Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012
реклама
e-mail: [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 1 2 Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected] Содержание: Современная лаборатория № 3 Медицинский алфавит Серия журналов для специалистов № 14 (180) 2012 www.medalfavit.ru Издатель: ООО «Альфмед» Тел.: (495) 616‑48‑00 E‑mail: [email protected] Учредитель и главный редактор издательства ООО «Альфмед»: Т. В. Синицка Адрес редакции: 129344 г. Москва, ул. Верхоянская, д. 18, к. 2 Тел.: (495) 616‑48‑00, 221‑76‑48 E‑mail: [email protected] Главный редактор серии журналов «Медицинский алфавит» А. С. Ермолов, д. м. н., профессор, член — корр. РАМН, главный хирург Департамента здравоохранения города Москвы, почётный директор НИИ СП им. Н. В. Склифосовского, руководитель отдела неотложной хирургии НИИ СП им. Н. В. Склифосовского [email protected] Руководитель отдела рекламы и маркетинга: Ю. В. Попов [email protected] Руководитель отдела продвижения, распространения, выставочной деятельности и подписки: Ирена Синицка [email protected] Редакция оставляет за собой право сокращения и стилистической правки текста без дополнительных согласований с авторами. Мнение редакции может не совпадать с точкой зрения авторов опубликованных материалов. Редакция не несет ответственности за последствия, связанные с неправильным использованием информации. Журнал зарегистрирован Министерством РФ по делам печати теле-, радиовещания и средств массовых коммуникаций. Рег. номер ПИ № 77–11514 от 04.01.2002 Уст. тираж 10 000. Формат А4. Цена договорная. При перепечатке ссылка на журнал «МА» обязательна. За содержание рекламы ответственность несет рекламодатель. За достоверность сведений, изложенных в статьях, ответственность несет автор. Наш индекс в каталоге «РОСПЕЧАТЬ» 36228 e-mail: [email protected] 4 Персонализированная медицина С. Н. Щербо 6 Цереброинтестинальные пептиды в патогенезе ожирения Т. И. Туркина, С. Н. Щербо, В. А. Беспалова, В. В. Талицкий 8 Итоги XVII Всероссийской научно-практической конференции «Интеграция в лабораторной медицине» 10 Персистирующие клетки микроорганизмов Н. В. Евдокимова 14 Новые аспекты лабораторной диагностики респираторного микоплазмоза Е. В. Щетинин, М. В. Батурина, В. А. Батурин 18 Влияние герпетической инфекции на минеральный состав биологических жидкостей Н. А. Терёхина, С. Э. Реук, Л. И. Соловьева 22 Иммунофенотипическое исследование клона опухолевых клеток в диагностике В‑ХЛЛ Г. И. Луговская, О. Н. Чибисова 24 Внедрение ГОСТ Р ИСО 15189–2009 в медицинскую лабораторию: предупреждающие действия при организации работы Т. И. Долгих 28 Концентрация белка в моче: мифы и реальность А. В. Козлов, Е. С. Ларичева 34 Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека и его применение в клинической практике М. С. Макаров; Н. В. Боровкова, Е. Н. Кобзева, И. В. Высочин, В. Б. Хватов 37 Иммунные и кардиоваскулярные нарушения у больных хроническим лимфолейкозом при использовании разных схем полихимиотерапии И. В. Cнежко, Ю. В. Шатохин, Е. В. Бурнашева, О. Н. Шатохина, 40 Проблемы терапии гормоночувствительного рака молочной железы у пациенток в постменопаузе 41 Оптохин и его использование для идентификации Streptococcus pneumoniae Г. В. Белошицкий 44 Автоматизация в клинической микробиологии Л. О. Иноземцева 46 Антимюллеров гормон —тест фертильности 48 Опыт модернизации клинико-диагностической лаборатории ФГБУ «Поликлиника № 1» Управления делами президента РФ Л. В. Кудрявцева 54 Современные методы организации процесса мониторинга параметров микроклимата в лабораториях 62 Подписка C 2011 года журнал «Медицинский алфавит» включен в НАУЧНУЮ ЭЛЕКТРОННУЮ БИБЛИОТЕКУ и РОССИЙСКИЙ ИНДЕКС НАУЧНОГО ЦИТИРОВАНИЯ (РИНЦ) Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 3 Редакционный совет журнала «Современная лаборатория» серии «Медицинский алфавит» Главный редактор Щербо Сергей Николаевич Щербо Сергей Николаевич д. м. н. профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова», г. Москва Косырев Александр Борисович к. м. н, доцент кафедры биохимии РМАПО, генеральный директор ООО ТПО «Медиолаб», г. Москва, [email protected] Вавилова Татьяна Владимировна д. м. н, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова», г. Санкт-Петербург, [email protected] Полонский Виталий Олегович к. м. н., старший региональный менеджер ЗАО «Вектор-Бест-Европа» (московское представительство ЗАО «Вектор-Бест»), г. Москва, [email protected] Гильманов Александр Жанович д. м. н., профессор, зав кафедрой биохимии и лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития РФ», г. Уфа, [email protected] Годков Михаил Андреевич д. м. н., врач высшей категории, руководитель отдела лабораторной диагностики ГБУЗ «НИИ СП им. Н. В. Склифосовского», г. Москва [email protected] Долгих Татьяна Ивановна д . м . н . , п р о ф е с с о р , з а в е д у ю щ а я Ц е н т р а л ь н о й н а у ч н о исследовательской лаборатории и руководитель Академического центра лабораторной диагностики Омской государственной медицинской академии, г. Омск [email protected] Тарасенко Ольга Анатольевна д. м. н., ФГУЗ «Головной центр гигиены и эпидемиологии ФМБА России» (ГЦГиЭ), заместитель главного врача, г. Москва, [email protected] Шипулин Герман Александрович к. м. н., руководитель отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии ФГУН «ВНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора РФ, г. Москва [email protected] Эмануэль Владимир Леонидович д. м. н., профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, директор Научно-методического центра Минздрава РФ по молекулярной медицине на базе СПбГМУ им. И. П. Павлова, вице-президент Российской ассоциации медицинской лабораторной диагностики, главный специалист-эксперт по клинической лабораторной диагностике Росздравнадзора по Северо-Западному федеральному округу, г. Санкт-Петербург, [email protected] Наши постоянные читатели знают, что журнал «Медицинский алфавит» выходит различными сериями. Данная серия «Современная лаборатория» освещает перспективы развития лабораторной службы. В целях более детального подхода к профессиональным терминам редакционный совет счел целесообразным помещать материалы, посвященные основным современным направлениям развития лабораторной медицины, которые позволят врачам понять тенденции развития лабораторной диагностики в нашей стране и мире. В небольших по объему обзорах мы постараемся дать определения, представления о методах, областях применения различных разделов лабораторной медицины. Надеемся, что наши читатели примут участие в формировании тематик указанных миниобзоров. Итак… Вторая статья посвящена «П», персонализированной медицине. Персонализированная медицина С. Н. Щербо О фициально признанного определения персонализированной медицины (ПМ) не существует. Термин «персонализированная медицина» был использован в качестве названия монографии Джейн в 1998 году и начал упоминаться в MEDLINE в 1999 году, но большая часть литературы, относящаяся к ПМ, часто 4 определяет ее как фармакогеномику и фармакогенетику. Различные термины, которые используются для описания концепции ПМ: ориентированная, подобранная, основанная на генотипе, индивидуализированная или основанная на индивидуальном подходе терапия; информационно обоснованная, системная, Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 геномная (genomic medicine), предсказательная (predictive medicine) или медицина под заказчика (tailored medicine), препараты генетического действия (фармакогеномика, фармакогенетика, фармакопротеомика), комплексное здравоохранение. Термин «комплексное здравоохранение» обозначает объединение диаe-mail: [email protected] гностики, скрининга, профилактики, лечения и мониторинга как будущее направление в медицине, но он уже используется для альянса классической и альтернативной медицины. Термин «геномной медицины» подразумевает, что секвенирование генома человека позволяет медицинской практике вступить в эру, в которой геном пациента поможет определить оптимальный подход к оказанию помощи, будь то профилактической, диагностической или терапевтической. Однако геномная медицина не является адекватным синонимом для ПМ, так как помимо геномики, протеомные технологии и метаболомика способствуют развитию ПМ. ПМ также отражается в индивидуальной терапии, это означает назначение конкретных процедур и методов лечения, лучше всего подходящих для индивидуального учета генетических и эпигенетических факторов, которые влияют на терапию. ПМ является наилучшим способом внедрения новых биотехнологий в медицину для улучшения понимания патогенетического механизма заболеваний и лечения больных. ПМ стала реальностью после определения последовательности генома человека и персонализированных геномов, прогрессом в области медицинской генетики, а также ряда технологий, в том числе медицинской диагностики, однонуклеотидного полиморфизма (ОНП) генотипирования и протеомики. Таким образом, персонализированная медицина (personalized medicine) представляет собой интегральную медицину, которая включает в себя разработку персонализированных средств лечения, тестирование на предрасположенности к болезням, профилактику, объединение диагностики с лечением и мониторингом лечения. Начался период параллельного одновременного исследования множества генов и продуктов их экспрессии в различных условиях, к созданию профилей экспрессии генов и сетей взаимодействий между генами и факторами их регуляции. Началась эпоха интегральных исe-mail: [email protected] следований геномов и кодируемых ими продуктов, которые образовали специфический раздел молекулярной генетики, включающий геномику и в том числе функциональную геномику. Геномика сегодня занимается анализом структуры и функций геномов как интегрального функционального массива генов, их регуляторных элементов и других последовательностей, необходимых для функционирования генома. Функциональная геномика порождает множество других «-омик»: протеомику, пептидомику, метаболомику, каждая из которых интегрально исследует один из аспектов деятельности живых систем и в конечном счете нацелена на расшифровку механизмов жизнедеятельности на уровне организмов, прежде всего на первом уровне — клеток. Важным фактором дальнейшего развития является появление системной биологии, способной оперировать с чрезвычайной сложностью живых систем. Роль молекулярной диагностики в ПМ охватывает следующие аспекты: раннюю диагностику и выбор безопасного и эффективного лечения на основе молекулярных методов; усиление интеграции молекулярной диагностики с терапией; мониторинг терапии, а также прогноз течения заболевания на основе определения биомаркеров (на уровне генома, транскриптома, протеома, метаболома и интерактомов). Классификация молекулярных диагностических технологий, имеющих отношение к ПМ, представлена ниже, многие из них сочетают в себе несколько технологий (амплификацию, гибридизацию, рестрикционный анализ и др.). Три важнейшие технологии имеют отношение к ПМ: генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов — ОНП (SNP), микрочипы/биочипы и секвенирование. Выделяют несколько групп лабораторных методов ПМ: 1. методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (полимеразная цепная реакция — ПЦР, ПЦР с детекцией в режиме реального времени, мультиплексная ПЦР и другие модификации для поиска ОНП); 2. методы, о снованные на ферментативных подходах (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов — ПДРФ или амплифицированных фрагментов — AFLR и др.); 3. методы, основанные на различной электрофоретической подвижности полиморфных участков ДНК (анализ конформации одноцепочечных фрагментов ДНК, денатурирующий градиентный гельэлектрофорез и др.); 4. методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот (генетические микрочипы, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и др.); 5. методы анализа пептидов (ферментное обнаружение мутаций; белковые микробиочипы, анализы на основе флуоресценции резонансного переноса энергии (FRET) и др.); 6. методы исследования частых мутаций, аллельного полиморфизма: хроматографические (денатурирующая жидкостная хроматография высокого разрешения (DHPLC)), поверхностного плазмонового резонанса (SPR); масс-спектрометрии (MALDI-TOF масс-спектометрия, тандемная масс-спектрометрия — ТМС); проточной цитометрии (технология X–MAP) и нанотехнологии (флуоресцентные нанокристаллы — квантовые точки). Важнейшей задачей лабораторной медицины и ПМ является поиск высокоспецифичных и высокоинформативных наборов лабораторных маркеров различных заболеваний. Маркеры патологий с идеальной специфичностью и чувствительностью редки, так как причина почти всех заболеваний никогда не бывает единственной, а обусловлена рядом неблагоприятных факторов. Поскольку высокотехнологичные методы лабораторной медицины позволяют установить причинно-следственные цепи: ген — РНК — белок — метаболит, такие комплексы маркеров могут состоять из специфических олигонуклеотидов, белков и метаболитов. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 5 Цереброинтестинальные пептиды в патогенезе ожирения Т. И. Туркина, д. б. н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики факультета усовершенствования врачей С. Н. Щербо, д. м. н. профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики В. А. Беспалова, к. м. н., доцент кафедры клинической лабораторной диагностики факультета усовершенствования врачей В. В. Талицкий, старший н. с. кафедры клинической лабораторной диагностики факультета усовершенствования врачей ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава Российской Федерации, Москва Т. И. Туркина В С. Н. Щербо настоящее время появляется все больше работ по расшифровке механизма действия энтериновых (кишечных, интестинальных) гормонов на важнейшие функции человека и животных. Благодаря развитию иммуноцитохимических и радионуклидных методов исследования были обнаружены аналоги интестинальных пептидов в ткани мозгового вещества. К подобным соединениям, имеющим двойную локализацию, относятся вазоактивный интестинальный пептид (ВИП), холесцистокинин (ХЦК), гастрин, соматостатин, β-эндорфин, энкефалин, бомбезин, вещество Р, нейротензин. Появляются сообщения о связи цереброинтестинальных пептидов с обменом веществ вообще и с утилизацией нутриентов, в частности [4]. Между пептидами, локализующимися в различных отделах мозга, и энтериновыми гормонами происходит перманентный обмен нейрометаболической информацией о динамике трансформации принятой пищи. Существует гипотеза о существовании системы, контролирующей потребление пищи и колебание массы тела. Эта система включает: 1) факторы, определяющие количество и качество 6 В. В. Талицкий пищи, связанные непосредственно с нервной афферентацией, психоэмоциональными моментами, сигналами от других гормональных пептидов и отражающих специфику усвоения пищи; 2) массу жировой ткани, регулирующую объем и качество принятой пищи. Обязательным компонентом, связывающим элементы этой системы с ЦНС, является инсулин. Такой же функциональной активностью обладает соматостатин и β-эндорфин; последний был обнаружен в спинномозговой жидкости (СМЖ), где его концентрация увеличивалась после системной перфузии глюкозой или инсулином и была пропорциональна концентрации инсулина в плазме. Таким образом, стала известна цепь, по которой индуцируемый пищей импульс передается с периферии в центр: желудок — поджелудочная железа — СМЖ — мозг. Экзогенный инсулин является реальным фактором увеличения потребления пищи, он может действовать на жировую ткань опосредованно, а вызывая гипогликемию, способствовать повышению аппетита и потреблению дополнительного количества пищи. Введение питательных веществ, составляющих 25–30 % Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 суточного каллоража, повышает уровень эндогенного инсулина и, как следствие этого, способствует уменьшению объема потребляемой пищи. Инсулин тормозит распад жира и мобилизацию его из жировой ткани. При экспериментальной гиперинсулинемии у крыс увеличивается объем жировых клеток. Понижая уровень сахара в крови, инсулин приводит к возбуждению «центров голода» гипоталамуса. Обнаружено также уменьшение количества ц‑АМФ в адипоцитах под влиянием избытка инсулина. Эти исследования еще раз подтверждают анаболическую роль инсулина в поддержании массы тела. На активность инсулина влияют многие факторы, в том числе и опиоиды, найденные в мозге, СМЖ, кишечнике. Они принимают участие в регуляции метаболической трансформации нутриентов. Экспериментально установлено, что введение налоксона (антагониста опиоидов) голодным крысам уменьшает объем потребляемой пищи. Налоксон в дозе 0,5 мг на 1 кг массы тела снижает объем потребляемой пищи на 22 %, а в дозе 1 мг на 1 кг массы тела — на 33 %. Однако этот эффект нельзя признать специфичным, поскольку при этом уменьшается потребление воды. Налоксон весьма эффективен у мышей и крыс с генетическим ожирением: в крови этих животных повышено содержание β-эндорфина при нормальной его концентрации в мозге. Развитие ожирения может быть обусловлено параллельным увеличением концентрации β-эндорфина в мозге и сыворотке крови. Введение в латеральный желудочек мозга β-эндорфина в дозе 200 мг уменьшает e-mail: [email protected] потребление пищи на 50 % уже через 30 минут, тогда как при введении его в вентикулярный отдел гипоталамуса отмечается повышение аппетита. Имеются указания о влиянии ряда пептидов на отдельные звенья обмена веществ. Так, например, ВИП стимулирует липолиз и гликогенолиз, а другие гормоны, как было сказано выше, оказывают влияние на углеводный обмен посредством высвобождения инсулина. Секретин и ХЦК контролируют водно-солевой и электролитный обмен на уровне тонкого кишечника. Доказано, что энтериновые гормоны являются не только регуляторами гемостаза, но и сами представляют объект для гомеостатирования. Важное значение в регуляции секреторной активности эндокринных клеток кишечника придается вагусной иннервации. Данный механизм в большей степени свойственен эндокринным клеткам желудка, тогда как контроль за активностью эндокринного аппарата кишечника связан с приемом пищи, а точнее с ее качественным составом. В последнем случае регуляция осуществляется по типу обратной связи. Одним из наиболее изученных представителей центрального контроля аппетита является бомбезин. Экспериментально установлено, что внутрицистеральное или внутрижелудочковое введение бомбезина вызывает четкое и длительное повышение гликемии. Эта реакция не является вторичной по отношению к физиологическим колебаниям гликемии, не предотвращается удалением гипофиза, но предупреждается адреналэктомией, ассоциируясь с выраженным повышением уровня норадреналина, глюкагона и снижением содержания инсулина. Поскольку известно, что введенный внутривенно бомбезин подобных эффектов не вызывает, то правомерно предположить, что последний действует в ЦНС на какую-то пока неизвестную область. Возможно, что бомбезин действует на центры аппетита не прямо, а через нейротрансмиттеры (например, через β-эндорфин, соматостатин). Имеются указания на модулирующее влияние этого соединения на симпатическое звено оси мозг — кишечник — надпочечник. Помимо бомбезина, аналогичными свойствами обладают нейротензин и β-эндорфин; e-mail: [email protected] последний вызывает гипергликемию, независимо от адреналовой системы. Что касается соматостатина и его аналогов, то они, вне зависимости от ЦНС, блокируют гипергликемию, вызванную внутрицистеральным введением бомбезина, кабохола, нейротензина. Все это практически эквивалентно обычному стрессу, вызванному гипергликемией. Имеются указания о гипергликемическом эффекте соматостатина при его введении в периферическую вену. Все изложенное позволяет сделать следующее заключение: механизм ингибирования ЦНС-зависимой гипергликемии аналогами соматостатина обусловлен, по всей видимости, в первую очередь блокированием синтеза адреналина. ХЦК и панкреатический полипептид (ПП) являются наиболее изученными энтерогормонами. В отношении ХЦК накопилось достаточное количество экспериментальных данных, указывающих на то, что внутривенное введение ХЦК или его аналогов способствует уменьшению объема потребляемой пищи у многих видов животных. Аналогичные эффекты отмечены и после введения мышам линии оь-оь бычьего ПП; в этом случае уменьшение концентрации ПП сопровождалось нарастанием массы тела. Средний уровень ПП у больных ожирением как натощак, так и после приема пищи, обогащенной белком, более низкий, чем в контрольной группе. Представленные данные демонстрируют сложность и многообразие взаимодействия нейропептидов и энтериновых гормонов в контроле аппетита и метаболизма нутриентов. Учитывая биологические свойства пептидов, а также результаты пока еще немногочисленных клинических наблюдений, мы сочли возможным обсудить новый вариант гипотезы механизма ожирения: компоненты пищи, перед тем как трансформироваться в соответствующие транспортные формы в лимфе крови, подвергаются различным воздействиям гормонально-метаболического регуляторного комплекса (ГМРК), в котором определяющая роль отводится инсулину и соматостатину. Первый отвечает за консервацию энергии, второй уменьшает (модулирует) всасы- вание аминокислот, триглицеридов, глюкозы, стимулирует функцию поджелудочной железы. Есть основания принять сведения об угнетающем действии соматостатина на инсулин. Согласно нашей гипотезе, дискоординированность ГМРК обусловлена недостаточно адекватным влиянием соматостатина (причина: генетически детерминированный, более низкий уровень секреции гормона или его усиленная инактивация; нельзя исключить и возможность пониженного порога чувствительности рецепторов соматостатина в клетках-мишенях). Нами с сотрудниками на протяжении многих лет изучались различные патогенетические аспекты ожирения в эксперименте и клинике. Создана концепция adiposus-генотипа, изучены многие гормональные (инсулин, СТГ, глюкагон, спектр глюкокортикоидов, альдостерон) и метаболические (спектр липидов крови и мембран эритроцитов, всасывание Д‑ксилозы, гликемия и др.) параметры при экспериментальном и клиническом ожирении, разработаны патогенетическая классификация заболевания и принципы реадаптационной терапии [1–3]. В условиях несбалансированного питания, различных стрессовых воздействий, при генетически обусловленном низком уровне адаптивной особенности гормонального аппарата мозга и кишечника возможно кратковременное или стабильное нарушение функционирования ГМРК, что выражается в избыточном накоплении энергии и липосинтетической направленности обмена веществ. Полученные за последние годы новые данные относительно фармакокинетики пептидов позволяют вплотную заняться разработкой нового направления в терапии ожирения — использование в качестве лечебных средств некоторые из вышеуказанных пептидов. Так, уже известно, что ХЦК в дозе 0,25 мг на 1 кг массы тела уменьшает объем потребляемой пищи на 15 %, а в комбинации с той же дозой бомбезина — на 27 %, который, в свою очередь, снижает объем потребляемой пищи на 9%; максимальный эффект от совместного применения препаратов равен 80 %. В этой связи представляет, несомненно, перспективное Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 7 значение исследования цереброинтестинальных гормонов с позиций трофологии [4] — совершенно новой междисциплинарной науки о пище и питании, которая тесно связана с проблемами педиатрии. Изучение функционального состояния эндокринного аппарата кишечника у детей в условиях патологии только начинается. Получение данных о нормативах интестинальных пептидов в крови и тканях в различные периоды жизни ребенка явится, с нашей точки зрения, новым подходом к профилактике ряда заболеваний пищеварительного трак- та и обмена веществ. При оценке взаимоотношений между секрецией отдельных гормонов и нарушением деятельности ряда органов желудочно-кишечного тракта (как функциональных, так и органических), необходимо учитывать, что нарушение секреции гормонов может быть основным звеном, ответственным за развитие клинического синдрома, что изменение концентрации кишечных пептидов в крови или тканях является отражением глубины и распространенности поражения органа, и что супрессия механизма обратной связи между системами «кишечник- мозг» и «кишечник-поджелудочная железа» способствует развитию патологического состояния. Список литературы 1. Картелишев А.