оценка адаптогенного потенциала пробиотических штаммов
advertisement
Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ Направление:06.03.01 (ОКСО 020400.62) – биология ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Бакалаврская работа ОЦЕНКА АДАПТОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ Работа завершена: "___"_________ 2015 г. ____________________ (А.В. Кириллова) Работа допущена к защите: Научный руководитель доцент, к.б.н. "___"_________ 2015 г. ____________________ (Д.Р. Яруллина) Заведующий кафедрой д.б.н., профессор "___"_________ 2015 г. ____________________ (О.Н. Ильинская) Казань-2015 СОДЕРЖАНИЕ стр. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4 ВВЕДЕНИЕ 5 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7 1.1 Влияние тяжелых металлов на организм человека 7 1.2 Значение тяжелых металлов для бактериальной клетки 10 1.3 Лактобациллы и тяжелые металлы 14 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 19 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 19 2.1 Тяжелые металлы 19 2.2 Объекты исследования и условия культивирования 19 2.3 Образование биопленок бактериями рода Lactobacillus в 20 присутствии Cd (II) и Pb (II) 2.4 Анализ гидрофобности бактериальной поверхности 21 2.5 Определение электрон-донорных/акцепторных свойств бактериальной поверхности 21 2.6 Измерение дзета-потенциала клеточной поверхности лактобацилл 22 2.7 Атомно-абсорбционная спектрометрия (ААС) 22 2.8 Статистическая обработка результатов 24 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 25 3.1 Оценка токсичности тяжелых металлов для лактобацилл 25 3.2 Характеристика физико-химических свойств поверхности 30 лактобацилл 3.3 Влияние кадмия и свинца на способность лактобацилл образовывать биопленки 2 34 3.4 Оценка способности лактобацилл связывать тяжелые 37 металлы ВЫВОДЫ 41 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 42 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ААС – атомно-абсорбционная спектрометрия ДЗА – двухстадийная зондовая атомизация ДНК – дезоксирибонуклеииновая кислота НАДФН – никотинамидадениндинуклеотидфосфат ОП – оптическая плотность ЭТААС – электротермическая атомно-абсорбционная спектрометрия ATSDR – Agency for Toxic Substances and Disease Registry IARC – International Agency for Research on Cancer MATS – Microbial Adhesion to Solvents method МRS – питательная среда De Man-Rogosa-Sharpe для культивирования лактобацилл R – коэффициент достоверности аппроксимации USEPA – US Environmental Protection Agency 4 ВВЕДЕНИЕ Увеличение антропогенной нагрузки на окружающую природную среду приводит к обострению экологической ситуации и изменению качества среды обитания человека. В связи с промышленной революцией использование тяжелых металлов резко возросло [Sharma, 2006].Методы, используемые для удаления тяжелых металлов из сточных вод очень эффективны, но требуют дорогих адсорбентов. Разрабатываются экологически чистые технологии, известные как «биосорбция» [Liu et al., 2014]. Многие тяжелые металлы относятся к наиболее широко распространенным поллютантам воды и пищи. Попадая с ними в организм животного или человека, они образуют комплексы и аккумулируются в тканях [Vinodhini et al., 2008].Накопление тяжелых металлов в течение долгого времени в органах может привести к развитию целого ряда серьезных заболеваний [Singh et al., 2011]. Важной человека составляющей являются бактерии естественной рода микробиоты Lactobacillus, кишечника которые массово используются в нормализующих микрофлору препаратах – пробиотиках [Giraffa et al., 2010]. С помощью пробиотиков увеличивается толерантность организма к антропогенной нагрузке. В последние несколько лет резко вырос интерес к молочнокислым микроорганизмам, способным связывать тяжелые металлы, как к альтернативе физическим и химическим методам детоксикации тяжелых металлов. В этой связи фундаментальной проблемой является поиск новых штаммов лактобацилл с высокой способностью связывать ионы тяжелых металлов, использование которых в пробиотикотерапии существенно расширит возможности традиционных средств борьбы с дисбактериозом. Целью настоящей работы является отбор штаммов лактобацилл, способных эффективно связывать тяжелые металлы кадмий и свинец. В соответствии с поставленной целью в работе решаются 5 следующие задачи: 1) Оценка токсичности кадмия и свинца по отношению к лактобациллам. 2) Характеристика физико-химических свойств поверхности клеток лактобацилл: гидрофобности, кислотно-основных свойств Льюиса и электрического заряда. 3) Выявление влияния кадмия и свинца на способность лактобацилл образовывать биопленки. 4) Оценка способности лактобацилл связывать тяжелые металлы с помощью метода атомно-абсорбционной спектрометрии. 6 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Влияние тяжелых металлов на организм человека Недавнее расширение производственной деятельности человека, в том числе горнодобывающей промышленности и металлургии, а также создание синтетических соединений привело к экспоненциальному росту размеров выбрасываемых в атмосферу, воду и почву тяжелых металлов [McConnell et al., 2008]. Термин тяжелые металлы, характеризующий широкую группу загрязняющих веществ, получил в последнее время значительное распространение. В качестве критериев принадлежности используются многочисленные характеристики: атомная масса, плотность, токсичность, распространенность в природной среде, степень вовлеченности в природные и техногенные циклы. Тяжелые металлы – это элементы, имеющие плотность более 5 г/см3 [Järup, 2003]. В некоторых случаях под определение тяжелых металлов попадают элементы, относящиеся к хрупким (например, висмут) или металлоидам (например, мышьяк). На сегодняшний день к тяжелым металлам относят более 40 металлов периодической системы Д.И. Менделеева с атомной массой свыше 50 атомных единиц: свинец (Pb), кадмий (Cd), ртуть (Hg), мышьяк (As), хром (Cr), медь (Cu), селен (Se), никель (Ni), серебро (Ag) и цинк (Zn). Другие, менее распространенные металлоиды включают алюминий (Al), цезий (Cs), кобальт (Со), марганец (Mn), молибден (Мо), стронций (Sr) и уран (U). При этом немаловажную роль в категорировании тяжелых металлов играют следующие условия: их высокая токсичность для живых организмов в относительно низких концентрациях, а также способность к биоаккумуляции [Теплая, 2013]. Тяжелые металлы относятся к наиболее широко распространенным поллютантам водной и почвенной среды. Однажды попав в биогеохимический цикл, они крайне редко и медленно покидают его. Тяжелые металлы, как правило, образуют соединения, которые очень токсичны, канцерогенны и не поддаются биохимическому 7 разложению даже при низких концентрациях. Загрязнения воды имеет большое значение для жизни человека, так как вода является первой жизненной потребностью. Производство и использование тяжелых металлов резко возросло в связи с промышленной революцией [Sharma, 2006]. Методы, используемые для удаления тяжелых металлов из сточных вод, включают осаждение, коагуляцию, восстановление, мембранные процессы, ионный обмен, восстановление и испарительная адсорбция. Ионообменные и адсорбционные процессы очень эффективны, но требуют дорогих адсорбентов [Liu et al., 2014]. Живым организмам необходимы тяжелые металлы в различных концентрациях. Железо, кобальт, медь, марганец, молибден, цинк являются обязательными для человека. Все металлы являются токсичными при более высоких концентрациях. Другие тяжелые металлы, такие как ртуть, плутоний и свинец являются токсичными и не оказывают важное или благоприятное воздействие на организмы, а их накопление в течение долгого времени в органах может вызвать серьезные заболевания [Singh et al., 2011]. Так, воздействие на организм тяжелых металлов может привести к повреждению почек [Satarug et al., 2004], остеопорозу [Staessen et al., 1999; Järup et al., 2004], раку почек [Waalkes et al., 1999], нарушению синтеза гемоглобина. Загрязнение тяжелыми металлами – серьезная проблема не только с точки зрения здоровья человека, но и с более широкой экологической точки зрения из-за их биодеградации, опасных и токсичных свойств. Опасные тяжелые металлы, такие как кадмий и свинец, входят в десятку токсичных металлов в перечне приоритетных опасных веществ (ATSDR, 2007) из-за сильного биологического воздействия путем биоаккумуляции и биомагнификации [Bhakta et al., 2012]. Природные, а также антропогенные источники кадмия, в том числе промышленные выбросы и применение удобрений и сточных вод на сельскохозяйственных землях, может привести к загрязнению почв и к 8 увеличению поглощения кадмия культурами и овощами, выращенными для потребления человеком. Известно, что процесс поглощения кадмия из