диссертация Колачевой А.А. - институт биологии развития
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук На правах рукописи Колачева Анна Алексеевна РАЗВИТИЕ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ И КОМПЕНСАТОРНЫХ ПРОЦЕССОВ В НИГРОСТРИАТНОЙ СИСТЕМЕ У МЫШЕЙ 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, академик РАН Михаил Вениаминович Угрюмов Москва – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .........................................................................................12 1.1 Морфологическая организация дофаминергических систем мозга ..........................12 1.2. Нигростриатная дофаминергическая система ............................................................13 1.2.1 Морфологическая характеристика нигростриатной дофаминергической системы ..............................................................................................................................13 1.2.2. Функциональная характеристика дофаминергических нейронов нигростриатной системы .................................................................................................15 1.2.2.1 Синтез дофамина .........................................................................................................15 1.2.2.2 Запасание, выделение и обратный захват дофамина ...............................................20 1.2.2.3 Деградация дофамина..................................................................................................23 1.2.3 Регуляция дофаминергических нейронов нигростриатной системы .................24 1.2.4 Роль дофаминергических нейронов нигростриатной системы в регуляции моторного поведения .......................................................................................................25 1.3. Функциональная недостаточность нигростриатной системы при болезни Паркинсона ...........................................................................................................................27 1.3.1 Патогенез болезни Паркинсона..............................................................................28 1.3.2. Механизмы нейродегенерации при болезни Паркинсона ..................................30 1.3.2.1 Окислительный стресс ................................................................................................30 1.3.2.2 Глутатион и антиоксидантная система ......................................................................30 1.3.2.3 Нарушение работы митохондрий ...............................................................................32 1.3.2.4 Эндогенные токсины ...................................................................................................34 1.3.2.5 Fe2+ и нейромеланин ..................................................................................................35 1.3.2.6 Агрегация белков и убиквинтиновая система ..........................................................36 1.3.2.7 Воспалительный процесс ............................................................................................38 1.3.2.8 Апоптоз, некроз и аутофагия ......................................................................................39 1.3.3 Компенсаторные механизмы при болезни Паркинсона ......................................40 3 1.3.4. Экспериментальное моделирование болезни Паркинсона.................................41 1.3.4.1 Генетические модели...................................................................................................42 1.3.4.2 Нейровоспалительные модели ...................................................................................44 I.3.4.3 Нейротоксические модели ...........................................................................................45 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .................................................................................54 2.1. Животные и эксперименты ..........................................................................................54 2.1.1 Оценка активности тирозингидроксилазы ............................................................54 2.1.2 Ингибирование обратного захвата дофамина с помощью 2-метил-4-фенил1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-амина..........................................................................54 2.1.3 Инъекции регуляторного пептида Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) .......55 2.2 Взятие материала............................................................................................................55 2.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией ................................................................................................................................................58 2.4 Иммуногистохимия ........................................................................................................58 2.5 Световая микроскопия и анализ изображений ............................................................59 2.6 Полуколичественный анализ содержания тирозингидроксилазы в нейронах черной субстанции и в терминалях аксонов стриатума ................................................................60 2.7 Иммуноферментный анализ ..........................................................................................61 2.8 Статистическая обработка результатов .......................................................................62 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ .......................................................................................................63 3.1. Морфологическая характеристика и количественный анализ нигростриатной дофаминергической системы в контроле и в первые сутки после введения МФТП ....63 3.1.1 Морфологическая характеристика и количественный анализ тел дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции ....................63 3.1.2 Морфологическая характеристика и количественный анализ дофаминергических терминалей в дорсальном стриатуме ..........................................67 3.2. Функциональное состояние нигростриатной системы в контроле и в первые сутки после введения МФТП .........................................................................................................70 3.2.1 Содержание дофамина и 3,4-диоксифенилуксусной кислоты в компактной части черной субстанции .................................................................................................70 4 3.2.2 Концентрация дофамина и 3,4-диоксифенилуксусной кислоты в дорсальном стриатуме ...........................................................................................................................72 3.2.3 Соотношение содержания 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и содержанию дофамину в компактной части черной субстанции ......................................................73 3.2.4 Соотношение концентрации 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и концентрации дофамину в дорсальном стриатуме .......................................................74 3.2.5 Ферментативная активность тирозингидроксилазы в нигростриатной системе после введения МФТП .....................................................................................................75 3.2.6 Концентрация глиального нейротрофического фактора в черной субстанции и стриатуме ...........................................................................................................................77 3.3. Функциональная характерисуноктика отдельных дофаминергических нейронов нигростриатной системы в контроле и в первые сутки после введения МФТП ...............78 3.3.1 Внутриклеточное содержание тирозингидроксилазы в телах нейронов в компактной части черной субстанции ............................................................................78 3.3.2 Содержание тирозингидроксилазы в терминалях дофаминергических аксонах нигростриатной системы в дорсальном стриатуме .......................................................78 3.3.3 Активность тирозингидроксилазы в отдельном нейроне в компактной части черной субстанции и отдельной терминали в дорсальном стриатуме ........................79 3.3.4 Содержание дофамина в отдельном нейроне в компактной части черной субстанции после введения МФТП ................................................................................80 3.3.5 Концентрация дофамина в отдельной терминали аксона в дорсальном стриатуме после введения МФТП ..................................................................................81 3.4 Влияние ингибитора обратного захвата дофамина – номифензина на нигростриатную систему .....................................................................................................82 3.5 Влияние фрагмента адренокортикотропного гормона – Семакс на нигростриатную систему ..................................................................................................................................84 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ........................................................................87 4.1. Динамика дегенерации и функциональное состояние выживших дофаминергических нейронов нигростриатной системы после введения МФТП ........88 4.1.1 Методические предпосылки изучения динамики дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы .............................................88 5 4.1.2 Динамика дегенерации нигростриатных дофаминергических нейронов под действием МФТП .............................................................................................................90 4.2. Модель ранней клинической стадии болезни Паркинсона в период дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для поиска потенциальных нейропротекторов ........................................................................99 4.2.1 Доказательство возможности использования модели ранней клинической стадии болезни Паркинсона в перилж дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для поиска потенциальных нейропротекторов .............................................................................................................99 4.2.2 Использование модели ранней клинической стадии болезни Паркинсона в период дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для тестирования потенциальных нейропротекторов .........101 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ......................................................................................................................105 ВЫВОДЫ ............................................................................................................................... 106 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ...................................................................................................107 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .....................................................................................................108 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования и современное состояние проблемы Нарушение метаболизма дофамина (ДА) – одного из основных нейротрансмиттеров мозга, приводит к развитию тяжелого хронического заболевания – болезни Паркинсона (БП) [Agid, 1991; Bernheimer et al., 1973]. БП относится к социально значимым нейродегенеративным заболеваниям, к которым также относят болезнь Альцгеймера, хорею Гентингтона, рассеянный склероз и ряд других [Iskedjian, Einarson, 2003]. В последние годы данные заболевания получают все большее распространение, что связывают с загрязнением окружающей среды и увеличеснием продолжительности жизни, а кроме того наблюдается тенденция к «омоложению» данных заболеваний [Wirdefeldt et al., 2011]. Характерными особенностями патогенеза БП являются: (1) гибель дофаминергических (ДА-ергических) нейронов нигростриатной системы мозга и возникающий при этом дефицит ДА, приводящие к нарушению двигательной функции – тремору в конечностях или скованности движений (ригидности); (2) развитие заболевания в течение многих лет или даже десятилетий без проявления симптомов благодаря включению компенсаторных процессов; (3) появление первых симптомов нарушения двигательной (моторной) функции только после гибели порогового уровня нигростриатных ДА-ергических нейронов (более 50% тел нейронов) и истощения компенсаторных резервов мозга; (4) распространение нейродегенеративного процесса на многие отделы мозга и периферическую нервную систему, что сопровождается нарушением висцеральных (периферических) функций и соответствующей периферической (немоторной) симптоматикой. Диагностика БП возможна только после появления специфических симптомов, что обусловлено гибелью большей части ДА-ергических нейронов нигростриатной системы и истощением компенсаторных механизмов. В настоящее время существует лишь два метода регистрации функциональной недостаточности нигростриатной системы в стриатуме это позитронно эмиссионная томография (ПЭТ) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ). Однако данные установки не являются общедоступными в силу своей высокой стоимости. Более того, данные методы позволяют детектировать только функциональную недостаточность в стриатуме, что может происходить не только при БП, но при ряде других заболеваний, таких как болезни Гентингтона, мультисистемной атрофии, деменции с тельцами Леви и др. [Cheesman, 7 Piccini, 2004]. Это приводит к необходимости «дожидаться» появления специфических симптомов для окончательной постановки диагноза. После поставки диагноза начинается лечение пациентов с БП, которое направлено на повышение функциональной активности нигростриатной системы, что позволяет улучшить качество жизни больного максимум на 5 лет, после чего лечение становится менее эффективным и медикаментозной приводит дискинезии. к ряду проявлению Снижение эффективности таких осложнений, как лечения связывают с прогрессирующей деградацией нигростриатной системы, поскольку традиционная терапия не влияет на скорость гибели ДА-ергических нейронов. Поэтому в последнее время ведется активный поиск новых лекарственных веществ с нейропротекторными свойствами. Однако для этого необходима разработка максимально адекватных моделей БП на животных, которые воспроизводили бы основные особенности заболевания. Созданию таких моделей БП на грызунах и были посвящены более ранние исследования в нашей лаборатории. В результате экспериментов удалось разработать модель ранней клинической стадии БП с помощью предшественника нейротоксина 1метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропирида (МФТП) [Ugrumov et al., 2011]. При этом происходит пороговая деградация нигростриатной системы, а именно снижение количества тел ДА-ергических нейронов на 43% и уровня ДА в стриатуме на 75%, что сопровождается нарушением двигательной функции животных. Характеристика данной модели была дана спустя две недели после введения МФТП. Это позволило детально изучить компенсаторные процессы, развивающиеся при пороговом дефиците ДА в стриатуме, учитывая, что к этому времени нейродегенерация уже завершилась [Хакимова и др., 2010, 2011; Jackson-Lewis et al., 1995; Kurosaki et al., 2004; Aoki et al., 2009; Kozina et al., 2014]. С точки зрения фундаментальной нейрофизиологии до сих пор не исследованы сопряженные процессы, происходящие в мозге, а именно дегенерация ДА-ергических нейронов нигростриатной системы и компенсаторные процессы, направленные на ее замедление и восстановление и/или увеличение функциональной активности выживших нейронов. Немногочисленные исследования по изучению динамики дегенерации тел ДАергических нейронов нигростриатной системы при различных схемах введения МФТП носят фрагментарный характер, а результаты исследований противоречивы, что может быть связано с разными, порой неадекватными методическими подходами [Jackson-Lewis et al., 1995; Aoki et al., 2009]. Несмотря на очевидную актуальность исследования дегенерации терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме, учитывая, что именно с них начинается дегенерация ДА-ергических нейронов при БП, таких работ практически нет 8 [Coleman, 2005; Kuhn et al., 2003]. Исследований, где проводился бы комплесный анализ нигростриатной системы во время нейродегерации, а именно гибель ДА-ергических нейронов и их функционального состояния в этот период, крайне мало [Sundström et al., 1987; Jakowec et al., 2004; Kurosaki et al., 2004]. В то время как именно фундаментальные исследования нейродегенерации нигростриатной системы и компенсаторных механизмов, которые развиваются параллельно, позволят провести адекватный поиск и тестирование потенциальных нейпротектоорных веществ. Цель и задачи исследования Целью данного исследования являлось изучение развития нейродегенерации и компенсаторных процессов в нигростриатной дофаминергической системе при моделировании ранней клинической стадии болезни Паркинсона у мышей. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1. Определить период и скорость дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы после введения нейротоксина МФТП по количеству тел дофаминергических нейронов и терминалей их аксонов. 2. Оценить функциональное состояние выживших дофаминергических нейронов в стриатуме и черной субстанции после введения МФТП по следующим параметрам: - содержание дофамина и его метаболита; - внутриклеточное содержание тирозингидроксилазы; - активность тирозингидроксилазы. 3. Показать возможность клинической стадии использования болезни охарактеризованной Паркинсона в модели период ранней дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для потенциальных нейропротекторов с использованием: - ингибитора обратного захвата дофамина – номифензина; - индуктора увеличения экспрессии эндогенных ростовых факторов и активности антиоксидантной системы – Семакс. 9 Научная новизна работы Впервые охарактеризована модель ранней клинической стадии БП в период дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы как на уровне тел нейронов в ЧС, так и на уровне терминалей аксонов в стриатуме. Согласно полученным данным, период дегенерации терминалей ДА-ергических аксонов длиться до 14 часов, что намного превышает таковой для тел нейронов. Впервые показано, что функциональное состояние выживших тел ДА-ергических нейронов в ЧС полностью восстанавливается в течение первых 12 часов после введения МФТП, в то время как терминалей аксонов – только частично. Полученные данные свидетельствуют о том, что терминали аксонов в большей степени подвержены дегенерации и угнетенности функционального состояния после введения МФТП, чем тела ДА-ергических нейронов, что делает их более перспективными мишенями для поиска и тестирования потенциальных нейропротекторов. Впервые показана возможность использования охарактеризованной модели ранней клинической стадии БП в период дегенерации ДА-ергических нейронов для поиска и тестирования потенциальных нейропротекторов для замедления гибели нейронов. Практическая значимость работы Полученные данные способствуют углублению существующих представлений о патогенезе БП. В данной работе впервые дана комплексная характеристика морфофункционального состояния ДА-ергических нейронов в период дегенерации нигростриатной системы. Результаты выполненной работы могут найти практическое применение в экспериментальной нейрофизиологии и медицине. Показана высокая значимость терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме, как потенциальных мишеней для фармакотерапии. Доказана возможность использования охарактеризованной модели ранней клинической стадии БП в период дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для поиска потенциальных веществ с нейропротекторыми свойствами. 10 Положения, выносимые на защиту 1. Дегенерация ДА-ергических нейронов нигростриатной системы при моделировании ранней клинической стадии БП идет с различной динамикой в телах и отростков нейронов. 2. Функциональное состояние сохранившихся ДА-ергических нейронов нигростриатной системы при моделировании ранней клинической стадии БП полностью восстанавливается в телах и только частично в отростках нейронов. 3. Охарактеризованная модель ранней клинической стадии БП в период дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы может быть использована в качестве тест-системы для поиска потенциальных нейропротекторов. Степень достоверности и апробация результатов Основные материалы диссертации были представлены и обсуждены на российских и международных симпозиумах: конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 29-30 ноября 2012 г., 5-6 декабря 2013 г., 8-9 декабря 2014 г.); III конференция молодых ученых и студентов ИНФ РАМН (Москва, 29 ноября 2012 г.); Federation of European Biochemical Societies Congress 2013 ―Mechanism in Biology‖ (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013 г.); XXII Съезд Физиологического общества им. Н.П. Павлова (Волгоград, 16-20 сентября 2013 г.); Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга (Санкт-Петербург, 24-26 июня 2014 г.); VII International meeting ―From Molecular to Cellular Events in Human Pathologies‖ (Рига, Латвия, 17-20 октября 2014 г.); The 12th International Conference of Alzheimer & Parkinson’s disease AD/PD 2015 (Ницца, Франция, 18-22 марта 2015 г.). Публикации По теме диссертации опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах ВАК, 3 главы в коллективной монографии «Нейродегенеративные заболевания: от генома до целостного организма» и 10 – тезисов конференций. 11 Данная работа финансировалась из следующих грантов - Российский фонд фундаментальных исследований – ориентированные фундаментальные исследования 09-04-12106-офи_м; - Российско-французский проект РФФИ_НЦНИЛ_а 10–04–93108; - Российский фонд фундаментальных исследований – 13-00-40375-К КОМФИ; - Программа Президиума РАН ―Фундаментальные науки - медицине‖; - Российский научный фонд № 14-15-01122 (2014-2016 гг.); - Федеральная целевая программа ―Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 годы‖ (уникальный идентификатор проекта RFMEFI60414X0073). Структура и объем жиссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литеруры, включчающего 428 источника. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков и 10 таблиц. 12 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Морфологическая организация дофаминергических систем мозга Одним из основных нейротрансмиттеров и нейрогормонов центральной нервной системы (ЦНС), а также гормон симпато-адреналовой системы является ДА. На сегодняшний день выделяют 7 ДА-ергических систем в головном мозге млекапитающих, которые локализованы от среднего мозга до обонятельных луковиц, кроме того одна система расположена вне головного мозга, а именно в сетчатке глаза (рисунок 1). ДА-ергическая система среднего мозга одна из самых крупных систем и состоит из трех групп нейронов: ретрорумбальной (А8), нигростриатной (А9), вентральной тегментальной области (ВТО) (А10). Аксоны ДА-ергических нейронов групп А8 и А10 проецируются в прилежащее ядро, миндалевидное тело и обонятельный бугорок, входя в состав мезолимбической и мезокортикальной систем [Prakash, Wurst, 2006]. ДА-ергические нейроны, локализованные в ЧС (А9), образуют мощный нигростриатный тракт, заканчивающийся в дорсолатеральной части стриатума и участвуют в регуляции двигательной функции. В промежуточном мозге выделяют 4 группы ДА-ергических нейронов: задняя гипоталамическая (А11), туберальная (аркуатная) (А12), дорсальная гипоталамическая (А13) и передняя перивентрикулярная (А14) группы. ДА-ергические нейроны группы А11 локализованы в каудо-дорсальном гипоталамусе, и аксоны этих нейронов проецируются в нижележащие отделы головного мозга (ствол) и в спинной мозг, однако, функция этих нейронов до конца не ясна. Туберальная (аркуатная) (А12) и перивентрикулярная (А14) группы иннервируют срединное возвышение и осуществляют регуляцию секреции гормонов гипофиза через портальную систему циркуляции. ДА-ергические нейроны группы А13 локализованы в зоне инсерта и проекции этих нейронов распределены диффузно по разным отделам гипоталамуса и миндалевидного тела. Нейроны группы А15 локализованы в латеральной и вентральной частях гипоталамуса, а ДА-ергические нейроны группы А16 – в обонятельных луковицах, их проекции локальны и оканчиваются в перигломерулярных интернейронах. Группа нейронов А17 расположена в сетчатке глаза, также как и проекции группы А16, их аксоны короткие, которые иннервируют амакриновые интернейроны. 13 Рисунок 1 – Схема локализации групп дофаминергических нейронов в головном мозге крысы [Björklund, Dunnett, 2007] 1.2. Нигростриатная дофаминергическая система 1.2.1 Морфологическая характеристика нигростриатной дофаминергической системы Нигростриатная система состоит из ДА-ергических нейронов, тела которых локализованы в черной субстанции (ЧС) среднего мозга, а их аксоны проецируются в стриатум переднего мозга. Нигростриатный путь является самым крупным из четырех ДА-ергических путей и участвует в регуляции двигательной функции как часть двигательной петли базальных ганглиев. В качестве клеток-мишеней выступают глутамат- и γ-аминомасляная кислотаергические (ГАМК-ергические) нейроны, локализованные в стриатуме. ЧС состоит из трех частей: компактная, ретикулярная и латеральная. В компактной часть ЧС локализованы тела ДА-ергических нейронов, ретикулярная часть представлена их отростками (дендритами), а в латеральной части располагаются немногочисленные тела ДАергических нейронов, аксоны которых входят в состав мезолимбического и мезокортикального трактов [Fallon, Moore, 1978; Björklund, Dunnett, 2007; Fu et al., 2012]. Выделяют три популяции нейронов в компактной части ЧС. Первая популяция, наиболее многочисленная, представлена пирамидальными клетками, которые располагаются ближе к 14 вентральной поверхности компактной части ЧС. Обычно эти нейроны имеют несколько дендритов с расширениями, которые проецируются в ретикулярную часть ЧС. ДА-ергические нейроны данной популяции образуют нигростриатный тракт. Вторая популяция нейронов локализуется ближе к дорсальной поверхности компактной части ЧС, имеет веретенообразную форму и ее дендриты тянуться в латеральную и медиальную часть компактной части ЧС, т.е. не покидают ее пределов. Аксоны данных нейронов проецируются в передний мозг и кору головного мозга. Третья популяция наименее многочисленная и представлена небольшими нейронами, которые не имеют ДА-ергического фенотипа. По данным разных авторов их количество колеблется от 5% до 20 % и они представляют собой ГАМК-ергические и холинергические нейроны [Van Der Kooy, Carter, 1981; Hebb, Robertson, 2000]. Было показано, что эти нейроны также имеют проекции в стриатум, как и ДА-ергические нейроны, что позволяет предположить, что они также участвуют в регуляции работы базальных ганглиев, но истинная их функция до конца не ясна. Как было сказано выше, ДА-ергические нейроны компактной части ЧС проецируются в стриатум. У приматов стриатум состоит из двух структур: скорлупа и хвостатое ядро, в то время как у грызунов такого разделения нет. Стриатум подразделяется на 2 компонента: стриосомы и матрикс, который занимает 85% всего стриатума [Johnston et al., 1990; Nakamura et al., 2009]. Разделение этих компонентов основано на содержании разного количества белков в нейронах, так содержание ацетилхолинэстеразы, кальбиндина и соматостатина больше в матриксе, чем в стриасомах [Gerfen, 1992; Graybiel, Ragsdale, 1978; Gerfen, Young, 1988]. Также µ-опиодные рецепторы в большей степени представлены в стриосомах, чем в матриксе [Delfs et al., 1994; Minami et al., 1994; Arvidsson et al., 1995; Kaneko et al., 1995; Mansour et al., 1995; Ding et al., 1996; Nakamura et al., 2009]. Показано, что нейроны стриосом и матрикса иннервируются разными волокнами. К примеру, ДА-ергические нейроны, расположенные в дорсальной области компактной части ЧС, ВТО и ретрорубральнаой области, иннервируют матрикс, в то время как расположенные в вентральной области ЧС – стриосомы [Gerfen et al., 1987]. Подавляющее большинство нейронов в стриатуме представляют собой ГАМКергические нейроны средних размеров [Oertel, Mugnaini, 1984]. Это интернейроны, которые получают информацию от разных отделов мозга (ЧС, ВТО, ретрорубральной области, бледного шара и т.д.) и передают информацию в другие области мозга (ЧС, бледный шар, базальные ганглии и кора головного мозга). 15 1.2.2. Функциональная характеристика дофаминергических нейронов нигростриатной системы 1.2.2.1 Синтез дофамина Синтез ДА проходит в два этапа: аминокислота L-тирозин гидроксилируется в бензольном кольце до 3,4-дигидроксифенилаланин (L-ДОФА) при участии скоростьлимитирующего фермента тирозингидроксилазы (ТГ) и далее с помощью фермента декарбоксилазы ароматических L-аминокислот (ДАА) происходит синтез ДА (рисунок 2) [Nagatsu et al., 1964]. BH4 – тетрагидробиоптерин, q-BH2 – дигидроптеридин, L-ДОФА – 3,4дигидроксифенилаланин. Рисунок 2 – Схема синтеза дофамина Тирозингидроксилаза ТГ относится к семейству белков, в которое также входят гидроксилаза ароматических L-аминоксилот, фенилаланингидроксилаза и триптофангидроксилаза. Все эти ферменты осуществляют присоединение гидроксильной группы к ароматическому кольцу соответствующих аминокислот с участием кислорода, восстановленного биоптерина (BH4, кофермента) и атома Fe2+. У человека в результате альтернативного сплайсинга образуются четыре мРНК ТГ и соответственно четыре изоформы белка (рисунок 3). При этом все различия между этими изоформами сосредоточены в R-домене фермента [Daubner et al., 2012]. У грызунов присутствует только одна изоформа, которая по структуре ближе всего к 1 изоформе у человека 16 (TГ1 на рисунке 2), у большинства приматов представлены две изоформы ТГ [Daubner et al., 2012]. По структуре ТГ представляет собой тетрамономер с молекулярной массой около 60 кДА [Grima et al., 1985]. Каждый мономер состоит из трех доменов: С-концевой короткий домен (20 аминокислотных остатков), который осуществляет образование комплекса тетрамера. Средний каталитический домен (около 330 аминокислотных остатков) осуществляют связывание с ионами Fe2+. Атом Fe2+ удерживается в каталитическом центре с помощью двух остатков гистидина и одного остатка глутамата [Daubner, Piper, 1995]. N-концевой домен фермента (регуляторный (R-) домен), состоящий из примерно 150 аминокислотных остатков, содержит 4 специфических центра фосфорилирования по остаткам серина, через которые происходит регуляция активности фермента. Рисунок 3 – R-домены четырех разных изоформ тирозингидроксилазы человека [Daubner et al., 2011] В настоящее время третичная структура R-домена ТГ не кристаллизована из-за высокой подвижности этой части фермента. Однако, по аналогии с фенилаланингидроксилазой, структуру которой удалось кристаллизовать, была выдвинута гипотеза, что остатки серина в подвижной части R-домена, обретая отрицательный заряд за счет фосфорилирования при участии киназ, «отходит» от каталитического центра, тем самым открывая его для связывания с субстратом и увеличивая активность фермента [Kobe et al., 1997] (рисунок 4). На R-домене находится 4 остатка серина по которым происходят фосфорилирование с помощью протеинкиназ, а именно по положениям 8, 19, 31 и 40 аминокислот. При этом различные протеинкиназы фосфорилируют остатки серина в определенном положении (таблица 1). Например, ц-АМФ-зависимая протеинкиназа (PKA) фосфорилирует серин в 40 положении, в результате чего аффинность ТГ к катехоламинам, которые ингибируют фермент по принципу 17 обратной связи, снижается до 300 раз [Ramsey, Fitzpatrick, 1998]. При фосфорилировании остатки серина в 31 положении несколькими возможными киназами происходит снижение константы Михаэлиса (Km) для BH4. Каталитический центр (С-домен) представлен голубым цветом. R-домен представлен розовым цветом, а его подвижная часть – желтым цветом. Рисунок 4 – Гипотетический механизм активации тирозингидроксилазы при фосфорилировании остатков серина в R-домене [Daubner et al., 2011] Таблица 1 – Специфичность различных протеинкиназ к фосфорилированию серина в Rдомене тирозингидроксилазы [Daubner et al., 2011] Протеинкиназа Остаток серина Результат фосфорилирования PKA 40 Снижение ингибирования по типу обратной связи ERK1&2 31, в меньшей степени 8 Активация в 2 раза MAPLARPK-2 40, в меньшей степени 19 Снижение ингибирования по типу обратной связи Cdk5 31 Не известно CAMKII 19, в меньшей степени 40 Связывание с 14-3-3, активация (?) PRAK 19 Связывание с 14-3-3, активация (?) Увеличение активности ТГ также происходит с помощью аллостерической модуляции фосфолипидами, полианионами и гепарином, которые обратимо взаимодействуют с ферментом, снижая Km к BH4 [Kuczenski, Mandell, 1972; Katz et al., 1976; Lloyd, Kaufman, 1979]. Как упоминалось ранее, ингибирование ТГ осуществляется катехоламинами по принципу обратной связи («feedback inhibition»). Так, например, ДА взаимодействует с 18 активным центром ТГ, а именно с окисленным атомом Fe (Fe3+), что маскирует место связывания с BH4 [Martinez et al., 1993]. Также регуляция работы ТГ осуществляется на генетическом уровне. В первую очередь за счет увеличения скорости транскрипции и увеличения времени жизни зрелой мРНК ТГ [Fossom et al., 1992; Kumer, Vrana, 1996]. К регуляции на этапе транскрипции относят и альтернативный сплайсинг у приматов, что приводит к образованию четырех изоформ белка ТГ (рисунок 3). Функции этих изоформ не до конца ясны, однако, наибольшая активность в мозге приматов показана для 1 и 2 изоформ ТГ, при этом их регуляция за счет фосфорилирования идет в разной степени. Например, скорость фосфорилирования с помощью MAP-киназы распределяется следующим образом: TГ3 = TГ4 >TГ 1»TГ2 [Sutherland et al., 1993]. Декарбоксилаза ароматических L-аминокислот Второй фермент синтеза ДА – ДАА относится к семейству аспартатаминотрансфераз. ДАА катализирует декарбоксилирование L-ДОФА в ДА и 5-гидрокситриптофан в серотонин, а также в значительно меньшей степени других ароматических аминокислот, таких как тирозин, триптофан и фенилаланин до соответствующих аминов [Lovenberg et al., 1962]. ДАА представляет собой гомодимер, каждый мономер которого (480 аминокислотных остатков) состоит из трех доменов [Ichinose et al., 1989; Nasrin et al., 1992]. L-домен («large-domain») формирует центральный каркас из β-листов окруженный α-спиралями, а короткий С-концевой домен и N-концевой домен обеспечивают димеризацию фермента [Sandmeier et al., 1994; Burkhard et al., 2001]. В качестве кофермента выступает пиридоксаль-5’-фосфат (ПФ), предшественник витамина B6 [Ishii et al., 1996; Burkhard et al., 2001]. Пиридоксаль-5’-фосфат проникает в центральную нервную систему в виде пиридоксала, пиридоксина и пиридоксамина. Активный центр фермента находится «в глубине» гомодимера, в котором и происходит связывание с двумя молекулами ПФ (рисунок 5) [Ishii et al., 1996; Burkard et al., 2001]. После образования комплекса ПФ с ДАА образуется комплекс с субстратом с дальнейшим декарбоксилированием последнего. Большое количество исследований было проведено по определению сродства ДАА к различным субстратам, так для L-ДОФА Km составляет от 120 µМ до 620µМ, для 5гидрокситриптофана от 20 µМ до 490 µМ в зависимости от условий реакции и ткани [Lovenberg et al., 1962; Boomsma et al., 1986; Moore et al., 1996; Jebai et al., 1997; Verbeek et al., 2007]. Для других ароматических кислот Km значительно выше [Lovenberg et al., 1962], но их количество в ЦНС находится в следовых количествах. 19 N-домен представлен синим ветом, красным – C-домен и желтым – L-домен. Активный центр фермента представлен розовым цветом, белым цветом обозначен второй мономер в составе димера фермента. Рисунок 5 – Трехмерная структура декарбоксилазы ароматических аминокислот [Giardina et al., 2011] В мозге ДАА локализуется в серотонинергических, ДА-ергических, норадреналинергических (НА-ергических) нейронах, а также в популяции неаминергических нейронов – Днейронах [Ugrumov, 2013; Jaeger et al., 1984; Kitahama et al., 1990; Eaton et al., 1993; Kitahama et al., 2009]. Д-нейроны были обнаружены в гипоталамусе, стриатуме, переднем мозге и коре головного мозга [Kitahama et al., 2009]. Одной из предполагаемых функций этих нейронов является участие их в кооперативном синтезе моноаминов. Это было показано на примере синтеза ДА в медиобазальном гипоталамусе крыс [Ugrumov et al., 2014]. При этом L-ДОФА, синтезирующийся в ТГ-содержащих нейронах, выделяется в межклеточное пространство, откуда захватывается в нейроны, экспериссирующие ДАА, где происходит синтез ДА. Как регулируется синтез катехоламинов на уровне ДАА до конца остается не ясным. Большинство работ, направленных на исследование регуляции активности ДАА проведено с использованием различных ингибиторов или агонистов/антагонистов. Например, показано, что антагонисты Д1 и Д2 рецепторов (рецепторы к ДА) в стриатуме увеличивают активность ДАА [Zhu et al., 1992; Hadjiconstantinou et al., 1993], что позволяет предположить ингибирование активности фермента ДАА по механизму обратной связи. Кроме того было показано ингибирование фермента по механизму обратной связи для серотонина [Neff et al., 2006]. Ингибирование ДАА с помощью NSD-1015 приводит «компенсаторному» увеличению экспрессии мРНК ДАА и количества белка [Li et al., 1993]. По предположению авторов это также является проявлением механизма обратной связи, т.