В. Вопросы ранней диагностики предрасположенности детей к конституционально-экзогенному ожирению.// «Педиатрия», 2006, № 4, стр. 7–11. 2. Туркина Т. И., Беспалова В.А., Сайкина Е. В. Содержание инсулина и триглицеридов в сыворотке крови при конституционально-экзогенном ожирении у детей.//«Педиатрия», 1980, № 6, стр. 25–27. 3. Туркина Т. И. Патохимические аспекты дислипидемий и ожирения в эксперименте и у детей. Дисс. канд. биол. наук., 1981, М. 4. Уголев А. М. Энтериновая (кишечная) гормональная система. Л., Наука, 1978. 318 с. Итоги XVII Всероссийской научно-практической конференции «Интеграция в лабораторной медицине» 27–29 марта 2012 года в МВЦ «Крокус Экспо» прошла XVII Всероссийская научно-практическая конференция «Интеграция в лабораторной медицине», организованная в соответствии с научными планами Российской медицинской академией последипломного образования (РМАПО) В работе конференции приняли участие 1 649 специалистов из 71 субъекта Российской Федерации и 55 зарубежных стран: Белоруссии (9), Бельгии (1), Германии (5), Дании (1), Испании (1), Казахстана (12), Канады (1), США (1), Украины (21), Финляндии (3), Франции (1). Организаторами мероприятия выступили: • Министерство здравоохранения и социального развития РФ; • Научно-практическое общество специалистов лабораторной медицины; • Российская медицинская академия последипломного образования; • конгресс-оператор «МЕДИ Экспо»; • журнал «Лаборатория» (информационная поддержка). В. В. Долгов Председатель оргкомитета конференции — профессор В. В. Долгов. А ктуальность темы конференции обусловлена необходимостью комплексного подхода к профилактике, диагностике и лечению, согласования применения лабораторных методов диагностики со стандартами оказания медицинской помощи, необходимости организации преемственности на этапах медицинской помощи. Новое в законодательстве здравоохранения требует от лабораторной службы страны целенаправленных интегрированных мероприятий по организационным, законодательным и образовательным формам деятельности, что и стало основным предметом обсуждения на конференции. Научная программа включала пленарные, секционные заседания, семинары, круглые столы, секцию молодых ученых, клинические разборы, школы передового опыта, дискуссионные клубы. По итогам мероприятия была принята резолюция 1. Научно-практическая конференция констатировала, что клиническая лабораторная диагностика — медицинская специальность, в рамках которой выполняется большой объем исследований. Однако перечень лабораторных 8 исследований значительно шире, чем те, что включаются в медицинские стандарты при диспансеризации населения, оказании специализированной и высокотехнологичной медицинской помощи, обследовании по экстренным показаниям. В лабораторной медицине активно внедряются высокотехнологичные исследования с применением молекулярно-генетических, иммунологических, биохимических, гематологических, коагулологических, цитологических, бактериологических, паразитологических, вирусологических и других методов. В практике лабораторной медицины все шире используется современное оборудование и наукоемкие технологии, интенсивно развиваются новые направления лабораторных исследований, которые, с одной стороны, оценивают все больше параметров состояния органов и систем человека, а с другой стороны, отражают мировые тенденции: персонифицированную диагностику, лекарственный мониторинг, оценку эффективности лечения конкретного пациента. В целях обеспечения эффективности применения высоких лабораторных технологий, их внедрения в диагности- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected] ческий процесс необходимо законодательно определить место лабораторной медицины в оказании медицинской помощи населению. 2. Научно-практическая конференция рекомендовала общественным организациям лабораторной медицины (научному обществу, ассоциации) активно включиться в законодательное нормотворчество по формированию современной базы работы клинических лабораторий. Отсутствие профильных стандартов и протоколов лабораторного обеспечения медицинской помощи требует разработки отдельных нормативных документов по штатному составу, принципов комплектации, оснащению клинико-диагностических лабораторий, перечню лабораторных исследований, порядкам и способам финансирования выполняемых исследований в клиникодиагностических лабораториях, включая специализированные, централизованные, экстренные лаборатории. 3. Научно-практическая конференция выказала обеспокоенность по игнорированию в новом законодательстве интересов и профессиональных навыков специалистов с биологическим образованием, ранее допущенных для работы в клинические лаборатории на должностях врачей-лаборантов. Современные лаборатории все больше приобретают черты автоматизированных комплексов современных молекулярно-биологических исследований, выполнять которые эффективно могут преимущественно специалисты с высшим биологическим образованием, включая биохимиков, биофизиков, молекулярных биологов, генетиков, микробиологов и других специалистов с немедицинским образованием. В то же время эти специалисты отстраняются современным законодательством в области медицины от получения оплаты за выполнение высокотехнологичной медицинской помощи, от получения квалификационных категорий, от руководства лабораторными подразделениями в медицинских учреждениях. 4. Научно-практическая конференция поддержала работу по созданию и внедрению в практику: • национальных стандартов Российской Федерации в области лабораторной медицины; • рабочих планов и программ подготовки специалистов клинической лабораторной диагностики на додипломном и последипломном уровнях, специалистов лабораторной диагностики со средним специальным образованием; • направления, перечень тем и технологию проведения конкурсов на научно-исследовательские и опытноконструкторские разработки (НИОКР) по Федеральной целевой программе создания отечественного медицинского (лабораторного) оборудования; • референсных значений лабораторных показателей в области гематологических, общеклинических и других видов лабораторных исследований, считает эти исследования приоритетными и обращается к лабораторным специалистам участвовать в этих работах. 5. Научно-практическая конференция приветствовала создание 2‑томного Национального руководства по клинической лабораторной диагностике (главные редакторы В. В. Долгов, В. В. Меньшиков, Геотар, 2012). Следующим национальным изданием должен e-mail: [email protected] быть учебник по клинической лабораторной диагностике, работу над созданием которого необходимо существенно интенсифицировать. 6. Научно-практическая конференция обратила внимание на несоответствие законодательной базы и порядков лабораторных исследований при проведении экспертных и диагностических лабораторных исследований: • по определению алкоголя в образцах биоматериалов (выдыхаемом воздухе, крови). Рекомендовала вместе с токсикологами разработать и начать работу по законодательному утверждению порядка освидетельствования на алкогольное и наркотическое отравление; • по порядкам организации лабораторного обеспечения серологических исследований в службе крови, по тестированию лекарственных средств, изготовленных с использованием донорской крови. 7. Научно-практическая конференция призвала лабораторную службу страны занять активную позицию в модернизации здравоохранения, усилить как законодательную, так и общественную составляющие развития лабораторной службы. Принимая во внимание большую численность специалистов с высшим образованием по специальности «биолог» в клинических лабораториях медицинских организаций, значимость вклада этих специалистов в оказание медицинских услуг по лабораторной диагностике и в целях эффективного управления качеством оказания медицинской помощи при подготовке новых нормативных документов, касающихся клинической лабораторной диагностики, учитывать необходимость определения порядка последипломного обучения и аккредитации указанных специалистов. 8. Достижения молодых ученых оценивались на специальном симпозиуме, который продемонстрировал высокий уровень научных работ молодых исследователей по клинической лабораторной диагностике. Наиболее значимые работы молодых специалистов, которые устанавливались научным комитетом из ведущих ученых, были отмечены грамотами и сертификатами, предоставляющими право на финансовое обеспечение дальнейшей НИР победителей конкурса. 9. Следующую весеннюю научно-практическую конференцию по клинической лабораторной диагностике решено провести на той же площадке — в МВЦ «Крокус Экспо» 26–28 марта 2013 г. по тематике «Аналитическая надежность и диагностическая значимость лабораторной медицины». В дни работы конференции проходила выставка современного лабораторного оборудования, реактивов и расходных материалов. В ней приняли участие 69 ведущих российских и зарубежных компаний. Полезная площадь экспозиции составила 800 кв. м. Организаторы XVII Всероссийской научно-практической конференции «Интеграция в лабораторной медицине» выражают благодарность главным спонсорам мероприятия — компаниям Siemens и Abbott Laboratories, а также спонсорам: Pribori Oy, Mindray, «Реагентика». Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 9 Персистирующие клетки микроорганизмов Н. В. Евдокимова, с. н. с. лаборатории клинической микробиологии, к. б. н. Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н. В. Склифосовского, Москва Д о настоящего времени проблема существования клетокперсистеров в микробных популяциях не получила широкого освещения в литературе и должного осознания в медицинском сообществе. Под термином «персистеры» подразумевают небольшое число клеток микробной популяции, которые, прекращая расти, остаются жизнеспособными. Эти клетки находятся в покоящемся состоянии, толерантны к антибактериальным препаратам. Они образуются в популяциях микроорганизмов при замедлении роста. Их доля в микробных популяциях невелика: в стационарной фазе роста число персистирующих клеток не превышает 1 % от общего числа, а в фазе активного роста их практически невозможно обнаружить. Присутствие персистирующих клеток долго не замечали или полагали, что их вклад в поддержание численности и жизнеспособности микробных популяций, в отличие от резистентных к антибиотикам клеток, незначителен. О существовании персистирующих клеток впервые заявил J. W. Bigger в 1941 году [11]. Работая с недавно внедренным в лечебную практику пенициллином, он обнаружил, что пенициллин разрушал не все клетки стафилококков. При добавлении антибиотика суспензия становилась прозрачной, происходил лизис клеток. После переноса лизата на агаризованную среду наблюдали рост небольшого числа колоний. Повторная инокуляция клеток из этих колоний на свежую среду и последующая обработка пенициллином не меняли картину — опять наблюдали рост небольшого числа клеток. Если бы способность к росту при высоких концентрациях антибиотика была связана с селекцией резистентных клеток, после повторной инокуляции практически все клетки 10 сохраняли бы способность к росту в присутствии антибиотика. Исследователь назвал эти клетки persisters (от англ. persist — устоять, сохраниться, продолжить существовать). Был сделан вывод о неспособности пенициллина воздействовать на все клетки стафилококков. Как показали дальнейшие исследования, эти клетки сохраняли жизнеспособность после обработки и другими антибиотиками. В последующие годы внимание исследователей полностью сфокусировалось на изучении мутантных штаммов, обладающих резистентностью к антибиотикам. В работах с резистентными штаммами выявляли высокие значения минимальной подавляющей концентрации антибиотика (МПК), исследовали свойства бета-лактамаз, изучали работу высокоэффективных транспортных систем, осуществляющих выведение антибиотиков из микробных клеток [33]. Спустя 40 лет в 1980‑е годы к проблеме персистирующих клеток вновь обратился генетик H. S. Moуed [8, 9, 37, 38], которого заинтересовали широкие фенотипические вариации в генетически однородных микробных популяциях и возможность образования клеток, обладающих толерантностью к высоким дозам антибиотиков. Он попытался получить мутантные штаммы, у которых образуется гораздо большее число персистирующих клеток. Был применен метод накопления персистирующих клеток, заключавшийся в многократной обработке бактериальной суспензии антибиотиком с последующим центрифугированием и «выбраковкой» резистентных клонов. В клетках-персистерах были изучены профили экспрессии хромосомных генов, кодирующих синтез внутриклеточных ингибиторов. Иными словами, была сделана Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 первая попытка увязать фенотипические проявления персистентности с генетическим базисом [24]. Спустя десятилетие на волне возникшего интереса к изучению микробных биопленок вновь вспомнили о персистирующих клетках [12]. Поразительная устойчивость микробных биопленок к воздействию многих антибактериальных препаратов, а также отсутствие в них клеток, обладающих известным арсеналом механизмов резистентности, ставили исследователей в тупик [35. 47]. Наличие матрикса, в который были погружены микробные клетки, затрудняло диффузию антимикробных препаратов, но не отменяло возможность проникновения антибиотиков внутрь биопленок [30, 48]. Отчасти невосприимчивость биопленок к стандартным методам лечения объяснялась созданием барьера для клеток иммунной системы [44]. Появились работы, по сути, повторяющие первые опыты J. W. Bigger, но с микроорганизмами, образующими биопленки. Эксперименты с воздействием различных доз антибиотиков на клетки P. aeruginosa из биопленок показали наличие клеток с толерантностью ко всем известным на тот момент антибиотикам [10, 42, 47]. Аналогичные данные были получены при изучении популяций E. coli. Использование флюоресцентной микроскопии позволило выявить в биопленках, образованных E. coli, бледно окрашенные клетки меньшего размера, обладавшие свойствами клеток-персистеров [25, 41]. Экспериментально доказали присутствие персистирующих клеток в биопленках, образованных микобактериями [6] и грибами [29]. Интересно, что персистирующие клетки были обнаружены только в биопленках, но не в планктонных культурах дрожжей [1, 29, 35, 36]. e-mail: [email protected] Работы с использованием методов проточной цитометрии, подкрепленные результатами молекулярногенетических исследований, показали, что персистирующие клетки являются покоящимися формами клеток. Они устойчивы ко многим неблагоприятным факторам внешней среды и значительно отличаются от активно растущих клеток [2, 4, 5, 30]. Многие современные микробиологи до сих пор рассматривают толерантность и резистентность как тождественные понятия. Однако толерантностью (или лекарственной индифферентностью) начиная с 1940‑х годов стали называть повышенную невосприимчивость к антибиотикам нерастущих или медленно растущих клеток бактерий [3, 31, 46, 48]. В частности, толерантность изучали в экспериментах с воспроизведением инфекционного процесса у животных [32]. Понимание глубинных различий между толерантностью персистирующих клеток и антибиотикорезистентностью мутантных клеток пришло только к 1980‑м годам. Большинство антибиотиков действуют на клетки, сохраняющие определенный уровень физиологической активности. Антибиотик внутри клетки атакует определенные мишени, активация или подавление которых приводит к синтезу внутриклеточных токсинов, автолизинов, нарушению биосинтетических реакций, синтезу высокореактивных кислородных радикалов [13, 22, 26]. В резистентных клетках механизмы защиты от антибиотика направлены на предотвращение процесса связывания с внутриклеточной мишенью [35]. Мишени (жизненно важные для клетки центры) в толерантных персистирующих клетках блокированы специфическими белками [35]. Именно поэтому клетки-персистеры устойчивы не только к антибиотикам, но и к солям ряда металлов (хроматам, арсенатам, теллуратам), токсичным для «нормальных» клеток [24, 35]. На практике наличие персистирующих клеток в популяции исследуемого штамма можно обнаружить следующим образом [25]. Меняя концентрацию антибиотика и отслеживая динамику жизнеспособных клеток, можно получить ниспадающую кривую с двумя характерными e-mail: [email protected] ступенями, образованными активно растущими и персистирующими клетками. Если же обработать суспензию резистентного штамма, то число жизнеспособных клеток не изменится во времени [35]. М е х а н и зм ы м о л е кул я р н о генетической и физиологической регуляции процессов переключения клеточного метаболизма при формировании персистеров пока изучены недостаточно. Неясно каким образом микробная популяция поддерживает необходимый для ее выживания уровень персистирующих клеток. Данные по генетическим аспектам регуляции образования клетокперсистеров многочисленны, но часто противоречивы [24]. Выявлены как гены, мутации в которых увеличивают число персистеров, так и те гены, которые подавляют процесс их образования [21]. Профиль экспрессии генов подтверждает предположение о покоящемся состоянии персистирующих клеток [24]. В персистирующих клетках были обнаружены гены, принадлежащие к так называемой токсин/антитоксин системе [19]. Расположенная в одном опероне пара генов, которая кодируют стабильный токсин и нестабильный антитоксин, регулирует обратимый процесс остановки роста клеток («бактериостазис») [11, 18]. Именно синтезу внутриклеточных белков‑токсинов отводится ведущая роль в поддержании персистирующего состояния [18, 35]. Изучение сложной системы регуляции экспрессии генов показало работу множества механизмов, дублирующих друг друга [24]. Такая многовариантность механизмов, по всей видимости, необходима для обеспечения выживания популяции при самом неблагоприятном развитии событий. Появление новых методов изучения популяций микроорганизмов, таких как проточная цитометрия, позволило изучать физиологическое состояние отдельных клеток. Это привело к пересмотру взгляда на структуру микробных популяций [24]. Традиционное представление о фенотипической однородности генетически однородной популяции оказалось ложным. Механизмы, лежащие в основе изменений фенотипов, относят к «шу- мам» на уровне экспрессии ключевых регуляторных факторов [23. 