почвы растениями усиливается при низком рН [Jarup et al., 1998]. Кадмий не участвует в процессах метаболизма и ядовит для растений, животных и человека [Gupta et al., 1998]. Он признан канцерогеном для человека (IARC, 1994). Вдыхание паров кадмия или его частиц может быть опасным для жизни, и, хотя острые легочные последствия и смерть редки, отдельные случаи заболевания известны [Barbee, 1999]. Воздействие на человека низкого уровня Cd может привести к почечной болезни, остеомаляции и раку легких, а также к повреждению сердечнососудистой системы, печени и репродуктивной системы (USEPA, 1992) [Hrudey et al., 1995; Belimov et al., 2005]. Свинец также рассматривается как поллютант окружающей среды, который несет ответственность за причинение различных расстройств, повреждений центральной и периферической нервной системы, ухудшение памяти и уменьшение интеллектуальных способностей детей [Bhakta et al., 2012]. Свинец способен связываться с эритроцитами крови и откладываться в костях скелета, а удаление его из организма идет очень медленно. Период полураспада свинца в крови составляет около 1 месяца, в скелете - 20-30 лет. Даже низкая концентрация свинца в крови связана с интеллектуальным нарушением у детей [Canfield et al., 2003]. Могут возникать расстройства в поведении, обучении и трудности с концентрацией внимания. В тяжелых случаях отравления свинцом человек может страдать от острого психоза, путаницы и снижения сознания. Дети особенно восприимчивы к воздействию свинца из-за высокого желудочнокишечного всасывания и проницаемого гематоэнцефалического барьера с последующим повреждением головного мозга. У взрослых же неорганический свинец не проникает через гематоэнцефалический барьер в силу его большей развитости [Järup, 2003]. 9 1.2 Значение тяжелых металлов для бактериальной клетки Тяжелые металлы играют двойственную роль в процессах жизнедеятельности микроорганизмов. Некоторые из них являются важными микроэлементами в «следовых» количествах. Mo, Сu, Fe, Zn, Mn, Со и Ni участвуют в каталитическом ускорении биохимических процессов. Они являются кофакторами или входят в состав ферментов [Matsui et al., 2009]. А такие как Cd, Pb, Sn, Hg и Ag не имеют положительной биологической функции и токсичны даже в очень небольших количествах. Cd, Pb, Hg и As рассматриваться как наиболее токсичные тяжелые металлы [Halttunen et al., 2007]. В последнее время, загрязнение окружающей среды стало глобальной проблемой для человечества. Одним из широко распространенных поллютантов стали тяжелые металлы [McConnell et al., 2008]. Так как обычные технологии очистки не экономичны и малоэффективны, разрабатываются экологически чистые технологии, известные как «биосорбция». Биосорбция – это свойство некоторых типов неактивной, мертвой или активной микробной биомассы связывать и удерживать даже низкие концентрации тяжелых металлов из водных растворов. У микроорганизмов, таких как бактерии, дрожжи, грибы и водоросли было обнаружено накопление большого количества ионов тяжелых металлов [Gosalbes, 2012; Inaba, 2005]. Биомасса, которая проявляет это свойство, действует в качестве химического вещества, как ионит биологического происхождения. Главную роль в этом процессе играют структуры клеточной стенки некоторых водорослей, грибов и бактерий, отвечающие за сорбцию тяжелых металлов. Биосорбция процессам: происходит адсорбции ионов главным на образом поверхности благодаря клеток или двум их биоаккумуляции внутри клетки [Blackwell et al., 1995]. Ионы Zn2+ стабилизируют структуру ДНК и белков клеточной 10 стенки бактерий [Nies, 1999]. Большое количество бактерий и архей могут использовать ионы некоторых металлов (Fe, Mn, Сг) и металлоидов (As) в качестве доноров или акцепторов электронов в энергетическом метаболизме [Ehrlich, 1997]. Установлена способность бактерий рода Pseudomonas использовать Cr (VI) как акцептор электронов при дыхании [Дмитренко с соавт., 2003]. У морской диатомовой водоросли Thalassiosira weissflogii найден фермент кадмий-угольная ангидраза, включающий в клеточный метаболизм кадмий в условиях низкой концентрации цинка [Lane, Morel, 2000]. Благодаря своим физиологическим и генетическим особенностям, микроорганизмы способны очень быстро реагировать на изменение качества среды и действие стрессовых факторов. Под действием стрессовых факторов в бактериальной клетке могут происходить изменения в морфологии путем физиологических перестроек. На уровне организмов адаптация реализуется за счет включения одного или нескольких механизмов индивидуальной резистентности [Forol et al., 2000]. Изучение отклика на присутствие в среде тяжелых металлов позволяет получить информацию об их токсическом эффекте, установить механизмы адаптации и резистентности бактерий. Токсичность тяжелых металлов по отношению к микроорганизмам зависит от таких факторов окружающей среды как рН, ионная сила, природа и концентрация катионов и анионов, а также от наличия органических соединений, которые способны взаимодействовать с металлами и влиять на их биодоступность [Bae et al., 2003]. Известны три основных механизма связывания металлов на клеточной стенке бактерий: ионообменные реакции с пептидогликаном и тейхоевыми кислотами, осаждение посредством нуклеазных реакций и комплексообразование азотных и кислородных лигандов [Mueller et al., 1989] Грамположительные бактерии имеют высокую адсорбционную способность благодаря высокому содержанию 11 пептидогликана и тейхоевых кислот в клеточной стенке. У грамотрицательных бактерий содержание этих компонентов в мембране ниже или они полностью отсутствуют, поэтому грациликуты меньше сорбируют металлы [Gavrilescu et al., 2004]. Бактериальные мембраны содержат карбоксильные, фосфорные, гидроксильные, амино- и функциональные группы, и с увеличением рН, эти функциональные группы депротонируются, в результате чего становятся способными сорбировать металл. Высокое отношение площади поверхности к объему бактерий позволяет им накапливать металлы в количествах, превышающих их собственный вес [Johnson, 2006]. Так как атомы тяжелых металлов не являются естественными элементами клетки, то их разложение и включение в метаболический цикл осуществляется путем их преобразования. Вместо этого, микроорганизмы развили стратегии преодоления токсичности тяжелых металлов. Они либо преобразовывают элемент в менее вредную форму, либо связывают металл внутри- или внеклеточно, тем самым предотвращая любые вредные взаимодействия в клетке-хозяине. Кроме того, они могут активно транспортировать металл из цитоплазмы клетки [White et al., 1998]. Ионы тяжелых металлов способны связываться с белками, нуклеотидами, коферментами, фосфолипидами, порфиринами, т.е. практически со всеми классами веществ, участвующих в метаболизме клетки. Ионы Cd2+, Hg2+, Ag+ могут соединяться с сульфгидрильными группами внутри чувствительных микробной ферментов. клетки, Ингибирование ингибируя тяжелыми активность металлами активности металлоферментов может быть связано с замещением специфического катиона. Они обладают также олигодинамическим действием по отношению ко многим бактериям за счет действия положительно заряженных ионов этих металлов, абсорбирующихся на отрицательно заряженной поверхности бактерий. При этом изменяется проницаемость цитоплазматической мембраны, нарушается питание и 12 клеточное деление. При непосредственном контакте с клетками они повреждают клеточную мембрану, что приводит к увеличению ее проницаемости. Они также стимулируют выработку свободных радикалов, участвующих в цепи окислительно-восстановительных реакций, токсичных для клетки [Matsui et al., 2009]. На примере Nostoc muscorum было показано, что аккумуляция Cd2+ сопровождается минерализацией оболочки. В этом случае токсичность Cd проявлялась в изменении морфологии клеток (уменьшении размеров клеток и укорочении трихома), ингибировании гидрогеназ и разрушении фотосинтетического аппарата, в результате чего происходило выцветание пигментов [Бекасов с соавт., 1999]. Живые организмы оснащены механизмом гомеостаза металла, который поддерживает внутриклеточную концентрацию ионов металла независимо от их концентрации в окружающей среде [Hall et al., 2002]. В этой системе транспортеры металл-реагирующие ионов металлов и транскрипционные металл-хелатные факторы, белки могут распознавать и связывать ионы металлов. После метаболизм-зависимого поглощения металл-хелатирующие белки, богатые остатками цистеина, такие как металлотионеины, фитохелатины и глутатионы, связывают ионы металлов в биологически неактивные формы. Посредством металлсвязывающей способности этих белков многие микроорганизмы могут накапливать ионы металлов внутриклеточно. Белки, которые распознают и связывают ионы металлов, действуют как факторы транскрипции и транспортеры [Pazirandeh et al., 1998]. Ионы металлов также могут быть связаны неорганическими анионами. Это ведет к детоксикации металла, поскольку образовавшиеся соединения являются малорастворимыми [Vasudevan et al., 2002]. Для Mycobacterium scrofulaceum обнаружена способность к внутриклеточной аккумуляции Сu2+ в форме сульфида [Bruins et al., 2000]. Детоксифицирующие ферменты могут обеспечивать устойчивость к 13 металлам. У Pseudomonas aeruginosa устойчивость наблюдается за счет повышения концентрации Hg2+-зависимой НАДФН-оксидоредуктазы. С ее помощью происходит восстановление Hg2+ до Hg0, которая затем диффундирует через клеточную мембрану в окружающую среду. Подобное явление наблюдается как у грамположительных (Staphylococcus aureus, Bacillus sp.), так и у грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Thiobacillus ferrooxidans) [Gadd, 1990; Bruins et al., 2000]. 