Масс-спектрометр

реклама
Новый
протеогеномный метод
идентификации
микроорганизмов
Челябинск, 2010
• Масс-спектрометрия –
аналитический метод
измерения массы молекул или атомов анализируемого
вещества
-
• Масс-спектрометр –
инструмент, способный в условиях
вакуума разделять заряженные
частицы вещества, находящиеся
в газовой фазе, по отношению их массы к заряду (m/z)
1й этап масс-спектрометрического анализа
Мягкая ионизация - MALDI
Матрично-Активированная Лазерная Десорбция/Ионизация
МАТРИЦА:
УФ лазер
- Поглощает энергию
_лазерного излучения
Ионы аналита
Нобелевский
лауреат 2002
Измерение
ионы
матрицы
- “вскипая”, увлекает
_ в газовую фазу
_ молекулы _аналита
- способствует
_ ионизации аналита
– Циано-4-гидроксикоричная кислота
Сокристаллизованное
с матрицей вещество
NC
ОН
O
OH
2й этап масс-спектрометрического анализа
Сортировка ионов по массам по времени пролѐта (TOF)
Ускорение
Образцы
погруженного
в матрикс
аналита
на планшете
Свободный дрейф ионов
+
+ + +
+
Электроды
+
Детектор
Интенсивность
Лазерная
десорбция/ионизация
Определение времени пролѐта (TOF) t ~ m/z
ионов до детектора
Масса
t пролѐта
m/z
1 Да
100 Да
1000 Да
10 000 Да
5 х 10
50 х 10
150 х 10
500 х 10
-7
-7
-7
-7
U=20-7кВ, расстояние -1 м
сек
сек
сек
сек
Схема исследования
MALDI – ToF-MS
Пробоподготовка
Идентификация
Biotyper
a.i.
500
Пробоподготовка
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
m/z
Колония первичного посева
клинического материала
Прямое бактериальное белковое профилирование
для видовой идентификации и штаммового типирования
Характеристики исследования:
• Быстрая и простая пробоподготовка: 5 минут/образец
• Предел измерения 104-105 клеток
• Скорость измерения: ~ 1 мин / образец
• Возможность автоматизации и роботизации всех стадий исследования
Подготовка образца
Колония первичного
посева
70% этанол
Осадок в 70% муравьиную
к-ту и 50% ацетонитрил
Повторное
центрифугирование
Стальной планшет
AnchorChip – это стальная планшета, содержащая гидрофильные пятна
для образцов точно заданного размера (600 или 400 мкм), окруженные
гидрофобным покрытием.
Такое устройство планшет позволяет готовить
объемов (0.3 - 1мкл).
образцы из очень малых
Незначительное влияние состава
питательных сред на белковый профиль
Рост Pseudomonas oleovorans на различных средах
Psdm. oleovorans B396_Medium 360
1000
0
Psdm. oleovorans B396_Medium 464
1000
Воспроизводимость вне зависимости отPsdm.
источника
oleovorans B396_Medium 53
выделения, типа инструмента, лаборатории
0
1000
0
Psdm. oleovorans B396_Medium 65
1000
0
Psdm. oleovorans B396_Medium 98
1000
500
0
Psdm. oleovorans B396_MRS10
2000
1000
0
Psdm. oleovorans B396_YPD
2000
1000
0
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
m/z
Bruker Daltonics
4364.06
Рибосомальный
белок
ribosomal Protein
RL36
RS32
RL34
RL33meth.
RL32
RL30
RL35
RL29
RL31
RS21
6254.64
5380.64
5000
7157.65
7273.87
3000
6410.90
5096.01
6315.49
4000
7870.62
2000
1000
8368.99
Intens. [a.u.]
Чрезвычайно высокая воспроизводимость обусловлена
измерением мажорных рибосомальных белков
0
4000
4500
5000
5500
6000
6500
7000
7500
8000
m/z
m/z
m/z
4364,33
5095,82
5380,39
6255,39
6315,19
6410,60
7157,74
7273,45
7871,06
8368,76
Intens. [a.u.]
Прямое белковое профилирование
x10 5
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
m/z
Программное
обеспечение
BioTyper
База данных
BioTyper
3476 штаммов
Идентификация c ПО “BioTyper”
1
Суммарный спектр
Аналитическое ПО и открытая
пополняемая база данных на
3476 штаммов
Идентификация пиков
по индексу совпадения спектров
2
Исследуемый
образец
Идеально совпавшие
с базой
3
Совпавшие в более
широком диапазоне
отклонений
Несовпавшие
4
Показатель достоверности:
>2,0 – достоверная видовая идентификация
База Biotyper
1,7-2,0 - вероятная идентификация до рода
<1,7
– не идентифицирован
Neisseria
N.meningitidis
N.gonorrhoeae
E.N.Ilina et al J Mol Diagn 2009,11 (1): 75-86
Лабораторная апробация совместно
с сотрудниками
межклинической бактериологической лаборатории ММА им. И.М.Сеченова
• Проанализирован 831 посев. Идентификация проведена для 822 (99%).
_В 9 случаях скудный рост
• Расхождение с бактериологическими данными в 37 случаях (4,5%)
совпадение
данных
расхождение
данных
В 35 случаях идентификация МС (BioTyper) подтверждена секвенированием 16S RNA. В 2х случаях секвенирование подтвердило бактериологическую идентификацию.
