Автореферат - НИИ психического здоровья

На правах рукописи
ЛОСЕНКОВ
Иннокентий Сергеевич
КЛИНИКО-ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КИНАЗЫ ГЛИКОГЕНСИНТАЗЫ 3β ПРИ
АФФЕКТИВНЫХ РАССТРОЙСТВАХ
(КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
Специальности:
14.01.06 – «Психиатрия»
14.03.03 – «Патологическая физиология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Томск
2015
1
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном
учреждении «Научно-исследовательский институт психического здоровья».
Научные руководители:
д-р мед. наук
Симуткин Герман Геннадьевич
НИИ психического здоровья (Томск)
д-р мед. наук, профессор
Иванова Светлана Александровна
НИИ психического здоровья (Томск)
Официальные оппоненты:
д-р мед. наук, профессор
д-р мед. наук, профессор
Зотов Павел Борисович
ГБОУ ВПО «Тюменский государственный
медицинский университет» Минздрава России,
профессор кафедры онкологии с курсом
урологии
Агафонов Владимир Иванович
НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томск),
главный научный сотрудник лаборатории
патофизиологии и экспериментальной терапии
Ведущее учреждение: ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный
медицинский университет» Минздрава России.
Защита состоится ___ декабря 2015 года в 10 часов на заседании совета по
защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.030.01 при НИИ
психического здоровья по адресу: 634014, Томск, ул. Алеутская, 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ психического
здоровья.
Автореферат разослан ___ ноября 2015 г.
Ученый секретарь совета по защите
докторских и кандидатских
диссертаций Д 001.030.01
кандидат медицинских наук
2
О. Э. Перчаткина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Аффективные расстройства
являются серьезным социально-экономическим и медицинским вопросом для
современного общества. Накапливающиеся эпидемиологические данные в
отношении данной группы психических расстройств отчетливо демонстрируют
высокие показатели их распространенности в населении (Краснов В.Н., 2011).
Обнаружена выраженная тенденция к росту заболеваемости аффективными
расстройствами. К началу 60-х гг. их распространенность в развитых странах
Европы и США составила 0,4 – 0,8%, в 90-е годы. – 5 – 10% (Utsun T.B. et al.,
1995). По разным данным частота встречаемости данной патологии в общей
популяции составляет 5 – 20% (Семке В.Я. и соавт, 2004; Cчастный Е.Д. и
соавт., 2005).
Депрессивное расстройство на современном этапе оценивается как
крайне распространенное и тяжелое заболевание с хроническим или
рецидивирующим течением, с высоким уровнем полиморфизма клинической
картины и характера течения (Смулевич А. Б. и соавт., 2012). Считается, что
данная мультифакторная патология по прогнозу развития к 2020 г. займет
второе место после ишемической болезни сердца (Murray C.J.L. et al., 1996).
Депрессия серьезно влияет на качество жизни и адаптационные возможности
пациента. Установлено, что примерно 50% пациентов с данной патологией
хотя бы один раз в жизни совершали суицидальные попытки (Смулевич А.Б.,
2007, Счастный Е.Д. и соавт., 2010).
В настоящее время биполярное аффективное расстройство (БАР)
является важной медико-социальной проблемой вследствие его высокой
распространенности, полиморфизма клинических симптомов, сложности
диагностирования (Мосолов С.Н., 2008). Распространенность данного
заболевания составляет от 0,5 до 5%, с учетом субсиндромальных форм – 12%
(Angst J. et al., 2003).
Существует множество теорий патогенеза аффективных расстройств:
нарушение механизмов нейротрансмиссии моноаминов, глутамата, ГАМК,
ацетилхолина, дефицит синтеза нейростероидов, ослабление работы
эндогенных опиоидов, нарушение работы гипоталамо-гипофизарной системы и
тиреоидных гормонов, изменение циркадианных ритмов, аутоиммунная
гипотеза и нарушение процессов нейрогенеза, нейрональной пластичности и
нейродегенерации (Изнак А.Ф., 2006; Frey B.N. et al., 2004; Belmaker R.H. et al.,
2008). Однако, несмотря на обилие научных фактов, лежащих в основе
вышеуказанных теорий, каждая из них имеет свои недостатки и противоречия.
К тому же, до сих пор не существует единой системы взглядов, которая бы
объединяла различные теории патогенеза аффективных расстройств.
Исследования последних лет показали, что дизрегуляция
внутриклеточных сигнальных путей играет важную роль в патогенезе
психических расстройств (Иванова С.А. и соавт., 2013; Emamian E.S., 2012).
Считается, что
протеинкиназы, задействованные в нейробиологических
процессах могут быть мишенями для новых методов фармакотерапии,
прогноза и диагностики аффективных расстройств (Dunman S. R., 2013).
3
Одной из таких протеинкиназ является фермент киназа
гликогенсинтазы 3β (GSK-3β). Первоначально данный фермент был открыт как
ингибитор гликогенсинтазы, однако на сегодняшний день известно, что GSK3β регулирует активность более 50 белков-мишеней, принимающих участие в
процессах метаболизма, клеточной пролиферации, апоптоза, клеточного цикла,
эмбриогенеза,
нейротрансмиссии,
нейродегенерации,
формирования
нейрональной полярности, синаптической пластичности, циркадианных
ритмов (Rayasam G.V. et al., 2009). Роль GSK-3β в патогенезе аффективных
расстройств изучается активно последние 10 лет (Li X. et al., 2010). В
экспериментальных исследованиях на животных показано, что дизрегуляция
GSK-3β пути приводит к развитию депрессивно- и маниакально-подобного
поведения (Polter A.M. et al., 2010, Diniz B.S. et. al., 2011; Joaquim H.P. et al.,
2012).
Степень разработанности темы исследования.
Несмотря на обилие экспериментальных данных о вовлеченности
GSK-3β в формирование депрессивно- и маниакально-подобных симптомов у
животных (Spittaels K. et al. 2002; Beaulieu J.M. et al., 2004; Gould T.D. et al.,
2004; Kaidanovich-Beilin O. et al., 2004; Prickaerts J. et al., 2006; Beaulieu J.M. et
al., 2008; Okamoto H. et al., 2010; Polter A.M. et al., 2010; Omata N. et al., 2011;
Enman N.M. et al., 2012), информация о вкладе данного белка в формирование
аффективных расстройств практически отсутствует. Результаты клинических
исследований немногочисленны, их данные противоречивы. Не изучена связь
GSK-3β с клиническим полиморфизмом аффективных расстройств (Li X. et al.,
2007; Pandey G.N. et al., 2010; Polter A.M. et al., 2010; Diniz B.S. et al., 2011;
Joaquim H.P. et al., 2012). Практически не известна роль негативного
регулятора GSK-3β протеинкиназы Akt1 при аффективных расстройствах
(Hsiung S. et al., 2003; Karege F. et al., 2007; Dwivedi Y. et al., 2010). Кроме
этого, ассоциация генов GSK3B и AKT1 с депрессивными расстройствами и их
клиническим полиморфизмом мало изучена (Pereira P.A. et al., 2005; Yoon
H.K. et al. 2007; Tsai S.J. et al., 2008; Inkster B. et al., 2009; Saus E. et al., 2010;
Yang C. et. al., 2010). Таким образом, является обоснованным изучение
компонентов молекулярно-биологического комплекса, определяющего
функционирование киназы гликогенсинтазы 3β, для установления роли
данного белка в патогенезе аффективных расстройств.
Цель работы:
Установить
клинико-патофизиологические
особенности
функционирования киназы гликогенсинтазы 3β (GSK-3β) у больных с
депрессивными и биполярным аффективными расстройствами.
Задачи исследования:
1. Выявить клинико-патофизиологические особенности содержания
общей GSK-3β, общей протеинкиназы Akt1 и их фосфорилированных
форм (фосфо-серин-9 GSK-3β, фосфо-серин-473 Akt1) у пациентов с
депрессивными и биполярным расстройствами в зависимости от
нозологии аффективного расстройства.
2. Оценить связь начального уровня общих и фосфорилированных форм
GSK-3β и Akt1 с выраженностью депрессивной симптоматики и
последующим ответом на антидепрессивную терапию.
3. Изучить частоту встречаемости аллелей и генотипов полиморфных
вариантов гена GSK3B (полиморфизмы rs334558, rs645582) и гена
AKT1 (полиморфизмы rs1130214, rs3730358) у лиц с депрессивными
расстройствами. Оценить ассоциацию данных полиморфизмов с
4
нозологической формой аффективного расстройства, тяжестью
депрессивной симптоматики, ответом на антидепрессивную терапию.
4. Выявить
корреляции
между
содержанием
общих
и
фосфорилированных форм белков GSK-3β и Akt1 в мононуклеарах
крови и полиморфизмом их генов, у больных с депрессивными и
биполярным расстройствами, а также здоровых лиц.
