Тема: Микробиологические методы диагностики

Е.Г. Волина, А.П. Аллилуев, Л.Е. Саруханова
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
К ПРОВЕДЕНИЮ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ
(подготовлены на кафедре микробиологии)
Для студентов, аспирантов и преподавателей
медицинского факультета
Москва
2006
Тема: Микробиологические методы диагностики менингококковой
инфекции.
Цель занятия:
1.Знать правила взятия и транспортировки в лабораторию исследуемого
материала, схемы микробиологического исследования при менингококковой
инфекции, диагностические, профилактические и лечебные бактерийные
препараты.
2.Уметь использовать микробиологические методы для диагностики
менингококковой инфекции.
Самостоятельная работа:
1. Изучить морфологию менингококка в мазках, окрашенных по Граму, из
чистой культуры и спинномозговой жидкости (СМЖ) от больного.
2. Изучить схему микробиологической диагностики менингококковой
инфекции.
3. Поставить реакцию латекс-агглютинации (РЛА) с целью обнаружения
менингококкового антигена в СМЖ, произвести учет результатов PЛA и
сделать заключение.
Методические указания к выполнению самостоятельной работы
Задание 1. Освоить правила взятия и транспортировки в лабораторию
исследуемого материала.
Менингококк - Neisseria meningitidis относится к роду Neisseria,
семейству Neisseriaceae. Он является возбудителем менингококковой
инфекции.
При цереброспинальном менингите основным исследуемым материалом
является спинномозговая жидкость. Ее берут асептически путем люмбальной
пункции в количестве 2-5 мл. Спинномозговую жидкость доставляют в
лабораторию в изотермических сосудах и немедленно исследуют. Пробы
спинномозговой жидкости исследуют в двух направлениях: 1) проводят общее
ликворологическое
исследование,
анализируют
количественными
цитологическим и биохимическим методами; 2) проводят микробиологические
исследования микроскопическим, бактериологическим и серологическим
методами.
Исследуемый материал из носоглотки берут изогнутыми проволочными
тампонами. Носоглоточную слизь берут с задней стенки носоглотки при
визуальном контроле, вводя тампон за мягкое небо. При исследовании слизи
применяют только бактериологический метод. От трупа исследуемый материал
(гной с мозговых оболочек, из кожных поражений и др.) изучают только
микроскопическим методом.
Задание 2. Изучить морфологию менингококка, промикроскопировать и
зарисовать готовые мазки: l) Neisseria meningitidis в чистой культуре, окраска
по Граму и метиленовой синькой; 2) Neisseria meningitidis в спинномозговой
жидкости, окраска метиленовой синькой; 3)люминесцентная микроскопия
мазков Neisseria memngitidis в спинномозговой жидкости при обработке
флуоресцирующей противоменингококковой сывороткой (РИФ).
Для прямого микроскопического исследования спинномозговой
жидкости, крови и трупного материала готовят мазки, затем их высушивают,
фиксируют и окрашивают по Граму или метиленовой синькой для выявления
присутствующих микроорганизмов и определения их концентрации. В случае
получения прозрачной спинномозговой жидкости ее центрифугируют при 3,5
тыс. оборотов в минуту в течение 5 минут и готовят мазки из осадка.
При микроскопии мазков СМЖ в положительных случаях наблюдают
гнойные клетки полинуклеары, эритроциты, фибрин и др., а менингококки
выглядят в виде типичных грамотрицательных диплококков бобовидной
формы. Клетки менингококка имеют капсулы. Они выявляются в виде плохо
окрашенного ореола. В мазках, окрашенных метиленовой синькой, хорошо
видны лейкоциты и менингококки, располагающиеся кучками, тетрадами,
парно и по одному.
Клетки менингококка имеют округлую форму - 0,6-1,0 мкм в диаметре и
располагаются попарно. Поверхности, обращенные друг к другу, вогнутые или
ровные. Клетки полиморфны. Величина отдельных клеток может значительно
варьировать: наряду с обычными менингококками в препарате могут быть
крупные (в 5-6 раз). Грамотрицательны. Они не имеют жгутиков и не образуют
спор.