27, 28, 4, 45, 15]. Данные переключения либо являются реакцией на изменяющиеся условия окружающей среды, либо происходят спонтанно. Было сделано предположение о стохастическом характере переключения клеточного метаболизма при образовании персистирующих клеток [35]. Такой случайный характер образования указанных клеток дает возможность популяции микроорганизмов выжить тогда, когда катастрофические события происходят нечасто и нет времени для адаптации к резко изменившимся условиям внешней среды [15]. В связи с этим было бы интересно сравнить динамику образования клеток-персистеров у коллекционных штаммов, длительное время не контактировавших с антибиотиками, и у штаммов от больных, подвергшихся длительной антибиотикотерапии [24]. Обнаружение персистирующих клеток как в планктонных популяциях, так и в биопленках, образуемых микроорганизмами, позволило рассматривать их клиническую роль в более широком аспекте. С наличием биопленок стали связывать течение длительно рецидивирующих, хронических инфекционных заболеваний, трудно поддающихся стандартной терапии [20]. Скрытая угроза со стороны клеток-персистеров состоит в том, что до сих пор неизвестны пусковые механизмы, приводящие к их появлению. В одних и тех же микробных популяциях в однотипных условиях количество клеток-персистеров может значительно различаться [35]. Исходя из факта присутствия клеток-персистеров в биопленках, была предложена модель длительно рецидивирующих инфекций [33]. Применение антибиотика приводит к гибели большей части клеток биопленки. Далее клетки иммунной системы разрушают часть оставшихся активно растущих клеток и часть персистирующих клеток. После снижения концентрации антибиотика оставшиеся персистирующие клетки возобновляют рост, что приводит к повторному активному росту популяции [35]. Среди длительно рецидивирующих заболеваний можно выделить эндокардиты, заболевания моче- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 11 выделительной системы, заболевания зубов, десен и полости рта, а также осложнения, вызванные применением протезов, имплантов, катетеров [12, 14]. Вклад клеток-персистеров в хронизацию инфекционного процесса может быть связан также с тем, что они «прячутся» в макрофагах, в клетках гранулем, в слизистой желудка, в желчном пузыре [24]. Было показано, что многократное применение антибиотиков приводит к увеличению субпопуляции персистирующих клеток за счет селекции мутантных штаммов [16, 37, 48]. Селекцией штаммов с повышенным числом персистирующих клеток можно объяснить часто наблюдаемую неэффективность терапии высокими дозами антибиотиков при лечении рецидивирующих пневмоний у больных с муковисцидозом. У таких пациентов выделяли клетки синегнойной палочки с типичными признаками персистирующих клеток — высокая толерантность к антибиотикам при неизмененном МПК при возобновлении роста [39]. С другой стороны, существование персистеров на фоне длительной, не поддающейся антибиотикотерапии инфекции создает почву для развития резистентности [24, 35, 36]: наличие клеток-персистеров значительно удлиняет и делает малоэффективной антибиотикотерапию, что приводит к селекции резистентных штаммов. В связи с этим остро встает вопрос о поиске препаратов и разработке режимов их введения, обеспечивающих не столько подавление, сколько полную эрадикацию микробных клеток-персистеров. Особые трудности возникают при работе с медленно растущими видами микроорганизмов, такими как микобактерии [34]. Одним из подходов к решению данной проблемы является создание комбинаций антибиотиков с ингибиторами белков, обеспечивающих поддержание жизнеспособности персистирующих клеток [49]. Такой ингибитор был получен для мутантного штамма E.coli [43, добавление которого значительно снижало число персистирующих клеток. Другим интересным подходом является применение пульс-терапии, предложенной еще J. W. Bigger [7]. Идея состояла в том, что в промежут12 ке между введением антибиотика его концентрация должна была снизиться до уровня, при котором клетки начинали расти. Повторное введение антибиотика должно было уничтожить эти проросшие клетки. Испытание такого подхода на клетках P. aeruginosa в биопленках было вполне успешным [35]. Проблема заключается в трудности подбора индивидуального режима введения для каждого пациента, но это, по всей видимости, вопрос времени. Идея пульс-терапии поддерживается и в работах, использующих математическое моделирование процессов образования персистеров в популяции [17]. Расчеты показывают, что возможен подбор такого режима введения антибиотиков, при котором произойдет полная эрадикация микробных клеток. Таким образом, имеющиеся в настоящее время результаты изучения персистирующих клеток микроорганизмов позволяют говорить об их важности для клинической практики. Они играют особую роль в развитии хронических инфекционных заболеваний человека, в том числе вызванных образованием микробных биопленок. Существование персистирующих клеток приводит к удлинению сроков лечения антибактериальными препаратами и создает базис для селекции резистентных и полирезистентных штаммов микроорганизмов. В настоящее время в ряде европейских стран ведется поиск новых лечебных препаратов, подавляющих образование персистирующих клеток. Список литературы 1. Al-Dhaheri R. S., Douglas L. J. Absence of amphotericin B‑tolerant persister cells in biofilms of some Candida species//Antimicrob. Agents Chemother. — 2008.-Vol. 52. — P. 1884–1887. 2. Alix E., Blanc-Potard A. Hydrophobic peptides: novel regulators within bacterial membranes//Mol. Microbiol. — 2009. — Vol. 72– P.5–11. 3. Aridesi J. N., Zahller E., Roe F. and Stewart P. S. Role of nutrient limitation and stationary phase existence in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin//Antimicrob. Agents Chemother. — 2003. — Vol. 47. — P. 1251–1256. 4. Avery S. V. Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity//Nat. Rev. Microbiol. — 2006.-Vol. 4. — P. 577–587. 5. Balaban N. Q., Merrin J., Chait R., Kowalik L. and Leibler S. Bacterial persistence as a phenotypic switch//Science. — 2004. — Vol. 305. — P. 1622–1625. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 6. Barry C. E. 3rd, Boshoff H.I,. Dartois V., Dick T., Ehrt S., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies//Nat. Rev. Microbiol. — 2009. — Vol.7 — P.845–855. 7. Bigger J. W. Treatment of staphylococcal infections with penicillin//Lancet. — 1944. — Vol. 244– P. 497–500. 8. Black D. S., IrwinB., Moyed H. S. Autoregulation of hip, an operon that affects lethality due to inhibition of peptidoglycan or DNA synthesis//J. Bacteriol. — 1994. — Vol.176 — P.4081–4091. 9. B l a c k D . S . , K e l l y A . J . , M a r d i s M . J . , Moyed H. S. Structure and organization of hip, an operon that affects lethality due to inhibition of peptidoglycan or DNA synthesis//J. Bacteriol. — 1991. — Vol. 173. — P. 5732–5739. 10. Brooun A., Liu S., Lewis K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms//Antimicrob. Agents Chemother. — 2000. –Vol.44. — P. 640–646. 11.Christensen S. K., Mikkelson M., Pedersen K. and Gerdes K. RelE, a global inhibitor of translation is activated during nutritional stress//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2001. — Vol. 98. — P. 14328–14333. 12.Costerton J. W., Stewart P.S., Greenberg E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections//Science. — 1999. — Vol. 284. — P. 1318–22 13. Davis B. D., Chen L. L., Tai P. C. Misread protein creates membrane channels: an essential step in the bactericidal action of aminoglycosides//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1986. — Vol. 83. — P. 6164–6168. 14. DelPozo J., Patel R. The challenge of treating biofilm-associated bacterial infections//Clin. Pharmacol. Ther. — 2007. — Vol. 82. — P. 204–209. 15. Dhar N. and McKinney J. D. Microbial phenotypic heterogeneity and antibiotic tolerance//Curr. Opin. Microbiol. — 2007. — Vol. 10. — P. 30–38. 16. Dorr T., Vulic M. and Lewis K. Ciprofloxacin causes persister formation by inducing the TisB toxin in E.coli//PloS Biology/ — 2010.– Vol. 8 (2). — P. 1–8. 17. Fu Y., Zhu M. and Xing J. Resonant actination: a strategy against bacterial persistence//Phys. Biol. — 2010. — Vol. 7. — P. 1–9. 18.Gerdes K. Toxin–antitoxin modules may regulate synthesis of macromolecules during nutritional stress//J. Bacteriol. — 2000. — Vol. 182. — P. 561–572. 19.Gerdes K., Christensen S. K. and LobnerOlessen A. Prokaryotic toxin–antitoxin stress response loci//Nature Rev. Microbiol. — 2005. — Vol. 3. — P. 371–382. 20.Hall-Stoodley L., Costerton J. W. and Stoodley P. Bacterial biofilms: From natural environment to infectious diseases//Nat. Rev. Microbiol. — 2004. — Vol. 2. — P. 95–108. 21.Hansen S., Lewis K. and Vulic M. The role of global regulators and nucleotide metabolism in antibiotic tolerance in E. coli//Antimicrob. Agents. Chemother. — 2008. — Vol. 52. — P. 2718–2726. 22.Hooper D. Mechanism of action of antimicrobials: focus on fluoroquinolones//Clin. Infect. Dis. — 2001. — Vol. 32. — S9–15. 23.Jayaraman R. Modulation of allele leakiness and adaptive mutability in Escherichia coli//J. Genet. — 2000. — Vol. 79. — P. 1–6. 24.J a y a r a m a n R . B a c t e r i a l p e r s i s tence: some new insights into an old phenomenon//J. Biosci. — 2008. — Vol. 33. — P. 795–805. e-mail: [email protected] 25.Keren I., Kaldalu N., Spoering A., Wang Y., Lewis K. Persister cells and tolerance to antimicrobials//FEMS Microbiol. Lett. — 2004. –Vol. 230. — P. 13–18. 26.Kohanski M. A., Dwyer D. J., Hayete B., Lawrence C. A., Collins J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics//Cell –2007. — Vol. 130. — P. 797–810. 27.Kussell E., Kishony R., Balaban N. Q. and Leibler S. Bacterial persistence: A model of survival in changing environments//Genetics. — 2005. — Vol. 169. — P. 1807–1814. 28.Kussell E. and Leibler S. Phenotypic diversity, population growth and information in fluctuating environments//Science. — 2005. — Vol. 309. P. 2075–2078. 29.LaFleur M. D., Kumamoto C. A., Lewis K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells//Antimicrob. Agents Chemother. — 2006. — Vol.50. — P. 3839–3846. 30.Lawrence R. Mulcahy, Jane L. Burns, Stephen Lory, and Kim Lewis Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis//J. Bacteriol. — 2010 — Vol. 192 (23) — P.6191–99. 31. Lee S. W., Foley E. J. and Epstein J. A. Mode of action of penicillin I. Bacterial growth and penicillin activity — Staphylococus aureus FDA//J. Bacteriol. — 1944. — Vol. 48. — P. 393–399. 32.Levin B. R. and Rozen D. E. Noninherited antibiotic resistance//Nat. Rev. Microbiol. — 2006. — Vol. 4. — P. 556–562. 33.Lewis K. Riddle of biofilm resistance//Antimicrob. Agents Chemother.- 2001. — Vol. 45. P. 999–1007. e-mail: [email protected] 34.Lewis K. Persister cells, dormancy and infectious disease//Nat. Rev. Microbiol. — 2007. Vol. 5. — P. 48–56. 35.Lewis K. Persister cells//Annu. Rev. Microbiol. — 2010. — Vol. 64. — P. 357 – — 372. 36.Lewis K., Spoering A., Kaldalu N., Keren I., Shah D. Persisters: specialized cells responsible for biofilm tolerance to antimicrobial agents. In Biofilms, Infection, and Antimicrobial Therapy, ed. J. Pace, M. E. Rupp, R.G. Finch. Boca Raton, FL: Taylor & Francis. — 2005. — P. 241–256. 37.Moyed H. S., Bertrand K. P. hipA, a newly recognized gene of Escherichia coli K‑12 that affects frequency of persistence after inhibition of murein synthesis//J. Bacteriol. — 1983. — Vol. 155. — P. 768–775. 38.Moyed H. S., Broderick S. H. Molecular cloning and expression of hipA, a gene of Escherichia coli K‑12 that affects frequency of persistence after inhibition of murein synthesis//J. Bacteriol. — 1986. — Vol. 166. — P. 399–403. 39.Periasamy S., Joo H. S., Duong A. C., Bach T. H. et al. How Staphylococcus aureus biofilms develop their characteristic structure//Proc. Nath. Acad. Sci. USA — 2012. — Vol. 109. — P.1281–1286. 40.Shah D., Zhang Z., Khodursky A., Kaldalu N., Kurg K., Lewis K. Persisters: a distinct physiological state of E. coli//BMC Microbiol. — 2006. — Vol. 6. — P. 53–— 61. 41.Shah D, Zhang Z., Rhodursky A., Kaldalu N., Kurg K. and Lewis K. Persisters: a distinct physiological state of E.coli//BMC Microbiology — 2006. — Vol. 6, P. 53. 42.Spoering A. L., Lewis K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials//J. Bacteriol. –2001. — Vol. 183. P. 6746–6751. 43.Spoering A. L., Vulic M. and Lewis K. GlpD and PlsB participate in persister cell formation in Escherichia coli//J. Bacteriol. — 2006. — Vol. 188. — P. 3494–3497. 44.Stewart PS, Costerton JW. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms//Lancet. — 2001. — Vol. — P. 358:135–38 45.Suel G. M., Garcia-Ojalvo J., Lieberman L. M.. and Elowitz M. B. An excitable gene regulatory circuit induces transient cellular differentiation//Nature (London) — 2006. — Vol. 440. — P. 545–550. 46.Trumanen E., Cozens R., Tosch W., Zak O. and Tomasz A. The rate of killing of E. coli by β-lactam antibiotics is strictly proportional to the bacterial growth//J. Gen. Microbiol. — 1986. Vol. 132. — P. 1297–1304. 47.Walters M. C. 3rd, Roe F., Bugnicourt A., Franklin M. J., Stewart P. S. Contributions of antibiotic penetration, oxygen limitation, and low metabolic activity to tolerance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to ciprofloxacin and tobramycin. Antimicrob. Agents Chemother. — 2003. — Vol. 47. — P. 317–323. 48.Wolfson J. S., Hooper D. C., McHugh G. L., Bozza M. A., Swartz M. N. Mutants of Escherichia coli K‑12 exhibiting reduced killing by both quinolone and betalactam antimicrobial agents//Antimicrob. Agents Chemother. — 1990. — Vol. 34. — P. 1938–1943. 49.Z e l l e r H . J . a n d V o i g t W . H . E f f i c a c y of ciprofloxacin in stationary phase bacteria in vitro//Am. J. Med. — 1987. — Vol. 82. — P. 87–90. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 13 Новые аспекты лабораторной диагностики респираторного микоплазмоза Е. В. Щетинин, д. м. н., зав. кафедрой патологической физиологии М. В. Батурина, научный сотрудник В. А. Батурин, д. м. н., проф., зав. кафедрой клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, ООО «Центр клинической фармакологии и фармакотерапии», Ставрополь New dimensions in laboratory diagnosis of respiratory mycoplasmosis Baturin V. A., Shetinin E. V., Baturina M. V. Резюме Обобщен многолетний опыт мониторинга возбудителей внебольничных инфекций респираторного тракта. Приведены данные о составе возбудителей респираторных инфекций и динамике резистентности к противомикробным препаратам Mycoplasma pneumoniae. Выявленная частота респираторного микоплазмоза и резистентность микоплазм к противомикробным средствам обосновывает использование методов выявления Mycoplasma pneumoniae в повседневной практике работы бактериологических лабораторий. Ключевые слова: респираторные инфекции, тест-системы, Mycoplasma pneumoniae. А декватный выбор антибактериального препарата при инфекционных процессах реализуется при наличии объективной информации о составе возбудителей и их чувствительности к противомикробным препаратам (ПМП). Обязательное проведение бактериологических исследований позволяет не только накапливать подобную информацию, но и решать вопросы о выборе терапии или ее смене при неэффективности. Приоритетным направлением современного здравоохранения в области диагностики можно считать приближение микробиологического диагностического комплекса к пациенту с применением воспроизводимых методов [1, 2]. Учитывая распространенность и значимость микоплазменных инфекций, проведен анализ десятилетнего опыта работы «Центра клинической фармакологии и фармакотерапии» в Ставрополе по контролю за возбудителями инфекций респираторного тракта с оценкой роли различных микроорганизмов, включая Mycoplasma pneumoniae, в общей структуре возбудителей. 14 Summary Generalized experience of community-acquired infections monitoring respiratory tract pathogens. Lists information about the composition of the pathogens of respiratory infections and dynamics of antimicrobial resistance Mycoplasma pneumoniae. Revealed the frequency of respiratory mycoplasmosis and mycoplasmas resistance to antimicrobial means justifies the use of methods of detection of Mycoplasma pneumoniae in the everyday practice of the bacteriological laboratory. Keywords: respiratory infections, test systems, Mycoplasma pneumoniae. Материалы и методы C 2000 года обследовано более 20 тыс. пациентов с внебольничными инфекциями респираторного тракта, обратившихся в поликлиники, а также госпитализированных в стационары Ставрополя после лечения в условиях поликлиники. Исследовались мазки из зева, носа, пунктаты пазух носа, мокрота. Получение, сбор и транспортировку патологического биологического материала от пациентов, посев первичного материала, выделение чистой культуры микроорганизмов и определение чувствительности к ПМП диско-диффузионным и иными методами производили в соответствии с установленными правилами [3–6]. Кроме того, в первые же сутки клинический материал исследовался методом прямой иммунофлюоресценции с использованием антимикоплазменных антител (ООО «Ниармедик плюс», Россия). При положительном результате материал от пациента подвергался дальнейшему исследованию с помощью тест-систем для выделения и определения чувствительности к ПМП Mycoplasma pneumoniae («Пневмо-тест» НПО «Иммунотэкс», Россия). Метод Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 позволяет в сроки от 48 до 72 часов выявить ферментативную активность жизнеспособных форм Mycoplasma pneumoniae и получить результат по оценке резистентности респираторных микоплазм к эритромицину, кларитромицину, азитромицину, тетрациклину, доксициклину, ципрофлоксацину, офлоксацину с использованием значений МПК и фармакокинетических / фармакодинамических характеристик препаратов. Для проведения бактериологических исследований использовались расходные материалы производства Becton Dickinson, США; Sigma, США; bioMerieux, Франция; COPAN, Италия; «Аквапаст», Россия; ООО «Ниармедик плюс», Россия; ООО НПО «Иммунотэкс», Россия. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием методов параметрической и непараметрической статистики, реализованных в пакете программы Excel для Windows XP (Microsoft Corp.). Для оценки достоверности различий в связанных выборках применялся критерий Фишера. Различия считались достоверными при p ≤ 0,05. e-mail: [email protected] Таблица 1 Структура возбудителей обострений хронического рецидивирующего тонзиллита/фарингита Результаты Тонзиллиты, фарингиты При острых тонзиллитах/фарингитах (обследовано 5 678 больных) Streptococcus pyogenes выделен в 20 % случаев. При рецидивирующих формах заболевания (всего 668 больных) диагноз бактериологически подтвержден у 425 (63,6 %) обследованных, при этом выделено 523 штамма микроорганизмов. Стрептококковый процесс выявлен у 37 % обследованных больных, что составило 45 % от числа пациентов, у которых диагноз был подтвержден бактериологическими методами. В 24,5 % случаев выделена Mycoplasma pneumoniae (таблица 1). В ассоциациях с микоплазмами или стрептококками у 98 пациентов были идентифицированы Staphylococcus aureus и/или представители Enterobacteriaceae spp. За весь период исследований не было выделено ни одного штамма Streptococcus pyogenes, резистентного к беталактамным антибиотикам, ванкомицину и левофлоксацину. Количество резистентных к эритромицину стрептококков группы А за 10 лет увеличилось с 6,2 % в 2001 г. до 12,4 % в 2010 г. К левомицетину резистентность осталась на прежнем уровне: 35–38 % во все периоды исследования. Синуситы При синуситах диагноз бактериологически был подтвержден у 380 пациентов из 710 обследованных. Результаты свидетельствуют, что в пунктатах чаще всего определяются Streptococcus pneumoniae, H. influenzae, Staphylococcus aureus и энтеробактерии. Достаточно часто обнаруживалась и Mycoplasma pneumoniae. Вместе с тем доля отдельных микроорганизмов в общей структуре отличалась в разных возрастных категориях обследованных (таблица 2). В частности, у старших пациентов уменьшается доля выделяемых пневмококков, а вероятность выявления в пунктатах ассоциаций микроорганизмов увеличивается. В частности в возрастной группе до 35 лет часто сочетаются пневмококки и гемофильные палочки со стаe-mail: [email protected] Возбудитель % от общего числа больных с бактериологически подтвержденным диагнозом (n — 425) Streptococcus pyogenes 45,2 % Streptococcus pneumoniae 7,8 % Enterococcus faecalis 3,5 % Staphylococcus aureus 26,8 % Enterobacteriaceae spp. 15,3 % Mycoplasma pneumoniae 24,5 % Таблица 2 Общая структура возбудителей острых синуситов в зависимости от возраста обследованных Возбудитель Всего (n — 380) До 7 лет (n — 89) 7–35 лет (n — 230) Старше 35 лет (n — 61) Streptococcus pneumoniae 48,2 % 73 % 42,6 %* 32,8 %* Staphylococcus aureus 18,9 % 9 % 23,9 %* 14,8 % H. influenzae 19,7 % 10,1 % 23,9 %* 18 % Enterobacteriaceae spp. 5,3 % 6,7 % 3,1 % 11,4 % Mycoplasma pneumoniae 7,9 % 1,2 % 6,5 %* 23 %* * — р < 0,05 в сравнении с показателями группы больных в возрасте до семи лет. Таблица 3 Структура микроорганизмов, выделяемых при внебольничных инфекциях респираторного тракта в поликлиниках Ставрополя, с учетом диагноза ( % от общего числа выделенных штаммов) Возбудители Пневмония (n — 811) Хронический бронхит (n — 1 418) ХОБЛ (n — 661) Streptococcus pneumoniae 42,8 % 37,8 %* 45 % Staphylococcus spp. 3,3 % 6,6 %* 8,9 %* H. influenzae 5 % 15,6 %* 8,9 % Enterobacteriaceae spp. 14,4 % 21,2 % 21,8 % Pseudomonas aeruginosa 0 % 2,8 %* 2,4 % Mycoplasma pneumoniae 34,5 % 16 %* 13 %* * — р < 0,05 в сравнении с данными, полученными в группе больных с ВП. филококками. У пациентов старше 35 лет повышается вероятность ассоциации с Mycoplasma pneumoniae. Внебольничные инфекции нижних отделов респираторного тракта При инфекционных заболеваниях нижних отделов респираторного тракта в амбулаторной практике структура выделяемых микроорганизмов зависела от установленного диагноза, возраста пациента, а также антибактериального анамнеза, предшествовавшего бактериологическому исследованию. Streptococcus pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae определялись наиболее часто (таблица 3). Гемофильные палочки в 2–3 раза чаще выделялись из мокроты больных с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и хроническим необструктивным бронхитом, чем у больных с внебольничной пневмонией (ВП). Mycoplasma pneumoniae заметно реже обнаруживалась в мокроте больных с хроническими формами патологии. С возрастом, независимо от диагноза, увеличивалась доля пневмококков, гемофильных палочек и различных представителей семейства Enterobacteriaceae. Роль Mycoplasma pneumoniae значительно снижалась. Вместе с тем даже у пациентов старше 60 лет микоплазмы занимали существенную долю в общей структуре возбудителей (до 10 %), что требует обязательного микробиологического мониторинга с выделением данного микроорганизма, особенно при ХОБЛ. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 15 16 Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected] Чувствительность основных возбудителей к ПМП Streptococcus pneumoniae. Выделено 1 653 штамма пневмококков. Динамика нарастания резистентности к часто используемым ПМП представлена в таблице 4. Наиболее существенными следует признать увеличение доли резистентных к пенициллинам штаммов пневмококков за весь период наблюдений практически в три раза. Резистентность Streptococcus pneumoniae к макролидам ежегодно имеет тенденцию к нарастанию: за десять лет количество штаммов, нечувствительных к эритромицину, увеличилось в 1,5 раза. Сохранялась высокой устойчивость пневмококков к тетрациклину и котримоксазолу. Mycoplasma pneumoniae Бактериологическую диагностику микоплазмозов начали проводить с 2005 года. Проводили оценку чувствительности к ПМП микоплазм, выделнных от пациентов, проходивших лечение в стационаре. Интересным можно считать отсутствие нарастания резистентности у выделяемых штаммов Mycoplasma pneumoniae только к фторхинолоновым препаратам (таблица 5). Макролидные препараты значительно снизили свою активность в отношении микоплазм. Таким образом, в структуре возбудителей инфекций верхних и нижних отделов респираторного тракта Mycoplasma pneumoniae занимает 2–3 место по частоте выявления. Обнаруженное нарастание резистентности микоплазм к ПМП, по всей видимости, связано с характером потребления препаратов в амбулаторной практике и селекцией пациентов, когда в стационар попадали лишь те, у которых стартовая антиботикотерапия была малоэффективна [8]. Поскольку чаще всего лечение начиналось, согласно стандартам терапии, с применения беталактамных антибиотиков, становится понятной высокая доля обнаружения Mycoplasma pneumoniae. Нарастающее применение макролидов, в свою очередь, видимо, опреe-mail: [email protected] Таблица 4 Количество резистентных к ПМП штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных в разные годы исследования Годы исследования 2001/02 (n — 259) 2003/04 (n — 333) 2005/06 (n — 369) 2007/08 (n — 365) 2009/10 (n — 327) Оксациллин 2,8 % 4,2 % 4,8 % 8,4 %* 8,0 %* Эритромицин 12,4 % 14,6 % 17,5 % 16,3 % 18,4 %* Левомицетин 9,6 % 8,4 % 10,3 % 9,6 % 10,4 % Тетрациклин 20,6 % 19,4 % 23,4 % 26,8 % 29,3 %* Ко-тримоксазол 31,4 % 33,6 % 38,4 %* 39,6 %* 44,2 %* Клиндамицин 4,3 % 2,4 % 6,0 % 4,8 % 6,3 % * — р < 0,05 в сравнении с данными, полученными в 2001/02 гг. Таблица 5 Количество резистентных к ПМП штаммов Mycoplasma pneumoniae, выделенных в разные годы исследования Годы исследования 2005/06 (n — 39) 2007/08 (n — 36) Ципрофлоксацин 7,7 % 5,6 % 2009/10 (n — 56) 5,7 % Офлоксацин 12,8 % 16,3 % 16,1 % Эритромицин 20,5 % 33,3 % 53,6 %* Азитромицин 18 % 19,4 % 50 %* Кларитромицин 12,8 % 19,4 % 33,9 %* Тетрациклин 5,1 % 8,3 % 13,9 % Доксициклин 5,1 % 8,3 % 13,9 % * — р < 0,05 в сравнении с данными, полученными в 2005/06 гг. деляет выявление значительного количества резистентных к этим антибиотикам микоплазм. Полученные результаты согласуются с выявленными фактами нарастания резистентности Mycoplasma pneumoniae [9] в Японии. Учитывая, что в период с 2002 по 2006 г. в Японии выявлено нарастание доли макролид-резистентных штаммов респираторных микоплазм (до 30,6 %), выделенных у детей с внебольничной пневмонией, предложенный метод скрининга микоплазм, позволивший выявить подобную же тенденцию в нашем исследовании, можно рекомендовать в практику работы бактериологических лабораторий. Выводы 1. Наиболее часто при внебольничных инфекциях респираторного тракта выделяются в ходе бактериологического исследования Streptococcus pyogenes (тонзиллиты/фарингиты), Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae. 2. Анализ результатов микробиологического мониторинга за последние десять лет показал нарастание резистентности Mycoplasma pneumoniae к макролидным антибиотикам. 3. Лабораторные методы, используемые в ходе постановки диагноза и определения тактики терапии, должны включать методики быстрой детекции микроорганизмов с оценкой их чувствительности к используемым в практике ПМП. Список литературы 1. Mera R. M., Miller L. A., Daniels J. J., Weil J. G., White A. R. Increasing prevalence of multidrugresistant Streptococcus pneumoniae in the United States over 10‑year period: Alexander project.//Diagn Microbiol Infect Dis 2005; 51 (3): 195–200. 2. Щетинин Е. В., Батурин В. А., Алиева Е. В. Стандартизация антибактериальной терапии: региональный опыт и проблемы.//Проблемы стандартизации в здравоохранении. — 2012. — № 3–4. — С 28–32. 3. Зубков М. Н. Сбор, транспортировка биологического материала и трактовка результатов микробиологических исследований.//Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2004.- Т. 6, № 2.- С. 143–154. 4. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890–04).//Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2004.- Т. 6, № 4.- С. 306–357. 5. NCCLS Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Ninth Informational Supplement. NCCLS document M100‑S0. — 1999. — 19 (1). 6. NCCLS Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. Eleventh Informational Supplement, M100‑S11. — 2001. — 21 (1). 7. Guidelines for ATC classification and DDD assignment.//WHO Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology. 6th ed.; Oslo.- 2003. 8. Щ е т и н и н Е . В . , Б а т у р и н В . А . , Б а т у р и на М. В. Респираторный микоплазмоз. Есть ли необходимость в оценке распространенности и эффективности противомикробных препаратов?//Проблемы стандартизации в здравоохранении. — 2012. — № 1–2. — С 47–50. 9. Morozumi M., Iwata S., Hasegawa K., Chiba N., Takayanagi R. et al. Increased Macrolide Resistance of Mycoplasma pneumoniae in Pediatric Patients with Community-Acquired Pneumonia.//Antimicrobial agents and chemotherapy, 2008, Vol. 52, No. 1, p. 348–350. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 17 Влияние герпетической инфекции на минеральный состав биологических жидкостей Н. А. Терёхина, д. м. н., проф., зав. кафедрой биохимии С. Э. Реук, к. м. н., доцент кафедры биохимии Л. И. Соловьева, к. м. н., ассистент кафедры глазных болезней Кафедра биохимии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е. А. Вагнера» Минздрава России, Пермь Influence of herpetic infection on mineral composition of biological liquids N. A. Terekhina, S. E. Reuk, L. I. Solovyova Резюме В слезной и ротовой жидкости и плазме крови 24 детей и 38 взрослых больных герпетическим кератитом установлен дисбаланс минеральных веществ: кальция, магния, фосфора, железа, цинка, меди, натрия и калия. Выявлены возрастные различия минерального состава слезы при герпетическом кератите. В биологических жидкостях из всех изученных элементов при офтальмогерпесе больше всего изменяется содержание меди и цинка. Результаты данной работы обосновывают целесообразность включения в комплексную терапию офтальмогерпеса цинка. Ключевые слова: минеральный состав, слезная жидкость, ротовая жидкость, офтальмогерпес. Н. А. Терёхина Summary In tears, saliva and blood plasma of 24 children and 38 adult patients with herpetic keratitis set imbalance of minerals such as calcium, magnesium, phosphorus, iron, zinc, copper, sodium and potassium. Established age differences in the mineral composition of tears herpetic keratitis. In biological liquids of all investigated elements in ophthalmoherpes most changes the content of copper and zinc. The results of this study confirm the appropriateness of including in the complex therapy of ophthalmoherpes zinc. Keywords: mineral composition, tear, saliva, ophthalmoherpes. С. Э. Реук С реди вирусных инфекций самой распространенной является герпетическая. В последние годы наблюдается неуклонный рост числа заболеваний глаз, вызванных вирусом простого герпеса (ВПГ). В России ежегодно регистрируется 300–500 тыс. случаев офтальмогерпеса [1]. Рецидивы герпетического кератита возникают в 25 % случаев после первой атаки ВПГ и в 75 % после повторных [1, 11]. Учащение рецидивов и утяжеление офтальмогерпеса связано с отсутствием четкого алгоритма в диагностике и лечении этого заболевания, что, в свою очередь, вызвано недостаточ- ным изучением молекулярных основ герпетического кератита. Известно, что при герпетической инфекции изменяется белковый и ферментативный состав ротовой (РЖ) и слезной (СЖ) жидкостей [2, 7, 8, 9], биохимический анализ которой имеет диагностическое и прогностическое значение [5, 6, 8]. Цель исследования Изучить в динамике минеральный состав биологических жидкостей человека (слезная и ротовая жидкость, плазма крови) при герпетическом кератите. Материалы и методы Для исследования были исполь- Таблица 1 Содержание минеральных веществ в биологических жидкостях здоровых взрослых людей 18 слезная жидкость ротовая жидкость К, ммоль/л 30,37 ± 1,60 19,8 ± 2,04 плазма крови 3,84 ± 0,35 Na, ммоль/л 138,65 ± 2,75 8,73 ± 1,48 141,27 ± 22,67 Р, ммоль/л 0,16 ± 0,02 4,59 ± 0,66 1,02 ± 0,16 Са, ммоль/л 1,14 ± 0,12 0,82 ± 0,11 2,46 ± 0,19 Mg, ммоль/л 0,58 ± 0,08 0,34 ± 0,07 0,83 ± 0,07 Fe, мкмоль/л 4,8 ± 1,14 0,94 ± 0,11 18,33 ± 2,31 Cu, мкмоль/л 26,37 ± 2,34 15,27 ± 2,06 14,51 ± 1,68 Zn, мкмоль/л 8,89 ± 0,98 9,28 ± 1,37 11,2 ± 0,98 Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 зованы три биологических жидкости: слеза, ротовая жидкость, плазма крови. Слёзную жидкость собирали по методу [4], ротовую жидкость по методу [2]. В биологических жидкостях 24 детей от 2 до 16 лет, 38 взрослых больных различными формами герпетического кератита спектрофотометрически определяли содержание кальция по методу [10], магния по [15], фосфора по [13], железа по [16], цинка по [12], меди по [14], натрия и калия при помощи ионселективных электродов. Контролем служили биологические жидкости 33 здоровых взрослых лиц и 27 здоровых детей. Результаты исследований В слезной жидкости здоровых детей и взрослых концентрация калия почти в восемь раз превосходит концентрацию этого электролита в плазме крови (табл. 1). Концентрация натрия в плазме крови такая же как в слезной жидкости, а содержание фосфора, железа, кальция и магния в слезной жидкости меньше, чем в плазме крови, как у детей, так и у взрослых. e-mail: [email protected] Рис. 1. Содержание минеральных веществ в слезной жидкости детей при офтальмогерпесе. К — контроль, 1 — герпетический кератит, 2 — древовидный герпетический кератит, 3 — глубокие формы герпетического кератита. Рис. 2. Содержание меди в слезе, ротовой жидкости и плазме крови взрослых больных герпетическим кератитом. К — контроль, 1 — герпетический кератит, 2 — древовидный герпетический кератит, 3 — метагерпетический кератоиридоциклит с изъязвлением. В слезе взрослых людей при герпетическом кератите достоверно снижается содержание фосфора, калия, железа, и увеличивается содержание магния. В СЖ детей при герпетическом кератите уменьшается концентрация магния и фосфора, что, возможно, связано с увеличением слезоотделения в период разгара заболевания (рис. 1). Концентрация калия в СЖ детей достоверно увеличивается по сравнению с контролем, что можно объяснить выходом его из разрушенных ВПГ клеток эпителия роговицы. Наибольшие изменения содержания калия, железа, магния и фосфора в СЖ детей наблюдаются при тяжеe-mail: [email protected] лых формах герпетического поражения роговицы (рис. 1). При офтальмогерпесе в СЖ детей и взрослых нет достоверных изменений содержания натрия и кальция. В плазме крови, РЖ детей и взрослых больных герпетическим кератитом не выявлены изменения содержания калия, натрия, кальция, фосфора, железа и магния. Содержание меди в СЖ, РЖ и плазме крови взрослых больных древовидным герпетическим кератитом увеличивается в 1,5–2 раза по сравнению с контролем (рис. 2). При метагерпетическом кератоиридоциклите с изъязвлением установлено достоверное снижение содержания этого микроэлемента в исследованных биологических жидкостях. В СЖ детей выявлено снижение содержания меди при всех клинических формах заболевания (рис. 3). Снижение содержания меди в СЖ детей и взрослых, вероятно, связано с резким снижением в ней уровня церулоплазмина [9]. Наиболее существенно из изученных минеральных веществ в СЖ при офтальмогерпесе изменяется содержание цинка. Концентрация этого микроэлемента в слезе здоровых детей составляет 21,59 ± 7,36 мкмоль/л, что в 2,5 раза больше, чем у взрослых людей (рис. 3). При герпетическом поражении роговицы в слезе взрослых людей содержание цинка резко падает: в 13 раз в слезе герпесинфицированного глаза и в 5 раз в слезе контрлатерального глаза. Изменение содержания минеральных веществ не только в слезе герпесинфицированного, но и контрлатерального глаза свидетельствует о необходимости лечения обоих глаз при герпетическом кератите. В СЖ детей при герпетическом кератите цинк не удалось обнаружить вовсе. При древовидном герпетическом кератите концентрация цинка в РЖ, плазме крови увеличивается в 1,5 раза, а при метагерпетическом кератоиридоциклите с изъязвлени- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 19 Рис. 3. Содержание цинка и меди в слезной жидкости больных герпетическим кератитом. К — контроль, 1 — герпесинфицированный глаз, 2 — контрлатеральный глаз. Рис. 4. Содержание цинка в слезе, ротовой жидкости и плазме крови больных герпетическим кератитом. К — контроль, 1 — герпетический кератит, 2 — древовидный герпетический кератит, 3 — метагерпетический кератоиридоциклит с изъязвлением. ем снижается в 2–2,5 раза (р < 0,05) по сравнению с контролем (рис. 4). Содержание изученных микроэлементов в биологических жидкостях нормализуется после лечения только у пациентов, перенесших древовидный герпетический кератит. Обсуждение результатов При герпетическом кератите наблюдается дисбаланс минеральных веществ в биологических жидкостях организма. Минеральный состав СЖ очень чувствителен к состоянию глаза и отражает обменные процессы, протекающие в нем. Установлены возрастные различия минерального состава слезы при герпетическом кератите. Содержание калия в СЖ детей увеличивается, а у взрослых снижается; содержание магния, напротив, увеличивается в СЖ взрослых и снижается у детей. В биологических жидкостях из всех изученных элементов при офтальмогерпесе больше всего изменяется содержание меди и цинка. В СЖ присутствие цинка резко снижается при всех 20 клинических формах заболевания, а содержание меди возрастает при древовидном герпетическом кератите и падает при метагерпетическом кератоиридоциклите. Содержание минеральных веществ изменяется не только в СЖ герпесинфицированного, но и контрлатерального глаза, что свидетельствует о необходимости лечения обоих глаз при герпетическом кератите. Установлено увеличение содержания меди и цинка в РЖ и плазме крови при древовидном герпетическом кератите и снижение при метагерпетическом кератоиридоциклите с изъязвлением. Полученные результаты позволили нам рекомендовать включение неферментативного антиоксиданта цинка в лечение больных герпетическим кератитом [3]. Патогенетически обоснованное назначение цинка при офтальмогерпесе сокращает сроки эпителизации роговицы. Использование цинка в комплексном лечении больных оказалось весьма полезным из-за его антиоксидантных и мембранопротекторных свойств. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 Список литературы 1. Каспаров А. А. Лечение герпес-вирусного кератита//Герпес.- 2006.- № 1.-С. 13–19. 2. Петрович Ю. А., Терёхина Н. А., Реук С. Э., Сухова Т. В. Прооксиданты, мексидол и другие антиоксиданты при герпетическом стоматите, гингивостоматите и хроническом генерализованном пародонтите//Российский стоматологический журнал.-2010.-№ 4.-С. 17–19. 3. Т е р ё х и н а Н . А . , Г о р я ч е в Ю . Е . , Реук С. Э. Обоснование использования неферментативных антиоксидантов в лечении больных офтальмогерпесом//Пермский медицинский журнал.-2003.-№ 2.-С. 43–46. 4. Терёхина Н. А., Петрович Ю. А., Батуева Р. А. Влияние метода сбора слезной жидкости на ее состав//Лаб. дело.-1989.№ 6.-С. 27–30. 5. Терёхина Н. А., Петрович Ю. А., Гольдфельд Н. Г. Прогнозирование рецидивов герпетического кератита с помощью определения активности дегидрогеназ слезы//Вестник офтальмологии.-1988.-№ 6.-С. 42–45. 6. Терёхина Н. А., Реук С. Э. Биохимический анализ слезы детей при герпетическом кератите//Клиническая лабораторная диагностика.-2003.- № 12.-С. 13–16. 7. Терёхина Н. А., Реук С. Э., Петрович Ю. А., Атаманова Т. И. Белки острой фазы воспаления в слюне детей при герпетическом стоматите и гингивостоматите//Российский стоматологический журнал.-2010.-№ 3.-С. 17–19. 8. Т е р ё х и н а Н . А . , Р е у к С . Э . , П е т р о вич Ю. А. Использование ферментного анализа слезной жидкости для прогнозирования рецидива герпетического кератита у детей//Вестник офтальмологии.2007.-№ 4.-С. 23–24. 9. Терёхина Н. А., Реук С. Э., Петрович Ю. А., Веретенникова Л. Г. Гликопротеины слезы и ротовой жидкости при офтальмогерпесе//Сборник тезисов X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения‑2012».- М., 2012.-С. 216–217. 10. Barnett R. N., Skodonn S. B., Goldberg, M. H. et al. Performance of ’kits’ used for clinical chemical analysis of calcium in serum//Am. J. Сlin. Path.- 1973.- Vol. 59.- P. 836–845. 11.C h o n g E . M . , W i l h e l m u s K . R . , M a t o ba A. Y. Herpes simplex virus keratitis in children//Am. J. Ophthalmol.-2004.-V. 138, № 3.-Р. 474–475. 12. Homsher R., Zak В. Spectrophotometric investigation of sensitive complexing agents for the determination of zinc in serum//Clin. Chem.-1985.- V. 31, № 8.-P. 1310–1313 13. Kitson R. E., Daly J. A., Ertingshausen G. Analysis and determination phosphorus in serum//Clin. Chem.-1972, № 18.-P. 263. 14. Landers J. W., Zak B. Determination of serum copper and iron in a single small sample//Am. J. Clin. Pathol.- 1958.- Vol. 29.№ 6.- P. 590–592. 15.М a n n C . K . , Y o e J . H . S p e c t r o p h o tometric determination of magnesium with sodium 1‑azo‑2‑hydroxy‑3(2,4‑dimethylcarboxanilido)-naphthalene‑1(2‑hydroxybenzene‑5‑sulfonate)//Anal. Chem.- 1956.- Vol. 28.- P. 202–205. 16.Siedel J. Method of iron determination in serum//Clin. Chem.-1984.-V. 30.-P. 975. e-mail: [email protected] e-mail: [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 21 Иммунофенотипическое исследование клона опухолевых клеток в диагностике В‑ХЛЛ Г. И. Луговская, врач клинической лабораторной диагностики высшей категории, зав. лабораторией иммунологических исследований О. Н. Чибисова, к. б. н., биолог лаборатории иммунологических исследований Областной консультативно-диагностический центр, Ростов‑на-Дону Резюме Иммунофенотипирование лимфоцитов методом лазерной проточной цитофлюориметрии с использованием достаточно широкой панели лимфоидных маркеров позволяет не только диагностировать конкретную нозологическую форму у первичных пациентов, но и определять неблагоприятные прогностические факторы. Показана информативность определения средней интенсивности флюоресценции клеточных антигенов для дифференциальной диагностики В‑ХЛЛ и других форм В‑клеточных лимфопролиферативных заболеваний, а также экспрессии прогностических маркеров для выявления агрессивного характера течения данного заболевания. Ключевые слова: В‑клеточный хронический лимфолейкоз, проточная цитофлюориметрия, активационные антигены, прогностические факторы. Г. И. Луговская В О. Н. Чибисова ‑ХЛЛ является наиболее распространённым видом лейкоза в странах Европы и США, где на его долю приходится до 30 % всех лейкемий. Иммунофенотипическое исследование клона опухолевых клеток на сегодняшний день является крайне важным методом в диагностике В‑ХЛЛ. Оценка иммунологического фенотипа опухолевых клеток может проводиться различными методами. Иммунологическая диагностика методом проточной цитофлюориметрии направлена на выявление отличий нормальных и трансформированных В‑клеток по их антигенному профилю. Одним из проявлений аберрантности является экспрессия маркеров, отсутствующих на В‑клетках. Иммунофенотип В‑клеточного хронического лимфолейкоза характеризуется экспрессией следующих антигенов: CD5+, CD19+, CD20+ (слабая экспрессия), CD22+ (слабая экспрессия), CD79a+, CD79b+ (слабая экспрессия), FMC7–, CD23+, CD43+, sIgM+ (слабая экспрессия). Опухолевые клетки при В‑ХЛЛ, в отличие от нормальных В‑лимфоцитов, слабо экспрессируют 22 Summary Immunophenotyping of lymphocytes by laser flow cytofluorometry with using a fairly large panel of lymphoid markers allows us not only to diagnose the specific nosological form of primary patients, but also to determine adverse prognostic factors. The article shows the determination of the average fluorescence intensity of cell antigens for the differential diagnosis of B‑CLL and other forms of B‑cell lymphoproliferative disorders, as well as the expression of prognostic markers to identify the aggressive nature of the disease course. Key words: B‑cell chronic lymphocytic leukemia, flow cytofluorometry, activation antigens, prognostic factors поверхностные иммуноглобулины класса IgM или IgM + IgD (в ряде случаев не обнаруживаются). Отмечается рестрикция легких цепей (κ или λ) (Foon K. A. et al., 1990). Важным прогностическим фактором при хроническом лимфолейкозе является экспрессия антигена CD38 на В‑лимфоцитах. Экспрессия данного антигена более чем на 30 % лейкозных клеток в течение длительного времени рассматривается как неблагоприятный прогностический признак В‑ХЛЛ (Chang C. C. и соавт., 2003). CD38‑позитивные клетки у больных В‑ХЛЛ более крупные, чем у пациентов подгруппы CD38–. Кроме того, при морфологическом анализе субпопуляции CD38‑клеток установлено, что CD38‑положительные клетки крупнее по сравнению с CD38– (Manocha S. et al., 2003). Это связано с тем, что антиген CD38 принимает участие во внутриклеточной передаче сигнала как акцессорная молекула, ассоциированная с BCR и его экспрессия важна для пролиферативной активности В‑лимфоцитов (Deaglio S. et. al., 2003). У некоторых Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 больных В‑ХЛЛ определяется экспрессия миеломоноцитарных антигенов CD11с и CD11b соответственно в 26,7 и 20,0 % случаев (Глузман Д. Ф., Абраменко И. В. и др., 1998). CD11 с‑положительные клетки чаще обнаруживаются у больных В‑ХЛЛ с коротким временем удвоения числа лимфоцитов в крови (менее 12 месяцев), а CD11b+-лимфоциты чаще встречаются у больных с большим числом вовлеченных в процесс органов. Не исключено, что более агрессивное течение заболевания при наличии на мембранах клеток антигена CD11b обусловлено его функциями адгезивной молекулы, участвующей в хоминге лимфоцитов в различные органы и ткани. Положительная экспрессия антигена CD11c при В‑ХЛЛ ассоциируется с благоприятным прогнозом [4]. Почти у 50 % больных В‑ХЛЛ на лимфоидных клетках отмечается экспрессия активационного антигена CD25 (Wormsley S. B., Baird S. M., Gadol N. et al., 1990; Masic N., Gargo A., Rabatic S. et al., 1998). Наличие CD25+-клеток ассоциируется с неблагоприятным прогнозом. e-mail: [email protected] Таким образом, общая тенденция в исследованиях В‑ХЛЛ заключается в углублённой иммунофенотипической характеристике клона В‑лимфоцитов, основанной в том числе и на оценке значения вышесказанных мембранных антигенов в прогнозе заболевания, так как существует связь между экспрессией ряда маркеров с частотой достижения полных ремиссий, их продолжительностью, а также с общей продолжительностью заболевания больных. Целью нашего исследования была иммунофенотипическая оценка экспрессии антигенов CD38, CD11c и CD25 как прогностических факторов при В‑ХЛЛ. В исследование были включены 69 пациентов, средний возраст составил 59 ± 2,0 лет. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводили методом проточной цитофлюориметрии на проточном цитометре FACS Canto (Becton Dickinson, США). e-mail: [email protected] Наличие CD38/СD19‑позитивных клеток менее чем на 20,0 % лимфоидной популяции была оценено как низкое (2,3 ± 0,9 % клеток лимфоцитарного гейта) и выявлена у 45 пациентов (65,2 % от всех обследованных больных В‑ХЛЛ). Экспрессия CD38 более чем на 20,0 % лимфоидной популяции была оценена как высокая (45,7 ± 7,7 % клеток лимфоцитарного гейта) и выявлена у 24 пациентов (34,8 % от всех обследованных больных В‑ХЛЛ). При исследовании активационного антигена CD25 оказалось, что его наличие на опухолевых клетках в группе больных с высокой экспрессией антигена CD38 оказалось в 1,6 раза выше и составило 61,3 ± 8,2 % по сравнению с экспрессией данного антигена в группе больных с низкой экспрессией CD38 (38,9 ± 6,5 %). С другой стороны, в группе больных с высокой экспрессией антигена CD38 уровень экспрессии CD11c оказался достоверно ниже (p < 0,05) и составил 21,7 ± 2,6 % по сравнению с уровнем экспрессии этого маркера в группе больных В‑ХЛЛ с низкой экспрессией CD38 (36,5 ± 4,3). В результате клинического обследования было установлено, что группа больных В‑ХЛЛ с высоким уровнем экспрессии антигена CD38 характеризовалась агрессивным характером течения заболевания, наличием гепатоспленомегалии и/или значительного увеличения лимфатических узлов. Таким образом, для выявления агрессивного характера течения В‑ХЛЛ целесообразно использование иммунофенотипирования лимфоцитов методом лазерной проточной цитофлюориметрии с достаточно широкой панелью маркеров, в том числе и определения экспрессии информативных антигенов CD38, CD11c и CD25, что позволяет не только верифицировать данное заболевание, но и определять неблагоприятные прогностические факторы. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 23 Внедрение ГОСТ Р ИСО 15189–2009 в медицинскую лабораторию: предупреждающие действия при организации работы Т. И. Долгих, д. м. н. профессор заведующая Центральной научно-исследовательской лабораторией и руководитель Академического центра лабораторной диагностики Омской государственной медицинской академии Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Минздрава РФ Implementing GOST R ISO 15189–2009 into medical laboratory business activity: preventive measures before starting the work T. I. Dolgikh, Central scientific research laboratory of Omsk State Medical Academy, Omsk Резюме В статье показаны проблемы на этапе организации работы по разработке и внедрению требований ГОСТ Р ИСО 15189 в систему менеджмента качества в лабораторию, которая является составной частью данной системы в учреждении в целом. Даны рекомендации, представлена необходимость разработки системы сбалансированных показателей по управлению качеством. Особое внимание уделено необходимости подготовки руководства лабораторий по вопросам менеджмента качества. Ключевые слова: ГОСТ Р ИСО, стандартизация, качество, менеджмент лабораторной медицины, проблемы, подготовка специалистов. В последнее время в России проводится интенсивная работа по внедрению системы менеджмента качества (СМК) в деятельность медицинских лабораторий [1, 2, 7], обусловленная необходимостью стандартизации [8, 15]. Основные требования изложены в национальном стандарте ГОСТ Р ИСО 15189–2009 [1], включающем в себя основные нормативные положения ИСО/МЭК 17025 и ИСО 9001–2008 в области лабораторной медицины [2], с уточнением его реализации в соответствующих частях ГОСТ Р ИСО 53079–2008 [3–6] и др. При планировании работы по разработке СМК и ее внедрению в медицинские лаборатории различного уровня следует учитывать необходимость внесения изменений и уточнений в устоявшуюся систему либо создание принципиально новой схемы (системы), что из-за отсутствия опыта в трактовке тре- 24 Summary The article shows the problems of the stage of launching the works on creating and implementing GOST R ISO 15189 conditions into quality management system of medical laboratory that is a part of a bigger institution. It has recommendations and a system of balanced marks that help with quality management. A special attention is paid to necessity of training laboratory managers for the aspects of running the quality. Key terms: GOST R ISO, standardization, quality, laboratory medicine management, problems, training of specialists. бований стандартов в России далеко не всегда проходит «безболезненно» как для руководства лаборатории и учреждения, так и для персонала, и касается всей инфраструктуры учреждения. СМК в отдельно взятом подразделении (лабораторной службе, лаборатории) не может быть эффективно реализована в отрыве от СМК медицинского учреждения, поскольку является составной частью системы обеспечения качества в учреждении в целом и требует разработки системы сбалансированных показателей по управлению качеством. Использование современных концепций организации лабораторных исследований, к которым относится и централизация [9], требует пересмотра сложившегося стереотипа и поиска новых форм работы с учетом экономической составляющей и требований ГОСТ Р ИСО 15189 и ГОСТ Р ИСО 9001. Для сертификации СМК Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 следует провести большую подготовительную работу, которая в крупных и многоцелевых лабораториях может занять от нескольких месяцев до одного года (в зависимости от готовности лаборатории). С чего начать работу по внедрению СМК, чтобы избежать ошибок, неправильных действий, как уложиться в сроки (порой крайне сжатыми по плану учреждения), как составить документы надлежащего качества, разработать алгоритмы действий, определить компетенции персонала, рассчитать затраты на внедрение системы, при этом не деморализовать персонал и не снизить, а сохранить (повысить) качество исследований? Эти вопросы в первую очередь задает себе заведующий лабораторией. Надо отметить, что разработать и внедрить реально действующую (а не формальную) систему, соотe-mail: [email protected] ветствующую требованиям национальных стандартов, за 2–3 месяца практически невозможно. Учитывая слабую подготовку (либо ее отсутствие) руководителей лабораторий по вопросам менеджмента качества и экономическим вопросам [12], говорить о том, что в большинстве лабораторий сделают все правильно, не приходится. В учреждениях государственной формы собственности, где включаются дополнительные механизмы регулирования, в том числе в области закупок и приобретения услуг, потребуется разработка дополнительных документов и соответственно больше времени уйдет на формализацию документов. В формате управления лабораторной службой (лабораторией) особое значение имеют предупреждающие и корректирующие действия, которые относятся к составным частям процесса улучшения качества (пункт 4.11 ГОСТ Р ИСО 15189–2009) [1]. Предупреждающее действие предпринимают для предотвращения возникновения события, а корректирующее действие — для предотвращения повторного возникновения события (потребность в них возникает как следствие выявления несоответствия). Обычно предупреждающие и корректирующие действия рассматриваются на этапах производственного процесса (преаналитическом, аналитическом и постаналитическом). Не снижая значимости вышесказанного, полагаю, что необходимо расширить представление об этих действиях для предотвращения последующих ошибок и некорректных действий и рассмотреть их в несколько ином аспекте на этапе организации и начала работы по сертификации лабораторий по ГОСТ Р ИСО 15189–9009.. Значительную помощь в подготовке документов и оценке состояния лаборатории могут оказать консалтинг, внутренний аудит и даже корректно проведенный предварительный аудит. Но в начале пути надо самим оценить степень готовности лаборатории к этому процессу и проe-mail: [email protected] вести соответствующие мероприятия. Не следует начинать работу с предварительного внешнего аудита! Оптимальна следующая схема: 1) подготовка руководителя, назначение и обучение ответственного по качеству по вопросам стандартизации медицинской лаборатории, обучение основного персонала, участвующего в организации СМК; → 2) планирование (составить общий план по разработке, внедрению и сертификации СМК по ГОСТ Р ИСО 15189–2009 и конкретизировать его детальными планами); → 3) анализ существующих проблем и удовлетворенности потребителей, внутренние проверки с анализом всех элементов системы группой специалистов (комиссией) лаборатории → приведение дел в порядок, составление общей схемы управления, выделение «сильных» и «слабых» звеньев цепочки качества (на последних сосредоточить особое внимание), выявление несоответствий, разработка плана устранения замечаний и его реализация, подготовка персонала к последующему аудиту; → 4) внутренний аудит, при котором «процедуры проверок должны определены, документированы, включая тип проверки, частоту, методологию и требуемую документацию» (пункт 4.12 ГОСТ Р ИСО 15189–2009) [1] → выявление несоответствий, рекомендации по их устранению, разработка плана устранения замечаний и его реализация, доработка документов, корректировка схем взаимодействий с учетом системы сбалансированных показателей по управлению качеством деятельности учреждения, проверка действующих механизмов СМК с последующей корректировкой; → 5) проведение предварительного аудита для оказания помощи в организации работы; можно выбирать орган сертификации (работа органа по сертификации — не надзор!); → в ходе ознакомления с деятельностью лаборатории аудитором будут даны рекомендации, что необходимо сделать для повышения вероятности положительного прохождения сертификационного аудита; → 6) проведение внешнего ауди- та для сертификации → выявление несоответствий, разработка плана устранения замечаний и его реализация; → 7) проверка действующих механизмов СМК и корректировка, дальнейшее сопровождение, совершенствование, оценка эффективности внедрения; → 8) готовность к надзорным аудитам и ресертификации [13]. С чего конкретно начинать? Целесообразно придерживаться следующего порядка: • изучить основные национальные стандарты [1–7]; • обучить руководителя лаборатории, на тематическом цикле или семинаре (обучение без предварительного знакомства со стандартами имеет низкую эффективность); • назначить ответственного по качеству и определить его функции, обучить его по требованиям стандартов; • изучить стандарты организации для дальнейшего использования; • издать приказ по учреждению о разработке общего плана внедрения СМК с определением реальных сроков исполнения мероприятий; • провести обучение персонала лаборатории (семинар, тренинг или другая форма на усмотрение руководства лаборатории или учреждения); за один семинар это сделать невозможно; • создать рабочую группу из специалистов лаборатории для совместной работы с ответственным по качеству (мнение, что ответственный по качеству сможет разработать, внедрить и сертифицировать СМК явно ошибочно); • провести анализ состояния работы в лаборатории; • описать жизненный цикл лаборатории; • провести анализ инфраструктуры и внести соответствующие коррективы; • определить процессы / операции, наиболее критичные для качества работы, поиск и апробация новых вариантов, анализ соответствия требованиям стандартов; это составляет основу СМК; Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 25 • описать «процессный подход» и составить единую систему процессов (лучше в виде схемы для наглядности), при этом все процессы должны быть идентифицированы и определено взаимодействие этих процессов; • разработать систему управления оборудованием для мониторинга и измерений; • определить достаточность компьютеризации и соответствие программного обеспечения лаборатории для информационного обеспечения и управления процессами; • приступить к поэтапному созданию первичного пакета документов (на первом этапе — описание процессов, которые не будут меняться на текущий момент; на втором этапе, который можно вести параллельно, • разработать новые или внести существенные изменения регламентов процессов; • для правовой оценки действующей или создаваемой документации (договоры, конфидициальность, порядок анонимного обследования и др.) передать их на согласование с юридической службой; • в лабораториях, работающих с микроорганизмами 3–4 групп патогенности, необходимо провести согласование со службой Роспотребнадзора внесенных изменений в технологический процесс, если они затрагивали поточность, размещение помещений и оборудования, способы забора, доставки биоматериала, дезинфекции и утилизации; в противном случае при контрольных проверках после готовности и утверждения документов может быть вынесено предписание о несоответствии санитарно-эпидемиологическому режиму, что потребует пересмотра созданной системы; • провести согласование документов по СМК в установленном в организации порядке и привести их в единообразный вид; • ознакомить персонал с первыми документами по СМК с целью передачи информации о начале работ по СМК; • в дальнейшем осуществляется внедрение и мониторинг системы СМК, доработка документов. 26 Остальные этапы проводятся в соответствии с планом внедрения СМК. ГОСТ Р ИСО 15189–2009, ГОСТ Р ИСО 53079–2008 и ГОСТ Р ИСО 53022–2008, уточняющие внедрение ГОСТ Р ИСО 9001 в лабораторной медицине, предоставляют инструмент для эффективного управления ключевыми процессами [1–7, 13]. Основополагающим документом лаборатории является «Руководство по качеству» [2–4], технология создания которого в соответствии с указанными стандартами обстоятельно представлена в статье А. В. Эмануэля [14]. Работу надо начинать со структуры данного руководства и уточнения механизма реализации, чтобы охватить полный цикл производственной деятельности, не забывая о биологической безопасности, взаимодействии с клинической службой и контролирующими органами. В работе следует руководствоваться «Положением о стандартизованных аналитических технологиях клинических лабораторных исследований», где даны четкие рекомендации по созданию данного документа [11]. Можно также использовать весьма полезную информацию, предложенную для стандартизации преаналитического этапа при проведении биохимических исследований (с учетом рекомендаций зарубежных национальных обществ клинической химии и лабораторной медицины) [10]. Возникают трудности в описании и выполнении соответствия пункту 4.6.2 ГОСТ Р ИСО 15189, который гласит: «Поставляемое оборудование и расходные материалы, которые способны повлиять на качество услуг лаборатории, не должны быть использованы до тех пор, пока они не будут проверены на соответствие требованиям стандартов или определенным требованиям, установленными методиками для данных исследований»? Известно, что закупки в государственных учреждениях осуществляются в соответствии с ФЗ‑94, и поставщиком-победителем конкурса могут быть поставлены рас- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 ходные материалы низкого качества (например, иглы или системы для взятия крови, пластиковые пробирки), что влияет на уровень оказания медицинской помощи и качество лабораторных исследований [6, 8–10]. Следующий момент, который важен при внедрении СМК, связан с «человеческим фактором» и моральной готовностью персонала к внутренним проверкам и аудиту (внутреннему, предварительному и сертификационному). Только взаимопонимание и взаимопомощь внутри лаборатории и учреждения, готовность персонала не прятать, а показать слабые места, чтобы решить неясные вопросы, отсутствие страха у персонала из-за возможного наказания, концентрация сил и средств — все это позволит создать действующую систему менеджмента качества. Наказание не является лучшим фактором стимулирования деятельности. Негативным фактором является отсутствие плана проверок, нарушение их сроков и внезапность внешней или внутренней проверки. Они должны проводиться в соответствии с регламентом. Руководство и персонал лаборатории должны быть заранее предупреждены о предстоящей процедуре (в установленные регламентами порядке и сроки). Проверка не должна вносить диссонанс в деятельность лаборатории, проводиться в период массового отпуска персонала, в период реорганизации лаборатории (учреждения) или внесения существенных изменений в деятельность лаборатории в результате централизации, совмещения на одной базе диагностического, научного и образовательного процессов, иначе ряд моментов может быть не оценено и не учтено при внедрении СМК. Как нонсенс следует рассматривать ситуацию, когда начинается проверка (аудит) без информирования руководителя лаборатории, и такие ситуации должны быть исключены. Руководитель лаборатории должен быть предупрежден о начале проверки в письменном виде (приказ, распоряжение, извещение) не менее чем за 30 дней до начала e-mail: [email protected] проверки (в отдельных случаях в соответствии с регламентом — за две недели). вания. Дальнейшее обучение можно проводить во время тренингов и семинаров. Одной из форм, способствующей уточнению СМК, могут быть совместная подготовка документов и встречные проверки, проводимые по доброй воле руководителями лабораторий или ответственных по качеству внутри сети учреждений, сходных по целям, задачам и организации работы (например, централизованные лаборатории города или округа, лаборатории службы профилактики ВИЧ-инфекции, больницы скорой помощи). Такая возможность также должен быть оговорена в документах учреждения по управлению качеством, служить инструментом улучшения качества работы, но ни в коей мере не нести надзорных функций! Таким образом, исходя из требований стандартизации, при разработке следует концентрировать силы персонала и имеющиеся средства. Ключевым моментом остается подготовка специалистов по организации работы лабораторий, вопросам экономики и менеджмента лабораторной службы, а также по разработке, внедрению и сертификации системы менеджмента качества. Следующий момент, который проясняется по ходу внедрения СМК или проверки — компетентность персонала и качество подготовки специалистов высшего и среднего звена на сертификационных циклах. Определение (дальнейшее подтверждение) компетентности персонала и составление матрицы компетенций вызывает большое количество вопросов и мнений. Следовало бы прийти к единому мнению и, возможно, предложить шаблон и примерный порядок реализации данного требования. Отсутствие базовых знаний по ряду вопросов является основанием для уточнения программ подготовки специалистов на этапах последипломного образо- В данной статье представлены проблемные моменты, которые основаны на собственном опыте автора. Буду весьма признательна за советы, пожелания, критические замечания и приглашаю к обмену мнением и дискуссии на страницах специализированных журналов. Список литературы 1. ГОСТ Р ИСО 15189–2009 Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности. 2. ГОСТ Р ИСО 9001–2008 Системы менеджмента качества. Требования 3. ГОСТ Р ИСО 53079.1–2008 Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 1. Правила описания методов исследования. 4. ГОСТ Р ИСО 53079.2–2008 Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 2. Руководство по управлению качеством в клиникодиагностической лаборатории. Типовая модель. 5. ГОСТ Р ИСО 53079.3–2008 Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 3. Правила взаимо- действия персонала клинических подразделений и клинико-диагностических лабораторий медицинских организаций при выполнении клинических лабораторных исследований. 