5. Выявить клинико-патофизиологические особенности содержания
нейромедиаторов-регуляторов
Akt1/GSK-3β-сигнального
пути
(дофамина и серотонина) у пациентов с депрессивными и
биполярным расстройствами в зависимости от нозологии
аффективного расстройства.
6. Оценить
связь
нейромедиаторов-регуляторов
Akt1/GSK-3βсигнального пути (дофамина и серотонина) с выраженностью
депрессивной симптоматики и последующим ответом на
антидепрессивную терапию.
Научная новизна.
В результате проведенного комплексного исследования с
использованием современных биологических и молекулярно-генетических
методов у больных депрессивными и биполярными аффективными
расстройствами выявлены специфические молекулярно-биологические
особенности функционирования белков GSK-3β и Akt1. Показана корреляция
уровней исследуемых белков с тяжестью депрессивной симптоматики и
ответом на антидепрессивную терапию. Впервые выявлены маркеры
дизрегуляции Akt1/GSK-3β-сигнального пути у больных депрессивными
расстройствами. Впервые показана взаимосвязь концентрации серотонина с
выраженностью типичных депрессивных симптомов, а также взаимосвязь
концентрации дофамина с выраженностью атипичных депрессивных
симптомов.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Продемонстрировано клиническое значение исследования белков
Akt1/GSK-3β-сигнального пути в мононуклеарах периферической крови у
больных аффективными расстройствами. Показано, что высокий уровень
общей GSK-3β у больных рекуррентным депрессивным расстройством связан с
тяжестью текущего депрессивного эпизода. По результатам исследования
получен патент № 2540491 «Способ оценки тяжести текущего депрессивного
эпизода у больных рекуррентным депрессивным расстройством». Разработана
новая медицинская технология «Оценка тяжести текущего депрессивного
эпизода у больных рекуррентным депрессивным расстройством на основе
определения внутриклеточного содержания общей киназы гликогенсинтазы
3β» (2014). Исследование позволило выявить комплекс молекулярнобиологических параметров, имеющих прогностическое значение при оценке
эффективности антидепрессивной терапии. Разработано учебно-методическое
пособие «Протеинкиназные сигнальные маркеры при шизофрении и
депрессии» (2013).
Основные результаты диссертационной работы включены в программу
обучения ординаторов и аспирантов НИИ психического здоровья и в учебные
программы студентов, интернов, клинических ординаторов и врачейпсихиатров кафедры психиатрии, наркологии и психотерапии Сибирского
государственного медицинского университета. Результаты внедрены в
лечебно-реабилитационный процесс отделения аффективных состояний
5
клиник НИИ психического здоровья. Результаты исследования в дальнейшем
могут служить теоретической базой для разработки принципиально новых
методов диагностики депрессивных расстройств, методов прогноза
антидепрессивной терапии. Применение результатов исследования в
практическом здравоохранении будет способствовать улучшению качества
оказания специализированной психиатрической помощи.
Методология и методы исследования
Комплексное исследование молекулярно-биологических признаков
выполнено на базе лаборатории молекулярной генетики и биохимии
(руководитель лаборатории – д-р мед. наук, профессор С. А. Иванова) НИИ
психического здоровья (директор – член-корреспондент РАН, профессор, д-р
мед. наук, заслуженный деятель науки РФ Н. А. Бохан). Было сформированы 3
группы: пациенты с депрессивными расстройствами, пациенты с биполярным
аффективным расстройством и здоровые доноры. В группе больных с
депрессивными расстройствами были дополнительно выделены подгруппы
пациентов с единственным депрессивным эпизодом и пациентов с
рекуррентным депрессивным расстройством. Для всех обследуемых было
проведено изучение комплекса психометрических и молекулярнобиологических показателей. Материалом для определения последних являлись:
цельная кровь с этилендиаминтетрацетатом (ЭДТА), мононуклеары
периферической крови, сыворотка и плазма крови.
Основные методы исследования:
1. Клинико-психопатологический;
2. Клинико-динамический;
3. Психометрическая оценка с использованием шкал SIGH-SAD, CGI-S,
CGI-I;
4. Выделение мононуклеаров периферической крови;
5. Определение общей GSK-3β, фосфо-серин-9 GSK-3β, общей Akt1,
фосфо-серин-473 Akt1 в мононуклеарах периферической крови
методом иммуноблоттинга;
6. Выделение ДНК сорбентным методом;
7. Определение аллельных вариантов генов AKT1 и GSK3B методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени;
8. Определение концентрации дофамина и серотонина методом
иммуноферментного анализа;
9. Статистический анализ результатов.
Положения, выносимые на защиту
1. У больных депрессивными и биполярным расстройствами
наблюдается
дизрегуляция
Akt1/GSK-3β-сигнального
пути,
проявляющаяся в повышении общей GSK-3β, снижении общей Akt1,
снижении фосфо-серин-473 Akt1.
2. Тип аффективного расстройства характеризуется специфическими
биохимическими признаками: у пациентов с рекуррентным
депрессивным расстройством наблюдается высокий уровень общей
GSK-3β по сравнению с больными единственным депрессивным
эпизодом, для больных депрессивными расстройствами характерен
низкий уровень фосфо-серин-473 Akt1 по сравнению с больными
БАР.
3. Начальные уровни белков Akt1/GSK-3β-сигнального пути связаны с
тяжестью депрессивной симптоматики, а также ответом на
6
антидепрессивную терапию. Ответ на антидепрессивную терапию
ассоциирован с полиморфизмом rs1130214 гена AKT1.
4. Клинический полиморфизм симптомов депрессии коррелирует с
концентрацией
нейромедиаторов-регуляторов
Akt1/GSK-3βсигнального пути: выраженность атипичных депрессивных
симптомов связана с низкой концентрацией дофамина в плазме
крови, выраженность типичных депрессивных симптомов связана с
низкой концентрацией серотонина в сыворотке крови.
Степень достоверности и апробация результатов
Высокая степень достоверности результатов, представленных в
работе, обоснована достаточным объемом выборок, применением современных
методов исследования, высокотехнологического оборудования и подтверждена
адекватными методами статистической обработки. Результаты проведенных
исследований докладывались и обсуждались на II Всероссийской научной
конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего
тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); на III Всероссийской конференции с
международным
участием
«Современные
проблемы
биологической
психиатрии и наркологии» (Томск, 2013); на Общероссийской конференции с
международным участием «Трансляционная медицина – инновационный путь
развития современной психиатрии» (Самара, 2013); XVI научной отчетной
сессии ФГБУ «НИИПЗ» СО РАМН (Томск, 2013 г.); на Всероссийской школе
молодых ученых и специалистов в области психического здоровья с
международным участием «Психиатрия вчера, сегодня, завтра» (Кострома,
2014); на IV региональной конференции молодых ученых и специалистов
«Современные проблемы психических и соматических расстройств: грани
соприкосновения» (Томск, 2014); на XVI Всемирном конгрессе по психиатрии
«Focusing on access, quality and human care» (Мадрид, 2014); на XXVII конгрессе
ECNP (Берлин, 2014); на XI Международном междисциплинарном конгрессе
«Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2015 г); на XVII научной
отчетной сессии НИИ психического здоровья (Томск, 2015 г.).
Исследования поддержаны грантами РФФИ №12-04-31268 мол_а
«Роль киназы гликогенсинтазы 3 бета в патогенезе депрессивных и
биполярных аффективных расстройств» (2012-2013), РФФИ № 14-04-01157 А
«Поиск биомаркеров депрессивных и аффективных расстройств» (2014-2016) и
ФЦП «Научно и научно-педагогические кадры современной России»
(Соглашение № 8140) «Разработка комплекса маркеров основных социально
значимых психических расстройств на основе изучения молекулярногенетических механизмов дизрегуляции нейрональных протеинкиназных
сигнальных путей» (2012-2013).
Публикации. По теме диссертации опубликована 25 работ, из
которых 6 в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК,
глава в монографии, учебно-методическое пособие, патент РФ, новая
медицинская технология.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста.
Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов
исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов,
списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 28
рисунками. Библиографический указатель включает 228 источников: 49
отечественных и 179 зарубежных авторов.
7
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Материал и методы исследования
Формирование групп, клиническая верификация диагноза выполнена
на базе отделения аффективных состояний НИИ психического здоровья
(руководитель отделения – д-р мед. наук, профессор Е. Д. Счастный). Группу
контроля составили психически и соматически здоровые лица, сопоставимые
по полу, не имеющие хронических заболеваний и не состоящие на
диспансерном учете, без признаков, перенесенных острых инфекционных
заболеваний на момент обследования. Критериями включения в группу
обследуемых лиц было наличие установленного диагноза в рамках F31-F33,
МКБ-10 (депрессивный эпизод, рекуррентное депрессивное расстройство,
биполярное аффективное расстройство), возраст пациентов от 20 до 60 лет,
наличие подписанной формы информированного согласия на участие в
исследовании, этническая принадлежность к славянской популяции. В
критерии исключения входили возраст старше 60 лет, наличие расстройств
шизофренического спектра (F2), эпилепсии, декомпенсированных форм
расстройств личности. Для группы пациентов с БАР критерием исключения
явился прием препаратов лития на момент поступления в стационар, т.к.
