разработка тест-систем для идентификации плодово

На правах рукописи
005008333
Мудрикова Ольга Викторовна
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ПЛОДОВО-ЯГОДНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕТОДОМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Специальность 05.18.15 - Технология и товароведение пищевых продуктов и
функционального и специализированного назначения и
общественного питания
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
1 9ЯНВ20|2
Кемерово
2012
Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (ФГБОУ ВПО
КемТИПП)
Научный руководитель:
доктор технических наук, профессор
Просеков Александр Юрьевич
Официальные оппоненты:
доктор технических наук, доцент
Гореликова Галина Анатольевна
доктор химических наук, профессор
Верещагин Александр Леонидович
Ведущая организация:
Государственное учреждение Ярославской области «Ярославский государственный институт
качества сырья и пищевых продуктов»
Защита диссертации состоится 17 февраля 2012 года в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.089.02 при ФГБОУ ВПО «Кемеровский
технологический институт пищевой промышленности» по адресу: 650056, г.
Кемерово, б-р Строителей, 47.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности».
С авторефератом можно ознакомиться на сайтах Высшей аттестационной
комиссии Министерства образования и науки Российской Федерации
(http://vak.ed.gov.ru/) и ФГБОУ ВПО «КемТИПП» (\у\у\у.кет!1рр.ш).
Автореферат разослан «12» января 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
И.А. Бакин
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Хорошо известно, что мякоть фруктов и ягод содержит многочисленные биологически активные соединения, которые очень
полезны для здоровья человека, снижают риск возникновения заболеваний. По
этой причине их активно используют в качестве ингредиентов для функциональных продуктов питания.
В условиях увеличения объема частного производства и свободной торговли продовольственными товарами, в том числе плодово-ягодным сырьем, полуфабрикатами и готовыми продуктами на основе плодово-ягодного сырья, возрастает возможность расширения их фальсификации по структуре и видовой
принадлежности сырьевых составляющих. По экономическим соображениям чаще
всего фапьсифицируют малоценное плодово-ягодное сырье, реализуя его как
продукцию высокого качества.
Государственное нормирование, а также надзор и контроль за качеством
и безопасностью пищевых продуктов питания на современном этапе являются
важнейпшми стратегическими задачами государства и осуществляются путем
введения стандартов, санитарных правил, норм и гигиенических нормативов,
обязательных для выполнения юридическими и физическими лицами. Процесс
вхождения России во Всемирную торговую организацию активиз1фовал разработки стандартов, а также гармонизации национальных стандартов с международной системой стандартов ISO, Codex Alimentarius, стандартами безопасности продовольствия стран Единого Союза.
Используемые в настоящее время методы органолептического и физикохимического анализа не позволяют однозначно определить видовую принадлежность плодово-ягодного сырья в полуфабрикатах. В работах зарубежных
исследователей (D.C. Hunter, J. Zhang, L,M. Stevenson, P. Taberlet, L. Gielly, G.
Pautou, J. Bouvet, J. Sabate, E. Barrio A. Ortola-Vidal, H. Schnerr, M. Rojmyr), посвященных установлению видовой принадлежности плодово-ягодного сырья
показано, что по сравнению с традиционными способами, установление видовой принадлежности плодово-ягодного сырья при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и возможностью количественного анализа.
Учитывая актуальность проблемы обеспечения продовольственного российского рынка качественными продуктами питания, настоящая диссертационная работа посвящена разработке ПЦР-тест-системы для видовой идентификации плодово-ягодной продукции.
Цель работы и задачи исследований. Целью настоящей диссертационной работы является разработка ПЦР-тест-системы для идентификации плодово-ягодной продукции.
Для достижения поставленной цели определены следующие задачи исследования:
- анализ нуклеотидных последовательностей ДНК клубники (лат.
Fragaria moschata), груши (лат. Pyrus), яблока (лат. Malm), черной смородины
(лат. Ribes nigrum), черники (лат. Vaccinium myrtillus), абрикоса (лат. Prunus armeniaca), персика (лат. Prunns pérsica);
- конструирование универсальных праймеров для амплификации кластера
ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria moscháta, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium
myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica-,
- определение оптимальных параметров проведения ПЦР для
идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium
myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica',
- сравнение специфичности ПЦР идентификации плодово-ягодного сырья
и классических физико-химических методов;
- описание ПЦР-тест-системы для идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica и
расчет затрат на проведение исследования в испытательных лабораториях.
Научная новизна работы. Сконструированы родо- и видоспецифичные
праймеры для амплификации кластера ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria
moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca,
Prunus pérsica. Проведена сравнительная оценка видовой специфичности
методом ПЦР с классическими физико-химическими методами на примере
продуктов питания на основе плодово-ягодного сырья.