е. чем ниже активность фермента, тем сильнее/быстрее идет транскрипция и/или трансляция. В ряде работ был показано влияние 20 кофермента на уровень экспрессии белка. При дефиците витамина B6 у животных была показана сниженная активность ДАА [Rahman et al., 1982; Siow, Dakshinamurti, 1985]. При этом добавление пиридоксаль-5’-фосфата перед измерением активности ДАА не восстанавливало данный показатель до контрольного уровня, что свидетельствует об изменении активности самого фермента. Регуляция на транскрипционном уровне, вероятно, осуществляется за счет наличия двух разных промоторов гена ДАА с дальнейшим альтернативным сплайсингом мРНК, что дает две изоформы фермента ДАА. Данные изоформы предположительно имеют нейрональное и ненейрональное происхождение [Albert et al., 1992]. 1.2.2.2 Запасание, выделение и обратный захват дофамина После синтеза ДА транспортируется из цитоплазмы в специализированные секреторные везикулы, где его концентрация составляет примерно 0,1 М, что в 10-1000 раз выше, чем уровень в цитоплазме [Elsworth, Roth, 1997]. Транспорт ДА в везикулы является АТФзависимым процессом при участии везикулярного моноаминового транспортера (ВМАТ) 2-го типа. ВМАТ2 является неспецифическим транспортером большинства биогенных моноаминов, которые могут конкурировать с ДА за связывание с ВМАТ2. Транспорт ДА в везикулы может обратимо ингибироваться резерпином [Elsworth, Roth, 1997]. Необходимо отметить, что ДА может синтезироваться и высвобождаться не только из аксональных окончаний, но также и из дендритов, где нейротрансмиттер может храниться как в классических везикулах, так и в гладком эндоплазматическом ретикулуме [Elsworth, Roth, 1997]. В терминалях аксонов обнаружено три пула везикул ДА: два из них представляют синаптические пулы и один резервный. Первый – «легко выделяемый пул» везикул, находящихся в активной зоне, второй – подвижный синаптический пул, который поддерживает работу первого пула, и третий – большой резервный пул (несколько сотен везикул), который начинает выделяться только при истощении синаптических пулов. Размер синаптических везикул около 50 нм, в то время как секреторных везикул резервного пула свыше 100 нм. Объем легко выделяемого пула составляет 1-2%, 10-20% приходится на подвижный пул и 80-90% на резервный [Yavich, 1996; Kristensen et al., 1994; Rizzoli, Betz, 2004, 2005]. Высвобождение ДА в синаптическую щель происходит под влиянием потенциала действия. При деполяризации мембраны открываются селективные потенциал-зависимые кальциевые каналы и ионы Са2+ входят в клетку. Повешенное содержание ионов Са2+ запускает биохимический каскад реакций, что приводит к слиянию мембраны секреторных везикул с цитоплазматической мембраной ДА-ергического нейрона при участии SNARE-комплекса, и 21 выделению ДА в синаптическую щель [Kelly et al., 1993]. Функционально различают две части SNARE-комплекса, расположенные на цитоплазматической (t-SNARE) и везикулярной (vSNARE) мембранах. При повышении концентрации Ca2+ в клетке Ca2+-зависимый белок синтаксин меняет конформацию и вместе с белком SNAP-25 образует t-SNARE комплекс. В этот момент везикула подходит к t-SNARE, на мембране которой локализован белок синаптобревин (v-SNARE). Эти три белка, а также белок Munc 13-1 образуют единый комплекс, после чего везикула «подтягивается» к плазматической мембране с дальнейшим слиянием мембран и выбросом нейротрансмиттера в синаптическую щель. Физиологическое действие ДА в синаптической щели осуществляется через G-белокассоциированные рецепторы, которые можно разделить на две группы Д1 (Д1 и Д5) и Д2 (Д2, Д3 и Д4). Рецепторы в этих двух группах различаются по фармакологическим и биохимическим свойствам, а также по распределению в пределах ЦНС [Andersen et al., 1990; Niznik, Van Tol, 1992; Sibley, Monsma, 1992; Civelli et al., 1993; Vallone et al., 2002]. Рецепторы ДА обладают высокой гомологией по составу друг к другу: Д1 и Д5 – 79%, а Д2, Д3 и Д4 – 75% [Civelli, 1993]. Структура рецепторов сходна, они имеют 7 трансмембранных доменов, которые образуют гидрофобную щель с тремя внутри- и тремя внеклеточными петлями [Missale et al., 1998]. Основное различие между двумя типами рецепторов связано с механизмами, которые они запускают внутри клеток. Так, рецепторы Д1 типа активируют Gs белки, что, в свою очередь, через активацию аденилатциклазы приводит к увеличению уровня цАМФ (вторичного мессенджера). Д2 рецепторы связаны с Gi белками, активация которых приводит к ингибированию аденилатциклазы и снижению уровня цАМФ [Beaulieu, Gainetdinov, 2011]. Распределение на пресинаптической и постсинаптической мембранах двух этих типов рецепторов также разное: Д1 класс обнаружен в подавляющем большинстве на постсинаптической мембране, в то время как Д2 тип и на пост- и на пресинаптической мембранах, где участвует в ауторегуляции ДА-ергических нейронов [Sokoloff et al., 2006; Rondou et al., 2010]. Экспрессия Д1 рецепторов осуществляется на высоком уровне в нигростриатной, мезолимбической и мезокортикальной системах (стриатум, ЧС, обонятельные луковицы, амигдала и фронтальная кора) и на более низком уровне в гиппокампе, таламусе, гипоталамусе, мозжечке. Д5 рецепторы экспрессируются в небольших количествах в разных областях мозга, таких как в пирамидальных нейронах префронтальной, премоторной и цингулярной коры, а также в ЧС, гипоталамусе, гиппокампе и в зубчатых извилинах [Missale et al., 1988; Sokoloff et al., 2006; Beaulieu, Gainetdinov, 2011]. Высокий уровень экспрессии Д2 рецепторов был обнаружен в стриатуме, прилежащем ядре и обонятельном бугорке, а также в ЧС, ВТО, 22 гипоталамусе, а Д3 рецепторов – в стриатуме, ЧС, ВТО, гиппокампе. Д4 рецепторы, экспрессия которых находится на самом низком уровне, показаны во фронтальной коре, гиппокампе, гипоталамусе, ретикулярной части ЧС и таламусе [Missale et al., 1988; Rondou et al., 2010; Beaulieu, Gainetdinov, 2011]. Обратный захват ДА из синаптической щели осуществляется при участии Na+/Cl- – зависимого мембранного транспортера (ДАТ), физиологическая роль которого заключается в регуляции «нахождения» (количества и времени) нейромедиатора в синаптической щели. Перенос одной молекулы ДА сопряжен с транспортом двух атомов Na+ и одного атома Cl– через клеточную мембрану, который, в свою очередь, осуществляется за счет градиента, создаваемого Na+-K+-АТФазой [Krueger, 1990; Hitri et al., 1994]. ДАТ представляет собой мембранный переносчик с 12 трансмембранными доменами, у которого С- и N-концы находятся внутри клетки, и между третьим и четвертым доменом располагается большая внеклеточная петля [Amara, Kugar, 1993; Giros, Caron, 1993; Nirenberg et al., 1996]. Молекулярная масса ДАТ колеблется от 617 до 630 аминокислотных остатков в зависимости от гликозилирования на внеклеточной петле [Amara, Kuhar, 1993; Giros, Caron, 1993; Nirenberg et al., 1996]. Принято считать, что ДАТ функционирует в виде мономера, однако, в ряде работ был показано, что ДАТ также может функционировать в виде олигомеров [Torres at al., 2003; Sorkina et al., 2003]. Регуляция ДАТ посттрансляционных осуществляется изменений. Разные на уровне экспрессии протеинкиназы и гена фосфатазы и с помощью контролируют встраивание ДАТ в мембрану и его функциональные характеристики. Регуляция ДАТ может быть длительной с помощью хронических инъекций амфетамина, кокаина и др., а также короткой при участии различных факторов, например, таких как ДА [Zahniser, Doolen, 2001; Gulley, Zahniser, 2003; Kahlig, Galli, 2003; Mortensen, Amara, 2003]. Хроническое воздействие лигандов ДАТ приводит к повышению или понижению транспортера на клеточной мембране. Например, хроническое воздействие кокаина приводит к снижению экспрессии ДАТ и уменьшению его на плазматической мембране нейрона, что было показано и на грызунах и приматах [Cline et al., 1995; Kuhar, Pilotte, 1996; Zahniser, Sorkin, 2004; Mash et al., 2002]. Также введение амфетамина приводит к развороту ДАТ и ВМАТ 2 на мембране, что в итоге приводит к выделению ДА из везикул в синаптическую щель. 23 1.2.2.3 Деградация дофамина Деградация ДА обеспечивается двумя ферментами: моноаминоксидазой (МАО) и катехол-о-метилтрансферазой катехоламинов до (КОМТ). соответствующих МАО осуществляет альдегидов при дезаминирование участии всех кофактора флавинадениндинуклеотида [Meiser et al., 2013]. Альдегиды являются промежуточными продуктами, которые быстро окисляются/редуцируются в соответствующий спирт или кислоту (рисунок 6). МАО является внутриклеточным ферментом, располагающимся на внешней мембране митохондрий. Его распределение не ограничивается только ЦНС, где он представлен в нейронах и клетках глии, также он функционирует и на периферии. Однако его распределение неравномерно в ЦНС, например, в ДА-ергических нейронов ЧС содержание фермента ниже, чем в нейронах НА-ергических нейронах голубого пятна и серотонинергических ядра шва [Westlund et al., 1988]. Показано две изоформы фермента МАО-А и МАО-Б, которые кодируются разными генами [Johnston et al., 1968; Bach et al., 1988]. Существует видовое различие дезаминирования ДА в ЦНС с помощью МАО: для приматов деградация ДА происходит при участии МАО-Б, а у грызунов – МАО-А [Napolitano et al., 1994]. ДОФУК – дигидроксифенилуксусная кислота, МАО – моноаминоксидаза, КОМТ – катехоло-метилтрансфераза. Рисунок 6 – Схема деградации дофамина [Meiser et al., 2013] Второй фермент деградации ДА – КОМТ осуществляет Mg2+-зависимый перенос метильной группы от S-аденозилметионинана на гидроксильную группу катехоламина (рисунок 6) [Mannisto et al., 1992; Mannisto, Kaakkola, 1999]. КОМТ представлен двумя изоформами, 24 которые кодируются одним геном [Tenhunen et al., 1993]. В клетках глии представлена свободная форма, также как и в клетках периферии. В нейронах КОМТ представлен в мембранно-связанной формой с эндоплазматическим ретикулом. Данная форма фермента имеет более высокую аффинность и в большей степени участвует в деградации катехоламинов, таких как, ДА и НА, чем его свободная форма в клетках глии [Napolitano et al., 1994]. Содержание КОМТ выше в клетках периферических органов (почек и печени), однако, при сравнении количества фермента среди клеток ЦНС, то наибольшее его содержание обнаружено в клетках микроглии, мало в астроцитах и совсем нет в ДА-ергических нейронах ЧС у человека [Napolitano et al., 1994]. 1.2.3 Регуляция дофаминергических нейронов нигростриатной системы Регуляция ДА-ергических нейронов нигростриатной системы осуществляется путем ауторегуляции, а также за счет иннервации нейронов, экспрессирующих НА, ацетилхолин, серотонин и пептиды. Ауторегуляция ДА-ергических нейронов происходит через Д2-рецепторы по механизму отрицательной обратной связи. При сниженном количестве ДА в стриаутме и ЧС происходит активация синтеза ДА за счет увеличения содержания и активности ТГ, в то время как при повышении концентрации ДА происходят обратные процессы [Strecker et al., 1987]. ГАМК-ергические нейроны составляют 80-90% всех нейронов стриатума. Около 70% всех аксонов ГАМК-ергических нерйонов стриатума имеют синаптические контакты с аксонами ДА-ергических нейронамов в стриатуме, осуществляя тормозной контроль [Kubota et al., 1987]. Также было обнаружено, что ГАМК-ергические нейроны стриатума иннервируют ретикулярную часть ЧС, куда проецируются дендриты ДА-ергических нейронов нигростриатной системы [Yoshida, 1981]. Стриатум получает иннервацию от глутаматергических нейронов, расположенных в моторной и сенсорных областях новой коры. Глутамат, как возбуждающий нейромедиатор, регулирует спонтанную локомоцию. Показано, что на ДА-ергических нейронах нигрострианой системы есть рецепторы к глутамату (NMDA), а на глутаматергических кортикостриатных аксонах – рецепторы к ДА (Д2), что свидетельствует о взаимной регуляции систем [Paquet et al., 1997]. Холинергические интернейроны составляют незначительную часть нейронов стриатума (менее 5%). Данные нейроны имеют рецепторы Д2 и Д5, что свидетельствует о тормозной регуляции данных нейронов с помощью ДА. На ДА-ергических аксонах стриатума есть 25 никотиновые рецепторы к ацетилхолину, который стимулирует синтез ДА [Lichtensteiger et al., 1982]. Серотонинергические нейроны, расположенные в дорсальной и частично в медиальной части ядра шва, иннервируют ЧС. Стриатум в значительной мере иннервируется нейронами дорсальной части ядра шва и плотность аксонов серотонинергических нейронов значительна в стриатуме. Серотонин оказывает тормозное влияение на активность ДА-ергических нейронов через серотониновые рецепторы 2-го типа (5-НТ2- рецепторы) [Dray, 1981]. Субстанция П, нейропептид, синтезируется как в стриатуме, так и в ЧС, оказывая стимулирующее влияние на активность ДА-ергических нейронов нигростриатной системы [Glowinsky et al., 1982]. 1.2.4 Роль дофаминергических нейронов нигростриатной системы в регуляции моторного поведения Нигростриатная система входит в базальные ганглии, одна из функций которых – регуляция двигательной функции. Стриатум получает иннервацию из коры головного мозга и таламуса через глутаматергические аксоны, ДА-ергическую иннервацию от компактной части ЧС, серотонинергическую и норадренергическую иннервацию от ядра шва и голубого пятна ствола мозга соответственно. Нейроны стриатума делят на две группы по биохимическому составу и по различным проекциям этих групп. Первая группа нейронов представляет собой ГАМК-ергические нейроны, которые коэкпрессируют субстанцию П, их аксоны иннервируют внутреннюю часть бледного шара и ретикулярную часть ЧС и представляют собой прямой путь («direct pathway») регуляции двигательной функции (рисунок 7). Вторая группа нейронов, которые образуют так называемый непрямой путь («indirect pathway»), экспрессируют ГАМК как нейромедиатор и энкефалин, и их аксоны проецируются во внешнюю часть бледного шара [Graybiel, 1990; Albin et al., 1989; Alexander, Crutcher, 1990]. Во внешней части бледного шара локализуются ГАМКергические нейроны, которые иннервируют глутаматергические нейроны субталамического ядра, а те в свою очередь внутреннюю часть бледного шара и ретикулярную часть ЧС. Таким образом, во внутреннем сегменте бледного шара происходит «объединение» прямого и непрямого пути. ГАМК-ергические нейроны внутренней части бледного шара иннервирует глутаматергичесие нейроны глутаматергические аксоны. таламуса, а от таламуса сигнал идет в кору через 26 По прямому пути ДА-ергические аксоны через Д1 рецепторы активируют ГАМКергические нейроны стриатума, аксоны которых ингибируют ГАМК-ергические нейроны внутренней части бледного шара, что приводит к активации глутаматергических нейронов таламуса и активации моторной коры (рисунок 7). В случае непрямого пути ДА-ергические аксоны через Д2 рецепторы ингибируют ГАМК-ергические нейроны стриатума, что приводит к активации ГАМК-ергических нейронов внешней части бледного шара, которое ингибирует субталамическое ядро. Это приводит к ингибированию таламуса ГАМК-ергическими нейронами внутренней части бледного шара, и моторная кора не получает активационного стимула [Gerfen et al., 1990; Nambu et al., 2002]. Медиаторы: ДА – дофамин, ГАМК – гамма-аминомаслянная кислота, Глу – глутамат, СП – субстанция П, ЭНК – энкефалин. Ядра: БШв – внутренняя часть бледного шара, БШн – внешняя часть бледного шара, СТЯ – субталамическое ядро, ЧСк – компактная часть черная субстанция, ЧСр – ретикулярная часть черной субстанции. Рисунок 7 – Схема взаимодействия ядер базальных ганглиев через прямой и непрямой пути [Obeso et al., 2008] 27 Последние данные свидетельствуют об активации как прямого, так и непрямого путей при инициации движения [Cui et al., 2013; Isomura et al., 2013]. Однако было обнаружно, что подавляющее количество нейронов стриатума, участвующих в прямом пути, также иннервируют и внешнюю часть бледного шара, что свидетельствует о том, что прямой путь регулирует как себя, так и непрямой путь [Kawaguchi et al., 1990; Lévesque, Parent, 2005; Fujiyama et al., 2011, 2015]. 1.3. Функциональная недостаточность нигростриатной системы при болезни Паркинсона Болезнь Паркинсона (БП) – хроническое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, которое проявляется в нарушении двигательной функции, а именно брадикинезии (замедленность движений, затруднение инициации движений и т.д.), ригидности мышц, тремора покоя и постуральной неустойчивости. Помимо нарушений двигательной функции также отмечают вегетативные, когнитивные и другие расстройства. Распространѐнность БП составляет 1% среди людей старше 60 лет, а к 80 составляет уже 4% [Lees, 2002], при этом средний возраст появления клинических симптомов БП – 45-55 лет. В зависимости от этиологии выделяют: – первичный (идиопатический) паркинсонизм – БП и ювенильный паркинсонизм (раннее начало – 18-30 лет); – вторичный (симптоматический) паркинсонизм вследствие повреждения головного мозга из-за травмы, токсина, энцефалита, гипоксии и т.д.; – паркинсонизм, который развивается при других нейродегенеративных заболеваниях (хорея Гентингтона, деменция с тельцами Леви, мультисистемная атрофия и т.д.). Классификацию БП проводят по форме, стадии и темпу прогрессирования. В зависимости от характера симптомов выделяют акинетико-ригидную форму (преобладание ригидности и брадикинезии), дрожательную (преобладание тремора) и смешанную форму, которая составляет 60-70% случаев БП. Для определения стадии заболевания наиболее широкое распространение получила шкала Хен-Яра [Hoehn, Yahr, 1998]. Согласно этой шкале выделяют 5 стадий БП от отсутствия самостоятельного передвижения. нарушений двигательной функции до невозможности 28 1.3.1 Патогенез болезни Паркинсона Нарушение двигательной функции происходит из-за дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы, что приводит к разбалансировке прямого и непрямого путей регуляции двигательной функции [Bernheimer et al., 1973]. 5-10% от всех случаев БП относят к генетической форме, когда причина развития заболевания обусловлена мутациями, делециями, повторами в генах белков, таких как α-синуклеин, LRRK2, parkin, tau, DJ-1 и т.д. Это значит, что практически во всех случаях причина деградации нигрострианой системы не известна. Снижение количества ДА-ергических нейронов нигростриатной системы в норме при старении организма составляет примерно 5% за десятилетие [McGeer et al., 19898; Fearnley, Lees, 1991]. Появление характерных симптомов нарушения двигательной функции при БП наступает при деградации нигростриатной системы до порогового уровня, а именно при снижении концентрации ДА на 70-80% в стриатуме и дегенерации 50-60% ДА-ергических нейронов в ЧС, при сравнении с возрастным контролем. Существуют три гипотезы развития нейродегенеративного процесса в нигростриатной системе. Первая из них была выдвинута после открытия предшественника нейротоксина, аналога героина, МФТП, который вызывает селективную дегенерацию ДА-ергических нейронов с характерными для БП симптомами [Langston, 1989]. Согласно этой гипотезе, в раннем возрасте организм подвергается действию токсинов, приводящих к гибели части ДА-ергических нейронов в ЧС, что накладывается на естественную потерю ДА-ергических нейронов и приводит к достижению пороговой деградации к 60 годам (рисунок 8, оранжевая линия). Если данная гипотеза верна, то количество фагоцитарных клеток, коррелирующее с количеством погибших ДА-ергических нейронов незадолго до анализа, в ЧС на момент гибели пациента должно быть аналогичным таковому в возрастном контроле. Однако МакГир с соавторами [McGeer et al., 1988] показали, что у пациентов с БП количество фагоцитарных клеток в ЧС увеличено в 6 раз по сравнению с возрастным контролем. Вторая гипотеза предполагает, что в течение жизни происходит «ускоренная» дегенерация ДА-ергических нейронов (рисунок 8, фиолетовая линия), что приводит к более быстрому достижению порогового уровня, чем в норме (для нормы, если продолжить кривую до порогового значения, возраст составит больше 100 лет). Такое снижение может приводить к увеличению фагоцитарных клеток в два раза на момент гибели пациента с БП, однако, их количество оказалось намного больше [McGeer et al., 1988]. 29 Третья гипотеза, которая находит больше всего подтверждений, в том числе и по количеству фагоцитарных клеток в ЧС на момент гибели, предполагает, что патологический процесс начинается во взрослом состоянии, и гибель нейронов носит экспоненциальный характер. Скорость дегенерации в этом случае составляет 45% за десятилетие [McGeer et al., 1988; Fearnley, Lees, 1991]. Если предположить, что скорость дегенерации такая же на досимптомной стадии и экстраполировать это на кривую нормы, то получится, что дегенерация начинается за 5-10 лет до появления симптомов (рисунок 8, зеленая линия). Эту гипотезу также подтверждают данные, полученные с помощью ПЭТ и ОФЭКТ. Показано, что скорость снижения концентрации ДА в стриатуме у пациентов на симптомной стадии составляет 12% в год. Это значит, что если скорость потери ДА в стриатуме одинакова на досимптомной и ранней симптомной стадии, то начало снижения концентрации нейротрансмиссии начинается за 4-6 лет до проявления болезни. Однако, учитывая высокую пластичность мозга, вероятно, начало заболевания происходит за 5-10 лет до появления симптомов [Brooks, 1998; Fearnley, Количество ДА-ергических нейронов в ЧС, % от контроля Lees, 1991]. 100 80 60 40 Пороговый уровень 20 0 20 30 40 50 60 Возраст, год 70 80 Норма Ускоренная дегенерация в начале жизни Ускоренная дегенерация в течение всей жизни Ускоренная дегенерация в конце жизни Рисунок 8 – Схематичное представление возможных способов развития нейродегенеративного процесса, приводящих к БП [Dunnett, Björklund, 1999] 30 1.3.2. Механизмы нейродегенерации при болезни Паркинсона Механизм дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы интенсивно изучается в последние десятилетия. Значительный массив данных накоплен по активации различных патологических механизмов в нигростриатной системе при БП: нарушение работы митохондрий, образование эндогенных нейротоксинов, накопление ионов Fe2+ и нейромеланина, перегрузка ионами Ca2+ нейронов и недостаток функциональной активности антиоксидантной системы, нарушение работы протеасомной системы, агрегация белков, а также активация нейровоспалительного процесса [Agid, 1991]. Все эти процессы приводят к активации окислительного стресса в нейроне, что приводит к гибели нейрона (рисунок 9). 1.3.2.1 Окислительный стресс Развитие окислительного стресса в нейроне обусловлено разбалансировкой образования активных форм кислорода (АФК), азота, металлов – формированием высоко реактивных форм веществ и снижением активности (эффективности) антиоксидантной системой, т.е. нарушением «редокс-статуса» клетки [Dias et al., 2014]. Повышенный уровень АФК ведет к активации каскадных реакций Фентона и/или Габера-Вейса [Fenton, 1894]. АФК, такие как перекись водорода (H2O2), супероксид анион радикал (·О2) и гидроксил радикала (·OH), активно взаимодействуют с белками, липидами, ДНК, что приводит к нарушению структуры белков, липидному окислению и разрывам в ДНК, что впоследствии введете к гибели клетки [Andersen, 2004]. Посмертный анализ ткани ЧС пациентов с БП показал повышенный уровень окислительного стресса по сравнению с возрастным контролем. Была показана увеличенная концентрация железа, сниженный уровень глутатиона, увеличенное содержание продуктов липидного окисления, а также наличие повреждѐнных ДНК и белков [Dexter et al., 1989; Good et al., 1992; Sofic et al., 1992; Dexter et al., 1994; Sian et al., 1994; Yoritaka et al., 1996; Alam et al., 1997]. 1.3.2.2 Глутатион и антиоксидантная система В ответ на повышенный уровень АФК в нейроне должна активироваться антиоксидантная система, одним из основных компонентов которой является глутатион, за счет 31 восстановленного состояния его тиоловых групп. Глутатион отдает окисленному соединению электрон с протоном, образуя при этом глутатион-дисульфид. Однако в ДА-ергических нейронах нигростриатной системы уровень глутатиона в норме ниже, при сравнении с другими отделами мозга [Sian et al., 1994; Pearce et al., 1997]. При БП показано снижение содержание глутатиона в ЧС на 40% у пациентов по соотношению глутатиона и дисульфида глутатиона при сравнении с возрастным контролем [Perry, Yong, 1986; Jenner et al., 1992; Sian et al., 1994]. При этом в других отделах мозга такого снижения не происходит, что свидетельствует о специфическом снижении активности антиоксидантной системы в ДА-ергических нейронах [Sian et al., 1994]. АФК – активные формы кислорода. Рисунок 9 – Схематичное представление механизмов, приводящих к образованию окислительного стресса в дофаминергическом нейроне при БП [Dias et al., 2013] 32 1.3.2.3 Нарушение работы митохондрий Наибольшей уязвимостью к развитию окислительного стресса в нейроне выступают митохондрии, основная функция которых образование АТФ в процессе окислительного фосфорилирования, фосфорилирование т.е. обеспечения происходит в клетки результате (нейрон) работы энергией. Окислительное трансмембранных комплексов, обеспечивающих перенос электрона от НАДФ·Н к кислороду с образованием воды, при этом образуется протонный градиент на внутренней мембране митохондрий, который используется для синтеза АТФ. Помимо обеспечения клеток (нейронов) энергией, митохондрии также участвуют в других важных функциях клетки, таких как метаболизм липидов, аминокислот, метаболических путях – цикл Кребса, регуляция гомеостаза Ca2+, образование и регуляция АФК и запуск запрограммированной клеточной гибели. В нигростриатной системе характерно снижение активности I комплекса дыхательной цепи митохондрий в нигростриатной системе на 25-30% при БП при сравнении с возрастным контролем [Hattori et al., 1991; Schapira et al., 1990]. Снижение работы митохондрий при БП показано в коре головного мозга, а также на периферии: в мышцах, фибробластах и тромбоцитах [Keeney et al., 2006]. Однако при других нейродегенеративных заболеваниях (множественная системная атрофия) нарушений I комплекса в нигростриатной системе не показано, хотя обнаружено в других органах и тканях [Schapira et al., 1990]. Это значит, что нарушение I комплекса дыхательной цепи в нигростриатной системы является специфическим механизмом при нейродегенерации ДА-ергических нейронов при БП. Ингибирование I комплекса дыхательной цепи митохондрий у крыс более чем на 50% не приводит к нейродегенерации, но сопровождается значительным дефицитом АТФ [Davey, Clark, 1996]. Вероятно, снижение активности I комплекса и развитие дефицита АТФ недостаточно чтобы быть единственным механизмом нейродегенерации ДА-ергических нейронов при БП, но возможно этого достаточно для потери мембранного потенциала митохондрий, что может приводить к открытию митохондриальных пор. Это, в свою очередь, вызывает выход Ca2+ и цитохрома с в цитоплазму нейрона и активации запрограммированной клеточной гибели – апоптоза. Митохондриальная ДНК (мтДНК) накапливает изменения по мере старения организма, и при достижении порогового количества нарушений фенотип митохондрий изменяется, что приводит к ее дисфункции и деградации. Скорость накопления мутаций в митохондриях будет выше в тканях, где энергообразование идет более интенсивно, таких как мозг, мышцы, сердце. ДА-ергические аксоны нейронов нигростриатной системы образуют один из самых длинных 33 трактов в мозге, что требует дополнительного АТФ, при этом синтез ДА также сопряжен с образованием АФК. Было выдвинуто предположение, что причина специфичности деградации именно нигростриатных нейронов при развитии БП найдена, ведь именно в них скорость накопления мутаций мтДНК должна идти быстрее, чем в других нейронах [Franco-Iborra et al., 2015]. Однако в настоящее время не обнаружено специфических мутаций в мтДНК при БП, но показана зависимость развития заболевания от принадлежности людей к одной из гаплогрупп по ДНК митохондрий. Например, гаплогруппы J и K европейской популяции имеют повышенную резистентность к развитию БП, в то время как супергаплогруппа HV (в основном Ближний Восток) наоборот показывает повышенный риск развития заболевания [Hudson et al., 2013]. В пользу предположения участия мтДНК в развитии БП было показано наличие делеций в мтДНК в отдельных ДА-ергических нейронах нигростриатной системы при идиопатической форме БП [Bender et al., 2006]. Учитывая, что при БП нарушается работа I комплекса дыхательной цепи, что приводит к образованию АФК и нарушению мтДНК, невозможно сказать, что развивается в первую очередь. Для решения данного вопроса были использованы мутантные мыши с аминокислотной заменой (D257A) в экзонуклеазном II домене POLG (полимераза γ), что приводит к многочисленным делециям в мтДНК. У этих мышей было обнаружено увеличение количества делеций в мтДНК с возрастом до 40-60%, в том числе и в ДА-ергических нейронах нигростриатной системы. Аналогичное значение было показано для ДА-ергических нейронов нигростриатной системы при БП. Однако, несмотря на увеличение делеций в мтДНК у этих животных, не было обнаружено дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы и снижения функциональной активности митохондрий, более того, было показано ее усиление и увеличение синтеза ДА [Perier et al., 2013]. Кроме того, наличие делеций в мтДНК у этой линии мышей не приводит к развитию более тяжелой формы паркинсонизма при введении МФТП по сравнению с диким типом (C57BL/6) [Dai et al., 2014]. Вероятно, накопление делеций в мтДНК не является причиной развития БП, но, несомненно, участвует в нейродегенерации. Нарушение транскрипции мтДНК (нокаутные мыши по митохондриальному транскрипционного фактора А) приводит к снижению ДА в стриатуме с возрастом и нарушению двигательной функции мышей при сравнении с диким типом, C57BL/6 [Ekstrand et al., 2007]. В другой работе использовали мышей, экспрессирущих митохондриальные рестриктазы в ДА-ергических нейронах нигростриатной системы, которые делают двойные разрывы в мтДНК. У этих мышей была обнаружена дегенерация ДА-ергических нейронов в ЧС и снижение уровня ДА в стриатуме, сопровождающееся нарушением двигательной функции [Pickrell et al., 2011]. Наконец, Сандерс с соавторами [Sanders et al., 2014] показал, что наличие АП-сайтов (лишенных азотистых оснований) в мтДНК при БП может приводить к остановке 34 репликации и транскрипции, что в свою очередь может вызывать окислительный стресс в нейроне. Полученные данные показывают важность делеций, мутаций, разрывов в мтДНК в ДА-ергических нейронах нигростриатной системы как одного из потенциальных механизмов патогенеза БП. 1.3.2.4 Эндогенные токсины Эндогенные токсины, которые могут приводить к гибели ДА-ергических нейронов нигростриатной системы, в первую очередь образуются из-за нарушения метаболизма самого нейротрансмиттера – ДА. Например, при наличии Fe2+ и H2O2 образуется 6-гидроксидофамин (6-ГДА) из ДА. 6-ГДА один из самых распространенных нейротоксинов, с помощью которого моделируют БП на грызунах. Механизм действия 6-ГДА связан с ингибированием I комплекса дыхательной цепи митохондрий, что приводит к нарушению энергетического баланса клетки и образованию АФК, т.е. запуску окислительного стресса в нейроне. Так, 6-ГДА был обнаружен в моче у пациентов с БП [Andrew et al., 1993]. Другим эндогенным токсином, синтез которого происходит из ДА, является Nметил(R)салсолинол. Образуется N-метил(R)салсолинол при участии (R)салсолинол синтазы до образования (R)салсолинола и N-метил-трансферазы до N-метил(R)салсолинола. В качестве подтверждения гипотезы возможного участия (R)салсолинола и N-метил(R)салсолинола в патогенезе БП выступают данные о повышенной концентрации (R)салсолинола в моче и ликворе пациентов. Также было показано, что N-метил(R)салсолинол вызывает паркинсонизм у крыс [Moser, Kömpf, 1992; Naoi et al., 1996]. Механизм действия (R)салсолинола и Nметил(R)салсолинола сходен с действием 6-ГДА, они также ингибирует I комплекс дыхательной цепи митохондрий, приводя к нарушению энергетического баланса нейрона и образованию АФК. Учитывая специфическую гибель ДА-ергических нейронов нигростриатной системы при БП, самым простым объяснением является токсичность ДА. Показано, что концентрация ДА для оказания токсического действия должна быть достаточно высока: 300 мкМ in vitro и in vivo – 20 мкг/кг на ДА-ергические нейроны в ЧС [Filloux, Townsend, 1993; Burke et al., 2003]. Однако в последние два десятилетия была выдвинута новая гипотеза, что не сам ДА токсичен для ДАергических нейронах, а его метаболит – 3,4-дигидроксифенилацетальдегид (ДОПАЛ). ДОПАЛ вызывает дегенерацию ДА-ергических нейронов в дозе 50 нг, что превышает токсическое действие ДА в 4000 раз. ДОПАЛ образуется из ДА при участии МАО А, после чего либо окисляется альдегиддегидрогеназой до ДОФУК, либо восстанавливается альдегидредуктазой до 35 3,4-дигидроксифенилетанол (ДОФЕТ). Токсическое действие ДОПАЛ было показано как in vitro, так и in vivo [Mattammal et al., 1995; Burke et al., 2003, 2004; Panneton et al., 2010]. ДОПАЛ оказывает токсическое действие в ДА-ергических нейронах через окисление до хинонов и образование АФК, что ведет к окислительному стрессу и гибели нейрона [Marchitti et al 2007; Rees et al., 2009; Anderson et al., 2011; Goldstein et al., 2013]. Учитывая, что МАО А является митохондриальным ферментном, повышенное содержание цитозольного ДА должно приводить к увеличению концентрации ДОПАЛ. В качестве косвенного доказательства увеличенного содержания цитозольного ДА могут выступать данные, полученные Далле-Донн с соавторами [Dalle-Donne et al., 2008]. Согласно поученными ими результатам, в стриатуме пациентов с БП иммунореактивность на ВМАТ 2 снижается на 96%, а на ТГ – на 65%. Голдштейн с соавторами [Goldstein et al., 2011] показали повышенное соотношение ДОПАЛ к ДА в 5 раз в стриатуме больных. У пациентов с БП ДОПАЛ был обнаружен в ЧС, в то время как при других нейродегенеративных заболеваниях или у возрастного контроля он не определялся [Mettammal et al., 1993]. При этом активность альдегиддегидрогеназы, метаболизирующая ДОПАЛ, снижена в стриатуме, крови и в спинномозговой жидкости [Galter et al., 2003]. 1.3.2.5 Fe2+ и нейромеланин Восстановленные атомы железа (Fe2+), связанные с белком ферритином, проникают через трансферриновые каналы в нейроны [Youdim et al., 1993]. Высокая концентрация ионов Fe2+ обнаружена в ЧС и бледном шаре в головном мозге [Dexter et al., 1987]. В ДА-ергических нейронах нигростриатной системы ионы Fe2+ участвуют в синтезе ДА из L-ДОФА, отдавая один электрон. Это приводит к образованию высокореактивного Fe3+, который при отсутствии восстановителя может запускать каскадную реакцию Фентона образования АФК и окисления липидов. Ферретин является одним из основных белков, связывающий атомы Fe3+, и в норме связывает до 2000 атомов Fe3+. Показано, что с возрастом происходит снижение содержания Hцепи белка, которая содержит ферроксидазный сайт в ЧС. При БП было обнаружено повышенное содержание свободного Fe3+ в ЧС, стриатуме и бледном шаре [Dexter et al., 1991; Kosta et al., 2006]. В ДА-ергических нейронах отношение восстановленного Fe2+ к окисленному Fe3+ примерно 1:1, в то время как у пациентов с БП это отношение составляет 1:3 [Sofic et al., 1988]. Одним из путей детоксикации Fe3+ может являться связывание железа с нейромеланином. Нейромеланин образуется из ДА, и его роль в нейродегенерации и 36 нейропротекции не до конца ясны. Как было упомянуто выше, нейромеланин способен связывать ионы Fe3+, что обеспечивается двумя сайтами связывания, тем самым защищая нейрон от окислительного стресса при БП. С возрастом нейромеланин накапливается в ДАергических нейронах, что приводит к характерной окраске тел нейронов. Наибольшее содержание нейромеланина обнаружено в ДА-ергических нейронах в ЧС и ВТО, НА-ергических нейронах голубого пятна, а также в единичных нейронах, неравномерно локализованных по головному мозгу [Cowen, 1986; Foley, Baxter, 1958; Duffy, Tennyson, 1965; Matzuk, Saper, 1985; Zecca et al., 2008]. Одна из гипотез участия нейромеланина в патогенезе БП основывается на содержании нейромеланина в выживших ДА-ергических нейронах нигростриатной системы [Hirsch et al. 1988; Marsden 1983; Youdim et al. 1989]. Манн и Ятес отметили, что в ДА-ергических нейронах при БП содержание нейромеланина было снижено по сравнению с возрастным контролем до 60% [Mann, Yates, 1983; Zecca et al., 2002]. В другой работе был сделан вывод о повышенной уязвимости к нейродегенерации менее пигментированных ДА-ергических нейронов, чем нейронов, содержащих большее количество нейромеланина [Gibb, Lees, 1991]. Однако прямого доказательства участия нейромеланина в патогенезе БП нет, и эта гипотеза требует дальнейших исследований, особенно учитывая данные, что содержание нейромеланина в ДА-ергических нейронов нигростриатной системы и ВТО одинаковое, но последние не подвержены нейродегенерации [Kish et al., 1988; German et al., 1992; Halliday et al., 2005]. Накопление нейромеланина было обнаружено во внеклеточном пространстве при БП, что может свидетельствовать о возможной его роли в активации или поддержании нейровоспалительного процесса [Dias et al., 2013]. 