известно, что литий способен блокировать фосфорилирование GSK-3β по
серину-9 (Freland L. et al., 2012). Помимо этого критерием исключения для всех
пациентов явилось наличие сахарного диабета, т.к. предполагается, что
дизрегуляция GSK-3β вовлечена в патогенез данной патологии (Jope R. et al., 2007).
Для группы контроля критериями включения стали письменное
информированное согласие, возраст от 20 до 60 лет, этническая
принадлежность к славянской популяции, критериями исключения – наличие
психических расстройств, соматической патологии в стадии обострения.
Исследование проводилось в соответствии с этическими принципами ведения
исследований человека согласно протоколу, утвержденному комитетом по
Биомедицинской этике НИИ психического здоровья. Комплексное
исследование молекулярно-биологических признаков выполнено на базе
лаборатории молекулярной генетики и биохимии (руководитель лаборатории –
д-р мед. наук, профессор С. А. Иванова) НИИ психического здоровья
(директор – член-корреспондент РАН, профессор, д-р мед. наук, заслуженный
деятель науки РФ Н. А. Бохан). Генетические исследования были проведены
согласно этическим принципам медицинской генетики. У всех обследованных
лиц получено информированное согласие.
Всего в рамках исследования обследовано 225 человек. Среди них 122
пациента с текущим депрессивным эпизодом в рамках депрессивных
расстройств (106 человек) и биполярного аффективного расстройства (16
человек), 103 здоровых донора (табл. 1). Дополнительно в группе пациентов с
депрессивными расстройствами были выделены следующие подгруппы:
пациенты с единственным депрессивными эпизодом (60 человек) и пациенты с
текущим депрессивным эпизодом в рамках рекуррентного депрессивного
расстройства (46 человек) (табл. 2).
8
Таблица 1
Характеристика исследованных групп контроля и больных по
полу и возрасту
Пол
Группа
Здоровые доноры
(n=103)
Депрессивные расстройства
(n=106)
Биполярное аффективное
расстройство (n=16)
Всего
Мужчины
%
Абс.
Женщины
%
Абс.
14,3
15
85,7
88
15,7
17
84,3
89
62,5
10
37,5
6
22,8
42
77,2
183
Возраст
Me
(25%Q–75%Q)
36,00
(26,50 – 47,00)
52,00**
(42,75 – 58,00)
37,50#
(27,50 – 58,00)
50,00
(38,00 – 56,00)
**р<0,01 по сравнению с группой здоровых доноров
#р<0,05 по сравнению с группой больных c депрессивными расстройствами
Методы психометрического обследования. Для объективизации
тяжести текущей депрессии в нашем исследовании использовалась 24
пунктовый вариант шкалы SIGH-SAD, включающий 17 пунктов шкалы
депрессии Гамильтона и 7 пунктов, оценивающих атипичные депрессивные
симптомы (социальный отход, увеличение аппетита, увеличение веса,
увеличение количества потребляемой пищи, предпочтение углеводистой пище,
гиперсомния, утомляемость) (Williams J.B.W et al., 1988). Рассчитывались
отдельно суммарный балл, балл для типичных депрессивных симптомов, балл
для атипичных депрессивных симптомов. Тяжесть состояния и эффективность
терапии также оценивалась по шкале общего клинического впечатления (CGI),
включающей в себя подшкалы, оценивающие тяжесть состояния и динамику
улучшения – CGI-S и CGI-I (Guy W., 1976). Психометрическое исследование
проводилось при поступлении, а также на 14 и 28 дни терапии.
Таблица 2
Характеристика исследованных групп больных депрессивными
расстройствами по полу и возрасту
Пол
Группа
Мужчины
%
Абс.
Женщины
%
Абс.
Депрессивный эпизод (n=60)
19,6
12
80,4
48
Рекуррентное депрессивное
расстройство (n=46)
10,9
5
89,1
41
Всего
19,6
17
80,4
89
Возраст
Me
(25%Q–75%Q)
50,00
(39,00 – 56,00)
55,00
(47,50 – 59,25)
52,00
(42,75 – 58,00)
9
Определение внутриклеточных белков методом иммуноблоттинга.
Материалом для исследования служила венозная кровь обследуемых лиц,
взятая с 8.00 до 9.00 натощак из локтевой вены до начала терапии, в пробирки
фирмы BDVacutainer, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту
(ЭДТА).
Из
цельной
крови
выделялись
мононуклеары
путем
центрифугирования на градиенте плотности фиколла (ρ=1,077 г/см3) («SigmaAldrich», США) по стандартной методике (Натвиг Д.Б., 1980). Далее
мононуклеары аликтвотировали в количестве 2106 и использовали для
приготовления клеточных лизатов для последующего определения
специфических белков. К выделенным из периферической крови
мононуклеарам в количестве 2106 добавляли 4 мкл смеси протеиназных
ингибиторов («Fermentas», США), 2 мкл смеси ингибиторов серинтреониновых фосфатаз («Sigma-Aldrich», США) и 200 мкл лизирующего
буфера (50 ммоль Трис-HCl (рН=6,5), 100 ммоль дитиотреитола, 0,1%
бромфеноловый синий, 10% глицерол, 2% натрия додецилсульфат). Затем
тщательно перемешивали и инкубировали 15 минут при 95ºС. Остывшие до
комнатной температуры лизаты еще раз перемешивали и центрифугировали 10
минут при 12000 об/мин и отбирали надосадок. Полученные клеточные лизаты
в объеме 20 мкл использовались для электрофореза в SDS-полиакриламидном
геле по стандартной методике (Laemmli U.K., 1970). Для последующего
исследования белки переносили на ПВДФ (поливинилденфторид)-мембрану
(Bio-Rad, США) на приборе Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, США). Далее мембраны
инкубировались с первичными (в разведении 1:1000) и вторичными
антителами (в разведении 1:300) (Abcam, Великобритания) с последующей
хроматографической детекцией по набору Opti-4CN Substrate Kit (Bio-Rad,
США). Вычисление оптической плотности полосы исследуемого белка и
обработку изображения проводили с использованием системы гельдокументации Alliance 2.7 (Uvitech Cambridge, Великобритания). Уровень
исследуемого белка в пробе рассчитывался как отношение к рефересному
сигналу
β-актина
(общая
GSK-3β/β-актин,
общая
Akt1/β-актин).
Относительный уровень фосфоформ GSK-3β и Akt1 рассчитывался по
отношению к уровню их общих фракций (фосфо-серин-9 GSK-3β/общая GSK3β, фосфо-серин-473 Akt1/общая Akt1).
Определение аллельных вариантов генов AKT1 и GSK3B методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.
Материалом для исследования служила венозная кровь обследуемых лиц,
взятая с 8.00 до 9.00 натощак из локтевой вены до начала терапии, в пробирки
фирмы BDVacutainer, содержащие ЭДТА. Выделение геномной ДНК из
цельной крови осуществляли с использованием набора «Силика» («Медиген»,
Россия) использованием лизиса клеток гуанидинизотиоцианатом с
последующей сорбцией ДНК на стеклянном носителе. К 100 мкл крови
добавляли 300 мкл раствора 1 и 10 мкл сорбента, перемешивали и
инкубировали 15 минут при комнатной температуре, перемешивая каждые 3
минуты. Пробы центрифугировали 60 сек при 5000 об/мин, супернатант
отбирали и отбрасывали. К осадку добавляли 150 мкл раствора 2,
перемешивали и осаждали сорбент центрифугированием 60 сек при 5000
об/мин, супернатант отбирали и отбрасывали. К осадку добавляли 0,7 мл
раствора 3, перемешивали и осаждали сорбент центрифугированием 60 сек при
5000 об/мин. Супернатант отбрасывали, осадок подсушивали при 50ºС в
течение 5 мин. В пробирки добавляли 50 мкл дистиллированной воды,
перемешивали, инкубировали в течение 5 мин при 50ºС. Затем пробы
10
центрифугировали 60 сек при 12000 об/мин. Супернатант, содержащий
геномную ДНК, отбирали в чистые пробирки. Генотипирование по SNP (single
nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм) гена AKT1
(rs1130214 и rs3730358) а также гена GSK3B (rs334558 и rs645582) проводили
методом real-time PCR с использованием наборов TaqMan® SNP Genotyping
Assay (Applied Biosystems, США). Амплификацию и анализ результатов
осуществляли с помощью прибора StepOnePlus (Applied Biosystems, США).
Иммуноферментный анализ для определения концентраций
серотонина и дофамина. У всех обследуемых лиц брали кровь из локтевой
вены в период с 8.00 до 9.00 натощак в пробирки фирмы BDVacutainer с
активатором свертывания для получения сыворотки, а также в пробирки с
ЭДТА для получения плазмы. Концентрацию серотонина определяли в
сыворотке крови. Концентрация дофамина была определена в плазме крови.