Практическая значимость работы. В результате теоретических и экспериментальных исследований разработана ПЦР-тест-система для идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания. Отправлены материалы в
ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической
службы» для проведения работ по аттестации «Методики идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции». Внесены в международную геномную базу данных два сорта персика,
предоставленных для секвенирования Крымским селекционным центром
ТАВРИШ" (Крымск).
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были предметом докладов и обсуждений на международных и
межрегиональных научно-технических конференциях, семинарах, конгрессах:
III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых
«Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2010); IX Международной научно-практической конференции "Инновационные технологии в пищевой промышленности" (Минск, 2010); Международной научно-практической
конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010); I Всероссийской интернет-конференции
«Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (Казань, 2010); II
Международной научно-практической конференции «Прогрессивные технологии и перспективы развития» (Тамбов, 2010); конкурса "Участник молодежного
научно-инновационного конкурса" («УМШЖ») Федерального Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере на территории Кемеровской области (Кемерово, 2010); XV-ой Международной школе
конференции молодых ученых (Пущино, 2011).
5
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том
числе три в журналах, рекомендованных экспертным советом ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из
следующих основных разделов: введение, обзор литературы, объекты и методы
выполнения работы, результаты исследований и их обсуждение, практическая
реализация результатов работы, результаты и выводы, список использованных
источников и приложения. Основное содержание работы изложено на 100 страницах, включая 30 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 175 наименований.
МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
Теоретические и экспериментальные исследования проведены в соответствии с поставленными задачами на кафедре «Бионанотехнология» Федерального Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Общая схема проведения исследований приведена на
рис. 1. Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов.
На первом этапе для формулировки цели и задач собственных исследований проводили анализ доступной отечественной и зарубежной информации по
теме диссертационного исследования.
На втором этапе проводили анализ нуклеотидных последовательностей,
которые M o i y r послужить универсальной ДНК-мишенью при разработке методики идентификации плодово-ягодного сырья. Проведено исследование на соответствие потенциальных нуклеотидных последовательностей требованиям,
предъявляемым к ДНК-мишени.
На третьем этапе исследования с использованием компьютерной программы ClustalW (версия 2.1) проводили сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующей кластер ITS1; 5.8S рРНК;
ITS2 Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus
armeniaca, Prunus pérsica, представленных в международной базе данных
ОепВапк, с целью выявления консервативных участков нуклеотидных последовательностей для закладки родоспецифичных и видоспецифичных праймеров. Результаты этих исследований положены в основу конструирования праймеров.
Четвертый этап посвящен оптимизации параметров амплификации. Оптимизировали последовательности праймеров с целью повышения температуры
отжига и увеличения специфичности получаемого ПЦР-продукта.
На пятом этапе проводили оценку специфичности ПЦР в сравнении с
классическими физико-химическими методами. Исследовали специфичность
парагаельной идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum,
Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica, a так же пищевых продуктов, изготовленных на их основе с использованием физико-химических методов и методики на основе ПЦР.
Разработка ПЦР-тест-систем
для идентификации плодово-ягодного сырья
Анализ отечественной и зарубежной литературы,
обоснование цели и формулировка задач исследований
Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК Fragaria
moschata, Pyrus, Malus, Ribes
nigrum, Vaccinium myrtillus.
Prunus armeniaca,
Prunus pérsica
данных GeneBank
- нуклеотидные последовательности
- последовательности KJiaciepa
ITSl; 5.8S рРНК; ITS2
-секвенирование
- филогенетический анализ
Конструирование универсальных праймеров для амплификации кластера ITS1; 5.8S рРНК;
ITS2 Fragaria moschata, Pyrus,
Malus, Ribes nigrum, Vaccinium
myrtillm, Prunus armeniaca,
Prunus pérsica
- последовательность нуклеотидов
- расчетная длина ПЦР ампликонов
- электрофореграмма продуктов
амплификации
• температура отжига
Определение оптимальных параметров проведения ПЦР для
идентификации Fragaria
moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus
armeniaca, Prunus pérsica
• температура отжига праймеров
• температура денатурации
• продолжительность денатурации
• количество циклов амплификации
Сравнение специфичности ПЦР
идентификации плодовоягодного сырья и физикохимических методов
- массовая доля сухих веществ
- массовая доля золы
- массовая доля яблочной кислоты
- массовая доля лимонной кислоты
- длина ПЦР ампликонов
Практическая реализация результатов исследований
Рис. 1. Общая схема проведения исследований
Заключительный этап связан с освоением и внедрением разработанной
ПЦР-тест-системы в аккредитованной испытательной лаборатории Научнообразовательного центра ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (аттестат аккредитации испытательной лаборатории № РОСС RU.0001.2inm08 от 01.06.09 г.), а также расчетом стоимости
разработанной тест-системы.
