Методы прямой ДНК- диагностики

ДНК-диагностика моногенных
заболеваний
А.В.Поляков
Лаборатория ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН
ДНК-диагностика
Изучает непосредственную причину заболевания
Наиболее адекватная и точная диагностика
Возможна даже в тех случаях,
когда неизвестен ген,
ответственный за заболевание
Типы ДНК-диагностики
ПРЯМАЯ
Определение мутации,
являющейся
непосредственной
причиной заболевания
КОСВЕННАЯ
Определение хромосомы,
несущей поврежденный ген
при семейном анализе
ПРЯМАЯ ДНК - ДИАГНОСТИКА
+
+
+
+
100%-ная точность
возможна при сомнительном диагнозе
возможна при полилокусном заболевании
возможна беспробандная диагностика
-
необходимо знание структуры гена
информативна не для всех семей
-
θ
КОСВЕННАЯ ДНК - ДИАГНОСТИКА
+ не требуется знание гена и спектра мутаций в
нем
+ информативны практически для всех семей абсолютная уверенность в клиническом
диагнозе
точность 95-99%
- обязательно наличие одного локуса
заболевания
- обязательно проведение семейного анализа
-
Моногенные болезни
Болезни, обусловленные мутациями в
одном гене
 Заболевания, подчиняющиеся
менделевским законам наследования
 В OMIM описано около 5 тысяч
фенотипов
 Для 3018 из них известен молекулярный
дефект

Число генов с известными
фенотипами
 2003
год ~ 1000
 2005 год – 1700
 2009 год - 3018
Типы ДНК-диагностики

Сокращение косвенных подходов

Резкое увеличение прямых методов
ДНК –диагностика
2003 год:
Европа – 400 заболеваний*
Россия – 50 заболеваний
за 2003 год в России обследовано 1000 семей
 2009 год:
Европа – 2000 заболеваний*
Россия – 220 заболеваний
за 2009 год в России обследовано ~ 6000 семей

* http://www.gendia.net/tests.html
Методы прямой ДНКдиагностики:
Количественная флюоресцентная ПЦР
Real-time ПЦР
Анализ кривой плавления
MLPA-анализ (количественная
лигазная реакция)
 Ресеквенирование




Методы прямой ДНКдиагностики:
Количественная флюоресцентная ПЦР
Real-time ПЦР
Анализ кривой плавления
MLPA-анализ (количественная
лигазная реакция)
 Ресеквенирование




ПЦР-ПДАФ (QF PCR)
 Анализ
дозы гена
 Анализ
экспрессии генов
Диагностика синдрома Дауна
методом QF-PCR
Отец
Мать
Ребенок
47,XY (+21)
Методы прямой ДНКдиагностики:
Количественная флюоресцентная ПЦР
Real-time ПЦР
Анализ кривой плавления
MLPA-анализ (количественная
лигазная реакция)
 Ресеквенирование




Применение real-time PCR в
диагностике моногенных
заболеваний

Анализ дозы гена

Определение точковых замен

Анализ экспрессии генов
Определение делеций/дупликаций
в локусе РМР22
ШМТ1А
ННПС
норма
Применение real-time PCR в
диагностике моногенных
заболеваний

Анализ дозы гена

Определение точковых замен

Анализ экспрессии генов
Диагностика
«Чувашских» болезней


Рецессивный остеопетроз; вызывается
мутацией IVS8+5g→a в гене TCIRG1;
Популяционная частота патологической
мутации среди чувашей составляет 1,7%;
расчетная частота заболевания 1:3500.
Рецессивный эритроцитоз; связан с
мутацией С598Т (Arg200Trp) в гене VHL;
Популяционная частота патологической
мутации среди чувашей составляет 2%;
расчетная частота заболевания 1:2500.
Аллельспецифический анализ
мутации С598Т гена VHL
Mut/mut
Mut/N
N/N
Применение real-time PCR в
диагностике моногенных
заболеваний

Анализ дозы гена

Определение точковых замен

Анализ экспрессии генов
Анализ экспрессии генов
Онкологические исследования
 Трисомии
 Анализ плодного материала по
кровотоку матери
 Генотерапия

Схема регистрации Fl и ∆7
мРНК гена SMN при СМА
5
6
7
5/6F
5
SMN1 = Fl
7/8R
6
5/6F
8
8
6/8R
SMN2 = ∆7
Детекция GADPH у больных СМА
К
М
П
До после
Детекция Fl у больных СМА
К
М
П
До после
Детекция Fl+∆7 у больных СМА
К
М
П
До после
Методы прямой ДНКдиагностики:
Количественная флюоресцентная ПЦР
Real-time ПЦР
Анализ кривой плавления
MLPA-анализ (количественная
лигазная реакция)
 Ресеквенирование