Для получения сыворотки и плазмы кровь центрифугировали при 4750 об/мин при
4ºС. Определение концентрации серотонина и дофамина проводили методом
иммуноферментного по наборам реактивов Serotonin ELISA Fast Track и
Dopamine ELISA Fast Track (Labor Diagnostika Nord, Германия). Постановку
реакции проводили согласно прилагаемым к наборам инструкциям с
обязательным контролем стандартных позитивных и негативных сывороток,
входящих в состав тест-системы. Результаты ИФА оценивали на
автоматическом микропланшетном спектрофотометре Epoch (BioTek
Instruments, США) при длине волны 450 нм. Конечные результаты выражали в
единицах, рекомендованных фирмами-изготовителями для построения
калибровочных графиков из стандартных навесок определяемых веществ
(нг/мл для серотонина, пг/мл для дофамина).
Статистическая обработка данных. Был использован пакет
прикладных программ SPSS 20.0. Для проверки соответствия распределения
частот генотипов генов GSK3B и AKT1 равновесию Харди-Вайнберга
использовался критерий χ² Фишера. Сравнение частот генотипов и аллелей
двух анализируемых групп проводили с помощью критерия χ² Фишера.
Различия считали достоверными при р<0,01. Для каждой выборки вычисляли
медиану, 25% и 75% квартили, статистическую значимость различий между
группами определяли по критериям Манна-Уитни (для двух независимых
выборок), Краскела-Уоллеса (для более двух независимых выборок),
Вилкосона (для двух зависимых выборок). Корреляционный анализ
проводился с расчетом коэффициента ранговой корреляции по Спирмену (r).
Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.
2. Результаты исследования и их обсуждение
2.1. Основные клинические характеристики пациентов с аффективными
расстройствами
В основную клиническую группу вошло 122 пациента (95 женщины,
27 мужчин) с текущим депрессивным эпизодом различной степени тяжести в
рамках F31-F33 (МКБ-10), средний возраст которых составил 45,50 (35,7 –
54,2) лет. Диагностическая структура аффективных расстройств в основной
группе была представлена единственным депресcивным эпизодом (60 человек
– 48%), текущим депрессивным эпизодом в рамках
рекуррентного
депрессивного расстройства (46 человек – 39%) и биполярного аффективного
расстройства (16 человек – 13%). Тяжесть текущего депрессивного эпизода в
11
основной группе, оцененная по шкале депрессии Гамильтона (HDRS-17),
составила 23,50 (16,25 – 30,50) балла, что соответствует умеренно выраженной
депрессии. Распределение пациентов по степени тяжести текущего
депрессивного эпизода, оцененной по субшкале тяжести шкалы общего
клинического впечатления (The clinical global impression-severity, CGI-S) было
следующим: легкий депрессивный эпизод встречался в 3 случаях (2,4%),
умеренный депрессивный эпизод в 107 случаях
(87,8%)
и
тяжелый
депрессивный эпизод
в 12 случаях (9,8%). Таким образом, в основной
группе преобладали пациенты с текущим депрессивным эпизодом умеренной
степени тяжести. Оценка синдромальной структуры у пациентов основной
группы показала высокую встречаемость (p<0,05) простой депрессии (45,6%) а
также тревожно-депрессивного синдрома (39,0%) (табл. 3).
Таблица 3
Синдромальная структура текущей депрессии в исследуемых группах
Синдром
Депрессивный (простая депрессия)
Тревожно-депрессивный
Астено-депрессивный
Депрессивно-ипохондрический
Всего
Основная группа
Абс.
%
55
45,6
48
39,0
17
13,8
2
1,6
122
100
Доля пациентов с атипичной депрессивной симптоматикой (в
соответствии с критериями DSM-5) составила 25,2% (n=31). При этом при
наличии атипичной депрессии наиболее часто из так называемых
инвертированных симптомов депрессии встречались гиперсомния (37,2%),
повышенный аппетит (43,6%) и повышение веса тела (43,6%).
2.2. Внутриклеточное содержание белков Akt1/GSK-3β-сигнального пути у
больных депрессивными и биполярными расстройствами
Для выявления дизрегуляции киназы гликогенсинтазы 3β в группах
контроля и больных было изучено содержание общей GSK-3β, ее неактивной
фосфорилированной по серину-9 формы в мононуклеарах периферической
крови. Для более полного представления о функционировании данного белка
проведено измерение негативного регулятора GSK-3β – протеинкиназы Akt1,
как общей, так и активной, фосфорилированной по серину-473 форм. Уровни
общей GSK-3β, фосфо-серин-9 GSK-3β, общей Akt1 и фосфо-серин-473 Akt1 в
группах больных и контроля представлено в таблицах 4 и 5. Обращает на себя
внимание факт повышения общей GSK-3β в группах больных депрессивными
расстройствами и БАР, а также статистически значимое повышение данного
показателя у пациентов с рекуррентным депрессивным расстройством по
сравнению с пациентами, имеющими единственный депрессивный эпизод.
Статистически значимых различий в содержании фосфо-серин-9 GSK-3β
между группами выявлено не было. Исследование выявило снижение общей
Akt1 в группах больных депрессивными расстройствами и по сравнению с
контрольной группой. Обнаружено низкое содержание фосфо-серин-473 Akt1
у больных депрессивными расстройствами (табл. 4). Различий по данным
показателям между группами пациентов с рекуррентным депрессивным
расстройством либо единственным депрессивным эпизодом не выявлено (табл. 5).
12
Таблица 4
Содержание общей GSK-3β, фосфо-серин-9 GSK-3β, общей Akt1 и фосфосерин-473 Akt1 в группах контроля и больных аффективными расстройствами
(Me (25%Q–75%Q))
Показатель
Общая GSK-3β/
β-актин
Фосфо-серин-9
GSK-3β/
общая GSK-3β
Общая Akt1/
β-актин
Фосфо-серин-473
Akt1/ общая Akt1
Контроль
(n=34)
Депрессивные
расстройства
(n=43)
0,61
(0,48 – 0,66)
0,75
(0,60 – 0,84)
Биполярное
аффективное
расстройство
(n=16)
0,78
(0,69 – 0,99)
0,61
(0,51 – 0,61)
0,55
(0,51 – 0,61)
0,51
(0,44 – 0,56)
0,85
(0,51 – 1,00)
0,74
(0,61 – 0,90)
0,61
(0,53 – 0,78)
0,61
(0,51 – 0,74)
0,59
(0,55 – 0,77)
0,76
(0,72 – 0,83)
Р по
критерию
КраскелаУоллеса
0,001
0,052
0,006
0,019
Таблица 5
Содержание общей GSK-3β и фосфо-серин-9 GSK-3β в группах больных с
единственным депрессивным эпизодом и рекуррентным депрессивным
расстройством (Me (25%Q–75%Q))
Показатель
Общая GSK-3β/
β-актин
Фосфо-серин-9 GSK-3β/
общая GSK-3β
Общая Akt1/
β-актин
Фосфо-серин-473 Akt1/
общая Akt1
Единственный
депрессивный
эпизод
(n=26)
0,66
(0,55 – 0,80)
0,56
(0,51 – 0,60)
0,60
(0,51 – 0,80)
0,61
(0,51 – 0,72)
Рекуррентное
депрессивное
расстройство
(n=17)
0,82
(0,68 – 0,93)
0,56
(0,50 – 0,62)
0,62
(0,54 – 0,76)
0,66
(0,50 – 0,88)
Р по
критерию
Манна-Уитни
0,042
0,832
0,783
0,058
В настоящее время считается, что высокая активность GSK-3β может
быть одним из механизмов формирования симптомов аффективных
расстройств, как депрессивных, так и маниакальных (Li X. et al., 2010). Наши
данные о высоком уровне данного белка у больных с БАР согласуются с ранее
выполненными работами (Li X. et al., 2007; Pandey G.N. et al., 2010). Вероятно,
что повышение GSK-3β может играть роль в прогрессировании аффективной
патологии и обусловливать рецидивирующее течение рекуррентной депрессии
и БАР. Известно, что фосфорилирование по серину-9 ингибирует функцию
GSK-3β. Наше исследование не выявило различий в содержании фосфо-серин9 GSK-3β, что не вполне согласуется с ранее полученными данными (Li X. et
al., 2007; Polter A.M. et al., 2010). Причина в отсутствии различий в содержании
фосфоформы GSK-3β остается пока не ясной. Вероятно, это результат
недостатка
дофамина,
ингибирующего
фосфорилирование
GSK-3β.
Активность GSK-3β также зависит от фосфорилирования по серину-398 и
13
тирозину-216 и, вероятно, этот процесс может быть более важен для патогенеза
депрессии (Lesort M. et al., 1999; Thornton T.M. et al., 2008).