При проведении исследований использовали общепринятые, стандартные, оригинальные методы исследований, в том числе физико-химические,
биохимические, микроскопические и другие. Отбор проб и подготовку их к
анализу проводили по ГОСТ 26313-84.
Физико-химические показатели определяли по стандартным методикам:
массовую долю сухих веществ определяли по ГОСТ 28562-90, титруемую кислотность определяли по ГОСТ 25555.0-82, минеральные примеси определяли
по ГОСТ 25555.3-82.
Для определения содержания органических кислот использовали систему
капиллярного электрофореза «Капель-105». Метод основан на миграции и разделении анионных форм анализируемых компонентов под действием электрического поля вследствие их различной элекгрофоретической подвижности по МВИ
М 04-47-2007 «Определение органических кислот в безалкогольных и алкогольных напитках».
Дтя проведения экстракции ДНК использовали коммерческий набор реагентов "Сорб-ГМО-А" (ЗАО «Синтол», Москва). Для амплификации использовали «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ» (ЗАО «Синтол», Москва).
Собственно реакцию проводили в термоциклере (амплификаторе) «Терцик»
(ДНК-технология, Россия) с применением функции активного точного регулирования температуры, по следующей программе: 95^0 - 200 сек - 1цикл, 64°С 50
сек; gS^C 20 сек - 35 циклов, ITC - 120 сек - 1 цикл. Детекцию продуктов реакции амплификации проводили при помощи электрофореза в агарозном геле. Для проверки достоверности получаемых результатов в одну из лунок помещали 1000 п.н. ДНК-маркер («Сибэнзим», Новосибирск).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК Fragaria moschata, Pyrus,
Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica
Проведен поиск потенциальных нуклеотидных последовательностей, которые могут послужить универсальной ДНК-мишенью при разработке методики идентификации указанных образцов плодово-ягодного сырья. Поиск нуклеотидных последовательностей растительных геномов проводили по базе данных
GeneBank.
Для того, чтобы можно было оценить использование ДНК-мишени для
построения универсальных праймеров по длине сегмента ДНК после проведения полимеразной цепной реакции, выбранные презентативные нуклеотидные
последовательности проанализированы и сведены в табл. 1.
Таблица 1
Наименование
Величина нуклеотидной последовательности, п.н.
гена и межчерная
генньпс облас- груша персик абрикос черника
яблоко клубника
смородина
тей
417
447
402
442
883
418
72
39
188рРНК
1063 1063
1063
1063
1063
1063
1Т81;5.88
571
585
596
724
628
436
625
рРНК; 1Т82
268 рРНК
294
290
36
487
37
р8ЬА-1тН
269
263
152
292
тPHK-Leu
564
572
86
478
(1пЛ)
(рзЬА) ген
942
1062
1062
1062
тРНК-С1у
735
737
691
(1тО) ген
1гп8-1тО
394
677
672
661
670
тPHK-Leu
564
568
578
86
475
(1пЛ) ген
«-» - нуклеотидные последовательности отсутствуют в геномной базе данных
Анализ данных, представленных в табл.1, указывает на то, что нуклеотидные последовательности гена т Р Ж - Ь е и (tmL), тРНК-Gly (tmG), (psbA),
тРНК -Leu (tmL) ген, 18S рРНК и межгенных областей tmL-tmF и psbA-tmH
недостаточно изучены. Имеющиеся последовательности свидетельствзтот о
низкой родовой дифференциации и, как следствие, не возможности их использования в качестве ДНК-мишени. Нуклеотидные последовательности кластера
ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 обеспечивают значительную родовую и видовую дифференциацию и могут быть рекомендованы к использованию в качестве /ЩКмишени.
Анализ всех нуклеотидных последовательностей свидетельствует о том,
что кластер ITS1; 5.8S р Р Ш ; ITS2 содержит наибольшее количество нуклеотидных остатков - гуанина и цитозина. При технологической тепловой обработке данная ДНК-мишень будет сохраняться в продукте в неизменном виде.
Таким образом, кластер ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 является единственной ДНКмишенью, которая соответствует всем предъявляемым требованиям.
С целью конструирования родо- видоспецифичных праймеров проведен
сравнительный анализ семи полных нуклеотидных последовательностей кластера ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum,
Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica (табл. 2).
