфекционных заболеваний. Однако беременность, напротив, характеризуется формированием состояния толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду, на фоне сохранения защитных свойств собственного организма. Поэтому изучение взаимодействия лептина и грелина, являющихся реципрокными регуляторами пищевого поведения и энергетического обмена, обладающих разнонаправленной иммуномодулирующей активностью на уровне клеток 208 иммунной системы, является актуальной проблемой иммунологии репродукции. В противоположность лептину, уровень грелина нарастает на ранних этапах беременности (I-II триместр), но снижается в поздние сроки (III триместр). Грелин угнетает секрецию ЛГ и ФСГ, ингибирует половое созревание, стимулирует продукцию СТГ, препятствует развитию бластоцисты и процессу имплантации, стимулирует пролиферацию клеток плаценты, ингибирует сокращение эндометрия [229]. Исследователи отмечают высокую концентрацию грелина в экстраворсинчатом трофобласте, особенно на концах ворсин в I триместре, предполагая, его значимую роль в процессе инвазии трофобласта [229]. Грелин ингибирует сокращение эндометрия [154], возможно, что снижение содержания грелина в III триместре беременности связано с подготовкой к родам [241]. Грелин матери, проникая через фетоплацентарный барьер, регулирует рост и развитие плода [235]. Плод сам также продуцирует фетальный грелин [148, 235]. Грелин проявляет противовоспалительную активность, блокируя лептин- индуцированную выработку провоспалительных цитокинов Т-лимфоцитами. Все вышесказанное позволяет предположить, что взаимодействие лептина и грелина на уровне клеток иммунной системы играет значимую роль в регуляции иммунных реакций при беременности. Экстраполяция полученных данных о влиянии лептина и грелина в концентрациях, соответствующих содержанию гормонов в периферической крови по триместрам беременности, иммуномодулирующую позволяет активность гипотетически лептина и охарактеризовать грелина в аспекте беременности. В работах ряда авторов показано, что лептин, в концентрациях, превышающих физиологические, является провоспалительным гормоном и активирует клеточно-опосредованные иммунные реакции, и теоретически должен способствовать аборту [111, 213]. В проведенных нами исследованиях установлено, что в концентрациях, отражающих уровень 209 гормона в периферической крови при беременности, лептин моделирует функциональную активность моноцитов. Так, ферментативную активность эластазы продукцию моноцитами, что с одной и стороны лептин повышает стимулирует Th1-цитокинов неспецифическую резистентность организма матери при беременности, а с другой облегчает инвазиию синцитиотрофобласта. Гормон угнетает активность катепсина G моноцитов, способного инициировать провоспалительные реакции в фетоплацентарном комплексе. Лептин в исследуемых концентрациях стимулирует ферментативную активность МПО и не влияет на спонтанную ЛЗХЛ и продукцию NO моноцитами, тогда как на индуцированную разными объектами продукцию АФК и фагоцитоз этих объектов гормон оказывает разнонаправленное действие. Лептин усиливает индуцированную активность IDO моноцитов, что определяет роль лептина в формировании периферической толерантности. Таким образом, лептин сохраняет общую провоспалительную направленность действия на моноциты, однако при физиологически протекающей беременности эти эффекты могут способствовать развитию плода. Гормон стимулирует окислительный потенциал моноцитов, усиливая неспецифическую резистентность организма матери в ответ на антигенную стимуляцию, не инициируя при этом процессы спонтанного образования свободных радикалов, избыток которых может приводить к повреждению собственных тканей и запуску провоспалительных иммунных реакций, имеющих фатальные последствия для развития беременности. Определены потенциальные механизмы участия лептина на уровне моноцитов в процессе имплантации и формировании иммунной толерантности. Грелин, действуя самостоятельно в концентрациях, характерных для беременности, не влияет на продукцию АФК, но угнетает поглотительную активность моноцитов в отношении бактериальных объектов фагоцитоза, а также продукцию NO. Причем специфичный ингибирующий эффект грелина на фагоцитарную активность моноцитов реализуется через GHS-R, однако не 210 связан с работой мембранных потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа. В то время как, регуляция грелином продукции NO происходит при участии Са2+-каналов потенциалзависимых L-типа. Грелин не влияет на индуцированную активность IDO моноцитов. Снижение фагоцитарной активности и продукции NO моноцитами под влиянием грелина, можно рассматривать как фетопротективный эффект, направленный на защиту собственных тканей от повреждения. При этом действие грелина не затрагивает процессы генерации АФК, необходимые для киллинга фагоцитированных микроорганизмов, что важно для поддержания защитных свойств организма матери. Таким образом, грелин при беременности оказывает преимущественно противовоспалительные эффекты на моноциты. Тогда как при совместном влиянии гормонов на моноциты, что ближе соответствует физиологическим условиям беременности, комбинация лептина и грелина нивелирует самостоятельное действие каждого гормона на фагоцитарную активность, продукцию АФК, но угнетает синтез NO в первой половине беременности, а во второй - усиливает индуцированную активность IDO моноцитов. Снижение выработки NO моноцитами в первой половине беременности можно рассматривать как протективный фактор, поскольку усиление продукции NO• стимулирует синтез провоспалительных цитокинов и Th1-иммунный ответ. Во второй половине беременности активация IDO индуцирует анергию эффекторных Т-клеток, что определяет роль лептина в формировании периферической толерантности при беременности с участием моноцитов. На уровне NK-клеток в первой половине беременности лептин проявляет провоспалительное действие, повышая в периферической крови количество цитотоксических CD56+NK-клеток, экспрессирующих CD16+. Этот эффект гормона связан не только с непосредственным влиянием на NKклетки, но и с лептин-индуцированным синтезом IFN- мононуклерами именно в первой половине беременности. Тогда как в концентрации, характерной для II-III триместра беременности, лептин, действуя 211 самостоятельно, снижает уровень цитотоксических CD16+56+NK-клеток, но повышает процент CD16+56+NKT-клеток. Есть данные, что NKT-клетки периферической крови в период имплантации индуцируют цитокиновое окружение Th2-типа, содержащее высокие концентрации IL-4 [74]. Таким образом, выявленные эффекты лептина в отношении CD16 +CD56+NKTклеток являются одним из возможных механизмов участия гормона в поддержании баланса цитокинов и иммунной толерантности при беременности. Остальные эффекты лептина во второй половине беременности синергичны с действием грелина и однонаправлены c их совместным влиянием. Лептин и грелин, действуя как самостоятельно, так и совместно повышают количество NK-клеток с регуляторным фенотипом CD56brightNKклеток, экспрессирующих L-селектин и способных к миграции в эндометрий, но снижают количество CD56dimNK-клеток и экспрессию низкоаффинного ингибиторного рецептора LILRB, определяющего взаимодействие со всеми белками MHC I класса, экспрессию активационной молекулы NKG2D, хемокинового рецептора CCR7, ответственного за миграцию клеток в лимфоузлы. Таким образом, взаимодействие лептина и грелина на уровне эффекторов врожденного иммунитета в первой половине беременности формирует условия резистентности для организма успешной матери, при имплантации этом и лептин поддержания демонстрирует присущую ему провоспалительную активность, а во второй половине беременности взаимодействие гормонов индуцирует условия для развития иммунной толерантности. При исследовании основных аспектов действия гормонов на эффекторы адаптивного иммунитета, установлено, что лептин и грелин реципрокно регулируют экспрессию активационных молекул (CD25, CD95) на CD4+Т-клетках и апоптоз Т-лимфоцитов. Лептин снижает количество активированных Тh-клеток и апоптоз лимфоцитов. Грелин, напротив, 212 стимулирует экспрессию CD25 и апоптоз зрелых Т-лимфоцитов. Комбинация гормонов нивелирует их индивидуальные эффекты каждого гормона на апоптоз. Грелин и комбинация лептина с грелином стимулируют синтез IL-4 как CD4+-, так и CD8+Т-клетками, способствуя Th2-девиации на периферии. Лептин и грелин проявляют реципрокные модулирующие эффекты на формирование адаптивных регуляторных субпопуляций Th17 и Treg. Лептин в концентрации, характерной для II-III триместров беременности усиливает дифференцировку в аTh17 при участии PI3K, повышая также экспрессию CCR6 на Th17 и продукцию IL-17A, одновременно лептин препятствует образованию aTreg и угнетает экспрессию CTLA-4 на aTreg. Лептин оказывает антиапоптотическое предшественников адаптивных действие в регуляторных отношении nTreg и Т-клеток. Гормон в концентрации, характерной для II-III триместра беременности, усиливает экспрессию GITR на nTreg. Грелин в концентрации, характерной для I-II триместров беременности, усиливает формирование аTreg, экспрессию на них CTLA-4, но угнетает поляризацию в Th17 и экспрессию CCR6 на них, а также продукцию IL-17А. Реализация регуляторных эффектов грелина на формирование аTh17/аTreg задействует PI3K и PKA. Гормон не влияет на апоптоз nTreg и предшественников адаптивных регуляторных Т-клеток. Гормон в концентрации, характерной для I-II триместра беременности, усиливает экспрессию GARP на nTreg. Совместное действие лептина и грелина приводит к РКА-зависимому усилению образования аTreg, а также оказывает антиапоптотическое действие в отношении nTreg и предшественников адаптивных регуляторных Т-клеток, а также нивелирует самостоятельное влияние каждого из гормонов на присутствие GITR и GARP на мембране nTreg. В целом, лептин и грелин, в исследуемых комбинациях, действуя совместно на уровне Т-лимфоцитов, стимулируют синтез IL-4 как CD4+, так и CD8+Т-клетками, способствуя преобладанию Тh2-ответа; усиливают 213 формирование аTreg, опосредуя модулирующее действие через РКА; не влияют на апоптоз зрелых Т-лимфоцитов, но оказывают антиапоптотическое действие в отношении nTreg периферической крови и предшественников адаптивных регуляторных Т-клеток периферической крови. Таким образом, раскрыты новые механизмы гормональной регуляции Т-клеточного звена иммунитета. Лептин и грелин, смещая направленность иммунных реакций по Тh2-типу путем усиления выработки IL-4, а также регулируя количество адаптивных и естественных Treg, как посредством апоптоза, так и индукции образования из наивных CD4+Т-клеток периферической крови, и дополняют механизмы, защищающие плод от цитолитической атаки материнских клеток. Лептин и грелин, оказывающие разнонаправленные эффекты на клетки иммунной системы, при совместном действии индуцируют условия для развития иммунной толерантности. При анализе действия гормонов на тимический этап формирования Тлимфоцитов показано, что лептин и грелин не оказывают значимого влияния на фенотипическое созревание тимоцитов. При изучении модуляции гормонами индукции формирования Th17/Treg/iNKT-клеток в тимусе установлено, что грелин снижает формирование Th17 и iNKT-клеток, лептин угнетает генерацию Treg, но усиливает iNKT-клеток, при этом как лептин, так и грелин не влияют на супрессорный потенциал образующихся Treg. Сочетанное действие гормонов снижает формирование Th17 в первой половине беременности и угнетает образования nTreg во второй половине беременности. Важно отметить, что исследуемые гормоны реализуют свои эффекты в концентрациях, которые наблюдаются во второй половине беременности. По-видимому, снижение содержания iNKT-клеток в периферической крови при беременности [74] может быть обусловлено влиянием гормонов, как на общий пул NKT-клеток периферической крови, так и на тимический этап формирования iNKT-клеток. При этом исследуемые гормоны усиливают выработку IL-4, и не влияют на продукцию IFN- тимоцитами, оказывают антиапоптотическое 214 действие в модели кортикостероид-индуцированного апоптоза тимоцитов. Лептин увеличивает экспрессию рецептора к IL-7 на CD4+тимоцитах. Возможным механизмом тимопоэтического действия лептина является усиление выработки IL-7 эпителиальными клетками тимуса и повышение экспрессии IL-7R на CD4+тимоцитах. Таким образом, лептин и грелин являются значимыми регуляторами тимического этапа дифференцировки регуляторных Т-лимфоцитов, и их функциональной активности. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, лептин и грелин модулирует реакций врожденного и адаптивного иммунитета, что в аспекте беременности важно не только для сохранения защитных свойств организма матери, но и для фетопротекции и формирования иммунной толерантности. Гипотетические схемы, суммирующие роль лептина и грелина в регуляции иммунных реакций и формировании иммунной толерантности при физиологически протекающей беременности представлены на рисунке 58 60. Полученные данные открывает новые перспективы в исследовании гормональной феноменом регуляции иммунной иммунных толерантности процессов, ассоциированных (беременность, с онкологические процессы). Полученные результаты необходимо учитывать при клиническом использовании гормонов. 215 Leptin апоптоз Ob-R Тимоциты IL-7R I-II iNK IFN- IL-4 nTreg II-III nTh17 Leptin NK-клетки Leptin Leptin Ob-R II-III II-III CD16dim Катепсин G CCR7 LILRB t -Формирование регуляторного фенотипа NK-клеток - Снижение числа цитотоксичных NK-клеток во II-III триместре IDO -Усиление активности IDO моноцитов nTreg NK/NKTклетки эластаза MPO - Усиление продукции провоспапалительных цитокинов, -увеличение числа цитотоксических - Увеличение активности МРО, NK/NKT-клеток эластазы РЕЗИСТЕНТНОСТЬ МАТЕРИ -Повышение формирования эффекторов воспалительных реакций aTh17 - Препятствует апоптозу nTreg - Повышает супрессорный потенциал nTreg CCR6 Ob-R IL-17A Leptin Ob-R GITR II-III CD56/16 ИНВАЗИВНЫЙ РОСТ СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТА НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ ИММУННАЯ ТОЛЕРАНТНОСТЬ апоптоз CD56/16 IFN- Моноцит CD56brigh L-селектин Leptin Ob-R I-II Ob-R RORt aTh17 CD25 апоптоз CD4+25-Тклетки CTLA-4 aTreg FOXP3 Рисунок - 58 Основные аспекты иммуномодулирующей активности лептина в аспекте беременности Примечание: здесь и на рисунке 58 - 60 - сплошная линия – стимулирующий эффект, пунктирная линия – угнетающий эффект 216 217 Leptin Ob-R Ghrelin GHS-R IL-7R ТИМОЦИТЫ апоптоз nTreg IL-4 ТОЛЕРАНТНОСТЬ IDO Leptin Ob-R Ghrelin GHS-R Leptin Ob-R IL-4 aTreg NO Ghrelin GHS-R CD56bright FOXP3 L-селектин МОНОЦИТ ы Ghrelin GHS-R Leptin Ob-R апоптоз NK-КЛЕТКИ CD4+ Т -КЛЕТКИ Рисунок 60 - Гипотетическая схема, отражающая участие лептина и грелина в формировании иммунной толерантности в аспекте беременности на уровне клеток врожденного и адаптивного иммунитета . 218 ВЫВОДЫ 1. Лептин в концентрациях, характерных для беременности, угнетает фагоцитарную активность и стимулированную люминолзависимую хемилюминесценцию моноцитов в отношении бактериальных объектов, но не влияет на продукцию окиси азота. Лептин в концентрации II-III триместра беременности снижает спонтанную люминолзависимую хемилюминесценцию моноцитов, но повышает активность индоламин-2,3диоксигеназы. Грелин в исследуемых концентрациях угнетает фагоцитарную активность моноцитов в отношении бактериальных объектов и продукцию окиси азота, но не влияет на стимулированную и спонтанную люминолзависимую хемилюминесценцию и активность индоламин-2,3диоксигеназы. Физиологические комбинации лептина и грелина не влияют на фагоцитарную активность, спонтанную и стимулированную люминолзависимую хемилюминесценцию моноцитов, но в комбинации первой половины беременности (I-II триместр) угнетают продукцию окиси азота моноцитами, тогда как во второй половине (II-III триместр) усиливают активность индоламин-2,3-диоксигеназы. 2. Лептин в концентрации I триместра беременности повышает, а во II-III триместре снижает количество CD56+NK-клеток, экспрессирующих CD16. Грелин не влияет на экспрессию CD16 на CD56+NK-клетках. Комбинация гормонов, характерной для второй половины беременности (II-III триместр) увеличивает количество CD56+NK-клеток, экспрессирующих CD16. Одновременно исследуемые гормоны, а также их комбинация второй половины беременности (II-III триместр) повышают число CD56brightNKклеток и экспрессию L-селектина на них, но снижают экспрессию рецептора -хемокинов 7 типа на NK-клетках. 3. Лептин в концентрации II-III триместра беременности повышает уровень CD16+CD56+NKT-клеток периферической крови. Грелин, а также сочетания лептина с грелином в исследуемых концентрациях не влияют на количество CD16+CD56+NKT-клеток периферической крови. 219 4. Грелин в концентрации I-II триместра беременности повышает количество активированных Тh-клеток и апоптоз лимфоцитов, а в концентрации III триместра не влияет на эти показатели. Лептин снижает уровень активированных Тh-клеток и апоптоз лимфоцитов. Комбинации лептина и грелина не влияют на апоптоз лимфоцитов, но усиливают экспрессию маркера активации/готовности к вступлению в апоптоз (CD95) CD4+Т-лимфоцитами. Грелин и комбинации лептина с грелином не влияют на внутриклеточный синтез интерферона-, но стимулируют синтез интерлейкина-4 Тh-клетками и цитотоксическими лимфоцитами. В комбинации I-II триместров беременности гормоны не влияют, а в сочетании II-III триместра увеличивают количество активированных Тh-клеток. 5. Лептин в концентрации II-III триместров беременности усиливает дифференцировку CD4+Т-лимфоцитов периферической крови в адаптивные при Th17 участии интерлейкина-17A. фосфатидилинозитол-3-киназы Одновременно лептин и препятствует продукцию образованию адаптивных Treg. Грелин в концентрации I-II триместров беременности, напротив, усиливает поляризацию в формирование адаптивные Th17 адаптивных и Treg, продукцию но угнетает интерлейкина-17А. Реализация регуляторных эффектов грелина на формирование адаптивных Th17/Treg задействует фосфатидилинозитол-3-киназу и протеинкиназу A. Совместное действие лептина и грелина приводит к протеинкиназа Aзависимому усилению образования адаптивных Treg. Лептин и комбинации лептина с грелином препятствуют апоптозу CD4+Т-лимфоцитов периферической крови. Грелин и лептин в концентрациях, характерных для беременности, разнонаправлено регулируют экспрессию иммуносупресорных молекул на Treg периферической крови. 6. Лептин и грелин не влияют на экспрессию корецепторных молекул CD4/CD8 тимоцитами и продукцию интерферона-, но усиливают выработку интерлейкина-4 тимоцитами. Исследуемые гормоны угнетают кортикостероид-индуцированный апоптоз тимоцитов. Лептин в комбинации 220 с грелином в I-II триместрах беременности и сам лептин в концентрации IIIII триместра беременности усиливают экспрессию рецептора к интерлейкину-7 на CD4+тимоцитах. 7. Лептин угнетает формирование натуральных Treg в тимусе, а в концентрации II-III триместра беременности усиливает генерацию натуральных Th17 и инвариантных NKT-клеток в тимусе. Грелин не влияет на формирование натуральных Treg в тимусе, а в концентрации I-II триместра снижает уровень натуральных Th17, а в III триместре - угнетает генерацию инвариантных NKT-клеток в тимусе. Совместное действие гормонов не оказывает эффектов на уровень натуральных Th17 и инвариантных NKT-клеток в тимусе, но препятствует натуральных Treg во второй половине беременности. образованию 221 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АЗКЦ – антителозависимая клеточная цитотоксичность АФК – активные формы кислорода ГнРГ – гонадотропин-рилизинг гормон ИФА – индекс фагоцитарной активности ЛГ – лютеонизирующий гормон ЛЗХЛ – люминол-зависимая хемилюминесценция ЛПС – липополисахарид МАРК – митоген-активируемая протеинкиназа МНЛ – мононуклеары периферической крови МПО – миелопероксидаза ППС – полная питательная среда СТГ – соматотропный гормон ТТГ – тиреотропный гормон ФИ – фагоцитарный индекс ФСГ – фолликулостимулирующий гормон ФЧ – фагоцитарное число ФЭБ – формалинизированные эритроциты барана опФЭБ – опсонизированные формалинизированные эритроциты барана ЦТЛ – цитотоксические лимфоциты ЭПР – эндоплазматический ретикулум ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка АМРК - АМP-активируемая протеинкиназа АР-1 – активирующий протеин-1 aSMase – активированная кислая сфингомиелиназа Bax – проапоптотический фактор Breg – В-регуляторные лимфоциты BSA – бычий сывороточный альбумин CaMKK2 – кальмодулин-зависимая протеинкиназа 222 cAMP – циклический аденозинмонофосфат Ca2+ – ионы кальция CaN – кальцинейрин CCR6 – хемокиновый рецептор CD (cluster of differentiation) – мембранные маркеры клеток CFSE – карбоксифлуоресцеинсукцимидиловый эфир CR – рецепторы к компонентам комплемента СREB –(cAMP response element binding protein) cAMP-отвечающий элемент CTLA-4 – (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) маркер Treg DAG – диацилглицерол D-Lys3-GHRP-6 – блокатор рецепторов грелина ERK1/2 - экстраклеточно-регулируемая протеинкиназа Fas-L – Fas-лиганд FcR – Fc-рецепторы FITC – Флуоресцеин изотиоцианат FOXP3 – (forkhead box P3) транскрипционный фактор Treg GARP – (Glycoprotein A repetitions predominant) рецептор для низкоаффинного (latent) TGF-β1 G-CSF – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор GM-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор GITR – индуцируемый глюкокортикоидами рецептор фактора некроза опухоли GHS-R – рецептор грелина Н89 – ингибитор РКА IgG – иммуноглобулин G IDO – индоламин-2,3-диоксигеназа IFN- – интерферон - гамма IL – интерлейкин iNOS – индуцибельная NO-синтетаза IP3 – инозитол-1,4,5-трифосфат 223 Jak2 – янус-киназа JNK – c-Jun-NH2-терминальная протеинкиназа MAPK – митоген-активированные киназы MARCKS – (myristoylated alanine-rich C kinase substrate) актиногелин MLCK (myosin light-chain kinase) – ERKII-индуцированная MLC-киназа МR – рецептор маннозы MSK1 –митоген-и-стресс-активированная протеинкиназа 1 mTOR – (Mammalian Target of Rapamycin) NADF-oxidase – НАДФ-оксидаза NADP – никотинамидадениндинуклеотидфосфат NF-AT – ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов NF-kB – ядерный фактор kB NK (Natural killer) – клетки естественные киллеры NKT – Т-клетки с функциями натуральных киллеров Ob-R – рецептор лептина PE – фикоэритрин PD1,2 – поверхностные рецепторы лимфоцитов «белок программируемой смерти» PDE – фосфодиэстераза PI3K – фосфотидилинозитол- 3-киназа PIP2 – фосфатидилинозитол 4,5-бифосфат PKA – протеинкиназа А PKC – протеинкиназа А PLA2 – фосфолипаза A2 PLC – фосфолипаза С PtdIns(3,4,5)P3 – фосфатидилинозитид-3,4,5-трифосфат RORt – (RAR-related orphan receptor gamma), транскрипционный фактор Sam68 – белок, связывающий РНК Smad2/3 – фактор транскрипции TGF- 224 STAT – (signal transducers and activators of transcription) белки сигнальной трансдукции и активаторы транскрипции SOCS-3 – (suppressor of cytokine signaling) супрессор трансдукции сигнала цитокинов TCR – Т-клеточный рецептор TGF- – трансформирующий фактор роста Тh1, Th2 – Т-хелперы 1 и 2 типов Th17 – интерлейкин-17-продуцирующие хелперы TNF- – фактор некроза опухоли TRAIL – (TNF-related apoptosis-inducing ligand) — цитокин семейства факторов некроза опухоли, лиганд, вызывающий апоптоз Treg – Т-регуляторные лимфоциты nTreg – натуральные Т-регуляторные лимфоциты aTreg – адаптивные Т-регуляторные лимфоциты W – вортманнин 225 ЛИТЕРАТУРА 1. Бакуев, М.М. Особенности секреции миелопероксидазы в хемилюминесцентном ответе нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы / М.М. Бакуев, М.З. Саидов, А.А. Бутаков // Иммунология. - 1991. - Т. 1. - С. 15-18. 