Известно, что протеинкиназа Akt1 является одним из основных
ингибиторов GSK-3β. Активность Akt1 связана с наличием фосфата по остатку
серина-473 (Beaulieu J.M. et al., 2011). Действие серотонина и
нейротрофических факторов (BDNF, NGF, GNF) через специфические
рецепторы на клеточной мембране активирует Akt1, в то время как дофамин
через D2-рецепторы ингибирует ее активность. Обнаруженное нами низкое
содержание общей Akt1 у больных аффективными расстройствами, повидимому, является одним из факторов дизрегуляции серотониновой и
дофаминовой передачи, которая, как известно, вовлечена в патогенез
аффективной патологии (Beaulieu J.M., 2012). Также известно, что
протеинкиназа Akt1 вовлечена в регуляцию антиапоптотических и
пролиферативных процессов (Manning B.D. et al., 2004). Низкое содержание
Akt1 и ее активной фосфоформы, продемонстрированное в настоящем
исследовании, вероятно, может быть вызвано ослаблением действия
нейротрофических факторов, что характерно для аффективных расстройств
(Belmaker R.H. et al., 2008). Сложным для объяснения является отсутствие
различий в уровне фософ-серин-473 Akt1 между группой контроля и БАР.
Патогенез БАР до конца не изучен и, вероятно, включает в себя большее число
сложных
биологических
механизмов,
чем
просто
дизрегуляция
вышеуказанных сигнальных путей.
2.3. Взаимосвязь белков Akt1/GSK-3β-сигнального пути с тяжестью
депрессивной симптоматики до начала, на 14-й и 28-й дни терапии у
больных аффективными расстройствами
Для изучения вклада киназы гликогенсинтазы 3β и протеинкиназы
Akt1 в развитие депрессивной симптоматики, а также ответа на
антидепрессивную терапию была изучена корреляция внутриклеточных
уровней белков Akt1/GSK-3β-сигнального пути, измеренных при поступлении
в стационар, с баллом по шкале SIGH-SAD (общий балл, балл для типичных,
балл для атипичных депрессивных симптомов) до начала, а также на 14 и 28
дни терапии.
Проведено изучение корреляций между средними
суммарными баллами (общего, степени выраженности типичных и атипичных
депрессивных симптомов) по шкале SIGH-SAD и уровнем общей GSK-3β.
Единственной статистически значимой являлась положительная корреляция
между средним общим баллом по SIGH-SAD и общей GSK-3β в группе
больных с рекуррентным депрессивным расстройством (r=0,601, p=0,039).
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что тяжесть текущей
депрессии у пациентов с рекуррентным депрессивным расстройством
положительно коррелирует с уровнем общей GSK-3β. На основе полученных
данных получен патент № 2540491 «Способ оценки тяжести текущего
депрессивного
эпизода
у
больных
рекуррентным
депрессивным
расстройством».
В группе пациентов с единственным депрессивным эпизодом
наблюдалась статистически значимая отрицательная корреляция среднего
общего балла по шкале SIGH-SAD после 14 дней терапии с уровнем
неактивной фосфо-серин-9 GSK-3β (r=-0,440, p=0,035). Как было указано
выше, фосфо-серин-9 GSK-3β является неактивной формой и ее избыточная
активность может быть связана с развитием депрессивных симптомов.
14
Полученная корреляция указывает на то, что чем выше активность GSK-3β
(т.е. чем меньше уровень ее фосфо-серин-9 формы), тем более будут выражены
депрессивные симптомы на 14-й день антидепрессивной терапии. Данный факт
представляется интересным ввиду того, что антидепрессанты способны
опосредованно, через увеличение концентрации серотонина повышать уровень
фосфо-серин-9 GSK-3β (Gould T.D. et al., 2004; Beaulieu J.M. et al., 2008; Rosa
A.O. et al., 2008; Okamoto H. et al., 2010). Вероятно, что высокий уровень
данной фосфоформы может выступать как негативный прогностический
признак эффективности антидепрессивной терапии.
Анализ корреляций уровня общей Akt1 со средними баллами по
SIGH-SAD выявил отрицательную корреляцию среднего суммарного балла для
типичных депрессивных симптомов после 28 дней терапии с уровнем общей
Akt1 в группе больных БАР (r=-0,599, p=0,031). Низкий начальный уровень
Akt1 в этом случае, по-видимому, является негативным прогностическим
признаком для эффективности терапии.
Уровень фосфо-серин-473 Akt1 отрицательно коррелировал со
средним суммарным баллом SIGH-SAD для типичных депрессивных
симптомов на 14-ый день терапии для пациентов с единственным
депрессивным эпизодом (r=-0,622, p=0,010) и на 28-й для пациентов с
рекуррентным депрессивным расстройством (r=-0,880, p=0,021). Вероятно, что
сниженное фосфорилирование по серину-473, ингибирующее активность Akt1,
может быть одним из факторов патогенеза аффективных расстройств,
особенно принимая во внимание вышеприведенные данные о сниженном
содержании данной формы у больных депрессивными расстройствами.
Интересным представляется факт того, что низкое начальное содержание
фосфо-серин-473 Akt1 может быть предиктором слабого ответа на терапию у
больных депрессивными расстройствами, но не у больных БАР, для которых
важен уровень общей Akt1. Это может быть связано с различными группами
психотропных препаратах, применявшихся в исследуемых группах.
Антидепрессанты могут повышать фосфорилирование Akt1 по серину-473
(Beaulieu J.M., 2012). Однако на сегодняшний день ничего не известно о связи
Akt1 с терапевтическим эффектом вальпроевой кислоты и карбамазепина.
Можно предположить, что данные препараты активируют сигнальные пути,
регулирующие Akt1 через фосфорилирование по другому важному сайту:
треонину-308.
2.4. Корреляция нейротрансмиттеров серотонина и дофамина с
типичными/атипичными депрессивными симптомами у больных
депрессивными расстройствами
Проведено изучение корреляций между средними суммарными
баллами по шкале SIGH-SAD и концентрацией дофамина. Единственно
значимой явилась отрицательная корреляция между средним суммарным
баллом для атипичных депрессивных симптомов до начала терапии и
концентрацией дофамина в группе больных c рекуррентным депрессивным
расстройством (r=-0,630, p=0,021). Ранее в исследовании M. B. Hamner и соавт.
(1996) была показана отрицательная корреляция концентрации дофамина и
величиной среднего суммарного балла по шкале Гамильтона у больных
депрессивными расстройствами. Однако по результатам нашего исследования
средний суммарный балл SIGH-SAD для типичных депрессивных симптомов
не коррелировал с уровнем дофамина. Вероятно, низкий уровень данного
15
медиатора является одним из факторов развития атипичной депрессивной
симптоматики, что подтверждается литературными данными. Известно, что
дефицит дофаминергической сигнализации ответственен за такие симптомы
депрессии как снижение когнитивных процессов, мотивации, ангедония,
снижение моторной активности, повышение аппетита (Ciraulo D.A. et al., 2011).
Практически все из них находят отражение в психометрической шкале SIGHSAD (Williams J.B.W et al., 1988).
Обнаружено, что в группе больных рекуррентным депрессивным
расстройством средний суммарный балл для типичных депрессивных
симптомов до начала терапии отрицательно коррелировал (r=-0,528, p=0,029) с
концентрацией серотонина. Известно, что дисфункция серотонинергической
системы определяет формирование таких симптомов депрессии как сниженное
настроение, расстройства сна, снижение либидо, тревога (Ciraulo D.A. et al.,
2011). Психометрическая шкала SIGH-SAD позволяет количественно оценить
данные симптомы (Williams J.B.W. et al., 1988). Таким образом, полученные
данные подтверждают роль серотонина в формировании типичных
депрессивных симптомов.
2.5. Распределение полиморфных вариантов генов AKT1 и GSK3B у
больных депрессивными расстройствами
Данные о распределении генотипов и аллелей генов AKT1 и GSK3B
представлены в таблицах 6 и 7. Как видно из таблицы 6, в группах здоровых и
больных депрессивными расстройствами распределение частот аллелей и
генотипов исследуемых полиморфизмов соответствовало равновесию ХардиВайнберга (p>0,05). Исследование не выявило различий в распределении
изучаемых генотипов и аллелей (p>0,05). В таблице 7 приведены результаты
распределения SNP гена GSK3B в группах пациентов с единственным
депрессивным эпизодом и рекуррентным депрессивным расстройством. В
данном случае ген AKT1 был исключен из исследования, изучение частот
генотипов и аллелей SNP rs1130214 и rs3730358 не представлялось возможным
вследствие низких частот минорного аллеля в исследуемых группах. Из
таблицы 9 видно, что распределение частот генотипов и аллелей исследуемого
полиморфизма гена GSK3B соответствовало равновесию Харди-Вайнберга
(p>0,05). Различий в распределении изучаемых генотипов и аллелей между
группами выявлено не было (p>0,05). Однако обращает на себя внимание
тенденция к повышению частоты генотипа А/А rs645582 у больных с
единственным депрессивным эпизодом по сравнению с пациентами,
имеющими рекуррентное депрессивное расстройство. Большинство работ
посвящено поиску ассоциаций полиморфизмов гена GSK3B с биполярным
аффективным расстройством, в то время как его связь развитием с
депрессивных расстройств практически не изучена. Результаты, полученные в
нашем исследовании, согласуются с немногочисленными данными литературы
(Saus E. et al., 2010; Yoon H.K. et al., 2010) Данные о связи SNP rs645582 с
депрессивными расстройствами в настоящий момент отсутствуют.