Melt curve analysis
Метод основан на различиях профиля кривой плавления фрагментов
ДНК после амплификации. Различие зависит от нуклеотидной
последовательности, определяющей температуру плавления и характер
кривой плавления.
F
dF
температура
температура
Рис. Генотипирование 6 различных генотипов бета-глобина (110 п.н.)
Idaho Technology (www.idahotech.com)
Анализ мутации c.807+5G>A гена
TCIRG1 при остеопетрозе
HRMCA F5 форма кривой
плавления
c. 1691G>A
c.1691G/ c.1691G
c.1691A/ c.1691G
Методы прямой ДНКдиагностики:
Количественная флюоресцентная ПЦР
Real-time ПЦР
Анализ кривой плавления
MLPA-анализ (количественная
лигазная реакция)
 Ресеквенирование




Применение MLPA в ДНКдиагностике
 Определение
числа копий
фрагмента (дозы гена)
 Анализ однонуклеотидных замен
(SNP)
Анализ дозы гена
 Носительство
Х-сцепленных
делеций для женщин
 Аутосомные делеции/дупликации
 Микроделеционные синдромы
 Анеуплоидии
 Определение числа копий
гена/псевдогена
MLPA. Количественный анализ копий
хромосомы Х человека
X
Мужчина
Женщина
ЖенщинаХХХ
MRC-Holland (www.mrc-holland.com)
MLPA. Количественный анализ
экзонов гена дистрофина
Гомозиготная делеция шести экзонов
гена DMD
1 5 4 3 2 6
Гетерозиготная делеция экзонов
1-6 гена DMD
2 6
1 5 4 3
Здоровый контроль
Здоровый контроль
2 6
3
5
1
2 6
4
3
5
1
4
Спинальная мышечная
амиотрофия
Норма
Del/SMN
Del SMNt
Del
SMNc
Анализ однонуклеотидных
замен (SNP)
 Моногенные
заболевания
 Мультифакторные
состояния
Анализ наиболее частых мутаций в
гене PAH методом ПДРФ
А) одна пара праймеров и две эндонуклеазы
рестрикции
IVS12+1g>a
Norm
R252W
R261Q
R408W
Norm
Б) две пары праймеров и одна эндонуклеаза рестрикции
11ex Norm
IVS10-11g>a
1
3ex Norm
I65T
2
3
P281L
7ex Norm
R158Q
5ex Norm
Анализ наиболее частых мутаций в гене
PAH методом MLPA
Анализ трех частых мутаций в
гене CFTR методом ПДРФ
G542X
W1282X/N
N1303K
Образец до
рестрикции
Норма
Анализ пяти частых мутаций в
гене CFTR методом MLPA
Методы прямой ДНКдиагностики:
Количественная флюоресцентная ПЦР
Real-time ПЦР
Анализ кривой плавления
MLPA-анализ (количественная
лигазная реакция)
 Ресеквенирование




ДНК-диагностика “on-line”
Клинический диагноз наследственного заболевания
ГЕН ЗАБОЛЕВАНИЯ
ИЗВЕСТЕН
Разработка диагностического протокола для каждой
конкретной семьи, даже с очень редким
наследственным заболеванием
Форма помутнения хрусталика в семье с
порошкообразной зонулярной катарактой
Сегрегационный анализ в семье
с порошкообразной зонулярной катарактой
2
1
D1S252
D1S2696
2
1
3
3
3
1
больные ПЗК
здоровые
1 3
2 3
4
2
1
2
3 3
1 3
2
1
3
3
3 1
1 2
Маркер
LOD - баллы при значениях доли рекомбинаций θ
0.00
0.01
0.05
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
D1S252
0.60
0.59
0.54
0.46
0.32
0.17
0.05
0.00
D1S2696
0.12
0.13
0.14
0.15
0.15
0.12
0.07
0.00
Анализ нуклеотидной последовательности
гена Cx50 у больного из семьи с
порошкообразной зонулярной катарактой
Замена T741G → Ile 247 Met
Перспективы
http://www.humanvariomeproject.org/
http://www.hgvs.org/
Перспективы

Ресеквенирование экзонов генов,
вовлеченных в данную патологию

Ресеквенирование всех кодирующих
последовательностей генома
Число наследственных заболеваний, для
которых возможно проведение ДНКдиагностики в лаборатории ДНКдиагностики МГНЦ РАМН
164
113
92
68
50
76
55
2009
2008
2007
2006
2005
2004
2003
39
2002
31
2001
26
2000
22
1999
19
1998
17
1997
14
1996
10
1995
5
1994
3
1993
2
1992
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Лаборатория ДНК-диагностики
Наши координаты:
115478 Москва,
Москворечье 1
МГНЦ РАМН
http://www.dnalab.ru
e-mail: info@dnalab.ru
(495) 221-90-84
(495) 324-05-01