2. Боровиков, В. Statistica. Искусство анализа данных на компьютере; для профессионалов, 2-е издание / В. Боровиков // Питер. - СПб. - 2003. - С. 688. 3. Глянц, С. Медико-биологическая статистика, Пер. с англ. / С. Глянц // Практика. - М. - 1999. - С. 459. 4. Дёрфлинг, П. Выделение макрофагов из суспензии спленоцитов // Иммунологические методы / П. Дёрфлинг Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова // Медицина. - М. - 1987. - С. 373-378. 5. Долгушин, И.И. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина // РАМН. - М. - 2009. – 208 с. 6. Каплин, В.Н. Методические аспекты изучения фагоцитоза / В.Н. Каплин, В.Ф. Кузнецов, Т.П. Обернебесова // I съезд иммунологов России: Тез. Докл. (23-25 июня 1992 г.). - Новосибирск. - 1992. - С. 200-201. 7. Каплин, В.Н. Нетрадиционная иммунология инфекции / В.Н. Каплин // Изд.-во Пермской государственной медицинской академии. - Пермь. 1996. - С. 163. 8. Кеворков, Н.Н. Гормоны репродукции в регуляции процессов иммунитета / Н.Н. Кеворков, Ю.И. Шилов, С.В. Ширшев, В.А. Черешнев // УИФ Наука. - Екатеринбург. - 1993. - С. 169. 9. Кетлинский, С.А. Тh17 - новая линия дифференцировки Т хелперов: обзор данных / С.А. Кетлинский // Цитокины и воспаление. - 2009. - Т.8, №2. - С. 3-15. 226 10.Кетлинский, С.А. Цитокины / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев // изд-во Фолиант. - Екатеринбург. - 2008. - С. 552. 11.Кириенкова, Е.В. Метаболические и сердечно-сосудистые эффекты грелина / Е.В. Кириенкова, Л.С. Литвинова, В.И. Селедцов и др. // Ожирение и метаболизм. - 2012. - №1. - С.3-8. 12.Кондратьева, И.А. Практикум по иммунологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / И.А. Кондратьева, А.А. Ярилин, С.Г. Егорова и др. // Издательский центр «Академия». - М. - 2004. - 272 с. 13.Куклина, Е.М. Влияние хорионического гонадотропина на дифференцировку тимоцитов в присутствии эпителиальных клеток тимуса / Е.М. Куклина, С.В. Ширшев, Н.И. Шарова, А.А. Ярилин // Онтогенез. 2003. - Т.34. - №1. - С. 48-54. 14.Куклина, Е.М. Роль фактора транскрипции NFAT в иммунном ответе / Е.М. Куклина, С.В. Ширшев // Биохимия. - 2001. - т. 66. - вып. 5. - С. 581591. 15.Куклина, Е.М. Репродуктивные гормоны в контроле баланса Th1/Th2 – цитокинов / Е.М. Куклина, С.В. Ширшев // Известия АН. Серия биологическая. - 2005.- №3. - С. 1-8. 16.Левкович, М.А. Иммунопатогенетические механизмы угрозы прерывания беременности: автореф. дис. … доктора мед. наук: 14.00.36 / М.А. Левкович; ФГБУ Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи.- Ростов-на-Дону. - 2009. 17.Митенькина, Е.В. Сериновые протеиназы в комплексной оценке тяжести преэклампсии: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.01 / Е.В. Митенькина, Пермская государственная медицинская академия. - Пермь. 2003. 18.Михнина, Е. А. Морфофункциональное состояние эндометрия у женщин с бесплодием и невынашиванием беременности: автореф. дис. … доктора мед. наук / Е. А. Михнина; Научно-исследовательский институт 227 акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Северо-Западного отделения РАМН. - Санкт-Петербург. - 2009. 19.Мицич, Д. Роль лептина в нарушении репродуктивной функции при ожирении / Д. Мицич, Г. Цвийович, А. Кендерешки и др. // Ожирение и метаболизм. - 2006. - №3. - С.2-8. 20.Панков, Ю.А. Лептин и его медиаторы в регуляции жирового обмена / Ю.А. Панков // Ожирение и метаболизм . -2010. - №2. - С.3-9. 21.Романцова, Т.И. Лептин и грелин: антагонизм и взаимодействие в регуляции энергетического обмена / Т.И. Романцова, Г.Е. Волкова // Ожирение и метаболизм. - 2005. - №2. - С.2-9. 22.Сибиряк, С.В. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях: Краткое методическое руководство / С.В. Сибиряк, С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка, В.А. Черешнев // Екатеринбург. - 2008. – 60 с. 23.Сотникова, Н.Ю. Регуляция fas-индуцированного апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови и плаценте при задержке развития плода / Н.Ю. Сотникова, А.В. Кудряшова, Л.В. Посисеева, М.В. Веденеева // Цитокины и воспаление. - 2006. -Т.5. - №3. - С. 10-15. 24.Талаев, В.Ю. Действие клеток плацентарного барьера на созревание дендритных клеток in vitro / В.Ю. Талаев, А.В. Матвеичев, М.А. Ломунова и др. // Иммунология. - 2010. - №3. - С.125-131. 25.Трунова, Л.А. Иммунология репродукции / Л.А. Трунова // Наука. Новосибирск. - 1984. - 157 с. 26.Хайдуков, С.В. Цитометрический анализ в клинической иммунологии / С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка, В.А. Черешнев // Российская акад. наук, Уральское отд-ние, Ин-т иммунологии и физиологии [и др.]. Екатеринбург. - 2011. – 220 с. 27.Хонина, Н.А. Иммунная дисфункция при бесплодии неясного генеза (обзор литературы) / Н.А. Хонина, Н.М. Пасман, Е.Р. Черных // Проблемы репродукции. – 2010. - №1. – С.57 – 62. 228 28.Черешнев, В.А. Экспериментаьные модели в патологии: учебник / В.А. Черешнев, Ю.И. Шилов, М.В. Черешнева и др. // Перм. гос. нац. исслед. ун-т.- П. - 2014. - 324 с. 29.Шарова, Н.И. Экспрессия цитокиновых генов и секреция цитокинов эпителиальными и лимфоидными клетками тимуса человека / Н.И. Шарова, А.Д. Донецкова, А.П. Топтыгина и др. // Иммунология. - 2008. - Т. 29, - №6. - С. 329-334. 30.Ширшев, С.В. Вторичные мессенджеры в реализации иммуномодулирующих эффектов хорионического гонадотропина / С.В. Ширшев, Н.Н. Кеворков // Мол. биология. - 1993. - Т. 27, - №3. - С. 500506. 31.Ширшев, С.В. Механизмы иммунного контроля процессов репродукции / С.В. Ширшев // УрО РАН. - Екатеринбург. - 1999. - 381 с. 32.Ширшев, С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля процессов репродукции / С.В. Ширшев // УрО РАН. - Екатеринбург. - 2002. - Т. 2. 557 с. 33.Ширшев, С.В. Цитокиновая сеть плаценты / С.В. Ширшев // Успехи современной биологии. - 2003. - Т. 123, №4. - C. 350-364. 34.Ширшев, С.В. Гормоны репродукции в регуляции апоптоза нейтрофилов / С.В. Ширшев, Е.М. Куклина, А.А. Ярилин // Биохимия. - 2003. - Т. 68, №6. - С. 840-848. 35.Ширшев, С.В. Роль репродуктивных гормонов в контроле апоптоза Тлимфоцитов / С.В. Ширшев, Е.М. Куклина, А.А. Ярилин // Биохимия. 2003. - Т. 68, №4. - С. 577-583. 36. Ширшев, С.В. Регуляция окислительного потенциала нейтрофилов репродуктивными гормонами в зависимости от уровня активации клеток / С.В. Ширшев, Е.М. Куклина // Докл. Академии Наук. - 2005. - Т. 401, №6. - С. 825-828. 37.Ширшев, С.В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий / С.В. Ширшев // УрО РАН. - Екатеринбург. - 2009. – 582 с. 229 38.Ширшев, С.В. цАМФ-зависимые механизмы эндокринного контроля иммунной системы при беременности / С.В. Ширшев // Успехи соврем. биологии. - 2010. - Т. 130, - №2. - С. 26-30. 39.Ширшев, С.В. Роль Epac-белков в механизмах цАМФ-зависимой иммунорегуляции / С.В. Ширшев // Биохимия. - 2011. - Т. 76, - №9. - С. 981-998. 40.Ширшев, С.В. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции / С.В. Ширшев, Е.М. Куклина, С.А. Заморина и др. // Патент РФ № 2292553. - 2007. 41.Шмагель, К.В. Иммунитет беременной женщины / К.В. Шмагель, В.А. Черешнев // Медицинская книга. - М. - Изд-во НГМА. - Н.Новгород. 2003. - 226 с. 42.Эккерт, Р. Иммунологические методы / Р. Эккерт под ред. Г. Фримеля // Медицина. - М. - 1987. - С. 226-254. 43.Ярилин, A.A. Цитокины в тимусе. Биологическая активность и функции цитокинов в тимусе / А.А. Ярилин // Цитокины и воспаление. - 2003. - №2. - С. 12-18. 44.Ярилин, А.А. Иммунология / А.А. Ярилин // ГОЭТАР-Медиа. - М. - 2013. 752 с. 45.Amal, E. Modulation of Treg cells/T effector function by GITR signaling is context–dependent / E. Amal, A.L. Epstein, G.L. Stephens et al // Eur. J. Immunol. - 2013. Vol. 43. - Р. 2421–2429. 46.Abrahams, V.M. Macrophages and apoptotic cell clearance during pregnancy / V.M. Abrahams et al. // Am. J. Reprod. Immunol. - 2004. - Vol. 51, №4. - Р. 275-282. 47.Acosta-Rodriguez, E.V. Interleukins 1beta and 6 but not transforming growth factor-beta are essential for the differentiation of interleukin 17-producing human T helper cells / E.V. Acosta-Rodriguez, G. Napolitani, A. Lanzavecchia, F. Sallusto // Nat Immunol. - 2007. - Vol. 8, №9. - P. 942-949. 230 48.Aderem, A.А. Mechanisms of phagocytosis in macrophages / A.А. Aderem, D.M. Underhill //Ann. Reviews. - 1999. - Vol.17. - P. 593-623. 49.Agrawal, S. Leptin activates human B cells to secrete TNF-α, IL-6, and IL10 via JAK2/STAT3 and p38MAPK/ERK1/2 signaling pathway /S. Agrawal, S. Gollapudi, H. Su, S. Gupta // J. Clin. Immunol. - 2011. - Vol. 31, № 3. - P. 472478. 50.Ahima, R.S. Leptin / R.S. Ahima , J.S. Flier //Ann. Rev. Physiol. - 2000. - Vol. 62. - P. 413-437. 51.Alonzi, T. Essential role of STAT3 in the control of the acute-phase response as revealed by inducible gene inactivation [correction of activation] in the liver / T. Alonzi et al. // Mol. Cell Biol. - 2001. - Vol. 21, № 5. - P. 1621-1632. 52.Amu, S. Regulatory B cells prevent and reverse allergic airway inflammation via FoxP3-positive T-regulatory cells in a murine model / S. Amu, S. P. Saunders, M. Kronenberg et al. // J. Allergy and Clin. Immunol. - 2010. - Vol. 125, №. 5. - P. 1114.e8–1124.e8. 53.Anderson, L.L. Physiology of ghrelin and related peptides / L.L. Anderson, S. Jeftinija, C.G. Scanes et al. // Domest. Anim. Endocrinol. - 2005. - Vol. 29. - P. 111-144. 54.Aniansson, H. Comparison between luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes / H. Aniansson, O. Stendahl, C. Dahlgren // Acta pat. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C. Immunol.-1984.-V.92.-P.357-365. 55.Annunziato, F. The phenotype of human Th17 cells and their precursors, the cytokines that mediate their differentiation and the role of Th17 cells in inflammation / F. Annunziato, L. Cosmi, F. Liotta et al.// Int Immunol. - 2008. Vol. 20, №11. - P. 1361-1368. 56.Ariyasu, H. Stomach is a major source of circulating ghrelin, and feeding state determines plasma ghrelin-like immunoreactivity levels in humans / H. Ariyasu, K. Takaya, T. Tagami et al. // J.Clinical Endocrinol & Metab. - 2001. - Vol.86. - Is.10. - P.4753–4758. 231 57.Arthur, J.S. MSK activation and physiological roles / J.S. Arthur // Front Biosci. – 2008. - Vol.13. - P. 5866-5879. 58.Ashkenasi, A. Death receptors: signaling and modulation / A. Ashkenasi, V.M. Dixit // Science. - 1998. - Vol. 281, № 5381. - P. 1305-1308. 59.Attoub, S. Leptin promotes invasiveness of kidney and colonic epithelial cells via phosphoinositide 3-kinase-, rho-, and rac-dependent signaling pathways / S. Attoub, V.Noe, L.Pirola et al. // FASEB J. - 2000. - Vol. 14. - P. 2329-2338. 60.Baatar, D. The effects of ghrelin on inflammation and the immune system / D. Baatar, K. Patel, D.D. Taub // Mol Cell Endocrinol. - 2011. - Vol. 340. - P. 44-58. 61.Baecher-Allan, C. CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood / C. Baecher-Allan, J.A.Brown, G.J.Freeman, D.A. Hafler // J. Immunol. - 2001. - Vol.167. - P. 1245- 1253. 62.Ballou, L.M. Galphaq binds to p110alpha/p85alpha phosphoinositide 3-kinase and displaces Ras / L.M. Ballou, M. Chattopadhyay , Y Li , S. Scarlata , R.Z. Lin // J. Biochem. - 2006. - Vol.394. - P. 557-562. 63.Banchereau, J. Dendritic cells and the control of immunity / J. Banchereau, R.M. Steinman // Nature. - 1998. - Vol. 392. - P. 245-252. 64.Barreiro, M.L. Cellular location and hormonal regulation of ghrelin expression in rat testis / M.L. Barreiro, F. Gaytán, J.E. Caminos, L. et al. // Biol. Reprod. 2002. - Vol..67, №6. - P.1768-1776. 65.Bates, S.H. The role of leptin-->STAT3 signaling in neuroendocrine function: an integrative perspective / S.H. Bates, M.G. Myers // J. Mol. Med. - 2004. Vol. 82. - P.12-20. 66.Baumann, H. The full-length leptin receptor has signaling capabilities of interleukin 6-type cytokine receptors / H. Baumann, K.K. Morella, D.W. White et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 1996. - Vol. 93. - P. 8374-8378. 