Полученные нами данные об отсутствии ассоциации гена SNP
rs1130214 AKT1 с депрессивными расстройствами согласуются с ранее
выполненной работой P. A. Pereira и соавт. (2013). Однако в их исследовании, в
отличие от данной работы, была продемонстрирована ассоциация SNP
rs3730358 с развитием большого депрессивного расстройства. Подобное
16
расхождение результатов исследования может быть объяснено, что указанное
исследование было выполнено на Бразильской популяции.
Таблица 6
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов
GSK3B и AKT1 (%) в группах и контроля и больных депрессивными
расстройствами
Полиморфизм
rs334558
гена
GSK3B
rs645582
гена
GSK3B
rs1130214
гена AKT1
rs3730358
гена AKT1
Генотип,
аллель
Здоровые
доноры
(n=103)
T/T
C/T
C/C
T
C
A/A
A/G
G/G
A
G
A/A
A/C
C/C
A
C
A/A
A/G
G/G
A
G
27,5
47,1
25,4
60,8
39,2
31,6
41,0
27,4
56,8
43,2
9,2
45,0
45,8
37,1
62,9
2,2
28,3
69,5
16,3
83,7
Больные
депрессивными
расстройствами
(n=106)
31,1
44,3
24,6
59,8
40,2
28,0
46,7
25,2
60,7
39,3
9,0
38,6
52,4
28,3
71,7
2,9
27,6
69,5
16,7
83,3
Соответствие
распределению
ХардиВайнберга
(χ², р)
χ² (F),
р по
сравнению
с
контролем
χ²1=0,456,
р1=0,499
χ²2=1,267,
p2=0,260
χ²=0,383
р=0,641
χ²1=2,992,
р1=0,08
χ²2=0,477,
p2=0,503
χ²=0,668
р=0,894
χ²1=0,190,
р1=0,662
χ²2=0,331,
p2=0,564
χ²1=0,116,
р1=0,733
χ²2=0,057,
p2=0,801
χ²=1,222
р=0,804
χ²=0,058
р=0,841
1 – группа здоровых доноров.
2 – группа больных депрессивными расстройствами.
2.6. Ассоциация полиморфных вариантов генов AKT1 и GSK3B с тяжестью
депрессии, а также ответом на антидепрессивную терапию
Для изучения связи тяжести депрессии, характера ответа на
антидепрессивную терапию и полиморфизмов в генах AKT1 и GSK3B было
проведено изучение зависимости средних суммарных баллов по шкалам CGI-S,
CGI-I и SIGH-SAD от исследуемых генотипов и группе больных
депрессивными расстройствами до начала, а также на 14-й и 28-й дни терапии.
Полиморфизм rs3730358 гена AKT1 был исключен из исследования вследствие
низких частот минорного аллеля в исследуемых группах. По результатам
исследования не было найдено ассоциации SNP rs334558 и rs645582 гена
GSK3B с величиной баллов по шкалам CGI-S, CGI-I и SIGH-SAD (p>0,05).
В настоящее время данные об ассоциации изучаемых полиморфизмов
гена GSK3B с тяжестью депрессивных симптомов и ответом на
антидепрессивную терапию практически отсутствуют. Интересно, что
17
полиморфизм rs334558 является функциональным, аллель T связан с более
активной экспрессией гена (Kwok J.B. et al., 2005).
Таблица 7
Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов
GSK3B и AKT1 (%) в группах больных с единственным депрессивным
эпизодом (ДЭ) и рекуррентным депрессивным расстройством (РДР)
Полиморфизм
rs334558
гена
GSK3B
rs645582
гена
GSK3B
Генотип,
аллель
T/T
C/T
C/C
T
C
A/A
A/G
G/G
A
G
Больные с
единственным
ДЭ
(n=60)
35,3
39,2
25,5
46,8
53,2
39,2
35,3
25,5
54,9
45,1
Больные
с РДР
(n=46)
25,6
51,2
23,3
64
36
18,6
58,1
23,3
67,4
32,6
Соответствие
распределению
ХардиВайнберга
(χ², р)
χ² (F),
р по
сравнению
с
контролем
χ²1=2,208,
р1=0,137
χ²2=0,240,
p2=0,876
χ²=1,506
р=0,628
χ²1=1,017,
р1=0,313
χ²2=0,175,
p2=0,287
χ²=6,037
р=0,229
1 – группа больных с единственным депрессивным эпизодом
2 – группа больных с рекуррентным депрессивным расстройством
Выявлена корреляция общей GSK-3β с выраженностью депрессивной
симптоматики в группе больных с рекуррентным депрессивным
расстройством. Вследствие малого объема выборки в данном исследовании не
представлялось возможным изучить ассоциацию SNP rs334558 с тяжестью
депрессии и ответом на антидепрессивную терапию в данной группе
пациентов. В связи с этим вопрос об ассоциации данного SNP с
выраженностью депрессивных симптомов остается открытым, вероятно, что
такая ассоциация может быть обнаружена только у пациентов с рекуррентной
депрессией.
Ранее было показано, что SNP rs334558 гена GSK3B связан с
эффективностью терапии литием (Benedetti F. et al., 2005; Adli, M. et al., 2007),
что вполне объяснимо, т.к. белок GSK-3β является биологической мишенью
данного нормотимика. В данном исследовании не было обнаружено
ассоциации SNP гена GSK3B с ответом на антидепрессивную терапию.
Несмотря на то, что действие антидепрессантов приводит к ингибированию
GSK-3β (Gould T.D. et al., 2004; Beaulieu J.M. et al., 2008; Rosa A.O. et al., 2008;
Okamoto H. et al., 2010), они действуют на GSK-3β опосредованно, через
повышение концентрации серотонина. Связи с этим вопрос о вкладе
полиморфизма гена GSK3B в развитие ответа на антидепрессивную терапию
остается открытым.
Не было найдено ассоциации SNP rs1130214 гена AKT1 с величиной
баллов по шкалам CGI-S и CGI-I (p>0,05), за исключением связи между баллом
по шкале CGI-I на 28-й день терапии. Выявлено, что пациенты с генотипом
C/C имели более высокий балл, равный 2,00 (1,00 – 3,00), в то время как у
носителей генотипов A/A и A/C данный показатель составил 1,00 (1,00 – 2,00)
(р<0,01). Средний общий суммарный балл по шкале SIGH-SAD, средний
18
суммарный балл для типичных депрессивных симптомов, средний суммарный
балл для атипичных депрессивных симптомов до начала терапии, а также на
14-й и 28-й дни лечения не зависели от исследуемых генотипов (p>0,05).
Литературные данные об ассоциации полиморфизмов гена AKT1 с
тяжестью депрессивных симптомов и ответом на антидепрессивную терапию
отсутствуют. В проведенном исследовании впервые показано, что
промотерный полиморфизм rs1130214 не связан с выраженностью
депрессивной симптоматики. Впервые показано, что носители генотипа C/C
имеют более высокий балл по шкале CGI-I на 28-й день терапии. Можно
предположить, что данные пациенты были более резистентны к
антидепрессивной терапии. Полученный факт является интересным в виду
того, что белок Akt1 важный компонент сигнальной трансдукции от
серотониновых рецепторов (Beaulieu J.M. et al., 2012). Также интересен ранее
обнаруженный факт того, что аллель А SNP rs1130214 связан с повышенной
транскрипцией гена AKT1 и высоким содержанием белка Akt1 (Emamian E.S. et
al., 2004; Park S. et al., 2005). Таким образом, можно предположить, что
rs1130214 вносит вклад в формирование резистентности к антидепрессивной
терапии, посредством измененной транскрипции гена AKT1. Однако это вопрос
остается до конца нерешенным, т.к. в настоящем исследовании было показано,
что вышеуказанный полиморфизм не ассоциирован с редукцией депрессивных
симптомов, оцененных по шкале SIGH-SAD, которая в данном контексте
является более точным психометрическим инструментом в сравнении с CGI-I.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в ходе исследования обнаружен ряд молекулярнобиологических признаков, подтверждающих гипотезу о вовлеченности киназы
гликогенсинтазы 3β в патогенез аффективных расстройств. В исследовании
показана дизрегуляции белков Akt1/GSK-3β-сигнального пути у больных
аффективными расстройствами. Были найдены клинико-биологические
взаимосвязи между содержанием белков Akt1/GSK-3β-сигнального пути в
мононуклеарах
периферической
крови
и
тяжестью
депрессивной
симптоматики, а также ответом на антидепрессивную терапию. Также была
продемонстрирована связь выраженности типичных депрессивных симптомов
с низким уровнем серотонина и связь тяжести атипичных депрессивных
симптомов с низким уровнем дофамина у пациентов с рекуррентным
депрессивным расстройством. Найдена ассоциация полиморфизма rs1130214
гена AKT1 с ответом на антидепрессивную терапию на 28-й день. На основе
результатов проведенного исследования и с привлечением литературных
данных (Li, X. et al., 2010; Jope R.S., 2011; Polter A. et al., 2011; Beaulieu J.M. et
al., 2012) по обсуждаемой проблеме нами представлена гипотетическая схема
участия киназы гликогенсинтазы 3β в патогенезе аффективных расстройств
(рис. 1).