1.3.2.6 Агрегация белков и убиквинтиновая система Основным морфологическим признаком БП, как спорадической, так и генетической форм заболевания, является распространение телец Леви в нейронах ЦНС, в том числе и в ДАергических нейронах нигростриатной системы [Braak et al., 2003, 2004]. Основным элементом телец Леви являются агрегированный белок α-синуклеин, а также нейрофиламенты, убиквитин и другие белки [Baba et al., 1998; Arima et al., 1999; Ishizawa et al., 2003; Paris et al., 2009]. Мутации в гене α-синуклеина, а также дупликация и трипликация приводят к развитию БП. В случае дупликации гена развивается более тяжелая форма заболевания, а при трипликации развитие начинается в молодом возрасте (до 40 лет) [Siggleton et al., 2003; ChartierHarlin et al., 2004; Hope et al., 2004]. 37 α-Синуклеин представляет собой белок с молекулярной массой 19 кДа (140 аминокислотных остатков), который локализован в основном в аксонах и пресинаптических окончаниях нейронов [Shults, 2006]. Белок состоит из трех доменов: N-концевой участок (1-65 аминокислотные остатки) участвует во взаимодействии с липидами, а также способен образовывать структуру α-спиралей, центральный гидрофобный участок (основания 66-95) включает склонную к агрегации NAC-последовательность (―non-amyloidcomponent‖) и С-конец (96-140) имеет несколько сайтов фосфорилирования, а также домен отвечающий за шаперонную активность белка [Lee et al., 2002; Recchia et al., 2004]. На сегодняшний день функция α-синуклеина остается неясной, однако, имеются данные, что он взаимодействует с липидами и локализуется в пресинаптических окончаниях нейронов, что позволяет сделать предположение о его роли в регуляции везикулярного пула [Abeliovich et al., 2000; Cabin et al., 2002]. Также показано, что α-синуклеин может выступать в роли шаперона для белков SNARE-комплекса, которые непосредственно вовлечены в процесс выброса нейромедиатора в синаптическую щель [Burré et al., 2010]. Предполагается, что α-синуклеин существует в двух равновесных состояниях в свободной и мембраносвязанной. В свободной форме он представляет собой растворимый белок без определенной упорядоченной структуры, при связывании с мембраной он приобретает структуру α-спирали [Bisaglia et al., 2009]. Также показано, что α-синуклеин может формировать тетрамеры, которые образуют поры в мембране [Bartels et al., 2011; Trexler, Rhoades, 2012; Westphal, Chandra, 2012]. При БП были обнаружены разные конформации белка: мономеры без определенной структуры или в виде α-спиралей и бета-листов, димеры, олигомеры, фибриллы и конечный этап агрегации белка – тельца Леви. В настоящее время принято считать, что образование телец Леви носит нейропротекторный характер, предотвращая токсический эффект растворимых олигомеров [Li et al., 2005]. Распространение «неправильно» уложенного α-синуклеина между нейронами может происходить по прион-подобному механизму. При этом «неправильно» уложенный белок, проникая в другие нейроны, инициирует переход из «правильной» конформации в «неправильную» [Marques, Outerio, 2012]. Кроме того, α-синуклеин, распространяясь по нейронам активирует воспалительный процесс. Было показано, что окисленные продукты ДА ингибируют переход из олигомеров и протофибрилл в фибриллы α-синуклеина, что приводит к накоплению токсических для ДАергических нейронов форм белка. При этом добавление антиоксидантов приводит к снижению содержания фибрилл [Conway et al., 2001; Chinta, Andersen, 2008]. Локализация α-синуклеина не ограничивается цитоплазмой, он показан также во внутренней мембране митохондрий ДА-ергических нейронов ЧС. При этом его уровень во 38 фракции митохондрий был выше у пациентов с БП, чем у возрастного контроля [Devi et al., 2008]. Связываясь с мембраной митохондрий, α-синуклеин запускает выделение цитохрома с в цитоплазму, что приводит к увеличению содержания АФК и Ca2+-зависимому запуску апоптоза [Hashimoto et al., 1999]. Одной из причин накопления неправильно свернутого белка α-синуклеина может быть нарушение работы убиквитин-протеасомной системы, основного пути деградации неправильно уложенных или поврежденных белков [Olanow, McNaught, 2006]. При окислительном стрессе, когда содержание окисленных белков повышается в нейроне, активность данной системы рассматривается как защитный механизм. Также при деградации белков образуются аминокислоты, которые могут выступать как антиоксиданты. При исследовании генетических форм БП были обнаружены две мутации в убиквитинпротеасомной системы, которые приводят к развитию БП: паркин (Е3 лигаза ) и убиквитин Сконцевая гидролаза L1 (UCH-L1) [Olanow, McNaught, 2006]. В случае спорадической формы БП, вероятно, вначале запускается окислительный стресс в нейроне, который негативно влияет на работу убиквитин-протеосомной системы, что повышает уязвимость ДА-ергических нейронов нигростриатной системы. Так, например, ингибирование комплекса I дыхательной цепи митохондрий и накопление α-синуклеина приводят к снижению активности убиквитинпротеасомной системы. В ДА-ергических нейронах нигростриатной системы пациентов с БП были обнаружены структурные изменения протеасом, включая потерю α-субъединицы компонента, который регулирует и стабилизирует протеасомный комплекс [McNaught et al., 2003; Tofaris et al., 2003]. 1.3.2.7 Воспалительный процесс При БП помимо гибели ДА-ергических нейронов в ЧС была обнаружена активация глии, которая играет ключевую роль в развитии иммунного ответа в ЦНС [Block, Hong, 2005; Nagatsu, Sawada, 2005]. Клетки глии, находясь в активном состоянии, с одной стороны являются источником супероксида и оксида азота, которые могут запускать окислительный и азотный стресс в окружении нейронов, и, соответственно, нейродегенерацию, выбрасывая токсические вещества (глутамат). С другой стороны, клетки глии могут способствовать «выживанию» нейрона за счет увеличения экспрессии нейроторофических факторов (глиальный нейротрофический фактор) или синтеза антиоксидантов, таких как глутатитон. Первые доказательства наличия нейровоспаления при идиопатической форме БП были получены МакГир с соавторами [McGeer et al., 1988], которые обнаружили в ЧС клетки, 39 иммунореактивные на гликопротеины II класса главного комплекса гистосовместимости (HLADR), что позволило определить фагоцитированные ДА-ергические нейроны микроглией. Показано, что при БП происходит увеличение содержания ферментов, цитокинов в ЧС, которые участвуют в воспалительном процессе, таких как интерлейкин-1 бета, интерферон-γ, фактор некроза опухоли (ФНО), циклооксигеназа-1 и -2, а также синтазу оксида азота [Hirsch et al., 1988; Mogi et al., 1994: Knott et al., 2000; Tansey et al., 2007]. Эти вещества связываются либо напрямую с рецепторами, которые запускают гибель клеток, либо действуют опосредованно через образование АФК, вызывая тем самым дисфункцию митохондрий и гибель клеток [Ferrari et al., 2006]. Одной из главных задач изучения роли воспалительного процесса при развитии БП, является поиск первопричины: дегенерация нейронов приводит к развитию воспалительного процесса или воспалительный процесс приводит к дегенерации нейронов в ЧС [Hirsch et al., 1998]. 1.3.2.8 Апоптоз, некроз и аутофагия В настоящее время, несмотря на большой массив накопленных данных о процессах, которые приводят к гибели ДА-ергических нейронов нигростриатной системы при БП, вопрос о механизме гибели клеток (апоптоз, некроз или аутофагия) остается открытым. Апоптоз – основной тип регулируемой программированной гибели клеток, который характеризуется конденсацией хроматина, ядра и цитоплазмы с их последующей фрагментацией с образованием апоптотических телец. Эти тельца фагоцитируют макрофаги, что не сопровождается явно выраженной иммунной реакцией [Clarke, 1990; Kerr et al., 1972]. Специфичным биохимическим маркером апоптоза является активация протеаз из семейства каспаз. После их активации запускается каскад реакций, приводящий к расщеплению ДНК, рибосомальной РНК и белков, потере мембранного потенциала митохондрий и высвобождению цитохрома с из них [Van Cruchten, Van Den Broeck, 2002]. Существует два типа активации каспаз: внтуриклеточный, активирующий эндогенные механизмы индукции апоптоза, и внешний – активация рецепторов смерти TNRF (tumor necrosis factor receptors) при взаимодействии с соответствующими лигандами [Helson et al., 1975; Beutler, Cerami, 1986]. Аутофагия – второй тип программированной клеточной гибели, для которого характерно образование аутофагосом, двухслойные мембранные образования, внутри которых находится клеточный материал, подвергающийся деградации [Ogier-Denis, Codogno, 2003; Levine, Klionsky, 2004]. Аутофагия отличается от апоптоза несколькими признаками: на поздних стадиях гибели наблюдается пикноз ядра, отсутствует деградация ДНК до 40 нуклеосомного уровня, наличие аутофагосом, повышенная лизосомальная активность и отсутствие активных каспаз. Для аутофагии также не характерен воспалительный процесс [Clarke, 1990]. Некроз сопровождается увеличением клетки, органелл с дальнейшим разрывом клеточной мембраны и потерей внутреклеточного содержания клетки. Ядро до терминальной стадии выглядит целостным с уплотнением хроматина. Важной особенностью некроза является активация воспалительного процесса [Holler et al., 2000]. Часть работ показывает наличие признаков апоптоза в нигростриатной системе при БП [Mochizuki et al., 1996; Tompkins et al., 1997; Kingsbury et al., 1998]. В то время как в других работах не показано наличия основного признака апоптоза в ДА-ергических нейронах в ЧС, а именно фрагментации ДНК [Kösel et al., 1997; Banati et al., 1998; Jellinger, 1999a; Graeber et al., 1999]. Интересно, что на одном посмертном материале в области ЧС были обнаружены погибающие клетки по пути и апоптоза и аутофагии, в то время как некроз был обнаружен только в клетках глии, но не в ДА-ергических нейронах. При этом погибающие нейроны не содержали тельца Леви, которые были показаны только в выживших нейронах ЧС [Anglade et al., 1997]. В качестве доказательства того, что апоптоз является основным механизмом гибели ДА-ергических нейронов в нигростриатной системе при БП, выступают данные о наличии активной каспазы 3, основного индуктора апоптоза [Anglade et al., 1997; Hartmann et al., 2000]. 1.3.3 Компенсаторные механизмы при болезни Паркинсона Параллельно с дегенерацией ДА-ергических нейронов нигростриатной системы при БП происходит развитие компенсаторных механизмов, которые направлены на возмещение дефицита ДА в стриатуме. Компенсаторные механизмы принято делить на два типа: быстрые и медленные [Zigmond, 1997; Zigmond, Stricker, 1989]. К быстрым механизмам относят: - увеличение активности синтеза ДА за счет повышения активности скоростьлимитирующего фермента синтеза ДА – ТГ, а также увеличение оборота ДА, как отношение метаболит/нейротрансмиттер (ДОФУК/ДА) [Agid et al., 1973; Bernheimer et al., 1973; Hefti et al., 1980; Pifl and Hornykiewicz 2006]; - увеличение высвобождения ДА из ДА-ергических нейронов, особенно из терминалей аксонов в стриатуме, что связывают с уменьшением аутоингибирования через Д2-рецепты на мембране [Snyder et al., 1990]; 41 - снижение скорости обратного захвата в ДА-ергические нейроны из синаптический щели за счет уменьшения количества ДАТ на мембране [Zigmond et al.,1989]. К медленным компенсаторным механизмам относят: - повышение содержания ТГ за счет увеличения синтеза мРНК и белка фермента [Masserano and Weiner, 1983; Zigmond et al.,1989]. Однако на посмертном материале было показано снижение содержания мРНК и белка ТГ при БП, но исследователи в первую очередь связывают это с применением препаратов, содержащих L-ДОФА [Javoy-Agid et al., 1990; Kastner et al., 1993]; - повышение чувствительности клеток-мишеней к ДА в стриатуме за счет увеличения количества рецепторов на их мембране [Bokobza et al., 1984; Rinne et al., 1985; Pierot et al., 1988]. Таким образом, при БП происходит гибель ДА-ергических нейронов нигростриатной системы, что приводит к специфическим нарушениям двигательной функции. Нейродегенерация нигростриатной системы сопровождается образованием АФК, накоплением агрегатов белка α-синуклеина и активацией воспалительного процесса. Однако основные результаты, приведшие к этим выводам, получены на посмертном материале. Это означает, что заболевание находилось на терминальной стадии: подавляющая часть ДА-ергических нейронов погибла, и компенсаторные механизмы пластичности мозга истощены. Единственным вариантом изучения функционального состояния нигростриатной системы прижизненно при БП является ПЭТ или ОФЭКТ, однако данные методы имеют свои ограничения. Альтернативным способом изучения функционального состояния ДА-ергических нейронов при нейродегенерации нигростриатной системы является моделирования заболевания на животных. 1.3.4. Экспериментальное моделирование болезни Паркинсона С помощью моделирования БП на животных изучаются механизмы пластичности в центральной и периферической нервной системе, гибели ДА-ергических нейронов нигростриатной системы, осуществляется поиск триггеров перехода из доклинической стадии заболевания в клиническую, а также поиск биомаркеров в крови, которые позволят диагностировать заболевания на досимптомной стадии. С помощью моделей БП на животных проводят разработку превентивной терапии, направленной на замедление нейродегенерации, контролирование нейропластичности. Учитывая, что у животных не происходит развития нейродегенеративных заболеваний с возрастом, для моделирования БП используют либо токсины (токсические модели), либо 42 генетически модифицированных животных (генетические модели) (рисунок 10). Использование экспериментальных моделей целесообразно, если они максимально приближены к патогенезу БП, поэтому они должны воспроизводить характерные особенности этого заболевания: прогрессирующую дегенерацию ДА-ергических нигростриатных нейронов, сопровождающуюся возникновением дефицита ДА в стриатуме; нарушение моторного поведения при достижении порогового уровня деградации нигростриатной ДА-ергической системы; наличие в нервной ткани агрегатов α-синуклеина в виде телец Леви; наличие воспалительного процесса в нервной ткани; системный характер БП - распространение нейродегенеративного процесса по мозгу и на периферическую нервную систему. БП – болезнь Паркинсона, 6-ГДА – 6-гидроксидофамин, МФТП – 1-метил-4-фенил-1,2,3,6тетрагидропиридин. Рисунок 10 – Схематичное представление моделирования БП 1.3.4.1 Генетические модели В настоящее время известны гены, имеющие отношение (приводящие к развитию БП или увеличивающие риск заболевания) к паркинсонизму: ген α-синуклеина, гены DJ-1, LRRK2, Parkin, UCH-L1, PINK1. 43 Модели на основе модификации гена α-синуклеина Первые мутации при БП были обнаружены в гене, кодирующем α-синуклеин: А30Р, А53Т, Е46К [Polymeropoulos et al., 1996, 1997]. Увеличение экспрессии гена (дупликация или трипликация не мутированного гена) также является причинной развития заболевания [Singleton et al., 2003; Chartier-Harlin et al., 2004]. К факторам, повышающим риск развития БП, относится полиморфизм в промоторе α-синклеина [Maraganore et al., 2006]. Мыши с нокаутом гена α-синуклеина проявляют меньшую активность в открытом поле и у них снижено содержание ДА в стриатуме [Chandra et al., 2004]. Повышенная экспрессия αсинуклеина приводит к патологическим отклонениям в структурах мозга, в том числе в нигростриатной системе, что сопровождается нарушением поведения [Richfield et al., 2002; Rockenstein et al., 2002]. Наличие мутаций (одной или двух) в гене α-синуклеина не приводит к гибели ДАергических нейронов, однако, при двойной мутации А30Р + А53Т происходит накопление белка в телах ДА-ергических нейронов [Dawson et al., 2010; Matsuoka et al., 2001]. У трансгенных мышей, экспрессирующих дважды мутированный ген человеческого hm2α-синуклеина, под промотором ТГ крысы, происходит прогрессивное уменьшение плотности ДАТ и содержания ДА в стриатуме с возрастом [Richfield et al., 2002]. У этих мышей также постепенно снижаются спонтанная двигательная функция [Richfield et al., 2002; Thiruchelvam et al., 2004]. Модели на основе модификации гена LRRK2 Самыми распространенными мутациями аутосомно-доминантной формы БП являются мутации в гене LRRK2, которые также обнаруживаются в 4% случаев при спорадической форме БП [Paisan-Ruiz et al., 2004; Zimprich et al., 2004]. LRRK2 (лицин-богатая киназа 2 или дардарин) – белок, который обеспечивает белок-белковые взаимодействия и имеет киназную и ГТФазную активность [Biskup et al., 2006]. Риск развития БП у людей с мутацией G2019S LRRK2 увеличивается с каждым десятилетием жизни: 28% в 59 лет, 51% в 69 лет и 74% в 79 лет [Healy et al., 2008]. У мышей с нокаутом гена LRRK2 не было обнаружено изменений в развитии и ДАергических нейронов, а также их выживаемости в течение жизни [Andres-Mateos et al., 2009]. У трансгенных мышей с LRRK2 или мутантными формами данного белка (R1441G, G2019S) не обнаружено дегенерации ДА-ергических нейронов [Deng et al., 2006]. Однако в большинстве работ были показаны нарушения нейротрансмиссии ДА в нигростриатной системе, что в ряде 44 случаев приводило к нарушению двигательной функции. Такие изменения расценивают как раннюю стадию дегенерации ДА-ергических нейронов [Dusonchet et al., 2011]. Модели на основе модификации гена паркин Паркин, являясь Е3 лигазой, вовлекается в процесс убикинирования белков – выработки сигнала для их последующего разрушения протеасомами [Lim et al., 2005]. Показано, что у мышей с выключенной функцией паркина увеличено содержание внеклеточного ДА в стриатуме, но количество ДА-ергических нейронов в ЧС не изменяется [Goldberg et al., 2003]. Модели на основе модификации гена DJ-1 Ген DJ-1 (PARK7) связан с ранним началом заболевания (до 40 лет) [Abou-Sleiman et al., 2004; Bandopadhyay et al., 2004]. Белок этого гена является пептидазой. У DJ-1 нокаутных мышей наблюдается раннее одностороннее повреждение ДА-ергических нейронов в ЧС, переходящее в двусторонние повреждения всей нигростриатной системы по мере взросления [Rousseaux et al., 2012]. При уменьшении или отсутствии DJ-1 повышается чувствительность к окислительному стрессу и снижается протеасомная активность [Yokota et al., 2003]. 1.3.4.2 Нейровоспалительные модели Липополисахариды, эндотоксины грамотрицательных бактерий, запускают воспалительный процесс при связывании с TLR4 рецепторами на мембране клеток глии, что приводит к их активации: увеличению содержания провоспалительных цитокинов и АФК. Впервые токсический эффект липополисахаридов был показан на ТГ-иммунореактивных нейронах среднего мозга крыс in vitro [Bronstein et al., 1995]. В дальнейшем были разработаны разные способы введения липополисахаридов in vivo: стереотаксически (в желудочки мозга и в ткани мозга: стриатум и ЧС) и системно, а также разные схемы введения – острые или хронические для взрослых животных и плодов. Во всех случаях наблюдали селективную дегенерацию ДА-ергических нейронов [Herrera et al., 2000; Qin et al., 2007; Hunter et al., 2009]. Введение липополисахаридов в стриатум мышей вызывает прогрессирующую дегенерацию ДА-ергических нейронов в ЧС, количество которых снижается до 59% через 4 недели после введения токсина, а уровень ДА в стриатуме до 58%. На этих моделях, помимо воспроизведения дегенерации ДА-ергических нейронов в выживших нейронах, была обнаружена агрегация α-синуклеина и убиквитина [Hunter et al., 2009]. Представляется крайне 45 интересным, что при системном введении липополисахаридов показана избирательная гибель ДА-ергических нейронов в ЧС (30-70%) по сравнению с ГАМК-ергическими и серотонинергическими нейронами мозга [Herrera et al., 2000; Qin et al., 2007], однако, это требует дальнейших исследований. I.3.4.3 Нейротоксические модели Разработка нейротоксических моделей БП на животных началась более 40 лет назад. Большинство работ используют схемы введения токсинов, которые приводят к гибели большей части ДА-ергических нейронов нигростриатной системы и к снижению содержания ДА в стриатуме ниже порогового уровня. Фактически эти модели воспроизводят терминальную стадию БП, что сопровождаются высокой летальностью животных. Нейротоксические модели БП разделяют на два класса – модели, созданные на основе неспецифических для ДАергических нейронов нейротоксинов (ротенон, паракват) и специфических: нейротоксина 6гидроксидофамина (6-ГДА) и пронейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП). Модели на основе введения ротенона Ротенон, инсектицид и пестицид, привлек внимание ученых для моделирования БП из-за повышенной заболеваемости в сельскохозяйственных районах по сравнению с городскими условиями [Betarbet et al., 2000]. Ротенон – липофильное вещество, которое проникает через гематоэнцефалический барьер, а также через клеточные мембраны. Его токсическое действие связано с ингибированием I комплекса дыхательной цепи митохондрий в клетках, а также полимеризацией тубулина в микротрубочки, что приводит к нарушению молекулярного транспорта внутри клеток [Brinkey et al., 1974; Schuler, Casida, 2001]. Ротенон вызывает гибель не только ДА-ергических нейронов нигростриатной системы, но и нейронов другой ергичности и локализованных в других областях мозга. Например, было показано снижение числа холинергических нейронов ядра моста, норадренергических нейронов голубого пятна, снижение плотности транспортера серотонина в стриатуме и гибель мотонейронов спинного мозга [Heikkila et al., 1985; Ferrante et al., 1997; Hoglinger et al., 2003; Lapointe et al., 2004; Samantaray et al., 2007]. Для локального действия ротенона на нигростриатную систему, его вводят непосредственно в ЧС или стриатум [Saravanan et al., 2005; Paul et al., 2010]. Существенным минусом моделей является отсутствие корреляции между 46 вводимой дозой нейротоксина и деградацией ДА-ергической нигростриатной системы, а также плохая воспроизводимость получаемых результатов [Hoglinger et al., 2003; Fleming et al., 2004; Lapointe et al., 2004; Zhu et al., 2004]. С другой стороны, введение ротенона приводит к накоплению убиквитина и α-синуклеина внутри некоторых ДА-ергических нейронов нигростриатной системы [Hoglinger et al., 2003; Sherer et al., 2003]. Модели на основе введения параквата Паракват – гербицит, длительное воздействие которого на человека повышает риск заболевания БП [Liou et al., 1997; McCormack et al., 2002]. Паракват (1,1’-диметил-4,4’бипиридиниум) является структурным аналогом ДА [Brooks et al., 1999; McCormack et al., 2003], который проникает в мозг с помощью транспортера нейтральных аминокислот [Shimizu et al., 2001; McCornack, DiMonte, 2003]. Токсический эффект паракват оказывает через образование АФК [Przedborski, Ischiropoulos, 2005]. Данные о повреждении нигростриатной системы после действия параквата достаточно противоречивы. С одной стороны показана относительно специфическая дегенерация ДАергических нейронов нигростриатной системы, но при этом не обнаружено снижение ДА в стриатуме [Brooks et al., 1999; Thiruchelvam et al., 2000b; McCornack et al., 2002]. Привлекательность параквата в качестве токсина для моделирования БП связана с накоплением и агрегацией α-синуклеина в ДА-ергических нейронах ЧС [Manning-Bog et al., 2002; Fernagut et al. 2007; Mak et al. 2010]. Часто для усиления эффекта параквата использую манеб (этилен-бис-дитикарбамат марганца), который предположительно оказывает ингибирующее влияние на антиоксидантную систему. Такое совместное использование приводит к более выраженной дегенерации ДАергических нейронов нигростриатной системы. Было показано нарушение моторного поведения животных, что вероятней связано с общетоксическим действием параквата, чем с деградацией нигростриатной системы [Clark et al., 1966; Cicchetti et al., 2005; Saint-Pierre et al., 2006]. Модели на основе введения 6-гидроксидофамина 6-ГДА – структурный аналог ДА, вследствие чего он избирательно захватывается в ДАергические и норадренергические нейроны с помощью соответствующих мембранных транспортеров ДАТ и транспортера норадреналина [Luthman et al., 1989]. Попадая в нейрон, 6ГДА при участии фермента МАО метаболизируется до ДОФУК, либо окисляется с образованием перекиси водорода и/или 6-ГДА-хинона, что приводит к образованию АФК и окислительному стрессу в нейроне с последующей его гибелью (рисунок 11) [Hou et al., 1997]. Действие 6-ГДА можно ограничить только ДА-ергическими нейронами, используя ингибитор 47 обратного захвата норадреналина или вводя нейротоксин в области мозга, где в основном локализованы ДА-ергические нейроны – тела или аксоны, такие как ЧС или стриатум. 6-ГДА не проникает через гематоэнцефалический барьер, поэтому его стереотаксически вводят в мозг, чаще крысам – в боковые желудочки мозга или непосредственно в ткань мозга, чаще в стриатум, ЧС или средний пучок переднего мозга [Hökfelt, Ungerstedt, 1973; Sauer, Oertel, 1994]. Внутрижелудочковое введение 6-ГДА приводит к обширному билатеральному повреждению катехоламинергических нейронов [Bosler, Calas, 1982], что сопровождается развитием у животных афагии [Ungerstedt, 1971; Zigmond, Stricker, 1973; Rowland, Stricker, 1982; Sakai, Gash, 1994]. АФК – активные формы кислорода, ВМАТ – везикулярный транспортер моноаминов, ДАергический нейрон – дофаминергический нейрон, ДАТ – мембранный транспортер дофамина, 6-ГДА – 6-гидроксидофамин, ГЭБ – гематоэнцефалический барьер, МАО Б – моноаминоксидаза Б, МФП+ – 1-метил-4-фенилпиридиум ион, МФТП – 1-метил-4-фенил1,2,3,6-тетрагидропиридин, синапт. везикула – синаптическая везикула. Рисунок 11 – Механизм действия нейротоксинов (6-ГДА, МФТП, ротенон и паракват) на ДАергические нейроны [Schober, 2004] Введение 6-ГДА в ткани мозга приводит к унилатеральным повреждениям, сопровождающимися односторонними нарушениями двигательной функции животных, что не в 48 полной мере соответствует моторным нарушениям при БП [Ungerstedt, Arbuthnott, 1970; Helfi et al., 1980]. Введение 6-ГДА в стриатум приводит к медленной ретроградной дегенерации ДАергических нейронов в ЧС. Количество терминалей ДА-ергических аксонов снижается уже в первые часы после введения 6-ГДА, в то время как тел нейронов в ЧС через 12 дней [Sauer, Oertel, 1994; Stott, Barker, 2014]. Введение 6-ГДА в средний пучок переднего мозга или ЧС вызывает более массивную и быструю дегенерацию ДА-ергических нейронов как в ЧС, так и в ВТО. Так через 12 часов после введения 6-ГДА дегенерируют 80% ДА-ергических нейронов в ЧС [Hökfelt, Ungerstedt, 1973; Smith et al., 2003]. Интересно, что механизм нейродегенерации зависит от место введения нейроткосина. Так, введение 6-ГДА в медиальный пучок переднего мозга приводит к гибели нейронов путем апоптоза [He et al., 2000; Zuch et al., 2000], а введение в ЧС приводит к гибели, происходящей по неапоптотическому пути [Jeon et al., 1995]. Данные по механизму гибели нейронов после введения 6-ГДА в стриатум носят противоречивый характер. С одной стороны было показано, что ингибирование каспазы 3 оказывает нейропротекторный эффект, что косвенно свидетельствует об апоптозе [Cutillas et al., 1999; He et al., 2000]. С другой стороны дальнейшие исследования не показали наличия активных каспаз в ДА-ергических нейронах в ЧС [Ebert et al., 2007]. Модели на основе введения 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина МФТП – предшественник специфического для ДА-ергических нейронов токсина 1метил-4-фенилпиридиум (МФП+). МФТП вызывает развитие паркинсонического синдрома у людей [Langston et al., 1983], что и привело к его широкому применению для моделирования БП на животных [Langston et al., 1983; Snow et al., 2000]. МФТП - липофильное соединение, которое легко проникает в мозг через гематоэнцефалический барьер, захватывается клетками глии, где с помощью фермента МАО Б метаболизируется в N-метил-4-фенил-2,3-дигидропиридин-ион (МФДП+), который окисляется до МФП+. МФП+ проникает в ДА-ергические нейроны с помощью ДАТ. Мыши, лишенные ДАТ, резистенты к действия МФТП. Внутри ДА-ергических нейронов МФП+ может: 1) транспортироваться в везикулы с помощью ВМАТ2; 2) накапливаться в митохондриях и 3) взаимодействовать с цитозольными белками. В митохондриях МФП+ ингибирует I комплекс дыхательной цепи, что приводит к окислительному стрессу и гибели ДА-ергических нейронов (рисунок 11) [Langston et al., 1983; Gerlach, Riederer, 1996; Przedborski et al., 2000]. Моделирование болезни Паркинсона на обезьянах В настоящее время разработаны две принципиально разные схемы введения МФТП для моделирования БП на обезьянах: острая схема введения нейротоксина и хроническая. Острое 49 введение МФТП подразумевает дозу от 0,33 до 0,75 мг/кг, которую вводят внутривенно или внутримышечно в течение 9-32 дней. Эта схема приводит к быстрой потере ДА-ергических нейронов нигростриатной системы, что сопровождается дефицитом ДА в стриатуме и появлением двигательных нарушений [Burns et al., 1983]. Хроническая схема введения МФТП – 0,05-0,15 мг/кг 3 раза в неделю в течение 4-7 месяцев. При данной схеме у обезьян вначале появляются когнитивные нарушения, после чего начинают увеличивать однократные дозы МФТП до появления двигательных нарушений (еще примерно 6 месяцев) [Schneider, 1990; Schneider, Kovelowski, 1990; Schneider, Pope-Coleman, 1995; Schneider et al., 1998]. Хроническое введение МФТП позволяет моделировать досимптомную стадию БП, однако, следует учитывать тот факт, что нарушение когнитивных функций при БП происходит намного позже появления нарушений двигательной функции. Другим признаком БП являются тельца Леви в ДА-ергических нейронах нигростриатной системы, однако, при моделировании БП на молодых обезьян включений не обнаружено. Структуры, схожие с тельцами Леви, были показаны у старых обезьян, причем в основном в нейронах нигростриатной системы, которые содержали нейромеланин [Forno et al., 1986; Forno et al., 1993]. Однако использование обезьян в качестве объектов исследования является трудоемким и сложным для воспроизведения, долгим и дорогим процессом. Поэтому подавляющее количество исследований с использованием МФТП проводят на грызунах. Моделирование болезни Паркинсона на грызунах Классическим объектом для моделирования БП являются самцы мышей линии C57BL/6, которым по различным схемам вводят МФТП [Sedelis et al., 2001; Tillerson et al., 2002]. МФТП вызывает дегенерацию ДА-ергических нейронов нигростриатной системы со снижением уровня ДА. Если снижение уровня ДА доходит до порогового значения, то у мышей наблюдается нарушение двигательной функции: акинезия, ригидность, тремор и появляется фенотип застывания [Muthane еt al., 1994; Tillerson et al., 2002; Langston, Irwin, 1986; Langston et al., 1983, 1989; Bankiewicz et al., 1986; Kurosaki et al., 2004; Smeyne, Jackson-Lewis, 2005]. На сегодняшний день введение МФТП можно разделить на три схемы: острая, подострая и хроническая. Острая схема введения МФТП предполагает одну или несколько инъекций в течение одного-двух дней. Например, однократное введение МФТП в дозе 40-50 мг/кг, четырехкратное введение в единичной дозе 10-20 мг/кг с интервалом в два часа в течение одного дня можно отнести к самым распространенным вариантам острых схем. Эти схемы приводят к значительной деградации нигростриатной системы, например, при введении 50 мг/кг погибает 60% ДА-ергических нейронов в ЧС, а при четырехкратном введении МФТП в 50 дозе 20 мг/кг с двухчасовым интервалом погибает 66% ДА-ергических нейронов [Sundström et al., 1987; Jackson-Lewis et al., 1995]. Подострые схемы – введение МФТП в течение нескольких дней: либо введение 15 мг/кг дважды в день с интервалом в два часа, либо однократно в дозе 20-30 мг/кг в течение 5-10 дней [Ricaurte et al., 1986; Schneider, Denaro, 1988; Petroske et al., 2001; Kuhn et al., 2003; McCollum et al., 2010]. Подострые схемы введения МФТП, также как и острые, приводят к функциональной недостаточности нигростриатной системы, но дегенерация ДА-ергических нейронов либо менее выражена, либо отсутствует, чем при острых моделях [Ricaurte et al., 1986; Schneider, Denaro, 1988; Petroske et al., 2001; Kuhn et al., 2003; McCollum et al., 2010]. На сегодняшний день существует всего несколько работ, в которых разрабатывали хронические схемы введения МФТП. Эти схемы можно разделить на два типа: ежедневное введение небольших доз МФТП (4 мг/кг) в течение 20 дней или доза 25 мг/кг каждые 3,5 дня в течение 5 недель [Lau et al., 1990; Bezard et al., 1997; Petroske et al., 2001]. Малое количество работ с использованием хронических схем введения МФТП, которые носят фрагментарный характер, не позволяют оценить воспроизведение признаков БП на данных моделях. Данные о наличиях агрегатов белка α-синуклеина в ДА-ергических нейронов при моделировании БП с помощью МФТП противоречивы. Так при острых схемах введения МФТП не обнаружено ни образования включений, содержащих α-синуклеин, ни увеличения содержания белка [Vila et al., 2000]. Подострая схема введения МФТП приводит к увеличению содержания α-синуклеина в ДА-ергических нейронах нигростриатной системы, однако, агрегатов не обнаружено [Vila et al., 2000]. Введение МФТП с помощью подкожной минипомпы (30 мг/кг/в день в течение 30 дней), т.е. хроническое введение нейротоксина, позволило выявить агрегаты α-синуклеина в ДА-ергических нейронах, а также в норадренергических нейронах голубого пятна [Fornai et al., 2005]. Однако в последующих работах при использовании аналогичной схемы введения МФТП агрегации и даже увеличения содержания α-синуклеина в ДА-ергических нейронах не было обнаружено [Alvarez-Fischer et al., 2008, Gibrat et al., 2009]. Существенным различием в функционировании ДА-ергических нейронов нигростриатной системы у приматов и грызунов является отсутствие нейромеланина у последних. Возможно, накопление с возрастом нейромеланина приводит к стимуляции накопления и агрегации α-синуклеина [Hirsch et al., 1988; Herrero et al., 1993]. При использовании МФТП в качестве нейротоксина для ДА-ергических нейронов было показано увеличение содержания провоспалительных цитокинов, например ФНО [Miller et al., 2009; Smeyne, Jackson-Lewis, 2005], что свидетельствует о важной роли воспаления в дегенерации нейронов в ЧС. Однако были получены противоречивые данные при использовании веществ, ингибирующих глию [Du et al., 2001; Wu et al., 2002; Yang et al., 2003; 51 O’Callaghan et al., 2008]. Миноциклин является ингибитором активации глии, но в большей степени оказывает влияние на микроглию, чем астроциты. Его использование не оказало нейропротекторного эффекта на ДА-ергические нейроны, что может свидетельствовать о преобладающей роли астроцитов в воспалении на МФТП-индуцированных моделях. С другой стороны, время активации астроцитов и микроглии разное после введения МФТП. Показано, что активация астроцитов происходит параллельно или позже потери ДА-ергических нейронов в ЧС, что было оценено по количеству клеток, экспрессирующих глиальный фибриллярный белок (GFAP), который является маркером данных клеток. При ингибировании захвата МФП+ в ДА-ергические нейроны не только не происходит дегенерации, но также не происходит и активации астроцитов. Активация микроглии происходит раньше, чем снижение количества ДА-ергических нейронов в ЧС. Активная микроглия может продуцировать АФК, цитокины и простагладины. При этом ингибирование активации микроглии приводит к менее выраженному токсическому эффекту МФТП на мышах. Помимо различных существующих схем введения МФТП все модели БП можно разделить на стадии, которые они воспроизводят по степени деградации нигростриатной системы и наличию нарушений двигательной функции: доклиническая и клиническая. К доклинической стадии относят модели, где при допорогой деградации нигростриатной системы, а именно потере меньше 50% тел ДА-ергических нейронов и 70% ДА в стриатуме, у животных отсутствуют моторные нарушения. К клинической стадии относятся модели, где деградация нигростриатной системы превышает пороговый уровень, что сопровождается нарушениями двигательной функции. Однако большинство работ используют либо полулетальную дозу МФТП, либо достаточно высокую дозу, что приводит к деградации нигростриатной системы, намного превышающей пороговый уровень, т.