Таблица 2
X
Номер последовательности кластера ITS 1; 5.8S рРНК; ITS2
D000627
EF211085
FJ356165
Н0836652
EU 150086.1
AJ297579.1
GU361894
л. л.
—
Название организма
Персик {Prunus pérsica)
Абрикос (Prunus armeniaca)
Клубника (Fragaria moschata)
Яблоко (Malus)
Г^уша (Pvrus)
Черная смородина (Ribes nigrum)
Черника (Vaccinium myrtillus)
после ИЦаТСЛЬПШК^ апшхп^^а.
i
ITS1; 5.8S рРНК; ITS2, имеющихся в современных банках данных, выбраны
наиболее консервативные участки в пределах отдельных родов, подходящие
для создания нуклеотидных праймеров. Для повышения специфичности нуклеотидные последовательности в регаонах, соответствующих позициям праймеров, детально проанализированы с целью выявления нуклеотидных замен.
Для проверки последовательностей, полученных при анализе геномной
базы данных, проведено секвенирование исследуемых образцов, предоставленных Крымским селекционнью центром ТАВРИШ" (Крымск) (совместно с Государственным
научным
учреждением
«Всероссийский
научноисследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии»). ДНК выделяли по стандартной методике с помощью набора ДНК-ЭкстранЗ (ЗАО «Синтол», Москва). Амплификацию проводили по программе: 95°С-3 мин - 1
цикл, 95°С-30 с - 30 циклов, IT'C - 7 мин - 1 цикл. Обнаружены нуклеотидные
замены в последовательности Prunus pérsica var.Maria Bianca и Prunus pérsica
var.Redhaven. В последовательности GAACGAGAGAGCGCATCGTCCC, представленной в геномной базе данных - нет вставки GTC.
Выбранные нами нуклеотидные последовательности использованы для
сравнительного филогенетического анализа, результаты которого отражены на
рис. 2.
ЛчХ»^. Рис.
2.
Филогенетическое
дерево, основанное на анализе
структур фрагментов кластера
ITS1;
5.8S
рРНК;
ITS2,
отражающее
родственные
связи исследуемых образцов, а
именно видов:
1 - Prunus pérsica-,
2 - Prunus armeniaca;
3 - Pyrus; 4 - Malus;
5 - Fragaria moschata;
6 - Ribes nigrum
10
Таким образом, мы получили три кластера. В первый вошли Prunus pérsica и Prunus armeniaca (DQ00627, EF211085), во второй - Malus и Pyrus
(HQ836652, ЕШ50086.1), в третий - Fragaria moschata, Ribes nigrum и
Vaccinium myrtillus (FJ356165, AJ297579.1, GU361894). Следовательно, необходимо разработать как родо- как и видоспецифичные праймеры для идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus
armeniaca, Prunus pérsica в продуктах питания.
Конструирование универсальных праймеров для амплификации кластера
ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum,
Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica
По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей кластера ITS1; 5.8S рРНК; ITS2 разработаны следующие праймеры:
Pap527-549F; ATG СТС GTT GTC ССС П Т АТС С
Pap527-549R; CGT TGA AAG CCG AGG GGG AG
Расчетная величина амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности составляет для Pyrus - 507 п.н.; Ribes nigrum - 610 п.н.; Malus 529 п.н.; Fragaria moschata - 562 п.н.; Prunus armeniaca - 527 п.н. Vaccinium
myrtillus и Prunus pérsica не реагируют с данной парой праймеров.
На рис. 3 видно, что в дорожке геля №1 наблюдается фрагмент размера
507 п.н., соответствующий Pyrus-, в №2 - 610 п.н., соответствующий Ribes nigrum- в №3 - 529 п.н., соответствующий Malus; в №4 - 562 п.н., соответствующий Fragaria moschata-, в №5 отсутствуют продукты амплификации; в №6 - 527
п.н., соответствующий Prunus armeniaca', в №7, как и ожидалось - нет продукта
амплификации. Экспериментальные данные показывают, что при работе с данной парой праймеров, нельзя идентифицировать Malus и Prunus armeniaca при
совместном прис)'тствии.
600
П.Н.-
500 П.Н.-
Рис. 3, Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента кластера ITS1; 5.8S рРНК;
ITS2 с использованием синтезированных
родоспецифичных
праймеров
Pap527-549F
и
Pap527-549R: М - маркер молекулярного веса; 1 - Pyrus-,
2 - Ribes nigrum-, 3 - Malus-,
4 - Fragaria moschata-, 5 - Prunus
pérsica-, 6 - Prunus armeniaca-,
7 - Vaccinium myrtillus
Обоснованная специфичность данной пары родоспепичных праймеров
подтверждена экспериментально на образцах фруктов и ягод, из которых приготовлены фруктово-ягодные смеси, содержащие от 0,01 до 100% исследуемых
11
видов фруктов и ягод, которые разделены на несколько опытных групп в зависимости от способа обработки.