19
Психогенные факторы
Дизрегуляция серотонинергической системы в мозге,
снижение сигнала от 5-HT-рецепторов
Снижение
фосфо-серин-473 Akt1
Снижение
общей Akt1
Аллель С
rs1130214
Снижение активности Akt1
Снижение
фосфо-серин-9 GSK-3β
Повышение
общей GSK-3β
Аллель T
rs334558
Эндогенные
факторы
(генетическая
детерминированность,
полиморфизм
генов AKT1, GSK3B)
Повышение активности GSK-3β





Нарушение синаптической пластичности
Нарушение нейронального морфогенеза
Усиление нейродегенерации
Воспаление
Нарушение углеводного обмена
Депрессивные симптомы
Аффективные расстройства
Рис. 1. Гипотетическая схема участия киназы гликогенсинтазы 3β в патогенезе
аффективных расстройств (по результатам собственного исследования и
данным литературы).
ВЫВОДЫ
1.
2.
20
Комплексное исследование пациентов с текущим депрессивным
эпизодом в рамках аффективных расстройств (n=122) позволило
выявить данные закономерности в отношении содержания белков
Akt1/GSK-3β-сигнального пути в мононуклеарах периферической
крови: наблюдается статистически значимое повышение общей GSK3β (p<0,01) и снижение общей Akt1 (p<0,01) по сравнению с
соответствующими показателям у здоровых лиц (n=103).
Нозологическая форма аффективного расстройства характеризуется
следующими особенностями содержания белков Akt1/GSK-3βсигнального пути в мононуклеарах периферической крови:
2.1. В группе пациентов с рекуррентным депрессивным
расстройством отмечается статистически значимое (p<0,05)
повышение содержания общей GSK-3β по сравнению с группой
пациентов, имеющих единственный депрессивный эпизод.
3.
4.
5.
6.
2.2. В группе пациентов с депрессивными расстройствами уровень
фосфо-серин-473 Akt1 статистически значимо (p<0,05) ниже по
сравнению с больными биполярным аффективным расстройством.
У больных аффективными расстройствами выявлены статистически
значимые взаимосвязи тяжести, степени улучшения текущего
депрессивного эпизода в ходе психофармакотерапии и уровней
белков
Akt1/GSK-3β-сигнального
пути
в
мононуклеарах
периферической крови:
3.1. Тяжесть текущего депрессивного эпизода до начала терапии,
оцененная по шкале SIGH-SAD, в случае рекуррентного
депрессивного расстройства статистически значимо (p<0,05)
положительно коррелирует с уровнем общей GSK-3β в
мононуклеарах периферической крови.
3.2. Низкий уровень фосфо-серин-9 GSK-3β в мононуклеарах
периферической крови у пациентов с единственным депрессивным
эпизодом статистически значимо (p<0,05) коррелирует с низкой
эффективностью антидепрессивной терапии на 14-й день лечения.
3.3. Низкий уровень общей Akt1 в мононуклеарах периферической
крови
является
предиктором
низкой
эффективность
антидепрессивной психофармакотерапии у пациентов с биполярным
аффективным расстройством на 28-й день лечения.
3.4. Низкий уровень фосфо-серин-473 Akt1 в мононуклеарах
периферической крови у пациентов с единственным депрессивным
эпизодом статистически значимо (p<0,05) коррелирует с низкой
эффективностью антидепрессивной терапии на 14-й день лечения, а у
пациентов с рекуррентным депрессивным расстройством на 28-й день
терапии.
Полиморфизмы rs334558 и rs645582 гена GSK3B, а также
полиморфизмы rs1130214 и rs3730358 гена AKT1 не ассоциированы с
наличием депрессивного расстройства. Полиморфизмы rs334558 и
rs645582 гена GSK3B не ассоциированы с нозологической формой
депрессивного расстройства, тяжестью депрессивных симптомов и
ответом на антидепрессивную терапию. Полиморфизм rs1130214 гена
AKT1 связан с низкой эффективностью антидепрессивной терапии на
28-й день.
В группе пациентов с рекуррентной депрессией выраженность
типичных депрессивных симптомов коррелирует (р<0,05) с низким
уровнем серотонина, в то время как тяжесть атипичных депрессивных
симптомов коррелирует (р<0,05) с низким уровнем дофамина.
Уровни белков Akt1/GSK-3β-сигнального пути в мононуклеарах
периферической крови позволяют определять тяжесть текущего
депрессивного
эпизода
и
клиническую
эффективность
антидепрессивной терапии, полиморфизм rs1130214 гена AKT1
позволяет определить
только
клиническую
эффективность
антидепрессивной терапии.
21
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Лосенков, И. С. Полиморфизмы гена GSK3B при депрессивных
расстройствах / И. С. Лосенков, Н. М. Вялова, Г. Г. Симуткин, С. А.
Иванова, Н. А. Бохан // Современные проблемы науки и
образования. – 2013. – №6; URL: http://www.science-education.ru/11311027 (дата обращения: 13.12.2013).
2. Лосенков, И. С. Полиморфизмы гена AKT1 при депрессивных
расстройствах / И. С. Лосенков // Сибирский вестник психиатрии и
наркологии. – 2014.– Т. 82 (№1). – С. 7 – 9.
3. Иванова, С. А. Роль киназы гликогенсинтазы-3β в патогенезе
психических расстройств / С. А. Иванова, И. С. Лосенков, Н. А. Бохан
// Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. – 2014. –
№ 6. – С. 70 – 76.
4. Лосенков, И. С. Содержание белков Akt1/GSK-3β-сигнального пути в
мононуклеарах периферической крови у больных с аффективными
расстройствами / И. С. Лосенков, С. А. Иванова, Н. М. Вялова, Г. Г.
Симуткин, Н. А. Бохан // Нейрохимия. – 2014. –Т.31 (№ 3). – С. 240 – 245.
5. Счастный Е.Д. Клинико-биологические, социально-психологические и
онтогенетические факторы полиморфизма и эффективности терапии
аффективных расстройств (итоги комплексной темы НИР НИИ
психического здоровья, 2013—2015 гг.) / Е. Д. Счастный, С. А. Иванова, Г.
Г. Симуткин, Е. В. Лебедева, А. Л. Яковлева, И. С. Лосенков, Л. А. Левчук,
Э. Ф. Муслимова, Т. Т. Сергиенко // Сибирский вестник психиатрии и
наркологии. – 2015. – Т.88 (№3). – С. 25 – 32.
6. Вялова, Н. М. Изучение ассоциации полиморфизмов гена PIP5K2A с
депрессивными расстройствами / Н. М. Вялова, О. Ю. Федоренко, И. С.
Лосенков, Г. Г. Симуткин, С. А. Иванова, Н. А. Бохан //
Фундаментальные исследования. – 2013. – №12 (часть 1). – С. 107-110.
7. Лосенков, И.С. Роль киназы гликогенсинтазы-3β в патогенезе
психических расстройств / Лосенков И.С., Н.М. Вялова //
Генетические
нарушения
протеинкиназ
при
психических
расстройствах на модели PIP5K2A, SGK1 и GSK-3β. – Palmarium
Academic Publishing, 2013. Гл. 5. С. 42 – 59.
8. Федоренко, О. Ю. Протеинкиназные сигнальные маркеры при
шизофрении и депрессии: учебно-методическое пособие / О.Ю.
Федоренко, И.С. Лосенков, С.А. Иванова, Н.А. Бохан. – Томск: Иван
Федоров, 2013. – 28 с.
9. Лосенков, И. С. Способ оценки тяжести текущего депрессивного
эпизода у больных рекуррентным депрессивным расстройством» /
Лосенков И. С., Вялова Н. М., Симуткин Г. Г., Иванова С. А., Бохан
Н. А. // Патент РФ № 2540491. 2014.
10. Оценка тяжести текущего депрессивного эпизода у больных
рекуррентным депрессивным расстройством на основе определения
внутриклеточного содержания общей киназы гликогенсинтазы 3β:
Медицинская технология / С. А. Иванова, И. С. Лосенков, Н. М.