6. ГОСТ Р ИСО 53079.4–2008 Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа. 7. ГОСТ Р ИСО 53022.1–2008 Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 1. Правила менеджмента качества клинических лабораторных исследований. 8. Долгих Т. И. Проблемные вопросы организации работы лабораторий и метрологическое обеспечение аналитического процесса//Клин. лаб. диагностика — 2009. — № 8. — С. 43–46. 9. Кишкун А. А., Арсенин С. Л. Основные направления реформирования лабораторной службы России//Современная лаборатория — 2011. — № 1. — С. 4–9. 10.Лукичева Т. И., Меньшиков В. В. Преаналитический этап при измерении концентрации каталитической активности ферментов: особенности и этапы стандартизации//Клин. лаб. диагностика — 2012. — № 6. — С. 9–12. 11.Меньшиков В. В., Пименова Л. М. О разработке стандартизованных технологий клинических лабораторных исследований//Клин. лаб. диагностика — 2011. — № 8. — С. 55–57. 12.Меньшиков В. В. О деятельности клинических лабораторий государственных и муниципальных учреждений здравоохранения в новых организационноэкономических условиях//Клин. лаб. диагностика — 2011. — № 9. — С. 3. 13.Эмануэль А. В., Тарасенко О. А., Осипова О. Н. Организация системы менеджмента качества в лабораторной медицине//Лаборатория — 2009. — № 4. — С. 21–24. 14.Эмануэль А. В. Технология создания руководства по качеству для медицинской лаборатории в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 15189 и ГОСТ Р ИСО 9001//Справочник заведующего КЛД. — 2011. — № 12. — С. 3–13. 15. Burnett D. A Practical Guide to Accreditation in Laboratory Medicine. ACB Venture Publications: London. 2002 Уважаемые читатели! С нового года журнал «Медицинский алфавит» издательства ООО «Альфмед», планирует выпуск новой серии журналов «Акушерство и гинекология» под редакцией М. А. Курцера. В редакционный совет войдут ведущие специалисты. +7 (495) 616-48-00,+7 (495) 221-76-48, [email protected] Приглашаем к сотрудничеству авторов и заинтересованных лиц. e-mail: [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 27 Концентрация белка в моче: мифы и реальность А. В. Козлов, Е. С. Ларичева Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова, С.-Петербург Protein concentration in urine: myths and a reality А. В. Козлов Резюме Проведен исторический экскурс, анализ литературных данных и результатов собственных исследований, посвященных методам оценки протеинурии. Представленные данные указывают на то, что выбор надежных подходов к оценке протеинурии ограничен. Использование количественного метода определения белка с пирогаллоловым красным в суточном объеме мочи позволит получать сопоставимые результаты в различных лабораториях и решить часть проблем, связанных с оценкой выраженности протеинурии. Характеризовать суточную потерю белка с мочой по величине отношения белок/креатинин в случайном образце мочи правомочно только для пациентов без заболеваний почек. У пациентов с заболеваниями почек использование подобного подхода, по мнению авторов, может привести к недостоверным результатам. Ключевые слова: пирогаллоловый красный, протеинурия, отношение белок/креатинин, объем мочи за сутки, случайный образец мочи Summary Historical digression, review of the literature and own results, devoted to methods of a quantification of proteinuria are presented. The data specify that the choice of reliable approaches to an estimation proteinuria is limited. Use of a quantitative method for total protein measurement with pyrogallol red in 24‑hour urine specimen will allow to receive comparable results in various laboratories and to solve a part of the problems connected with an estimation of significant proteinuria. The assessing of 24‑h protein excretion with the use of protein/creatinine ratio in untimed (spot) urine is competent only for patients without kidneys diseases. In patients with kidneys diseases the use of the similar approach in author’s opinion can lead to reception of doubtful results. Key words: Pyrogallol red; proteinuria; protein/creatinine ratio; 24‑h urine collections; untimed urine Е. С. Ларичева А нализ мочи относится к разряду наиболее часто выполняемых лабораторных процедур. В само понятие «анализ мочи» включены: описательная часть и результаты исследования химического состава, микроскопического анализа осадка мочи. Среди показателей, включенных в раздел «химический состав» мочи, особый интерес для клиницистов представляет параметр «концентрация белка», поскольку протеинурия является нередко первым и в ряде случаев единственным лабораторным маркером поражения почек при преэклампсии, диабетической нефропатии, воздействии нефротоксичных препаратов и других заболеваний [1]. С присутствием белка в моче связан ряд мифов, обсуждение причин возникновения которых является предметом данной работы. На взгляд авторов статьи, заслуживают внимания истоки трех основных мифов. • Миф № 1. Моча здорового человека белка не содержит, либо его концентрация не превышает 0,033 г/л. • Миф № 2. О протеинурии можно судить по содержанию белка в суточном объеме мочи. • Миф № 3. Протеинурию можно оценивать по величине белок/креатинин в случайном образце мочи. Данные, послужившие основанием для возникновения первого мифа, были обусловлены недостаточными знаниями и использованием доступных в то время методов определения белка в моче химиками и врачами в XVIII и XIX веке. Один из самых ранних тестов для обнаружения белка в моче был предложен в 1694 г. профессором медицины в университете г. Лейдена Фредериком Деккерсом (Fredericus Dekkers, 1648–1720). При кипячении мочи он обнаружил образование белого осадка, который не растворялся после добавления уксусной кислоты [2]. Позднее известный итальянский врач и анатом Доменико Котуньо (Domenico Cotugno, 1736–1822), изучая состав мочи, написал в 1764 г.: «.. я также обнаружил, что они [water of consumptives] после нагревания в пламени быстро становятся похожими на молоко, пахнут подобно молоку и имеют вкус сладкого молока; после добавления одной или двух капель уксусной кислоты и охлаждения на воздухе белый цвет исчезал, свернувшаяся часть опускалась на дно … довольно гомогенная сыворотка была сладкой» и «… после нагревания на пламени двух пинт мочи и испарения половины объема образовывалась белая масса, подобная альбумину яйца» [3]. Интерес к изучению белка в моче и использованию результатов исследований в практической медицине к концу XVIII столетия увеличился. В 1797 г. английский химик Уильям Использовать азотную кислоту в качестве реактива для определения белка в моче предложил венский химик Иоганн Геллер (I. Heller, 1813–1871). Он родился в Вене, изучал химию в Праге и позднее в Германии в лаборатории профессора Юстуса Либиха (Justus Liebig 1803–1873) и профессора Фридриха Вёлера (Friedrich Wöhler, 1800–1882) в Гессене. В 1844 г. он организовал лабораторию патологической химии в Вене. Заведовать данной лабораторией начал только c 1855 г., поскольку в то время считали, что данную должность должен занимать врач. С 1844 г. он редактировал журнал Archiv fur Physiologische und Pathologische Chemie und Mikroskopie, предназначенный для публикаций, касавшихся исключительно патологической химии. Издание прекратило существование после шести выпусков из-за отсутствия статей. 28 Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected] Круикшанк (William Cruikshank, 1745–1800) обнаружил способность многих образцов мочи к коагуляции при нагревании [4]. Использование методов, основанных на термокоагуляции, для обнаружения белка в моче, позволило английским врачам Вильяму Макинтайру (W. Macintyre) и Томасу Уотсону (T. Watson) в 1845 г. обнаружить в моче больного белок, который привлек их внимание необычным поведением при нагревании. Образец мочи, направленный Уотсоном врачу лондонской больницы Св. Георгия Генри Бенс Джонсу, сопровождался следующим письмом: «Дорогой доктор Бенс Джонс. Пробирка содержит мочу очень высокой плотности. При кипячении она становится непрозрачной. При добавлении азотной кислоты она пенится, приобретает красноватый оттенок и становится вполне прозрачной; при охлаждении приобретает консистенцию и вид, который Вы можете наблюдать. Нагревание вновь превращает содержимое в жидкость. Что это?». Ответы на этот вопрос были даны в серии работ, закрепивших приоритет Генри Бенс-Джонса в изучении данного белка [5]. Известный английский врач Ричард Брайт (Richard Bright, 1789–1858) изучал взаимосвязь между отеками у больных с анатомическими признаками поражения почек и альбуминурией, определяемой по коагуляции мочи при ее нагревании. Результаты наблюдений навели его на мысль об «альбуминовой природе мочи», и он описал этот лабораторный признак нефрита в 1827 г. Сам Брайт при посещении больных для обнаружения белка в моче использовал самый простой вариант пробы: он нагревал мочу больного в ложке над пламенем свечи и по образованию сгустков судил о присутствии альбумина в моче. Для этого Брайт носил с собой ложку, свечу и уксусную кислоту [6]. Термин «альбуминурия» был позднее предложен французским исследователем М. Solon для обозначения присутствия белка в моче [7]. Использовать азотную кислоту в качестве реактива для определения белка в моче предложил венe-mail: [email protected] ский химик Иоганн Геллер (I. Heller, 1813–1871). Он родился в Вене, изучал химию в Праге и позднее в Германии в лаборатории профессора Юстуса Либиха (Justus Liebig 1803–1873) и профессора Фридриха Вёлера (Friedrich Wöhler, 1800–1882) в Гессене. В 1844 г. он организовал лабораторию патологической химии в Вене. Заведовать данной лабораторией начал только c 1855 г., поскольку в то время считали, что данную должность должен занимать врач. С 1844 г. он редактировал журнал Archiv fur Physiologische und Pathologische Chemie und Mikroskopie, предназначенный для публикаций, касавшихся исключительно патологической химии. Издание прекратило существование после шести выпусков из-за отсутствия статей. В 1852 г. Геллер разработал так называемую «кольцевую» пробу для определения белка в моче, позднее получившую его имя. Суть его метода сводилась к осторожному наслаиванию разведенной мочи на поверхность азотной кислоты. Толщина диска коагулированного белка на границе жидкостей отражает его содержание в моче. Процедура обнаружения белка в моче с использованием азотной кислоты позднее получила название «проба Геллера» [8]. Желание приблизить исследование мочи к постели больного привело известного английского химика и врача У. Праута (William Prout, (1785–1850) к созданию прообраза современной мобильной лаборатории (point-off-care testing). Он писал: «Одна или две небольшие пробирки и небольшие закрывающиеся склянки, содержащие раствор чистого аммиака, поташа и азотной кислоты, могут быть размещены в саквояже и будут достаточны с помощью свечи для проведения всех экспериментов с мочой, которые необходимы с практической точки зрения» [9]. Позднее были разработаны методы, в основу которых была положена кольцевая проба Геллера. В отечественных клинических лабораториях в качестве основного метода применяли полуколичественную модификацию пробы Геллера с азотной кислотой — так называемый метод Робертса–Стольникова [10]. Концентрацию белка в моче этим способом устанавливали путем разведения образца мочи до тех пор, пока при очередном ее наслаивании на раствор азотной кислоты с концентрацией 500 г/л не образуется кольцо на границе фаз в промежуток между второй и третьей минутами. При расчете концентрации белка в исследуемом образце значение 0,033 г/л умножали на степень разведения мочи. Несмотря на низкую воспроизводимость и чувствительность метода, его длительное время использовали в клинических лабораториях, в основном в лабораториях, не оснащенных фотометрическими приборами. В настоящее время метод представляет исторический интерес. При рассмотрении вклада отечественных ученых в решение проблемы определения белка в моче нельзя пройти мимо заслуг ученика известного терапевта С. П. Боткина профессора Дмитрия Ивановича Кошлакова (1835–1891), выпускника Медикохирургической академии. Он был известен не только как терапевт-практик, но и как специалист в области физиологической химии, физики и микроскопической техники. Из многочисленных его сочинений особенный интерес заслуживает «Руководство по анализу мочи», первое издание которого появилось в 1880 г. [11]. В нем данный метод был приведен со всеми нюансами. Таким образом, можно считать, что зарождение первого стойкого и долгоживущего мифа обязано: 1. привлекательности и простоте качественной, не требующей сложного и дорогостоящего оборудования процедуре выявления белка в моче; 2. ее применением в клинических лабораториях в течение многих десятилетий в XIX и XX веке, в связи с чем в сознании многих поколений врачей величина 0,033 превратилась в магическое значение, не подвергающееся сомнениям и переосмыслению; 3. недо статочным знакомством клиницистов с возможностями лабораторий и часто с нежеланием вникать в суть используемых в них технологий. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 29 Для того чтобы понять истоки мифа № 2, следует проанализировать историю разработки количественных методов определения белка в моче. Внедрение в лабораторную практику количественных методов происходило достаточно медленно, поскольку колориметры, разработанные французским инженером и оптиком Жюлем Дюбоском (1817–1886) в еще 1854 г., в лабораториях практически не использовали. Простейшие визуальные колориметры, фотоэлектроколориметры и позднее спектрофотометры стали приобретать популярность только после работ О. Фолина, разработавшего 1904 г. количественный метод определения креатинина в крови. Несмотря на кажущуюся простоту, определение концентрации белка в моче в ряде случаев может оказаться непростой задачей, обусловленной следующим рядом факторов: • низким содержанием белка в моче здорового человека, часто находящимся на пороге чувствительности большинства известных методов; • присутствием в моче множества соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций; • значительными вариациями содержания и состава белков мочи при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала. В клинических лабораториях преимущественно применяются так называемые «рутинные» методы определения белка в моче, однако они далеко не всегда позволяют получать удовлетворительные результаты. Результаты, полученные при проведении процедуры внешней оценки качества в лабораториях Великобритании, явились основанием для статьи с многозначительным заголовком Urinary total protein estimation — fact or fiction? [12] С точки зрения специалистааналитика, работающего в лаборатории, метод, предназначенный для количественного определения белка в моче, должен отвечать следующим требованиям [13]: 1. обладать линейной зависимостью между светопоглощением обра30 зовавшегося в ходе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, что позволит избежать дополнительных ошибок при разведении образца; 2. результат определения не должен зависеть от белкового состава исследуемого образца мочи; 3. должен быть прост, не требовать высокой квалификации исполнителя, выполняться при малом количестве операций; 4. обладать высокой чувствительностью, аналитической надежностью при использовании небольших объемов исследуемого материала; 5. быть устойчивым к воздействию различных возмущающих факторов (колебаниям белкового состава образца, присутствию лекарственных препаратов и др.); 6.обладать приемлемой стоимостью; 7. быть легко адаптируемым к автоанализаторам. Как будет очевидно из представленных данных, ни один из известных к настоящему времени методов количественного определения белка в моче не может в полной мере претендовать на роль «золотого стандарта». Все известные методы количественного определения содержания белка в моче могут быть условно разделены на три группы: турбидиметрические, «химические» и связывания с красителями [14]. Первый количественный метод определения концентрации белка в моче c использованием сульфосалициловой кислоты был предложен американскими биохимиками О. Фолиным (O. Folin) и У. Денис (W. Denis) в 1914 г. Благодаря простоте и достаточной чувствительности, метод получил широкое распространение. Он основан на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием денатурирующего агента — сульфосалициловой кислоты. О содержании белка в исследуемом образце мочи судят либо по интенсивности светорассеяния (нефелометрия), либо Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрия). Результаты данной группы методов зависят от скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН-среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Некоторые лекарственные препараты сказываются на результатах определения белка в моче данным методом, приводя к ложноположительным либо ложноотрицательным результатам. К ним относятся некоторые антибиотики (бензилпенициллин, клоксациллин и др.), рентгеноконтрастные йодсодержащие вещества, сульфаниламидные препараты. Несмотря на эти недостатки, метод длительное время применяли в лабораториях для определения концентрации белка в моче. В России в 1978 г. он стал использоваться в качестве унифицированного. В ряде лабораторий его продолжают использовать до сих пор. Химические методы В 1951 г. американский биохимик О. Лоури предложил для определения концентрации белка в сыворотке и моче метод, основанный на использовании так называемого «фенольного» реактива Фолина. Несмотря на высокую чувствительность, метод не нашел широкого распространения в лабораториях, поскольку в моче содержится ряд соединений (аскорбиновая кислота, мочевая кислота и др.), способных восстанавливать реактив Фолина и приводить к получению искаженных результатов. Биуретовый метод для определения концентрации белка в моче можно использовать только после предварительной подготовки — концентрирования мочи. В таком виде он может претендовать на роль референтного метода [15]. Методы связывания с красителями В настоящее время для определения концентрации белка в моче предпочтение отдают методам, основанным на способности различных красителей понсо S (Ponceau S), кумасси бриллиантовый синий (Coumassie Brilliant Blue) и пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red) e-mail: [email protected] образовывать окрашенные комплексы с белками. Наибольший интерес представляет метод, основанный на использовании красителя пирогаллолового красного (ПГК). Сам краситель пирогаллолсульфофталеин (С19 Н12 О8S) — хорошо известный химикам индикатор, использовавшийся для титрования ионов висмута, кобальта, никеля, тория [16]. Пирогаллоловый красный (ПГК). Связывание в кислой среде (рН = 2,5) белками комплекса пирогаллоловый красный — ионы молибдена сдвигает максимум светопоглощения с 400 нм до 600 нм, что позволяет проводить количественное определение белка в моче в широком диапазоне концентраций. Образующийся комплекс устойчив к воздействию многих соединений, в том числе лекарственных. Поглощение комплекса глобулины — краситель составляет 70 % от величины поглощения комплекса альбумин-краситель, для легких цепей иммуноглобулинов от 52 % до 68 %. Для нивелирования различий в чувствительности ПГК к разным типам белков в растворе многие компании-производители в тест-системах используют калибровочные растворы, содержащие альбумин и g‑глобулины в соотношении, близком к их соотношению в моче. Несмотря на перечисленные проблемы, обусловленные неодинаковой чувствительностью ПГK к разным белкам, метод остается лучшим среди других фотометрических методов определения белка и имеет ряд достоинств. • Он прост и удобен для выполнения как в неавтоматизированном режиме, так и после адаптации к автоанализатору. e-mail: [email protected] • За счет значительного разведения образца мочи в реакционной смеси значительно снижается влияние на результаты фотометрии состава мочи. • Образование комплекса протекает в среде с высокой буферной емкостью, что обеспечивает протекание реакции при стабильном рН вне зависимости от состава и рН мочи. • Широкий диапазон линейной зависимости между величиной поглощения и концентрацией белка позволяет избежать необходимости разведения многих образцов мочи. • Стабильность окраски комплекса сохраняется в пределах часа, что достаточно для фотометрии большого числа образцов мочи. Для анализа не требуется длительной подготовки мочи, достаточен малый объем пробы, реактив стабилен в течение длительного срока [17]. Несмотря на то, что в арсенале лаборатории появились количественные методы определения концентрации белка в моче, проблема оценки протеинурии не решена до конца. По мнению экспертов Национального почечного фонда (National Kidney Foundation, NKF, США), для всех клинических ситуаций окончательное заключение о степени протеинурии должно основываться на определении белка в суточном объеме мочи [18]. С этой точки зрения интерес представляют приведенные в таблице 1 литературные данные, имеющие прямое отношение к вопросу оценки протеинурии. Нетрудно заметить, что верхние пределы референтных значений суточной экскреции белка у здоровых людей зависят от использованного метода, однако авторы многих публикаций, как правило, не ссылаются на использованный в работе метод. В этом случае сравнение результатов исследований, в которых использованы методы, основанные на различных физико-химических принципах, имеет в основном познавательный характер. Одним из немногих современных документов, в котором одновременно приведены верхние референтные значения (мг/сут.) для нескольких методов, является руководство European Urinalysis Guidelines [25]. Таблица 1 Величина суточной протеинурии у здоровых людей Суточная экскреция белка с мочой Источник По данным производителей тестсистем: Chronolab: 10–140 (мг/сут.) 1) Biocon: 21–120 (мг/сут.) 1) Biorad: 1–114 (мг/сут.) 1) 17 Дети. В разовых порциях мочи: до 0,033 г/л 3) Суточная экскреция белка: 30– 50 мг/сут. 3) У детей до 1 мес.: 240 мг/м 2 3) У детей старше 1 мес.: 60 мг/м 2/сут. 3) 19 Взрослые: 20–50, 3) 80–100 мг 3) 20 21 Взрослые: 30–50 мг/сут. 3) 22 Взрослые: 60 мг/м 2/сут. первый месяц жизни физиологическая протеинурия может в четыре раза превышать данное значение 23 Взрослые: 40 мг/сут. 1) 24 3) Пирогаллоловый метод. Биуретовый метод. 