1.3 Лактобациллы и тяжелые металлы Некоторые обитатели микрофлоры кишечника, такие как лактобациллы, используемые также в пищевой промышленности в качестве пробиотиков и заквасок для кисломолочных продуктов, могут участвовать в снижении токсичности металла в организме человека. Это возможно благодаря наличию у них механизмов резистентности, которые являются эффективными в предотвращении повреждения их собственных клеток [Sinha et al., 2011]. Так, они могут связывать и удерживать тяжелые металлы на поверхности своих клеточных стенок [Robinson et al., 1984]. Также известно о способности лактобацилл к детоксикации микотоксинов в пище [Pierides et al., 2000] и цианотоксинов в воде [Meriluoto et al., 2005; Nybom et al., 2007]. Гены устойчивости к тяжелым металлам и к антибиотикам часто расположены рядом на одной плазмиде [Devirgiliis et al., 2011]. В последние годы широко исследуется способность лактобацилл связывать ионы металлов из раствора для применения их в биотехнологии. Связывание ионов металлов лактобациллами, а также другими микроорганизмами, - это сложный процесс, который зависит от характеристики ионов металлов, физиологических свойств микробных штаммов и физико-химических характеристик окружающей среды (рН, температура, концентрация ионов металла). Следует отметить, что значение различных тяжелых металлов для лактобацилл различно. Некоторые необходимы лактобациллам для 14 функционирования ферментов и, таким образом, жизненно важны, а другие металлы, которые оказывают только токсическое действие, не имеют пользы для жизнедеятельности. К металлам, используемым в незначительных количествах в биохимических процессах, относятсятся железо, цинк и магний. Вероятно, они необходимы всем бактериям, в то время как никель, кобальт, селен и молибден используются только некоторыми из них [Solioz et al., 2011]. Большое значение имеет способность лактобацилл к снижению окислительного стресса, вызванного тяжелыми металлами in vitro [Bhakta et al., 2012; Koller et al., 2008] и способности к детоксикации в отношении других пищевых токсинов [Stidl et al., 2008]. Бактерии, которые способны экспортировать металлы из клетки, уменьшают повреждение организма, снижая концентрацию металлов в клетках. Однако такой механизм не идеален для детоксикации в желудочно-кишечном тракте, поскольку ведет к круговороту металлов. Полагают, что идеальными для детоксикации являются не те виды лактобацилл, которые имеют гены, кодирующие металлотранспортеры, а те, которые могут только связать и удерживать тяжелые металлы [Monachese et al., 2012]. Описаны два основных механизма связывания ионов металлов: одни виды способны к биосорбции – связыванию ионов металлов на поверхности клеток, другие осуществляют биоаккумуляцию, то есть поглощают ионы тяжелых металлов [Mrvčić et al., 2012]. Второй путь менее предпочтителен для детоксикации металлов в организме, поскольку ведет к циркуляции токсичного элемента [Monachese et al., 2012]. Связывание ионов металлов лактобациллами происходит очень быстро. Для эффективного связывания в водном растворе необходимо от 5 минут до 1 часа. После сорбции, даже через 48 часов металлы остаются прочно связанными с бактериальной поверхностью. Ионы металлов пассивно связываются с клеточной поверхностью с помощью электростатических и гидрофобных взаимодействий [Halttunen et al.,2007]. 15 Ионы металлов связываются с клеточной стенкой и внеклеточными полисахаридами жизнеспособных и неактивных клеток путем адсорбции, ионного обмена, комплексообразования, хелатирования и микроосаждения [Blackwell et al., 1995]. В зависимости от механизма, процесс связывания тяжелых металлов в большей или меньшей степени зависит от условий окружающей среды: концентрации тяжелых металлов, pH, температуры и др. [Ibrahim et al., 2006; Monachese et al., 2012]. Клеточная оболочка бактерий рода Lactobacillus представлена типичной клеточной стенкой грамположительных бактерий, основными структурными компонентами которой являются пептидогликан, органические кислоты (тейхоевые и липотейхоевые кислоты) и некоторые нейтральные полисахариды. Возможно присутствие также белкового Sслоя [Frece et al,. 2005]. Адгезия и связывание макромолекул происходит за счет сети тейхоевых кислот и полисахаридов [Delcour, 1999]. Экзополисахариды либо выделяется во внешнюю среду, либо остаются на поверхности и образуют полисахаридную капсулу. Некоторые лактобациллы синтезируют экзополисахариды, содержащие глюкозу, галактозу, рамнозу, ацетилгалактозамин маннозы, [Sanchez, N-ацетилглюкозамин 2006]. Пептидогликан и N- состоит из полимеризованных цепей дисахарида N-ацетил-глюкозамина-бета (1→4)кислоты, N-ацетилмурамовой ковалентно сшитых вместе пентапептидными мостиками. Ацетильные группы N-ацетил-глюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты могут быть расщеплены [Jarup, 2000]. Тейхоевые кислоты – это анионные полимеры, связанные с пептидогликановым слоем через блок сцепления. Структурной единицей блока сцепления является глицерин-фосфо-N-ацетилманнозамин-бета (1→4)-глюкозамин [Kojima, 1985]. У лактобацилл были обнаружены два типа тейхоевых кислот: поли(глицеролфосфат)- и оли(рибитолфосфат)тейхоевые кислоты [Ambrosini, 1996]. Липотейхоевые кислоты структурно сходны с тейхоевыми кислотами, но прикреплены к плазматической 16 мембране с помощью гликолипидов. Все лактобациллы имеют отрицательный суммарный заряд поверхности клетки при нейтральном рН [Schar-Zammaretti, 2003]. Объяснение этому может быть в том, что положительно заряженные области белкового S-слоя присоединены к пептидогликану [Smit, 2001]. На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что клеточная стенка лактобацилл содержит большое количество отрицательно заряженных функциональных групп, включая карбоксилат, гидроксид, амин, фосфат и гидросульфит, так что они могут выборочно связывать ионы металлов [Naumann et al., 1991]. Но метилирование карбоксильных и фосфатных групп снижает способность к связыванию. Это говорит о том, что обе эти группы играют важную роль в связывании свинца и кадмия [Halttunen et al., 2008]. Повышение денатурацию температуры поверхностных и обработка белков и кислотой частичное вызывают разрушение пептидогликана, что в свою очередь приводит к появлению новых сайтов связывания на поверхности бактерий [Haskard et al., 2001]. Кроме того, повышенная температура или обработка этанолом могут зафиксировать растворимые белки клеточной стенки на клеточной поверхности, которые в противном случае могут быть растворены и будут конкурировать с участками связывания [Huang et al., 1990]. Механизмы связывания ионов металлов у лактобацилл не отличаются от таковых других исследованных бактерий, способных связывать металлы [Vijayaraghavan & Yun, 2008]. Различия отмечены только в свойствах функциональных бактерий, групп и например, площади структуре, поверхности, также наличии родо- и видоспецифичнх особенностях. Факторы, влияющие на синтез клеточной стенки, оказывают существенное влияние на процесс биосорбции и металл-связывающую способность бактерий. Помимо структуры клеточной стенки, некоторые физико-химические параметры, такие как 17 начальная концентрация ионов металла, начальный рН, время контакта, концентрация биосорбента и изменения температуры также могут влиять на процесс биосорбции [Mrvčić et al., 2012]. Значение рН является одним из ключевых параметров, влияющих на биосорбцию и активность функциональных групп. Также рН влияет на конкуренцию между катионами металлов и протонами H+ за сайты связывания на клеточной стенке. При низких значениях рН (рН ≤ 3) в присутствии высокой концентрации H+ связывание ионов металлов является незначительным и растет с увеличением начального значения рН [Mrvčić et al., 2009а]. При рН выше 3 оно резко увеличивается, а максимальное связывание часто достигается при рН 4-6 [Halttunen, 2007]. В интервале рН 3-6 карбоксильные группы, которые участвуют в связывание иона металла, заряжены отрицательно, что увеличивает эффективность процесса. При более высоком показателе рН раствора может произойти снижение растворимости ионов металлов и их осаждение [Schut et al,. 