е. воспроизводят продвинутую (терминальную) клиническую стадию БП [Araki et al., 2001; Kurosaki et al., 2004]. С точки зрения перспективы изучения возможных компенсаторных механизмов, развитие которых в течение длительного времени скрывает дефицит ДА в стриатуме на доклинической стадии, и для понимания того, истощение каких компенсаторных механизмов приводит к появлению симптоматики, набольший интерес вызывают модели, воспроизводящие доклиническую и раннюю клиническую стадии БП. Работ, в которых проводили моделирование двух этих стадий, крайне мало и они носят скорее фрагментарный характер, где определение соответствующей стадии проводилась только по одному из показателей: количество тел ДА-ергических нейронов, содержание ДА или наличие нарушений двигательной функции животных [Itzhak et al., 1999; Bezard et al., 2001; Kirchhoff et al., 2009]. При этом комплексный анализ досимптомной и ранней симптомной стадий провели в одной работе с последующим их сравнением и изучением компенсаторных механизмов [Хакимова и др., 2011, 2012; Ugrumov et al., 2011; Kozina et al., 52 2014]. Также как и в других работах, компенсаторные механизмы изучаются через длительный срок после введения МФТП, что позволяет отделить их от процессов нейродегенерации. В то же время изучение нейродегенерации имеет фундаментальное значение для решения теоретических и практических проблем нейрофизиологии. Ведь именно изучение нейродегенерации, и в первую очередь, динамики деградации нигростриатной системы, позволит изучить возможные механизмы, происходящие при БП, что в дальнейшем позволит найти способы замедления гибели нейронов, а возможно и восстановления аксонального древа выживших нейронов в стриатуме. Работ, посвященных изучению нейродегенерации после введения МФТП крайне мало, при этом в них, также как в случае постадийного моделирования БП, отсутствует комплексность исследования. При остром введении МФТП было обнаружено только 4 работы, в которых, несмотря на разные схемы введения МФТП воспроизводили продвинутую стадию БП [Sundström et al., 1987; Lackson-Lewis et al., 1995; Kurosaki et al., 2004; Aoki et al., 2009]. Например, в работе Джаксон-Левис с соавторами [Lackson-Lewis et al., 1995], используют только анализ количества ДА-ергических нейронов нигростриатной системы после введения МФТП [Aoki et al., 2004]. Показано, что количество ДА-ергических нейронов снижается в первые двое суток после введения МФТП без изменений в последующие дни. В работе Куросаки с соавторами [Kurosaki et al., 2004] был проведен анализ только концентрация ДА в стриатуме, которая была снижена почти в 7 раз через 1 день после введения МФТП. При подострой схеме введения МФТП (в течение 5 дней) количество ДА-ергических нейронов в нигростриатной системе было снижено на следующий день после последней инъекции предшественника нейротоксина без дальнейших изменений, т.е. нейродегенерация в основном происходила во время инъекций МФТП [Turmel et al., 2001]. Это значит, что подострая схема введения МФТП не подходит для изучения дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы. Работ по изучению нейродегенерации при хроническом моделировании БП обнаружить не удалось. Таким образом, существующие модели БП обычно воспроизводят одну или две особенности заболевания. Генетические модели позволяют воспроизводить агрегацию белка αсинуклеина, в то время как специцифической гибели ДА-ергических нейронов нигростриатной системы с сопутствующими нарушениями двигательной функции животных не наблюдается. Среди токсических моделей БП наибольший интерес представляют модели с введением МФТП, что позволяет воспроизводить основные особенности заболевания на животных, в том числе и постадийность. Однако, не смотря на большой массив данных, накопленных за последние несколько десятилетий с открытия МФТП, многие вопросы остаются без ответа. Один из таких вопросов заключается в том, какие механизмы компенсации, направленные на защиту и 53 восстановление функционального состояния нейронов происходят во время нейродегенерации нигростриатной системы. Решению данного вопроса и посвящена эта работа. 54 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Животные и эксперименты В работе использованы 318 мышей - самцов линии С57BL/6 в возрасте 2-2,5 месяцев и весом 22-26 г. Мыши содержались в стандартных условиях вивария, со сменой светлой и темной фаз суток 12/12 часов при свободном доступе к пище и воде. Все манипуляции с животными были проведены согласно протоколу, утвержденному комиссией по биоэтике Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, находящимся в соответствии с национальными и международными требованиями. Животным в опытной группе четырехкратно подкожно вводили МФТП (Sigma, США) в разовой дозе 12 мг/кг с интервалом 2 часа между инъекциями, моделируя, таким образом, раннюю симптомную стадию БП у мышей [Ugrumov et al., 2011]. Животным контрольной группы вводили 0,9% NaCl по аналогичной схеме. 2.1.1 Оценка активности тирозингидроксилазы Для определения активности ТГ за 30 минут до декапитации как опытным, так и контрольным животным вводили ингибитор ДАА – 3-гидроксибензилгидразин (NSD1015, Sigma, США) в концентрации 100 мг/кг веса тела животного [Carlsson, 1973]. После декапитации выделяли структуры мозга – компактную часть ЧС и дорсальный стриатум. В собранных образцах ткани определяли активность ТГ по накоплению L-ДОФА, измеренного с помощью ВЭЖХ-ЭД. Результаты представлены в виде изменения содержания L-ДОФА в ЧС и его концентрации в стриатуме в опыте относительно контроля, принятого за 100%. 2.1.2 Ингибирование обратного захвата дофамина с помощью 2-метил-4-фенил1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-амина Для ингибирования обратного захвата ДА использовали подкожное введение (RS)-2метил-4-фенил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-амина (номифензина) (Sigma, США) в дозе 10 мг/кг веса животного за полчаса до каждого введения МФТП. Было использовано четыре группы животных, получавших только 0,9% NaCl и 0,9% NaCl, 0,9% NaCl и номифензин, 55 МФТП и 0,9% NaCl, МФТП и номифензин. Через 12 часов после последней инъекции МФТП осуществляли сбор материала, в котором выявляли ТГ-иммунореактивных терминали в дорсальном стриатуме методом иммуногистохимии, подсчитывали их количество и определяли уровень белка ТГ. Также определяли содержание катехоламинов и их метаболитов в компактной части ЧС и дорсальном стриатуме методом ВЭЖХ-ЭД. 2.1.3 Инъекции регуляторного пептида Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) В первом случае Семакс (препарат предоставлен отделом химии физиологически активных веществ, Институт молекулярной генетики РАН) вводили интраназально за 12 часов до первой инъекции МФТП в дозе 50 мкг/кг веса животного. Во втором случае Семакс вводили интраназально через 1 час после последней инъекции МФТП в дозе 50 мкг/кг веса животного. Количество групп в обоих случаях равнялось трем: 0,9% NaCl и 0,9% NaCl, МФТП и 0,9% NaCl, МФТП и Семакс. Сбор материала в данных экспериментах осуществляли через 12 часов после последней инъекции МФТП, затем образцы использовали для определения количества катехоламинов с помощью ВЭЖХ ЭД. 2.2 Взятие материала Для морфологического исследования динамики дегенерации ДА-ергических нейронов (тел нейронов в компактной части ЧС и терминалей аксонов в дорсальном стриатуме) брали материал через 1 (только терминали аксонов), 3, 6, 12 и 24 часа после последнего введения МФТП (рисунок 12). Для этого мышей наркотизировали хлоралгидратом (600 мг/кг) (Sigma, США) и интракардиально перфузировали следующими растворами: 12 минут фосфатносолевым буфером (0,9% NaCl на 0,02 М фосфатно-солевом буфере, рН 7,2 ‒ 7,4) (ФСБ), затем 12 минут 4% параформальдегидом на 0,2 М фосфатном буфере (ФБ). После этого мышей декапитировали, извлекали мозг и помещали в 4% параформальдегид на 12 часов при +4о С. Для морфологического исследования влияния ингибитора обратного захвата – номифензина, мышей декапитировали, извлекали мозг и фиксировали иммерсией 4% параформальдегидом на 0,2 М ФБ в течение 12 часов при +4о С. Далее в обоих случаях мозг мышей промывали в 0,02 М ФСБ, помещали в 20% сахарозу на 0,02 М ФСБ на 48 часов, 56 замораживали в гексане при -40о С и хранили при -70о С до последующего выявления ТГ – маркера ДА-ергических нейронов методом иммуногистохимии. Для биохимического анализа через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП мышей наркотизировали хлоралгидратом (600 мг/кг), декапитировали, извлекали мозг (рисунок 12). На хладоэлементе под бинокулярной лупой (Leica M60, Германия), снабженной окулярмикрометром, разрезали мозг по среднесагиттальной плоскости. Для выделения дорсального стриатума делали первый фронтальный разрез на 0,3 мм каудальнее передней камиссуры (bregma 0.02) и второй – на 1 мм ростральнее мозолистого тела (bregma 2.10). Из полученного фронтального среза выделяли стриатум согласно атласу [Paxinos, Franklin, 2001]. Из оставшегося блока мозга выделяли ЧС, для этого делали два фронтальных разреза: на уровне каудальной границы мозолистого тела (bregma -2.70) и на 0,8 мм каудальнее первого разреза. Отступив на 0,75 мм от сагиттальной линии получившегося фронтального среза, и на 1,3 мм от нижнего края, также делали разрезы, после чего выделяли ЧС (рисунок 13, 14). Кусочки взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70о С до последующего определения содержания катехоламинов. МФТП 12 мг/кг 0,9% NaCl 0 2 4 6 час 0 1 3 12 6 24 Концентрация ГНФ Активность ТГ Количество тел нейронов и терминалей аксонов Содержание белка ТГ Содержание катехоламинов ГНФ – глиальный нейроотрофический фактор, ТГ – тирозингидроксилаза. Рисунок 12 – Схема введения МФТП и сбора материала 57 5 4 3 1 2 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 мм Bregma ЧС стриатум 1 мм 1 мм 0.3 мм ЧС – черная субстанция. Рисунок 13 – Схематичное изображение выделения фронтальных срезов, содержащих стриатум и черную субстанцию из половины мозга, разрезанного в среднесагиттальной плоскости БЖ – боковой желудочек, ВТО – вентральная тегментная область, МТ – мозолистое тело, ПК – передняя комиссура, СТР – стриатум, ЧСк – компактная часть черной субстанции, ЧСр – ретикулярная часть черной субстанции. Бар - 0,45 мм. Рисунок 14 – Схема выделения черной субстанции (А) и дорсального стриатума (Б) из фронтальных слайсов мозга 58 2.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД) определяли содержание ДА и ДОФУК в дорсальном стриатуме и ЧС. Для этого образцы ЧС и стриатума размораживали, гомогенизировали соответственно в 70 и 150 мкл 0,1 Н HCIО4 с добавлением 3,4-дигидроксибензиламин гидробромида (250 пмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта. Далее пробы центрифугировали при 17 000 g при +4оС в течение 20 мин и отбирали супернатант для дальнейшего анализа. Определение ДА и ДОФУК осуществляли на обращѐнно-фазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3,4 х 100 мм с диаметром пор 3 мкм (Элсико, Россия) при скорости подвижной фазы 0,7 мл/мин. В состав подвижной фазы входили: 0,1 M цитратно-фосфатный буфер (pH 3,0), 1,1 мM октансульфоновая кислота, 0,1 мM ЭДТА и 9% ацетонитрил. Для измерения катехоламинов использовали стеклоугольный электрод (+0,85 В) и электрод сравнения Ag/AgCl. Пики ДА и ДОФУК идентифицировали по времени их выхода в растворе стандартов. Содержание ДА и ДОФУК рассчитывали методом внутреннего стандарта, используя отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце с помощью программного обеспечения «Мультихром» (Ampersand LTD, Россия). Данные представлены в виде изменения содержания ДА и ДОФУК в опыте по отношению к контролю, принятому за 100%. 2.4 Иммуногистохимия Для выявления ТГ-иммунореактивных нейронов методом иммуногистохимии делали серийные фронтальные срезы мозга, содержащие стриатум (от bregma 1,70 до bregma 0,14) и ЧС (от bregma 2,54 до bregma 4,04), на криостате (Leica, Германия). Толщина срезов стриатума составляла 12 мкм, а ЧС – 20 мкм. На стекла монтировали серийные срезы ЧС и стриатума, при этом на каждом стекле присутствовали как срезы контрольной, так и опытной групп. Cрезы на стеклах последовательно инкубировали: (а) с 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА) (Sigma, США) и 0,3% Тритоном X100 (Triton-X100, Sigma, США) в ФСБ 30 мин при 20оС; (б) с антителами кролика к ТГ (1:2000) (предоставлены профессором Ж. Тибо, Франция), 1% БСА и 0,1% Тритоном X-100 в ФСБ в течение 20 часов при 20оС; (в) с биотинилированными антителами козы к антителам кролика (1:200) (Vector Laboratories, США) в ФСБ в течение 2-х часов при 20оС; и (г) с авидин-биотиновым комплексом, 59 связанным с пероксидазой хрена (Vector Laboratories, США) в ФСБ в течение 1 часа при 20оС. После каждой инкубации, за исключением первой, срезы промывали в ФСБ в течение 30 минут при 20оС. Пероксидазу авидин-биотинового комплекса выявляли путем инкубации срезов с 0,03% 3,3’-диаминобензидин-тетрогидрохлоридом (Sigma, США) и 0,01% H2O2 в ФСБ при 20оС под визуальным контролем, причем «проявление» срезов от одной пары мозга (контроль и опыт) на всех стеклах осуществляли одновременно. Затем срезы заключали в гидрофильную среду Mowiol 4-88 (Sigma, США). 2.5 Световая микроскопия и анализ изображений Срезы ЧС и стриатума после выявления ТГ с помощью пероксидазного моноиммуномечения изучали в просвечивающем световом микроскопе Olympus BX51 (Olympus, Япония), оснащенном цифровой камерой Olympus DP70 (Olympus, Япония), при увеличении объектива х10 и х100, соответственно. Изображения анализировали с помощью программы AnalySIS 5.0 (Olympus, Япония). Серийные срезы ЧС (примерно 70 срезов с мозга) были сфотографированы, после чего на каждом изображении была обведена область компактной части ЧС, содержащая ДА-ергические нейроны, в соответствии с атласом головного мозга мышей [Paxinos, Franklin, 2001] и схемами по статье Нельсон с соавторами [Nelson et al., 1996]. Далее в обведенной области подсчитывалось количество нейронов с видимым ядром. Для исключения двойного подсчета нейронов, расположенных на соседних срезах использовали метод Аберкромби [Abercrombie, 1946]: N=n* ⁄ , где N – общее число клеток в слое, n – число подсчитанных клеток в слое, Δ – толщина среза (20 мкм), d – средний диаметр ядра для клетки. Для количественного анализа терминалей аксонов в дорсальном стриатуме делали фотографии четырех условно выделенных областей дорсального стриатума (зона 1, 2, 3 и 4), как показано на рисунке 15. В данные зоны, согласно Герфен с соавторами, в основном проецируются ДА-ергические аксоны от нейронов в компактной части ЧС [Gerfen, 1985]. Количество терминалей аксонов подсчитывали в центре каждой из четырех условно выбранных зон площадью 200х200 мкм2 с помощью программы Striatum Image Analysis» (Россия), разработанной нами совместно с Вычислительным Центром им. А.А. Дородницына 60 РАН [Gurevich et al., 2010]. Окончательные результаты представлены в виде изменения количества тел и терминалей аксонов ТГ-иммунореактивных (ДА-ергических) нейронов в опыте относительно контроля, принятого за 100%. br: -3.84 ЧСк br: -3.34 ЧСл вто br: -3.24 А ЧСр ЧСл ЧСл br: -3.04 вто вто ЧСк ЧСк ЧСл ЧСк ЧСк ЧСр ЧСр вто br: 0.14 ЧСк ЧСр 500 μm br: 0.50 br: 0.86 Б br: 1.18 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1000 μm ВТО – вентральная тегментальная область, ЧСк – компактная часть черной субстанции, ЧСр – ретикулярная часть черной субстанции, ЧСл – латеральная часть черной субстанции. Схемы среднего мозга основаны на данных стереотаксического атласа [Paxinos, Franklin, 2001] и рекомендаций Нельсона с соавторами [Nelson et al., 1996]. Рисунок 15 – Схемы локализации тел ДА-ергических нейронов в среднем мозге, использованные для подсчета нейронов в компактной части черной субстанции (А) и терминалей аксонов в области дорсального стриатума (мелкий пунктир), использованные для их подсчета (Б) 2.6 Полуколичественный анализ содержания тирозингидроксилазы в нейронах черной субстанции и в терминалях аксонов стриатума Для полуколичественного иммуноцитохимического анализа содержания ТГ в телах ТГ-иммунореактиных (ДА-ергических) нейронов выбирали каждый десятый срез ЧС (7 срезов с ЧС) от каждого животного. Черно-белые изображения срезов получали при помощи микроскопа Olympus BX51 (Япония), оснащенного цифровой камерой Olympus DP70 61 (Япония), при увеличении объектива ×20. На каждом выбранном срезе в программе АnalySIS 5.0. (Olympus, Япония) обводили область компактной части ЧС, которая содержит ДАергические нейроны, после чего обводили область перикариона всех нейронов, попавших в эту область. Оптическую плотность (ОП) нейронов, коррелирующую с содержанием ТГ, определяли по формуле: ОП = ⁄ Уровень серого сигнала определяли для каждого нейрона (без ядра) по ТГиммунореактиной цитоплазме, в качестве фона выступала часть среза, не содержащая тел и аксонов ТГ-иммунореактивных нейронов. На тех же срезах одновременно определяли средний диаметр (в мкм) и среднюю площадь (в мкм2) тел нейронов, а также диаметр ядра (в мкм). Для полуколичественного анализа содержания ТГ в терминалях аксонов дорсального стриатума использовали разработанную совместно с Вычислительным центром им. А.А. Дородницына РАН программу «Striatum Image Analysis», позволяющую автоматически обрабатывать каждое загруженное изображение, определяя помимо количества терминалей аксонов их средний размер (площадь в мкм2), а также уровень серого каждой терминали для дальнейшего вычисления ОП терминалей [Gurevich et al., 2010]. 2.7 Иммуноферментный анализ Измерение уровня глиального нейротрофического фактора в компактной части ЧС и дорсального стриатума проводили с помощью метода иммуноферментного анализа, с использованием коммерческого набора GDNF Emax ImmunoAssay System (Promega, США). Компактную часть ЧС лизировали в 120 мкл, а дорсальный стриатум в 500 мкл в буфере, который содержал: 20мМ Trizma base (Sigma, США), 137 мМ NaCl (Sigma, США), 1% NP40 (Sigma, США), 10% глицерола, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (Sigma, США), 10 мкг/мл апротинин (Sigma, США), 1 мкг/мл леупептин (Sigma, США) и 0,5 мМ ванадата натрия (Sigma, США). Гомогенат ткани центрифугировали при скорости вращения 16 000 g в течение 30 минут при +4°С, после чего отбирали 100 мкл супернатанта и разводили в 5 раз фосфатно-солевым буфером Дульбекко (2,68 мМ KCl, 137 мМ NaCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, 0,9 мМ CaCl2*2H20, 0,5 мМ MgCl2*6H2O). Для выделения всей фракции нейротрофического фактора образцы инкубировали в течение 15 минут при 20 оС при 2,5 pH, 62 что добивались добавлением 10 мкл 1Н HCl. По истечению 15 минут добавляли 10 мкл 1Н NaOH для остановки реакции. Сразу после остановки реакции отбирали 100 мкл полученных образцов и наносили в лунки, заранее покрытые антителами и определяли количество нейротофического фактора c помощью спектрофотометра для плашек (BioRad iMark, США). Содержание нейротрофического фактора в стриаутме и ЧС нормировали на количества суммарного белка в исследуемых структурах, определенного с помощью BCA метода [Smith et al., 1985]. 2.8 Статистическая обработка результатов Для определения статистической значимости полученных данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента (t-тест) и непараметрический U-критерий МаннаУитни (U-тест) в программах GraphPad Prism Version 5.0 (GraphPad Software, США) и Office Excel (Microsoft, США). Данные представлены как среднее значение ± средняя ошибка среднего значения. Достоверность различий признавалась при p < 0,05, при 0,05 > p < 0,1 расценивалось как тенденция к изменению, при р > 0,01 изменения считались недостоверными. 63 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Морфологическая характеристика и количественный анализ нигростриатной дофаминергической системы в контроле и в первые сутки после введения МФТП 3.1.1 Морфологическая характеристика и количественный анализ тел дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции Тела ТГ-иммунореактивных (ДА-ергических) нейронов в компактной части ЧС представляют собой вытянутые округлые нейроны с окрашенной цитоплазмой и хорошо видимым ядром, средний диаметр и площадь сом составляет 20 мкм и 166 мкм2 соответственно. Ядра нейронов имеют овальную форму со средним диаметром около 11 мкм. Распределение тел ТГ-иммунореактивных в компактной части ЧС имеет рострокаудальный градиент, наибольшее количество нейронов находится в ростральном отделе компактной части ЧС (рисунок 16, 17). Количество нейронов в компактной части ЧС у контрольной группы (0,9% NaCl) мышей линии C57BL/6 в возрасте 2-2,5 месяца составляло в среднем 1639 (1508 ± 41,5, 1610 ± 64,3, 1834 ± 80,8 и 1603 ± 92,0) клеток во всей компактной части ЧС в одной половине мозга. Через 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП морфологические параметры, такие как площадь (мкм2) и диаметр (мкм) тела нейрона и диаметр (мкм) ядра ТГ-иммунореактивных нейронов в компактной части ЧС, не изменялись (таблица 1). На рисунке 17 приведено распределение количества ТГ-иммунореактиных нейронов в ЧС через 6 часов после последней инъекции МФТП. Снижение числа нейронов после введения МФТП в большей степени выражено в медиальном отделе компактной части ЧС, а именно с 11 по 30 срез ЧС (рисунок 17). Также показано, что количество нейронов снижается в каудальном отделе ЧС, но в меньшей степени, чем в медальном отделе. Аналогичное снижение количества в медиальной части ЧС сохранялось и в последующие сроки – через 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП. Через 3 часа после последней инъекции МФТП количество ТГ-иммунореактиных нейронов в компактной части ЧС не изменялось по сравнению с контролем (0,9% NaCl), составляя 1508 ± 41,5 в опытной и 1511 ± 70,0 в контрольной группах (рисунок 18, 19). Через 6 часов обнаружено снижение количества ТГ-иммунореактиных нейронов до 67% (1082 ± 136,4) от уровня в контроле (1610 ± 64,3). Через 12 и 24 часа количество нейронов 64 составляло 1171 ± 73,2 и 919,8 ± 84,0 в опытных группах и 1834 ± 80,8 и 1603 ± 92,0 в контрольных соответственно. ЧСк ЧСк 500 мкм Bregma -2,80 мм ЧСл ВТО Bregma -2,92 мм ЧС л ВТО ЧСк ЧСк Bregma -3,52 мм Bregma -3,08 мм ЧСл РРО ВТО ВТО ЧСк ЧСк Bregma -3,64 мм Bregma -3,80 мм ВТО – вентральная тегментальная область, РРО – ретрорубральная область, ЧСк – компактная часть черной субстанции, ЧСл – латеральная часть черной субстанции. Рисунок 16 – Ростро-каудальное распределение количества ТГ-иммунореактивных нейронов в среднем мозге в контроле (0,9% NaCl) Количество ТГ-ИР нейронов на срез 65 140 0,9% NaCl 120 МФТП 100 80 60 40 20 0 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 Номер среза ТГ-ИР нейроны – тирозингидроксилаза-иммунореактиные нейроны. Рисунок 17 – Ростро-каудальное распределение количества ТГ-иммунореактивных нейронов в компактной части черной субстанции в контроле (0,9% NaCl) и через 6 часов после последней инъекции МФТП Таблица 1 – Морфометрические показатели тирозингидроксилазаиммунореактивных (ТГ-ИР) нейронов в компактной части черной субстанции: площадь (мкм2), диаметр (мкм), а также диаметр ядра сомы (мкм) в контроле (0,9% NaCl) и через 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП Время после введения 0,9% 3 часа 6 часов 12 часов 24 часа NaCl / МФТП Группа животных Параметр Площадь ТГ-ИР 0,9% NaCl МФТП 0,9% МФТП NaCl 0,9% NaCl МФТП 0,9% NaCl 166,1±16,8 176,5±10,1 164,5±15,2 МФТП 166±18,0 181,9±8,3 167,9±10,9 168,9±5,8 169±8,9 20,9±0,8 21,9±0,4 20,8±1,0 20,5±0,4 20,4±0,8 21,0±0,6 21,0±0,8 20,7±0,4 11,6±0,2 11,4±,03 11,6±0,5 11,8±0,3 10,7±0,4 10,5±0,2 10,7±0,5 10,4±0,5 нейронов, мкм2 Диаметр ТГ-ИР нейронов, мкм Диаметр ядра ТГИР нейронов, мкм *р < 0,05 по сравнению с контролем Количество ТГ-иммунореактивных нейронов в компактной части статистически достоверно снижалось к 6 часам после последней инъекции МФТП, при сравнении с предыдущим сроком (3 часа). В последующие 18 часов количество нейронов не 66 изменилось, хотя сохранялась тенденция к снижению их количества к 24 часам после последней инъекции МФТП (р < 0,1) (рисунок 19). А Bregma -2,92 мм 0,9% NaCl Б В 3 часа после МФТП 6 часов после МФТП Г Д 12 часов после МФТП 24 часов после МФТП Объектив х10. Бар – 100 мкм Рисунок 18 – Световая микроскопия. ТГ-иммунореактивные нейроны в черной субстанции в контроле (0,9% NaCl) (А) и через 3 часа (Б), 6 часов (В), 12 часов (Г) и 24 (Д) часа после последней инъекции МФТП 67 МФТП Количество ТГ-ИР нейронов в ЧС, % от контроля 0,9% NaCl 120 Δ 100 * 80 * * 60 40 20 0 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч ТГ-ИР нейроны – тирозингидроксилаза-иммунореактивные нейроны, ЧС – черная субстанция. *р < 0,05 по сравнению с контролем; Δр < 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 19 – Количество ТГ-иммунореактивных нейронов в компактной части черной субстанции через 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 3.1.2 Морфологическая характеристика и количественный анализ дофаминергических терминалей в дорсальном стриатуме Площадь терминалей ТГ-иммунореактивных аксонов в дорсальной стриатуме составляла в среднем 2,6 мкм2 у контрольных животных (таблица 2). Количество ТГиммунореактивных терминалей аксонов в контрольных группах (0,9% NaCl) составляло 2404 ± 53,3, 2077 ± 34,3, 2033 ± 17 и 2050 ± 29,9 в дорсальном стриатуме на единицу площади (200 х 200 мкм2) (рисунок 20). Морфометрический анализ не показал изменений в размерах ТГ- иммунореактивных терминалей в дорсальном стриатуме через 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП по сравнению с контролем. Количество терминалей в стриатуме через 3 часа после последней инъекции МФТП составляло 1596 ± 39,5, что было ниже количества в контроле (2404 ± 53,3) на 33,5% (рисунок 20, 21). Через 6, 12 и 24 часа количество терминалей аксонов было снижено относительно контролей в равной степени и составляло 1138 ± 28, 1053 ± 56,8 и 1073 ± 29,7, что относительно контролей (2077 ± 34,3; 2033 ± 17 и 2050 ± 29,9) составляло 52 – 55%. 68 А 0,9% NaCl Б В 3 часа после МФТП 6 часов после МФТП Г Д 12 часов после МФТП 24 часа после МФТП Объектив х100. Бар – 10 мкм. Рисунок 20 – Световая микроскопия. ТГ-иммунореактивные волокна (черные стрелочки) и терминали (белые стрелочки) в дорсальном стриатуме в контроле (0,9% NaCl) и через 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП Снижение количества ТГ-иммунореактиных терминалей в дорсальном стриатуме на 12% происходило к 6 часам после последней инъекции МФТП при сравнении с 69 предыдущим сроком (3 часа). После этого вплоть до последнего изученного срока – 24 часа их количество не изменялось. Таблица 2 – Площадь (мкм2) ТГ-иммунореактивных (ТГ-ИР) терминалей в дорсальном стриатуме в контроле (0,9% NaCl) и через 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП Время после введения 0,9% 3 часа 6 часов 12 часов 24 часов NaCl / МФТП Группа животных Параметр 0,9% 0,9% МФТП NaCl 0,9% МФТП NaCl МФТП NaCl 0,9% NaCl МФТП Площадь ТГ-ИР терминалей 2,4±0,01 аксонов, мкм 2,5±0,01 2,7±0,02 2,6±0,01 2,6±0,01 2,7±0,01 2,6±0,02 2,7±0,01 2 *р < 0,05 по сравнению с контролем. Количество ТГ-ИР терминалей в стриатуме, % от контроля 0,9% NaCl 120 МФТП Δ 100 80 * * 60 * * 40 20 0 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч *р < 0,05 по сравнению с контролем; Δр < 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 21 – Количество ТГ-иммунореактивных (ТГ-ИР) терминалей в дорсальном стриатуме через 3, 6, 12 и 24 часа после последнего введения МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 70 3.2. Функциональное состояние нигростриатной системы в контроле и в первые сутки после введения МФТП 3.2.1 Содержание дофамина и 3,4-диоксифенилуксусной кислоты в компактной части черной субстанции Содержание ДА в компактной части ЧС составляло в среднем 6 пмоль (8,3 ± 0,9; 4,3 ± 1,5; 5,3 ± 0,3; 6,4 ± 0,5 и 6,0 ± 0,6 пмоль) у контрольных животных без достоверных различий между контролями. Через 1 час после последней инъекции МФТП содержание ДА было достоверно ниже по сравнению с контролем (8,3 ± 0,9 пмоль), ровняясь 2,6 ± 0,3 пмоль (рисунок 22). Через 3 и 6 часов после последней инъекции МФТП содержание ДА составляло 1,1 ± 0,2 и 1,9 ± 0,2 пмоль, что при сравнении с соответствующими контролями (4,3 ± 1,5 и 5,3 ± 0,3 пмоль) составляло снижение в три раза. Через 12 и 24 часа содержание ДА составляло 4,6 ± 0,5 и 4,2 ± 0,3 пмоль, в то время как в контролях 6,4 ± 0,5 и 6,0 ± 0,6 пмоль соответственно. При сравнении содержания ДА в опыте не было обнаружено статистически значимых различий через 1, 3 и 6 часов после последней инъекции МФТП, а также между 12 и 24 часа. В то время как, содержание ДА увеличилось в два раза в интервале между 6 и 12 часами после последней инъекции МФТП (рисунок 22). МФТП Содержание дофамина в ЧС, % от контроля 0,9% NaCl 120 Δ 100 * 80 * 60 40 * * * 20 0 1 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч ЧС – черная субстанция. *р < 0,05 по сравнению с контролем; Δр < 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 22 – Содержание дофамина в компактной части черной субстанции (ЧС) через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 71 Содержание ДОФУК, одного из основных продуктов деградации ДА, в компактной части ЧС в контрольных группах в среднем составляло 2 пмоль (1,5 ± 0,3; 2,8 ± 0,4; 2,8 ± 0,4; 1,8 ± 0,2; 1,9±0,2 пмоль), без достоверных различий между контролями. В первые 12 часов после последней инъекции МФТП было обнаружено снижение содержания ДОФУК в ЧС по сравнению с контрольными группами (рисунок 23). Так, через 1 час после последней инъекции МФТП содержание ДОФУК составляло 0,8 ± 0,1 пмоль, в то время как в соответствующем контроле 1,5 ± 0,3 пмоль. Через 3 часа содержание ДОФУК было на уровне 1,1 ± 0,4 пмоль, а через 6 часов – 0,6 ± 0,1 пмоль, в контролях – 2,8 ± 0,4 пмоль. Через 12 часов содержание ДОФУК также было ниже контроля (1,8 ± 0,2 пмоль) и составляло 1,1 ± 0,3 пмоль, а через 24 часа статистически достоверной разницы не было обнаружено между контролем (1,9 ± 0,2 пмоль) и опытом (1,5 ± 0,7 пмоль). Через 1 и 6 часов после последней инъекции МФТП происходило снижение содержания ДОФУК в ЧС в два раза, между 3 и 6 часов была обнаружена тенденция к снижению содержания ДОФУК, хотя не было достоверных различий. Было обнаружено увеличение в 4 раза содержания ДОФУК к 24 часам после последнего введения МФТП при сравнении с данным показателем через 6 часов. 0,9% NaCl Δ 120 Содержание ДОФУК в ЧС, % от контроля МФТП Δ 100 80 * 60 * * 40 * 20 0 1 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч ДОФУК – 3,4-диоксифенилуксусная кислота, ЧС – черная субстанция. *р < 0,05 по сравнению с контролем; Δр < 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 23 – Содержание 3,4-диоксифенилуксусной кислоты в компактной части черной субстанции через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 72 3.2.2 Концентрация дофамина и 3,4-диоксифенилуксусной кислоты в дорсальном стриатуме Концентрация ДА в дорсальном стриатуме составляла в среднем 16,2 мкг/г веса ткани в контрольных группах, а именно 14,8 ± 0,5, 19,5 ± 0,3, 14,2 ± 1,4, 18,1 ± 2,2 и 14,5 ± 1,0 мкг/г. После введения МФТП уровень ДА резко падал, через 1 час после последней инъекции МФТП концентрация ДА была снижена почти в 9 раз по сравнению с контролем (14,8 ± 0,5 мкг/г в контрольной группе и 1,9 ± 0,2 в опытной группе). В дальнейшем, через 3, 6, 12 и 24 часа после введения МФТП, концентрация ДА не изменялась при сравнении с концентрацией ДА через 1 час, составляя 2,2 ± 0,3, 1,5 ± 0,1, 2,5 ± 0,3 и 1,9 ± 0,1 мкг/г соответственно (рисунок 24). МФТП 0,9% NaCl Концентрация дофамина в стриатуме, % от контроля 120 100 80 60 40 20 * * * * * 0 1 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч *р < 0,05 по сравнению с контролем. Рисунок 24 – Концентрация дофамина в дорсальном стриатуме через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% Концентрация ДОФУК в дорсальном стриатуме в норме примерно в 10 раз меньше, чем ДА, и составляла в среднем 1440 нг/г веса ткани (1130 ± 84, 1881 ± 86, 1534 ± 290, 1470 ± 209 и 1295 ± 124 нг/г) (рисунок 25). Концентрация ДОФУК через 1 час была снижена до 171 ± 43 нг/г, в то время как в соответствующем контроле было 1130 ± 84 нг/г, что составляет 15%. Через 3, 6, 12 и 24 часа концентрация ДОФУК также была ниже контрольного уровня примерно на 80%: в контроле через 3 часа –1881 ± 86, 6 часов – 1534 ± 290, 12 часов – 1470 ± 209 и 24 часа – 73 1295 ± 124 нг/г), в то время как в опытных группах 3 часа – 147 ± 30, 6 часов – 206 ± 34, 12 часов – 379 ± 73 и 24 часа – 340 ± 32 нг/г соответственно. При сравнении концентрации ДОФУК между сроками было обнаружено, что через 3 часа сохранялась тенденция к снижению концентрации метаболита по сравнению с данными, полученными через 1 час. В последующие временные сроки, через 6, 12 и 24 часа, наблюдалась тенденция к увеличению уровня ДОФУК соответственно до 14%, 19% и 26%. Однако статистически достоверные различия были отмечены только между сроками 3 часа и 24 часа после последней инъекции МФТП (рисунок 25). Концентрация ДОФУК в стриатуме, % от контроля 0,9% NaCl МФТП Δ 120 100 80 60 40 * 20 * * * * 0 1 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч ДОФУК – 3,4-диоксифенилуксусная кислота. *р < 0,05 по сравнению с контролем; Δр < 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 25 – Концентрация 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) в дорсальном стриатуме через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 3.2.3 Соотношение содержания 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и содержанию дофамину в компактной части черной субстанции Соотношение содержания продукта деградации и содержанию нейромедиатора является интегративным показателем «оборота» (―turnover‖) нейромедиатора, который складывается из синтеза, выделения, обратного захвата и деградации медиатора. Соотношение ДОФУК/ДА в ЧС через 1 и 3 часа после последнего введения МФТП было увеличено примерно в 2 раза относительно уровня в контролях, принятых за 100%. Через 74 6 и 12 часов было обнаружено снижение уровня ДОФУК/ДА в 3 и почти в 2 раза, соответственно. Через 24 часа после последней инъекции МФТП соотношение ДОФУК/ДА было на уровне в контроле (рисунок 26). Между сроками изменения были обнаружены только между 3 и 6 часами, когда происходило статистически достоверное снижение соотношения ДОФУК/ДА от 199% до 30%, а также между 12 и 24 часами при увеличении от 64% (12 часов) до 119% (24 часа). 0,9% NaCl Отношение ДОФУК/ДА в ЧС, % от контроля 300 МФТП Δ * 250 200 Δ 150 100 * * 50 0 1 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч ДА – дофамин, ДОФУК – 3,4-диоксифенилуксусная кислота, ЧС – черная субстанция. *р < 0,05 по сравнению с контролем; Δр < 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 26 – Соотношение содержания 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и содержания дофамина (ДОФУК/ДА) в компактной части черной субстанции через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 3.2.4 Соотношение концентрации 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и концентрации дофамину в дорсальном стриатуме Соотношение концентраций ДОФУК/ДА в дорсальном стриатуме не менялось в первые 6 часов после последней инъекции МФТП. Через 12 и 24 часа происходило значительное увеличение соотношения ДОФУК/ДА в 2,5 и 2 раза соответственно 75 относительно уровня в контроле, что также было статистически достоверно при сравнении с соотношением ДОФУК/ДА на предыдущем сроке, 6 часов (рисунок 27). МФТП Отношение ДОФУК/ДА в стриатуме, % от контроля 0,9% NaCl Δ 350 * 300 250 * 200 150 100 50 0 1 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч ДА – дофамин, ДОФУК – 3,4-диоксифенилуксусная кислота. *р < 0,05 по сравнению с контролем; Δр < 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 27 – Соотношение концентрации 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и концентрации дофамина (ДОФУК/ДА) в дорсальном стриатуме через 1, 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 3.2.5 Ферментативная активность тирозингидроксилазы в нигростриатной системе после введения МФТП Активность ТГ является основным показателем скорости синтеза ДА и определяется по накоплению L-ДОФА при ингибировании ДАА, второго фермента синтеза ДА. В контроле содержание L-ДОФА в ЧС, при ингибировании второго фермента синтеза ДА, составляло в среднем 11 пмоль (11,0 ± 1,2, 13,2 ± 0,7 и 8,2 ± 1,1 пмоль). Содержание L-ДОФА в компактной части ЧС через 3 часа после последней инъекции МФТП было снижено в 2 раза по сравнению с уровнем в контроле и составляло 5,4 ± 0,5, пмоль (в контроле – 11,0 ± 1,2 пмоль). Через 6 часов было обнаружено также сниженное содержание L-ДОФА: 13,2 ± 0,7 пмоль в контрольной группе и 4,1 ± 0,4 пмоль в опытной группе. Через 12 часов изменений относительно уровня в контроле не было, однако, было обнаружена тенденция к снижению (р < 0,1). Содержание L-ДОФА в 76 компактной части ЧС статически значимо снижалось от 3х до 6 часов после последней инъекции МФТП и увеличивалось к 12 часам (рисунок 28). В дорсальном стриатуме концентрация L-ДОФА, при ингибировании второго ДАА, в контрольных группах составляет 3800 нг/г на вес ткани (4316 ± 288, 2838 ± 386 и 4339 ± 263 нг/г) (рисунок 28). На все исследуемые сроки концентрация L-ДОФА была существенно ниже относительно соответствующих контролей. Так, через 3 часа после последней инъекции МФТП концентрация L-ДОФА была снижена в 20 раз по сравнению с контролем (контроль – 4316 ± 288 нг/г, опыт – 234 ± 36 нг/г). Через 6 часов уровень LДОФА был ниже в 9 раз (324 ± 109 нг/г), чем в контроле (2838 ± 386 нг/г), а через 12 часов в 3,5 раза ниже и составляла 1251 ± 135 нг/г (контроль – 4339 ± 263 нг/г). При сравнении концентрации L-ДОФА в дорсальном стриатуме между сроками было обнаружено, что уровень аминокислоты статистически достоверно увеличивается между 3 и 6 часов и 6 и 12 часов после последней инъекции (рисунок 28). Содержание L-ДОФА в ЧС, % от контроля МФТП Δ Б Δ Δ Δ 120 100 100 80 80 60 60 * * 40 * 20 * * 40 20 0 0 3 6 12 Время после введения МФТП, ч 3 6 Концентрация L-ДОФА в стриатуме, % от контроля 0,9% NaCl А 120 12 Время после введения МФТП, ч L-ДОФА – 3-гидрокситирозин, ЧС – черная субстанция. *р < 0,05 по сравнению с контролем; Δр < 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 28 – Содержание в компактной части черной субстанции (А) и концентрация в дорсальном стриатуме (Б) L-ДОФА при ингибировании декарбоксилазы ароматических аминокислот в контроле и через 3, 6 и 12 часов после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 77 3.2.6 Концентрация глиального нейротрофического фактора в черной субстанции и стриатуме Концентрация глиального нейротрофического фактора в компактной части ЧС в контрольных группах совпадала между собой и составляла 9,1 ± 2,8 и 7,5 ± 2,2 нг/г белка (рисунок 29). Через 3 и 6 часов после последней инъекции МФТП изменений не было обнаружено в ЧС. Так через 3 часа концентрация нейротрофического фактора была 10,6 ± 1,9 нг/г белка, а через 6 часов – 7,5 ± 2,2 нг/г белка. Концентрация глиального нейротрофического фактора в дорсальном стриатуме в контрольных группах была в 6 раз ниже, чем в ЧС и составляла 1,3 ± 0,2 нг/г белка и 1,4 ± 0,3 нг/г белка. Изменений концентрации нейротрофического фактора через 3 и 6 часов после последней инъекции МФТП не было обнаружено, и она составляла 1,2 ± 0,1 нг/г белка на обоих сроках (рисунок 29). Концентрация ГНФ в ЧС, нг/г 14 А MФТП Б 2 12 1,5 10 8 1 6 4 0,5 2 0 3 6 Время после МФТП, ч Концентрация ГНФ в стриатуме, нг /г 0,9% NaCl 0 3 6 Время после МФТП, ч ГНФ – глиальный нейротрофический фактор, ЧС – черная субстанция. Рисунок 29 – Концентрация глиального нейротрофического фактора (нг/г белка) в компактной части черной субстанции (А) и в дорсальном стриатуме (Б) в контроле и через 3, 6 часов после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl) 78 3.3. Функциональная характерисуноктика отдельных дофаминергических нейронов нигростриатной системы в контроле и в первые сутки после введения МФТП 3.3.1 Внутриклеточное содержание тирозингидроксилазы в телах нейронов в компактной части черной субстанции Оптическая плотность тел ТГ-иммунореактивных нейронов в компактной части ЧС, которая коррелирует с внутринейрональным содержанием фермента, на всех исследованных сроках после введения МФТП оставалась на уровне контроля (рисунок 30). 