Расширенная аннотация проекта. 1.

Расширенная аннотация проекта.
1.
Полное наименование проекта (в соответствии с госконтрактом или соглашением):
«Системы кворум-сенсинга - молекулярные мишени антимикробных препаратов
нового поколения»
2.
Наименование программы:
Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России на 2009-2013 годы».
3.
Наименование мероприятия Программы:
Мероприятие 1.2.2. Проведение научных исследований научными группами под
руководством кандидатов наук
4.
Научный руководитель:
Маргулис Анна Борисовна
5.
Ответственный исполнитель:
Каюмов Айрат Рашитович
6.
Описание ожидаемых (полученных) результатов с указанием конкретных планируемых
характеристик и параметров объектов исследования или разработки (1-2 страницы).
1 этап: В результате выполнения данного этапа работы согласно календарному плану
проведен анализ литературных источников на предмет антибактериальных, мутагенных и
антимутагенных свойств производных фуранонов, механизмах их действия и возможности их
применения для блокирования систем кворум сенсинга; проанализированы: a. Возможность
взаимоперехода диссоциативных форм бактерий с участием экзогенных микробных
ауторегуляторов. b. Модификация вирулентности, фагоустойчивости и способности к
размножению
(колониеобразованию)
различных
штаммов
грамположительных
и
грамотрицательных микроорганизмов в результате стрессовых воздействий под действием
алкилрезорцинов и гомосеринлактона. c. Наличие/отсутствие связи между повреждающим
действием ауторегуляторов на геном и индукцией морфогенеза. d. Содержание ряда
химических элементов в молодых активных клетках бактерий и в клетках со сниженным
уровнем метаболизма (гипометаболических) методом масс-спектрометрии. e. Участие данных
ауторегуляторных молекул как триггерных в системе адаптивных реакций у бактерий;
проведен сравнительный анализ структуры и антимикробных свойств ранее изученных 2(5Н)фуранонов, что позволит целенаправленно вводить в лактонный цикл соответствующие
заместители и группировки и получать новые соединения с практически полезными
свойствами.
2 этап: В результате выполнения данного этапа работы согласно календарному плану
проведены экспериментальные и теоретические исследования в области синтеза, изучения
строения
и
свойств
серосодержащих
производных
2(5Н)-фуранона.
При
широком
варьировании условий эксперимента разработаны селективные и эффективные методы
направленного синтеза новых производных пятичленных кислород- и азотсодержащих
гетероциклов – 2(5Н)-фуранона и 3-пирролин-2-она, структурные фрагменты которых входят в
состав природных и синтетических биологически активных веществ. Синтезированы и
спектрально
охарактеризованы
следующие
основные
ряды
новых
функциональных
производных 2(5Н)-фуранона: а. Различным образом замещенные тиоэфиры и бис-тиоэфиры
фуранонов с ароматическими и алифатическими заместителями; б. Сульфоны и сульфоксиды
фуранонового ряда; в. 5-Алкокси-3-хлор-2(5Н)-фураноны; г. Сернистые конденсированные и
спиро-бициклические гетероциклы на базе фуранонов; д. Тиоэфиры 3-пирролин-2-она разного
структурного типа. На основе анализа полученных синтетических результатов предложены
возможные
механистические
схемы
реакций
замещения,
циклизации,
размыкания
циклической фураноновой структуры, приводящих к выделенным продуктам. Заложен
фундамент понимания уже изученных процессов и обоснованных прогнозов результатов
реакций с другими, более сложными нуклеофилами с целью создания веществ с желаемой
структурой и прогнозируемыми свойствами, в том числе – и практически полезными.
Строение более ста новых серосодержащих соединений фуранонового и пирролинонового
ряда доказано методами спектроскопии ИК, ЯМР 1Н и 13С, масс-спектрометрии, состав
подтвержден данными элементного анализа. Методом РСА охарактеризована кристаллическая
структура и картина межмолекулярных водородных связей большого числа новых
соединений.
3 этап: В результате выполнения данного этапа работы согласно календарному плану
проведены экспериментальные и теоретические исследования в области исследования
биологических
эффектов
новых
синтезированных
соединений.
Проведен
скрининг
производных фуранонов по антимикробной активности и генотоксичности и изучение in vitro
антибактериальной активности отобранных производных фуранонов в отношении тестмикроорганизмов,
возбудителей
токсикоинфекций.