67.Bendelac, A. The biology of NKT cells / A. Bendelac, P.B. Savage, L. Teyton // Annu. Rev. Immunol. - 2007. - Vol.25. - P. 297-336. 232 68.Bennett, B.D. A role for leptin and its cognate receptor in hematopoiesis / B.D. Bennett, G.P. Solar, J.Q. Yuan et al. // Current Biol. - 1996. - Vol. 6. - P. 11701180. 69.Berthelot, J. Regulatory B cells play a key role in immune system balance / J. Berthelot, C. Jamin, K. Amrouche, B. Goff, Y. Maugars, P. Youinou // Joint Bone Spine - 2013. - Vol. 80, №9. - P. 18–22. 70.Bijl, M. Anti-CD3-induced and anti-Fas-induced apoptosis in systemic lupus erythematosus (SLE) / M. Bijl, G. Horst, P.C. Limburg, C.G. Kallenberg // Clin. Exp. Immunol. - 2001. - Vol. 123. - P. 127-132. 71.Bjorbaek, C. Divergent signaling capacities of the long and short isoforms of the leptin receptor / C. Bjorbaek, S. Uotani, B. Silva, J. Flier // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 32686-32695. 72.Bodor, J. Cyclic AMP underpins suppression by regulatory T cells / J. Bodor, T. Bopp, M. Vaeth, M. Klein et al. // Eur J Immunol. - 2012. - Vol. 42, № 6. - P. 1375-1384. 73.Bouloumie, A. Leptin induces oxidative stress in human endothelial cells / A.Bouloumie, T.Marumo, M.Lafontan, R.Busse // J. FASEB - 1999. - Vol. 13. P.1231-1238. 74.Boyson, J.E. CD1d and invariant NKT cells at the human maternal-fetal interface / J.E. Boyson, B. Rybalov, L.A. Koopman et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2002. - Vol.99. - P. 13741-13746. 75.Braun, D. A two-step induction of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) activity during dendritic-cell maturation / D. Braun, R.S. Longman, M.L. Albert // Blood. - 2005. - Vol. 106. - P. 2375-2381. 76.Brisslert, M. Phenotypic and functional characterization of human CD25+ B cells / M. Brisslert, M. Bokarewa, P. Larsson, K. Wing, L.V. Collins, A. Tarkowski // J. Immunology. - 2006. - Vol. 117. - P. 548–557. 77.Brzozowski, T. Exogenous and endogenous ghrelin in gastroprotection against stress-induced gastric damage / T. Brzozowski, P.C. Konturek, S.J. Konturek et al. // Regul. Pept. - 2004. - Vol. 120. - P.39-51. 233 78.Budak, E. Interactions of the hormones leptin, ghrelin, adiponectin, resistin, and PYY3-36 with the reproductive system / E. Budak, M. Fernández Sánchez, J. Bellver et al. // Fertil Steril. - 2006. - Vol. 85, №6. - P. 1563-1581. 79.Buss, J. Associations of ghrelin with eating behaviors, stress, metabolic factors, and telomere length among overweight and obese women: preliminary evidence of attenuated ghrelin effects in obesity? / J. Buss, P.J. Havel, E. Epel et al. // Appetite. - 2014. - Vol.76. - P. 84-94. 80.Busso, N. Leptin signaling deficiency impairs humoral and cellular immune responses and attenuates experimental arthritis / N. Busso, A. So, V.ChobazPeclat et al. // J. Immunol. - 2002. - Vol. 168. - P. 875-882. 81.Campbell, J.J. Unique subpopulations of CD56+ NK and NK-T peripheral blood lymphocytes identified by chemokine receptor expression repertoire / J.J. Campbell, S. Qin, D. Unutmaz et al. // J Immunol. - 2001. - Vol. 166. - P. 6477- 6482. 82.Campbell, E.J. Elastase and cathepsin G of human monocytes. Quantification of cellular content, release in response to stimuli, and heterogeneity in elastasemediated proteolytic activity / E.J. Campbell, E.K. Silverman, M.A. Campbell // Immunol. - 1989. - Vol. 143, №9. - P. 2961-2968. 83.Calleja-Agius, J. Investigation of systemic inflammatory response in first trimester pregnancy failure /J. Calleja-Agius, E. Jauniaux, A.R. Pizzey, S. Muttukrishna // Hum. Reprod. – 2012. – Vol. 27. - № 2. – P. 349-357. 84.Carmen, V. Maternal serum ghrelin levels in early IVF pregnancies: lack of prognostic value for viable pregnancy and altered post-prandial responses / V. Carmen, J. Roa, L. Pinilla et al. // Human Reproduction. - 2008. - Vol.23, №.4. - P. 958- 963. 85.Carter, N.A. Interleukin-10 produced by B cells is crucial for the suppression of Th17/Th1 responses, induction of T regulatory type 1 cells and reduction of collagen-induced arthritis / N.A. Carter, E.C. Rosser, C. Mauri // Arthritis Research and Therapy. - 2012. - Vol. 14, №. 1. - A. R32. 234 86.Carter, N.A. Mice lacking endogenous IL-10-producing regulatory B cells develop exacerbated disease and present with an increased frequency of Th1/Th17 but a decrease in regulatory T cells / N. A. Carter, R. Vasconcellos, E. C. Rosser et al. // J. of Immunology. - 2011. - Vol. 186, №. 10. - P. 5569– 5579. 87.Cecchetti, S. Functional role of phosphatidylcholine-specific phospholipase C in regulating CD16 membrane expression in natural killer cells / S.Cecchetti, F. Spadaro, L. Lugini, F. Podo, C. Ramoni // Eur. J. Immunol. - 2007. - Vol.37. - P. 2912-2922. 88.Chan, J.L. Regulation of circulating soluble leptin receptor levels by gender, adiposity, sex steroids, and leptin: observational and interventional studies in humans // J.L.Chan, S. Bluher, N. Yiannakouris et al. // Diabetes. - 2002. - Vol. 51. - Р. 2105-2112. 89. Chaouat, G. The Th1/Th2 paradigm: still important in pregnancy? / G. Chaouat // Semin. Immunopathol. – 2007. – Vol. 29, № 2. – P. 95-113. 90.Chen, P.C. Leptin Regulates KATP Channel Trafficking in Pancreatic β-Cells by a Signaling Mechanism Involving AMP-activated Protein Kinase (AMPK) and cAMP-dependent Protein Kinase (PKA) / P.C. Chen, Y.N. Kryukova, S.L. Shyng // J. Biol. Chem. - 2013. - Vol.288. - P. 34098-34109. 91.Clark, D.A. TH1/TH2,3 imbalance due to cytokine-producing NK, gammadelta T and NK-gammadelta T cells in murine pregnancy decidua in success or failure of pregnancy / D.A. Clark, K. Croitoru // Am J. Reprod Immunol. 2001. - Vol.45, №5. - P. 257-265. 92.Claycombe, K. A role for leptin in sustaining lymphopoiesis and myelopoiesis / K. Claycombe, L.E. King, P.J. Fraker // Proc. Natl. Acad Sci U S A. - 2008. Vol.105, №6. - P. 2017-2021. 93.Cohen, G. Effect of leptin on polymorphonuclear leucocyte functions in healthy subjects and haemodialysis patients / G. Cohen, J. Raupachova, D. Ilic, J. Werzowa, W.H. Hörl // J. Nephrol. Dial. Transplant. - 2011. - Vol. 26. - P. 2271–2281. 235 94.Coller, S.P. Signaling pathways initiated in macrophages after engagement of type A scavenger receptors / S.P. Coller, D.M. Paulnock // J. Leukoc. Biol. 2001. - Vol. 70. - № 1. - P. 142-148. 95. Considine, V. The hypothalamic leptin receptor in humans: identification of incidental sequence polymorphisms and absence of the db/db mouse and fa/fa rat mutations / V. Considine, E. L. Considine, C. J. Williams, T. M. Hyde, J. F. Caro // Diabetes. - 1996. - Vol.45. - P.992- 994. 96.Cooper, M.A. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset / M.A. Cooper, T.A. Fehinger, S.C. Turner et al. // Blood. - 2001. - Vol.97. - P. 46-51. 97.Cooper, M.A. The biology of human natural killer-cell subsets / M.A. Cooper, T.A. Fehniger, M.A. Caloguri // Trends Immunol. - 2001. - Vol.11. - P. 633640. 98.Correa-Silva, S.R. Decreased GH secretion and enhanced ACTH and cortisol release after ghrelin administration in Cushing's disease: comparison with GHreleasing peptide-6 (GHRP-6) and GHRH / S.R. Correa-Silva, S.O. Nascif, A.M. J. Lengyel // Pituitary. - 2006. - Vol. 92. - P. 101-107. 99.Cosmi, L. Human CD8+CD25+ thymocytes share phenotypic and functional features with CD4+CD25+ regulatory thymocytes. / L. Cosmi, F. Liotta, E.Lazzeri, M. Francalanci et al. // Blood. - 2003. - Vol. 102, №12. - P. 41074114. 100. Dafopoulos, K. Blood ghrelin, resistin, and adiponectin concentrations during the normal menstrual cycle / K. Dafopoulos, D. Sourlas, A. Kallitsaris, S. et al //Fertil. Steril. – 2009. – Vol. 92. – P.1389–1394. 101. Dahigren, C. Myeloperoxidase modulates the phagocytic activity of polymorphonuclear neutrophil leukocytes. Studies with cells from a myeloperoxidase deficient patient / C. Dahigren, O. Stendahl // J. Clin. Invest. 1984. - Vol. 73. - P. 366-373. 102. Date, Y. Ghrelin, a novel growth hormone-releasing acylated peptide, is synthesized in a distinct endocrine cell type in the gastrointestinal tracts of rats 236 and humans / Y. Date, M. Kojima, H. Hosoda et al. // Endocrinology. – 2000. Vol.141. - P.4255- 4261. 103. Davies, S.P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors / S.P. Davies, H. Reddy, M. Caivano, P. Cohen // J. Biochem - 2000. - Vol. 351. - P. 95-105. 104. De Rosa, V. A key role of leptin in the control of regulatory T cell proliferation / V. De Rosa, C. Procaccini, G. Cali et al. // Immunity. - 2007. Vol. 26. - P. 143-145. 105. Dekker, L.V. Protein kinase C-beta contributes to NADPH oxidase activation in neutrophils / L.V. Dekker, M. Leitges, G. Altschuler, N. Mistry, A. McDermott, J. Roes, A. W. Segal // J. Biochem - 2000. - Vol. 347. - P.285-289. 106. Delporte, C. Structure and Physiological Actions of Ghrelin / C. Delporte // Scientifica. - 2013.- Vol.3 - P. 1-25. 107. Deng, J. Leptin exacerbates collagen-induced arthritis via enhancement of Th17 cell response / J. Deng, Y. Liu, M. Yang et al. // Arthritis Rheum. - 2012. - Vol.64, №11. - P. 3564-3573. 108. Denhardt, D.T. Signal-transducing protein phosphorylation cascades mediated by Ras/Rho proteins in the mammalian cell: the potential for multiplex signalling / D.T. Denhardt //Biochem. J. - 1996. - Vol. 318. - P.729747. 109. Dixit, V.D. Leptin induces growth hormone secretion from peripheral blood mononuclear cells via a protein kinase C- and nitric oxide-dependent mechanism / V.D. Dixit, M.Mielenz, D.D.Taub, N. Parvizi // Endocrinol. 2003. - Vol. 144. - P. 5595-5603. 110. Dixit, V.D. Ghrelin and immunity: a young player in an old field / V.D. Dixit, D.D. Taub // Exp. Gerontol. - 2005. - Vol. 40. - P. 900-910. 111. Dixit, V.D. Ghrelin inhibits leptin- and activation-induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells / V.D. Dixit, E.M. Schaffer, R.S. Pyle et al. // J. Clin. Invest. - 2004. - Vol.1. - P. 57-66. 237 112. Dixit, V.D. Reduction of T cell-derived ghrelin enhances proinflammatory cytokine expression: implications for age-associated increases in inflammation / V.D. Dixit, H. Yang, A. Cooper-Jenkins et al. // Blood. - 2009. - Vol.113. - P. 5202-5205. 113. Dreyer, M.G. Leptin activates the promoter of the interleukin-1 receptor antagonist through p42/44 mitogen-activated protein kinase and a composite nuclear factor kappa B/PU.1 binding site / M.G. Dreyer, C.E.Juge-Aubry, C.Gabay et al. // J. Biochem. - 2003. - Vol.370. - P. 591. 114. Dujardin, H.C. Regulatory potential and control of Foxp3 expression in newborn CD4+ T cells / H.C. Dujardin, О. Burlen-Defranoux, L. Boucontet et al. // Proc. Natl. Acad Sci U S A. – 2004. – Vol. 101, №40. P. 14473-14478. 115. Dumur, C.I. A new death domain associated with gestational trophoblastic diseases induces apoptosis in distinct cell types / C.I. Dumur, J.A. Almenara, S. Durand et al. // Int. J. Oncol. - 2001. - Vol.19. - P.1161-1167. 116. El-Eter, E. In vivo and in vitro antioxidant activity of ghrelin: Attenuation of gastric ischemic injury in the rat / E. El-Eter, A. Al. Tuwaijiri, H. Hagar, M. Arafa // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2007. – Vol.22, №11. – P. 1791-1799. 117. Fadok, V.A. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF / V.A. Fadok, D.L. Bratton, A.Konowal et al. // J. Clin. Invest. - 1998. - Vol.101. - P. 890-898. 118. Faggioni, R. IL-1 beta mediates leptin induction during inflammation / R. Faggioni, G. Fantuzzi, J. Fuller, Konowal et al. // Am. J. Physiol. - 1998. - Vol. 274. - P. 204-208. 119. Fainboim, L. Mechanisms involved in the expansion of Tregs during pregnancy: role of IL-2/STAT5 signalling / L. Fainboim, L. Arruvito // J.Reprod. Immunol.