Рис. 4. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента кластера ITS1; 5.8S
рРНК; ITS2 яблока с использованием пары
родоспецифичных праймеров Pap527-549F и
Pap527-549R; М - маркер молекулярного веса;
1 - смесь Malus (0,01%) и Prunus pérsica-,
2 - смесь Malus (90,0%) и Prunus pérsica-,
3 - смесь Malus (90,0%) и Prunus pérsica после термической обработки при 90°С в течение 30 минут, включая процедуру автоклавирования (120°С, 2 атм.)
На рис. 4 видно, что фрагменты ДНК искомого размера (529 п.н.) наблюдаются во всех дорожках агарозного геля, куда нанесены пробы ДНК Malus, не
зависимо от концентрации, состава смеси и термической обработки.
В связи с этим разработана пара праймеров для идентификации Prunus
pérsica в продуктах питания:
Pp289F: GAA CG А GAG AGC GCG TCG ТС
Pp289R: GCC GAG GAC TTG GTA TTT ATT CCA А
Величина амплифицирующего участка составляет 289 п.н. Температура
отжига составляет 65,0°С для For-праймера и 64,0°С для Rev-праймера. Также
разработана пара праймеров для идентификации Prunus armeniaca, поскольку
при работе Pap527-549F и Pap527-549R пары праймеров величины амплифицируемых фрагментов для Prunus armeniaca и Malus аналогичны.
Pa319F: AGT ТСА TAC ССТ ТСС GGG CGT
РаЗ 19R: GCA ТТТ TAT GCC AAC CGC GCG АСА A
Величина амплифицирующего участка составляет 319 п.н. Температура
отжига составляет 63,0°С для For-праймера и 67,0°С для Rev-праймера. Все
праймеры были проверены на специфичность.
Обоснованная специфичность данных пар видоспецифичных праймеров
была подтверждена экспериментально на самостоятельно полученных препаратах ДНК Prunus armeniaca и Prunus pérsica.
На рис. 5 видно, что при использовании пар видоспецифичных праймеров
Pp289F-Pp289R и Pa319F-Pa319R в дорожке, куда была нанесена проба ДНК
Prunus pérsica, размер продукта амплификации составляет 289 п.н.; в дорожке,
куда была нанесена проба ДНК Prunus armeniaca, размер продукта амплификации составляет 319 п.н. Следовательно, пара праймеров Pp289F-Pp289R и
Pa319F-Pa319R позволяет проводить идентификацию Prunus pérsica и Prunus
armeniaca при совместном присутствии в объекте исследования.
12
Рис. 5. Электрофореграмма проов
амплификации
фрагмента
тера ITS1; 5,8S рРНК; ITS2 с
|Льзованием пар видоспецифичных
:меров Pp289F-Pp289R и Ра319Р9R: М - маркер молекулярного веса;
runus pérsica-, 2 - Prunus armeniaca
300 П . Н . 200 п.н,-
Проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей кластера
ITS1; 5,8S рРНК; ITS2 Ribes nigrum и Vaccinium myrtillus, несмотря на таксонометрические отличия, нуклеотидные последовательности кластера ITS1; 5,8S
рРНК; ITS2 для них идентичны. Таким образом, разработана пара праймеров
для определения Vaccinium myrtillus и Ribes nigrum-.
Pch503F: GCC TAG С AG AAC GAC CCG T
Pch503R: CCG TGC GCG GTC GGC СТА А
По расчетным данным длина амплифицируемого участка кластера ITS 1;
5,88 рРНК; ITS2 для ДНК Ribes nigrum составляет 482 п.н., для ДНК Vaccinium
myrtillus - 503 п.н.
Полученные экспериментальные данные позволяют утверждать, что
сконструированная и исследованная нами система праймеров для выявления
кластера ITS1; 5,8S рРНК; ITS2, может быть использована для идентификации
Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica.
Определение оптимальных параметров проведения ПЦР для
идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium
myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica
Известно, что эффективность проведения полимеразной цепной реакции
зависит от температуры отжига праймеров, их количества и концентрации ионов Mg^"^. При выборе условий ПЦР проводили в реакционном буфере содержащем фиксированную концентрацию ионов Mg^'^.
Таким образом подбор условий ПЦР свелся к варьированию таких параметров, как температура отжига праймеров, температура денатурации, продолжительность денатурации и количество циклов амплификации.