Прямая идентификация из биологических образцов
Прямая идентификация возбудителей из мочи:
• Проанализировано 200 образцов
• Идентификация проведена для 188 образцов (94%)
• Совпадение результатов
_ с бактериологической идентификацией в 179 случаях (95,2%)
• Расхождение данных в 9 случаях (4,8%):
- в 4х случаях МС-идентификация подтверждена секвенированием
_
- в 5 случаях проведена МС-идентификация и скудный рост при
бактериологическом тестировании
Данные представлены на 19 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и
инфекционным заболеваниям, 16-19 мая 2009
Прямое белковое профилирование
a.i.
1400
1200
1000
800
600
400
200
4000
6000
8000
10000
12000
14000
m/z
Масс-спектрометрия – надежный метод идентификации микроорганизмов
с минимальными трудовыми и финансовыми затратами на
пробоподготовку и анализ
Генетически-детерминированная лекарственная устойчивость
Дикий тип
Препарат
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
МАРКЕРЫ
РЕЗИСТЕНТНОСТИ
УСТОЙЧИВЫЕ
НАРУШЕНИЯ
НУКЛЕОТИДНОЙ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
В
ОПРЕДЕЛЕННЫХ
УЧАСТКАХ
БАКТЕРИАЛЬНОГО ГЕНОМА, СВЯЗАННЫЕ С ФОРМИРОВАНИЕМ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТОМУ
ИЛИ ИНОМУ ПРОТИВОМИКРОНБОМУ ПРЕПАРАТУ
Мутантный тип
Изониазид
Мутации в генах
katG, inhA, ahpC, oxyR, furA
Рифампицин
Мутации в гене rpoB
Пиразинамид
Мутации в гене pncA
Этамбутол
Мутации в гене embB
Стрептомицин
Мутации в гене rpsL, rrs
Фторхинолоны
Мутации в генах gyrA, gyrB
Канамицин/ амикацин
Мутации в гене rrs (16S pРНК)
Исследуемый материал:
мокрота, биологические жидкости,
культура микроорганизма, т.д.
ПЦР (для накопления гена,
несущего маркерную мутацию)
Реакция
минисиквенирования
MALDI-ToF масс-спектрометрия
продуктов реакции
минисиквенирования
Получение масс-профилей
Анализ масс-спектра
и вывод о наличии
мутации, приводящей
к лекарственной
УСТОЙЧИВОСТИ
микроорганизма
Устойчивость к рифампицину
531
Ser
Мутация в 531 кодоне гена rpoB
-субъединицы РНК-полимеразы
Дикий тип
CGC CGA CTG TCG GCG CTG GGG CCC GGC GGT CTG
Ser531Leu
... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ...
Праймер 19 звеньев
Праймер 19 звеньев
TC
Достроенный праймер 20 звеньев
ТС
+ddC 273,1898
+ ДНК-полимераза
+ ddTTP
+ddCTP
ТТ
Достроенный праймер 20 звеньев
ТТ
+ddT 288,2015
Практическое применение
Разработан набор для выявления маркеров устойчивости
к рифампицину, изониазиду и этамбутолу у M. tuberculosis
• Шесть (6) систем праймеров для амплификации фрагментов генов:
rpoB субъединицы РНК-полимеразы,
katG - каталазы - пероксидазы,
inhA - eнол-АСР-редуктазы,
embB – арабинозилтрансферазы и
gyrA - субъединицы А ДНК-гиразы
• Двадцать один (21) зонд для выявления мутаций минисеквенированияем с последующей MALDI-ToF масс-спектрометрией
• В работе:
– системы праймеров для амплификации rrs генов
– Праймеры (зонды) для анализа мутаций, ассоциированных
с устойчивостью и канамицину/амикацину
Исследованы 1003 штамма Mycobacterium tuberculosis
Центральный регион РФ - 410
Уральский регион РФ - 310
Сибирский (западносибирский) - 283
Сибирский
Центральный
ЦНИИ туберкулеза, Москва
НИИ фтизиопульмонологии Екатеринбург
НИИ туберкулеза , Новосибирск
Уральский
Эффективность методики: 96 % для RIF-резистентных штаммов
94% для INH-резистентных штаммов
microflex
(Bruker
Daltonics)
Чувствительность: 200 бактериальных клеток в образце
Воспроизводимость результатов исследования – 100%
Разработана высокоинформативная система генетического скрининга
лекарственной устойчивочти M.tuberculosis
При наличии
в КДЛ
баклаборатории и
ПЦР-лаборатории
достаточно
подключить только
масс-спектрометр
Сравнение методов идентификации микроорганизмов
для рутинной клинической практики
Все 1660 проанализированных изолята получены из образцов крови, СМЖ,
гноя, биопсий, ран, фекалий, отделяемого дыхательного тракта
Метод
Затраченное
время
Уровень подготовки
персонала
Цены дек. 2008
Ручной
Окраска по Граму
Стоимость,
€
6 мин
0,6
От среднего до
высокого
Система идентификации API
(bioMerieux)
18 - 48 ч
4,6 - 6,0
Средний
Определение устойчивости
к антибиотикам
18 - 48 ч
6,6 - 7,4
Средний
Phoenix - система идентификации и опрeделения чувствительности к
_
антибиотикам (BD Diagnostics)
5 - 20 ч
12,65
Средний
5-8ч
5,9 - 8,23
Система Vitek (bioMerieux)
идентификация
Средний
идентификация и определенние
чувствительности к антибиотикам
MALDI-TOF
5-8ч
10,38 -12,71
6 - 8,5 мин
1,43
P.Seng et. al. (France), Clinical Infectious Diseases 2009; 49:543-51
От низкого до
среднего
MALDI-TOF масс-спектрометрия –
быстрый, недорогой и точный метод
для клинической бактериологии
ДОСТУПНЫЙ !
Скачать