-2011- V.88, №2.- P.88-93. 120. Fallarino, F. Murine plasmacytoid dendritic cells initiate the immunosuppressive pathway of tryptophan catabolism in response to CD200 238 receptor engagement / F. Fallarino, C. Asselin-Paturel, C. Vacca et al. // J Immunol. - 2004. – Vol. 173. – P.3748-3754. 121. Fantuzzi, G. Adipose tissue, adipokines, and inflammation / G. Fantuzzi // J. Allergy Clin. Immunol. - 2005. - Vol. 115, №. 5. - P. 911-919. 122. Fantuzzi, G. Leptin in the regulation of immunity, inflammation, and hematopoiesis / G. Fantuzzi, R. Faggioni // J. Leukoc. Biol. - 2000. - Vol. 68. P. 437-446. 123. Favaro, E. The ghrelin gene products and exendin-4 promote survival of human pancreatic islet endothelial cells in hyperglycaemic conditions, through phosphoinositide 3-kinase/Akt, extracellular signal-related kinase (ERK)1/2 and cAMP/protein kinase A (PKA) signalling pathways / E. Favaro, R. Granata, I. Miceli et al. // Diabetologia. - 2012. - Vol. 55. – P.1058-1070. 124. Fernandez-Fernandez, R. Novel signals for the integration of energy balance and reproduction / R. Fernandez-Fernandez, A.C. Martini, V.M. Navarro et al. // Mol. Cell Endocrinol. – 2006. – Vol. 25, № 254-255. - P. 127-132. 125. Filigheddu, N. Ghrelin and des-acyl ghrelin promote differentiation and fusion of C2C12 skeletal muscle cells / N. Filigheddu, V.F. Gnocchi, M. Coscia et al. // J. Mol. Biol. Cell. - 2007. - Vol.18, № 3. - P. 986-994. 126. Flier, J.S. Obesity and the hypothalamus: novel peptides for new pathways / J.S. Flier, E. Maratos-Flier // Cell. - 1998. - Vol. 92. - P. 437-440. 127. Fong, T.M. Localization of leptin binding domain in the leptin receptor / T.M. Fong, R.R. Huang, M.R. Tota, et al. // Mol. Pharmacol. - 1998. - Vol. 53. - P. 234 - 240. 128. Forman, H.J. Signaling by the Respiratory Burst in Macrophages / H.J. Forman, M. Torres // IUBMB Life. - 2001. - Vol.51. - P. 365 – 371. 129. Fruhbeck, G. Intracellular signalling pathways activated by leptin / G. Fruhbeck / G. Fruhbeck // J. Biochem. – 2006. – Vol. 393. – P. 7-20. 130. Fuchs, T.A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps / T. A. Fuchs, U. Abed, C. Goosmann, et al. // J. Cell Biology. – 2004. - Vol. 176, № 2. - Р. 231-241. 239 131. Fuglsang, J. Ghrelin and its relationship to growth hormones during normal pregnancy / J. Fuglsang, Skjærbæk, U. Espelund, J. Frystyk // Clin. Endocrinol. - 2005. - Vol. 62. - P. 554- 559. 132. Fujimaki, W. Comparative study of regulatory T cell function of human CD25CD4 T cells from thymocytes, cord blood, and adult peripheral blood / W. Fujimaki, N. Takahashi, K. Ohnuma et al. // Clin Dev Immunol. - Vol. 2008. – P. 1-12. 133. Fujita, Y. Leptin inhibits stress-induced apoptosis of T lymphocytes / Y. Fujita, M. Murakami, Y. Ogawa et al. // Clin. Exp. Immunol. - 2002. - Vol. 128. - P. 21-26. 134. Gainsford, T. Leptin can induce proliferation, differentiation, and functional activation of hemopoietic cells / T. Gainsford, T.A.Willson, D.Metcalf, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - Vol. 93. - P. 14564-14568. 135. Gainsford, T. A role for leptin in hemopoieses? / T. Gainsford, W.S. Alexander // Mol. Biotechnol. - 1999. - Vol. 11, №2 - P. 149-158. 136. Garofalo, C. Leptin and cancer / C. Garofalo, E. Surmacz //J. Cellular Physiology – 2006. – Vol. 207 – P. 12-22 137. Gauna, C.B. Unacylated ghrelin is not a functional antagonist but a full agonist of the type 1a growth hormone secretagogue receptor (GHS-R) / C. Gauna, B. van de Zande , A. van Kerkwijk et al. // Mol. Cell. Endocrinol. – 2007. – Vol. 274. – P.30-34. 138. Girardi, G. The complement system in the pathophysiology of pregnancy / G. Girardi, R. Bulla, J.E. Salmon, F. Tedesco // Mol. Immunol. - 2006. - Vol. 43, № 1-2. – P. 68-77. 139. Gonzalez-Rey, E. Therapeutic action of ghrelin in a mouse model of colitis / E. Gonzalez-Rey, A. Chorny, M. Delgado // Gastroenterology. - 2006. - Vol. 30. - P. 1707-1720. 140. Gorczynski, R.M. The same immunoregulatory molecules contribute to successful pregnancy and transplantation / R.M. Gorczynski, S. Hadidi, G. Yu, D.A. Clark // Am. J. Reprod. Immunol. - 2002. – Vol.48. – P.18-26. 240 141. Gorska, E. Wasik Leptin receptors / E. Gorska, K. Popko, A. StelmaszczykEmmel et al. // J. Med Res. – 2010. – Vol. 15 – P.50-54. 142. Granado, M. Anti-inflammatory effect of the ghrelin agonist growth hormone-releasing peptide-2 (GHRP-2) in arthritic rats / M. Granado, T. Priego, A.I. Martín et al. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. - 2005. - Vol. 288. P.486-492. 143. Granata, R. Acylated and unacylated ghrelin promote proliferation and inhibit apoptosis of pancreatic beta-cells and human islets: involvement of 3',5'cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A, extracellular signalregulated kinase 1/2, and phosphatidyl inositol 3-Kinase/Akt signaling / R. Granata, F. Settanni, L. Biancone et al. // Endocrinology. - 2007. – Vol.148. – P. 512-529. 144. Grant, C. Foxp3 represses retroviral transcription by targeting both NFkappaB and CREB pathways / C. Grant, U. Oh.Fugo, N. Takenouchi, et al. // PLoS. Pathog. - 2006. – Vol. 2, №4 – e.33. 145. Greenberg, S. Diversity in phagocytic signalling / S. Greenberg // J. Cell. Sci. - 2001. - Vol. 114. - P. 1039. 146. Gregori, S. Dendritic cells in networks of immunological tolerance / S. Gregori // Tissue Antigens. - 2011. - Vol.77. - P.89-99. 147. Gruver, A.L. Leptin receptor is expressed in thymus medulla and leptin protects against thymic remodeling during endotoxemia-induced thymus involution / A.L. Gruver, M.S. Ventevogel, G.D.Sempowski // J. Endocrinol. 2009. – Vol. 203. – P.75-85. 148. Gualillo, O. Ghrelin, a novel placental-derived hormone / O. Gualillo, J. Caminos, M. Blanco et al. // Endocrinology. - 2001. - Vol. 142. – P.788-794. 149. Guebre-Xabier, M. Altered hepatic lymphocyte subpopulations in obesityrelated murine fatty livers: potential mechanism for sensitization to liver damage / M. Guebre-Xabier, S. Yang, H.Z. Lin, R. Schwenk, U. Krzych, A.M. Dieh //Hepatology. – 2000. – Vol. 31 – P. 633-640. 241 150. Gupta, S. Increased activation and cytokine secretion in B cells stimulated with leptin in aged humans / S. Gupta, S. Agrawal, S. Gollapudi // Immun. Ageing. - 2013. - Vol. 23, № 10. - P. 10-13. 151. Hahn, S.A. Soluble GARP has potent antiinflammatory and immunomodulatory impact on human CD4+ T cells / S.A. Hahn, H.F. Stahl, C. Becker et al. // Blood. - 2013. - Vol.122. – P.1182-1191. 152. Hardie L. Circulating leptin in women: longitudinal study in menstrual cycle and during pregnancy / L. Hardie, P. Trayhurn // Clin. Endocrinol. - 1997. Vol.47. - P.101 - 106. 153. Hattori, N. GH, GH Receptor, GH Secretagogue Receptor, and Ghrelin Expression in Human T Cells, B Cells, and Neutrophils / N. Hattori, T.Saito, T.Yagyu et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2001. - Vol.86. - P. 4284- 4291. 154. Hehir, M.P. Uterorelaxant effect of ghrelin on human myometrial contractility / M.P. Hehir, S.V. Glavey, J.J. Morrison // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2008. – Vol. 198. – P.323e1-323e15. 155. Heikkinen, J. Phenotypic characterization of regulatory T cells in the human deciduas / J. Heikkinen, M. Mottonen, A. Alanen, O. Lassila // Clin. Exp. Immunol. - 2004. - Vol. 136. - P. 373-378. 156. Hick, R.W. Leptin selectively augments thymopoiesis in leptin deficiency and lipopolysaccharide-induced thymic atrophy / R.W. Hick, A.L. Gruver, M.S. Ventevogel et al. // J. Immunol. - 2006. – Vol.177. – P. 169-176. 157. Hong, H.S. Loss of CCR7 expression on CD56(bright) NK cells is associated with a CD56(dim)CD16⁺ NK cell-like phenotype and correlates with HIV viral load / H.S. Hong, F. Ahmad, J.M. Eberhard // PLoS One. - 2012. – Vol. 7. – P. e44820. 158. Hori, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3 / S. Hori, T. Nomura, S. Sakaguchi // Science. - 2004. - Vol. 299. - P. 1057-1061. 242 159. Horlick, M.B. Effect of puberty on the relationship between circulating leptin and body composition / M.B. Horlick, M. Rosenbaum, M. Nicolson et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2000. - Vol.85. – P.2509- 2518. 160. Horvath, T.L. Minireview: Ghrelin and the regulation of energy balance - a hypothalamic perspective / T.L. Horvath, S. Diano, P. Sotonnyi et al. // Endocrinology. - 2001. – Vol.142. – P.4163-4169. 161. Hosoda, H. Ghrelin and the regulation of food intake and energy balance / H. Hosoda, M. Kojima, K. Kangawa // Mol. Interventions. - 2002. – Vol.2. – P. 494-503. 162. Hosoda, H. Structural divergence of human ghrelin. Identification of multiple ghrelin-derived molecules produced by post-translational processing / H. Hosoda, M. Kojima, T. Mizushima et al. // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol.278. – P.64-70. 163. Howard, J.K. Leptin protects mice from starvation-induced lymphoid atrophy and increases thymic cellularity in ob/ob mice / J.K. Howard, G.M. Lord, G. Matarese et al. // J. Clin. Invest. - 1999. – Vol.104. – P.1051-1059. 164. Hubert, P. The cross-talk between dendritic and regulatory Tcells: good or evil? / P. Hubert, N. Jacobs, J.-H. Caberg, J. Boniver, P. Delvenne // J. of Leukocyte Biol. - 2007. - Vol. 82. – P. 787-794. 165. Hunt, J.S. Macrophages in human uteroplacental tissues: a review / J.S. Hunt // Am. J. Reprod. Immunol. - 1989. - Vol. 21, №3-4. - P. 119-22. 166. Ichiyama, K. Foxp3 inhibits RORgammat-mediated IL-17A mRNA transcription through direct interaction with RORgammat / K. Ichiyama, H. Yoshida, Y. Wakabayashi et al. // J. Biol. Chem. - 2008. - Vol. 283, №25. - P. 17003-17008. 167. Jeong, Y. Curcumin Suppresses the Induction of Indoleamine 2,3Dioxygenase by Blocking the Janus-activated Kinase-Protein Kinase C STAT1 Signaling Pathway in Interferon-g-stimulated Murine Dendritic Cells / Y.-I Jeong, S. W. Kim, I. D. Jung, J. S. Lee et al. // J.Biol. Chem.-2009.-V.284.P. 3700-3708. 243 168. Jiang, S. Regulatory T cells and transplantation tolerance / S. Jiang, R.I. Lechler, X.S. He, J.F. Huang // Hum Immunol. – 2006. - Vol. 67, № 10. P.765-776. 169. Jung, I.D. Differential regulation of indoleamine 2,3-dioxygenase by lipopolysaccharide and interferon gamma in murine bone marrow derived dendritic cells / I.D. Jung , C.M. Lee, Y.I. Jeong et al. // FEBS Lett. 2007.V.581.-№7.-P.1449-1456. 170. Karmiris, K. Circulating levels of leptin, adiponectin, resistin, and ghrelin in inflammatory bowel disease / K. Karmiris, I.E. Koutroubakis, C. Xidakis et al. // Inflamm. Bowel Dis. - 2006. - Vol. 12, № 2. – P. 100-105. 171. Kayisli, U.A. Human chorionic gonadotropin contributes to maternal immunotolerance and endometrial apoptosis by regulating Fas-Fas ligand system / U.A. Kayisli, B. Selam, O. Guzeloglu-Kayisli et al. // J. Immunol. 2003. - Vol. 171, № 5. – P. 2305-2313. 172. Keskin, D.B. TGFbeta promotes conversion of CD16+ peripheral blood NK cells into CD16- NK cells with similarities to decidual NK cells / D.B. Keskin, D.S. Allan, B. Rybalov et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2007. - Vol. 104. – P.3378-3383. 173. Kessel, A Human CD19(+)CD25(high) B regulatory cells suppress proliferation of CD4(+) T cells and enhance Foxp3 and CTLA-4 expression in T-regulatory cells / A. Kessel, T. Haj, R. Peri et al. // J. Autoimmun. Rev. 2012. - Vol. 11. - P. 670–677. 174. Kilts, J. D. β (2) adrenergic and several other G protein_coupled receptors in human atrial membranes activate both G (s) and G (i) / J.D. Kilts, M.A. Gerhardt , M.D. Richardson et al. // J. Circ. Res. - 2000. - Vol. 87. - P. 705-716. 175. Kim, M.S. The mitogenic and antiapoptotic actions of ghrelin in 3T3-L1 adipocytes / M.S. Kim, C.Y. Yoon, P.G. Jang et al. // Mol. Endocrinol. - 2004. Vol. 18. – P.2291-2301. 