0,9% NaCl МФТП ОП ТГ в нейроноах в ЧС, % от контроля 120 100 80 60 40 20 0 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч ОП – оптическая плотность, ЧС – черная субстанция. Рисунок 30 – Оптическая плотность ТГ-иммунореактивных нейронов в компактной части черной субстанции через 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 3.3.2 Содержание тирозингидроксилазы в терминалях дофаминергических аксонах нигростриатной системы в дорсальном стриатуме Оптическая плотность ТГ-иммунореактивных терминалей в дорсальном стриатуме была снижена на всех исследованных сроках. Так, через 3 часа после последней инъекции МФТП составляла 76% от контрольного уровня; через 6 и 12 часов она достигала 61% и 58% от уровня в контроле, а через 24 часа оптическая плотность ТГ-иммунореактивных терминалей аксонов составляла 82% (рисунок 31). 79 При сравнении полученных результатов были обнаружены статически значимое снижение уровня оптической плотности ТГ-иммунореактивных терминалей от 3х до 6 часов с отсутствием изменений в последующие 3 часа. Однако еще через 12 часов (через 24 часа после последней инъекции МФТП) было отмечено увеличение оптической плотности в стриатуме по сравнению с предыдущим сроком (рисунок 31). ОП ТГ в терминалях аксонов в стриатуме , % от контроля 0,9% NaCl МФТП Δ 120 Δ 100 * * 80 * 60 * 40 20 0 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч ОП – оптическая плотность. *р < 0,05 по сравнению с контролем; Δр < 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 31 – Оптическая плотность ТГ-иммунореактивных терминалей аксонов в дорсальном стриатуме через 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 3.3.3 Активность тирозингидроксилазы в отдельном нейроне в компактной части черной субстанции и отдельной терминали в дорсальном стриатуме Содержание L-ДОФА при ингибировании декарбоксилазы ароматических Lаминокислот в отдельном нейроне, которое было оценено как отношение содержания LДОФА в ЧС к общему количеству ТГ-иммунореактивных нейронов в компактной части ЧС, было снижено через 3 часа после последней инъекции МФТП в 2 раза и сохранялось на этом же уровне в последующие 3 часа. В течение следующих 6 часов было обнаружено достоверное увеличение содержания L-ДОФА до контрольного уровня по сравнению с предыдущим сроком (рисунок 32). 80 Концентрация L-ДОФА при ингибировании декарбоксилазы ароматических Lаминокислот в отдельной терминали в дорсальном стриатуме была высчитана аналогично ее содержанию в телах нейронов. Через 3 часа после последней инъекции МФТП концентрация L-ДОФА была снижена почти в 13 раз, через 6 часов – в 5 раз, а через 12 часов – в 1,5. При этом между сроками были обнаружены статистически достоверные Содержание L-ДОФА в нейроне ЧС, % от контроля 0,9% NaCl 140 А Δ МФТП Б Δ 120 Δ 120 100 100 * 80 80 60 * 60 * 40 40 * 20 20 * 0 0 3 6 12 Время после введения МФТП, ч 3 6 12 Концентрация L-ДОФА в терминале в стриатуме, % от контроля изменения: между 3 и 6 часов и между 6 и 12 часов (рисунок 32). Время после введения МФТП, ч L-ДОФА, 3-гидрокситирозин, ЧС – черная субстанция. *р < 0,05 по сравнению с контролем. Рисунок 32 – А. Содержание L-ДОФА при пересчете на отдельный нейрон в черной субстанции; Б. Концентрация L-ДОФА в отдельной терминали в дорсальном стриатуме через 3, 6 и 12 часов после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 3.3.4 Содержание дофамина в отдельном нейроне в компактной части черной субстанции после введения МФТП Содержание ДА в телах нейронов в компактной части ЧС было снижено через 3 и 6 часов на 75% и 58% соответственно от уровня в контроле. Через 12 и 24 часа содержание ДА в телах нейронов не изменялось по сравнению с контролем. Было обнаружено статистически достоверное увеличение уровня ДА через 6 и 12 часов по сравнению с предыдущими сроками (3 и 6 часов) соответственно (рисунок 33). Содержание дофамина в нейроне ЧС, % от контроля 81 0,9% NaCl 140 МФТП Δ Δ 120 100 80 60 * 40 * 20 0 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч ЧС – черная субстанция. *р < 0,05 по сравнению с контролем; Δр < 0,05 между выбранными сроками. Рисунок 33 – Содержание дофамина в отдельном нейроне в компактной части черной субстанции через 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 3.3.5 Концентрация дофамина в отдельной терминали аксона в дорсальном стриатуме после введения МФТП Концентрация ДА в отдельной терминали аксонов в дорсальном стриатуме через 3 и 6 часов после последнего введения МФТП была в значительной степени снижена относительно контролей и составляла 17%. На последующие сроки концентрация ДА в терминали аксонов составляла 25% от уровня в контролях. Между двумя сроками – 6 и 12 часов, не было обнаружено статистически значимое увеличение концентрации ДА (рисунок 34). 82 МФТП Концентрация дофамина в терминале аксона в стриатуме, % от контроля 0,9% NaCl 120 100 80 60 40 * * 20 * * 0 3 6 12 24 Время после введения МФТП, ч *р < 0,05 по сравнению с контролем. Рисунок 34 – Концентрация дофамина в отдельной терминали аксона в дорсальном стриатуме через 3, 6, 12 и 24 часа после последней инъекции МФТП относительно уровня в контроле (0,9% NaCl), принятого за 100% 3.4 Влияние ингибитора обратного захвата дофамина – номифензина на нигростриатную систему Содержание ДА и ДОФУК в компактной части ЧС в группах животных, получавших 0,9% NaCl и 0,9% NaCl (контроль), составляло 5,9 ± 1,0, 1,02 ± 0,2 и 2,8 ± 0,4 пмоль соответственно. В группе, получавшей 0,9% NaCl и номифензин, изменений по содержанию ДА и ДОФУК в ЧС не было обнаружено по сравнению с группой 0,9% NaCl и 0,9% NaCl и составляло 6,3 ± 0,5 и 1,2 ± 0,4 пмоль. В группе МФТП и 0,9% NaCl содержание ДА сохранялось на уровне контроля и было ровно 3,5 ± 0,7 пмоль, а содержание ДОФУК было ниже и составляло 0,5 ± 0,1 пмоль (таблица 3, рисунок 35). В группе, получавшей МФТП и номифензин, содержание ДА и ДОФУК было равно 5,9 ± 0,6 и 0,6 ± 0,1 пмоль, соответственно, что совпадает с их содержанием в контрольной группой. Отношение ДОФУК/ДА было принято за 100% в группе контроля (0,9% NaCl и 0,9% NaCl) и в опытных группах: 0,9% NaCl и номифензин и МФТП и 0,9% NaCl достоверных изменений обнаружено не было, составляя 121 % ± 15 и 119 % ± 38 соответственно. Было обнаружено двухкратное снижение соотношения ДОФУК/ДА в 83 группе МФТП и номифензин при сравнении с контрольной группой (0,9% NaCl и 0,9% NaCl). В дорсальном стриатуме количество терминалей ТГ-ИР аксонов не изменялось в группе 0,9% NaCl и номифензин и составляло 1572 ± 13,4 по сравнению с контрольной группой (1589 ± 19,6). Количество терминалей аксонов в группах МФТП и 0,9% NaCl и МФТП и номифензин было 889,5 ± 13,4 и 1395 ± 38,6, что было ниже от уровня в контроле на 56% и 12%, соответственно. Между этими группами были обнаружены статистически достоверные различия. Таблица 3 – Содержание и концентрация дофамина (ДА), 3,4диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и соотношение ДОФУК/ДА в компактной части черной субстанции (ЧС) и дорсальном стриатуме, а также количество терминалей ТГиммунореактивных аксонов в дорсальном стриатуме через 12 часов в группах 0,9% NaCl и 0,9% NaC;, 0,9% NaCl и номифензин; МФТП и 0,9% NaCl; МФТП и номифензин Группа животных Область 0,9% NaC l и 0,9% NaCl и МФТП и МФТП и 0,9% NaCl номифензин 0,9% NaCl номифензин Черная субстанция ДА, пмоль 5,9±1,0 6,3±0,5 3,5±0,7 5,9±0,6 ДОФУК, пмоль 1,0±0,2 1,2±0,4 0,5±0,1 * 0,6±0,1 ДОФУК/ДА, % 100±22 121±15 119±38 47±7,8 * Стриатум Количество ТГ-ИР 1589±19,6 1572±62,1 889,5±13,4* 1395±38,6 * ДА, мкг/г 19±1,4 19,7±1,4 3,9±0,3 * 20,3±1,2 ДОФУК, нг/г 109±112 1053±178 362±130 * 626±121 ДОФУК/ДА, % 100±6,3 89,0±9,8 154±50 53±11 * терминалей, шт *р < 0,05 по сравнению с контролем (0,9% NaCl + 0,9% NaCl). Концентрации ДА и ДОФУК в дорсальном стриатуме в группе животных, получавших 0,9% NaCl и номифензин, были 19,7 ± 1,4 мкг/г и 1053 ± 178, что совпадает с концентрациями катехоламинов в контрольной группе (19 ± 1,4 мкг/г и 1096 ± 112 нг/г). В группе МФТП и 0,9% NaCl концентрации ДА и ДОФУК были ниже контрольного значения и составляли 3,9 ± 0,3 мкг/г и 362 ± 130 нг/г. В группе, получавшей МФТП и 84 номифензин изменений концентрации ДА (20,3 ± 1,2 мкг/г) и ДОФУК (626 ± 121 нг/г) не было обнаружено относительно контрольного уровня. В опытных группах 0,9% NaCl и номифензин и МФТП и 0,9% NaCl не было изменений в соотношении ДОФУК/ДА и составляли 89,0 % ± 9,8 и 154 % ± 50 соответственно относительно 0,9% NaCl и 0,9% NaCl – 100 % ± 6,3. В группе, получавшей МФТП и номифензин, соотношение ДОФУК/ДА было снижено в два раза (53 % ± 11) от уровня в контроле. А Δ 120 100 * 80 60 40 20 0 * Б 120 MФТП и 0,9% NaCl 100 80 60 40 20 * MФТП и номифензин В Δ Δ 120 Содержание ДА в ЧС, % от контроля 0,9% NaCl и номифензин Концентрация ДА в стриатуме, % от контроля Количество ТГ-ИР терминалей аксона в стриатуме, % от контроля 0,9% NaCl и 0,9% NaCl 0 100 80 * 60 40 20 0 Через 12 часов после МФТП ДА – дофамин, ТГ-ИР терминали аксона, тирозингидроксилаза – иммунореактиные терминали аксона, ЧС – черная субстанция. *р < 0,05 по сравнению с контролем (0,9% NaCl и 0,9% NaCl); Δр < 0,05 между выбранными группами. Рисунок 35 – Количество ТГ-иммунореактивных терминалей аксонов в стриатуме (А) и концентрация дофамина в дорсальном стриатуме (Б) и содержание дофамина в компактной части черной субстанции (В) через 12 часов после введения МФТП и номефензина в дозе 10 мг/кг 3.5 Влияние фрагмента адренокортикотропного гормона – Семакс на нигростриатную систему Концентрация ДА в дорсальном стриатуме при введении СЕМАКС за 12 часов до первой инъекции МФТП (группа МФТП и Семакс) была значительно снижена до 1,8 ± 0,3 мкг/г от контрольного уровня (19,9 ± 2,1 мкг/г), а также не отличалась от концентрации 85 ДА в группе, получавшей только МФТП (МФТП и 0,9% NaCl) – 1,5 ± 0,3 мкг/г (таблица 4, рисунок 36). Концентрация ДОФУК в одинаковой степени была снижена при сравнении с контролем в группах, получавших МФТП и 0,9% NaCl и МФТП и СЕМАКС и составляла 268 ± 34 нг/г и 205 ± 61 нг/г соответственно (0,9% NaCl и 0,9% NaCl – 2202 ± 208 нг/г). Соотношение ДОФУК/ДА изменялось в группе МФТП и 0,9% NaCl при сравнении с контрольной группой в два раза (195% ± 29). В группе, получавшей МФТП и СЕМАКС, изменений в соотношении ДОФУК/ДА не было от уровня в контроле (91% ± 31), однако, было обнаружено статистически значимое изменение при сравнении с группой МФТП и 0,9% NaCl. Введение Семакс через 1 час после последней инъекции МФТП не привело к изменению уровня катехоламинов в дорсальном стриатуме при сравнении с группой, получавшей только МФТП (МФТП и 0,9% NaCl). Так, концентрация ДА в обоих группах была снижена примерно в 10 раз до 1,4 ± 0,3 и 1,5 ± 0,2 мкг/г в группах МФТП и 0,9% NaCl и МФТП и Семакс, соответственно, в то время, как в контроле было 14,9 ± 0,6 мкг/г. Концентрация ДОФУК была равна 395 ± 89 нг/г в группе, получавшей МФТП и 0,9% NaCl, и 351 ± 47 нг/г, получавшей МФТП и Семакс, что ниже в 3,5 раза, чем в контроле 1440 ± 115 нг/г. Соотношение ДОФУК/ДА было увеличено в 2,9 и 2,4 раза в группах МФТП и 0,9% NaCl и МФТП и Семакс соответственно от уровня в контроле. Таблица 4 – Концентрация дофамина (ДА), 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и соотношение ДОФУК/ДА в дорсальном стриатуме через 12 часов после введения МФТП в группах 0,9% NaCl и 0,9% NaCl, МФТП и 0,9% NaCl, МФТП и Семакс Группа животных Параметр 0,9% NaC l и МФТП и МФТП и 0,9% NaCl 0,9% NaCl Семакс Семакс за 6 часов до МФТП ДА, мкг/г 18,1±1,3 1,5±0,3 * 1,8±0,3 * ДОФУК, нг/г 2202±208 268±34 * 205±61 * ДОФУК/ДА, % 100±29 195±29 * 91±31 Семакс через 1 час после МФТП ДА, мкг/г 14,9±0,6 1,4±0,3 * 1,5±0,2 * ДОФУК, нг/г 1440±115 395±89 * 351±47 * ДОФУК/ДА, % 100±6,3 289±29 * 243±24 * *р < 0,05 по сравнению с контролем (0,9% NaCl и 0,9% NaCl). 86 MФТП и 0,9% NaCl 0,9% NaCl и 0,9% NaCl А 120 100 80 60 40 20 0 * * Концентрация ДА в стриатуме, % от контроля Концентрация ДА в стриатуме, % от контроля 120 MФТП и Семакс Б 100 80 60 40 20 * * 0 *р < 0,05 по сравнению с контролем (0,9% NaCl и 0,9% NaCl). Рисунок 36 – Концентрация дофамина (ДА) в дорсальном стриатуме через 12 часов после последней инъекции МФТП при введении Семакс (50 мкг/кг) за 12 часов до введения МФТП (А) и через 1 час после последней инъекции МФТП (Б) 87 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Деградация нигростриатной ДА-ергической системы мозга, как известно, является основным элементом патогенеза БП. Гибель ДА-ергических нейронов может, по одной из гипотез, длиться десятилетиями, прежде чем появятся специфические симптомы, а именно нарушение двигательной функции. Считается, что переход из доклинической стадии в клиническую происходит при достижении порогового уровня деградации нигростриатной системы, а также истощении компенсаторных резервов в мозге. Порогом дегенерации считается гибель 50-60% ДА-ергических нейронов (тел нейронов) в ЧС и 70-80% их аксонов в стриатуме, что приводит к значительному дефициту ДА в стриатуме (снижение до 80%). Параллельно нейродегенерации развиваются компенсаторные процессы, которые обеспечивают возмещение сниженного уровня ДА и повышение чувствительность клеток мишеней к действию ДА в стриатуме, а также процессы, которые направлены на «защиту» сохранившихся ДА-ергических нейронов (например, увеличение экспрессии нейротрофических факторов). На сегодняшний день единственными методами диагностики заболевания на доклинической стадии являются ПЭТ или ОФЭКТ, которые, однако, не являются общедоступными методами из-за небольшой распространѐнности установок в силу их дороговизны и технической сложности. Кроме того, использование данных методов позволяет визуализировать функциональную недостаточность ДА-ергической системы на уровне стриатума, что без специфических симптомов БП, также может возникать при болезни Гентингтона, мультисистемной атрофии, деменции с тельцами Леви и др. [Picini, Cheesman, 2004]. Таким образом, в настоящее время возможность изучения функционального состояния ДА-ергической нигростриатной системы (синтез ДА, обратный захват, количество рецепторов к ДА в зависимости от использованного лиганда) с помощью ПЭТ и ОФЭКТ существует только на симптомной стадии БП, т.е. после постановки диагноза по наличию нарушений двигательной функции. В том числе, и по мере прогрессирования заболевания, в то время как количество выживших ДА-ергических нейронов, а, следовательно, и погибших нейронов, в ЧС можно установить только на аутопсийном материале. Поэтому крайне важным представляется моделирование заболевания на животных, что позволит заполнить «белые пятна» в представлении о патогенезе БП, например клеточно-молекулярные механизмы деградации нигростриатной системы по мере развития заболевания. На сегодняшний день общепринятым методом моделирования БП является использование предшественника нейротоксина МФТП, который превращается в клетках глии в токсин МФП+. МФП+, в свою очередь, вызывает дегенерацию ДА-ергических нейронов нигростриатной системы. Модель ранней клинической стадии БП у мышей была разработана в 88 нашей лаборатории при четырехкратном введении МФТП в разовой дозе 12 мг/кг [Ugrumov et al., 2011], что приводит к пороговой дегенерации ДА-ергических нейронов с появлением моторных нарушений. Данная модель была комплексно охарактеризована через 2 недели после введения МФТП, что позволило в полной мере изучить компенсаторные механизмы, которые развиваются при пороговой деградации нигростриатной системы, однако, уже после завершения процесса нейродегенерации. Для фундаментальной нейрофизиологии и для понимания клеточно-молекулярных механизмов патогенеза заболевания намного важнее воспроизведение двух сопряженных процессов, протекающих в мозге: нейродегенерации нигростриатной системы и компенсации функции погибших нейронов. Поэтому в рамках данного исследования был проведен анализ динамики дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы на модели ранней клинической стадии БП, а также основных параметров функционального состояния выживших нейронов. Учитывая то, что при БП нейродегенерация протекает непрерывно, нами было выдвинуто предположение, что, зная динамику дегенерации ДА-ергических нейронов, можно «прицельно» использовать потенциальные нейропротекторные вещества, так чтобы пик их действия приходился на пик дегенерации нейронов. Для проверки возможности использования данной модели БП в период дегенерации ДА-ергичкеских нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для скрининга потенциальных нейропротекторов в процессе нейродегенерации были поставлены эксперименты с ингибитором обратного захвата ДА номифензином, а также с индуктором синтеза эндогенных нейротрофических факторов и антиоксиданта – Семакс. 4.1. Динамика дегенерации и функциональное состояние выживших дофаминергических нейронов нигростриатной системы после введения МФТП 4.1.1 Методические предпосылки изучения динамики дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы В рамках данной работы первой задачей было определить период и скорость дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы как на уровне тел нейронов в ЧС, так и их аксонов в стриатуме. Несмотря на широкий выбор маркеров нейродегенерации для иммуногистохимии, большинство из них позволяют детектировать только специфический путь гибели нейронов (чаще всего апоптоз) на терминальных стадиях гибели нейрона (активная каспаза 3, а также TUNEL и FluoroJade – разрывы ДНК). Учитывая, что апоптоз длиться порядка 2-х часов [Elmore, 2007], а исследование динамики дегенерации ДА-ергических 89 нейронов может длиться несколько дней после введения МФТП [Jackson-Lewis et al., 1995; Aoki et al., 2009]. Сложно ожидать, что использование этих маркеров даст адекватные результаты по количеству дегенерирующих нейронов, т.к. данные методы позволяют только качественно констатировать наличие дегенерации нейронов. Поэтому в данной работе был использован общепринятая методология по оценке альтернативного показателя, а именно подсчет количества «выживших» ДА-ергических нейронов после введения МФТП, определяемое с помощью специфического маркера – ТГ, скорость-лимитирующего фермента синтеза ДА. ТГ равномерно распределена по всему нейрону от дендритов до терминалей аксонов. Эффективность такого подхода подтверждается совпадением количества ТГ- иммунореактивных нейронов в компактной части ЧС с количеством нейронов, окрашенных методом Ниссля после введения МФТП (через 1 и 7 дней, 2 недели), а также во время нейродегенерации – в первые несколько дней [Jackson-Lewis et al., 1995; Turmel et al., 2001]. Однако только в одной работе было показано расхождение количества нейронов, выявленных этими методами при нейродегенерации. На пике дегенерации нейронов в ЧС количество ТГиммунореактивных нейронов было меньше на 20%, чем количество нейронов, окрашенных по методу Ниссля [Jackson-Lewis et al., 1995]. При этом к 7-му дню после введения МФТП, к концу нейродегенерации согласно этой статье, количество ТГ-ИР нейронов увеличивается в ЧС, совпадая с количеством нейронов окрашенных методом Ниссля. Авторы исследования объясняют расхождение количества нейронов в ЧС недостаточным уровнем экспрессии ТГ в момент нейродегенерации для выявления ДА-ергических нейронов с помощью этого маркера. Учитывая то, что дегенерация нейронов при нейродегенеративных заболеваниях начинается с терминалей аксонов и потом ретроградно распространяется к телам нейронам [Iseki et al., 2001; Braak et al., 2006], крайне важным представляется изучение динамики дегенерации аксонов ДА-ергических нейронов в стриатуме и изменения их функционального состояния. Это возможно позволит найти новые механизмы дегенерации нейронов, а также потенциальные мишени для нейропротекции. На сегодняшний день подавляющее число работ по дегенерации терминалей ДА-ергических нейронов использует оптическую плотность окрашенного продукта методом иммуногистохимии (чаще всего на ТГ) всей области дорсального стриатума, что является косвенным показателем [Jakowec et al., 2004; Kurosaki et al., 2004]. Снижение оптической плотности ТГ в стриатуме может быть связано как с дегенерацией терминалей аксонов, так и со снижением количества белка в них в ответ на введение МФТП [Kozina et al., 2014]. Поэтому данный подход не является адекватным для изучения динамики дегенерации ДА-ергических аксонов в стриатуме. Только в одной работе была проведена количественная оценка терминалей аксонов в стриатуме в первые сутки после введения МФТП с использованием сетки Вейбеля [Kuhn et al., 2003]. Использованный 90 неавтоматизированный подсчет количества терминалей аксонов существенно ограничевает исследование, поэтому в работе Кухна с соавторами количество терминалей определеяли только в одной области стриатума. В то время как, в данном исследовании была использована разработаная оригинальная программа для автоматизированного подсчета количества терминалей аксонов, окрашенных на ТГ, в дорсальном стриатуме на единицу площади [Gurevich et al., 2010]. Этот подход позволил оценить их количество на всем протяжении стриатума, от ростральной части, до каудальной. 4.1.2 Динамика дегенерации нигростриатных дофаминергических нейронов под действием МФТП Согласно полученным нами результатам количество ДА-ергических нейронов ЧС начинало снижаться только через 3 часа после четырехкратного введения МФТП. Данное снижение продолжалось всего 3 часа, после чего их количество не менялось. Так, через 24 часа их количество составляло 57%, что соответствовало количеству нейронов через 2 недели после введения МФТП [Ugrumov et al, 2011]. Учитывая эти данные, увеличение продолжительности периода оценки количества ДА-ергических нейронов в ЧС было признано нами не целесообразным. Несмотря на то, что дегенерация тел ДА-ергических нейронов нигростриатной системы при БП является основным элементом патогенеза заболевания, существуют лишь единичные работы по исследованию динамики их дегенерации после введения МФТП [Jackson-Lewis et al., 1995; Aoki et al., 2009]. При этом анализ этих работ создает достаточно противоречивую картину. В двух работах была использованы мыши линии C57BL/6 такого же возраста и веса, что и в нашем исследовании, однако, доза МФТП была больше, составляя 20 мг/кг при аналогичном четырехкратном введении с интвервалом два часа. Тела ДА-ергических нейронов в ЧС выявлялись с помощью иммуногистохимии на ТГ. В работе Джексон-Левис с соавторами [Jackson-Lewis et al., 1995] дегенерация ДА-ергических нейронов (тел нейронов) начиналась позднее – через 12 часов после последней инъекции МФТП, и продолжалась дольше – в течение 36 часов. В работе Аоки с соавторами [Aoki et al., 2009] также была проведена оценка динамики дегенерации ДА-ергических нейронов в ЧС, согласно полученным данным количество ДАергических нейронов было снижено на 35% через 5 часов. Это согласуется с нашими данными, где количество нейронов снижалось к 6 часам. Однако в этой работе снижение длилось вплоть до 24 часов, достигая при этом 44% от уровня в контроле, в то время как по нашим данным их 91 количество не меняется после 6 часов. Единственным объяснением расхождения данных полученных в этих работах, несмотря на одинаковые схемы введения МФТП, а также с результатами нашей работы, могут быть разные методические подходы количественной оценки ДА-ергических нейронов (ТГ-иммунореактивные) в ЧС. Если в нашей работе был проведен подсчет количества тел ДА-ергичекских нейронов на серийный срезах, что позволило учесть зональность распределения нейронов в ЧС, то в работе Джексон-Левис для подсчета количества тел нейронов были использованы только выборочные срезы от 3-х до 5, а в работе Аоки не представлено методических указаний об уровне использованных срезов. Помимо количественного анализа ДА-ергических нейронов в ЧС мы также оценивали ростро-каудальный градиент при нейродегенерации. Было показано, что основная потеря ДАергических нейронов после введения МФТП происходит в медиальной части ЧС. Эти результаты согласуются с ранее полученными данными при разработке данной модели [Хаиндрава и др., 2010]. При увеличении дозы происходит снижение количества нейронов по всей протяженности ЧС примерно до 20 нейронов на срез [German et al., 1996]. Однако, учитывая то, что в контроле в медиальной части нейронов больше, чем в каудальной и ростральной частях ЧС, при введении МФТП наибольшее снижение количества нейронов происходит именно в этой области структуры. Деградация нигростриатной системы при БП в значительной степени выражена в медиальной и каудальной частях компактной части ЧС [Damier et al., 1999; German et al., 1992]. ЧС у приматов принято делить на субпопуляции ДА-ергических нейронов: матрикс, образованный нейронами, содержащими Са2+-связывающий белок кальбиндин, и 5 нигросом, в которых локализованы нейроны, не содержащих этот белок. Анализ чувствительности этих субпопуляций к нейротоксическим факторам показал, что нейроны, локализованные в матриксе, менее подвержены деградации по мере развитии заболевания (на терминальной стадии погибает 80%), чем нейроны нигросом. Для нейронов нигросом существует зависимость степени деградации от их расположения: так в каудальной части ЧС гибель нейронов достигает 100%, а ближе к ростральной части – до 70-80% [Lavoie, Parent, 1991; German et al., 1992; Damier et al., 1999]. У грызунов ЧС имеет несколько иную морфологическую организацию, чем у приматов, а именно нейроны, содержащие Са2+-связывающие белки кальбиндин и кларнитин, образуют дорсальный тяж, тянущийся от ростральной до каудальной части ЧС. В то же время вентральная и медиальная части ЧС представлены ДА-ергическими нейронами, которые не содержат данные белки [Liang et al., 1992a; McRitchie et al., 1996; Nemoto et al., 1999; et al., 2000]. После введения мышам линии С57BL/6 суммарной дозы 80 мг/кг МФТП наблюдается гибель ДА-ергических нейронов в ЧС, которые не содержат Са2+-связывающие белки, тогда как 92 остальные нейроны ЧС и нейроны ВТО не подвергаются дегенерации [Muthane et al., 1994]. Увеличение дозы МФТП до 140 мг/кг приводит к гибели ДА-ергических нейронов обеих популяций в ЧС, а также нейронов в ВТО [Liang et al., 1996b]. Таким образом, Са2+связывающие белки являются нейропротекторами для ДА-ергических нейронов ЧС за счет поддержания внутриклеточного уровня Са2+ и сдерживая образование АФК [Hirsch, 1992; Yamada et al., 1990; German et al., 1992; Liang et al., 1996b]. Представляется интересным факт, что после введения МФТП уровень кальбиндина в ДА-ергических нейронах ВТО повышается через 3 часа после введения нейротоксина [Ng et al., 1996]. Аналогичных данных по оценке уровня кальбиндина в ЧС в ответ на введения МФТП обнаружить не удалось. Однако учитывая то, что при увеличении дозы МФТП происходит гибель ДА-ергических нейронов в ЧС и ВТО обеих популяций (содержащих и не содержащих Са2+-связывающие белки), то вероятно, их наличие не является единственным фактором, отвечающим за протекцию нейронов. Одной из гипотез, объясняющей разную чувствительность к действию токсинов ДАергических нейронов разных систем (ЧС, ВТО и тубероинфудибулярная система – ТИДАС), является предположение о зависимости гибели нейронов от количества ДАТ на мембране, через который МФП+ проникает в нейрон [Sanghera et al., 1994]. С одной стороны, действительно, ДАТ на ДА-ергических нейронах ТИДАС практически отсутствуют из-за того, что волокна этих нейронов выбрасывают ДА в портальную систему циркуляции крови, и регуляция функционального состояния нейронов через механизм обратной связи у них не развита [Demarest, Moore, 1979; Annunziato et al., 1980; Revay et al., 1996]. Однако оказалось, что уровень МФП+ в этих нейронах превышает таковой в стриатуме в 4 раза через 5 часов после введения МФТП (20 мг/кг) и МФП+ захватывается в эти нейроны с помощью транспортера органических катионов 3 типа [Cui et al., 2009; Gasser et al., 2009; Benskey et al., 2012]. Эти данные свидетельствуют о том, что количество ДАТ на мембране не является определяющим фактором гибели ДА-ергического нейрона, а, вероятно, связано с молекулярными механизмами протекции в нейроне от действия токсина. Действительно, авторы этого исследования показали, что в нейронах ТИДАС происходит увеличение уровня паркина, который является Е3 лигазой, после введения МФТП, в то время как, в нейронах ЧС обнаружено снижение содержания данного белка [Benskey et al., 2012]. Подводя итог, можно заключить, что ДА-ергические нейроны различных систем реагируют на действие токсина по-разному из-за разного функционального состояния и разных механизмов защиты нейронов. Дальнейшее исследование и сравнение реакции на действие токсина ДА-ергических нейронов этих систем позволит найти клеточные механизмы, которые приводят к более высокой чувствительности нигростриатной системы, а также новые мишени для фармакотерапии. 93 Как уже упоминалось, в основе патогенеза БП лежит деградация не только тел ДАергических нейронов в ЧС, но и их аксонов в стриатуме. Более того, считается, что дегенерация нигростриатных ДА-ергических нейронов при БП начинается именно с деградации терминалей аксонов в стриатуме [German et al., 1996]. Это можно объяснить более высоким содержанием ДАТ на мембранах аксонов, чем на телах нейронов, что приводит к большему захвату МФП+ в нейроны на уровне аксонов и, следовательно, к более выраженному токсическому эффекту. Нами было показано, что через 3 часа после последней инъекции МФТП, число терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме, в отличие от тел нейронов, чье число не изменялось, было значительной степени снижено – примерно на 34% по сравнению с контролем. Это подтверждает более высокую чувствительность к МФТП аксонов по сравнению с телами нейронов. Деградация терминалей аксонов, как и тел нейронов, продолжается в последующие 3 часа, однако, с меньшей скоростью. Так, в это время число тел нейронов в ЧС уменьшилось на 35%, а терминалей аксонов в стриатуме – на 10%. Если предположить, что скорость деградации терминалей аксонов сохраняется на постоянном уровне, то этот процесс должен начинаться сразу же после первой инъекции МФТП (рисунок 37). Это предположение хорошо согласуется с данными, полученными в нашей лаборатории ранее, согласно которым количество терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме снижается на 20% уже после однократного введения МФТП в дозе 12 мг/кг [Ugrumov et al., 2011]. Через 6 часов после последней инъекции МФТП число терминалей ДАергических аксонов в стриатуме не изменялось, как и тела нейронов в ЧС в последующие изученные сроки – через 12 часов и 24 часа после последнего введения МФТП. Данные единственной работы, где проводили подсчет терминалей аксонов в стриатуме после острого введения МФТП (четырехкратно в разовой дозе 16,6 мг/кг), получены через 2 часа после второй инъекции и 3 часа после четвертой инъекции предшественника нейротоксина [Kuhn et al., 2003]. В этой работе количество терминалей ДА-ергических аксонов составляло 75% после второй инъекции МФТП по сравнению с контролем, а через 3 часа после четвертой инъекции их количество уже составляло 65%. Это означает, что в первые часы после начала введения МФТП деградация терминалей аксонов идет быстрее, т.к. за первые 6 часов количество терминалей снизилось на 25%, а за последующие 5 – только на 10%. Практически полное отсутствие работ по оценке динамики дегенерации терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме затрудняет интерпретацию полученных данных. Однако можно с уверенностью говорить, что из-за более продолжительного снижения количества терминалей аксонов по сравнению с телами ДА-ергических нейронов после введения МФТП именно на терминали аксонов следует ориентироваться при поиске и тестировании потенциального нейропротектора. 94 100% аксонов Количество терминалей аксонов 80 60 Период дегенерации составляет 14 часов 40 20 0 3 6 24 12 Время после введения МФТП, ч 0 Количество ДА-ергических терминалей аксонов в стриатуме, % от контроля 100 4 инъекции МФТП с интервалом 2 часа Рисунок 37 – Динамика дегенерации терминалей дофаминергических аксонов в стриатуме после введения МФТП Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что дегенерация как тел, так и терминалей аксонов ДА-ергических нейронов нигростриатной системы длиться до 6 часов после последней инъекции МФТП, при этом период дегенерации ДА-ергических тел нейронов длиться 3 часа, а терминалей аксонов около 14 часов. Скорость деградации терминалей аксонов составляет примерно 3-4% в час, в то время как тел нейронов около 10%. 4.1.3 Функциональное состояние дофаминергических нейронов, не подвергшихся дегенерации Помимо оценки количества тел ДА-ергических нейронов в ЧС и терминалей их аксонов в стриатуме был также проведен анализ функционального состояния «выживших» нейронов нигростриатной системы по основным показателям: содержание и активность ТГ, содержание ДА и ДОФУК. При этом было показано, что через 1 и 3 часа после последней инъекции МФТП содержание ДА в ЧС было снижено примерно на 70% от уровня в контроле, в то время как 95 количество ДА-ергических нейронов в ЧС не изменялось по сравнению с контролем. Это означает, что содержание ДА в телах отдельных нейронов в среднем сократилось примерно на 70% (таблица 10). Столь значительное снижение ДА в телах нейронов в первую очередь связано со снижением активности ТГ по сравнению с контролем в два раза, при этом уровень белка ТГ сохранялся на уровне контроля. Действие МФТП/МФП+ на фермент ТГ можно разделить на три фазы: в первые минуты после введения нейротоксина количество белка ТГ остается на уровне контроля, в то время как активность фермента снижается за счет увеличения цитозольного ДА (―feed-back regulation‖) и снижения фосфорилирования фермента. В первые часы после введения активность также снижена, что уже связывают с нитрованием фермента, и это, вероятно, происходит и на сроках, примененных в данной работе. На третьем этапе происходит снижение белка на фоне сниженной активности фермента, эту фазу определяют в нигростриатной системе при БП [Nagatsu, 1990; Grima et al., 1987; Ara et al., 1998]. Несмотря на то, что в интервале от 3 до 6 часов после последней инъекции МФТП значительно уменьшилось число ДА-ергических нейронов (тел нейронов) в ЧС, ни один из оцениваемых показателей – общее содержание ДА, ДОФУК в ЧС, а также содержание ТГ в отдельных телах нейронов, при этом не изменился, кроме активности ТГ, которая снижалась. Уменьшение содержания ДА в телах нейронов по сравнению с контролем на этих сроках может также быть связано с увеличением скорости его ферментативной деградации, как способа защиты от токсического действия цитозольного ДА, который должен увеличиваться, учитывая, что МФП+ конкурентно с ДА проникает и накапливается в везикулах [Miller et al., 1998]. В данном случае это маловероятно, поскольку содержание ДА и ДОФУК, ближайшего продукта деградации ДА, в ЧС через 1 и 3 часа после последней инъекции МФТП снижено в равной степени. Однако полностью исключить этого нельзя, т.к. через 30 минут показан пик содержания МФП+ в ЧС, а через 1 и 3 часа содержание токсина снижается соответственно только на треть и в два раза [Fornai et al., 1997]. К 6 часам содержание с МФП+ составляет 15% от уровня такового в ЧС через 30 минут. Согласно полученным данным, уровень ДА на сроках вплоть до 6 часов в ЧС одинаков, однако, уровень ДОФУК снижается от 1 до 6 часов после введения МФТП. Это косвенно может свидетельствовать о восстановлении захвата ДА в везикулы с помощью ВМАТ, которые к 6 часам «освобождаются» от МФП+ и, таким образом, ДА «протектируется» от деградации с помощью МАО. Более того, в пользу этого предположения свидетельствуют данные о внутриклеточном содержании ДА и активности ТГ через 6 часов. Так, активность ТГ в нейроне не меняется по сравнению с 3 часами, а уровень ДА увеличивается. 