2011]. При термической обработке увеличивается доступность сайтов связывания металлов на поверхности бактерий [Göksungur, 2005]. Присутствие других ионов в растворе, в результате конкуренции ионов металлов, повышает ионную силу раствора и негативно влияет процесс биосорбции[Halttunen et al., 2008]. С другой стороны, повышение концентрации микробной биомассы увеличивает площадь контакта и количество металл- связывающих сайтов, что приводит к увеличению количества связанных ионов металлов [Mrvčić et al., 2009а,b]. Однако, по мнению других авторов, при более высокой плотности биомассы наблюдается уменьшение удельной мощности связывания ионов металла [Halttunen et al., 2008b]. Кроме того, эффективность процесса зависит также от размера частиц биосорбента. Более мелкие частицы имеют большую площадь контакта и больше подходят для процесса биосорбции. Биосорбция более эффективна при более высокой начальной концентрации ионов металла в растворе и при высокой скорости перемешивания [Mrvčić et al., 2012]. 18 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Тяжелые металлы Растворы Pb(CH3COO)2*3H2O (316512, Sigma-Aldrich) и Cd(NO3)2 (642045, Sigma-Aldrich) в бидистиллированной воде (milliQ) с концентрацией 2 мг/мл автоклавировали 30 мин при 0.7 атм и использовали свежеприготовленными. 2.2 Объекты исследования и условия культивирования Объектом исследования служили микроорганизмы, указанные в таблице 1. Для культивирования лактобацилл использовали жидкую питательную среду MRS следующего состава (г/л дистиллированной воды): дрожжевой экстракт – 5, мясной экстракт – 10, Bacto-Pepton – 10, глюкоза – 20, аммоний лимоннокислый – 2, натрий уксуснокислый – 5, твин 80 – 1, K2HPO4 – 2, MgSO4, 7 H2O – 0.2, MnSO4 H2O – 0.04; pH 6.2–6.4 [De Man et al., 1960], в которую перед инокуляцией вносили растворы тяжелых металлов. Исследование влияния тяжелых металлов на рост лактобацилл проводили в 96-луночных полистироловых планшетах Cellstar (Grenier Bioone) с помощью планшетного ридера Tecan Infinite F200 PRO (Швейцария). В лунки планшета вносили по 150 мкл ночной культуры лактобацилл, разведенной 1:50 свежей питательной средой MRS с Pb2+ или Cd2+ в концентрациях от 0, 5, 10 и 50 мг/л и инкубировали при 37ºС в течение 18 ч с измерением оптической плотности (ОП) при 600 нм каждые 30 мин. 19 Таблица 1 – Используемые в работе штаммы лактобацилл № Штамм Источник 1. Lactobacillus plantarum Препарат «Лактобактерин сухой» 8PA3 (ФГУП НПО «Биомед») Lactobacillus plantarum B- Всероссийская коллекция 578 микроорганизмов Lactobacillus plantarum S1 Силос сельскохозяйственного 2. 3. предприятия «Кулон» Чистопольского района РТ 4. Lactobacillus plantarum Ga Лекарственный препарат «Гастрофарм» (АО «Биовет», Болгария) 5. Lactobacillus fermentum Na БАД «Наринэ» (ОАО «Narex», Армения) 6. Lactobacillus fermentum 3-2 Кисломолочный напиток «Айран» (ООО ФудМилк) 7. Lactobacillus fermentum 3-3 Кисломолочный напиток «Дар гор» (ООО ФудМилк) 8. 9. Lactobacillus buchneri Немецкая коллекция микроорганизмов DSM-20057 и клеточных культур Lactobacillus brevis DSM- Немецкая коллекция микроорганизмов 20054 и клеточных культур 10. Lactobacillus rhamnosus I2L Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов 2.3 Определение способности лактобацилл образовывать биопленки Образование биопленок оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах Cellstar (Grenier Bio-one). После выращивания 20 лактобацилл в течение 24 ч при 37ºС на жидкой среде MRS с Pb2+ или Cd2+ в стерильном 96-луночном планшете лунки планшета промывали 2 раза дистиллированной водой, добавляли в каждую лунку 0.1% раствор кристаллического фиолетового в 96% этаноле и инкубировали 1ч при комнатной температуре. Краситель удаляли из лунок и промывали лунки 3 раза дистиллированной водой. После подсушивания планшета в каждую лунку добавляли 100 мкл 96% этанола и инкубировали 1ч при комнатной температуре на качалке при 250 об./мин. Измеряли оптическую плотность растворенного спиртом красителя при 570 нм. 2.4 Анализ гидрофобности бактериальной поверхности Гидрофобность бактериальной поверхности определяли МАТS методом в двухфазной системе с н-гексадеканом [Rosenberg et al., 1980, Bellon-Fontaine et al., 1996]. Выращенные в течение 18-20 ч при 37ºС на жидкой среде MRS без тяжелых металлов и трижды отмытые от среды 0.1 М KNO3 (рН = 6.2) центрифугированием 10 мин при 5000 об./мин лактобациллы ресуспедировали в 0.1 М KNO3 (рН = 6.2) до оптической плотности 0.4 при 400 нм (A0). К 1.2 мл полученной клеточной суспензии добавляли 0.2 мл н-гексадекана (соотношение 6:1), интенсивно встряхивали в течение 2 мин и оставляли в покое на 15 мин, чтобы обеспечить разделение смеси на фазы. Измеряли оптическую плотность водной фазы при 400 нм (А1). Гидрофобность бактериальной поверхности рассчитывали по формуле: (1 - А1/А0) х 100 (%). 2.5 Определение электрон-донорных/акцепторных свойств бактериальной поверхности Электрон-донорные свойства поверхности лактобацилл определяли по адгезии леток на этилацетате, а электрон-акцепторные свойства – по адгезии на хлороформе по методике, описанной [Bellon-Fontaine et al., 1996]. Для этого лактобациллы, выращенные в течение 18-20 ч при 37ºС на жидкой среде MRS без тяжелых металлов и трижды отмытые от среды 0.1 М KNO3 (рН = 6.2) центрифугированием 10 мин при 5000 об./мин, 21 ресуспедировали в 0.1 М KNO3 (рН = 6.2) до оптической плотности 0.4 при 400 нм (A0). Полученную суспензию клеток смешивали с этилацетатом или хлороформом в соотношении 6:1, интенсивно встряхивали 2 мин, затем оставляли на 15 мин в покое для разделения двух фаз. Измеряли оптическую плотность водной фазы при 400 нм (А1). Гидрофобность бактериальной поверхности рассчитывали по формуле: (1 - А1/А0) х 100 (%). 2.6 Измерение дзета-потенциала клеточной поверхности лактобацилл Дзета-потенциал клеточной поверхности лактобацилл измеряли методом микроэлектрофореза на автоматическом лазерном анализаторе Malvern Zetasizer Nano ZS (Великобритания). Выращенные в течение 1820 ч при 37ºС на жидкой среде MRS без тяжелых металлов трижды отмывали от среды 1 мМ KNO3 (рН = 6.0) центрифугированием 10 мин при 5000 об./мин. Лактобациллы ресуспедировали в 1 мМ KNO3 (рН = 6.0), содержащем 10 мг/л Pb2+ или Cd2+, и инкубировали 1 ч при комнатной температуре на качалке при 180 об./мин, после чего клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 1 мМ KNO3 (рН = 6.0). Измерения проводили при комнатной температуре и электрическом поле 100 В [Pelletier et al.,1997]. 2.7 Атомно-абсорбционная спектрометрия (ААС) В питательную среду MRS, содержащую Pb2+ или Cd2+ в концентрации 5 мг/л, вносили ночные культуры лактобацилл (таблица 1) в соотношении 1:50 и выращивали микроаэрофильно 24 ч при 37 оС. По истечении времени инкубации бактерии отделяли от среды центрифугированием 5 мин при 7 000 об./мин, супернатант использовали для анализа методом ААС. Измерения проводили на спектрометре МГА-915МД с автодозатором жидких проб (Люмэкс, Россия) (рисунок 1). Использовали аргон высокой чистоты, лампу с полым катодом на Pb и спектральную 22 линию 283.3 нм, а для Cd - высокочастотную лампу и линию 228.8 нм. Применяли пиропокрытые графитовые трубчатые печи длиной 28 мм, внутренним диаметром 6 мм с толщиной стенок 1 мм. Для работы в режиме ДЗА использовали приставку АТЗОНД-1 (Россия). С ее помощью осуществляется фракционное отделение аналита от мешающей матрицы на вольфрамовом зонде. Манипулятор, установленный над атомизатором, перемещает зонд относительно дозировочного отверстия печи. Дозировочное отверстие расширили до 3 мм для введения U-образного зонда длиной 40 мм, выгнутого из проволоки толщиной 0.9 мм. Поперечный размер зонда в широкой части составлял 2 мм. Сначала холодный зонд улавливает пар аналита над дозировочным отверстием печи во время первичной атомизации пробы. Затем, зонд опускали внутрь нагретой печи для вторичного испарения очищенной от матрицы пробы за счет нагрева электрическим током. Градуировочные растворы готовили из стандартных образцов типа ГСОРМ 10 мг/л путем разбавления бидистиллированной водой в пластиковых мерных флаконах с подкислением азотной кислотой. Пробы дозировали непосредственно на дно печи. Объем дозирования варьировали от 5 до 40 мкл. Рисунок 1 – Спектрометр МГА-915МД с автодозатором жидких проб и приставкой Атзонд-1 (управляющий прибором персональный компьютер не показан) 23 2.8 Статистическая обработка результатов Статистический анализ проводили с использованием стандартных математических методов в программе Microsoft Excel. Результат в отдельной группе данных из трех независимых экспериментов считали достоверным при отклонении внутри группы s<15%. Достаточным для достоверной разницы групп данных принимали критерий вероятности Р<0.05. 