В процессе оценки параметров учитывали наличие или отсутствие фоновой амплификации, наличие дополнительных продуктов амплификации. Результаты представлены в табл. 3-5. Эффективность амплификации при разных температурах отжига изучали отдельно для каждой пары праймеров.
13
Таблица 3
Влияние параметров проведения амплификации при использовании
Температура
Температура отжига праймеров.
Наименование
денатурации
, С
образцов иссле94
95
93
65
64
63
дования
62
+
+
+
Prunus pérsica
+
+
+
Malus
+
+
+
Pyrus
+
_
_
+
+
Ribes nigmm
+
+
Fragaria moschata
Полученные экспериментальные данные указывают, что при использовании праймеров Pap527-549F-Pap527-549R амплификацию следует проводить по
следующей схеме: 95°С - 200 с - 1цикл, 64°С 50 с; 95°С 20 с - 35 циклов, 72°С 120 с - 1 цикл.
Таблица 4
Влияние параметров проведения амплификации при использовании пар
Температура
Температура отжига праймеров,
Наименование
денатурации, °С
образцов иссле94
95
93
67
66
65
64
дования
63
+
+
+
Prunus pérsica
+
+
+
+
+
Prunus armeniaca
Полученные экспериментальные данные указывают, что при использовании пар видоспецифичных праймеров Рр289Р-Рр289К и Ра319Р-Ра319К амплификацию следует проводить по следующей схеме: 95°С - 200 с - 1цикл, 65-66°С
50 с; 95°С 20 с - 35 циклов, 72°С -120 с - 1 цикл.
Таблица 5
Влияние параметров проведения амплификации при использовании
Наименование образцов исследования
Ribes nigrum
Vaccinium myrtillus
Наименование образцов исследования
Ribes nigrum
Vaccinium myrtillus
Температура отжига праймеров, °С
62
61
64
63
66
65
+
+
+
Температура денатурации, °С
-
93
-
+
-
-
-
-
94
-
-
-
95
+
+
НИИ праймеров РсЬ503Р - РсЬ503К амплификацию следует проводить по следующей схеме: 95°С - 200 с - 1цикл, 64°С 50 с; 95°С 30 с - 35 циклов, 72°С - 120
с - 1 ЦИ1СЛ.
14
Сравнение специфичности ПЦР-ндентнфнкации плодово-ягодного сырья
н физико-химнческих методов
Проведено исследование по идентификации плодово-ягодного сырья в
образцах повидла из абрикоса. Результаты опыта по параллельной идентификации плодово-ягодного состава повидла физико-химическими методами и с помощью ПЦР-метода исследования показаны в табл. 6.
Таблица б
Результаты параллельной идентификации плодово-ягодного состава повидла
№
п/п
Эксперимент
Метод анализа
Показатель
1
ГОСТ 28562-90
Рефрактометрия
Массовая доля
растворимых
сухих веществ,%
61
65
2
ГОСТ 25555.382
Флотация
Массовая доля
минеральных
примесей, %
0,05
0,04
3
М В И М 04-472007
Капиллярный
электрофорез
Хяблочной к-ты^
^лимонной к-ты
23,18
0,48
Норма
Заключение по
составу повидла
Соответствует
ГОСТ Р 51934,
нет данных
по составу
продукта
Соответствует
ГОСТ Р 51934,
нет данных
по составу
продукта
Нельзя сделать
заключение
0 составе
прод>тсга
Длина ПЦР
Содержит
ампликонов,
319 п.н. 319 п.н.
абрикос
П.н.
Повидло из абрикоса должно соответствовать ГОСТ Р 51934-2002 «Повидло. Технические условия» и может содержать в своем составе до 40% яблочного сока. Исследования, проведенные согласно действующей документации (рефрактометрия и флотация) подтверждают, что данный продукт соответствует требованиям. Сделать заключение о составе продукта по экспериментальным данным нельзя.
Нами предпринята попытка идентифицировать состав повидла по профилю органических кислот. Для этого бьши приготовлены контрольные образцы
абрикосового повидла в лабораторных условиях. В контрольном образце «повидло из абрикоса» отношение яблочной и лимонной кислот составляет 23,18, в
исследуемом образце повидла - Х,блочной к-™/ Хл„„онной к-ты = 0,48. Однако сделать
однозначное заключение о содержании абрикоса в абрикосом повидле в данном
случае нельзя, поскольку возможно, что в качестве регулятора кислотности была использована органическая кислота (например, лимонная кислота), что соответствует ГОСТ Р 51934-2002, п.4.3.1.