96 Таблица 10 – Схематичное представление функционального состояния Тело нейрона / Терминаль аксона Область мозга дофаминергической нигростриатной системы в первые сутки после введения МТФП ДА – дофамин, ДОФУК – 3,4-диоксифенилуксусная кислота, МФТП – 1-метил-4-фенил1,2,3,6-тетрагидропиридин, СТР – стриатум, ТГ – тирозингидроксилаза, ЧС – черная субстанция. Данные представлены как проценты от уровня в контроле, стрелочками представлены статистически значимые изменения относительно предыдущего срока. В интервале от 6 до 12 часов после последней инъекции МФТП наблюдалось скачкообразное увеличение содержания ДА, активности ТГ в ЧС в целом и в отдельных телах 97 нейронов на фоне сохранения содержания белка ТГ на уровне контроля. При этом внутринейрональное содержание ДА и активность ТГ достигают контрольного уровня, что свидетельствует о функциональном восстановлении выживших ДА-ергических нейронов в ЧС к 12 часам после последней инъекции МФТП. В интервале от 12 до 24 часов после последней инъекции МФТП в ЧС в целом и в отдельных телах нейронов не было выявлено изменений ни по одному из оцениваемых показателей, за исключением ДОФУК. При этом содержание ДОФУК в ЧС выросло почти вдвое, что на фоне неизменного содержания ДА является показателем увеличения активности ферментов деградации, в первую очередь МАО А – ключевого фермента деградации ДА у грызунов [Nagatsu, 2004]. Для оценки функционального состояния ДА-ергических нейронов особенно важной является функциональная характеристика терминалей аксонов, образующих синаптические контакты с нейронами-мишенями. Согласно нашим данным, через 1 и 3 часа после последней инъекции МФТП, общее содержание ДА в стриатуме было снижено по сравнению с контролем почти на 90% (таблица 10). С учетом изменения числа терминалей аксонов в этот период это означает, что содержание ДА в отдельных терминалях снижено примерно на 80%. В терминалях аксонов также снижено содержание и активность ТГ через 3 часа после введения МФТП примерно на 25% и 90% соответственно. Из полученных данных по сниженному содержанию ТГ и ее ферментативной активности можно заключить, что столь низкая концентрация ДА связана с уменьшением уровня его синтеза. Вероятно, это не единственная причина, и снижение содержания ДА в терминалях аксонов может быть также вызвано повышением скорости выделения ДА и/или снижением скорости обратного захвата ДА. Как и в случае тел нейронов, можно практически исключить увеличение скорости ферментативной деградации ДА в терминалях аксонов, т.к. содержание ДА и ДОФУК в стриатуме в целом и в отдельных терминалях аксонов снижено примерно в равной степени. Учитывая, что в телах нейронов содержание ТГ сохраняется на уровне контроля, снижение уровня белка в терминалях аксонов может быть связано с нарушением антероградного аксоплазматического транспорта. Действительно, по данным литературы нарушение аксоплазматического транспорта было показано на гигантском аксоне кальмара при добавлении МФП+ в раствор [Morfini et al., 2007]. Интересно, что в ходе данного эксперимента было показано увеличение динеин-зависимого ретроградного транспорта и снижение кинезинзависимого антероградного транспорта. Такое разнонаправленное изменение аксолазматического транспорта авторами исследования было объяснено влиянием МФП+ на активность разных протеинкиназ, которые регулируют степень фосфорилирования различных 98 белков, в том числе и участвующих в транспорте [Saporito et al., 2000; Shang et al., 2005; Morfini et al., 2007]. В интервале от 3 до 6 часов после последней инъекции МФТП в стриатуме, несмотря на снижение количества терминалей аксонов на 10%, уровень ДА сохранялся на прежнем уровне. При этом было показано снижение внутринейронального содержания ТГ при увеличении активности фермента, что приводит к увеличению синтеза ДА в сохранившихся терминалях аксонов. С другой стороны, значительное уменьшение содержания ТГ в терминалях аксонов (на 40% по сравнению с контролем и на 15% по сравнению с 3 часами, т.е. через 6 часов), но при неизменном уровне ТГ в телах нейронов по сравнению с контролем, свидетельствует о прогрессирующем со временем снижении скорости антероградного аксоплазматического транспорта под влиянием МФТП. В интервале от 6 до 12 часов после последней инъекции МФТП не было обнаружено изменений по большинству оцениваемых показателей, а именно по концентрации ДА, ДОФУК как в стриатуме, так и внутринейронально, а также содержания ТГ в терминалях аксонов. При этом было показано увеличение активности ТГ в стриатуме, и при пересчете на количество терминалей аксонов ее активность составляла 70% от уровня в контроле через 12 часов, в то время как через 6 она равнялась 20%. Увеличение активности фермента при неизменном уровне ДА и ДОФУК, как показателя скорости деградации ДА, свидетельствует об активации других компенсаторных механизмов, таких как увеличение выделения ДА или снижение его обратного захвата, что приводит к более длительному нахождению нейротрансмиттера в синаптической щели. В интервале от 12 до 24 часов после последней инъекции МФТП единственным изменением в стриатуме было внутринейрональное увеличение содержания ТГ до 80% от уровня в контроле, в то время как концентрация ДА и ДОФУК сохранялась на прежнем уровне. Эти данные могут свидетельствовать о восстановлении аксоплазматического транспорта в ДАергических нейронах. Учитывая, что на предыдущих срока активность ТГ постоянно увеличивалось, сложно ожидать, что через 24 часа после последней инъекции, она будет снижаться, и сохранение ДА на прежнем уровне при увеличении белка ТГ также может свидетельствовать об увеличении скорости выделения ДА и уменьшении скорости его обратного захвата. Одним из важных показателей функциональной активности ДА-ергических нейронов, особенно ДА-ой нейротрансмиссии является «оборот» (―turnover‖) ДА – интегральный показатель синтеза, выделения, обратного захвата и деградации ДА. По полученным нами данным этот показатель в ЧС увеличен в два раза через 1 и 3 часа после последнего введения МФТП, затем в период дегенерации нейронов – с 3 до 6 часов падает примерно вдвое. Также 99 «оборот» ДА снижен и спустя 12 часов и далее к 24 часам компенсаторно возрастает, достигая контрольного уровня. Динамика изменения оборота ДА в ЧС и в стриатуме существенно различается. Уровень оборота ДА в стриатуме не меняется вплоть до 6 часов после последней инъекции МФТП, тогда как в последующие 9 часов этот показатель быстро возрастает, превышая его уровень в контроле в два раза. Далее – до 24 часов, этот показатель не меняется, что свидетельствует о значительном усиления ДА-ой нейротрансмиссии в стриатуме через 12-24 часа после последней инъекции МФТП. Таким образом, функциональная активность тел ДА-ергических нейронов в ЧС полностью восстанавливается через 12 часов после последней инъекции МФТП. В то же время функциональная активность терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме была значительно снижена в течение первый 12 часов с последующим частичном восстановлением функциональной активности. 4.2. Модель ранней клинической стадии болезни Паркинсона в период дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для поиска потенциальных нейропротекторов 4.2.1 Доказательство возможности использования модели ранней клинической стадии болезни Паркинсона в перилж дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для поиска потенциальных нейропротекторов Специфические симптомы, связанные с пороговой дегенерацией ДА-ергических нейронов нигростриатной системы и истощением компенсаторных резервов мозга, при БП являются основным критерием диагностики заболевания. После постановки диагноза начинается лечение, которое направленно на снижение моторных нарушений с помощью системного использования различного рода веществ, участвующих в ДА-вой нейротрансмиссии – предшественники синтеза (L-ДОФА), лиганды рецепторов, ингибиторы ферментов деградации [Fahn, 2008]. Такое лечение позволяет продлить комфортную жизнь больного максимум на 5 лет. Столь непродолжительный период связан в первую очередь с прогрессированием гибели ДА-ергических нейронов, т.к. до сих пор не разработана нейропротекторная терапия, что, отчасти, является причиной увеличения дозы лекарственных веществ с сопряженными осложнениями («медикаментозная дискинезия» при лечении LДОФА). 100 В настоящее время введется активный поиск новых лекарственных веществ, в том числе и с нейропротекторными свойствами. Для такого поиска необходима наиболее адекватная модель БП на животных. В рамках данного исследования мы оценили динамику дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы после введения МФТП по схеме, приводящей к пороговой деградации нигростриатной системы с моторными нарушениями. Для того чтобы оценить возможность использования данной модели БП в момент дегенерации ДАергических нейронов в качестве тест-системы для потенциальных лекарственных веществ с нейропротекторными свойствами, был поставлен эксперимент с номефинзином - ингибитором мембранного переносчика ДА [Church et al., 1987; Schultz et al., 1986]. Нейропротекторное действие номифензина и его аналогов основано на предотвращении захвата ДА-ергическими нейронами экзогенных нейротоксинов при экспериментальном моделировании паркинсонизма и эндогенных нейротоксинов, таких как N-метил(R)салсолинола при БП. По нашей схеме номифензин вводился за полчаса до каждой инъекции МФТП и оценивали количество терминалей аксонов ДА-ергических нейронов, а также содержание ДА в стриатуме и в ЧС через 12 часов после последней инъекции МФТП. Введение только номифензина (0,9% NaCl и номифензин) не приводило к метаболическим изменениям в нигростриатной системе, а также к изменению количества терминалей аксонов в стриатуме по сравнению с контрольной группой (0,9% NaCl и 0,9% NaCl). Данные полученные в опытной группе (МФТП и 0,9% NaCl), полностью воспроизводят полученные раннее данные по исследованию динамики дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы, что позволяет сделать заключение, о высокой степени воспроизводимости данной модели БП на мышах. В группе, получавшей МФТП и номифензин, была показана почти полная нейропротекция ДА-ергических нейронов нигростриатной системы. Количество терминалей аксонов в стриатуме было снижено всего на 10% от уровня в контроле (0,9% NaCl и 0,9% NaCl). При этом в группе, получавшей только МФТП (МФТП и 0,9% NaCl), количество терминалей аксонов составляло 44%. Аналогичные данные были получены при определении уровня ДА в стриатуме и ЧС – в группе, получавшей номифензин и МФТП, не происходило снижения ДА по сравнению с контролем (введение 0,9% NaCl и 0.9% NaCl). Единственным различием между контрольной группой и группой, получавшей МФТП и номифензин, было снижение отношения ДОФУК/ДА в стриатуме и в ЧС, что свидетельствует о снижении ДА-вой нейротрансмиссии. Таким образом, получены доказательства того, что разработанная и охарактеризованная нами модель нейродегенерации при паркинсонизме может быть использована для поиска и тестирования лекарственных веществ, оказывающих нейропротекторное действие. 101 4.2.2 Использование модели ранней клинической стадии болезни Паркинсона в период дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы в качестве тест-системы для тестирования потенциальных нейропротекторов В рамках реализации третей задачи данной работы была предпринята попытка оценить возможность остановки или замедления дегенерации ДА-ергических нейронов нигростриатной системы на охарактеризованной модели ранней клинической стадии БП с помощью потенциального нейропротектора. В последние десятилетия накоплен большой массив данных о регуляции жизнедеятельности ДА-ергических нейронов нейротрофическими факторами. Эта большая группа полипептидов, участвующих регуляции жизнедеятельности нейронов от образования до поддержания нейронов нервной системы во взрослом состоянии, а также обеспечивающих выживание нейронов при действии стресса (токсины, ишемия и др.). Нейротрофические факторы синтезируются как в нейронах, так и в клетках глии. Основными нейротрофическими факторами, которые контролируют ДА-ергические нейроны нигростриатной системы, являются глиальный нейротрофический фактор (GDNF), фактор роста нервов (NGF), нейротрофический фактор мозга (BDNF). Интересные данные были получены на моделях БП (6-ГДА и МФТП) на грызунах. Так, было показано, что введение нейротрофического фактора мозга в стриатум после нейротоксина приводит к восстановлению нигростриатной системы, а именно к прорастанию ДА-ергических аксонов из ЧС по направлению стриатума. Введение этого фактора в ЧС после нейротоксина приводит к разрастанию аксонов, однако, они не покидают средний мозг, т.е. отсутствует направленность (ориентир) роста [Kirik et al., 2001; Rosenblad et al., 2000; Björklund et al., 2000]. Пока не ясно, происходит ли полное восстановление функционирования нигростриатной системы со сложной архитектоникой стриатума при введении нейротрофических факторов в стриатум после нейротоксинов, однако, бесспорно результаты исследования влияния нейротрофических факторов на поврежденную нигростриатную систему имеют большую перспективу. Другим аспектом действия нейротрофических факторов помимо восстановления нигростриатной системы является их нейропротекторный эффект при дегенерации ДАергических нейронов [Tomac et al., 1995; Granholm et al., 1997; Sullivan et al., 1998; Kholodilov et al., 2004; Hegarty et al., 2014]. В момент нейродегенерации показана активация глии (астроцитов и микроглии), в клетках которой происходит основной синтез нейротрофических факторов при действии стресса. В первые часы и сутки после введения МФТП, 6-ГДА или после гипоксии 102 показано увеличение экспрессии мРНК и белка нейротрофического фактора мозга и глиального нейротроического фактора, а также мРНК и белка рецепторов к ним в первые часы и сутки [Aliaga et al., 2000; Bustos et al., 2009; Li et al., 2014]. Так, через 3 часа после однократного введения МФТП экспрессия мРНК нейротрофического фактора мозга была увеличена на 30% от уровня в контроле. Однако на нашей модели БП содержание белка глиального нейротрофического фактора в стриатуме и ЧС не увеличивается после последней инъекции МФТП на нашей модели БП, вероятно, необходимо больше времени для активации клеток глии и синтеза нейротрофических факторов из мРНК. Протекторный эффект нейротрофических факторов на ДА-ергические нейроны был показан во многих работах при экзогенном их введении на моделях БП на грызунах. Нейротрофические факторы вводят непосредственно в мозг, используя белок или векторные конструкции, содержащий их гены. Такое введение носит кратковременный характер, и через несколько недель/месяцев содержание нейротрофических факторов снижается до нормы. Клинические испытания введения глиального нейротрофического фактора в желудочки мозга пациентам с БП не привели к положительным результатам по сравнению с группой контроля (placebo), что, вероятно, связано с недостаточно высокой концентрацией белка в стриатуме [Nutt et al., 2003]. В другой работе использовалось введение глиального нейротрофического фактора непосредственно в стриатум, что позволило снизить моторные нарушения у пациентов [Slevin et al., 2007]. Однако положительный эффект пропадал спустя 9 месяцев после прекращения лечения. Авторы данного исследования подчеркивают, что побочных эффектов не было обнаружено после введения нейротрофических факторов [Patel et al., 2005]. Поэтому на данный момент одной из актуальных проблем является метод хронического введения нейротрофических факторов. Альтернативой введению экзогенных нейротрофических факторов является увеличение секреции эндогенных факторов. В качестве вещества, которое повышает синтез эндогенных нейротрофических факторов в мозге, использовали Семакс. Семакс представляет собой фрагмент адренокортикотроного аминокислотных остатков гормона, регуляторный (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), пептид, не состоящий имеющий из 7 гормональной активности [Ashmarin et al., 1995]. Помимо увеличения синтеза эндогенных нейротрофических факторов (непрямое действие), Семакс также имеет антиоксидантную активность (прямое действие) [Levitskaya et al., 2002; Dolotov et al., 2003]. Введение Семакса осуществляется интраназально, что бесспорно является его преимуществом перед экзогенными нейротрофическими факторами и векторными конструкциями, которые необходимо вводить непосредственно в мозг. 103 В нашей работе было проведено исследование влияния прямого и непрямого действия Семакса на выживаемость ДА-ергических нейронов в течение нейродегенерации на модели ранней клинической стадии БП. Для оценки прямого действия Семакса, т.е. его антиоксидантной активности, препарат (50 мкг/кг) вводили через полчаса после последней инъекции МФТП. Для оценки непрямого действия (увеличение синтеза эндогенных нейротрофических факторов) Семакс (50 мкг/кг) вводили за 12 часов до первой инъекции МФТП. В обоих случаях была проведена оценка функционального состояния выживших ДАергических нейронов по концентрации ДА в стриатуме спустя 12 часов после последней инъекции. Нами не было обнаружено изменений в концентрации ДА при обеих схемах введения МФТП и Семакса по сравнению с группой, получавшей только МФТП. Мы предполагаем, что это связано с недостаточной дозой Семакса для оказания нейропротекторного действия на ДА-ергические нейроны. Действительно, интраназальное введение 50 мкг/кг Семакса приводит к увеличению мРНК и белка нейротрофического фактора мозга в гипоталамусе на 30% и на 40% соответственно через 24 часа после введения препарата [Dolotov et al., 2003, 2006]. Аналогичное увеличение белка нейротрофического фактора мозга было обнаружено в базальных ганглиях, куда входит также и стриатум. С другой стороны, увеличение дозы Семакса в 10 раз (т.е. 500 мкг/кг) не приводило к увеличению содержания белка нейротрофического фактора мозга по сравнению с 50 мкг/кг [Dolotov et al., 2006]. Возможно, нейропротекторный эффект Семакса на ДА-ергические нейроны удастся обнаружить при другой схеме эксперимента, например, не при однократном введении препарата, а при введении течение нескольких дней. Таким образом, несмотря на отсутствие положительного эффекта Семакса на функциональное состояние терминалей ДА-ергических аксонов в стриатуме, охарактеризованная модель ранней клинической стадии БП в период дегенерации ДАергических нейронов нигростриатной системы является перспективной для поиска и тестирования новых лекарственных веществ с нейропротекторными свойствами. 104 Тела нейронов в ЧС Терминали аксонов в стриатуме стриатуме Tyr Tyr ДА ДА контроль контрол ь Tyr Tyr ДА ДА 3ч Tyr Tyr ДА ДА 12 ч - ДА - Содержание ТГ (контрольный уровень) - Содержание ТГ (76 %) - Содержание ТГ (контрольный уровень) - Содержание ТГ (57 %) - Активность ТГ (контрольный уровень) - Активность ТГ (контрольный уровень) - Активность ТГ (49 %) - Активность ТГ (66 %) - Активность ТГ (29 %) - Активность ТГ (5 %) ДА – дофамин, ТГ – тирозингидроксилаза. Рисунок 38 – Схематичное представление функционального состояния дофаминергических нейронов нигростриатной системы после МФТП 105 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В работе была исследована динамика дегенерации дофаминергических нейронов нигростриатной системы на модели ранней клинической стадии болезни Паркинсона, а также оценено функциональное состояние выживших нейронов после введения МФТП (рисунок 38). Дегенерация тел дофаминергических нейронов в черной субстанции длиться 3 часа и завершается к 6 часам после последней инъекции МФТП, т.е. в последующие сроки их количество не меняется. Согласно полученным данным, функциональная активность тел дофаминергических нейронов снижена до и во время дегенерации, в то время как после выхода на плато количества нейронов, функциональная активность выживших нейронов начинает восстанавливаться, достигая контрольного уровня в течение 12 часов. Противоположная картина была показана в стриатуме, где дегенерация терминалей аксонов начиналась сразу после первой инъекции МФТП и продолжалась в течение 14 часов. Функциональное состояние выживших терминалей аксонов было в значительной степени снижено на всем периоде исследования, однако, после выхода на плато количества терминалей аксонов было показано частичное восстановление их функционального состояния. Вероятно, одной из причин разнонаправленных изменений в содержании тирозингидроксилазы и уровня дофамина в черной субстанции и стриатуме в первые часы после введения МФТП является нарушение аксоплазматического транспорта, дальнейшее изучение которого, бесспорно, позволит дополнить представление о дегенерации дофаминергических нейронов при болезни Паркинсона. Более высокая чувствительность терминалей аксонов к действию нейротоксина по сравнению с телами нейронов, а также более продолжительный период снижения их количества, делают терминали аксонов перспективным объектом для тестирования потенциальных нейропротекторов. В рамках данной работы была показана возможность использования модели ранней клинической стадии в период дегенерации дофаминергических нейронов в качестве тестсистемы, с применением ингибитора обратного захвата дофамина – номифензина. Полученные данные открывают перспективу тестирования новых лекарственных веществ с нейропротекторными свойствами, что позволит, если не остановить, то хотя бы замедлить гибель нейронов и продлить комфортную жизнь пациентов на ранней клинической стадии болезни Паркинсона. 106 ВЫВОДЫ 1. Дегенерация дофаминергических нейронов нигростриатной системы при моделировании ранней клинической стадии болезни Паркинсона у мышей в разных частях нейронов идет с различной динамикой: а) количество тел дофаминергических нейронов в черной субстанции снижается в течение 3-х часов, а скорость дегенерации 3-4% в час; б) период дегенерации терминалей дофаминергических аксонов в стриатуме составляет 14 часов со скоростью 10% в час. 2. Функциональное состояние выживших дофаминергических нейронов нигростриатной системы при моделировании ранней клинической стадии болезни Паркинсона различалось в разных частях нейронов по скорости восстановления синтеза дофамина: а) в телах нейронов в черной субстанции активность тирозингидроксилазы и содержание дофамина снижаются через 3 часа и полностью восстанавливаются к 12 часам после введения МФТП, а содержание тирозингидроксилазы не изменяется на всем периоде исследования; б) в терминалях аксонов в стриатуме содержание тирозингидроксилазы, ее активность и концентрация дофамина значительно снижаются через 3 часа после введения МФТП. К 12 часам частично восстанавливается активность фермента, а к 24 часам – его содержание. 3. Охарактеризованная модель ранней клинической стадии болезни Паркинсона в период дегенерации дофаминергических нейронов является перспективной в качестве тестсистемы для поиска потенциальных нейропротекторов: а) Семакс при использованных схемах не оказал нейропротекторного действия на дофаминергические нейроны нигростриатной системы; б) номифензин, ингибитор обратного захвата дофамина, предотвращает дегенерацию дофаминергических нейронов нигростриатной системы. 107 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6-ГДА – 6-гидроксидофамин L-ДОФА – 3,4-дигидроксифенилаланин АТФ – аденозинтрифосфат АФК – активные формы кислорода БП – болезнь Паркинсона ВМАТ – везикулярный моноаминовый транспортер ВТО – вентральная тегментальная область ГАМК – γ-аминомасляная кислота ДА – дофамин ДАА – декарбоксилаза ароматических L-аминокислот ДА-ергический нейрон – дофаминергический нейрон ДАТ – мембранный транспортер дофамина ДОФЕТ – 3,4-дигидроксифенилетанол ДОФУК – дигидроксифенилуксусная кислота КОМТ – катехол-о-метилтрансфераза МАО – моноаминоксидаза МФП+ – 1-метил-4-фенилпиридиум МФТП – 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин НА-ергический нейрон – норадреналинергический нейрон ОФЭКТ – однофотонная эмиссионная компьютерная томография ПФ – пиридоксаль-5’-фосфат ПЭТ – позитронно эмиссионная томография ТГ – тирозингидроксилаза ЦНС – центральная нервная система ЧС – черная субстанция 108 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Хаиндрава, В.Г. Моделирование преклинической и ранней клинической стадий болезни Паркинсона / В. Г. Хаиндрава [и др.] // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. – 2010. – Т. 110. – №. 7. – С. 41-47. 2. Хакимова, Г.Р. Выделение дофамина в черной субстанции и стриаутме на досимптомной и ранней симптомной стадиях паркинсонизма у мышей / Г. Р. Хакимова [и др.] // Нейрохимия. – 2011. – Т. 28. – № 1. – С. 42-48. 3. Хакимова, Г.Р. Обратный захват дофамина в черной субстанции и стриатуме на досимптомной и ранней симптомной стадиях паркинсонизма у мышей / Г. Р. Хакимова [и др.] // ДАН. – 2010. – Т. 435. – № 2. – С. 1–4. 4. Abeliovich, A. Mice lacking α-synuclein display functional deficits in the nigrostriatal dopamine system / A. Abeliovich // Neuron. – 2000. – Vol. 25. – N. 1. – P. 239-252. 5. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections / M. Abercrombie // Anat. Res. Int. – 1946. – Vol. 94. – P. 239–247. 6. Abou-Sleiman, P. M. Causes of Parkinson’s disease: genetics of DJ-1 / P. M. Abou-Sleiman, D. G. Healy, N. W. Wood //Cell Tissue Res. – 2004. – Vol. 318. – N. 1. – P. 185-188. 7. Agid, Y. Hyperactivity of remaining dopaminergic neurones after partial destruction of the nigro-striatal dopaminergic system in the rat / Y. Agid, F. Javoy, J. Glowinski // Nat. New Biol. – 1973. – Vol. 245. – P. 150-151. 8. Agid, Y. Parkinson's disease: pathophysiology / Y. Agid // The Lancet. – 1991. – Vol. 337. – N. 8753. – P. 1321-1324. 9. Alam, Z. I. Oxidative DNA Damage in the Parkinsonian Brain: An Apparent Selective Increase in 8‐Hydroxyguanine Levels in Substantia Nigra / Z. I. Alam [et al.] // J. Neurochem. – 1997. – Vol. 69. – N. 3. – P. 1196-1203 10. Albert, V. R. Distinct promoters direct neuronal and nonneuronal expression of rat aromatic Lamino acid decarboxylase / V. R. Albert [et al.] // PNAS. – 1992. – Vol. 89. – N. 24. – P. 12053-12057. 11. Albin, R. L. The functional anatomy of basal ganglia disorders / R. L. Albin, A. B. Young, J. B. Penney // Trends Neurosci. – 1989. – Vol. 12. – N. 10. – P. 366-375. 12. Alexander, G. E. Functional architecture of basal ganglia circuits: neural substrates of parallel processing / G. E. Alexander, M. D. Crutcher // Trends Neurosci. – 1990. – Vol. 13. – N. 7. – P. 266-271. 109 13. Aliaga, E. Transient increase of brain derived neurotrophic factor mRNA expression in substantia nigra reticulata after partial lesion of the nigrostriatal dopaminergic pathway / E. Aliaga [et al.] // Mol. Brain Res. – 2000. – Vol. 79. – N. 1. – P. 150-155. 14. Alvarez-Fischer, D. Modelling Parkinson‐like neurodegeneration via osmotic minipump delivery of MPTP and probenecid / D. Alvarez-Fischer [et al.] // J. Neurochem. – 2008. – Vol. 107. – N. 3. – P. 701-711. 15. Amara, S. G. Neurotransmitter transporters: recent progress / S. G. Amara, M. J. Kuhar // Annu. Rev. Neurosci. – 1993. – Vol. 16. – N. 1. – P. 73-93. 16. Andersen, J. K. Oxidative stress in neurodegeneration: cause or consequence? / J. K. Andersen // Nat. Med. – 2004. – Suppl. 10. – P. 18-25. 17. Andersen, P. H. Dopamine receptor subtypes: beyond the D1/D2 classification / P. H. Andersen // Trends Pharmacol. Sci. – 1990. – Vol. 11. – N. 6. – P. 231-236. 18. Anderson, D. G. Oxidation of 3, 4-dihydroxyphenylacetaldehyde, a toxic dopaminergic metabolite, to a semiquinone radical and an ortho-quinone / D. G. Andersen [et al.] // J. Biol. Chem. – 2011. – Vol. 286. – N. 30. – P. 26978-26986. 19. Andres-Mateos, E. Unexpected lack of hypersensitivity in LRRK2 knock-out mice to MPTP (1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine) / E. Andres-Mateos [et al.] // J. Neurosci. – 2009. – Vol. 29. – N. 50. – P. 15846-15850. 20. Andrew, R. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls / R. Andrew [et al.] // Neurochem. Res. – 1993. – Vol. 18. – N. 11. – P. 1175-1177. 21. Anglade, P. Apoptosis in dopaminergic neurons of the human substantia nigra during normal aging / P. Anglade [et al.] // Histol. Hitopathol. – 1997. – Vol. 12. – N. 3. – P. 603-610. 22. Annunziato, L. Supersensitivity of pituitary dopamine receptors involved in the inhibition of prolactin secretion / L. Annunziato [et al.] //Adv. Biochem. Psychopharmacol. – 1980. – Vol. 24. – P. 379-385. 23. Aoki, E. Role of nuclear transcription factor kappa B (NF-kappaB) for MPTP (1-methyl-4phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahyropyridine)-induced apoptosis in nigral neurons of mice / E. Aoki [et al.] // Exp. Mol. Pathol. – 2009. – Vol. 86. – N. 1. – P. 57-64. 24. Ara, J. Inactivation of tyrosine hydroxylase by nitration following exposure to peroxynitrite and 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP) / J. Ara [et al.] // PNAS. – 1998. – Vol. 95. – N. 13. – P. 7659-7663. 25. Araki, T. Biochemical and immunohistological changes in the brain of 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP)-treated mouse / T. Araki [et al.] // Eur J. Pharm. Sci. – 2001. – Vol. 12. – N. 3. – P. 231-238. 110 26. Arima, K. Cellular co-localization of phosphorylated tau-and NACP/α-synuclein-epitopes in Lewy bodies in sporadic Parkinson's disease and in dementia with Lewy bodies / K. Arima [et al.] // Brain Res.. – 1999. – Vol. 843. – N. 1. – P. 53-61. 27. Arvidsson, U. Distribution and targeting of a mu-opioid receptor (MOR1) in brain and spinal cord / U. Arvidsson [et al.] // J. Neurosci. – 1995. – Vol. 15. – N. 5. – P. 3328-3341. 28. Ashmarin, I. P. Design and investigation of an ACTH (4-10) analogue lacking D-amino acids and hydrophobic radicals / I. P. Ashmarin [et al.] // Neurosci. Res. Commun. – 1995. – Vol. 16. – N. 2. – P. 105-112. 29. Baba, M. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies / M. Baba [et al.] // Am. J. Pathol. – 1998. – Vol. 152. – N. 4. – P. 879-884. 30. Bach, A. W. cDNA cloning of human liver monoamine oxidase A and B: molecular basis of differences in enzymatic properties / A. W. Bach [et al.] // PNAS. – 1988. – Vol. 85. – N. 13. – P. 4934-4938. 31. Banati, R. B. Glial pathology but absence of apoptotic nigral neurons in long‐standing Parkinson's disease / R. B. Banati, S. E. Daniel, S. B. Blunt // Mov. Disord. – 1998. – Vol. 13. – N. 2. – P. 221-227. 32. Bandopadhyay, R. The expression of DJ‐1 (PARK7) in normal human CNS and idiopathic Parkinson’s disease / R. Bandopadhyay [et al.] // Brain. – 2004. – Vol. 127. – N. 2. – P. 420430. 33. Bankiewicz, K. S. Hemiparkinsonism in monkeys after unilateral internal carotid artery artery infusion of 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP) / K. S. Bankiewicz [et al.] // Life Sciences. – 1986. – Vol. 39. – N. 1. – P. 7-16. 34. Bartels, T. [agr]-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation / T. Bartels, J. G. Choi, D. J. Selkoe //Nature. – 2011. – Vol. 477. – N. 7362. – P. 107-110. 35. Barton, B. Paradoxical visuomotor adaptation to reversed visual input is predicted by BDNF Val66Met polymorphism / B. Barton [et al.] // J. Vis. – 2014. – Vol. 14. – N. 9. – P. 4. 36. Beaulieu, J. M. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors / J. M. Beaulieu, R. R. Gainetdinov // Pharmacol. Rev. – 2011. – Vol. 63. – N. 1. – P. 182-217. 37. Bender, A. High levels of mitochondrial DNA deletions in substantia nigra neurons in aging and Parkinson disease / A. Bender [et al.] // Nat. Genet. – 2006. – Vol. 38. – N. 5. – P. 515-517. 38. Benskey, M. Recovery of hypothalamic tuberoinfundibular dopamine neurons from acute toxicant exposure is dependent upon protein synthesis and associated with an increase in parkin 111 and ubiquitin carboxy-terminal hydrolase-L1 expression / M. Benskey [et al.] // Neurotoxicology. – 2012. – Vol. 33. – N. 3. – P. 321-331. 39. Bernheimer, H. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson and Huntington Clinical, morphological and neurochemical correlations / H. Bernheimer [et al.] // J. Neurol. Sci. – 1973. – Vol. 20. – N. 4. – P. 415-455. 40. Betarbet, R. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease / R. Betarbet [et al.] // Nat. Neurosci. – 2000. – Vol. 3. – N. 12. – P. 1301-1306. 41. Beutler, B. Tumor necrosis, cachexia, shock, and inflammation: a common mediator / B. Beutlet, A. Cerami // Annu. Rev. Biochem. – 1988. – Vol. 57. – N. 1. – P. 505-518. 42. Bezard, E. Relationship between the appearance of symptoms and the level of nigrostriatal degeneration in a progressive 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine-lesioned macaque model of Parkinson's disease / E. Bezard [et al.] // J. Neurosci. – 2001. – Vol. 21. – N. 17. – P. 6853-6861. 43. Bezard, E. A chronic MPTP model reproducing the slow evolution of Parkinson's disease: evolution of motor symptoms in the monkey / E. Bezard [et al.] // Brain Res. – 1997. – Vol. 766. – N. 1. – P. 107-112. 44. Bisaglia, M. Structural insights on physiological functions and pathological effects of αsynuclein / M. Bisaglia, S. Mammi, L. Bubacco // FASEB J. – 2009. – Vol. 23. – N. 2. – P. 329-340. 45. Biskup, S. Localization of LRRK2 to membranous and vesicular structures in mammalian brain / S. Biskup [et al.] // Ann. Neurol. – 2006. – Vol. 60. – N. 5. – P. 557-569. 46. Björklund, A. Dopamine neuron systems in the brain: an update / A. Björklund, S. B. Dunnett // Trends Neurosci. – 2007. – Vol. 30. – N. 5. – P. 194-202. 47. Björklund, A. Towards a neuroprotective gene therapy for Parkinson’s disease: use of adenovirus, AAV and lentivirus vectors for gene transfer of GDNF to the nigrostriatal system in the rat Parkinson model / A. Björklund [et al.] // Brain Res. – 2000. – Vol. 886. – N. 1. – P. 82-98. 48. Block, M. L. Microglia and inflammation-mediated neurodegeneration: multiple triggers with a common mechanism / M. L. Block, J. S. Hong // Prog. Neurobiol. – 2005. – Vol. 76. – N. 2. – P. 77-98. 49. Bokobza, B. [3H]spiperone binding, dopamine and HVA concentrations in Parkinson's disease and supranuclear palsy / B. Bokobza [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 1984. – Vol. 99. – P. 16775. 112 50. Boomsma, F. Determination of aromatic-L-amino acid decarboxylase in human plasma / F. Boomsma, F. A. J. van der Hoorn, M. A. D. H. Schalekamp // Clinica chimica acta. – 1986. – Vol. 159. – N. 2. – P. 173-183. 51. Bosler, O. Radioautographic investigation of monoaminergic neurons: an evaluation / O. Bosler, A. Calas // Brain Res. Bull. – 1982. – Vol. 9. – N. 1. – P. 151-169. 52. Braak, H. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease / H. Braak [et al.] // Neurobiol. Aging. – 2003. – Vol. 24. – N. 2. – P. 197-211. 53. Braak, H. Stages in the development of Parkinson’s disease-related pathology / H. Braak [et al.] // Cell Tissue Res. – 2004. – Vol. 318. – N. 1. – P. 121-134. 54. Braak, H. Gastric α-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology / H. Braak [et al.] // Neurosci. Lett. – 2006. – Vol. 396. – N. 1. – P. 67-72. 55. Brinkley, B. R. Rotenone inhibition of spindle microtubule assembly in mammalian cells / B. R. Brinkley [et al.] // Exp. Cell Res. – 1974. – Vol. 85. – N. 1. – P. 41-46. 56. Bronstein, D. M. Glia-dependent neurotoxicity and neuroprotection in mesencephalic cultures / D. M. Bronstein [et al.] // Brain Res. – 1995. – Vol. 704. – N. 1. – P. 112-116. 57. Brooks, D. J. The early diagnosis of Parkinson's disease / D. J. Brooks //Ann. Neurol. – 1998. – Vol. 44. – N. S1. – P. S10-S18. 58. Brooks, A. I. Paraquat elicited neurobehavioral syndrome caused by dopaminergic neuron loss / A. I. Brooks [et al.] // Brain Res. – 1999. – Vol. 823. – N. 1. – P. 1-10. 59. Burke, W.J. Neurotoxicity of MAO metabolites of catecholamine neurotransmitters: role in neurodegenerative diseases / W. J. Burke [et al.] // Neurotoxicology. – 2004. – Vol. 25. – N. 1. – P. 101-115. 60. Burke, W. J. 3, 4-Dihydroxyphenylacetaldehyde is the toxic dopamine metabolite in vivo: implications for Parkinson’s disease pathogenesis / W. J. Burke [et al.] // Brain Res. – 2003. – Vol. 989. – N. 2. – P. 205-213. 61. Burkhard, P. Structural insight into Parkinson's disease treatment from drug-inhibited DOPA decarboxylase / P. Burkhard [et al.] // Nat. Struct. Mol. Biol. – 2001. – Vol. 8. – N. 11. – P. 963-967. 62. Burns, R. S. A primate model of parkinsonism: selective destruction of dopaminergic neurons in the pars compacta of the substantia nigra by N-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine / R. S. Burns [et al.] // PNAS. – 1983. – Vol. 80. – N. 14. – P. 4546-4550. 63. Burré, J. α-Synuclein promotes SNARE-complex assembly in vivo and in vitro / J. Burré [et al.] // Science. – 2010. – Vol. 329. – N. 5999. – P. 1663-1667. 113 64. Bustos, G. NMDA receptors mediate an early up‐regulation of brain‐derived neurotrophic factor expression in substantia nigra in a rat model of presymptomatic Parkinson's disease / G. Bustos [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2009. – Vol. 87. – N. 10. – P. 2308-2318. 