176. Kim, S.Y. Preferential effects of leptin on CD4 T cells in central and peripheral immune system are critically linked to the expression of leptin 244 receptor / S.Y.Kim, J.H. Lim, S.W. Choi et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2010. - Vol. 394. - P.562-568. 177. Kitawaki, J. Expression of leptin receptor in human endometrium and fluctuation during the menstrual cycle / J. Kitawaki, H. Koshiba, H. Ishihara et al. // J.Clin Endocrinol Metab. - 2000. - Vol.85. - P.1946-1950. 178. Klinker, M.W. Multiple mechanisms of immune suppression by B lymphocytes / M.W. Klinker, S.K. Lundy // Mol. Med. - 2012. - Vol. 18. - P. 123–137. 179. Kohno, D. Leptin suppresses ghrelin-induced activation of neuropeptide Y neurons in the arcuate nucleus via phosphatidylinositol 3-kinase- and phosphodiesterase 3-mediated pathway / D. Kohno, M. Nakata, F. Maekawa et al. // Endocrinology. – 2007. – Vol. 148. – P. 2251-2263. 180. Kohno, D. Ghrelin directly interacts with neuropeptide-Y-containing neurons in the rat arcuate nucleus: Ca2+ signaling via protein kinase A and Ntype channel-dependent mechanisms and cross-talk with leptin and orexin / D. Kohno, H.Z. Gao, S. Muroya et al. // Diabetes. - 2003. - Vol. 52. – P.948-956. 181. Kojima, M. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach / M. Kojima, H. Hosoda, Y. Date et al. // Nature. - 1999. - Vol. 402. P. 656-660. 182. Koldehoff, M. Thoughts on feto- maternal tolerance: is there a lesson to be learned from allogeneic haematopoietic stem cell transplantation? / M. Koldehoff, A.H. Elmaagacli // Cell Biol. Int. - 2013. -Vol. 37. - P. 766-767. 183. Komori, T. Regulation of ghrelin signaling by a leptin-induced gene, negative regulatory element-binding protein, in the hypothalamic neurons / T. Komori, A. Doi, H. Furuta et al. // J. Biol. Chem. - 2010. – Vol. 285. – P.37884-37894. 184. Konturek, P.C. Role of leptin in ulcer healing / P.C. Konturek, T. Brzozowski, Z. Sulekova et al. // Eur. J. Pharmacol. - 2001. - Vol. 414. - P. 8797. 245 185. Koopman, L.A. Human decidual natural killer cells are a unique NK subset with immunomodulatory potential / L.A. Koopman, H.D. Kopcow, B. Rybalov et al. // J. Exp. Med. - 2003. - Vol. 198. - P. 1201- 1212. 186. Korbonits, M. Ghrelin - a hormone with multiple functions / M. Korbonits, A.P. Goldstone, M. Gueorguiev, A.B. Grossman // Front. Neuroendocrinol. 2004. - Vol. 25. - P. 27-68. 187. Korbonits, M. Presence of ghrelin in normal and adenomatous human pituitary / M. Korbonits, M. Kojima, K. Kangawa, A.B. Grossman // Endocrine. - 2001. - Vol. 14. – P. 101-104. 188. Koshiba, H. Progesterone inhibition of functional leptin receptor mRNA expression in human endometrium / H. Koshiba, J. Kitawaki, H. Ishihara et al. // Mol. Hum. Reprod. - 2001. - Vol. 7, № 6. – P. 567-572. 189. Kwan, J. CCR7 directs the migration of thymocytes into the thymic medulla / J. Kwan, N. Killeen // J. Immunol. - 2004 - Vol. 172 – P. 3999-4007. 190. Lam, Q.L. Leptin signaling maintains B-cell homeostasis via induction of Bcl-2 and Cyclin D1 / Q.L. Lam, S. Wang, O.K. Ko, P.W. Kincade, L. Lu // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2010. - Vol.107, № 31. - P. 13812–13817. 191. Laurence, A. STAT3 transcription factor promotes instability of nTreg cells and limits generation of iTreg cells during acute murine graft-versus-host disease / A. Laurence, S. Amarnath, J. Mariotti et al. // Immunity. – 2012. - Vol. 37. – P.209-222. 192. Lehtoviita, A. The CD4(+)CD8(+) and CD4(+) subsets of FOXP3(+) thymocytes differ in their response to growth factor deprivation or stimulation. / A. Lehtoviita, L.H. Rossi, E. Kekäläinen et al. // Scand. J. Immunol. - 2009. – Vol. 70. – P.377-383. 193. Leung, P.K. The truncated ghrelin receptor polypeptide (GHS-R1b) acts as a dominant-negative mutant of the ghrelin receptor / P.K. Leung, K.B. Chow, P.N. Lau et al. // Cell Signal. - 2007. - Vol. 19. - P. 1011-1022. 246 194. Li, Z. Murine leptin deficiency alters Kupffer cell production of cytokines that regulate the innate immune system / Z. Li, H. Lin, S. Yang, A.M. Diehl // Gastroenterology. - 2002. - Vol. 123. - P. 1304. 195. Liu, F. Placental trophoblasts shifted Th1/Th2 balance toward Th2 and inhibited Th17 immunity at fetomaternal interface / F. Liu, J. Guo, T. Tian et al. – APMIS. – 2011. – Vol. 119, № 9. – P. 597-604. 196. Liu, Y. Role of IL-10-producing regulatory B cells in control of cerebral malaria in Plasmodium berghei infected mice / Y. Liu, Y. Chen, Z. Li et al. // Eur. J. of Immunology. - 2013. - Vol. 43, № 11. - P. 2907–2918. 197. Liu, Y.S. Study on the relationship between Th17 cells and unexplained recurrent spontaneous abortion / Y.S. Liu, L. Wu, X.H. Tong et al. // Am. J. Reprod. Immunol. - 2011. - Vol. 65, №.5. - P. 503-511. 198. Loffreda, S. Leptin regulates proinflammatory immune responses / S. Loffreda, S.Q. Yang, H.Z. Lin et al. // FASEB J. - 1998. - Vol. 12. - P. 57-65. 199. Lord, G.M. Leptin modulates the T-cell immune response and reverses starvation-induced immunosuppression / G.M. Lord, G. Matarese, J.K. Howard et al. // Nature. - 1998. - Vol. 394. - P. 897-901. 200. Louis, G.W. Molecular mapping of the neural pathways linking leptin to the neuroendocrine reproductive axis / G.W. Louis, M. Greenwald-Yarnell, R. Phillips et al. // Endocrinology. - 2011. - Vol. 152. – P.2302-2310. 201. Lutz, M.B. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: witch signals induce tolerance or immunity? / M.B. Lutz, G. Schuler // Trends Immunol. – 2002. – V.23. - P.235-244. 202. Mackay, D.J. Rho GTPases / D.J. Mackay, A. Hall // J. Biol. Chem. - 1998. Vol. 273. - P. 20685-20688. 203. Maddur, M.S. Th17 Cells: Biology, Pathogenesis of Autoimmune and Inflammatory Diseases, and Therapeutic Strategies / M.S. Maddur, P. Miossec , S.V. Kaveri , Bayry J. // Am. J. Pathol.- 2012 - V.181 - P.8-18. 204. Mager, U. Expression of ghrelin gene in peripheral blood mononuclear cells and plasma ghrelin concentrations in patients with metabolic syndrome / U. 247 Mager, M. Kolehmainen, V.D. de Mello et al. // Eur. J. Endocrinol. - 2008. Vol. 158. - P.499-510. 205. Mailliard, R.B. IL-18-induced CD83+CCR7+ NK helper cells / R.B. Mailliard, S.M. Alber, H. Shen et al. //J. Exp. Med. – 2005. – Vol. 202. – P. 941-953. 206. Maingrette, F. Leptin increases lipoprotein lipase secretion by macrophages: involvement of oxidative stress and protein kinase C / F. Maingrette, G. Renier // Diabetes. - 2003. - Vol. 52. - P. 2121-2128. 207. Makovey, J., Naganathan V, Seibel M, Sambrook P. Gender differences in plasma ghrelin and its relations to body composition and bone - an opposite-sex twin study / J. Makovey, V. Naganathan, M. Seibel, P. Sambrook //Clin. Endocrinol. – 2007. – Vol. 66. – P.530-537. 208. Mancuso, P. Leptin augments alveolar macrophage leukotriene synthesis by increasing phospholipase activity and enhancing group IVC iPLA2 (cPLA2gamma) protein expression / P. Mancuso, C. Canetti, A. Gottschalk et al. //Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. - 2004. - Vol. 287. - P. 497-502. 209. Mancuso, P. Leptin-deficient mice exhibit impaired host defense in Gramnegative pneumonia / P. Mancuso, A. Gottschalk, S.M. Phare et al. // J. Immunol. - 2002. - Vol. 168. - P. 4018-4024. 210. Martín-Romero, C. Human leptin activates PI3K and MAPK pathways in human peripheral blood mononuclear cells: possible role of Sam68 / C. MartínRomero, V. Sánchez-Margalet // Cell. Immunol. - 2001. - Vol. 212. - P. 83-91. 211. Martín-Romero, C. Human leptin enhances activation and proliferation of human circulating T lymphocytes/ J. Santos-Alvarez, R. Goberna, V. SánchezMargalet // Cell. Immunol. - 2000. - Vol. 199. - P.15-24. 212. Masuzaki, H. Nonadipose tissue production of leptin: leptin as a novel placenta-derived hormone in humans / H. Masuzaki, Y. Ogawa, N. Sagawa et al. // Nat Med. - 1997. – Vol. 3. – P.1029-1033. 248 213. Matarese, G. Leptin increase in multiple sclerosis associates with reduced number of CD4(+)CD25+ regulatory T cells / G. Matarese, P.B. Carrieri, A. La Cava et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. – Vol.102. – P.5150-5155. 214. Matarese, G. Leptin and the immune system: how nutritional status influences the immune response / G. Matarese // Eur Cytokine Netw. – 2000. – Vol. 11. – P.7-14. 215. Matarese, G. Regulatory T cells in obesity: the leptin connection / G. Matarese, C. Procaccini, V. De Rosa et al //Trends. Mol. Med. - 2010. - Vol. 16, №6. - P.247-256. 216. Matsumoto, J. Expression of surface CD1d in the extravillous trophoblast cells of early gestational placenta is downregulated in a manner dependent on trophoblast differentiation / J. Matsumoto, K. Kawana, T. Nagamatsu et al // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2008. – Vol. 371. – P.236-241. 217. Mattioli, B. Leptin promotes differentiation and survival of human dendritic cells and licenses them for Th1 priming / B. Mattioli, E. Straface, M.G. Quaranta et al. // J. Immunol. – 2005. - Vol. 174. - P. 6820-6828. 218. Mazzocchi, G. Ghrelin enhances the growth of cultured human adrenal zona glomerulosa cells by exerting MAPK-mediated proliferogenic and antiapoptotic effects / G. Mazzocchi, G. Neri, M. Rucinski et al. // Peptides. – 2004. – Vol. 25. – P.1269-1277. 219. McCord, N. System y+ arginine transport and NO production in peripheral blood mononuclear cells in pregnancy and preeclampsia / N. McCord, P. Ayuk, M. McMahon et al// Hypertension. – 2006. - Vol. 47. – P.109-115. 220. Memmott, R.M. Akt-dependent and -independent mechanisms of mTOR regulation in cancer / R.M. Memmott, Ph.A. Dennis // Cell Signal. – 2009. – Vol. 21. – P. 656- 664. 221. Mikhail, A.A. Leptin stimulates fetal and adult erythroid and myeloid development / A.A. Mikhail, E.X. Beck, A. Shafer et al. // Blood. – 1997. - Vol. 89, № 5. – P. 1507-1512. 249 222. Miles, K. A tolerogenic role for Toll-like receptor 9 is revealed by B-cell interaction with DNA complexes expressed on apoptotic cells / K. Miles, J. Heaney, Z. Sibinska et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2012. - Vol. 109, № 3. - P. 887–892. 223. Mittag, A. Polychromatic (eight-color) slide-based cytometry for the phenotyping of leukocyte, NK, and NKT subsets / A. Mittag, D. Lenz, A.O. Gerstner et al. // Cytometry. - 2005. - Vol. 65, №2. - P. 103-115. 224. Miwa, N. IDO expression on decidual and peripheral blood dendritic cells and monocytes/macrophages after treatment with CTLA-4 or interferon-gamma increase in normal pregnancy but decrease in spontaneous abortion / N. Miwa, S. Hayakawa, S. Miyazaki et al // Mol. Hum. Reprod. - 2005. – Vol. 11. – P.865-870. 225. Moffett-King, A. Natural killer cells and pregnancy / A. Moffett-King // Nat. Rev. Immunol. - 2002. – Vol. 2. – P.656- 663. 226. Moore, S.I. Leptin modulates neutrophil phagocytosis of Klebsiella pneumoniae. / G.B. Huffnagle, G.H. Chen, E.S. White, P. Mancuso // Infect. Immun. - 2003. - Vol. 71. - P. 4182. 227. Morikawa, K. Modulatory effect of antibiotics on cytokine production by human monocytes in vitro / K. Morikawa, H. Watabe, M. Araake, S. Morikawa // Antimicrobial agent and chemotherapy. - 1996. - V. 40, №6. - P. 1366-1370. 228. Moriuchi, H. Cathepsin G, a neutrophil-derived serine protease, increases susceptibility of macrophages to acute humanimmunodeficiency virus type 1 infection / H. Moriuchi, M. Moriuchi, A.S. Fauci // Journal of virology. - 2000. - Vol. 74, № 15. - P. 6849-6855. 229. Muccioli, G. Beyond the metabolic role of ghrelin: a new player in the regulation of reproductive function / G. Muccioli, T. Lorenzi, M. Lorenzi et al. // Peptides. – 2011. – Vol. 32. – P. 2514-2521. 