4
ПЦР-тестсистема
15
Из представленных данных видно, что использование классических физико-химических методов при идентификации плодово-ягодного сырья не дает
однозначных результатов о составе продукта.
Суммируя вышесказанное, можно заключить, что результаты идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus
armeniaca, Prunus persica, полученные с использованием полимеразной цепной
реакции, превосходят результаты классических физико-химических методов
идентификации плодово-ягодного сырья в продуктах питания, поскольку позволяют сократить время и расходы на проведение одного исследования.
ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
Тест-система представлена в виде готовых пробирок с реакционной смесью и необходимыми положительными и отрицательными контрольными образцами, в которые требуется только внести образец ДНК. Такая форма снижает вероятность ошибок оператора и риск контаминации реактивов при приготовлении смеси, повышает воспроизводимость результатов, а также уменьшает
время и трудоемкость анализа. Тест-система для идентификации плодовоягодного сырья в продуктах питания позволяет провести исследования по следующей схеме, представленной на рис. 6.
выделенпе распггельной ДНК
^
*
~
610П.Н.
черная смородрпга
=
507 п.н:
груша
4
~ ~
нет продуктов амплификящш
562П.Н.
кл>^нпка
щзоведешге ПЦР с Pap527-.549F
- Pap527-549R
*
электрофорез в агарозном геле
528 П.Н.
проведение
ГЩРсРсЬ503РPch503R
электрофорез в
агарозном геле
••
503П.Н.
проведение
ГЩРсРр289КPp2S9R
проведение ПЦР с
Pa319F-Pa319R
t
электрофорез в
агарочном геле
электрофорез в агарозном
геле
Ч
289 П . Н .
•
I
черника
319П.Н.
персик
абрпкос
нет п. а.
+
яблоко
Рис. 6. Этапы идентификации плодово-ягодного сырья
Отличительными особенностями набора тест-систем является наличие
родо- и видоспецифичных праймеров, специально подобранных для кластера
16
ITSl; 5,8S р Р Ж ; ITS2 Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium
myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica.
ВЫВОДЫ
1. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей ДНК Fragaria
moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca,
Prunus pérsica, произведен выбор презентативной ДНК-мишени на основе данньк о размерах нуклеотидных последовательностей и соответствии требованиям, предъявляемым к ДНК-мишени. Установлено, что нуклеотидные последовательности кластера ITS1; 5.8S р Р Ж ; ITS2 обеспечивают значительную родовую дифференциацию и обладают наибольшей термоустойчивостью и, следовательно, могут быть рекомендованы к использованию в качестве ДНКмишени.
2. Сконструированы и синтезированы родо- и видоспецифичные праймеры для амплификации кластера 1TS1; 5.8S рРНК; ITS2 Fragaria moschata, Pyrus,
Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus armeniaca, Prunus pérsica.
3. Определены оптимальные параметры проведения ПЦР для идентификации Fragaria moschata, Pyrus, Malus, Ribes nigrum, Vaccinium myrtillus, Prunus
armeniaca, Prunus pérsica.
При идентификации Prunus pérsica, Malus, Pyrus, Ribes nigrum. Fragaria
moschata амплификацию следует проводить по следующей схеме: 95°С - 200 с 1цикл, 64°С 50 с; 95°С 20 с - 35 циклов, 12°С. - 120 с - 1 цикл. При идентификации Prunus pérsica, Prunus armeniaca - 95°C - 200 с - 1цикл, б5-66°С 50 с; 95°С
20 с - 35 циклов, 72°С - 120 с - 1 цикл. При идентификации Ribes nigrum,
Vaccinium myrtillus - 95°C - 200 с - 1цикл, 64°C 50 с; 95°C 30 с - 35 циклов, 72°С 120 с - 1 цикл.
4. Проведена сравнительная оценка специфичности ПЦР с физикохимическими методами исследования. Идентификации плодово-ягодного сырья
в продуктах питания с использованием полимеразной цепной реакции позволяет сократить время и расходы на проведение одного исследования.
5. Разработана тест-система для идентификации плодово-ягодного сырья
в продуктах питания, что позволит совершенствовать контроль за качеством
продуктов питания на основе растительного, сырья.
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и
научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», ГК№
14.740.11.1219.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНО
В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ
В журналах, рекомендованных экспертным советом ВАК РФ:
1. Остроумов, л.А. Метод выделения растительной ДНК из растений и
продуктов питания на их основе / Л.А. Остроумов, А.Ю. Просеков, А.Н. Архи-
17
пов, O.B. Мудрикова // Известия Самарского научного центра РАН, 2010.Т.12.-№4(3).-С. 722-724.