65. Cabin, D. E. Synaptic vesicle depletion correlates with attenuated synaptic responses to prolonged repetitive stimulation in mice lacking α-synuclein / D. E. Cabin [et al.] // J. Neurosci. – 2002. – Vol. 22. – N. 20. – P. 8797-8807. 66. Carlsson, A. In-vivo measurements of tryptophan and tyrosine hydroxylase activities in mouse brain / A. Carlsson, M. Lindqvist // J. Neural. Transm. – 1973. – Vol. 34. – P. 79-91. 67. Chandra, S. α-Synuclein cooperates with CSPα in preventing neurodegeneration / S. Chandra [et al.] // Cell. – 2005. – Vol. 123. – N. 3. – P. 383-396. 68. Chartier-Harlin, M. C. α-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease / M. Chartier-Harlin [et al.] // The Lancet. – 2004. – Vol. 364. – N. 9440. – P. 1167-1169. 69. Cheesman, A. Functional Imaging of Mov. Disord. / A. Cheesman, P. Piccini // Adv. Clin. Neurosci. Rehabil. – 2004. – Vol. 4. – P. 10-13. 70. Chinta, S. J. Redox imbalance in Parkinson's disease / S. J. Chinta, J. K. Andersen // Biochim. Biophys. Acta. – 2008. – Vol. 1780. – N. 11. – P. 1362-1367. 71. Church, W. H. Extracellular dopamine in rat striatum following uptake inhibition by cocaine, nomifensine and benztropine / W. H. Church, J. B. Justice, L. D. Byrd // Eur. J. Pharmacol. – 1987. – Vol. 139. – N. 3. – P. 345-348. 72. Cicchetti, F. Systemic exposure to paraquat and maneb models early Parkinson's disease in young adult rats / F. Cicchetti [et al.] // Neurobiol. Dis. – 2005. – Vol. 20. – N. 2. – P. 360-371. 73. Civelli, O. Molecular diversity of the dopamine receptors / O. Civelli, J. R. Bunzow, D. K. Grandy // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 1993. – Vol. 33. – N. 1. – P. 281-307. 74. Clark, D. G. The toxicity of paraquat / D. G. Clark, T. F. McElligott, E. W. Hurst // Br. J. Ind. Med. – 1966. – Vol. 23. – N. 2. – P. 126-132. 75. Clarke, P. G. H. Developmental cell death: morphological diversity and multiple mechanisms / P. G. H. Clarke // Anatomy and embryology. – 1990. – Vol. 181. – N. 3. – P. 195-213. 76. Cline, E. J. Medial dorsal striatum is more sensitive than lateral dorsal striatum to cocaine inhibition of exogenous dopamine clearance: relation to [3H] mazindol binding, but not striosome/matrix / E. J. Cline [et al.] // Exp. Neurol. – 1995. – Vol. 134. – N. 1. – P. 135-149. 77. Coleman, M. Axon degeneration mechanisms: commonality amid diversity / M. Coleman // Nat. Rev. Neurosci. – 2005. – Vol. 6. – N. 11. – P. 889-898. 78. Conway, K. A. Kinetic stabilization of the α-synuclein protofibril by a dopamine-α-synuclein adduct / K. A. Conway [et al.] // Science. – 2001. – Vol. 294. – N. 5545. – P. 1346-1349. 114 79. Cowen, D. The melanoneurons of the human cerebellum (nucleus pigmentosus cerebellaris) and homologues in the monkey / D. Cowen // J. Neuropathol. Exp. Neurol. – 1986. – Vol. 45. – N. 3. – P. 205. 80. Cui, M. The organic cation transporter-3 is a pivotal modulator of neurodegeneration in the nigrostriatal dopaminergic pathway / M. Cui [et al.] // PNAS. – 2009. – Vol. 106. – N. 19. – P. 8043-8048. 81. Cui, G. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation / G. Cui [et al.] // Nature. – 2013. – Vol. 494. – N. 7436. – P. 238-242. 82. Cutillas, B. Caspase inhibition protects nigral neurons against 6‐OHDA‐induced retrograde degeneration / B. Cutillas [et al.] // Neuroreport. – 1999. – Vol. 10. – N. 12. – P. 2605-2608. 83. Dai, Y. Somatic mitochondrial DNA mutations do not increase neuronal vulnerability to MPTP in young POLG mutator mice / Y. Dai [et al.] // Neurotoxicol. Teratol. – 2014. – Vol. 46. – P. 62-67. 84. Dalle-Donne, I. Molecular mechanisms and potential clinical significance of S- glutathionylation / I. Dalle-Donne [et al.] // Antioxid. Redox Signal. – 2008. – Vol. 10. – N. 3. – P. 445-474. 85. Damier, P. The substantia nigra of the human brain / P. Damier [et al.] // Brain. – 1999. – Vol. 122. – N. 8. – P. 1421-1436. 86. Daubner, S. C. Tyrosine hydroxylase and regulation of dopamine synthesis / S. C. Daubner, T. Le, S. Wang // Arch. Biochem. Biophys. – 2011. – Vol. 508. – N. 1. – P. 1-12. 87. Daubner, S. C. Deletion mutants of tyrosine hydroxylase identify a region critical for heparin binding / S. C. Daubner, M. M. Piper // Protein Science. – 1995. – Vol. 4. – N. 3. – P. 538-541. 88. Davey, G. P. Threshold effects and control of oxidative phosphorylation in nonsynaptic rat brain mitochondria / G. P. Davey, J. B. Clark // J. Neurochem. – 1996. – Vol. 66. – N. 4. – P. 1617-1624. 89. Dawson, T. M. Genetic animal models of Parkinson's disease / T. M. Dawson, H. S. Ko, V. L. Dawson // Neuron. – 2010. – Vol. 66. – N. 5. – P. 646-661. 90. Delfs, J. M. Regulation of μ‐Opioid Receptor mRNA in Rat Globus Pallidus: Effects of Enkephalin Increases Induced by Short‐and Long‐Term Haloperidol Administration / J. M. Delfs [et al.] // J. Neurochem. – 1994. – Vol. 63. – N. 2. – P. 777-780. 91. Demarest, K. T. Comparison of dopamine synthesis regulation in the terminals of nigrostriatal, mesolimbic, tuberoinfundibular and tuberohypophyseal neurons / K. T. Demarest, K. E. Moore // J. Neural. Transm. – 1979. – Vol. 46. – N. 4. – P. 263-277. 92. Deng, H. Genetic analysis of LRRK2 mutations in patients with Parkinson disease / H. Deng [et al.] // J. Neurol. Sci. – 2006. – Vol. 251. – N. 1. – P. 102-106. 115 93. Devi, L. Mitochondrial import and accumulation of α-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain / L. Devi [et al.] // J. Biol. Chem. – 2008. – Vol. 283. – N. 14. – P. 9089-9100. 94. Dexter, D.T. Alter-ations in the levels of iron, ferritin and other trace metals in Parkinson’s disease and other neurodegenerative diseases affecting the basal ganglia / D. T. Dexter [et al.] // Brain. – 1991. Vol. – 114. – P. 1953–1975. 95. Dexter, D.T. Increased levels of lipid hydroperoxides in the parkinsonian substantia nigra: an HPLC and ESR study / D. T. Dexter [et al.] // Mov. Disord. – 1994. – Vol. 9. – N. 1. – P. 9297. 96. Dexter, D. T. Increased nigral iron content in postmortem parkinsonian brain / D. T. Dexter [et al.] // The Lancet. – 1987. – Vol. 330. – N. 8569. – P. 1219-1220. 97. Dexter, D. T. Increased nigral iron content and alterations in other metal ions occurring in brain in Parkinson's disease / D. T. Dexter [et al.] // J. Neurochem. – 1989. – Vol. 52. – N. 6. – P. 1830-1836. 98. Dias, V. The role of oxidative stress in Parkinson’s disease / V. Dias, E. Junn, M. M. Mouradian // J. Parkinsons Dis. – 2013. – Vol. 3. – N. 4. – P. 461. 99. Ding, Y. Q. Immunohistochemical localization of μ‐opioid receptors in the central nervous system of the rat / Y. Q. Ding [et al.] // J. Comp. Neurol. – 1996. – Vol. 367. – N. 3. – P. 375402. 100. Dolotov, O. V. Semax, an analog of ACTH (4–10) with cognitive effects, regulates BDNF and trkB expression in the rat hippocampus / O. V. Dolotov [et al.] // Brain Res. – 2006. – Vol. 1117. – N. 1. – P. 54-60. 101. Dolotov, O. V. The heptapeptide SEMAX stimulates BDNF expression in different areas of the rat brain in vivo / O. V. Dolotov [et al.] // Dokl. Biol. Sci. – 2003. – Vol. 391. – N. 1. – P. 292295. 102. Revay, R. Dopamine transporter immunohistochemistry in median eminence, amygdala, and other areas of the rat brain / R. Revay [et al.] // Synapse. – 1996. – Vol. 22. – N. 2. – P. 93-99. 103. Dray, A. Serotonin in the basal ganglia: functions and interactions with other neuronal pathways / A. Dray // J. de physiologie. – 1980. – Vol. 77. – N. 2-3. – P. 393-403. 104. Du, Y. Minocycline prevents nigrostriatal dopaminergic neurodegeneration in the MPTP model of Parkinson's disease / Y. Du [et al.] // PNAS. – 2001. – Vol. 98. – N. 25. – P. 14669-14674. 105. Duffy, P. E. Phase and electron microscopic observations of Lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in Parkinson's disease / P. E. Duffy, V. M. Tennyson // J. Neuropathol. Exp. Neurol. – 1965. – Vol. 24. – N. 3. – P. 398-414. 116 106. Dunnett, S. B. Prospects for new restorative and neuroprotective treatments in Parkinson's disease / S. B. Dunnett, A. Björklund // Nature. – 1999. – Vol. 399. – P. A32-A39. 107. Dusonchet, J. A rat model of progressive nigral neurodegeneration induced by the Parkinson's disease-associated G2019S mutation in LRRK2 / J. A. Dusonchet [et al.] // J. Neurosci. – 2011. – Vol. 31. – N. 3. – P. 907-912. 108. Eaton, M. J. Distribution of aromatic L‐amino acid decarboxylase mRNA in mouse brain by in situ hybridization histology / M. J. Eaton [et al.] // J. Comp. Neurol. – 1993. – Vol. 337. – N. 4. – P. 640-654. 109. Ebert, A. D. Human neural progenitor cells over-expressing IGF-1 protect dopamine neurons and restore function in a rat model of Parkinson's disease / A. D. Ebert [et al.] // Exp. Neurol. – 2008. – Vol. 209. – N. 1. – P. 213-223. 110. Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons / M. Ekstrand [et al.] // PNAS. – 2007. – Vol. 104. – N. 4. – P. 1325-1330. 111. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death / S. Elmore // Toxicol. Pathol. – 2007. – Vol. 35. – N. 4. – P. 495-516. 112. Elsworth, J. D. Dopamine synthesis, uptake, metabolism, and receptors: relevance to gene therapy of Parkinson's disease / J. D. Elsworth, R. H. Roth // Exp. Neurol. – 1997. – Vol. 144. – N. 1. – P. 4-9. 113. Fahn, S. The history of dopamine and levodopa in the treatment of Parkinson's disease / S. Fahn // Mov. Disord. – 2008. – Vol. 23. – N. S3. – P. S497-S508. 114. Fallon, J. H. Catecholamine innervation of the basal forebrain IV. Topography of the dopamine projection to the basal forebrain and neostriatum / J. H. Fallon, R. Y. Moore // J. Comp. Neurol. – 1978. – Vol. 180. – N. 3. – P. 545-579. 115. Fearnley, J. M. Ageing and Parkinson's disease: substantia nigra regional selectivity / J. M. Fearnley, A. J. Lees // Brain. – 1991. – Vol. 114. – N. 5. – P. 2283-2301. 116. Fenichel, G. M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children / G. M. Fenichel, M. Bazelon // Neurology. – 1968. – Vol. 18. – N. 8. – P. 817. 117. Fenton, H. J. H. LXXIII.—Oxidation of tartaric acid in presence of iron / H. J. H. Fenton // J. Chem. Soc., Trans. – 1894. – Vol. 65. – P. 899-910. 118. Fernagut, P. O. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of α-synuclein over-expression / P. O. Fernagut [et al.] // Synapse (New York, NY). – 2007. – Vol. 61. – N. 12. – P. 991-1001. 119. Ferrante, R. J. Systemic administration of rotenone produces selective damage in the striatum and globus pallidus, but not in the substantia nigra / R. J. Ferrante [et al.] // Brain Res. – 1997. – Vol. 753. – N. 1. – P. 157-162. 117 120. Ferrari, C. C. Progressive neurodegeneration and motor disabilities induced by chronic expression of IL-1β in the substantia nigra / C. C. Ferrari [et al.] // Neurobiol. Dis. – 2006. – Vol. 24. – N. 1. – P. 183-193. 121. Filloux, F. Pre-and postsynaptic neurotoxic effects of dopamine demonstrated by intrastriatal injection / F. Filloux, J. J. Townsend //Exp. Neurol. – 1993. – Vol. 119. – N. 1. – P. 79-88. 122. Fleming, S. M. Behavioral and immunohistochemical effects of chronic intravenous and subcutaneous infusions of varying doses of rotenone / S. M. Fleming [et al.] // Exp. Neurol. – 2004. – Vol. 187. – N. 2. – P. 418-429. 123. Folley, J.M. On the nature of pigment granules in the cells of the locus coeruleus and substantia nigra / J. M. Folley, D. Banter // J. Neuropathol. Exp. Neurol. – 1958. – Vol. 17. – N. 4. – P. 586-598. 124. Fornai, F. Parkinson-like syndrome induced by continuous MPTP infusion: convergent roles of the ubiquitin-proteasome system and α-synuclein / F. Fornai [et al.] // PNAS. – 2005. – Vol. 102. – N. 9. – P. 3413-3418. 125. Fornai, F. Effects of noradrenergic lesions on MPTP/MPP+ kinetics and MPTP-induced nigrostriatal dopamine depletions / F. Fornai [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1997. – Vol. 283. – N. 1. – P. 100-107. 126. Forno, L. S. Locus ceruleus lesions and eosinophilic inclusions in MPTP‐treated monkeys / L. S. Forno [et al.] // Ann. Neurol. – 1986. – Vol. 20. – N. 4. – P. 449-455. 127. Fossom, L. H., Regulation of tyrosine hydroxylase gene transcription rate and tyrosine hydroxylase mRNA stability by cyclic AMP and glucocorticoid / L. H. Fossom, C. R. Sterling, A. W. Tank // Molecular pharmacology. – 1992. – Vol. 42. – N. 5. – P. 898-908. 128. Franco-Iborra, S. The Parkinson Disease Mitochondrial Hypothesis Where Are We at? / S. Franco-Iborra, C. Vila M., Perier // Neuroscientist. – 2015. – P. 1073858415574600. 129. Fu, Y. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse / Y. Fu [et al.] // Brain Struct. Funct. – 2012. – Vol. 217. – N. 2. – P. 591-612. 130. Fujiyama, F. Morphological elucidation of basal ganglia circuits contributing reward prediction / F Fujiyama, S. Takahashi, F. Karube // Front. Neurosci. – 2015. – Т. 9. – P. 6 131. Fujiyama, F. Exclusive and common targets of neostriatofugal projections of rat striosome neurons: a single neuron‐tracing study using a viral vector / F. Fujiyama [et al.] // Eur. J. Neurosci. – 2011. – Vol. 33. – N. 4. – P. 668-677. 132. Galter, D. ALDH1 mRNA: presence in human dopamine neurons and decreases in substantia nigra in Parkinson's disease and in the ventral tegmental area in schizophrenia / D. Galter [et al.] // Neurobiol. Dis. – 2003. – Vol. 14. – N. 3. – P. 637-647. 118 133. Gasser, P. J. Distribution of organic cation transporter 3, a corticosterone‐sensitive monoamine transporter, in the rat brain / P. J. Gasser [et al.] // J. Comp. Neurol. – 2009. – Vol. 512. – N. 4. – P. 529-555. 134. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic. I. Compartmental organization of projections from the striatum to the substantia nigra in the rat / C. R. Gerfen // J. Comp. Neurol. – 1985. – V. 236. – N. 4. – P. 454-476. 135. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization / C. R. Gerfen // Advances in Neuroscience and Schizophrenia. – Springer Vienna. – 1992. – P. 43-59. 136. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: II. Patch-and matrix-directed mesostriatal dopaminergic and non-dopaminergic systems / C. R. Gerfen, M. Herkenham, J. Thibault // J. Neurosci. – 1987. – Vol. 7. – N. 12. – P. 3915-3934. 137. Gerfen, C. R. Distribution of striatonigral and striatopallidal peptidergic neurons in both patch and matrix compartments: an in situ hybridization histochemistry and fluorescent retrograde tracing study / C. R. Gerfen, W. S. Young // Brain Res. – 1988. – Vol. 460. – N. 1. – P. 161167. 138. Gerfen, C. R. D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of striatonigral and striatopallidal neurons / C. R. Gerfen [et al.] // Science. – 1990. – Vol. 250. – N. 4986. – P. 1429-1432. 139. Gerlach, M. Animal models of Parkinson's disease: an empirical comparison with the phenomenology of the disease in man / M. Gerlach, P. Riederer // J. Neural. Transm. – 1996. – Vol. 103. – N. 8-9. – P. 987-1041. 140. German, D. C. Midbrain Dopaminergic Cell Loss in Parkinson's Disease and MPTP‐Induced Parkinsonism: Sparing of Calbindin‐D25k—Containing Cellsa / D. C. German [et al.] // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1992. – Vol. 648. – N. 1. – P. 42-62. 141. German, D. C. The neurotoxin MPTP causes degeneration of specific nucleus A8, A9 and A10 dopaminergic neurons in the mouse / D. C. German [et al.] // Neurodegeneration. – 1996. – Vol. 5. – N. 4. – P. 299-312. 142. Giardina, G. Open conformation of human DOPA decarboxylase reveals the mechanism of PLP addition to Group II decarboxylases / G. Giardina [et al.] // PNAS. – 2011. – Vol. 108. – N. 51. – P. 20514-20519. 143. Gibb, W. R. Anatomy, pigmentation, ventral and dorsal subpopulations of the substantia nigra, and differential cell death in Parkinson's disease / W. R. Gibb, A. J. Lees // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. – 1991. – Vol. 54. – N. 5. – P. 388-396. 119 144. Gibrat, C. Differences between subacute and chronic MPTP mice models: investigation of dopaminergic neuronal degeneration and α‐synuclein inclusions / C. Girbat [et al.] // J. Neurochem. – 2009. – Vol. 109. – N. 5. – P. 1469-1482. 145. Giros, B. Molecular characterization of the dopamine transporter / B. Giros, M. G. Caron // Trends Pharmacol. Sci. – 1993. – Vol. 14. – N. 2. – P. 43-49. 146. Glowinski, J. The striatonigral substance P pathway and dopaminergic mechanisms / J. Glowinski, Y. Torrens, J. C. Beaujouan // Substance P in the nervous system. – Pitman London. – 1982. – P. 281-295. 147. Goldberg, M. S. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons / M. S. Goldberg [et al.] // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278. – N. 44. – P. 4362843635. 148. Goldstein, D. S. Determinants of buildup of the toxic dopamine metabolite DOPAL in Parkinson's disease / D. S. Goldstein [et al.] // J. Neurochem. – 2013. – Vol. 126. – N. 5. – P. 591-603. 149. Goldstein, D. S. Catechols in post‐mortem brain of patients with Parkinson disease / D. S. Goldstein [et al.] // Eur. J. Neurol. – 2011. – Vol. 18. – N. 5. – P. 703-710. 150. Good, P. F. Neuromelanin-containing neurons of the substantia nigra accumulate iron and aluminum in Parkinson's disease: a LAMMA study / P. F. Good, C. W. Olanow, D. P. Perl // Brain Res. – 1992. – Vol. 593. – N. 2. – P. 343-346. 151. Graeber, M. B. Nigral neurons are likely to die of a mechanism other than classical apoptosis in Parkinson's disease / M. B. Graeber [et al.] // Parkinsonism Rel. Disord. – 1999. – Vol. 5. – N. 4. – P. 187-192. 152. Granholm, A. C. Glial cell line-derived neurotrophic factor improves survival of ventral mesencephalic grafts to the 6-hydroxydopamine lesioned striatum / A. C. Granholm [et al.] // Exp. Brain Res. – 1997. – Vol. 116. – N. 1. – P. 29-38. 153. Graybiel, A. M. Neurotransmitters and neuromodulators in the basal ganglia / A. M. Graybiel // Trends Neurosci. – 1990. – Vol. 13. – N. 7. – P. 244-254. 154. Graybiel, A. M. Histochemically distinct compartments in the striatum of human, monkeys, and cat demonstrated by acetylthiocholinesterase staining / A. M. Graybiel, C. W. Ragsdale // PNAS. – 1978. – Vol. 75. – N. 11. – P. 5723-5726. 155. Grima, B. Complete coding sequence of rat tyrosine hydroxylase mRNA / B. Grima [et al.] // PNAS. – 1985. – Vol. 82. – N. 2. – P. 617-621. 156. Grima, B. A single human gene encoding multiple tyrosine hydroxylases with different predicted functional characteristics / B. A. Grima [et al.] // Nature. – 1987. – Vol. 326. – N. 6114. – P. 707-711. 120 157. Gulley, J. M. Rapid regulation of dopamine transporter function by substrates, blockers and presynaptic receptor ligands / J. M. Gulley, N. R. Zahniser // Eur. J. Pharmacol. – 2003. – Vol. 479. – N. 1. – P. 139-152. 158. Gurevich, I. B. (2010) Automating extraction and analysis of dopaminergic axon terminals in images of frontal slices of the striatum / I. B. Gurevich [et al.] // Patt. Rec. Img. Anal. – 2010. – Vol. 20. – P. 349-359. 159. Hadjiconstantinou, M. Aromatic L‐Amino Acid Decarboxylase Activity of Mouse Striatum Is Modulated via Dopamine Receptors / M. Hadjiconstantinou [et al.] // J. Neurochem. – 1993. – Vol. 60. – N. 6. – P. 2175-2180. 160. Halliday, G. M. L. α-Synuclein redistributes to neuromelanin lipid in the substantia nigra early in Parkinson's disease / G. M. L. Halliday [et al.] // Brain. – 2005. – Vol. 128. – N. 11. – P. 2654-2664. 161. Hantraye, P. Stable parkinsonian syndrome and uneven loss of striatal dopamine fibres following chronic MPTP administration in baboons / P. Hantraye [et al.] // Neuroscience. – 1993. – Vol. 53. – N. 1. – P. 169-178. 162. Hartmann, A. Caspase-3: a vulnerability factor and final effector in apoptotic death of dopaminergic neurons in Parkinson's disease / A. Hartmann [et al.] // PNAS. – 2000. – Vol. 97. – N. 6. – P. 2875-2880. 163. Hashimoto, M. Role of cytochrome c as a stimulator of α-synuclein aggregation in Lewy body disease / M. Hashimoto [et al.] // J. Biol. Chem. – 1999. – Vol. 274. – N. 41. – P. 28849-28852. 164. Hattori, N. Immunohistochemical studies on complexes I, II, III, and IV of mitochondria in Parkinson's disease / N. Hattori [et al.] // Ann. Neurol. – 1991. – Vol. 30. – N. 4. – P. 563-571. 165. He, Y. 6-Hydroxydopamine induced apoptosis of dopaminergic cells in the rat substantia nigra / Y. He, T. Lee, S. K. Leong // Brain Res. – 2000. – Vol. 858. – N. 1. – P. 163-166. 166. Healy, D. G. Test for LRRK2 mutations in patients with Parkinson’s disease / D. G. Healy, N. W. Wood, A. H. V. Schapira // Pract. Neurol. – 2008. – Vol. 8. – N. 6. – P. 381-385. 167. Hebb, M. O. Identification of a subpopulation of substantia nigra pars compacta γ‐aminobutyric acid neurons that is regulated by basal ganglia activity / M. O. Hebb, H. A. Robertson // J. Comp. Neurol. – 2000. – Vol. 416. – N. 1. – P. 30-44. 168. Hefti, F. Partial lesions of the dopaminergic nigrostriatal system in rat brain: biochemical characterization / F. Hefti, E. Melamed, R. J. Wurtman // Brain Res. – 1980. – Vol. 195. – P. 123-137. 169. Hegarty, S. V. Roles for the TGFβ superfamily in the development and survival of midbrain dopaminergic neurons / S. V. Hegarty, A. M. Sullivan, G. W. O’Keeffe // Mol. Neurobiol. – 2014. – Vol. 50. – N. 2. – P. 559-573. 121 170. Heikkila, R. E. Dopaminergic toxicity of rotenone and the 1-methyl-4-phenylpyridinium ion after their stereotaxic administration to rats: implication for the mechanism of 1-methyl-4phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine toxicity / R. E. Heikkila [et al.] // Neurosci. Lett. – 1985. – Vol. 62. – N. 3. – P. 389-394. 171. Helson, L. Effect of tumour necrosis factor on cultured human melanoma cells / L. Helson [et al.] // Nature. – 1975. – Vol. 258. – N. 5537. – P. 731-732. 172. Herrera, A. J. The single intranigral injection of LPS as a new model for studying the selective effects of inflammatory reactions on dopaminergic system / A. J. Herrera [et al.] // Neurobiol. Dis. – 2000. – Vol. 7. – N. 4. – P. 429-447. 173. Herrero, M. T. Does neuromelanin contribute to the vulnerability of catecholaminergic neurons in monkeys intoxicated with MPTP? / M. T. Herrero [et al.] // Neuroscience. – 1993. – Vol. 56. – N. 2. – P. 499-511. 174. Hirsch, E. C. Why are nigral catecholaminergic neurons more vulnerable than other cells in Parkinson's disease? / E. C. Hirsch // Ann. Neurol. – 1992. – Vol. 32. – N. S1. – P. S88-S93. 175. Hirsch, E. Melanized dopaminergic neurons are differentially susceptible to degeneration in Parkinson's disease / E. Hirsch, A. M. Graybiel, Y. A. Agid // Nature. – 1988. – Vol. 334. – N. 6180. – P. 345-348. 176. Hitri, A. Molecular, functional and biochemical characteristics of the dopamine transporter: regional differences and clinical relevance / A. Hirti [et al.] // Clin. Neuropharmacol. – 1994. – Vol. 17. – N. 1. – P. 1-22. 177. Hoehn, M. M. Parkinsonism: onset, progression, and mortality / M. M. Hoehn, M. D. Yahr // Neurology. – 1998. – Vol. 50. – N. 2. – P. 318-318. 178. Höglinger, G.U. The mitochondrial complex I inhibitor rotenone triggers a cerebral tauopathy / G. U. Höglinger [et al.] // J. Neurochem. – 2005. – Vol. 95. – N. 4. – P. 930-939. 179. Hökfelt, T. Specificity of 6-hydroxydopamine induced degeneration of central monoamine neurones: an electron and fluorescence microscopic study with special reference to intracerebral injection on the nigro-striatal dopamine system / T. Hökfelt, U. Ungerstedt // Brain Res. – 1973. – Vol. 60. – N. 2. – P. 269-297. 180. Holler, N. Fas triggers an alternative, caspase-8–independent cell death pathway using the kinase RIP as effector molecule / N. Holler [et al.] // Nat. Immunol. – 2000. – Vol. 1. – N. 6. – P. 489-495. 181. Hope, A. D. α-Synuclein missense and multiplication mutations in autosomal dominant Parkinson’s disease / A. D. Hope [et al.] // Neurosci. Lett. – 2004. – Vol. 367. – N. 1. – P. 97100. 122 182. Hou, J. G. G. Basic fibroblast growth factor stimulation of glial cells protects dopamine neurons from 6‐hydroxydopamine toxicity: involvement of the glutathione system / J. G. G. Hou, G. Cohen, C. Mytilineou // J. Neurochem. – 1997. – Vol. 69. – N. 1. – P. 76-83. 183. Hudson, G. Two-stage association study and meta-analysis of mitochondrial DNA variants in Parkinson disease / G. Hudson [et al.] // Neurology. – 2013. – Vol. 80. – N. 22. – P. 2042-2048. 184. Hunter, R. L. Intrastriatal lipopolysaccharide injection induces parkinsonism in C57/B6 mice / R. L. Hunter [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2009. – Vol. 87. – N. 8. – P. 1913-1921. 185. Ichinose, H. Isolation and characterization of a cDNA clone encoding human aromatic L-amino acid decarboxylase / H. Ichinose [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1989. – Vol. 164. – N. 3. – P. 1024-1030. 186. Iseki, E. A neuropathological study of the disturbance of the nigro-amygdaloid connections in brains from patients with dementia with Lewy bodies / E. A. Iseki [et al.] // J. Neurol. Sci. – 2001. – Vol. 185. – N. 2. – P. 129-134. 187. Ishii, S. Functionally important residues of aromatic L-amino acid decarboxylase probed by sequence alignment and site-directed mutagenesis / S. Ishii [et al.] // J. Biochem. – 1996. – Vol. 120. – N. 2. – P. 369-376. 188. Ishizawa, T. Colocalization of Tau and alpha‐synuclein epitopes in lewy bodies / T. Ishizawa [et al.] // J. Neuropathol. Exp. Neurol. – 2003. – Vol. 62. – N. 4. – P. 389-397. 189. Iskedjian, M. Cost analysis of ropinirole versus levodopa in the treatment of Parkinson’s disease / M. Iskedjian, T. R. Einarson // Pharmacoeconomics. – 2003. – Vol. 21. – N. 2. – P. 115-127. 190. Isomura, Y. Reward-modulated motor information in identified striatum neurons / Y. Isomura [et al.] // J. Neurosci. – 2013. – Vol. 33. – N. 25. – P. 10209-10220. 191. Itzhak, Y. Effect of the dopaminergic neurotoxin MPTP on cocaine-induced locomotor sensitization / Y. Itzhak [et al.] // Pharmacol. Biochem. Behav. – 1999. – Vol. 63. – P. 101-107. 192. Jackson-Lewis, V. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine / V. Jackson-Lewis [et al.] // Neurodegeneration. – 1995. – Vol. 4. – N. 3. – P. 257-269. 193. Jaeger, C. B. Aromaticl-amino acid decarboxylase in the rat brain: Immunocytochemical localization in neurons of the brain stem / C. B. Jaeger [et al.] // Neuroscience. – 1984. – Vol. 11. – N. 3. – P. 691-713. 194. Jakowec, M. W. Tyrosine hydroxylase and dopamine transporter expression following 1‐ methyl‐4‐phenyl‐1, 2, 3, 6‐tetrahydropyridine‐induced neurodegeneration of the mouse nigrostriatal pathway / M. W. Jakowe [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2004. – Vol. 76. – N. 4. – P. 539-550. 123 195. Javoy-Agid, F. Decreased tyrosine hydroxylase messenger RNA in the surviving dopamine neurons of the substantia nigra in Parkinson's disease: an in situ hybridization study / F. JavoyAgid [et al.] // Neuroscience. – 1990. – Vol. 38. – P. 245-253. 196. Jebai, F. Expression, Purification, and Characterization of Rat Aromaticl-Amino Acid Decarboxylase inEscherichia coli / F. Jebai [et al.] // Protein Expr. Purif. – 1997. – Vol. 11. – N. 2. – P. 185-194. 197. Jellinger, K. A. Is there apoptosis in Lewy body disease? / K. A. Jellinger // Acta neuropathol. – 1999. – Vol. 97. – N. 4. – P. 413-415. 198. Jenner, P. Oxidative stress as a cause of nigral cell death in Parkinson's disease and incidental Lewy body disease / P. Jenner [et al.] // Ann. Neurol. – 1992. – Vol. 32. – N. S1. – P. S82-S87. 199. Jeon, B. S. 6-Hydroxydopamine lesion of the rat substantia nigra: time course and morphology of cell death / B. S. Jeon, V. Jackson-Lewis, R. E. Burke // Neurodegeneration. – 1995. – Vol. 4. – N. 2. – P. 131-137. 200. Johnston, J. P. Some observations upon a new inhibitor of monoamine oxidase in brain tissue / J. P. Johnston // Biochem. Pharmacol. – 1968. – Vol. 17. – N. 7. – P. 1285-1297. 201. Johnston, J. G. Mechanisms of striatal pattern formation: conservation of mammalian compartmentalization / J. G. Johnston [et al.] // Dev. Brain Res. – 1990. – Vol. 57. – N. 1. – P. 93-102. 202. Kahlig, K. M. Regulation of dopamine transporter function and plasma membrane expression by dopamine, amphetamine, and cocaine / K. M. Kahling, A. Galli // Eur. J. Pharmacol. – 2003. – Vol. 479. – N. 1. – P. 153-158. 203. Kaneko, T. Immunocytochemical localization of μ-opioid receptor in the rat caudate-putamen / T. Kaneko [et al.] // Neurosci. Lett. – 1995. – Vol. 184. – N. 3. – P. 149-152. 204. Kastner, A. Tyrosine hydroxylase protein and messenger RNA in the dopaminergic nigral neurons of patients with Parkinson's disease / A. Kastner [et al.] // Brain Res. – 1993. – Vol. 606. – P. 341-345. 205. Katz, I. R. Activation of tyrosine hydroxylase by polyanions and salts An electrostatic effect / I. R. Katz, T. Yamauchi, S. Kaufman // Biochim. Biophys. Acta. – 1976. – Vol. 429. – N. 1. – P. 84-95. 206. Kawaguchi, Y. Projection subtypes of rat neostriatal matrix cells revealed by intracellular injection of biocytin / Y. Kawaguchi, C. J. Wilson, P. C. Emson // J. Neurosci. – 1990. – Vol. 10. – N. 10. – P. 3421-3438. 207. Keeney, P. M. Parkinson's disease brain mitochondrial complex I has oxidatively damaged subunits and is functionally impaired and misassembled / P. M. Keeney [et al.] // J. Neurosci. – 2006. – Vol. 26. – N. 19. – P. 5256-5264. 124 208. Kelly, R. B. Biogenesis of synaptic vesicles / R. B. Kelly [et al.] // J. Cell Sci. – 1993. – Vol. 1993. – Suppl. 17. – P. 81-83. 209. Kerr, J. F. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics / J. F. R. Kerr, A. H. Wyllie, A. R. Currie // Br. J. Cancer. – 1972. – Vol. 26. – N. 4. – P. 239. 210. Kholodilov, N. Regulation of the development of mesencephalic dopaminergic systems by the selective expression of glial cell line-derived neurotrophic factor in their targets / N. Kholodilov [et al.] // J. Neurosci. – 2004. – Vol. 24. – N. 12. – P. 3136-3146. 211. Kingsbury, A. E. DNA fragmentation in human substantia nigra: apoptosis or perimortem effect? / A. E. Kingsbury, C. David Mardsen, O. J. F. Foster //Mov. Disord. – 1998. – Vol. 13. – N. 6. – P. 877-884. 212. Kirchhoff, J. Striatal extracellular dopamine levels and behavioural reversal in MPTP-lesioned mice / J. Kirchhoff [et al.] // Neuroreport. – 2009. – Vol. 20. – N. 5. – P. 482-486. 213. Kirik, D. Delayed infusion of GDNF promotes recovery of motor function in the partial lesion model of Parkinson's disease / D. Kirik [et al.] // Eur. J. Neurosci. – 2001. – Vol. 13. – N. 8. – P. 1589-1599. 214. Kish, S. J. Uneven pattern of dopamine loss in the striatum of patients with idiopathic Parkinson's disease / S. J. Kish, K. Shannak, O. Hornykiewicz // N. Engl. J. Med. – 1988. – Vol. 318. – N. 14. – P. 876-880. 215. Kitahama, K. Aromatic L‐amino acid decarboxylase‐immunohistochemistry in the cat lower brainstem and midbrain / K. Kitahama [et al.] // J. Comp. Neurol. – 1990. – Vol. 302. – N. 4. – P. 935-953. 216. Kitahama, K. Aromatic L-amino acid decarboxylase-immunoreactive structures in human midbrain, pons, and medulla / K. Kitahama [et al.] // J. Chem. Neuroanat. – 2009. – Vol. 38. – N. 2. – P. 130-140. 217. Knott, C. Inflammatory regulators in Parkinson's disease: iNOS, lipocortin-1, and cyclooxygenases-1 and-2 / C. Knott, G. Stern, G. P. Wilkin // Mol. Cell. Neurosci. – 2000. – Vol. 16. – N. 6. – P. 724-739. 218. Kobe, B. Regulation and crystallization of phosphorylated and dephosphorylated forms of truncated dimeric phenylalanine hydroxylase / B. Kobe [et al.] // Protein science. – 1997. – Vol. 6. – N. 6. – P. 1352-1357. 219. Kösel, S. On the question of apoptosis in the parkinsonian substantia nigra / S. Kösel // Acta neuropathol. – 1997. – Vol. 93. – N. 2. – P. 105-108. 220. Kosta, P. MRI evaluation of the basal ganglia size and iron content in patients with Parkinson’s disease / P. Kosta [et al.] // J. Neurol. – 2006. – Vol. 253. – P. 26–32. 125 221. Kozina, E. A. Tyrosine hydroxylase expression and activity in nigrostriatal dopaminergic neurons of MPTP-treated mice at the presymptomatic and symptomatic stages of parkinsonism / E. A. Kozina [et al.] // J. Neurol. Sci. – 2014. – Vol. 340. – N. 1. – P. 198-207. 222. Kristensen, H. K. Capillary electrophoresis of single cells: observation of two compartments of neurotransmitter vesicles / H. K. Kristensen, Y. Y. Lau, A. G. Ewing // J. Neurosci. Methods. – 1994. – Vol. 51. – N. 2. – P. 183-188. 223. Krueger, B. K. Kinetics and block of dopamine uptake in synaptosomes from rat caudate nucleus / B. K. Krueger // J. Neurochem. – 1990. – Vol. 55. – N. 1. – P. 260-267. 224. Kubota, Y. Dopaminergic axons directly make synapses with GABAergic neurons in the rat neostriatum / Y. Kubota [et al.] // Brain Res. – 1987. – Vol. 406. – N. 1. – P. 147-156. 225. Kuczenski, R. T. Regulatory properties of soluble and particulate rat brain tyrosine hydroxylase / R. T. Kuczenski, A. J. Mandell // J. Biol. Chem. – 1972. – Vol. 247. – N. 10. – P. 3114-3122. 226. Kuhar, M. J. Neurochemical changes in cocaine withdrawal / M. J. Kuhar, N. S. Pilotte // Trends Pharmacol. Sci. – 1996. – Vol. 17. – N. 7. – P. 260-264. 227. Kühn, K. The mouse MPTP model: gene expression changes in dopaminergic neurons / K. Kühn // Eur. J. Neurosci. – 2003. – Vol. 17. – N. 1. – P. 1-12. 228. Kumer S. C. Intricate regulation of tyrosine hydroxylase activity and gene expression / S. C. Kumer, K. E. Vrana // J. Neurochem. – 1996. – Vol. 67. – N. 2. – P. 443-462. 229. Kurosaki, R. Biochemical, behavioral and immunohistochemical alterations in MPTP-treated mouse model of Parkinson's disease / R. Kurosaki [et al.] // Pharmacol. Biochem. Behav. – 2004. – Vol. 78. – N. 1. – P. 143-153. 230. Langston, J. W. Current theories on the cause of Parkinson's disease / J. W. Langston // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. – 1989. – Vol. 52. – P. 13-17. 231. Langston, J. W. MPTP: current concepts and controversies / J. W. Langston, I. Irwin // Clin. Neuropharmacol. – 1986. – Vol. 9. – N. 6. – P. 485-507. 232. Langston, J. W. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis / J. W. Langston [et al.] // Science. – 1983. – Vol. 219. – N. 4587. – P. 979-980. 233. Lapointe, N. Rotenone induces non-specific central nervous system and systemic toxicity /N. Lapointe [et al.] // FASEB J. – 2004. – Vol. 18. – N. 6. – P. 717-719. 234. Lau, Y. S. Depletion of striatal dopamine by the N-oxide of 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6tetrahydropyridine (MPTP) / Y. S. Lau [et al.] // Neurotoxicology. – 1990. – Vol. 12. – N. 2. – P. 189-199. 235. Lavoie, B. Dopaminergic neurons expressing calbindin in normal and parkinsonian monkeys / B. Lavoie, A. Parent // Neuroreport. – 1991. – Vol. 2. – N. 10. – P. 601-604. 126 236. Lee, H. J. Membrane-bound α-synuclein has a high aggregation propensity and the ability to seed the aggregation of the cytosolic form / H. J. Lee, C. Choi, S. J. Lee // J. Biol. Chem. – 2002. – Vol. 277. – N. 1. – P. 671-678. 237. Lees, A. J. Drugs for Parkinson’s disease / A. J. Lees // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. – 2002. – Vol. 73. – N. 6. – P. 607-610. 238. Lévesque, M. The striatofugal fiber system in primates: a reevaluation of its organization based on single-axon tracing studies / M. Lévesque, A. Parent // PNAS. – 2005. – Vol. 102. – N. 33. – P. 11888-11893. 239. Levine, B. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy / B, Levine, D. J. Klionsky // Dev. Cell. – 2004. – Vol. 6. – N. 4. – P. 463-477. 240. Levitskaya, N. G. The neuroprotective effects of Semax in conditions of MPTP-induced lesions of the brain dopaminergic system / N. G. Levitskaya [et al.] // Neurosci. Behav. Physiol. – 2004. – Vol. 34. – N. 4. – P. 399-405. 241. Li, W. Aggregation promoting C-terminal truncation of α-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson's disease-linked mutations / W. Li [et al.] // PNAS. – 2005. – Vol. 102. – N. 6. – P. 2162-2167. 242. Li, X. M. NSD-1015 alters the gene expression of aromaticl-amino acid decarboxylase in rat PC12 pheochromocytoma cells / X. M. Li, A. V. Juorio, A. A. Boulton // Neurochem. Res. – 1993. – Vol. 18. – N. 8. – P. 915-919. 243. Liang, C. L. Midbrain dopaminergic neurons in the mouse: co-localization with calbindin-D 28K and calretinin / C. L. Liang, C. M. Sinton, D. C. German // Neuroscience. – 1996. – Vol. 75. – N. 2. – P. 523-533. 244. Lichtensteiger, W. Stimulation of nigrostriatal dopamine neurones by nicotine / W. Lichtensteiger [et al.] // Neuropharmacology. – 1982. – Vol. 21. – N. 10. – P. 963-968. 245. Lim, K. L. Parkin mediates nonclassical, proteasomal-independent ubiquitination of synphilin1: implications for Lewy body formation / K. L. Lim [et al.] // J. Neurosci. – 2005. – Vol. 25. – N. 8. – P. 2002-2009. 246. Liou, H. H. Environmental risk factors and Parkinson's disease A case‐control study in Taiwan / H. H. Liou [et al.] // Neurology. – 1997. – Vol. 48. – N. 6. – P. 1583-1588. 247. Lloyd, T. The effects of phosphatidylinositol on tyrosine hydroxylase / T. Lloyd, S. Kaufman // J. Biol. Chem. – 1979. – Vol. 254. – P. 7247-7254. 