24 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Оценка токсичности тяжелых металлов для лактобацилл Тяжелые металлы жизнедеятельности играют двоякую микроорганизмов. роль Некоторые из в процессах них являются важными микроэлементами и участвуют в каталитическом ускорении биохимических процессов [Matsui et al., 2009]. Другие, в частности Cd и Pb, являются токсичными для бактериальных клеток даже в малых количествах и способны влиять на их жизнедеятельность, то есть изменяется проницаемость цитоплазматической мембраны, нарушается питание и клеточное деление, в результате чего рост биомассы замедляется или ингибируется [Halttunen et al., 2007]. В работе исследовали влияние свинца и кадмия в концентрациях 5, 10 и 50 мг/л на рост лактобацилл (рисунки 2-10). Свинец в концентрации 50 мг/л обладал выраженным токсическим действием по отношению ко всем исследованным штаммам лактобацилл. Наиболее устойчивым к данной концентрации Pb (II) является штамм L. plantarum Na (снижение роста на 65%), а наиболее чувствительными L. plantarum Ga, L. fermentum 3-2 и L. rhamnosus I2L (снижение роста более чем на 80%) (рисунки 2-4). Эффекты 5 и 10 мг/л Pb (II) в отношении роста лактобацилл существенно не отличались для всех штаммов, кроме L. plantarum В-578 и L. brevis DSM-20054 – на эти бактерии свинец оказывал дозозависимое действие (рисунок 2, 4). Бактерии, принадлежащие к виду L. plantarum, оказались наиболее чувствительными к присутствию в среде роста свинца – наименьшая исследованная концентрация 5 мг/л вызывала снижение роста на 10-20% по сравнению с культурами, растущими без тяжелого металла (рисунок 2). У остальных исследованных лактобацилл добавление в среду роста 5 и 10 мг/л Pb (II) не вызывало достоверного снижения роста культур (рисунки 3, 4). 25 Рисунок 2 - Токсическое действие свинца на штаммы L. plantarum на 24 ч инкубирования на среде MRS с добавлением Pb (II). За 100% принята ОП600 культуры лактобацилл на среде MRS без добавления Pb (II). Рисунок 3 - Токсическое действие свинца на штаммы L. fermentum на 24 ч инкубирования на среде MRS с добавлением Pb (II). За 100% принята ОП600 культуры лактобацилл на среде MRS без добавления Pb (II). 26 Рисунок 4 - Токсическое действие свинца на лактобациллы на 24 ч инкубирования на среде MRS с добавлением Pb (II). За 100% принята ОП600 культуры лактобацилл на среде MRS без добавления Pb (II). Мы также оценили влияние кадмия на рост лактобацилл (рисунки 5-7). Наименьшая из исследованных концентраций (5 мг/л Cd (II)) не влияла на рост бактерий, за исключением штамма L. fermentum 3-2 (рисунки 6Б). По динамике роста, представленной на рисунке 6Б, видно, что, действительно, присутствие уже 5 мг/л Cd (II) в среде роста приводит к снижению урожая культуры L. fermentum 3-2. Добавление в среду роста 10 мг/л Cd (II) приводило к снижению значений ОП600 на 24 ч роста у штаммов L. plantarum В-578, L. fermentum 3-2, L.brevis DSM-20054, L.buchneri DSM-20057, L.rhamnosus I2L. В целом, бактерии родов L. plantarum и L. fermentum не чувствительны к исследованной концентрации кадмия, а L. brevis DSM-20054, L. buchneri DSM-20057 и L. rhamnosus I2L – чувствительны. Наивысшая концентрация кадмия 50 мг/л токсичная для всех исследованных лактобацилл. Причем, по представленным на рисунках 5,6 и 7 динамикам роста видно, что присутствие 50 мг/л Cd (II) в среде замедляет рост штаммов L. plantarum и L. fermentum и полностью подавляет рост штаммов L. brevis DSM-20054, L. buchneri DSM-20057 и L. rhamnosus I2L. 27 А Б В Г Рисунок 5 – Рост бактерий L. plantarum на среде MRS с добавлением кадмия. Слева – ОП600 на 24 ч роста лактобацилл, справа – кривые роста. За 100% прията ОП600 культуры лактобацилл на 24 ч роста на среде MRS без добавления Cd (II). А - L. plantarum 8PA3, Б - L. plantarum В-578, В - L. plantarum S1, Г - L. plantarum Ga 28 А Б В Рисунок 6 – Рост бактерий L. fermentum на среде MRS с добавлением кадмия. Слева – ОП600 на 24 ч роста лактобацилл, справа – кривые роста. За 100% прията ОП600 культуры лактобацилл на 24 ч роста на среде MRS без добавления Cd (II). А - L. fermentum Na, Б - L. fermentum 3-2, В - L. fermentum 3-3. 29 А Б В Рисунок 7 – Рост лактобацилл на среде MRS с добавлением кадмия. Слева – ОП600 на 24 ч роста лактобацилл, справа – кривые роста. За 100% прията ОП600 культуры лактобацилл на 24 ч роста на среде MRS без добавления Cd (II). А - L. brevis DSM-20054, Б - L. buchneri DSM-20057, В - L. rhamnosus I2L. 3.2 Характеристика физико-химических свойств поверхности лактобацилл С целью охарактеризовать физико-химические свойства поверхности клеток лактобацилл, мы использовали MATS-тест [Rosenberg et al., 1980]; 30 [Bellon-Fontaine et al., 1996]. Данный метод позволяет определить гидрофобность клеточной поверхности по адгезии бактерий на неполярном растворителе н-гексадекане в двухфазной системе. О кислотных и основных свойствах Льюиса клеточной поверхности можно судить по адгезии клеток на этилацетате и хлороформе. Адгезия клеток на хлороформе, который является акцептором электронов и кислотой по Льюису, свидетельствует об электрон-донорных (основных) свойствах поверхности. Адгезия на этилацетате, сильно основном и электрондонорном растворителе, свидетельствует об электрон-акцепторных (кислотных) свойствах поверхности адгезирующихся на нем клеток [Pelletier et al., 1997]; [Bellon-Fontaine et al., 1996]. Отметим, что с помощью фазово-контрастной микроскопии было показано, что данные растворители не приводят к лизису молочнокислых бактерий [BellonFontaine et al., 1996]. Количество адгезированных на н-гексадекане клеток позволяет считать их поверхность слабо гидрофобной (т.е. гидрофильной), если процент адгезированных клеток составляет от 0 до 35%; средне гидрофобной - при 36-70% и высоко гидрофобной – при 71-100% [Ahumada et al., 1999]. В соответствии с данной градацией, большинство исследованных лактобацилл может быть отнесено к гидрофильным. Бактерии L. plantarum B-578, L. brevis DSM-20054, L. buchneri DSM-20057 отнесены к средне гидрофобным, поскольку адгезия на н-гексадекане составила (52.0 ± 6.4), (63.1 ± 5.6) и (66.9 ± 6.3)%, соответственно (Таблица 2). Отметим, что чем более гидрофобной является поверхность молочнокислых бактерий, тем выше их адгезия к стенкам кишечника. Адгезивность является штаммоспецифичным свойством лактобацилл [Pelletier et al., 1997]. Действительно, адгезия на н-гексадекане сильно отличается у представителей вида L. plantarum (Таблица 2). Высокую гидрофобность связывают с наличием на поверхности клеток (глико)пептидов, а гидрофильность – с полисахаридами [Cuperus et al., 31 1993]. Известно, что лактобациллы, в частности, с гидрофильной поверхностью, характеризуются высокой адгезией на кислом растворителе хлороформе и низкой адгезией – на основном растворителе этилацетате. Это обусловлено электрон-донорными (основными) свойствами клеточной поверхности [Pelletier et al., 1997]. Однако, адгезия на хлороформе, а следовательно, кислотно-основные свойства лактобацилл сильно варьировали среди исследованных штаммов. У штаммов L. plantarum B-578, L. fermentum 3-2, L. brevis DSM-20054, L.buchneri DSM-20057 аффинность к хлороформу была высокой - 88.8-97.1% (Таблица 2). Выявленные основные свойства поверхности могут объясняться наличием на поверхности клеток спиртовых и фосфатных групп, карбоксильных анионов - компонентов грамположительной клеточной стенки [Kuroda et al., 2011]. Но остальные штаммы характеризовались низкой адгезией на хлороформе (Таблица 2). Известно, что некоторые лактобациллы могут иметь на своей поверхности S-слои из белков и гликопротеинов, причем регуляция образования этой структуры остается слабо изученной. Способность образовывать S-слой – штаммоспецифичное свойство, кроме того его наличие зависит от условий культивирования [Frece et al,. 2005]. Обнаруженный у ряда штаммов слабо выраженный электрон-донорный характер поверхности клеток, вероятно, можно объяснить возможным наличием у них S-слоев. При этом все исследованные лактобациллы, в полном соответствии с характеристикой этой группы бактерий [Pelletier et al., 1997], демонстрировали слабую адгезию на этилацетате (Таблица 2), т.