Показано,
что
на
полноценной
питательной среде вещества проявляют токсические эффекты в следующих концентрациях: 5гидрокси-3,4-дихлор-2(5Н)-фуранон – 150 мкг/мл; 5-гидрокси-3,4-дихлор-3-пирролин-2-он,
3,4-дихлор-5-(1,3-дихлорпропан-2-илокси)-2(5Н)-фуранон
и
5-гидрокси-4[(4-
Метилфенил)тио]-3-хлор-2(5Н)-фуранон – в концентрации 300 мкг/мл; 3,4-дихлор-5-(2хлорэтокси)-2(5Н)-фуранон – 600 мкг/мл; 5-гидрокси-4-хлор-3-[(4-Метилфенил)тио]-2(5Н)фуранон – 1200 мкг/мл. В глюкозо-солевом растворе активность соединений возрастает в 80400 раз, и МИК составляет для 5-гидрокси-3,4-дихлор-2(5Н)-фуранона и 3,4-дихлор-5-(2хлорэтокси)-2(5Н)-фуранона 0.75 мкг/мл; для 5-гидрокси-3,4-дихлор-3-пирролин-2-она и 5-
гидрокси-4-хлор-3-[(4-Метилфенил)тио]-2(5Н)-фуранона – 30 мкг/мл; для 3,4-дихлор-5-(1,3дихлорпропан-2-илокси)-2(5Н)-фуранона – 7.5 мкг/мл; для 5-гидрокси-4[(4-Метилфенил)тио]3-хлор-2(5Н)-фуранона – 9 мкг/мл. 5-гидрокси-3,4-дихлор-2(5Н)-фуранон и 3,4-дихлор-5-(2хлорэтокси)-2(5Н)-фуранон проявляют слабую мутагенную активность в тесте Эймса в
концентрациях 1.5 – 3 мкг/мл, давая увеличение количества ревертантов в 2 – 2.2 раза. При
этом зарегистрирована высокая токсичность в концентрации 7.5 мкг/мл. 5-гидрокси-3,4дихлор-3-пирролин-2-он также показывает слабые мутагенные свойства в концентрации 30
мкг/мл, увеличивая количество ревертантов вдвое. 3,4-дихлор-5-(1,3-дихлорпропан-2-илокси)2(5Н)-фуранон и 5-гидрокси-4[(4-Метилфенил)тио]-3-хлор-2(5Н)-фуранон не проявляют
мутагенных
эффектов
в
исследуемых
концентрациях.
5-гидрокси-4-хлор-3-[(4-
Метилфенил)тио]-2(5Н)-фуранон начиная с 7.5 мкг/мл до 30 мкг/мл обладает мутагенным
действием и увеличивает количество ревертантов на чашку до трех раз. В концентрации 75
мкг/мл и больше наблюдаются только токсические эффекты. Антимутагенные эффекты не
обнаружены ни для одного из соединений в исследуемых концентрациях. Исследованы
токсикологические
показатели
безопасности
производных
фуранонов
на
культуре
растительных клеток. Показано, что фуранон 3Н в концентрации 150-300 мкг/мл не влиял на
рост неморфогенного каллуса гречихи. Тогда как процессы дифференцировки (образование
ПЭКК - структур, из которых формируются соматические зародыши) в морфогенном каллусе
подавлялись, в результате чего прирост биомассы каллуса снижался. Концентрация 75 мкг/мл
стимулировала рост растяжением неморфогенного каллуса и активировала образование ПЭКК,
т.е. пролиферацию клеток, в морфогенной культуре. Фуранон 1S в концентрации 300 мкг/мл
вызывал снижение роста неморфогенного каллуса и почти полностью подавлял прорастание
семян кукурузы, но не оказывал никакого воздействия на прорастание семян и развитие
проростков редиса. Фуранон 2Н в концентрации 300 мкг/мл не оказывал влияния на рост
неморфогенного каллуса, на 80% активировал прорастание семян кукурузы, но угнетающе
действовал на развитие семян редиса. Также исследованы токсикологических показателей
безопасности производных фуранонов на клетки животного организма на примере дрозофилы.
Предположительно, фураноны взаимодействует с генами, регулирующими развитие особей
женского или мужского пола у мушки-дрозофилы.
4 этап: Исследовано, оказывает ли влияние 5-гидрокси-3,4-дихлор-2(5Н)-фуранон на
процесс взаимодействия фактора TnrA с ГС. Показано, что в присутствии фуранона
происходило снижение эффективности связывания TnrA и ГС. Если концентрация фуранона
2.5 мкг/мл не оказывала влияния на взаимодействие белков, концентрация 10 мкг/мл
приводила к его полному отсутствию. Этот факт позволяет ожидать также подавления роста
клеток в присутствии 5-гидрокси-3,4-дихлор-2(5Н)-фуранона. Однако этот эффект, по всей
вероятности, будет заметен при высоких концентрациях соединения, которые могут иметь
токсический эффект на клетки эукариот. Поэтому перспективы практического применения
данного
соединения
сомнительны.