248. Lovenberg, W. A sensitive assay of monoamine oxidase activity in vitro: application to heart and sympathetic ganglia / W. Lovenberg, R. J. Levine, A. Sjoerdsma // J. Pharmacol. Exp. Therap. – 1962. – Vol. 135. – N. 1. – P. 7-10. 127 249. Luthman, J. Effects ofd-amphetamine and methylphenidate on hyperactivity produced by neonatal 6-hydroxydopamine treatment / J. Luthman [et al.] // Psychopharmacology. – 1989. – Vol. 99. – N. 4. – P. 550-557. 250. Mak, S. K. Lysosomal degradation of α-synuclein in vivo / S. K. Mak [et al.] // J. Biol. Chem. – 2010. – Vol. 285. – N. 18. – P. 13621-13629. 251. Mann, D. M. A. Possible role of neuromelanin in the pathogenesis of Parkinson's disease / D. M. A. Mann, P. O. Yates // Mech. Ageing Dev. – 1983. – Vol. 21. – N. 2. – P. 193-203. 252. Manning-Bog, A. B. The Herbicide Paraquat Causes Up-regulation and Aggregation of αSynuclein in Mice paraquat and α-synuclein / A. B. Manning-Bog [et al.] // J. Biol. Chem. – 2002. – Vol. 277. – N. 3. – P. 1641-1644. 253. Männistö, P. T. Catechol-O-methyltransferase (COMT): biochemistry, molecular biology, pharmacology, and clinical efficacy of the new selective COMT inhibitors / P. T. Männistö, S. Kaakkola // Pharmacol. Rev. – 1999. – Vol. 51. – N. 4. – P. 593-628. 254. Männistö, P. T. Different in vivo properties of three new inhibitors of catechol O‐ methyltransferase in the rat / P. T. Männistö, P. Tuomainen, R. K. Tuominen // Br. J. Pharmacol. – 1992. – Vol. 105. – N. 3. – P. 569-574. 255. Mansour, A. Immunohistochemical localization of the cloned μ opioid receptor in the rat CNS / A. Mansour [et al.] // J. Chem. Neuroanat. – 1995. – Vol. 8. – N. 4. – P. 283-305. 256. Maraganore, D. M. Genetic Epidemiology of Parkinson's Disease (GEO-PD) Consortium. Collaborative analysis of α-synuclein gene promoter variability and Parkinson disease / D. M. Maraganore [et al.] // Jama. – 2006. – Vol. 296. – N. 6. – P. 661-670. 257. Marchitti, S. A. Neurotoxicity and metabolism of the catecholamine-derived 3, 4dihydroxyphenylacetaldehyde and 3, 4-dihydroxyphenylglycolaldehyde: the role of aldehyde dehydrogenase / S. A. Marchitti, R. A. Deitrich, V. Vasiliou // Pharmacol. Rev. – 2007. – Vol. 59. – N. 2. – P. 125-150. 258. Marques, O. Alpha-synuclein: from secretion to dysfunction and death / O. Marques // Cell Death Dis. – 2012. – Vol. 3. – N. 7. – P. e350. 259. Martinez, A. Conformation and interaction of phenylalanine with the divalent cation at the active site of human recombinant tyrosine hydroxylase as determined by proton NMR / A. Martinez [et al.] // Biochemistry. – 1993. – Vol. 32. – N. 25. – P. 6381-6390. 260. Mash, D. C. Dopamine transport function is elevated in cocaine users / D. Mash [et al.] // J. Neurochem. – 2002. – Vol. 81. – N. 2. – P. 292-300. 261. Masserano, J. M. Tyrosine hydroxylase regulation in the central nervous system / J. M. Masserano, N. Weiner // Mol. Cell Biochem. – 1983. – Vol. 53-54. – P. 129-152. 128 262. Matsuoka, Y. Lack of nigral pathology in transgenic mice expressing human α-synuclein driven by the tyrosine hydroxylase promoter / Y. Matsuoka [et al.] // Neurobiol. Dis. – 2001. – Vol. 8. – N. 3. – P. 535-539. 263. Mattammal, M. B. Confirmation of a dopamine metabolite in parkinsonian brain tissue by gas chromatography—mass spectrometry / M. B. Mattammal [et al.] // J. Chromatogr. B. Biom. Sci. Appl. – 1993. – Vol. 614. – N. 2. – P. 205-212. 264. Mattammal, M. B. An endogenous dopaminergic neurotoxin: implication for Parkinson's disease / M. B. Mattammal [et al.] // Neurodegeneration. – 1995. – Vol. 4. – N. 3. – P. 271-281. 265. Matzuk, M. M. Preservation of hypothalamic dopaminergic neurons in Parkinson's disease / M. M. Matzuk, C. B. Saper // Ann. Neurol. – 1985. – Vol. 18. – N. 5. – P. 552-555. 266. McCollum, M. Post-MPTP treatment with granulocyte colony-stimulating factor improves nigrostriatal function in the mouse model of Parkinson’s disease / M. McCollum [et al.] // Mol. Neurobiol. – 2010. – Vol. 41. – N. 2-3. – P. 410-419. 267. McCormack, A. L. Effects of l‐dopa and other amino acids against paraquat‐induced nigrostriatal degeneration / A. L. McCormack, D. A. Di Monte // J. Neurochem. – 2003. – Vol. 85. – N. 1. – P. 82-86. 268. McCormack, A. L. Environmental risk factors and Parkinson's disease: selective degeneration of nigral dopaminergic neurons caused by the herbicide paraquat / A. L. McCormack [et al.] // Neurobiol. Dis. – 2002. – Vol. 10. – N. 2. – P. 119-127. 269. McGeer, P. L. The inflammatory response system of brain: implications for therapy of Alzheimer and other neurodegenerative diseases / P. L. McGeer, E. G. McGeer // Brain Res. Rev. – 1995. – Vol. 21. – N. 2. – P. 195-218. 270. McGeer, P. L. Rate of cell death in parkinsonism indicates active neuropathological process / P. L. McGeer [et al.] // Ann. Neurol. – 1988. – Vol. 24. – N. 4. – P. 574-576. 271. McNaught, K. S. P. Altered proteasomal function in sporadic Parkinson's disease / K. S. P. McNaught [et al.] // Exp. Neurol. – 2003. – Vol. 179. – N. 1. – P. 38-46. 272. McRitchie, D. A. Cytoarchitectural distribution of calcium binding proteins in midbrain dopaminergic regions of rats and humans / D. A. McRitchie, C. D. Hardman, G. M. Halliday // J. Comp. Neurol. – 1996. – Vol. 364. – N. 1. – P. 121-150. 273. Meiser, J. Complexity of dopamine metabolism / J. Meiser, D. Weindl, K. Hiller // Cell Commun. Signal. – 2013. – Vol. 11. – N. 1. – P. 34. 274. Miller, R. L. Oxidative and inflammatory pathways in Parkinson’s disease / R. L. Miller [et al.] // Neurochem. Res. – 2009. – Vol. 34. – N. 1. – P. 55-65. 275. Minami, M. Molecular cloning and in situ hybridization histochemistry for rat μ-opioid receptor / M. Minami [et al.] // Neuroscience research. – 1994. – Vol. 18. – N. 4. – P. 315-322. 129 276. Missale, C. Identification and characterization of postsynaptic D1-and D2-dopamine receptors in the cardiovascular system / C. Missale [et al.] // J. Cardiovasc. Pharmacol. – 1988. – Vol. 11. – N. 6. – P. 643-650. 277. Missale, C. Dopamine receptors: from structure to function / C. Missale [et al.] // Physiol. Rev. – 1998. – Vol. 78. – N. 1. – P. 189-225. 278. Mochizuki, H. Histochemical detection of apoptosis in Parkinson's disease / H. Mochizuki [et al.] // J. Neurol. Sci. – 1996. – Vol. 137. – N. 2. – P. 120-123. 279. Mogi, M. Interleukin-1β, interleukin-6, epidermal growth factor and transforming growth factor-α are elevated in the brain from parkinsonian patients / M. Mogi [et al.] // Neurosci. Lett. – 1994. – Vol. 180. – N. 2. – P. 147-150. 280. Moore, P. Cloning and expression of pig kidney dopa decarboxylase: comparison of the naturally occurring and recombinant enzymes / P. Moore, P. Dominici, V. C. Borri // Biochem. J. – 1996. – Vol. 315. – P. 249-256. 281. Morfini, G. 1-Methyl-4-phenylpyridinium affects fast axonal transport by activation of caspase and protein kinase C / G. Morfini [et al.] // PNAS. – 2007. – Vol. 104. – N. 7. – P. 2442-2447. 282. Mortensen, O. V. Dynamic regulation of the dopamine transporter / O. V. Mortensen, S. G. Amara // Eur. J. Pharmacol. – 2003. – Vol. 479. – N. 1. – P. 159-170. 283. Moser, A. Presence of methyl-6, 7-dihydroxy-1, 2, 3, 4-tetrahydroisoquinolines, derivatives of the neurotoxin isoquinoline, in parkinsonian lumbar CSF / A. Moser, D. Kömpf // Life sciences. – 1992. – Vol. 50. – N. 24. – P. 1885-1891. 284. Muthane, U. Differences in nigral neuron number and sensitivity to 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine in C57/bl and CD-1 mice / U. Muthane [et al.] // Exp. Neurol. – 1994. – Vol. 126. – N. 2. – P. 195-204. 285. Nagatsu, T. Change of tyrosine hydroxylase in the parkinsonian brain and in the brain of MPTP-treated mice as revealed by homospecific activity / T. Nagatsu // Neurochem. Res. – 1990. – Vol. 15. – N. 4. – P. 425-429. 286. Nagatsu, T. Progress in monoamine oxidase (MAO) research in relation to genetic engineering / T. Nagatsu // Neurotoxicology. – 2004. – Vol. 25. – N. 1. – P. 11-20. 287. Nagatsu, T. Tyrosine hydroxylase the initial step in norepinephrine biosynthesis / T. Nagatsu, M. Levitt, S. Udenfriend // J. Biol. Chem. – 1964. – Vol. 239. – N. 9. – P. 2910-2917. 288. Nagatsu, T. Inflammatory process in Parkinson's disease: role for cytokines / T. Nagatsu, M. Sawada // Curr. Pharm. Des. – 2005. – Vol. 11. – N. 8. – P. 999-1016. 289. Nakamura, K. C. Afferent islands are larger than μ-opioid receptor patch in striatum of rat pups / K. C. Nakamura [et al.] // Neuroreport. – 2009. – Vol. 20. – N. 6. – P. 584-588. 130 290. Nambu, A. Organization of corticostriatal motor inputs in monkey putamen / A. Nambu [et al.] // J. Neurophysiol. – 2002. – Vol. 88. – N. 4. – P. 1830-1842. 291. Naoi, M. A novel enzyme enantio-selectively synthesizes (R) salsolinol, a precursor of a dopaminergic neurotoxin, N-methyl (R) salsolinol / M. Naoi [et al.] // Neurosci. Lett. – 1996. – Vol. 212. – N. 3. – P. 183-186. 292. Napolitano, A. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission / A. Napolitano, A. M. Cesura, M. Da Prada // J. Neural. Transm. Supplementum. – 1994. – Vol. 45. – P. 35-45. 293. Nasrin, S. Comparison of characteristics of bovine aromatic l-amino acid decarboxylase with human enzyme / S. Nasrin, H. Ichinose, T. Nagatsu // Biochim. Biophys. Acta. – 1992. – Vol. 1118. – N. 3. – P. 318-322. 294. Neff, N. H. Clozapine modulates aromatic L-amino acid decarboxylase activity in mouse striatum / N. H. Neff, H. Ichinose, T. Nagatsu // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2006. – Vol. 317. – N. 2. – P. 480-487. 295. Nelson, E. L. Midbrain dopaminergic neurons in the mouse: computer-assisted mapping / E. L. Nelson [et al.] // J. Comp. Neurol. – 1996. – Vol. 369. – P. 361-371. 296. Nemoto, C. Calretinin and calbindin-D28k in dopaminergic neurons of the rat midbrain: a triple-labeling immunohistochemical study / C. Nemoto, T. Hida, R. Arai // Brain Res. – 1999. – Vol. 846. – N. 1. – P. 129-136. 297. Ng, M. C. The neurotoxin MPTP increases calbindin-D 28k levels in mouse midbrain dopaminergic neurons / M. C. Ng [et al.] // Mol. Brain Res. – 1996. – Vol. 36. – N. 2. – P. 329336. 298. Nirenberg, M. J. Ultrastructural localization of the vesicular monoamine transporter-2 in midbrain dopaminergic neurons: potential sites for somatodendritic storage and release of dopamine / M. J. Nirenberg [et al.] // J. Neurosci. – 1996. – Vol. 16. – N. 13. – P. 4135-4145. 299. Niznik, H. B. Dopamine receptor genes: new tools for molecular psychiatry / H. B. Niznik, H. H. Van Tol // J. Psychiatry Neurosci. – 1992. – Vol. 17. – N. 4. – P. 158-180. 300. Nutt, J. G. Glial cell line-derived neurotrophic factor. Randomized, double-blind trial of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in PD / J. G. Nutt [et al.] // Neurology. – 2003. – Vol. 60. – N. 1. – P. 69-73. 301. Obeso, J. A. The basal ganglia in Parkinson's disease: current concepts and unexplained observations / J. A. Obeso [et al.] // Ann. Neurol. – 2008. – Vol. 64. – N. S2. – P. S30-S46. 302. O'Callaghan, J. P. Defining ―neuroinflammation‖ / J. P. O'Callaghan, K. Sriram, D. B. Miller // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2008. – Vol. 1139. – N. 1. – P. 318-330. 131 303. Oertel, W. H. Immunocytochemical studies of GABAergic neurons in rat basal ganglia and their relations to other neuronal systems / W. H. Oertel, E. Mugnaini // Neurosci. Lett. – 1984. – Vol. 47. – N. 3. – P. 233-238. 304. Ogier-Denis, E. Autophagy: a barrier or an adaptive response to cancer / E. Ogier-Denis, P. Codogno // Biochim. Biophys. Acta. – 2003. – Vol. 1603. – N. 2. – P. 113-128. 305. Olanow, C. W. Ubiquitin–proteasome system and Parkinson's disease / C. W. Olanow, K. S. P. McNaught // Mov. Disord. – 2006. – Vol. 21. – N. 11. – P. 1806-1823. 306. Paisán-Ruíz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease / C. Paisán-Ruíz [et al.] // Neuron. – 2004. – Vol. 44. – N. 4. – P. 595-600. 307. Panneton, W. M. The neurotoxicity of DOPAL: behavioral and stereological evidence for its role in Parkinson disease pathogenesis / W. M. Panneton [et al.] // PLoS One. – 2010. – Vol. 5. – N. 5. – e15251. 308. Paquet, M. AMPA and NMDA Glutamate Receptor Subunits in Midbrain Dopaminergic Neurons in the Squirrel Monkey: An Immunohistochemical andIn Situ Hybridization Study / M. Paquet [et al.] // J. Neurosci. – 1997. – Vol. 17. – N. 4. – P. 1377-1396. 309. Paris, I. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis / I. Paris [et al.] // Neurotox. Res. – 2009. – Vol. 16. – N. 3. – P. 271-279. 310. Patel, N. K. Intraputamenal infusion of glial cell line–derived neurotrophic factor in PD: A two‐year outcome study / N. K. Patel [et al.] // Ann. Neurol. – 2005. – Vol. 57. – N. 2. – P. 298-302. 311. Paul, J. Dopamine D 1 and D 2 receptor subtypes functional regulation in cerebral cortex of unilateral rotenone lesioned Parkinson’s rat model: Effect of serotonin, dopamine and norepinephrine / J. Paul [et al.] // Parkinsonism Rel. Disord. – 2011. – Vol. 17. – N. 4. – P. 255259. 312. Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates / G. Paxinos, K. B. J. Franklin // Academic Press, San Diego, 2001. – 350 P. 313. Pearce, R. K. B. Alterations in the distribution of glutathione in the substantia nigra in Parkinson's disease / R. K. B. Pearce [et al.] // J. Neural. Transm. – 1997. – Vol. 104. – N. 6-7. – P. 661-677. 314. Perier, C. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms / C. Perier [et al.] // Brain. – 2013. – Vol. 136. – N. 8. – P. 23692378. 315. Perry, T. L. Idiopathic Parkinson's disease, progressive supranuclear palsy and glutathione metabolism in the substantia nigra of patients / T. L. Perry, V. W. Yong // Neurosci. Lett. – 1986. – Vol. 67. – N. 3. – P. 269-274. 132 316. Petroske, E. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment / E. Petroske [et al.] // Neuroscience. – 2001. – Vol. 106. – N. 3. – P. 589-601. 317. Nirenberg, M. J. The dopamine transporter is localized to dendritic and axonal plasma membranes of nigrostriatal dopaminergic neurons / M. J. Nirenberg [et al.] // J. Neurosci. – 1996. – Vol. 76. – N. 2. – P. 436-447. 318. Pickrell, A. M. Striatal dysfunctions associated with mitochondrial DNA damage in dopaminergic neurons in a mouse model of Parkinson's disease / A. M. Pickrell [et al.] // J. Neurosci. – 2011. – Vol. 31. – N. 48. – P. 17649-17658. 319. Pierot, L. D1 and D2-type dopamine receptors in patients with Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy / L. Pierot [et al.] // J. Neurol. Sci. – 1988. – Vol. 86. – N. 2. – P. 291-306. 320. Pifl, C. Dopamine turnover is upregulated in the caudate/putamen of asymptomatic MPTPtreated rhesus monkeys / C. Pifl, O. Hornykiewicz // Neurochem. Int. – 2006. – Vol. 49. – P. 519-524. 321. Polymeropoulos, M. H. Mapping of a gene for Parkinson's disease to chromosome 4q21-q23 / M. H. Polymeropoulos [et al.] // Science. – 1996. – Vol. 274. – N. 5290. – P. 1197-1199. 322. Polymeropoulos, M. H. Mutation in the α-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease / M. H. Polymeopoulos [et al.] // Science. – 1997. – Vol. 276. – N. 5321. – P. 20452047. 323. Prakash, N. Genetic networks controlling the development of midbrain dopaminergic neurons / N. Prakash, W. Wurst // J. Physiol. – 2006. – Vol. 575. – N. 2. – P. 403-410. 324. Przedborski, S. Reactive oxygen and nitrogen species: weapons of neuronal destruction in models of Parkinson's disease / S. Przedborski, H. Ischiropoulos // Antioxid. Redox Signal. – 2005. – Vol. 7. – N. 5-6. – P. 685-693. 325. Przedborski, S. The parkinsonian toxin MPTP: action and mechanism / S. Przedborski [et al.] // Restor. Neurol. Neurosci. – 1999. – Vol. 16. – N. 2. – P. 135-142. 326. Qin, L. Systemic LPS causes chronic neuroinflammation and progressive neurodegeneration / L. Qin [et al.] // Glia. – 2007. – Vol. 55. – N. 5. – P. 453-462. 327. Rahman, M. K. Effect of pyridoxal phosphate deficiency on aromatic L-amino acid decarboxylase activity with L-DOPA and L-5-hydroxytryptophan as substrates in rats / M. K. Rahman [et al.] // Jpn. J. Pharmacol. – 1982. – Vol. 32. – N. 5. – P. 803-811. 328. Ramsey, A. J. Effects of phosphorylation of serine 40 of tyrosine hydroxylase on binding of catecholamines: evidence for a novel regulatory mechanism / A. J. Ramsey, P. F. Fitzpatrick // Biochemistry. – 1998. – Vol. 37. – N. 25. – P. 8980-8986. 133 329. Recchia, A. α-Synuclein and Parkinson’s disease / A. Recchia [et al.] // FASEB J. – 2004. – Vol. 18. – N. 6. – P. 617-626. 330. Rees, J. N. Protein reactivity of 3, 4-dihydroxyphenylacetaldehyde, a toxic dopamine metabolite, is dependent on both the aldehyde and the catechol / J. N. Rees [et al.] // Chem. Res. Toxicol. – 2009. – Vol. 22. – N. 7. – P. 1256-1263. 331. Ricaurte, G. A. Fate of nigrostriatal neurons in young mature mice given 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine: a neurochemical and morphological reassessment / G. A. Ricaurte [et al.] // Brain Res. – 1986. – Vol. 376. – N. 1. – P. 117-124. 332. Richfield, E. K. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human αsynuclein in transgenic mice / E. K. Richfield [et al.] // Exp. Neurol. – 2002. – Vol. 175. – N. 1. – P. 35-48. 333. Rinne, J. O. Dopamine D-1 receptors in the parkinsonian brain / J. O. Rinne [et al.] // Brain Res. – 1985. – Vol. 359. – P. 306-310. 334. Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools / S. O. Rizzoli, W. J. Betz // Nat. Rev. Neurosci. – 2005. – Vol. 6. – N. 1. – P. 57-69. 335. Rizzoli, S. O. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles / S. O. Rizzoli, W. J. Betz // Science. – 2004. – Vol. 303. – N. 5666. – P. 2037-2039. 336. Rockenstein, E. Differential neuropathological alterations in transgenic mice expressing α‐ synuclein from the platelet‐derived growth factor and Thy‐1 promoters / E. Rockenstein [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2002. – Vol. 68. – N. 5. – P. 568-578. 337. Rondou, P. The dopamine D4 receptor: biochemical and signalling properties / P. Rondou, G. Haegeman, K. Van Craenenbroeck // Cell. Mol. Life Sci. – 2010. – Vol. 67. – N. 12. – P. 19711986. 338. Rosenblad, C. Sequential administration of GDNF into the substantia nigra and striatum promotes dopamine neuron survival and axonal sprouting but not striatal reinnervation or functional recovery in the partial 6-OHDA lesion model / C. Rosenblad, D. Kirik, A. Björklund // Exp. Neurol. – 2000. – Vol. 161. – N. 2. – P. 503-516. 339. Rousseaux, M. W. Progressive dopaminergic cell loss with unilateral-to-bilateral progression in a genetic model of Parkinson disease / M. W. Rousseaux [et al.] // PNAS. – 2012. – Vol. 109. – N. 39. – P. 15918-15923. 340. Rowland, N. Effects of dopamine-depleting brain lesions on experimental hyperphagia in rats / N. Rowland, E. M. Stricker // Physiol. Behav. – 1982. – Vol. 28. – N. 2. – P. 271-277. 341. Saint‐Pierre, M. Temporal effects of paraquat/maneb on microglial activation and dopamine neuronal loss in older rats / M. Saint-Pierre [et al.] // J. Neurochem. – 2006. – Vol. 98. – N. 3. – P. 760-772. 134 342. Sakai, K. Effect of bilateral 6-OHDA lesions of the substantia nigra on locomotor activity in the rat / K. Sakai, D. M. Gash // Brain Res. – 1994. – Vol. 633. – N. 1. – P. 144-150. 343. Samantaray, S. The parkinsonian neurotoxin rotenone activates calpain and caspase-3 leading to motoneuron degeneration in spinal cord of Lewis rats / S. Samantaray [et al.] // Neuroscience. – 2007. – Vol. 146. – N. 2. – P. 741-755. 344. Sanders, L. H. Mitochondrial DNA damage: molecular marker of vulnerable nigral neurons in Parkinson's disease / L. H. Sanders [et al.] // Neurobiol. Dis. – 2014. – Vol. 70. – P. 214-223. 345. Sandmeier, E. Multiple evolutionary origin of pyridoxal‐5′‐phosphate‐dependent amino acid decarboxylases / E. Sandmeier, T. I. Hale, P. Christen // Eur. J. Biochem. – 1994. – Vol. 221. – N. 3. – P. 997-1002. 346. Sanghera, M. K. Low dopamine transporter mRNA levels in midbrain regions containing calbindin / M. K. Sanghera [et al.] // Neuroreport. – 1994. – Vol. 5. – N. 13. – P. 1641-1644. 347. Saporito, M. S. MPTP Activates c‐Jun NH2‐Terminal Kinase (JNK) and Its Upstream Regulatory Kinase MKK4 in Nigrostriatal Neurons In Vivo / M. S. Saporito, B. A. Thomas, R. W. Scott // J. Neurochem. – 2000. – Vol. 75. – N. 3. – P. 1200-1208. 348. Saravanan, K. S. L-deprenyl protects against rotenone-induced, oxidative stress-mediated dopaminergic neurodegeneration in rats / K. S. Saravanan [et al.] // Neurochem. Int. – 2006. – Vol. 49. – N. 1. – P. 28-40. 349. Sauer, H. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat / H. Sauer, W. H. Oertel // Neuroscience. – 1994. – Vol. 59. – N. 2. – P. 401-415. 350. Schapira, A. H. V. Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson's disease / A. H. V. Schapira [et al.] // J. Neurochem. – 1990. –Vol. 54. – N. 3. – P. 823-827. 351. Schneider, J. S. Chronic exposure to low doses of MPTP. II. Neurochemical and pathological consequences in cognitively-impaired, motor asymptomatic monkeys / J. S. Schneider // Brain Res. – 1990. – Vol. 534. – N. 1. – P. 25-36. 352. Schneider, J. S. Astrocytic responses to the dopaminergic neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP) in cat and mouse brain / J. S. Schneider, F. J. Denaro // J. Neuropathol. Exp. Neurol. – 1988. – Vol. 47. – N. 4. – P. 452-458. 353. Schneider, J. S. Chronic exposure to low doses of MPTP. I. Cognitive deficits in motor asymptomatic monkeys / J. S. Schneider, C. J. Kovelowski // Brain Res. – 1990. – Vol. 519. – N. 1. – P. 122-128. 135 354. Schneider, J. S. Cognitive deficits precede motor deficits in a slowly progressing model of parkinsonism in the monkey / J. S. Schneider, A. Pope-Coleman // Neurodegeneration. – 1995. – Vol. 4. – N. 3. – P. 245-255. 355. Schneider, J. S. Effects of the nicotinic acetylcholine receptor agonist SIB‐1508Y on object retrieval performance in MPTP‐Treated monkeys: Comparison with levodopa treatment / J. S. Schneider [et al.] // Ann. Neurol. – 1998. – Vol. 43. – N. 3. – P. 311-317. 356. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP / A. Schober // Cell Tissue Res. – 2004. – Vol. 318. – N. 1. – P. 215-224. 357. Schuler, F. Functional coupling of PSST and ND1 subunits in NADH: ubiquinone oxidoreductase established by photoaffinity labeling / F. Schuler, J. E. Casida // Biochim. Biophys. Acta. – 2001. – Vol. 1506. – N. 1. – P. 79-87. 358. Schultz, W. The catecholamine uptake blocker nomifensine protects against MPTP-induced parkinsonism in monkeys / W. Schultz [et al.] // Exp. Brain Res. – 1986. – Vol. 63. – N. 1. – P. 216-220. 359. Sedelis, M. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease / M. Sedelis, R. K. W. Schwarting, J. P. Huston // Behav. Brain Res. – 2001. – Vol. 125. – N. 1. – P. 109-125. 360. Shang, T. Death-associated Protein Kinase as a Sensor of Mitochondrial Membrane Potential role of lysosome in mitochondrial toxin-induced cell death / T. Shang [et al.] // J. Biol. Chem. – 2005. – Vol. 280. – N. 41. – P. 34644-34653. 361. Sherer, T. B. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease / T.B. Sherer [et al.] // J. Neurosci. – 2003. – Vol. 23. – N. 34. – P. 10756-10764. 362. Shimizu, K. Paraquat leads to dopaminergic neural vulnerability in organotypic midbrain culture / K. Shimizu [et al.] // Neurosci. Res. – 2003. – Vol. 46. – N. 4. – P. 523-532. 363. Shults, C. W. α-Synuclein from platelets is not phosphorylated at serine 129 in Parkinson's disease and multiple system atrophy / C. W. Shults, J. M. Barrett, D. Fontaine // Neurosci. Lett. – 2006. – Vol. 405. – N. 3. – P. 223-225. 364. Sian, J. Glutathione‐related enzymes in brain in Parkinson's disease / J. Sian [et al.] // Ann. Neurol. – 1994. – Vol. 36. – N. 3. – P. 356-361. 365. Sibley, D. R. Molecular biology of dopamine receptors / D. R. Sibley, F. J. Monsma // Trends Pharmacol. Sci. – 1992. – Vol. 13. – P. 61-69. 366. Singleton, A. B. α-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease / A. B. Singleton [et al.] // Science. – 2003. – Vol. 302. – N. 5646. – P. 841-841. 136 367. Siow, Y. L. Effect of pyridoxine deficiency on aromatic L-amino acid decarboxylase in adult rat brain / Y. L. Siow, K. Dakshinamurti // Exp. Brain Res. – 1985. – Vol. 59. – N. 3. – P. 575581. 368. Smeyne, R. J. The MPTP model of Parkinson's disease / R. J. Smeyne, V. Jackson-Lewis // Mol. Brain Res. – 2005. – Vol. 134. – N. 1. – P. 57-66. 369. Smith, P. K. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid / P. K. Smith [et al.] // Anal. Biochem. – 1985. – Vol. 150. P. 76-85. 370. Smith, A. D. Effect of 6-hydroxydopamine on striatal GDNF and nigral GFRα1 and RET mRNAs in the adult rat / A. D. Smith [et al.] // Mol. Brain Res. – 2003. – Vol. 117. – N. 2. – P. 129-138. 371. Snow, B. J. Pattern of dopaminergic loss in the striatum of humans with MPTP induced parkinsonism / B. J. Snow [et al.] // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. – 2000. – Vol. 68. – N. 3. – P. 313-316. 372. Snyder, G. L. Dopamine efflux from striatal slices after intracerebral 6-hydroxydopamine: evidence for compensatory hyperactivity of residual terminals / G.L. Snyder, R. W. Keller, M. J. Zigmond // J. Pharmacol. Exp .Ther. – 1990. – Vol. 253. – P. 867-876. 373. Sofic, E. Reduced and oxidized glutathione in the substantia nigra of patients with Parkinson's disease // E. Sofic [et al.] // Neurosci. Lett. – 1992. – Vol. 142. – N. 2. – P. 128-130. 374. Sofic, E. Increased iron (III) and total iron content in post mortem substantia nigra of parkinsonian brain / E. Sofic [et al.] // J. Neural. Transm. – 1988. – Vol. 74. – N. 3. – P. 199205. 375. Sokoloff, P. The dopamine D3 receptor: a therapeutic target for the treatment of neuropsychiatric disorders / P. Sokoloff [et al.] // CNS Neurol. Disord. Drug Targets. – 2006. – Vol. 5. – N. 1. – P. 25-43. 376. Sorkina, T. Oligomerization of dopamine transporters visualized in living cells by fluorescence resonance energy transfer microscopy / T. Sorkina [et al.] // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278. – N. 30. – P. 28274-28283. 377. Stott, S. R. W. Time course of dopamine neuron loss and glial response in the 6‐OHDA striatal mouse model of Parkinson's disease / S. R. W. Stott, R. A. Barker // Eur. J. Neurosci. – 2014. – Vol. 39. – N. 6. – P. 1042-1056. 378. Strecker, R. E. Autoregulation of dopamine release and metabolism by intrastriatal nigral grafts as revealed by intracerebral dialysis / R. E. Strecker [et al.] // Neuroscience. – 1987. – Vol. 22. – N. 1. – P. 169-178. 137 379. Sullivan, A. M. Growth differentiation factor 5 and glial cell line‐derived neurotrophic factor enhance survival and function of dopaminergic grafts in a rat model of Parkinson's disease / A. M. Sullivan, J. Pohl, S. B. Blunt // Eur. J. Neurosci. – 1998. – Vol. 10. – N. 12. – P. 3681-3688. 380. Sundström, E. Chronic neurochemical and behavioral changes in MPTP-lesioned C57BL/6 mice: a model for Parkinson's disease / E. Sundström, A. Fredriksson, T. Archer // Brain Res. – 1990. – Vol. 528. – N. 2. – P. 181-188. 381. Sundström, E. Time course of MPTP-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine system in C57 BL/6 mice / E. Sundström [et al.] // Brain Res. Bull. – 1988. – Vol. 21. – N. 2. – P. 257-263. 382. Sutherland, C. Phosphorylation and activation of human tyrosine hydroxylase in vitro by mitogen‐activated protein (MAP) kinase and MAP‐kinase‐activated kinases 1 and 2 / C. Sutherland [et al.] // Eur. J. Biochem. – 1993. – Vol. 217. – N. 2. – P. 715-722. 383. Tansey, M. G. Neuroinflammatory mechanisms in Parkinson's disease: potential environmental triggers, pathways, and targets for early therapeutic intervention / M. G. Tansey, M. K. McCoy, T. C. Frank-Cannon // Exp. Neurol. – 2007. – Vol. 208. – N. 1. – P. 1-25. 384. Tenhunen, J. Structure of the rat catechol-O-methyltransferase gene: separate promoters are used to produce mRNAs for soluble and membrane-bound forms of the enzyme / J. Tenhunen [et al.] // DNA Cell Biol. – 1993. – Vol. 12. – N. 3. – P. 253-263. 385. Thiruchelvam, M. J. Risk factors for dopaminergic neuron loss in human α‐synuclein transgenic mice / M. J. Thiruchelvam [et al.] // Eur. J. Neurosci. – 2004. – Vol. 19. – N. 4. – P. 845-854. 386. Thiruchelvam, M. The nigrostriatal dopaminergic system as a preferential target of repeated exposures to combined paraquat and maneb: implications for Parkinson's disease / M. Thiruchelvam [et al.] // J. Neurosci. – 2000. – Vol. 20. – N. 24. – . 9207-9214. 387. Tillerson, J. L. Detection of behavioral impairments correlated to neurochemical deficits in mice treated with moderate doses of 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine / M. Thiruchelvam [et al.] // Exp. Neurol. – 2002. – Vol. 178. – N. 1. – P. 80-90. 388. Tofaris, G. K. Ubiquitination of α-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function / G. K. Tofaris [et al.] // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278. – N. 45. – P. 44405-44411. 389. Tomac, A. Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo / A. Tomac [et al.] // J. Nature. – 1995. – Vol. 373. – P. 335-339. 390. Tompkins, M. M. Apoptotic-like changes in Lewy-body-associated disorders and normal aging in substantia nigral neurons / M. M. Tompkins [et al.] // Am. J. Pathol. – 1997. – Vol. 150. – N. 1. – P. 119. 138 391. Torres, G. E. Oligomerization and trafficking of the human dopamine transporter mutational analysis identifies critical domains important for the functional expression of the transporter / G. E. Torres [et al.] // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278. – N. 4. – P. 2731-2739. 392. Trexler, A. J. N‐terminal acetylation is critical for forming α‐helical oligomer of α‐synuclein / A. J. Trexler, E. Rhoades // Prot. Sci. – 2012. – Vol. 21. – N. 5. – P. 601-605. 393. Tsuboi, K. Calretinin-containing axons and neurons are resistant to an intrastriatal 6hydroxydopamine lesion / K. Tsuboi, T. A. Kimber, C. W. Shults // Brain Res. – 2000. – Vol. 866. – N. 1. – P. 55-64. 394. Turmel, H. Caspase‐3 activation in 1‐methyl‐4‐phenyl‐1, 2, 3, 6‐tetrahydropyridine (MPTP)‐ treated mice / H. Turmel [et al.] // Mov. Disord. – 2001. – Vol. 16. – N. 2. – P. 185-189. 395. Ugrumov, M. V. Brain neurons partly expressing dopaminergic phenotype: location, development, functional significance, and regulation / M. V. Ugrumov // Adv. Pharmacol. – 2013. – Vol. 68. – P. 37-91. 396. Ugrumov, M. V. Modeling of presymptomatic and symptomatic stages of parkinsonism in mice / M. V. Ugrumov [et al.] // Neuroscience. – 2011. – Vol. 181. – P. 175-188. 397. Ugrumov, M. Neurons expressing individual enzymes of dopamine synthesis in the mediobasal hypothalamus of adult rats: Functional significance and topographic interrelations / M. Ugrumov [et al.] // Neuroscience. – 2014. – Vol. 277. – P. 45-54. 398. Ungerstedt, U. Postsynaptic supersensitivity after 6‐hydroxy‐dopamine induced degeneration of the nigro‐striatal dopamine system / U. Ungerstedt // Acta Physiol. Scand. – 1971. – Vol. 82. – N. S367. – P. 69-93. 399. Zigmond, M. J. Recovery of feeding and drinking by rats after intraventricular 6hydroxydopamine or lateral hypothalamic lesions / M. J. Zigmond, E. M. Stricker // Science. – 1973. – Vol. 182. – N. 4113. – P. 717-720. 400. Ungerstedt, U. Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6-hydroxy-dopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system / U. Ungerstedt, G. W. Arbuthnott // Brain Res. – 1970. – Vol. 24. – N. 3. – P. 485-493. 401. Slevin, J. T. Unilateral intraputamenal glial cell line-derived neurotrophic factor in patients with Parkinson disease: response to 1 year of treatment and 1 year of withdrawal / J.T. Slevin [et al.] // J. Neurosurg. – 2007. – Vol. 106. – N. 4. – P. 614-620. 402. Vallone, D. Activity, non-selective attention and emotionality in dopamine D2/D3 receptor knock-out mice / D. Vallone [et al.] // Behav. Brain Res. – 2002. – Vol. 130. – N. 1. – P. 141148. 139 403. Van Cruchten, S. Morphological and biochemical aspects of apoptosis, oncosis and necrosis / S. Van Cruchten, W. Van Den Broeck // Anat. Histol. Embryol. – 2002. – Vol. 31. – N. 4. – P. 214-223. 404. Van Der Kooy, D. The organization of the efferent projections and striatal afferents of the entopeduncular nucleus and adjacent areas in the rat / D. Van Der Kooy, D. A. Carter // Brain Res. – 1981. – Vol. 211. – N. 1. – P. 15-36. 405. Verbeek, M. M. Aromatic L-amino acid decarboxylase enzyme activity in deficient patients and heterozygotes / M. M. Verbeek [et al.] // Mol. Genet. Metab. – 2007. – Vol. 90. – N. 4. – P. 363-369. 406. Vila, M. α‐Synuclein Up‐Regulation in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons Following Administration of the Parkinsonian Toxin MPTP / M. Vila [et al.] // J. Neurochem. – 2000. – Vol. 74. – N. 2. – P. 721-729. 407. Westlund, K. N. Localization of distinct monoamine oxidase A and monoamine oxidase B cell populations in human brainstem / K. N.Westlund [et al.] // Neuroscience. – 1988. – Vol. 25. – N. 2. – P. 439-456. 408. Westphal, C. H. Monomeric synucleins generate membrane curvature / C. H. Westphal, S. S. Chandra // J. Biol. Chem. – 2013. – Vol. 288. – N. 3. – P. 1829-1840. 409. Wirdefeldt, K. Epidemiology and etiology of Parkinson’s disease: a review of the evidence / K. Wirdefeldt [et al.] // Eur. J. Epidemiol. – 2011. – Vol. 26. – N. 1. – P. 1-58. 410. Wu, DC. cell response: A pathogenic factor in Parkinson's disease / D. C. Wu [et al.] // J. Neurovirol. – 2002. – Vol. 8. – N. 6. – P. 551-558. 411. Yamada, T. Relative sparing in Parkinson's disease of substantia nigra dopamine neurons containing calbindin-D 28K / T. Yamada [et al.] // Brain Res. – 1990. – Vol. 526. – N. 2. – P. 303-307. 412. Yang, L. Minocycline enhances MPTP toxicity to dopaminergic neurons / L Yang [et al.] // J. Neurosci. Res. – 2003. – Vol. 74. – N. 2. – P. 278-285. 413. Yavich, L. Two simultaneously working storage pools of dopamine in mouse caudate and nucleus accumbens / L. Yavich // Br. J. Pharmacol. – 1996. – Vol. 119. – N. 5. – P. 869-876. 414. Yokota, T. Down regulation of DJ-1 enhances cell death by oxidative stress, ER stress, and proteasome inhibition / T. Yokota [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2003. – Vol. 312. – N. 4. – P. 1342-1348. 415. Yoritaka, A. Immunohistochemical detection of 4-hydroxynonenal protein adducts in Parkinson disease / A. Yoritaka [et al.] // PNAS. – 1996. – Vol. 93. – N. 7. – P. 2696-2701. 416. Yoshida, M. The GABAergic systems and the role of basal ganglia in motor control / M. Yoshida // Adv. Biochem. Psychopharmacol. – 1981. – Vol. 30. – P. 37. 140 417. Youdim, M. B. H. The possible role of iron in the etiopathology of Parkinson's disease / M. B. H. Yodim, D. Ben‐Shachar, P. Riederer P. // Mov. Disord. – 1993. – Vol. 8. – N. 1. – P. 1-12. 418. Zahniser, N. R. Chronic and acute regulation of Na+/Cl–-dependent neurotransmitter transporters: drugs, substrates, presynaptic receptors, and signaling systems / N. R. Zahniser, S. Doolen // Pharmacol. Ther. – 2001. – Vol. 92. – N. 1. – P. 21-55. 419. Zahniser, N. R. Rapid regulation of the dopamine transporter: role in stimulant addiction? / N. R. Zahniser, A. Sorkin // Neuropharmacol. – 2004. – Vol. 47. – P. 80-91. 420. Zecca, L. The neuromelanin of human substantia nigra and its interaction with metals / L. Zecca [et al.] // J. Neural. Transm. – 2002. – Vol. 109. – N. 5-6. – P. 663-672. 421. Zecca, L. New melanic pigments in the human brain that accumulate in aging and block environmental toxic metals / L. Zecca [et al.] // PNAS. – 2008. – Vol. 105. – N. 45. – P. 1756717572. 422. Zhu, C. Variable effects of chronic subcutaneous administration of rotenone on striatal histology / C. Zhu [et al.] // J. Comp. Neurol. – 2004. – Vol. 478. – N. 4. – P. 418-426. 423. Zhu, M. Y. Regulation of Aromatic l‐Amino Acid Decarboxylase by Dopamine Receptors in the Rat Brain / M. Y. Zhu [et al.] // J. Neurochem. – 1992. – Vol. 58. – N. 2. – P. 636-641. 424. Zigmond, M. J. Do compensatory processes underlie the preclinical phase of neurodegenerative disease? Insights from an animal model of parkinsonism / M. J. Zigmond //Neurobiol. Dis. – 1997. – Vol. 4. – N. 3. – P. 247-253. 425. Zigmond, M. J. Animal models of parkinsonism using selective neurotoxins: clinical and basic implications / M. J. Zigmond, E. M. Stricker // Int. Rev. Neurobiol. – 1989. – Vol. 31. – N. 1. – P. 1-79. 426. Zigmond, R. E. Acute regulation of tyrosine hydroxylase by nerve activity and by neurotransmitters via phosphorylation / R. E. Zigmond, M. A. Schwarzschild, A. R. Rittenhouse // Annu. Rev. Neurosci. – 1989. – Vol. 12. – P. 415-461. 427. Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology / A. Zimprich [et al.] // Neuron. – 2004. – Vol. 44. – N. 4. – P. 601-607. 428. Zuch, C. L. Time course of degenerative alterations in nigral dopaminergic neurons following a 6‐hydroxydopamine lesion / C. L. Zuch [et al.] // J. Comp. Neurol. – 2000. – Vol. 427. – N. 3. – P. 440-454.