е. обладали слабыми электрон-акцепторными свойствами. Исходя из физико-химических свойств поверхности клеток, наибольшая способность к биосорбции катионов металлов характерна для штаммов L. plantarum B-578, L. fermentum 3-2, L. brevis DSM-20054, L.buchneri DSM-20057, у которых наиболее выражены электрон-донорные (основные) свойства. 32 Таблица 2 – Адгезивная активность лактобацилл Виды и штаммы лактобацилл % адгезии (среднее ± станд. откл.) на гексадекане на хлороформе на этилацетате L. plantarum 8PA3 B-578 S1 Ga 9.3 ± 2.2 52.0 ± 6.4 6.6 ± 1.6 17.6 ± 3.8 17.9 ± 1.6 88.8 ± 3.6 29.3 ± 3.4 29.9 ± 2.6 34.5 ± 3.0 19.1 ± 2.0 L. fermentum Na 3-2 3-3 20.8 ± 3.1 27.9 ± 3.3 8.7 ± 1.8 9.8 ± 1.2 93.8 ± 2.2 20.1 ± 2.1 18.4 ± 2.7 23.8 ± 2.2 10.7 ± 1.6 L. brevis DSM-20054 63.1 ± 5.6 94.6 ± 0.1 26.5 ± 2.0 L. buchneri DSM-20057 66.9 ± 6.3 97.1 ± 0.1 35.6 ± 3.1 L. rhamnosus I2L 28.7 ± 3.3 34.8 ± 4.0 21.3 ± 2.7 15.1 ± 2.3 14.6 ± 2.8 Заряд поверхности клеток играет существенную роль в сорбции ионов металлов клеткой. Halttunen с соавт. было показано, что чем более отрицательный заряд несет клетка, тем эффективнее она сорбирует ионы кадмия и свинца, а при нейтрализации отрицательного заряда сорбция снижается [Halttunen et al., 2007]. Поэтому мы измерили дзета-потенциал нативных клеток лактобацилл; измерения проводили в 1 мМ KNO3, так как этот раствор позволяет избежать неспецифического поглощения ионов металлов поверхностью клетки [Pelletier et al., 1997]. Поверхность всех исследованных лактобацилл заряжена отрицательно, при этом значения варьируют от 7.4±0.9 до 34.9±6.8 мВ у представителей различных видов и штаммов (Рисунок 11). Обнаруженная видо- и штаммоспецифичность заряда поверхности клеток согласуется с данными литературы [Millsap et al., 2011]. Величина заряда поверхности клетки не коррелирует с электронакцепторными (R2=0.06) и электрон-донорными (R2=0.03) свойствами 33 клеток. Наибольший отрицательный заряд характерна для бактерий L. plantarum S1 (7.4±0.9 мВ), а наиболее слабо заряжена поверхность L. fermentum 3-3 (34.9±6.8 мВ) (Рисунок 8). Следовательно, на основе заряда поверхности клеток, наибольшую способность к биосорбции катионов металлов можно ожидать у штамма L. plantarum S1. Рисунок 8 - Заряд поверхности клеток лактобацилл: нативных (темные столбцы) и после 1 ч инкубации в растворах тяжелых металлов. 3.3 Влияние кадмия и свинца на способность лактобацилл образовывать биопленки Биопленки, микробные сообщества, в которых клетки необратимо прикреплены друг к другу и субстрату, а также защищены внеклеточным полимерным матриксом преимущественно полисахаридного состава, являются распространенной формой существования микроорганизмов, в том числе лактобацилл, в естественных условиях [Lebeer et al., 2007]. Известно, что в составе биопленок бактерии более устойчивы к 34 токсическому действию тяжелых металлов по сравнению с планктонными микроорганизмами [Teitzel et al., 2003]. Кроме того, в нескольких работах было показано, что полисахаридный матрикс биопленки может связывать тяжелые металлы [Kazy et al., 2002; Kim et al., 1996]. Тяжелые металлы, в свою очередь, способны влиять на способность бактерий образовывать биопленки – так, ионы Ni (II) и Cd (II) в микромолярных концентрациях ингибировали кворум-сенсинг у бактерий Burkholderia multivorans [Vega et al.,2014]. Поэтому в данной работе мы исследовали влияние Cd (II) и Pb (II) в концентрациях 5 мг/л и 10 мг/л на способность лактобацилл образовывать биопленки. У штаммов L. plantarum Ga, L. fermentum Na и 33 не выявлена способность образовывать биопленки на 24 ч роста на среде MRS как в отсутствие, так и в присутствии тяжелых металлов. Влияние Cd (II) и Pb (II) в концентрациях 5 мг/л и 10 мг/л на образование биопленок у остальных исследованных штаммов представлено на рисунках 9 и 10. Присутствие в среде роста ионов Cd (II) и Pb (II) по-разному сказывалось на образовании биопленок представителями разных видов и даже штаммов лактобацилл. Выявлена слабая корреляция между зарядом поверхности клеток и способностью образовывать биопленки (r2=0.31). В еще меньшей степени свойство формировать биопленки зависит от гидрофобности (r2=0.24) и электрон-донорных свойств поверхности (r2=0.22) лактобацилл (таблица 3). 35 Рисунок 9 - Влияние Cd (II) в концентрациях 5 мг/л (А) и 10 мг/л (Б) на образование биопленок лактобациллами. За 100% принята биопленка на среде MRS без добавления Pb (II). Рисунок 10 - Влияние Pb (II) в концентрациях 5 мг/л (А) и 10 мг/л (Б) на образование биопленок лактобациллами. За 100% принята биопленка на среде MRS без добавления Pb (II). 36 Таблица 3 – Коэффициент корреляции между физико-химическими свойствами поверхности лактобацилл и их способностью образовывать биопленки (r2) Свойство Гидрофобность лактобацилл Способность образовывать биопленки 0.24 Электрондонорные свойства Электронакцепторные свойства Заряд поверхности клетки 0.22 0.07 0.31 3.4 Оценка способности лактобацилл связывать тяжелые металлы Известно два основных механизма детоксикации тяжелых металлов молочнокислыми бактериями одни виды способны к биосорбции – связыванию ионов металлов на поверхности клеток, другие осуществляют биоаккумуляцию, то есть поглощают ионы тяжелых металлов [Mrvčić et al., 2012]. Первый путь протекает быстро, в течение нескольких минут и более предпочтителен для детоксикации металлов в организме, поскольку биоаккумуляция ведет к циркуляции токсичного элемента [Monachese et al., 2012]. В данной работе предпринята попытка оценить биосорбцию тяжелых металлов лактобациллами по изменению заряда клеточной поверхности. Поэтому мы измерили дзета-потенциал нативных клеток лактобацилл и после 1 ч инкубации в 10 мкг/л растворе тяжелых металлов. После инкубации в растворах Cd (II) и Pb (II) ни у одного из исследованных штаммов лактобацилл не выявлено изменения заряда поверхности клеток в сторону более положительных значений (Рисунок 10), поэтому мы полагаем, что связывание ионов Cd (II) и Pb (II) с поверхностью клетки не происходит. Отметим, что отсутствие связывания тяжелых металлов не может быть связано с недостаточным временем контакта бактерий с Cd (II) и Pb (II) – в работе Halttunen с соавт. показано, 37 что извлечение Cd (II) и Pb (II) уже через 5 мин совместной инкубации достигало (87.8±2.9)% и (92.6±1.9)%, соответственно [Halttunen, 2007]. У ряда лактобацилл обнаружено снижение заряда (Рисунок 11), которое, повидимому, объясняется взаимодействием с клеткой анионов присутствующих в растворе солей Pb(CH3COO)2*3H2O, Cd(NO3)2, KNO3. Для выяснения возможности биоаккумуляции тяжелых металлов мы выращивали лактобациллы 24 ч на среде MRS, содержащей 5 мкг/л тяжелого металла, после чего определяли оставшееся содержание Cd (II) и Pb (II) в среде методом ААС. Из результатов, представленных на рисунке 11Б видно, что в пределах погрешности данного эксперимента 5% достоверно выявить уменьшение концентрации Pb (II) в MRS не удалось. Хотя отмечается ничтожный на 2% спад в образцах среды после роста в ней бактерий L. fermentum 3-3, L. buchneri DSM-20057, L. rhamnosus I2L. У ряда штаммов обнаружена способность извлекать из среды ионы Cd(II). Убыль содержания Cd(II) в MRS через 24 ч роста в ней L. plantarum В-578 составила 16%, L. fermentum 3-3 – 12%, L. plantarum 8РА3, S1, Ga, L. fermentum 3-2 – 8% (рисунок 10А). 38 Рисунок 11 - Сорбция ионов Cd(II) (A) и Pb(II) (Б) клетками лактобацилл. Темные столбцы – измеренная методом ААС концентрация тяжелого металла в среде MRS через 24 ч роста на ней лактобацилл; светлые столбцы – убыль концентрации металла по сравнению с исходной концентрацией 5 мг/л. Ранее Bhakta с соавт. показали, что молочнокислые бактерии, выделенные из загрязненных тяжелыми металлами источников, извлекают из MRS Cd (II) на уровне 3.42–25% и Pb (II) - 3–59% [Bhakta et al., 2012]. Тем не менее, корреляция между устойчивостью молочнокислых бактерий к тяжелым металлам и их способностью связывать их не была выявлена [Bhakta et al., 2012]. Поэтому нельзя с полной уверенностью объяснить разницу в способности связывать металлы между микроорганизмами, исследованными нами и описанными в данной работе тем, что последние эволюционно приобрели устойчивость к тяжелым металлам и способность связывать их. Ряд фактов свидетельствует о том, что способность связывать тяжелые металлы, подобно многим свойствам лактобацилл, является видо- и даже штаммоспецифичной [Pelletier et al., 1997]. Полностью исключить вклад связывания металлов поверхностью 39 клеток лактобацилл в регистрируемое снижение концентрации Cd (II) в среде после роста на ней лактобацилл нельзя. Пассивная сорбция ионов тяжелых металлов на поверхности клеток лактобацилл, основанная на гидрофобных и электростатических взаимодействиях, очевидно, зависит от физико-химических свойств поверхности клеток [Halttunen et al., 2007]. Поэтому, чтобы исключить