Люминесцентная
микроскопия
мазков,
обработанных
флуоресцирующими противоменингококковыми сыворотками (прямая реакция
иммунофлуоресценции - РИФ) применяется как метод экспресс - диагностики.
Задание 3. Изучить схему микробиологической диагностики при
менингококковой инфекции.
Микробиологическая
диагностика
менингококковой
инфекции
проводится с использованием микроскопического, бактериологического и
серологического методов (таблица №1, схема № 1).
В предложенных схемах представлены основные этапы этих
исследований.
Схема № 1. Микробиологическое исследование при менингококковой
инфекции
Исследуемый материал:
Ликвор, кровь, гной,
экссудат, носоглоточная
слизь
Кровь,
Ликвор
Окраска
Первичный посев
Обнаружение
по Граму,
на среды:
антигена
метиленовой 1. шоколадный агар
(экспресссинькой
2. сывороточный
диагностика)
агар
РИФ
3.селективные среды
с антибиотиками
Выделение чистой
культуры
Идентификация
чистой культуры
по свойствам:
1. Изучение морфологии
2. Посев на "пестрый ряд"
3. Определение антигенной
структуры –
р. агглютинации,
р. микропреципитации в геле, иммуноферментный анализ
(ИФА)
4 . Серотипирование
культуры
5. Определение чувствительности к антибиотикам
1. Реакция
встречного
иммуноэлектрофореза
2. Реакция
латекс-агглютинации
3. Реакция иммунофлуоресценции
4. Радиоиммунный анализ
5. РНГА
6. Реакция коагглютинации
7. ИФА
Сыворотка
крови
Обнаружение
антител:
РНГА с
менингококковыми
эритроцитарными
диагностикумами
серогрупп
А, В, С
Таблица 1.
Схема лабораторной диагностики при менингококковой инфекции
Исследуемый
материал
Метод исследования
Результат
1
2
3
Спинномозговая
жидкость,
кровь, гной с
мозговых
оболочек, из
кожных
петехий,
носоглоточная
слизь
Микроскопический
Приготовление мазков,
окраска по Граму,
метиленовой синькой и др.
Бактериологический
Посев на сывороточный,
Mieller Hinton Agar,
"шоколадный" агар и др.,
полужидкий агар (среда
"обогащения"), на среды с
ристомицином или
линкомицином (для
подавления роста
грамположительных кокков)
Грамотрицательные
диплококки бобовидной
формы с нежной капсулой
Нежные, сероватого цвета, с
блестящей поверхностью,
ровными краями,
маслянистой консистенции
колонии
Нежный рост
Отсев колоний на скошенный
сывороточный агар
Микроскопия мазка из чистой Грамотрицательные
культуры
диплококки
Посев на "пестрый ряд" с
сахарами (глюкоза, мальтоза)
Ферментация глюкозы и
мальтозы с образованием
кислоты
Серологическая
идентификация
в реакции агглютинации на
стекле с
группоспецифическими
сыворотками А, В, С, X, Y,Z,
29Е, W135и др.
Реакция положительная с
одной из
группоспецифических
сывороток
Реакция микропреципитации
в агаре для определения
серогруппы менингококка
Положительная
(линия преципитации)
Продолжение таблицы 1.
1
2
Определение чувствительности
к антибиотикам
Спинномозговая Серологический
жидкость
Метод встречного
иммуноэлектрофореза
для определения
менингококкового
группоспецифического
(полисахаридного) антигена
Сыворотка
РНГА с менингококковыми
крови
эритроцитарными
диагностикумами А,В и С
для обнаружения
антименингококковых антител
Ликвор, слизь
из зева и носа,
кровь, гной
Экспресс-диагностика на
основе выявления
менингококковых антигенов:
-постановка реакции
иммунофлуоресценции;
-иммуноферментный анализ;
-радиоиммунный метод;
-встречный
иммуноэлектрофорез;
-реакция агглютинации частиц
(стафилококка штамм Cowan I,
эритроцитов или частиц
латекса), фиксирующих
иммунную сыворотку
3
Учет по зоне задержки
роста
Положительная реакция
(линии преципитации)
Диагностический титр
антител в разведении
1:40-1:80 у взрослых и
детей старше трех лет,
1:20 - у детей моложе трех
лет
Учет результатов в ЛЮМ'е
зеленое свечение
менингококка
Задание 4. Исследовать ликвор больного с целью обнаружения
менингококкового антигена.