Вялова, Г. Г. Симуткин, Н. А. Бохан. – Томск: Иван Федоров, 2014. –
22 с.
11. Лосенков, И. С. Полиморфизм гена GSK3B у больных депрессивными
расстройствами / И. С. Лосенков // Материалы 2-ой всероссийской
научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской
науки третьего тысячелетия», 12-14 ноября 2012 г., Медицинский
академический журнал. Приложение. – 2012. – С. 222 – 223.
12. Лосенков, И. С. Внутриклеточный уровень киназы гликогенсинтазы
3β у больных аффективными расстройствами / И. С. Лосенков, Н. М.
1.
22
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Вялова, Г. Г. Симуткин // Сборник тезисов Третьей Всероссийской
конференции с международным участием «Современные проблемы
биологической психиатрии и наркологии» (г. Томск, 5-6 марта 2013
г). – 2013. – С. 114 – 115.
Лосенков, И. С. Полиморфизмы гена GSK3B у больных
депрессивными расстройствами в русской популяции региона Сибири
/ И. С. Лосенков, Н. М. Вялова, Л. А. Левчук, Г. Г. Симуткин, С. А.
Иванова // Трансляционная медицина – инновационный путь развития
современной психиатрии, 19-21 сентября 2013 года, г. Самара, тезисы
конференции / под ред. Н.Г. Незнанова, В.Н. Краснова. – Самара,
2013. – С. 124 – 125.
Лосенков, И. С. Внутриклеточный уровень киназы гликогенсинтазы
3β у больных аффективными расстройствами / И. С. Лосенков, Н. М.
Вялова, Л. А. Левчук, Г. Г. Симуткин, С. А. Иванова //
Трансляционная медицина – инновационный путь развития
современной психиатрии, 19-21 сентября 2013 года, г. Самара, тезисы
конференции / под ред. Н.Г. Незнанова, В.Н. Краснова. – Самара,
2013. – С. 125 – 126.
Лосенков, И. С. Полиморфизмы гена AKT1 у больных
депрессивными расстройствами в русской популяции региона Сибири
/ И. С. Лосенков // Актуальные вопросы психиатрии и наркологии:
сборник тезисов XVI научной отчетной сессии ФГБУ «НИИПЗ» СО
РАМН (Томск, 8 октября 2013 г.) и Российской научно-практической
конференции «Адаптация больных шизофренией» (Томск, 9 октября
2013 г.) / под редакцией члена-корреспондента РАМН Н.А. Бохана. –
Томск: Иван Федоров, 2013. – Вып. 16. – С. 76 – 77.
Лосенков, И. С. Содержание киназы гликогенсинтазы 3β в
мононуклеарах крови больных аффективными расстройствами / И. С.
Лосенков, Н. М. Вялова, Л. А. Левчук, Г. Г. Симуткин, С. А. Иванова
// Сборник тезисов докладов Всероссийской молодежной
конференции «Нейробиология интегративных функций мозга»
(Санкт-Петербург, 12 – 14 ноября 2013 г.). – Санкт-Петербург, 2013.
С. 46 – 47.
Лосенков, И. С. Изучение ассоциации полиморфных вариантов гена
AKT1 с депрессивными расстройствами в русской популяции региона
Сибири / И. С. Лосенков, Н. М. Вялова, Л. А. Левчук, Г. Г. Симуткин,
С. А. Иванова // Сборник тезисов докладов Всероссийской
молодежной конференции «Нейробиология интегративных функций
мозга» (Санкт-Петербург, 12 – 14 ноября 2013 г.). – Санкт-Петербург,
2013. С. 47.
Лосенков, И. С. Изучение ассоциации полиморфных вариантов гена
GSK3B с депрессивными расстройствами в русской популяции
региона Сибири / И. С. Лосенков, Н. М. Вялова, Л. А. Левчук, Г. Г.
Симуткин, С. А. Иванова // Сборник тезисов докладов Всероссийской
молодежной конференции «Нейробиология интегративных функций
мозга» (Санкт-Петербург, 12 – 14 ноября 2013 г.). – Санкт-Петербург,
2013. С. 48.
Лосенков, И. С. Внутриклеточное содержание белков Akt1/GSK-3βсигнального пути у больных аффективными расстройствами / И. С.
Лосенков, Н. М. Вялова // Психиатрия вчера, сегодня, завтра:
материалы всероссийской школы молодых ученых и специалистов в
области психического здоровья с международным участием
(Кострома, 22-24 апреля 2014 г). – М., 2014. – С. 310—313.
Лосенков, И. С. Белки Akt1/GSK-3β-сигнального пути у больных
аффективными расстройствами / И. С. Лосенков, Н. М. Вялова, Г. Г.
23
21.
22.
23.
24.
25.
Симуткин, С. А. Иванова // Сборник тезисов IV региональной
конференция молодых ученых и специалистов «Современные проблемы
психических и соматических расстройств: грани соприкосновения»
(Томск, 17 – 18 июня 2014 г.) – Томск, 2014 – 63 – 65.
Losenkov, I. S. Genetic variations of AKT1 gene in Russian depressive
patients from Siberia / I. S. Losenkov, N. M. Vyalova, G. G. Simutkin, S.
A. Ivanova, N. A. Bokhan. // XVI World congress of psychiatry «Focusing
on access, quality and human care». September 14 – 18, 2014. Madrid,
Spain. Abstracts book. Oral and poster communications. – Vol. 3. – P. 122.
Bokhan, N. A. Correlation between levels of Akt1/GSK-3β signaling
pathway proteins and severity of depressive symptoms / N. A. Bokhan, I.
S. Losenkov, N. M. Vyalova, G. G. Simutkin., S. A. Ivanova // European
neuropsychopharmacology. – 2014. – Vol. 24, Suppl. 2. – P. 365.
Лосенков И. С. Взаимосвязь серотонина, дофамина и уровня белков
AKT1/GSK-3β сигнального пути с тяжестью депрессивных
симптомов / И. С. Лосенков, С. А. Иванова, Н. А. Бохан // Нейронаука
для
медицины
и
психологии:
11-й
Международный
междисциплинарный конгресс (Судак, 2-12 июня 2015 г) / под ред.
Лосевой Е.В., Крючковой А.В., Логиновой Н.А. – М.: Макс Пресс,
2015. – С. 258.
Лосенков И. С. Связь ответа на антидепрессивную терапию у
пациентов с депрессивными расстройствами с полиморфизмами гена
AKT1 / И. С. Лосенков, Н. М. Вялова, Г. Г. Симуткин, С. А. Иванова, Н.
А. Бохан // XVI съезд психиатров России. Всероссийская научнопрактическая конференция с международным участием «Психиатрия
на этапах реформ: проблемы и перспективы», 23-26 сентября 2015
года, г. Казань [Электронный ресурс]: тезисы / под общей редакцией
Н.Г. Незнанова. — СПб.: Альта Астра, 2015. – С. 116.
Лосенков И.С. Отсутствие ассоциации полиморфизмов гена GSK3B с
тяжестью депрессивных симптомов и ответом на антидепрессивную
терапию у больных депрессивными расстройствами // Актуальные
вопросы психиатрии и наркологии: сборник тезисов XVII научной
отчетной сессии НИИ психического здоровья (Томск, 6 октября 2015
г.) и II Российско-китайской научно-практической конференции
«Актуальные вопросы биопсихосоциальной реабилитации пациентов
с аффективными расстройствами» (Томск, 7 октября 2015 г.) / под
редакцией члена-корреспондента РАН Н. А. Бохана. – Томск: Изд-во
«Иван Федоров», 2015. – Вып. 17. – С. 123.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БАР – биполярное аффективное расстройство
ДЭ – депрессивный эпизод
ГАМК – гамма-амино-масляная кислота
ПЦР – полимеразная цепная реакция
РДР – рекуррентное депрессивное расстройство
СИОЗС – селективные ингибиторы обратного захвата серотонина
ЭДТА – этилендиаминтетрацетат
GSK-3β – glycogensyntase kinase 3β, киназа гликогенсинтазы 3β
CGI-I – The clinical global impression-improvement
CGI-S – The clinical global impression-severity
HDRS – Hamilton depression rating scale
SIGH-SAD – Structured interview guide for the Hamilton depression rating scale,
seasonal affective disorders
SNP – single nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм
24
Подписано к печати 15.10.2014 г.
Формат 60х841/16. Печать ризографическая.
Бумага офсетная № 1.
Гарнитура «Times Roman».
Тираж 100 экз. Заказ № 144487 .
Тираж отпечатан в типографии «Иван Фёдоров»
634026, г. Томск, ул. Розы Люксембург, 115/1
тел.: (3822) 78-80-80, тел./факс: (3822) 78-30-80
E-mail: mail@if.tomsk.ru http://www.ifedorov.org/
25