Также
исследовали
влияние
5-гидрокси-4[(4-
метилфенил)тио]-3-хлор-2(5Н)-фуранона (Ф2) на взаимодействие этих белков в тех же
условиях. В отличие от 5-гидрокси-3,4-дихлор-2(5Н)-фуранона, присутствие 5-гидрокси-4[(4Метилфенил)тио]-3-хлор-2(5Н)-фуранона в буфере приводило к полному подавлению
взаимодействия глутаминсинтетазы с фактором транскрипции TnrA. Этот факт позволяет
предположить, что данное соединение будет оказывать высокое бактерицидное действие на
клетки, поскольку, по-видимому, оказывает сильное воздействие на белки – регуляторы
азотного метаболизма в клетках бацилл. Таким образом, наши эксперименты позволили
установить,
наибольший
что
5-гидрокси-4[(4-Метилфенил)тио]-3-хлор-2(5Н)-фуранон
негативный
эффект
на
связывание
фактора
транскрипции
оказывает
TnrA
с
глутаминсинтетазой. Это позволяет предположить высокий бактериостатический эффект
данного соединения на клетки бацилл за счет нарушения регуляции азотного обмена.
Молекулярные же механизмы влияния этого фуранона на процесс взаимодействия белков
пока остаются неизвестным и требуют дальнейших исследований. Исследовали, оказывают ли
влияние фураноны на взаимодействие фактора транскрипции TnrA с регуляторным белком
GlnK. Наши данные показали, что один из исследуемых фуранонов, а именно 5-гидрокси-4[(4Метилфенил)тио]-3-хлор-2(5Н)-фуранон, уже в концентрации 1 мкг/мл в 2 раза подавляет рост
клеток бацилл. TnrA регулирует экспрессию множества генов в условиях недостатка азота.
Для установления влияния фуранонов на его активность исследовали активность βгалактозидазы в рекомбинантном штамме B.subtilis GP250. В этом штамме ген βгалактозидазы находится под контролем промотора nrg, который позитивно регулируется
белком TnrA. Это позволяет судить об активности фактора транскрипции по величине
галактозидазной активности в клетках.
5 этап: В данный момент полученные результаты находятся на стадии обработки и
описания, т.к. до окончания этапа осталось еще больше месяца.
7.
Библиографическое описание публикации по проекту и гиперссылки на публикации на
персональных страницах.
1 этап: 0
2 этап: 0
3 этап: 3 статьи
1. Гимадеева, Р.М. Цитотоксичность и генотоксичность новых производных фуранона /
Р.М.Гимадеева, Э.В.Бабынин, А.Б.Маргулис // "Вестник Уральской медицинской
академической науки" (Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и
биотехнологии).- 2011.- №4/1(38).- С. 26.
2. Белоногова, Н.В. Особенности развития стафилококковой инфекции при действии
гомосеринлактона in vivo / Н.В.Белоногова, А.И.Колпаков, Б.М.Куриненко, А.Б.Маргулис //
"Вестник Уральской медицинской академической науки" (Тематический выпуск по
микробиологии, иммунологии и биотехнологии).- 2011.- №4/1(38).- С. 20.
3. Митько, В.Е. Производные фуранонов как ингибиторы плотностно-зависимых
процессов у бактерий / В.Е.Митько, А.В.Гарусов, О.Н.Ильинская, А.Б.Маргулис // "Вестник
Уральской медицинской академической науки" (Тематический выпуск по микробиологии,
иммунологии и биотехнологии).- 2011.- №4/1(38).- С. 41.
4 этап: 1 статья
4. Латыпова, Л.З. Электрохимическое восстановление мукохлорной кислоты и ее 5алкоксипроизводных / Л.З.Латыпова, В.В.Янилкин, А.Р.Курбангалиева, Е.А.Бердников,
Г.А.Чмутова // Изв. АН, Сер. хим.- 2012.- № 3.- С. 566-579.
5 этап: 3 статьи
5. Маргулис, А.Б. Гомосеринлактон как регулятор индуцибельных и конститутивных
ферментов микроорганизмов / А.Б. Маргулис, О.В. Сиадат, Е.В. Никитина, А.И. Колпаков,
О.Н. Ильинская // Вестник Казанского технологического университета.- 2012.- Т.15, №17.- С.
173-176.
6. Белоногова, Н.В. Гомосеринлактон как модулятор функциональной активности клеток
прокариот / Н.В. Белоногова, А.Б. Маргулис, В.Я. Пономарев, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская
// Вестник Казанского технологического университета.- 2012.- Т.15, №23.- С.109-113.
7. Косолапова,
Л.С.
Синтез
и
структура
продуктов
реакций
4_[(4_метилфенил)сульфанил]_5_метокси_3_хлор_2(5Н)_фуранона с N,N_бинуклеофильными
реагентами / Л.С. Косолапова, А.Р. Курбангалиева, М.Ф. Валиев, О.А. Лодочникова, Е.А.
Бердников, Г.А. Чмутова // Известия Академии наук. Серия химическая.- 2013.- № 2.- С.457463.