Необходимые реактивы и оборудование:
1. Диагностикум латексный антительный, жидкий, для выявления
менингококкового антигена;
2. Ликвор больного цереброспинальным менингитом;
3. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) или физиологический
раствор в качестве электролита;
4. Планшеты для иммунологических реакций;
5. Микропипетки.
В один ряд лунок с 1 по 6 планшета вносят по 0,05 мл ФСБ. Затем в 1-ю
лунку добавляют равное количество (0,05 мл) исследуемого ликвора больного в
разведении 1:2, перемешивают и путем последовательных переносов титруют
до 5-й лунки, из которой 0,05 мл смеси удаляют. Затем во все лунки вносят по
0,05 мл 0,05% раствора латексного антительного диагностикума. 6-я лунка
служит контролем диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации и не
содержит исследуемого ликвора.
Схема постановки реакции представлена в таблице 2.
Таблица 2.
Схема постановки РЛА с целью обнаружения менингококкового антигена
Ингредиенты,
мл
Номер лунки планшета
1
2
3
4
5
Фосфатно-солевой
буферный раствор
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
6
контроль
0,05
Ликвор больного 1:2
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
-
Разведение ликвора
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
Латексный
антительный
диагностикум
0,05
0,05
0,05
0,05
0,05
Конечное разведение
ликвора
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
0,05
Планшет осторожно встряхивают и оставляют при комнатной
температуре на 18-24 час. Реакцию учитывают визуально по 4-х плюсовой
системе.
За титр антигена принимают максимальное разведение исследуемого
материала (ликвора), при котором наблюдается агглютинация латекса на +++.
Сделать заключение по результатам РЛА.
Задание 5. Изучить препараты, используемые для специфической
профилактики, терапии и диагностики менингококковой инфекции.
Оснащение: набор бактерийных препаратов.
1.Вакцины менингококковые полисахаридные серогрупп А,С, А+С,
A+C+Y+W135 применяются с профилактической целью в период
эпидемического неблагополучия при показателе заболеваемости более 2,0 на
100 000 населения и с целью экстренной профилактики в очагах инфекции в
первые 5 дней после выявления первого случая заболевания генерализованной
формой менингококковой инфекции.
2.Иммуноглобулин нормальный человеческий применяется для
пассивной профилактики и лечения детей до 1 года.
3.Агтлютинирующие
группоспецифические
менингококковые
сыворотки серогрупп: анти - A, B, C, Д, X, Y, Z, W135 и 29Е и др.
используют для определения серогруппы выделенной чистой культуры.
4.Преципитирующие антименингококковые сыворотки серогрупп A, B,
C, Д, X, Y, Z, W135 и 29Е
применяют с целью обнаружения
менингококкового антигена в спинномозговой жидкости методом встречного
иммуноэлектрофореза.
5. Сыворотки диагностические менингококковые группоспецифические
преципитирующие, агглютинирующие серогрупп: A, B, C, Д, X,Y, Z, W135 и
29Е.
6. Менингококковые эритроцитарные диагностикумы серогрупп А, В и
С применяются для выявления антител при менингококковой инфекции в
реакции непрямой гемагглютинации.