2. Архипов, А.Н. Сравнительный анализ геномов организмов, используемых Б производстве пищевых добавок / А.Н. Архипов, О.В. Мудрикова, H.A.
Масунов // Техника и технология пищевых производств.- 2010.- № 4.- С. 77-81.
3. Просеков, А.Ю. Методы ДНК-технологии для идентификации растительного сырья в молочных продуктах/ А.Ю. Просеков, О.В. Мудрикова, A.B.
Булавина, А.Н. Архипов // Молочная промышленность.- 2011.- № 12.- С. 62-63.
Статьи в других журналах и сборниках материалов конференций:
1. Мудрикова, О.В. ПЦР-тест-системы для видовой идентификации и
количественной оценки плодово-ягодного сырья в полуфабрикатах и готовой
продукции // Пищевые продукты и здоровье человека: материалы III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых.- Кемерово,
2010.- С.42.
2. Мудрикова, О.В. Молекулярно-генетическая родовая идентификация
рода Malus / O.B. Мудрикова, А.Ю. Просеков // Интеллект и наука: материалы
X Международной научно-практической конференции (г. Железногорск, 28-29
апреля 2010 г.).- Красноярск: ИПК СФУ.- 2010.- С. 238.
3. Просеков, А.Ю. Разработка методики определения качества плодовоягодного сырья / А.Ю. Просеков, О.В. Мудрикова // Инновационные технологии в пищевой промышленности: материалы IX Международной научнопракгической конференции (7-8 октября 2010г., г. Минск).- Минск: РУП "Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию".- 2010.- С.289-290.
4. Мудрикова, О.В. Филогенетический ананиз для экспертизы качества
продуктов питания на основе сравнительного анализа геномов / О.В. Мудрикова, С.А. Сухих, К.В. Беспоместных // Биотехнология растительного сырья,
качество и безопасность пищевых продуктов: материалы Всероссийской научно-практической конференции.- Иркутск: ИрГТУ, 2010.- С 204-205.
5. Мудрикова, О.В. Использование ДНК-фингерпринтинга для генетической идентификации сырья пищевой промышленности / О.В. Мудрикова,
А.Ю. Просеков // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и
клинической медицине: материалы I Международной научно-практической
конференции (17-19 ноября) / под общей ред. В.В. Уйба.- М.: Парк-медиа.2010.- С.ПЗ.
6. Мудрикова, О.В. Исследование эволюции растительного сырья для
пищевой промышленности с использованием повторяющихся последовательностей / О.В. Мудрикова, А.Ю. Просеков // Актуальные проблемы биохимии и
бионанотехнологий: материалы I Всероссийской Интернет-конференции (17-22
ноября). Казань, 2010.- С.112.
7. Архипов, H.A. Компьютерный поиск мишеней для ПЦР в пищевои
промышленности / А.Н. Архипов, О.В. Мудрикова, H.A. Масунов // Прогрессивные технологии и перспективы развития: материалы II Международной научно-практической конференции. Тад1бов: ООО «ТР-Принт», 2010.- С.143-144.
18
8. Архипов, H.A. Внедрение ПЦР в пищевой промышленности: проблемы
и перспективы / H.A. Архипов, О.В. Мудрикова // Наука в современной мире:
материалы Ш Международной научно-практической конференции (30 октября)
/ под ред. Г.Ф.Гребенщикова.- М.: Издательство «Перо», 2010.- С. 10-13.
9. Мудрикова, О.В. ПЦР-маркеры для видовой дифференциации персика
и абрикоса / О.В. Мудрикова, А.Ю. Просеков, Ю.В. Мудрикова // Биология Наука XXI века: материалы XV Международной школы-конференции молодых
ученых." Пущино: Пущинский научный центр РАН, 2011.- С. 282-283.
Отчеты по НИР
1. Разработка методов выявления фальсификации и идентификации продукции на растительной основе / О.В. Мудрикова // Научно-технический отчет
по государственному контракту №14.740.11.1219 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (1-ый этап, Ж110707120514).- Кемерово, 2011.- 72 с.
2. Разработка методов выявления фальсификации и идентификации продукции на растительной основе / О.В. Мудрикова // Научно-технический отчет
по государственному контракту №14.740.11.1219 в рамках федеральной целевой про1раммы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (2-ой этап, ИК01040412191).- Кемерово, 2011.- 65 с.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
п.н. - пар нутслеотидов
п.а. - продукт амплификации
Подписано в печать 29.12.11. Формат 60x86/16. Тираж 80 экз. Объем 1,1 п.л. Заказ №157.
Отпечатано в редакционно-издательском центре КемТИПП.
650010, г. Кемерово, ул. Красноармейская, 52