этот механизм в регистрируемом снижении концентрации Cd (II) в среде MRS, мы проверили наличие корреляции между всеми исследованными характеристиками поверхности клеток лактобацилл и их способностью извлекать Cd (II) из среды. Аналогично работе [Halttunen et al., 2008], зависимость между физико-химическими свойствами поверхности клеток и их способностью извлекать Cd (II) из среды не была обнаружена (таблица 4). Мы полагаем, что это является свидетельством биоаккумуляции металлов клеткой, механизм которой в не зависит от физико-химических характеристик поверхности клеток по сравнению с биосорбцией. Таблица 4 – Коэффициент корреляции между физико-химическими свойствами поверхности лактобацилл и их способностью извлекать Cd (II) из среды (r2) Свойство Гидрофобность лактобацилл Извлечение Cd 2+ 0.15 Электрондонорные свойства Электронакцепторные свойства Заряд поверхности клетки 0.02 0.23 0.02 Таким образом, у ряда пробиотических и промышленно важных лактобацилл, а именно, у L. plantarum В-578, 8РА3, S1 и Ga, L. fermentum 3-2 и 3-3, обнаружена способность аккумулировать ионы Cd (II). Поскольку это свойство ведет к циркуляции тяжелого металла [Monachese et al., 2012], эти лактобациллы нежелательно применять в пробиотиках и кисломолочных продуктах в районах, загрязненных тяжелыми металлами. 40 ВЫВОДЫ 1) В присутствии 50 мг/л Pb (II) в среде рост исследованных лактобацилл снижался на 65-80%, Cd (II) – на 55-90%. Тяжелые металлы в концентрациях 5 и 10 мг/л не оказывали существенного влияния на рост бактерий, кроме штаммов L. brevis DSM-20054, L. buchneri DSM-20057 и L. rhamnosus I2L, у которых при 10 мг/л Cd (II) практически полностью ингибировался рост. 2) 7 из 10 исследованных штаммов лактобацилл имеют гидрофильную поверхность клеток. Бактерии L. plantarum B-578, L. brevis DSM-20054, L. buchneri DSM-20057 отнесены к средне гидрофобным. 3) Исследованные лактобациллы характеризуются слабой адгезией на этилацетате, следовательно, обладают слабыми электрон-акцепторными (кислотными) свойствами. У бактерий L. plantarum B-578, L. fermentum 3-2, L. brevis DSM-20054, L.buchneri DSM-20057 по высокой аффинности к хлороформу (88.8-97.1%) обнаружены сильные электрон-донорные (основные) свойства. 4) Все исследованные лактобациллы несут отрицательный заряд (дзета-потенциал) на своей поверхности (7.4±0.9 до 34.9±6.8 мВ). 5) Бактерии L. plantarum Ga, L. fermentum Na и 3-3 не способны образовывать биопленки на 24 ч роста на среде MRS. У остальных штаммов способность образовывать биопленки не коррелирует с физикохимическими свойствами поверхности. 6) У исследованных лактобацилл не обнаружена способность сорбировать ионы Pb (II) и Cd (II) на своей поверхности. 7) и 3-3 У бактерий L. plantarum В-578, 8РА3, S1 и Ga, L. fermentum 3-2 методом атомно-адсорбционной способность аккумулировать ионы Cd (II). 41 спектрометрии обнаружена СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1) Бекасова, О.Д. Аккумуляция кадмия, титана и алюминия цианобактерией Nostoc muscorum II [Текст] / О.Д.Бекасова, В.К.Орлеанский, В.В.Никандров // Микробиология. – 1999. – Т. 68. – С. 851-859. 2) Дмитренко, Т.Н. Восстановление Cr (VI)бактериями рода Pseudomonas [Текст] / Т.Н.Дмитренко, В.В.Коновалова, О.А.Шум //Микробиология. – 2003. – Т.72. – С. 370-373 3) Ambrosini, V.M. Chemical composition of the cell wall of lactic acid bacteria and related species [Text] / V.M. Ambrosini, S.Gonzalez, G.Perdigon, A.P. de Ruiz Holdago, G. Oliver // Chem. Pharm. Bull. – 1996. – V. 44. – P. 2263-2267. 4) Bae, W. Enhanced mercury biosorption by bacterial cells with surface-displayed MerR [Text] / W. Bae, C.H. Wu, J. Kostal, A. Mulchandani, W. Chen// Appl Environ Microbiol. – 2003. – V. 69. – P. 3176-3180. 5) Barbee, J.Y. Acute respiratory distress syndrome in a welder exposed to metal fumes [Text] / J.Y. Barbee, T.S. Prince // South Med J. – 1999. – V. 92. – P. 510–516. 6) Belimov, A.A. Cadmium-tolerant plant growth-promoting bacteria associated with the roots of Indian mustard [Text] / A.A. Belimov, N.Hontzeas, V.I. Safronova // Soil Biol Biochem. – 2005. – V. 37. – P. 241–250. 7) Bellon-Fontaine, M. N.Microbial adhesion to solvents: a novel method to determine the electron-donor/electronacceptor or Lewis acid-base properties of microbial-cells [Text] / M. N.Bellon-Fontaine, J. Rault, C. J. van Oss // Colloids Surf. – 1996. – V.7. – P.47–53. 8) Bhakta, J.N. Characterization of lactic acid bacteria-based probiotics as potential heavy metal sorbents [Text] / J.N. Bhakta, K. Ohnishi, Y. Munekage, K. Iwasaki, M.Q.Wei // J. Appl. Microbiol. – 2012. – V.112. – P.1193–1206. 42 9) Blackwell, K.J. Metal cation uptake by yeast: a review [Text] / K.J. Blackwell, I. Singleton, J.M. Tobin // Appl Microbiol Biotechnol. – 1995. – V.43. – P.579–584. 10) Bruins, M.R. Microbial resistance to metals in the environment [Text] / M.R. Bruins, S. Kapil, F.W. Oehme // Ecotoxicology and Environmental Safety. – 2000. – V. 45. – P. 198-207. 11) Delcour, J. The biosynthesis and functionality of the cell-wall of lactic acid bacteria [Text] / J.Delcour, T.Ferain, M.Deghorain, E.Palumbo, P.Hols // Anton. van Leeuw. – 1999. – V. 76. – P. 159-184. 12) De Man, J.C. A medium for the cultivation of lactobacilli [Text]/ J.C.De Man, M. Rogosa, M.T. Sharpe // J. Appl. Bacteriol. – 1960. – V.23. – P. 130–135. 13) Devirgiliis, C. Antibiotic resistance determinants in the interplay between food and gut microbiota [Text] / C. Devirgiliis, S. Barile, G. Perozzi // Genes Nutr. – 2011. – V.6. – P.275–284. 14) Eckburg, P.B. Diversity of the human intestinal microbial flora [Text] / P.B. Eckburg, E.M. Bik, C.N. Bernstein, E. Purdom, L. Dethlefsen // Science. – 2005. – V. 308. – P. 1635–1638. 15) Ehrlich, H.L. Microbes and metals [Text] / H.L. Ehrlich // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1997. – V. 48. – P. 687-692. 16) Frece, J. In vivo testing of functional properties of three selected probiotic strains [Text] J.Frece, B. Kos, J. Beganovic, S. Vukovic, J. Suskovic // World J Microbiol Biotechnol. – 2005. – V.21. – P.1401–1408. 17) Gadd,G.M. Metal tolerance [Text] / G.M. Gadd // Microbiology of extreme environments / Ed. By C.Edwards. Philadelphia: Open University Press. 1990. – P. 178-210. 18) Gavrilescu, M. Removal of heavy metals from the environment by biosorption [Text] / M. Gavrilescu// Eng. Life Sci. – 2004. – V. 4. – P. 219 – 232. 43 19) Giraffa, G. Importance of lactobacilli in food and feed biotechnology [Text] / G.Giraffa, N Chanishvili., Y.Widyastuti // Res. Microbiol. – 2010. – V.161(6). – P.480-487. 20) Göksungur, Y. Biosorption of cadmium and lead ions by ethanol treated waste baker's yeast biomass [Text] / Y.Göksungur, S.Üren, U.Güvenc // Bioresour. Technol. – 2005. – V. 96 (1). – P.103-109. 21) Gosalbes, M.J. Metagenomics of human microbiome: beyond 16s rDNA [Text] / M.J. Gosalbes, J.J. Abellan, A. Durban, A.E. Perez-Cobas, A. Latorre // Clin Microbiol Infect. – 2012. – V.4. – P.47–49. 22) Gupta, U.C. Trace element toxicity relationships to crop production and livestock and human health: implications for management [Text] / U.C. Gupta, S.C. Gupta // Commun Soil Sci Plant. – 1998. – V.29. – P.1491– 1522. 23) Hall, J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance [Text] / J.L. Hall // J Exp Bot. – 2002. – V. 53. – P. 1-11. 24) Halttunen, T. Combining strains of lactic acid bacteria may reduce their toxin and heavy metal removal efficiency from aqueous solution [Text] / T.Halttunen, M.C. Collado, H. El-Nezami, J. Meriluoto, S. Salminen // Lett Appl Microbiol. – 2008b. – V.46. – P.160–165. 25) Halttunen, T. Rapid removal of cadmium, lead and arsenic from water by lactic acid bacteria [Text] / T. Halttunen, S. Salminen , R. Tahvonen // International Journal of Food Microbiology. – 2007. – V. 114. – P. 30–35. 26) Halttunen, T. Reversible surface binding of cadmium and lead by lactic acid and bifidobacteria [Text] / T.Halttunen, S.Salminen, J.Meriluoto, T R.ahvonen, K.Lertola // International Journal of Food Microbiology. – 2008. – V.125. – P.170–175. 27) Haskard, C. Surface binding of aflatoxin B1 by lactic acid bacteria [Text] / C.Haskard, H.El-Nezami, P.Kankaanpaa, S.Salminen, J.Ahokas // Appl. Environ. Microbiol. – 2001. – V.67 (7). – P.3086-3091. 44 28) Hrudey, S.E. Bioavailability in Environmental Risk Assessment [Text] / S.E. Hrudey, W.Chen, C.G. Rousseaux // Boca Raton, FL: Lewis Publication. – 1995. 29) Huang, C. The removal of Cu (II) from dilute aqueous solutions by Saccharomyces cerevisiae [Text] / C.Huang, C.Huang, A.L.Morehart // Water Res. – 1990. – V.24(4). – P.433-439. 