230. Muccioli, G. Neuroendocrine and peripheral activities of ghrelin: implications in metabolism and obesity / G. Muccioli, M. Tschop, M. Papotti et al. // Eur J Pharmacol. - 2002. - Vol. 440- P. 235-254. 250 231. Muzzio, D. The role of pregnancy-associated hormones in the development and function of regulatory B cells / D. Muzzio, M. Zygmunt, F. Jensen // Front. Еndocrinol. - 2014. - Vol. 5, № 39. - P. 1-5. 232. Nagaeva O. Dominant IL-10 and TGF-beta mRNA expression in gammadeltaT cells of human early pregnancy decidua suggests immunoregulatory potential / Nagaeva O1, Jonsson L, Mincheva-Nilsson L.// Am. J. Reprod. Immunol. - 2002 - Vol.48. – P. 9-17. 233. Nagaya, N. Hemodynamic and hormonal effects of human ghrelin in healthy volunteers / N. Nagaya, M. Kojima, M. Uematsu et al. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 2001. - Vol. 280. - P. 1483-1487. 234. Najib, S. Human leptin promotes survival of human circulating blood monocytes prone to apoptosis by activation of p42/44 MAPK pathway / S. Najib, V. Sanchez-Margalet // Cell Immunol. - 2002. - Vol. 220. - P. 143-149. 235. Nakahara, K. Maternal ghrelin plays an important role in rat fetal development during pregnancy / K. Nakahara, M. Nakagawa, Y. Baba et al. // Endocrinology. - 2006. - Vol. 147. – P. 1333-1342. 236. Nakashima, A. The balance of the immune system between T cells and NK cells in miscarriage / A. Nakashima, T. Shima, K. Inada et al. // Am. J. Reprod. Immunol. – 2012. – Vol. 67, № 4. – P. 304-310. 237. Nakazato, M. A role for ghrelin in the central regulation of feeding / M. Nakazato, N. Murakami, Y. Date et al. // Nature. - 2001. - Vol.409 – P. 194198. 238. Nishihara, M. IL-6-gp130-STAT3 in T cells directs the development of IL17+ Th with a minimum effect on that of Treg in the steady state / M. Nishihara, H. Ogura, N. Ueda et al. // Int. Immunol. – 2007. - Vol.19, № 6. – P. 695-702. 239. Noh, G. Regulatory B cells and allergic diseases / G. Noh, J.H. Lee // Allergy Asthma Immunol. Res. – 2011. - Vol. 3. - P. 168–177. 251 240. O’Shea, J.J. Signal transduction and Th17 cell differentiation / M. Scott Steward-Tharp, A. Laurence et al. // Microbes and Infection. - 2009. – Vol. 11. - P.599-611 241. O'Brien, M. Ghrelin in the human myometrium / M. O'Brien, E. Padraig, J. J. Morrison et al. // Reproductive Biology and Endocrinology. - 2010. - Vol. 8. – P. 55-66. 242. O'Connor, C.M. Alpha 1-Proteinase inhibitor, elastase activity, and lung disease severity in cystic fibrosis / C.M. O'Connor, K. Gaffney, J. Keane et al. // Am. Rev. Respir. Dis. - 1993. - Vol. 148, № 6. - P. 1665-1670. 243. Otero, M. Synergistic induction of nitric oxide synthase type II: in vitro effect of leptin and interferon-gamma in human chondrocytes and ATDC5 chondrogenic cells / M. Otero, J.J. Gomez Reino, O. Gualillo // Arthritis Rheum. - 2003. - Vol.48. - P. 404 - 409. 244. Ou, D. Beta-cell antigen-specific CD56(+) NKT cells from type 1 diabetic patients: autoaggressive effector T cells damage human CD56(+) beta cells by HLA-restricted and non-HLA-restricted pathways. / D. Ou, D.L. Metzger, X. Wang et al. // Hum. Immunol. - 2002. - Vol. 63. - P. 256-270. 245. Petersenn, S. Structure and regulation of the growth hormone secretagogue receptor / S. Petersenn // Minerva Endocrinol. - 2002. - Vol. 27. – P. 243-256. 246. Pletinckx, K. Role of dendritic cell maturity/costimulation for generation, homeostasis, and suppressive activity of regulatory T cells / K. Pletinckx, A. Döhler, V. Pavlovic, M.B. // Lutz Front Immunol. - 2011. - Vol. 2. – 39 P. 247. Probst-Kepper, M. FOXP3: required but not sufficient. the role of GARP (LRRC32) as a safeguard of the regulatory phenotype / M. Probst-Kepper, R. Balling, J. Buer // Curr Mol Med. - 2010. - Vol.10, № 6. – P. 533-539. 248. Procaccini, C. An oscillatory switch in mTOR kinase activity sets regulatory T cell responsiveness / C. Procaccini, V. De Rosa, M. Galgani, et al. // Immunity. - 2010. - Vol. 6. - P. 929-941. 249. Procaccini, C. Leptin-induced mTOR activation defines a specific molecular and transcriptional signature controlling CD4+ effector T cell responses / V. De 252 Rosa, M. Galgani, F. Carbone et al. // Journal of Immunology. - 2012. - Vol. 189. – P. 2941- 2953. 250. Puccetti, P. IDO and regulatory T cells: a role for reverse signalling and noncanonical NF-kappaB activation / P. Puccetti, U. Grohmann // Nat. Rev. Immunol. - 2007. - Vol. 7, № 10. – P. 817-823. 251. Rak-Mardyla, A. ERK 1/2 and PI-3 kinase pathways as a potential mechanism of ghrelin action on cell proliferation and apoptosis in the porcine ovarian follicular cells / A. Rak-Mardyla, E.L. Gregoraszczuk // J. Physiol Pharmacol.- 2010. - Vol. 61, № 4. – P. 451-458. 252. Refici, M.L. Fcgamma-receptor signaling augments the LPS-stimulated increase in serum tumor necrosis factor-alpha levels / M.L. Refici, D.W. Metzger, B.P. Arulanandam et al. //Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 2001. - Vol. 280. – P. R1037-1044. 253. Rissoan, M.C. Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation / M.C. Rissoan, V. Soumelis, N. Kadowski // Science. - 1999. Vol. 283. - P. 1183 - 1185. 254. Rocha, M. Physiologic estradiol levels enhance hypothalamic expression of the long form of the leptin receptor in intact rats / M. Rocha, C. Bing, G. Williams, M. Puerta // J. Nutr. Biochem. - 2004. - Vol. 15. - P. 328-334. 255. Rolle, L Cutting edge: IL-10-producing regulatory B cells in early human pregnancy / L. Rolle, M. Memarzadeh Tehran, A. Morell-García et al. // Am. J. Reprod. Immunol. - 2013. - Vol. 70- P. 448–453. 256. Roncador, G. Analysis of FOXP3 protein expression in human CD4+CD25+ regulatory T cells at the single-cell level / G. Roncador, P.J. Brown, L. Maestre et al. // Eur. J. Immunol. - 2005. - Vol.35. - P. 1681-1691. 257. Rosenbaum, M. Sexual dimorphism in circulating leptin concentrations is not accounted for by differences in adipose tissue distribution / M. Rosenbaum, A. Pietrobelli, J.R. Vasselli et al. // Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. – 2001. Vol. 25, № 9. – P. 1365-1371. 253 258. Rouet-Benzineb, P. Leptin counteracts sodium butyrate-induced apoptosis in human colon cancer HT-29 cells via NF-kappaB signaling / P. RouetBenzineb, T. Aparicio, S. Guilmeau et al. // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. P. 16495-16502. 259. Sagawa, N. Possible role of placental leptin in pregnancy: a review / N. Sagawa, S. Yura, H. Itoh et al. // Endocrine. - 2002. - Vol. 19, № 1. – P. 65-71. 260. Sagawa, N. Role of leptin in pregnancy-a review / N. Sagawa, S. Yura, H. Itoh et al. // Placenta. - 2002. – Supp. A23. – P. 80-86. 261. Saito, S. The balance between cytotoxic NK cells and regulatory NK cells in human pregnancy / S. Saito, A. Nakashima, S. Myojo-Higuma, A. Shiozaki // J. Reprod. Immunol.- 2008. - Vol.77. – P. 14-22. 262. Saito, S. What is the role of regulatory T-cells in the success of implantation and early pregnancy? / S. Saito, T. Shima, A. Nakashima et al. // J. Assist. Reprod. Genet. – 2007. – Vol. 24, № 9. – P. 379-386. 263. Saito, S. Regulatory T cells and regulatory natural killer (NK) cells play important roles in feto-maternal tolerance / S. Saito, A. Shiozaki, Y. Sasaki et al. // Semin. Immunopathol. - 2007. - Vol.29, №2. - P. 115-122. 264. Saito, S. Th1/Th2/Th17 and regulatory T-cell paradigm in pregnancy/ S. Saito, A. Nakashima, T. Shima, M. Ito // Am. J. Reprod. Immunol. - 2010.- Vol. 601, № 63. – P. 601- 610. 265. Sakaguchi, S. Regulatory T cells and immune tolerance / S. Sakaguchi, T. Yamaguchi, T. Nomura, M. Ono // Cell. - 2008. - Vol. 133. - № 5. – P. 775787. 266. Samstein, R.M. Extrathymic generation of regulatory T cels in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict / R.M. Samstein, S.Z. Josefowicz, A. Arvey et al. // Cell. – 2012. – Vol. 150, № 1. – P. 29-38. 267. Sánchez-Margalet, C. Role of leptin as an immunomodulator of blood mononuclear cells: mechanisms of action. / C. Sánchez-Margalet, J. MartínRomero, R. Santos-Alvarez et al. // Clin. Exp. Immunol. - 2003. - Vol. 133. - P. 11-19. 254 268. Sánchez-Margalet, V. Human leptin signaling in human peripheral blood mononuclear cells: activation of the JAK-STAT pathway / V. SánchezMargalet, C. Martín-Romero // Cell Immunol. – 2001. - Vol. 211, № 1. – P. 3036. 269. Sánchez-Margalet, V. Leptin receptor (Ob-R) expression is induced in peripheral blood mononuclear cells by in vitro activation and in vivo in HIVinfected patients / V. Sánchez-Margalet, C. Martín-Romero, C. González-Yanes et al. // Clin. Exp. Immunol. - 2002. - Vol. 129, № 1. – P. 119-24. 270. Santner-Nanan, B. Systemic increase in the ratio between Foxp3+ and IL17-producing CD4+ T cells in healthy pregnancy but not in preeclampsia / B. Santner-Nanan, M.J. Peek, R. Khanam, L. Richarts et al. // J Immunol. – 2009. V. 183, №11. - P. 7023-30. 271. Santos-Alvarez, J. Human leptin stimulates proliferation and activation of human circulating monocytes / J. Santos-Alvarez, R. Goberna, V. SánchezMargalet // Cell Immunol. - 1999. - Vol.194. - P. 6-11. 272. Sarraf, P. Multiple cytokines and acute inflammation raise mouse leptin levels: potential role in inflammatory anorexia / P. Sarraf, R.C. Frederich, E.M. Turner et al. // J. Exp. Med. - 1997. - Vol. 185. - P. 171 - 175. 273. Sasaki, Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+regulatory T cells in early pregnancy subjects and spontaneous abortion cases / Y. Sasaki, M. Sakai, S. Miyazaki et al. // Mol Hum Reprod. - 2004. - Vol. 10. - P. 347-353. 274. Sauer, S. T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR / S. Sauer, L. Bruno, A. Hertweck et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2008. - Vol. 105, № 22. – P. 7797-7802. 275. Schellekens, H. Taking two to tango: a role for ghrelin receptor heterodimerization in stress and reward / H. Schellekens, T.G. Dinan, J.F. Cryan // Front Neurosci. - 2013. - Vol. 7. – A. 148. 276. Segerer, S.E. The glycoprotein-hormones activin A and inhibin A interfere with dendritic cell maturation / S.E. Segerer, N. Müller, J. van den Brandt et al. // J. Reprod. Biol. and Endocrinol. - 2008. - Vol. 6, № 17 - P. 1-10. 255 277. Sivan, E. Leptin is present in human cord blood / E. Sivan, W.M. Lin, C.J. Homko et al. // Diabetes. - 1997. - Vol. 46, № 5. – P. 917-9. 278. Soares, J.B. Ghrelin, des-acyl ghrelin and obestatin: three pieces of the same puzzle / J.B. Soares, F. Leite-Moreira // Peptides. - 2008. - Vol. 29, № 7. – P. 1255-1270. 279. Somerset, D.A. Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD25+CD4+ regulatory T-cell subset / D.A. Somerset, Y. Zheng, M.D. Kilby et al. // Immunology. - 2004. - V. 112. - P. 38-43. 280. Soriano-Guillén, L. Ghrelin levels in obesity and anorexia nervosa: effect of weight reduction or recuperation / L. Soriano-Guillén, V. Barrios, A. CamposBarros, J. Argente // J. Pediatr. – 2004. - Vol. 144, № 1. – P. 36-42. 281. Souza-Moreira, L. Therapeutic effect of ghrelin in experimental autoimmune encephalomyelitis by inhibiting antigen-specific Th1/Th17 responses and inducing regulatory T cells Brain / L. Souza-Moreira, V. Delgado-Maroto, M. Morell et al. // Behavior and Immunity. - 2013, № 30 - P.54- 60. 282. Spencer, S.J. Ghrelin regulates the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and restricts anxiety after acute stress / S.J. Spencer, L. Xu, M.A. Clarke et al. // Biol. Psychiatry. – 2012. - Vol. 72, № 6. – P. 457-465. 283. de Souza, M.J. Fasting ghrelin levels in physically active women: relationship with menstrual disturbances and metabolic hormones / M.J. de Souza, H.J. Leidy, E. O'Donnell et al // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2004. Vol. 89. – P. 3536-3542. 