Тестовый контроль
Выберите сочетание правильных ответов:
А-2,4
В - 2,4,6
С-1,4,6,8
Д-1,2,3,5,8
Е-3,4,6,8,9,10
F - все ответы правильные
I. Таксономическое положение возбудителя менингококковой инфекции:
семейство, род, вид:
1. Vibrionaceae
2. Neisseriaceae
3. Enterobacteriaceae
4. Neisseria
5. Streptococcus
6. N. meningitidis
7. Shigella
8. S. flexneri
II. Морфологические и тинкториальные свойства менингококка:
1. Грамотрицательные кокки
2. Грамположительные кокки
3. Располагаются беспорядочно
4. Диплококки
5. Подвижны
6. Неподвижны
7. Образуют споры
8. Образуют капсулы в макроорганизме
9. Не образуют спор
10.Не образуют капсулу
III. Менингококки разлагают с образованием кислоты следующие сахара:
1. лактозу
2. глюкозу
3. сахарозу
4. мальтозу
5. маннит
IV. Эпидемические серогруппы менингококков:
1-Д
2-А
3-Х
4-С
5-Y
6-B
7-Z
8 – 29E
9 – 135W
V. Исследуемый материал для микробиологической диагностики
менингококковой инфекции:
1. кровь
2. моча
3. мокрота
4. ликвор
5. испражнения
6. носоглоточная слизь
7. пищевые продукты
8. гной из мозговых оболочек
VI. Методы микробиологической диагностики менингококковой инфекции:
1.биологический
4.бактериологический
2.микроскопический 5. ксенодиагностика
3.аллергический
6.серологический
VII. Какие из перечисленных питательных сред используют для
культивирования возбудителя менингококковой инфекции:
1. сывороточный МПА
2. МПА
3. МПБ
4. “шоколадный” агар
5. среда Эндо
6. кровяной агар
7. щелочной МПА
8. сывороточный агар с антибиотиками
VIII. Для экспресс -диагностики выявления антигена возбудителя
менингококковой инфекции в ликворе и другом исследуемом материале
используются следующие методы исследования:
1. реакция агглютинации
2. реакция лизиса
3. метод встречного
иммуноэлетрофореза
4. реакция иммунофлуоресценции
5. реакция гемолиза
6. реакция коагглютинации
7. РСК
8. латекс-агглютинация
9. иммуноферментный анализ
10. радиоиммунный метод
IX. Факторы патогенности возбудителя менингококковой инфекции:
1. эндотоксин
2. фимбрии (пили)
3. капсула
4. ферменты агрессии
(гиалуронидаза, нейроминидаза)
Х. Источник возбудителя менингококковой инфекции:
1. домашние животные
2. здоровые носители
3. грызуны
4. больные генерализованными формами
5. пищевые продукты
6. больные острым назофарингитом
XI. Пути передачи возбудителя менингококковой инфекции и условия,
способствующие ее распространению:
1. алиментарный
2. воздушно-капельный
3. трансмиссивный
4. скученность людей в закрытых помещениях
5. поврежденная кожа
6. половой
XII. Основные клинические формы менингококковой инфекции:
1. назофарингит
2. кишечная форма
3. кожная форма
4. менингококкемия (септическая)
5. пневмония
6. менингит, менингоэнцефалит
7. бубонная форма
8. менингококконосительство
XIII. Постинфекционный иммунитет при генерализованных формах
менингококковой инфекции:
1. нестойкий
2. стойкий
3. клеточный
4. гуморальный
5. видовой
6. группоспецифический
XIV. Профилактические препараты, применяемые при менингококковой
инфекции:
1. живая вакцина
2. химическая вакцина
3. убитая вакцина
4. иммуноглобулин человеческий
5. иммунные сыворотки
6. анатоксин
Ответы на тестовые вопросы
I-B
II - C
III - A
IV - A
V-C
VI - B
VII - C
VIII - E
IX - F
X-B
XI - A
XII - C
XIII - B
XIV - A
Контрольные вопросы по теме:
1. Таксономическое положение возбудителя менингококковой инфекции.
2. Морфологические признаки менингококков.
3. Питательные среды для культивирования менингококков и их
культуральные свойства.
4. Антигенная структура менингококков.
5. Эпидемические серогруппы менингококков.
6. Факторы патогенности менингококков.
7. Источник инфекции при менингококковой инфекции.
8. Механизм передачи менингококковой инфекции.
9. Входные ворота возбудителя менингококковой инфекции.
10.Клинические формы менингококковой инфекции.
11.Исследуемый
материал
для
микробиологической
диагностики
менингококковой инфекции.
12.Методы микробиологической диагностики менингококковой инфекции.
13.Основные свойства менингококков, на основании которых проводят
идентификацию выделенной чистой культуры.
14.Серологические методы для обнаружения антигена менингококков.
15.Серологические методы для обнаружения антител при менингококковой
инфекции.
16.Диагностические бакпрепараты при менингококковой инфекции.
17.Специфические профилактические и лечебные препараты при
менингококковой инфекции.