30) Ibrahim, F. Probiotic bacteria as potential detoxification tools: assessing their heavy metal binding isotherms [Text] / F.Ibrahim, T.Halttunen, R.Tahvonen, S.Salminen // Can J Microbiol. – 2006. – V.52. – P.877–885. 31) Inaba, T. Estimation of cumulative cadmium intake causing Itaiitai disease [Text] / T. Inaba, E. Kobayashi, Y. Suwazono, M. Uetani, M. Oishi // Toxicol Lett. – 2005. – V.159. – P.192–201. 32) Inthorn, D. Removal of Cadmium from aqueous solutions by filamentous cyanobacterium Tolypothrixtenuis [Text] / D.Inthorn, H.Nagase, Y.Isaji, K. Hirata, K.Miyamoto // J. Ferment. Bioeng. – 1996. – V.82. – P.580584. 33) Jarup, L. Health effects of cadmium exposure—a review of the literature and a risk estimate [Text]/ L.Jarup, M.Berglund, C.G. Elinder, G. Nordberg, M.Vahter // Scand J Work Environ Health. – 1998. – V.24. – P.1–51. 34) Jarup, L. Low level exposure to cadmium and early kidney damage: the OSCAR study [Text] / L.Jarup, L.Hellstrom, T.Alfven, M.Carlsson, A.Grubb, B.Persson, C.Pettersson, G. Spang, A.Schutz, C.Elinder // Occup. Environ. Med. – 2000. – V.57. – P.668-672. 35) Järup,L. Hazards of heavy metal contamination [Text] : Department of Epidemiology and Public Health, Imperial College, London, UK. Br Med Bull. – 2003. – V.68. – P.167-182. 36) Johnson, K.J. Bacterial adsorption of aqueous heavy metals: molecular simulations and surface complexation models [Text] : A Dissertation , Doctor of Philosophy / K.J. Johnson; University of Notre Dame. – Indiana, 2006. – P.7-43. 45 37) Kazy, S. K. Extracellular polysaccharides of a copper-sensitive and a copper-resistant Pseudomonas aeruginosa strain: synthesis, chemical nature and copper binding [Text] / S. K.Kazy, P. Sar, S. P. Singh, A. K. Sen, S. F. D’Souza // World J. Microbiol. Biotechnol. – 2002. – V.18. – P.583–588. 38) Kim, S.-Y. Metal adsorption of the polysaccharide produced from Methlobacterium organophilum [Text] / S.-Y. Kim, J.-H. Kim, C.-J. Kim, D.-K. Oh. // Biotechnol. Lett. – 1996. – V.18. – P.1161–1164. 39) Kojima, N. Structural studies on the linkage unit of ribitol teichoic acid of Lactobacillas plantarum [Text] / N.Kojima, Y.Araki, E.Ito // Eur. J. Biochem. – 1985. – V.148. – P.29-34. 40) Koller, V.J. Impact of lactic acid bacteria on oxidative DNA damage in human derived colon cells [Text] / V.J. Koller // Food Chem. Toxicol. – 2008. – V.46. – P.1221– 1229. 41) Lane,T.W. A biological function for cadmium in marine diatoms [Text] / T.W. Lane, F.M.Morel // Proc Natl Acad Sci USA. – 2000. – V.97. – P.4627–4631. 42) Lebeer, S. Impact of environmental and genetic factors on biofilm formation by the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus GG [Text] / S.Lebeer, T.L.A.Verhoeven, M.P.Velez, J.Vanderleyden, S.C.J. De Keersmaecker // Appl. Environ. Microbiol. – 2007. – V. 73. – P. 6768-6775. 43) Matsui, K. Creation of a novel peptide endowing yeasts with acid tolerance using yeast cell-surface engineering [Text] / K. Matsui, K. Kuroda, M. Ueda // Appl Microbiol Biotechnol. – 2009. – V. 82. – P. 105-113. 44) McConnell, J. R. Coal burning leaves toxic heavy metal legacy in the Arctic [Text] / J. R. McConnell, R. Edwards // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2008. – V 105. –P. 12140 –12144. 45) Meriluoto, J. Removal of the cyanobacterial toxin microcystin-LR by human probiotics [Text] / J.Meriluoto, M.Gueimonde, C.A. Haskard, L.Spoof, O.Sjovall, S.Salminen // Toxicon. – 2005. – V.46. – P.111–114. 46 46) Monachese, M. Bioremediation and Tolerance of Humans to Heavy Metals through Microbial Processes: a Potential Role for Probiotics [Text] / M. Monachese, P.J. Burton, G. Reida // Applied and Environmental Microbiology. – 2012. – V. 78. – P. 6397–6404. 47) Monachese, M. Bioremediation and tolerance of humans to heavy metals through microbial processes: a potential role for probiotics? [Text] / M.Monachese, J.P.Burton, G.Reid // Appl Environ Microbiol. – 2012. – V.78. – P.6397-404. 48) Mrvčić, J. Copper binding by lactic acid bacteria (LAB) [Text] J.Mrvčić, D.Stanzer, V.Bacˇun-Druzˇina, V.Stehlik-Tomas // Biosci Microflora. - 2009b. – V.28(1). – P.1–6. 49) Mrvčić, J. Interaction of lactic acid bacteria with metal ions: opportunities for improving food safety and quality [Text] / J.Mrvčić, D.Stanzer, E.Solić, V. Stehlik-Tomas // World J Microbiol Biotechnol. – 2012. – V.28(9). – P.2771-2782. 50) Mrvčić, J. Zinc binding by lactic acid bacteria [Text] / J. Mrvčić, T. Prebeg, L. Barisˇic´, D. Stanzer, V. Bacˇun-Druzˇina, V. Stehlik-Tomas // Food Technol Biotechnol. - 2009a. – V.47(4). – P.381–388. 51) Mueller, J.G. Creosote-contaminated sites. Their potential for bioremediation [Text] / J.G. Mueller, P.J. Chapman, P.H. Pritchard // Environ. Sci. Technol. – 1989. – V. 23. – P. 1197–1201. 52) Nies, D.H. Microbial heavy-metal resistance [Text] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1999. – V.51. – P. 730-750. 53) Nybom, S.M.K. Removal of microcystin-LR by metabolically active probiotic bacteria [Text] / S.M.K.Nybom, S.L.Salminen, J.A.O.Meriluoto // FEMS Microbiology Letters. – 2007. – V.270. – P.27–33. 54) Pierides, M. Ability of dairy strains of lactic acid bacteria to bind aflatoxin M1 in a food model [Text] / M.Pierides, H.El-Nezami, K.Peltonen, S.Salminen, J.Ahokas // Journal of Food Protection. – 2000. – V.63. – P.645– 650. 47 55) Robinson, J.B. Mechanisms of microbial resistance and detoxification of mercury and organomercury compounds: physiological, biochemical, and genetic analyses [Text] / J.B. Robinson, O.H. Tuovinen // Microbiol. Rev. – 1984. – V.48. – P.95–124. 56) Rosenberg, M. Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell-surface hydrophobicity [Text] / M.Rosenberg, D. Gutnick, E. Rosenberg. // FEMS Microbiol. Lett. – 1980. – V.9. – P.29–33. 57) Sanchez, J.I. Culture conditions determine the balance between two different exopolysaccharides produced by Lactobacillus pentosus LPS26 [Text] / J.I.Sanchez, B.Martinez, R.Guillen, R.Jimenez-Diaz, A.Rodriguez // Appl. Environ. Microbiol. – 2006. – V.72 (12). – P.7495-7502. 58) Schar-Zammaretti, P. The cell wall of lactic acid bacteria: surface constituents and macromolecular conformations [Text] / P.Schar-Zammaretti, J.Ubbink // Biophys. J. – 2003. – V.85(6), - P.4076- 4092. 59) Schut, S. Biosorption of copper by wine-relevant lactobacilli [Text] / S.Schut, S.Zauner, G.Hampel, H.Ko¨nig, H.Claus // Int J Food Microbiol. – 2011. – V.145(1). – P.126–131. 60) Sharma, Y.C. Adsorption of Cadmium (II) from aqueous solutions by an indigenous clay mineral [Text] / Y.C. Sharma, V.Srivastava // Indian Journal of Chemical Technology. – 2006. – V.13. – P.218-221. 61) Singh, R. Heavy metals and living systems: An overview [Text] / R.Singh, N.Gautam, A.Mishra, R.Gupta // Indian J Pharmacol. – 2011. – V.43(3). – P.246-53. 62) Sinha, V. Amplification of arsH gene in Lactobacillus acidophilus resistant to arsenite [Text] / V.Sinha, R.Mishra, A.Kumar, A.Kannan, R.K. Upreti // Biotechnology. – 2011. – V.10. – P.101–107. 63) Smit, E. The Slayer protein of Lactobacillus acidophilus ATCC4356: Identification and charaterisation of domains responsible for Sprotein assembly and cell wall binding [Text] / E.Smit, F.Oling, R.Demel, B.Martinez, P.H.Pouwels, J. Mol. Biol. – 2001. – V.305(2). – P.245-257. 48 64) Stidl, R. Binding of heterocyclic aromatic amines by lactic acid bacteria: results of a comprehensive screening trial [Text] / R.Stidl, G.Sontag, V.Koller, S.Knasmüller // Mol. Nutr. Food Res. – 2008. – V.52. – P.322–329. 65) Teitzel, G. M. Parsek Heavy Metal Resistance of Biofilm and Planktonic Pseudomonas aeruginosa [Text] / G.M. Teitzel, M.R. Parsek // Applied and environmental microbiology/ - 2003. – V. 69. – P. 2313–2320. 66) Vasudevan, P. Biosorption of monovalent and divalent ions on baker’s yeast [Text] / P. Vasudevan, V. Padmavathy, S.C. Dhingra // Bioresour Technol. – 2002. – V. 82. – P. 285-289. 67) Vega, L.M. Nickel and cadmium ions inhibit quorum sensing and biofilm formation without affecting viability in Burkholderia multivorans [Text] / L.M. Vega, J.Mathieu, Y.Yang, B.H. Pyle, R.J.C. McLean, P.J.J. Alvarez // International Biodeterioration & Biodegradation. – 2014. – V.91. – P.82-87. 68) Vinodhini, R. Bioaccumulation of heavy metals in organs of fresh water fish Cyprinus carpio (common carp) [Text] / R.Vinodhini, M.Narayanan // Int J Environ Sci Tech. – 2008. – V.5(2). – P.179–182. 69) Vijayaraghavan, K. Bacterial biosorbents and biosorption [Text] / K.Vijayaraghavan, Y.S.Yun // Biotechnol Adv. – 2008. – V.26(3). – P.266–291. 70) Volesky, B. Biosorption of heavy metals by S. cerevisae [Text] / B.Volesky, H.A. May-Phillips // Appl Microbiol Biotechnol. – 1995. – V.42. – P.797–806. 49