284. Stenqvist, A.C. Exosomes secreted by human placenta carry functional Fas ligand and TRAIL molecules and convey apoptosis in activated immune cells, suggesting exosome-mediated immune privilege of the fetus / A.C. Stenqvis, O. Nagaeva, V. Baranov, L. Mincheva-Nilsson // J. Immunol. - 2013. - Vol. 191, № 11. – P. 5515-5523. 285. Sweeney, G. Leptin signalling / G. Sweeney // Cell. Signalling. - 2002. V.14. - P. 655. 256 286. Sаnchez-Pozo, C. Leptin stimulates the oxidative burst in control monocytes but attenuates the oxidative burst in monocytes from HIV-infected patients / C. Sаnchez-Pozo, J. Rodriguez-Bano, A. Dominguez-Castellano et al. // Clin. Exp. Immunol. - 2003. - Vol. 134. - P. 464-469. 287. Tanaka, M. Role of central leptin signaling in the starvation-induced alteration of B-cell development / M. Tanaka, T. Suganami, M. Kim-Saijo et al. // J. Neuroscience. - 2011. - Vol. 31, № 23. - P. 8373-8380. 288. Tang, Q. The Foxp3+ regulatory T cell: a jack of all trades, master of regulation / Q. Tang, J.A. Bluestone // Nat. Immunol. - 2008. - V. 9, №3. - P. 239-44. 289. Tartaglia, L.A. The leptin receptor / L.A. Tartaglia // J. Biol. Chem. - 1997. Vol. 272. - P. 6093-6096. 290. Tawadros, N. Facilitation of decidualization by locally produced ghrelin in the human endometrium / N. Tawadros, Salamonsen L.A., Dimitriadis E. Chen C.//Mol. Human Reprod. – 2007. - Vol.13. - No.7 – P. 483–489. 291. Tena-Sempere, M. Ghrelin as a pleotrophic modulator of gonadal function and reproduction / M. Tena-Sempere // Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab. 2008. - Vol. 4, № 12. – P. 666-74. 292. Tena-Sempere, M. Leptin in male reproduction: the testis paradigm / M. Tena-Sempere, M.L. Barreiro // Mol. Cell Endocrinol. - 2002. - Vol. 188, № 12. – P. 9-13. 293. Tena-Sempere, M. Roles of ghrelin and leptin in the control of reproductive function / M. Tena-Sempere // Neuroendocrinology. - 2007. - Vol. 86. - P.229241. 294. Tena-Sempere, M. Interaction between energy homeostasis and reproduction: central effects of leptin and ghrelin on the reproductive axis / M. Tena-Sempere // Horm. Metab. Res. - 2013. - Vol. 45. - P.919-927. 295. Tesmer, J.J. Molecular basis for P-site inhibition of adenylyl cyclase / J.J. Tesmer, C.W. Dessauer, R.K. et al. //Biochemistry. 2000. - Vol. 39, № 47. – P. 14464-14471. 257 296. Thornton, A.M. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production / A.M. Thornton, E.M. Shevach // J. Exp. Med. - 1998. - Vol. 188, № 2. – P. 287-296. 297. Tian, Z. Impaired natural killer (NK) cell activity in leptin receptor deficient mice: leptin as a critical regulator in NK cell development and activation / Z. Tian, R. Sun, H. Wei, B. Gao // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2002. -Vol. 298, № 3. - P. 297-302. 298. Tomasello, E. Mapping of NKp46(+) Cells in Healthy Human Lymphoid and Non-Lymphoid Tissues / E. Tomasello, N. Yessaad, E. Gregoire et al. // Front. Immunol. – 2012. - Vol. 3. – P. 344-358. 299. Tone, Y. Smad3 and NFAT cooperate to induce Foxp3 expression through its enhancer / Y. Tone, K. Furuuchi , Y. Kojima et al. // Nat. Immunol. – 2008. - Vol. 9, № 2. – P. 194-202. 300. Truitt, K.E. Stimulation of CD28 triggers an association between CD28 and phosphatidylinositol 3-kinase in Jurkat T cells / K.E. Truitt, C.M. Hicks, J.B. Imboden // J. Exp. Med. - 1994, №179. - P. 1071- 1076. 301. Tümer, C. Effect of ghrelin administration on phagocytic activity in acute cold-restraint stress exposed rats / C. Tümer, H.M. Bilgin, B.D. Obay et al. // Regul. Pept. - 2007. - Vol. 2-3. - P.113-117. 302. Uemura, Y. Role of human non-invariant NKT lymphocytes in the maintenance of type 2 T helper environment during pregnancy / Y. Uemura, M. Suzuki, T.Y. Liu et al. // Int. Immunol. - 2008. - Vol. 20, № 3. – P. 405-412. 303. Vacca, P. Origin, phenotype and function of human natural killer cells in pregnancy / P. Vacca, L. Moretta, A. Moretta, M.C. Mingari // Trends in Immunology. - 2011. - - Vol. 32, № 11. - P. 517-523. 304. van den Heuvel, M.J. Decline in number of elevated blood CD3(+) CD56(+) NKT cells in response to intravenous immunoglobulin treatment correlates with successful pregnancy / M.J. van den Heuvel, C.G. Peralta, K. Hatta et al. // Am. J. Reprod. Immunol. - 2007. - Vol. 58. – P.447-459. 258 305. van der Lely, A.J. Biological, physiological, pathophysiological, and pharmacological aspects of ghrelin / A.J. van der Lely, M. Tschöp, M.L. Heiman, E. Ghigo // Endocr. Rev. - 2004. - Vol. 25. – P. 426-457. 306. van der Velde, M. An age-dependent interaction with leptin unmasks ghrelin's bone-protective effects / M. van der Velde, B.C. van der Eerden, Y. Sun et al. // Endocrinology. – 2012. - Vol. 153, № 8. – P.3593-3602. 307. Veldhuis, J.V. Integrating GHS into the Ghrelin System / J.V. Veldhuis, C.Y. Bowers // Int. J. Pept. – 2010 - P. 879503 308. Vidal, C. Flow cytometry detection of platelet procoagulation activity and microparticles in patients with unstable angina treated by percutaneous coronary angioplasty and stent implantation / C. Vidal, C. Spaulding, F. Picard et al. // Thromb. Haemost. – 2001. - Vol. 86, № 3. – P.784-790. 309. Vidal, C. Parietaria pollinosis in an Atlantic area: clinical and palynological data / C. Vidal, A. Dopazo, M.J. Aira // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 2001. - Vol. 11, № 2. – P.107-111. 310. Voo, K.S. Identification of IL-17-producing FOXP3+ regulatory T cells in humans / K.S. Voo, Y.H. Wang, F.R. Santori et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2009. - Vol. 106, № 12. – P. 4793-4798. 311. Walker, M.R. Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25-T cells / M.R. Walker, D.J. Kasprowicz, V.H. Gersuk et al. // J. Clin. Invest.- 2003.- V.112.- P.1437-1443. 312. Wang, L. IL-6 induces NF-kappa B activation in the intestinal epithelia / L. Wang, B. Walia, J. Evans et al. // J. Immunol. - 2003. - Vol. 171. - P. 31943201. 313. Waring, P. Cell death induced by the Fas/Fas ligand pathway and its role in pathology / P. Waring, А. Müllbacher // Immunol. Cell Biol. – 1999. - Vol. 77, № 4. – P. 312-317. 314. Waseem, T. Exogenous ghrelin modulates release of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in LPS-stimulated macrophages through distinct 259 signaling pathways / T. Waseem, M. Duxbury, H. Ito et al. // Surgery. - 2008. - Vol. 143. - Р.334-342. 315. Watterson, K.R. Anorexigenic and orexigenic hormone modulation of mammalian target of rapamycin complex 1 activity and the regulation of hypothalamic agouti-related protein mRNA expression / K.R. Watterson, D. Bestow, J. Gallagher et al. // Neurosignals. - 2013. - Vol. 21, № 1-2. – P. 28-41. 316. Webster, S.J. Distinct Cell Death Programs in Monocytes Regulate Innate Responses Causes of Invasive Bacterial Disease Following Challenge with Common / S. J. Webster, M. Daigneault, M. A. Bewley et al. // The Journal of Immunology. - 2010. - Vol. 185. - P. 2968-2979. 317. Wegmann, T. Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a TH2 phenomenon? / T.G. Wegmann, H. Lin, L.Guilbert, T.R. Mosmann // Immunol. Today.- 1993. - Vol. 14, №7. Р.353-356. 318. Wilczynski, J.R. The characterization and role of regulatory T cells in immune reactions / J.R. Wilczynski, M. Radwan, J. Kalinka // Front Biosci. 2008 Jan 1. - Vol. 13. – P. 2266-2274. 319. Williams, Z. Inducing tolerance to pregnancy / Z. Williams // N. Engl. J. Med. – 2012. – Vol. 376, № 12. – P. 1159-1161. 320. Wrann, C.D. Short-term and long-term leptin exposure differentially affect human natural killer cell immune functions / C.D. Wrann, T. Laue, L. Hübner et al. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. – 2012. - Vol. 302, № 1. – P. 108116. 321. Wren, A.M. The novel hypothalamic peptide ghrelin stimulates food intake and growth hormone secretion / A.M. Wren, C.J. Small, H.L. Ward et al. // Endocrinology. - 2000 - Vol. 141. – P. 4325-4328. 322. Xie, Q. IL-17: a potential therapeutic target for rheumatoid arthritis / Q. Xie, S.C. Wang, J. Li // Clin Rheumatol. – 2012- №7 - Р.1145-1146. 260 323. Yamagishi, S.I. Leptin induces mitochondrial superoxide production and monocyte chemoattractant protein-1 expression in aortic endothelial cells by increasing fatty acid oxidation via protein kinase A / S.I. Yamagishi, D. Edelstein, X.L. Du et al. // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276, №. 27. – P. 25096– 25100. 324. Yamamoto, Y. Involvement of mannose receptor in cytokine interleukin1beta (IL-1beta), IL-6, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor responses, but not in chemokine macrophage inflammatory protein 1beta (MIP1beta), MIP-2, and KC responses, caused by attachment of Candida albicans to macrophages / Y. Yamamoto, T.W. Klein, H. Friedman // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 1077-1082. 325. Yanaba, K. A regulatory B cell subset with a unique CD1dCD5+ phenotype controls T cell-dependent inflammatory responses / K. Yanaba, J.-D. Bouaziz, K. M. Haas et al. // Immunity. - 2008. - Vol. 28, № 5. - P. 639–650. 326. Yang, S.P. Carvedilol, a new antioxidative beta-blocker, blocks in vitro human peripheral blood T cell activation by downregulating NF-kappaB activity / S.P. Yang, L.J. Ho, Y.L. Lin et al.// Cardiovasc. Res. - 2003. - Vol. 59. - P. 776-787. 327. Yi, H. The phenotypic characterization of naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T cells / H. Yi, Y. Zhen, L. Jiang et al. // Cell. Mol. Immunol. 2006. - Vol. 3. - P. 189-195. 328. Yildiz, B.O. Alterations in the dynamics of circulating ghrelin, adiponectin, and leptin in human obesity / B.O. Yildiz, M.A. Suchard, M.L. Wong et al. // Proc .Natl. Acad. Sci. U S A. – 2004. - Vol. 101, № 28. – P. 10434-10439. 329. Yip, L. Immunological aspects of pregnancy / L. Yip, J. McCluskey, R. Sinclair // Clin. Dermatol. – 2006. - Vol. 24, № 2. – P. 84-87 330. Zarkesh-Esfahani, H. High-dose leptin activates human leukocytes via receptor expression on monocytes / H. Zarkesh-Esfahani, A.G. Pockley, R.A. Metcalfe et al. // J. Immunol. - 2001. - Vol. 167. - P. 4593-4599. 261 331. Zarkesh-Esfahani, H. Leptin indirectly activates human neutrophils via induction of TNF-alpha / H. Zarkesh-Esfahani, A.G. Pockley, Z. Wu et al. // J. Immunol. - 2004. - Vol. 172. - P. 1809-1814. 332. Zenclussen, A.C. Adaptive immune responses during pregnancy / A.C. Zenclussen / Am J Reprod Immunol. – 2013. – Vol. 69, № 4. – P. 291-303. 333. Zeng, H. The interplay between regulatory T cells and metabolism in immune regulation / H. Zeng, H. Chi // Oncoimmunology. – 2013. - Vol. 2, № 11. – P. e26586. 334. Zhang, J.V. Obestatin, a peptide encoded by the ghrelin gene, opposes ghrelin's effects on food intake / J.V. Zhang, P.G. Ren, O. Avsian-Kretchmer et al. // Science. - 2005. - Vol. 310. - P. 996-999. 335. Zhao, Y. Expression of leptin receptors and response to leptin stimulation of human natural killer cell lines / Y. Zhao, R. Sun, L. You, C. Gao, Z. Tian // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2003. - Vol. 300. - P. 247-252. 336. Zheng, Y. Acquisition of suppressive function by activated human CD4+ CD25- T cells is associated with the expression of CTLA-4 not FoxP3 / Y. Zheng, C.N. Manzotti, F. Burke et al // J. Immunol. – 2008. - Vol. 181. - P. 1683-1691. 337. Zheng, X.L. Activation of apolipoprotein AI gene expression by protein kinase A and kinase C through transcription factor/ X.L. Zheng, S. Matsubara, C. Diao et al. //J. Biol. Chem.- 2000.-V. 275, №41.- P.31747-31754. 338. Zimmer, J. NK cells and Treg cells: a fascinating dance cheek to cheek / J. Zimmer, J.E. Andrès, F. Hentges // Eur. J. Immunol. - 2008. - Vol. 38. - P. 2942- 2945.