3) Метод не указан. 1) 2) Они составляют: • для метода с пирогаллоловым красным: здоровые люди — ниже 180 мг/сут. [26], беременные — ниже 260 мг/сут. [27]; • для биуретового метода ниже 150 мг/сут. [28]; • для турбидиметрического метода ниже 75 мг/сут. [29]. В педиатрии многие авторы считают необходимым величину суточной потери белка относить к поверхности тела ребенка, полагая, что данная процедура позволяет нормализовать данные и сравнивать потери белка с мочой в разных возрастных группах. Представляют интерес данные, приведенные в таблице 2. По их мнению, у детей старше одного года выделение белка с мочой, выраженное в мг и отнесенное к м 2 поверхности тела за сутки, становится относительно постоянной величиной [30]. Анализ приведенных выше данных указывает на то, что суждение о протеинурии по содержанию белка в суточном объеме мочи пока мож- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 31 Таблица 2 Выделение белка с мочой за сутки у детей разных возрастных групп Возрастная группа Суточная экскреция белка (мг/м 2 сут.) 5–30 дней (недоношенные) 29 182 от 88 до 377 7–30 дней (доношенные) 32 145 от 68 до 309 2–12 мес. 38 109 от 48 до 244 2–4 года 49 91 от 37 до 223 4–10 лет 71 85 от 31 до 234 10–16 лет 83 63 от 22 до181 но отнести к разряду мифов (миф № 2), основанных, в первую очередь, на результатах исследований, полученных при использовании разных методов, тест-систем и способов выражения концентрации. Для того, чтобы данный миф развеять и перевести данный показатель из разряда сомнительных в разряд надежных и обоснованных, лабораторному сообществу и клиницистам необходимо договориться, как минимум, о нижеследующем: 1. использовать во всех лабораториях один и тот же метод, либо ту его модификацию и соответствующую тест-систему, обеспечивающую сопоставимые с прототипом метода результаты. На взгляд авторов статьи, на эту роль с успехом может претендовать пирогаллоловый метод, для которого значение 150 мг/сут. как верхний допустимый предел постепенно становится общепризнанным [31]; 2. в педиатрии следует провести дополнительные исследования и решить вопрос, насколько отнесение протеинурии к поверхности тела ребенка является диагностически более значимым по сравнению с показателями суточной экскреции белка; 3. для разработки обоснованных референтных значений следует организовать проведение популяционных исследований, тем более что сценарий их проведения апробирован на примере других лабораторных показателей [32]. Миф № 3 — протеинурию можно оценивать по величине белок/креатинин в случайном образце мочи. Воз32 95 % пределы (мг/м 2) (мг/сут.) никновение данного мифа связано с попытками избежать множества неудобств и проблем при сборе мочи, выделенной за 24 часа, в особенности у детей и пожилых людей. Было проведено множество исследований с целью доказать приемлемость оценки суточной потери белка с мочой по величине отношения белок (альбумин)/креатинин в случайном образце мочи. На основании данных в этих работах был сделан вывод о том, что отношение белок/креатинин в случайном образце мочи может служить надежным показателем, характеризующим суточную экскрецию белка и многие солидные организации, в частности, Национальный почечный фонд (National Kidney Foundation США), рекомендуют широко использовать данное отношение [18]. Эксперты PARADE для суждения о протеинурии отдают предпочтение количественной оценке суточной экскреции белка по сравнению с определением белка в случайном образце мочи. В качестве верхнего предела они рекомендуют значение 100 мг/м 2/сут. Отношение белок/креатинин, по их мнению, является менее надежным маркером, чем величина суточной протеинурии. При наличии трудностей с получением суточного объема мочи отношение белок/креатинин предпочтительнее определять в первой утренней порции мочи. Верхние значения референтного интервала зависят от возраста ребенка [33]: • < 2 мг белка/мг креатинина у детей старше двух лет; • < 5 мг белка/мг креатинина у детей в возрасте от шести месяцев до двух лет. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 Другие авторы считают, что нормализованный с учетом креатинина показатель отношения белок/креатинин позволяет решить большую часть проблем оценки протеинурии у детей. В этом случае величина протеинурии у детей в возрасте до шести месяцев не должна превышать отношение 50 мг/моль креатинина, от 6 до 24 месяцев — 50 мг/моль креатинина. У детей старше двух лет это значение снижается до 25 мг/моль [34]. На наш взгляд, использование отношения белок/креатинин для оценки величины суточной протеинурии не вполне корректно. Выводы экспертов NKF, на которые ссылаются многие авторы, основаны в основном на результатах исследований, в которых была обнаружена высокая степень корреляции между отношением белок/креатинин в случайных образцах мочи и суточной потерей белка в различных группах больных [18]. Не все авторы согласны с таким подходом. Группа исследователей из Оксфорда [35], проанализировав литературу, касающуюся использования отношения белок/креатинин в случайных образцах вместо анализа суточной экскреции белка, пришла к выводу о том, что в литературе нет достаточных оснований для доказательства высокой корреляции между отношением белок/креатинин в случайных образцах мочи и суточной экскреции белка. К аналогичным выводам пришли другие группы исследователей, обнаруживших неправомочность замены этих тестов, по крайней мере, при гломерулонефритах [36]. Ряд авторов скептически относится к возможности оценки суточной протеинурии по величине показателя белок/креатинин, утверждая, что регрессионный анализ и определение коэффициента корреляции свидетельствуют лишь о степени линейной связи между двумя переменными, но не дают оснований заменять одну переменную другой. К числу скептиков причисляют себя и авторы данной статьи [37], обнаружившие, что в отличие от здоровых детей, у пациентов с заболеваниями почек ценность отношения белок/креатинин в случайной порции e-mail: [email protected] мочи для оценки протеинурии ограничена из-за нарушений циркадного ритма выведения как белка, так и креатинина (см. рисунок). Как следует из представленных на рисунке данных, лишь у детей в контрольной группе отношение белок/креатинин сохраняет монотонный характер в течение суток, в то время как в группах пациентов с заболеваниями почек (ПМР и ПН) данный показатель меняет свое значение в течение суток. Иными словами, характеризовать суточную потерю белка с мочой по величине отношения белок/креатинин правомочно только для пациентов без заболеваний почек. При его использовании у пациентов с заболеваниями почек следует считаться с возможностью получения недостоверных результатов. Таким образом, вопрос о выборе надежных способах оценки протеинурии остается открытым, и мы надеемся, что последующие исследования помогут хотя бы частично решить данную проблему. Список литературы 1. Рябов С. И. Нефрология: Руководство для врачей.- СПб.: СпецЛит,200.-672 с. 2. Cameron J. S. Milk or albumin? The history of proteinuria before Richard Bright//Nephrol. Dial.Transplant.-2003, Vol.18, P. 1281–1285. 3. Schena F. P. Domenico Cotugno and his interest in proteinuria//Am. J. Nephrol.- 1994. Vol.14, P. 325–329. 4. Neild G. H. William Cruickshank (FRS–1802): clinical chemist//Nephrol. Dial. Transplant.1996, Vol. 11, P.1885–1889. 5. Р о з е н ф е л ь д Л . Г е н р и Б е н с Д ж о н с (1813–1873): лучший «врач-химик» в Лондоне//Лабораторная диагностика.- 2010, № 1–2 (22), с. 26–32. 6. Тареев Е. М. Ричард Брайт. К 150‑летию основной работы, положившей начало нефрологии//Клиническая нефрология. 2009.-Т. 1, С. 40–43. 7. Solon M. De l’albuminurie ou hydropisie causee par maladies des reins, 1 volume inS° avec planches coloriees. Paris. 1835. 8. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София., 1968. 9. Rosenfeld L. William Prout: early 19th century physician-chemist//Clin. Chem.- 2003, Vol. 49, P. 699–705. 10.Морозова В. Т., Миронова И. М., Марцишевская Р. Л.. Исследование мочи. М.: РМАПО. 2006. 11. Кошлаков Д. И. Анализ мочи (клиническое руководство). 1‑е изд. 1880, СПб. 12. Chambers R. E., Bullock D. G., Whicher J. T. Urinary total protein estimation-fact or fiction?//Nephron. –1989. -Vol.53, N1. -P. 33–36. 13. Козлов А. В. Протеинурия. Методы выявления. (учебное пособие) — СПб.: Изд. дом СПбМАПО, 2009. — 80 С. e-mail: [email protected] Рисунок. Изменение величины отношения белок/креатинин (мг/г) в моче в течение суток у детей контрольной группы, детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом (ПМР) и детей с острым пиелонефритом (ПН). 14. Koller A. Total urinary protein. In: Clinical Chemistry. Theory, Analysis and correlation. L. Kaplan, A. S. Pesce eds. 1984. 15.Ларичева Е. С., Андреев Ю. Н., Ребякова Е. Н.. Козлов А. В. Способен ли метод определения белка в моче с пирогаллоловым красным претендовать на роль основного?//Лабораторная диагностика. — 2009, № 1. — С. 25–32. 16. Шварценбах Г., Флашка Г. Комплексонометрическое титрование. Пер. с нем. Изд. «Химия».М.,1970. 360 С. 17. Пупкова В. И., Прасолова Л. М. Определение белка в моче и спинномозговой жидкости. — Кольцово, 2007.43 С. 18. National Kidney Foundation. K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease: evaluation, classification and stratification//Am. J. Kidney. Dis. 2002. Vol. 39 (2 Suppl 1). P. S1–266. 19.Эрман М. В. Нефрология детского возраста в схемах и таблицах. Издательство «Специальная литература». 2010. 683 С. 20.Тареев Е. М. Нефриты. М. 1958. 21.Рябов С. И., Наточин Ю. В., Бондаренко Б. Б. Диагностика болезней почек. 1979. 22.Нефрология (руководство для врачей). В 2 томах. Под ред. И. Е. Тареевой. М., Медицина, 1995. 23.Робсон А. Протеинурия и нефротический синдром/В кн.: Почки и гомеостаз в норме и при патологии. Пер. с англ., М., 1987. 24.Leman J., Doumas B. T. Proteinuria in health and disease assessed by measuring the urinary protein/creatinine ratio//Clin.Chem. –1987. -Vol.33, N2. -P‑297–299. 25.E u r o p e a n U r i n a l y s i s G u i d e lines//Scand. J. Clin. Lab. Invest.- 2000, Vol. 60, P.1–96. 26.Orsonneau J. L., Douet P., Massoubre C., Lustenberger P. et al. An improved pyrogallol red-molybdate method for determining total urinary protein//Clin. Chem. –1989, Vol. 35, P.2232 –2236. 27.Higby K., Suiter C. R., Phelps J. Y., Siler-Khodr T. et al. Normal values of urinary albumin and total protein excretion during pregnancy//Am. J. Obstet. Gynecol. — 1994, Vol. 171, P. 984–9. 28.Weichselbaum T. E. An accurate and rapid method for the determination of proteins in small amounts of blood serum//Am. J. Clin. Pathol. –1946, Vol. 13, P. 40–49. 29.Henry R. J., Sobel C., Seglove M. Turbidimetric determination of proteins with sulphosalicylic and trichloroacetic acids//Proc. Soc. Exp. Biol. Med. — 1956, Vol. 92, P. 748–51. 30.Miltényi M. Urinary protein excretion in healthy children//Clin. Nephrol.- 1979, Vol. 12, P.216–21. 31.Энциклопедия клинических лабораторных тестов/под ред. Н. Тица, М., 1997, С. 76–78. 32.Stomme J. H., Rustad P., Steensland H., Theodorsen L., Urdal P. Reference intervals for eight enzymes in blood of adult females and males measured in accordance with the international Federation of Clinical Chemistry reference system at 378C: part of the Nordic Reference Interval Project//Scand. J. Clin. Lab. Invest. — 2004, Vol. 64, P. 371–384. 33.Hogg R. J., Portman R. J. Millner D., Lemley K. V., Eddy A., Ingelfinger J. Evaluation and management of proteinuria and nehprotic syndrome in children: recommendation from a pediatric nephrology panel established at the National kidney foundation conference in Proteinuria, Albuminuria, Risk, Assessment, Detection, And Elimination (PARADE)//Pediatrics.-2000, Vol.105, P. 1242–1249. 34.Christian M. T., Watson A. R. The investigation of proteinuria//Current Paediatrics. — 2004, Vol.14, P. 547–555. 35.Price Ch. P., Newall R.G, Boyd J. C.. Use of protein: creatinine ratio measurements on random urine samples for prediction of significant proteinuria: A Systematic Review//Clin. Chem. — 2005, Vol.51, P. 1577–1586. 36.Koopman M. G., Krediet R..T. et al. Circadian Rhythm of Proteinuria: Consequences of the Use of Urinary Protein: Creatinine Ratios//Nephrol Dial Transplant. –1989. — V. 4. — P. 9–14. 37.Л а р и ч е в а Е . С . , К о з л о в А . В . , Э р ман М. В. Правомочность оценки протеинурии у детей по отношению белок/креатинин в моче//Российский семейный врач.- 2011, Т. 15 (3), С. 28–33. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 33 Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека и его применение в клинической практике М. С. Макаров; Н. В. Боровкова, д. м. н.; Е. Н. Кобзева, к. м. н.; И. В. Высочин; В. Б. Хватов, д. м. н., проф. ГБУЗ «НИИ СП им. Н. В. Склифосовского», Москва Резюме В статье описывается способ морфофункционального исследования тромбоцитов человека с помощью витального окрашивания и примеры его использования в клинической практике. Предложенный способ позволяет определить биологическую полноценность тромбоцитов независимо от их концентрации в пробе в норме и при различных патологиях, а также оценить качество тромбоцитов, используемых для трансфузии. Ключевые слова: тромбоциты, гранулы, витальное окрашивание, адгезивная активность, морфофункциональный статус. М. С. Макаров Т В. Б. Хватов Summary The new method of morphological and functional analysis of human platelets with vital staining is presented. Our approach was to study vital-stained platelets in clinic. Due to our method, the quality of platelets can be defined apart from platelet concentration in normal and pathological blood and in transfusion components. Keywords: platelets, granules, vital staining, adhesive activity, morphofunctional status. ромбоциты — это мелкие безъядерные высокоспециализированные клетки с уникальной структурой и функциями. Тромбоциты предупреждают и прекращают кровотечения, связанные с тромбоцитопенией или тромбоцитопатией. Определены показания к переливанию концентрата тромбоцитов (Инструкция по применению компонентов крови, Приказ Минздрава РФ № 363 от 25.11.2002). Лечебная эффективность тромбоцитов зависит от их биологической полноценности и функциональной активности [6, 7]. Однако «Технический регламент о требованиях безопасности крови, ее продуктов, используемых в инфузионно-трансфузионной терапии» (Постановление Правительства РФ № 29 от 26.01.2010) не содержит данных, регламентирующих биологическую полноценность и функциональную активность тромбоцитов. Оценку качества тромбоцитов человека проводят с помощью микроскопии фиксированных [2, 3, 7] и нефиксированных клеток [1] без анализа их функциональной активности. Информационная значимость методов оценки агрегационной активности тромбоцитов [3, 5] весьма ограничена из-за следующих недостатков: отсутствие анализа морфологии тромбоцитов; трудность выбора 34 оптимального индуктора агрегации, необходимость проведение анализа лишь при регламентированной концентрации тромбоцитов, невозможность проведения анализа в бесплазменной среде. Это определило разработку и внедрение адекватной оценки качества тромбоцитов. Предложена оценка морфофункционального статуса тромбоцитов человека, позволяющая проводить параллельный анализ морфологической целостности и функциональной активности тромбоцитов независимо от их концентрации в пробе и основанная на анализе витально окрашенных клеток во флуоресцентном микроскопе (заявка на изобретение № 2012105560). Витальное (прижизненное) окрашивание позволяет выявить различные структурные компоненты клеток без нарушения их жизнедеятельности. Для окрашивания тромбоцитов предложен краситель на основе двух флуорохромов — трипафлавина и акридинового оранжевого (АО). Окрашенные трипафлавином–АО тромбоциты во флуоресцентном микроскопе имеют зеленое свечение цитоплазмы и красно-оранжевое свечение гранул. Гранулы (везикулы с секреторными веществами) являются важным структурным компо- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 нентом тромбоцитов; при различных заболеваниях увеличивается доля тромбоцитов, не содержащих гранул. Такие клетки обладают сниженной функциональной активностью или являются дегенеративными [4]. Следовательно, наличие в тромбоците гранул, а также их количество можно рассматривать в качестве критериев жизнеспособности и функциональной активности клеток. Витальное окрашивание тромбоцитов осуществляли следующим образом. Готовили смесь трипафлавина и акридинового оранжевого на 0,15 М фосфатном буфере Зеренсена (рН = 7,3). Затем 10–20 мкл цельной крови, плазмы, богатой тромбоцитами (ПБоТ), или тромбоконцентрата в пробирке смешивали с 10–20 мкл рабочего раствора красителя. Окрашивание проводили в течение 5–10 минут, после чего пипеткой отбирали 10–15 мкл смеси, переносили на предметное стекло и накрывали покровным стеклом. Изображения витально окрашенных тромбоцитов получали с помощью флуоресцентного микроскопа (объектив ×100, числовая апертура 1,25, λ возбуждения 450–490 нм, λ эмиссии от 520 нм). Для анализа изображения тромбоцитов использовали программу Adobe Photoshop. e-mail: [email protected] Среди пула анализируемых тромбоцитов отчетливо выявлялись клетки с гранулами и клетки без гранул, при этом количество гранул на одну клетку сильно варьировало (рисунок 1). Тромбоциты с гранулами содержали от 3 до 15 визуально различимых гранул диаметром 300–600 нм, которые были распределены по всему объему клетки и интенсивно окрашивались также на Са 2+ и серотонин. Тромбоциты без гранул не содержали гранул диаметром 300–600 нм или содержали 1–2 гранулы меньших размеров, которые всегда были связаны с клеточной оболочкой и практически не окрашивались на Са 2+ и серотонин. Подчеркнем, что интенсивность свечения тромбоцитов зависела от количества в них гранул и существенно превышала интенсивность свечения клеток без гранул. Тромбоциты, прижизненно окрашенные трипафлавином и акридиновым оранжевым, сохраняли свою адгезивную и агрегационную активность, которая зависела от количества тромбоцитов, содержащих более трех гранул. Кроме того, в экспериментах было показано, что как неокрашенные, так и окрашенные трипафлавином–АО тромбоциты после их активации кальцием проявляли ростстимулирующее действие в культуре фибробластов человека. Таким образом, прижизненно окрашенные трипафлавином и акридиновым оранжевым тромбоциты человека полностью сохраняли свою функциональную активность. Результаты этих исследований обосновывают возможность оценки морфофункциональной активности этих клеток. Установлено, что прижизненно окрашенные тромбоциты после воздействия индуктором агрегации (коллаген) образовывали тесное скопление клеток (агрегатов), не содержащих гранул (рис. 1 е). Следовательно, отсутствие или уменьшение количества тромбоцитов с гранулами указывает на прошедший процесс активирования клеток в анализируемой популяции. Эти клетки либо потеряли, либо снизили свой функциональный потенциал. Клиническая эффективность трансфузии такой популяции тромбоцитов для коррекции e-mail: [email protected] Рисунок 1. Тромбоциты человека, витально окрашенные трипафлавином-АО: а — клетки без гранул; б — клетка с 1–2 гранулами; в — клетки с 3–9 гранулами, г — клетки с 10–15 гранулами; д — тромбоциты в плазме до активации коллагеном; е — тромбоциты в плазме после активации коллагеном. система гемостаза у больных невысока или отсутствует. С другой стороны, выявление популяции тромбоцитов без или с повышенным количеством гранул в крови имеет большое диагностическое значение. Морфофункциональный анализ витально окрашенных тромбоцитов включал определение следующих параметров. 1. Концентрацию тромбоцитов (Стр) в анализируемом образце (тыс./мкл) определяли с помощью гематологического анализатора. 2. Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (Dтр.гр) в процентах. При большом увеличении (объектив ×100) оценивали от 150 до 200 прижизненно окрашенных клеток и регистрировали количество тромбоцитов, содержащих три и более гранулы в цитоплазме, и выражали в процентах.. 3. Концентрация тромбоцитов с гранулами (С тр.гр) в анализируемом образце (тыс./мкл). Определяли по формуле Стр.гр = Стр × Dтр.гр, т. е. количество тромбоцитов в образце (тыс./мкл) × долю тромбоцитов с гранулами. Например, при исследовании концентрата тромбоцитов количество клеток составило 2 000 тыс./мкл, а доля тромбоцитов с гранулами составила 69,3 % или 0,693. Количество тромбоцитов с гранулами в концентрате тромбоцитов равнялось 2 000 тыс/мкл × 0,693 = 1 386 тыс./мкл. 4. Морфофункциональную активность тромбоцита (МФАТ) определяли по интенсивности флуоресценции окрашенных тромбоцитов, оценивали в фут-канделах на одну клетку или баллах (1 фут-кандел = 1 баллу). МФАТ отображал целостность внутренней структуры тромбоцита и среднее содержание гранул в расчете на одну клетку. Например, при исследовании популяции из 100 тромбоцитов яркость клеток варьировала от 20 до 60 футкандел, что в сумме составило 4 860 фут-кандел. МФАТ = 4 860: 100 = 48,6 фут-кандел или баллов. 5. Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле. Препарат с прижизненно окрашенными трипафлавином–АО клетками на стекле помещали на 10–15 мин. в термостат при 37 °C, затем с помощью флуоресцентного микроскопа определяли количество адгезировавших тромбоцитов в расчете на 100 или 150 анализируемых клеток. Адгезивную активность выражали в проценте адгезировавших тромбоцитов к общему числу обследованных тромбоцитов или в баллах. 1 % адгезивной активности равен одному баллу. Например, при исследовании 150 витально окрашенных тромбоцитов отмечено 95 больших распластанных по стеклу клеток. ААТ равна 95: 150 × 100 = 63,3 % или 63,3 балла. 6. Морфофункциональный статус тромбоцитов (МФСТ) — интегральная оценка структурной целостности и адгезивной активности тромбоцитов. МФСТ определяли как сумму МФАТ и ААТ и выражали в баллах. У здоровых людей концентрация тромбоцитов (Стр) варьировала от 160 до 390 тыс./мкл, относительное содержание тромбоцитов с гранулами (D тр.гр) от 37 до 75 %, концентрация тромбоцитов с гранулами (Стр.гр) от 60 до 180 тыс./мкл, морфо- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 35 Таблица 1 Морфофункциональные параметры оценки качества тромбоцитов человека Объект исследования Концентрация тромбоцитов (тыс./мкл) Концентрация тромбоцитов с гранулами (тыс./мкл) МФАТ, баллы ААТ, баллы МФСТ, баллы Доноры. Кровь. N = 200 180–320 35–80 60–180 37–57 40–70 Доноры. Плазма, обогащенная тромбоцитами. N = 200 400–800 30–75 180–490 37–56 30–70 67–126 Доноры. Концентрат тромбоцитов. N = 50 1 000–5 000 30–70 400–2 500 35–56 30–60 65–116 77–127 Больные с травмой конечностей. N = 50 160–340 35–80 60–210 36–60 35–80 71–140 Больные с экзогенными отравлениями. N = 50 160–300 10–50 25–100 30–42 10–45 40–87 Гематологичес–кие больные с геморрагическим синдромом. N = 40 2–100 0–10 0–5 10–30 0 10–30 Больные с тромбоэмболи–ческими осложнениями N = 10 600–800 80–90 570–700 65–80 80–90 145–170 функциональная активность тромбоцитов (МФАТ) от 37 до 60 баллов; адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле от 40 до 70 балл о в ; м о р ф о фу н к ц и о н а л ь н а л ь ный статус тромбоцитов (МФСТ) от 75 до 130 баллов. Разработанный метод оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека позволил оценить качества тромбоцитов в цельной крови, в плазме, богатой тромбоцитами (ПБоТ) и тромбоконцентрате доноров, а также в крови и плазме пациентов с различными патологиями (таблица 1). Результаты оценки морфофункционального статуса тромбоцитов у доноров (в цельной крови, ПБоТ и тромбоконцентрате) приняты нами за физиологическую норму. У пациентов с травмой конечностей значения морфофункциональных параметров тромбоцитов находились в пределах нормы, у пациентов с острыми экзогенными отравлениями были снижены. У гематологических больных с геморрагическим синдромом морфофункциональная и адгезивная активность тромбоцитов была крайне подавлена, что привело к угнетению клеточного звена системы гемостаза и развитию геморрагического синдрома. С другой стороны, у больных с тромбоэмболическими осложнениями имела место резкая активация системы клеточного звена гемостаза, что проявлялось в резком увеличении концентрации тромбоцитов с гранулами, МФАТ и ААТ. Разработанный метод также был использован для оценки качества тромбоцитов в тромбоконцентратах (ТК) в начале и в конце срока хра36 Относительное содержание тромбоцитов с гранулами ( %) Таблица 2 Морфофункциональные параметры тромбоцитов тромбоконцентрата в начале и в конце хранения Анализируемые параметры Тромбоконцентрат в начале 1‑х суток хранения N = 10 Тромбоконцентрат через 5 суток хранения N = 10 Концентрация тромбоцитов (Стр), тыс./мкл 2 500–3 000 2 000–2 700 Количество тромбоцитов в 100 мл (млрд в дозе) 250–300 200–270 Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (Dтр.гр), % 45–69 0 Концентрация тромбоцитов с гранулами (Стр.гр), млрд в дозе 165–200 0 Морфофункциональная активность тромбоцитов (МФАТ), баллы 40–48 10–20 Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле, баллы 37–65 0 Морфофункциональнальный статус тромбоцитов (МФСТ), баллы 77–113 10–20 нения (пять суток при комнатной температуре). В начале хранения во всех ТК морфофункциональные параметры тромбоцитов (МФАТ, ААТ, МФСТ) были в пределах нормы; через пять суток в исследуемых тромбоконцентратах наблюдалось резкое падение всех морфофункциональных параметров тромбоцитов (таблица 2). Это данные свидетельствовали о том, что через пять суток хранения при комнатной температуре ТК непригоден для клинического использования. Предложенный способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека можно рекомендовать для использования в практике станций и отделений переливания крови. Таким образом, предложенный метод оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека является перспективным для оценки качества тромбоцитов, используемых в клинической практике, а также для Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 оценки биологической полноценности и функциональной активности тромбоцитов при различных патологиях в целях коррекции проводимой терапии. Список литературы 1. Василенко И. А., Пашкин И. Н., Суслов В. П., Власова Е. А.//Урология. 2011. № 2. С. 36–41 2. Коробова Ф. В., Левина Т. Н., Соколинский Б. З., Белов Е. В., Козинец Г. И.//Клин. лаб. диагн. 2000. № 12. С. 46–49. 3. Льюис С. М., Бэйн Б., Бэйтс И. Практическая и лабораторная гематология. Пер с англ. Под ред. А. Г. Румянцева//М.: ГЭОТАР-Медия. 2009. 672 с. 4. Мазуров А. В.//Физиология и патология тромбоцитов Москва. 2011. С. 10–56. 5. Руководство по гематологии.//под ред. Воробьева А. И. В 3 томах. Том 1. Москва: Ньюдиамед. 2002. 280 с. 6. Шевченко Ю. Л., Жибурт Е. Б. Безопасное переливание крови: руководство для врачей//СПб.: ПИТЕР. 2000. 308 с. 7. Walker H. K., Hall W. D., Hurst J. W. Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3rd edition.//Boston: Butterworth’s. 1990. 460 p. e-mail: [email protected] Иммунные и кардиоваскулярные нарушения у больных хроническим лимфолейкозом при использовании разных схем полихимиотерапии И. В. Cнежко, к. м. н., доцент кафедры гематологии и трансфузиологии ФПК и ППС, РостГМУ Ю. В. Шатохин, д. м. н., профессор, зав. кафедрой гематологии и трансфузиологии ФПК и ППС, РостГМУ Е. В. Бурнашева, к. м. н., ассистент кафедры внутренних болезней № 2 О. Н. Шатохина, врач отделения онкогематологии Ростовского научно-исследовательского онкологического института Ростовский государственный медицинский университет, Ростов‑на-Дону О И. В. Cнежко Ю. В. Шатохин Е. В. Бурнашева Резюме Основная цель статьи — определение оптимальной стратегии лечения больных с хроническим лимфолейкозом, основанной на фактах, прогнозах, реакции на терапию и возможные осложнения, в том числе и сердечно-сосудистой системы. В связи с этим, актуальным является изучение возможной взаимосвязи кардиоваскулярных нарушений с дисбалансом иммунной системы при использовании разных схем полихимиотерапии у больных ХЛЛ. Первая линия терапии — митоксантрон, флударабин, циклофосфа, вторая линия терапии — Мабтера, флударабин, циклофосфамид. Исследование показало, что наличие сердечно-сосудистых расстройств в ХЛЛ возможную роль играет иммунная дисфункция. Повышение уровня ФНО-α на фоне проведения химиотерапии при отсутствии активности основного заболевания и инфекционного процесса может трактоваться как неблагоприятный маркер развития значимых кардиоваскулярных нарушений. Выявленные иммунные нарушения у больных ХЛЛ: увеличение содержания ФНО-α в крови, количества клеток с HLA-DR+ и клеток с CD95+ в пунктате костного мозга, коррелируют со степенью выраженности морфофункциональный изменений сердечно-сосудистой системы и более выражены у больных при полихимиотерапии по схеме первой линии терапии Ключевые слова: хронический лимфолейкоз, химиотерапия, кардиотоксичность, фактор некроза опухолей. Summary The main objective of the treatment of patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the determination of the optimal treatment strategy based on the facts prognosis, response to therapy and possible complications, including cardio-vascular system. In this regard, relevant is the study of a possible association with cardiovascular disorders immune system imbalance in the use and comparison of the most effective regimens of chemotherapy: the first consisted of mitoxantrone, fludarabine, cyclophosphamide, and the second — MabThera, fludarabine, cyclophosphamide. The study showed that in the genesis of cardiovascular disorders in CLL possible role of immune dysfunction. Increased against chemotherapy with no activity of the underlying disease TNF-a and the infection can be treated as a marker of significant adverse cardiovascular disorders. Identified levels, the immune disorders in patients with CLL: increase of TNF-a, number of cells with HLA-DR and CD95 cells in the bone marrow are correlated with the severity of morphological changes of the cardiovascular system and are more pronounced in patients with chemotherapy on the first scheme. Keywords: chronic lymphocytic leukemia, chemotherapy, cardiac toxicity, tumor necrosis factor. e-mail: [email protected] пределение оптимальной стратегии лечения пациентов с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) в зависимости от факторов прогноза, ответа на терапию и возможных осложнений, в том числе со стороны сердечно-сосудистой системы, является в настоящее время важной задачей (J. G. Gribben, 2006). Практически каждый из цитостатиков обладает кардиотоксичностью (Городецкий В. М.,1998; Орел Н. Ф., 2006), которое наиболее выражено у антрациклиновых антибиотиков, особенно адриамицина (доксорубицина, адриабластина, доксолема) и др. (Ватутин Н. Т. и соавт., 1998). В лечении ХЛЛ в настоящее время сочетание пуринового аналога флударабина и циклофосфана, вызывающее необратимое повреждение внутриклеточных структур опухолевых клеток и лекарственных схем на их основе, рассматривается как наиболее перспективное (Волкова М. А., 2007). По данным литературы, схема FCМ (митоксантрон, флударабин, циклофосфан) имеет высокую клиническую эффективность (Bellosillo B. еt al., 1998; Bosch F. et al., 2002; Загоскина Т. П. и соавт., 2005). Широко используемые моноклональные антитела ритуксимаб (мабтера) сенсибилизируют линии лимфомных клеток к различным химиотерапевтическим агентам (в частности, флударабину), и схема на их основе RFC (мабтера, флударабин, циклофосфан) рекомендована в лечении больных ХЛЛ в качестве первой линии терапии (Волкова М. А., 2007). Развивающийся иммунный дисбаланс, важная роль провоспалительных цитокинов как потенциальных регуляторов роста и апоптоза лейкозных В‑клеток определяет особое значение изучения влияния иммунологических параметров на развитие сердечно-сосудистых осложнений при ПХТ у больных ХЛЛ. Цель исследования Изучение возможной взаимосвязи кардиоваскулярных нарушений с дисбалансом иммунной системы при использовании разных схем полихимиотерапии у больных ХЛЛ. Материалы и методы В основу данной работы положены результаты обследования 100 больных ХЛЛ, которым в период с 2006 по 2011 гг. в отделении гематологии Ростовского государственного медицинского университета проводи- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 37 Таблица 1 Клинические показатели признаков кардиотоксичности при FCМ и RFC Схема Схема FCМ Схема RFC Показатели Абс. P ± mp ( %) Абс. P ± mp ( %) Кардиалгии 34 14,2 ± 2,3 41 11,4 ± 1,7 Сердцебиения 124 51,7 ± 3,2 162 45,0 ± 2,6 Одышка при физической нагрузке 49 20,4 ± 2,6 55 15,3 ± 1,9 Типичные ангинозные боли 13 5,4 ± 1,5 9 2,5 ± 0,8 Всего нарушений на 100 курсов 220 91,7 ± 6,2 267 74,2 ± 4,5* Примечание: * — статистически достоверные различия (р < 0,05) Таблица 2 Инструментальные показатели признаков кардиотоксичности при проведении ПХТ полихимиотерапии Схема Схема FCМ (n = 240) Схема RFC (n = 360) Показатели абс P ± mp ( %) абс P ± mp ( %) Внутрижелудочковые блокады 24 10,0 ± 1,9 27 7,5 ± 1,4 Диффузные нарушения реполяризации миокарда 78 32,5 ± 3,0 100 27,8 ± 2,4 Синусовая тахикардия (I стадия кардиотоксичности) 112 46,7 ± 3,2 144 Однофокусная желудочковая экстрасистолия 59 24,6 ± 2,8 71 19,7 ± 2,1 Мерцательная аритмия 10 4,2 ± 1,3 9 2,5 ± 0,8 Многофокусная эктрасистолия 25 10,4 ± 2,0 26 7,2 ± 1,4 Снижение фракции выброса левого желудочка 20 8,3 ± 1,8 18 5,0 ± 1,1 Значение митрально-септальной сепарации выше нормы 20 8,3 ± 1,8 18 Сегментарные нарушения сократимости 31 12,9 ± 2,2 36 Ишемические смещения интервала ST при СМ ЭКГ 13 5,4 ± 1,5 9 Всего нарушений на 100 курсов 392 163,3 ± 8,2 458 40,0 ± 2,6 5,0 ± 1,1 10,0 ± 1,6 2,5 ± 0,8 127,2 ± 5,9* Примечание: * — статистически достоверные различия (р < 0,05). лась полихимиотерапия по схемам FCМ (митоксантрон, флударабин, циклофосфан), составивших I группу из 40 человек, и RFC (мабтера, флударабин, циклофосфан), составивших II группу из 60 человек. Возраст обследуемых составил от 44 до 76 лет. Срок наблюдения за пациентами, начиная от первого дня химиотерапии, составил 12–47 месяцев. Программа FCМ включала флударабин 25 мг/м 2 в/в капельно на 100 мл физраствора в 1–3‑й день, циклофосфан 200 мг/м 2 внутривенно капельно в 1–3‑й день, митоксантрон 6 мг/м 2 внутривенно капельно в первый день (I группа). Схема RFC включала: мабтера 375 мг/м 2 в/в капельно в первый день, флударабин 25 мг/м 2 в/в капельно во второй, третий, четвертый дни; циклофосфан по 300 мг/м 2 в во второй, третий, четвертый дни струйно с интервалом между циклами 28 дней, всего шесть курсов терапии. Группы были сопоставимы по возрасту, полу, стадии по Binet, общему состоянию (по ECOG), наличию β2 микроглобулина, делеции 17 р‑хромосомы. Для 38 профилактики синдрома массивного цитолиза опухоли пациентам назначались аллопуринол и гипергидратация. С целью коррекции синдрома вторичного иммунодефицита назначались внутривенные иммуноглобулины (иммуновенин, габриоглобин). Ответ на терапию оценивали через два месяца после окончания всех курсов полихимиотерапии с использованием критериев, рекомендованных интернациональной рабочей группой по ХЛЛ и рабочей группой Национального института рака США (IWCLL/NCI) (Волкова М. А., 2007). Продолжительность общей выживаемости и безрецидивной выживаемости анализировали с помощью метода Каплана–Майера. Критерии сравнивали по значению log-rank. Всем пациентам проводилось кардиологическое обследование: стандартная ЭКГ в покое до начала терапии и после окончания каждого проведенного курса, холтеровское мониторирование ЭКГ (СМ ЭКГ) при появлении эпизода аритмии, ЭхоКГ с допплеровским сканированием. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 ЭхоКГ выполняли на аппарате Sonoline G60S (Siemens). Сократительная функция миокарда исследовалась в 16 сегментах. Для количественной оценки нарушений сократительной функции рассчитывался индекс нарушения сегментарной сократимости (ИНСС) ЛЖ. Для анализа параметров иммунной системы у всех обследованных больных определяли CD3+, CD4+, CD19+, CD20+, CD21+, CD23+, CD38+, CD95+, HLA-DR+лимфоцитов цитофлюориметрическим методом с использованием моноклональных антител. Учет полученных результатов проводили на проточном лазерном цитофлуориметре EPICS–XL фирмы Coulter SL (США); содержание в сыворотке иммуноглобулинов A, M, G определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. П р и от су т с т в и и п р и з н а ко в инфекционно-воспалительного процесса и гемолиза в день введения химиопрепаратов, через неделю после введения, по завершению курса лечения, а также при появлении нарушений ритма определялось содержание фактора некроза опухоли α (ФНО-α) методом твердофазного иммуноферментного анализа. Общая эффективность терапии по схеме FCМ и RFC составила соответственно 75 % и 80 %, при этом полные ремиссии были достигнуты у первичных пациентов в 61,1 % и 81 % случаев, ранее леченных в 18,2 % и 25,6 %, частичные: у первичных в 11,1 % и 14,2 %, ранее леченных в 31,8 % и 33,3 % случаев, стабилизация состояния отмечена в первой и второй группе соответственно в 12,5 % и 8,3 %, эффект не достигнут в первой группе в 2,5 % случаев. Таким образом, использование схемы RFC показало большую эффективность по сравнению со схемой FCМ по основным параметрам. Представляло интерес выяснить наличие кардиоваскулярных нарушений в рассматриваемых группах. При проведении полихимиотерапии (через шесть месяцев от начала терапии) клинические показатели были представлены в табл. 1. При назначении схем FCМ и RFC клинические симптомы отмечаe-mail: [email protected] лись соответственно: кардиалгии в 14,2 ± 2,3 % и 11,4 ± 1,7 %; сердцебиения в 51,7 ± 3,2 % и 45,0 ± 2,6 %; одышка при физической нагрузке в 20,4 ± 2,6 % и 15,3 ± 1,9 %, типичные ангинозные боли в 5,4 ± 1,5 % и 2,5 ± 0,8 %. Расчет на 100 проведенных курсов ПХТ выявил достоверное превышение частоты клинических симптомов кардиотоксичности при ПХТ по схеме FCМ 91,7 ± 6,2 против 74,2 ± 4,5* по схеме RFC. В табл. 2 представлены показатели, полученные при ЭКГ-исследовании, холтеровском мониторировании, эхокардиоскопии. П р и Э К Г в н у т р и ж е л уд о ч ковые блокады в 10,0 ± 1,9 % и 7,5 ± 1,4 %, диффузные нарушения реполяризации миокарда в 32,5 ± 3,0 % и 27,8 ± 2,4 %. Синусовая тахикардия (I стадия кардиотоксичности) выявлялась соответ ственно в 46,7 ± 3,2 % и 40,0 ± 2,6 % случаев; однофокусная желудочковая экстрасистолия (II стадия) в 24,6 ± 2,8 % и 19,7 ± 2,1 %, мерцательная аритмия (II стадия) в 4 , 2 ± 1 , 3 % и 2 , 5 ± 0 , 8 % , многофокусная экстрасистолия (III стадия) в 10,4 ± 2,0 % и 7,2 ± 1,4 % случаев. Снижение фракции выброса л е во го же л уд оч ка от м еч а л о с ь в б ол ь ш е м ч и с л е ку р с о в п р и проведении схемы FCМ: 8,3 ± 1,8 % в отличие от RFC (5,0 ± 1,1 %). Сегментарные нарушения сократимости также отмечались чаще в этой группе: 12,9 ± 2,2 % против 10,0 ± 1,6 %. Ишемические смещения интервала ST при суточном мониторировании ЭКГ в первой и второй группах отмечались соответственно в 5,4 ± 1,5 % и 2,5 ± 0,8 %. Таким образом, наибольшее количество нарушений выявлено при проведении ПХТ по схеме FCМ в более старших возрастных группах. При расчете на 100 проведенных курсов ПХТ по схеме FCМ выявлено достоверное превышение частоты инструментальных признаков кардиотоксических проявлений (163,3 ± 8,2) в сравнении со схемой RFC (127,2 ± 5,9). Важная роль ФНО-α как потенциального регулятора роста и апоптоза лейкозных клеток, а также в инициации апоптоза кардиомиоe-mail: [email protected] Таблица 3 Корреляционные взаимосвязи между иммунологическими и сердечно-сосудистыми показателями у больных ХЛЛ при ПХТ по схеме FCМ Показатель ФВ ИММ ЛЖ Количество наджелудочковых и желудочковых экстрасистол при СМ ЭКГ Ишемическое смещение сегмента ST при СМ ЭКГ Е/А CD3+ 0,48* –0,43* –0,23 –0,33 –0,28 CD19+ 0,56** –0,52** –0,35 –0,28 –0,17 CD20+ 0,60*** –0,58*** –0,24 –0,32 –0,15 HLA-DR+ –0,58** 0,54** 0,45* 0,52* 0,29 IgG 0,63** –0,57* –0,27 –0,23 –0,24 IgA 0,54* –0,42 –0,31 –0,18 –0,29 IgM 0,48* –0,50* –0,37 –0,21 –0,31 НСТстим/НСТспонт 0,42 –0,41 –0,16 –0,22 –0,29 ФНО-α –0,69*** 0,64*** 0,56* 0,63** 0,35 СD95+, пунктат костного мозга 0,65*** –0,62*** –0,49* –0,58** –0,42 Примечание: * — достоверные корреляционные связи при p < 0,05; ** — при p < 0,01; *** — при p < 0,001. цитов, определяет особое значение изучению его влияния на развитие сердечно-сосудистых осложнений при ПХТ у больных ХЛЛ (Насонов Е. Л. и соавт., 2000; Демьянова А В. и соавт., 2003). В результате проведенного исследования было установлено, что у больных ХЛЛ исходно наблюдалась тесная корреляционная связь между фракцией выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ), индексом массы миокарда левого желудочка (ИММ ЛЖ), индексом нарушения сегментарной сократимости (ИНСС), соотношением E/A как маркером диастолической дисфункции при его сдвигах, с одной стороны, и количеством СD19+ и СD20+ клеток, лимфоцитов с маркерами поздней активации рецепторов НLА-DR+, уровнем иммуноглобулинов в крови, количеством клеток с СD95+ в пунктате костного мозга, с другой стороны. Особенно тесной была взаимосвязь между ФВ ЛЖ, ИММ ЛЖ и содержанием в сыворотке ФНО-α и количеством CD95+-клеток в костном мозге. При проведении ПХТ по схеме FCМ установлены взаимосвязи между ФВ, ИММ ЛЖ и количеством В‑лимфоцитов, лимфоцитов, находящихся в стадии поздней активации фактором HLA-DR+, содержанием Ig A, M, G, ФНО-α, количеством клеток костного мозга, экспрессирующих рецепторы готовности к апоптозу. Увеличение количества клеток с маркерами поздней активации HLA-DR+, содержания ФНО-α и клеток костного мозга, экспрессирующих СD95+, определяли также частоту аритмических осложнений и ишемических изменений миокарда, что отражено в табл. 3. Из 50 корреляционных пар выявлено 24 достоверных коэффициента корреляции (48 %) с уровнем взаимосвязи от 0,43 до 0,69 (связь средней силы) между иммунологическими показателями тяжести онкологического процесса и выраженностью нарушений в состоянии ССС (степенью кардиотоксичности). У больных ХЛЛ, получавших ПХТ по схеме RFC, взаимосвязи между иммунологическими параметрами и сердечно-сосудистыми показателями были менее выражены (табл. 4). Как и в первой группе, более выраженные взаимосвязи были установлены между параметрами сердечной деятельности и содержанием ФНО-α в крови, количеством клеток костного мозга, экспрессирующих СD95+. В отличие от ПХТ FCМ, в группе ПХТ RFC из 50 корреляционных пар выявлено лишь 14 достоверных коэффициентов корреляции (28 %) с уровнем взаимосвязи от 0,34 до 0,59 (средняя степень связи). При этом коэффициенты детерминации указывали на уровень управляемости этих связей от 0,18 (18 %) до 0,35 (35 %), что косвенно также свидетельствует о меньшей взаимосвязи (и степенью ее детерминированности) между изменениями в иммунологическом ста- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 39 Таблица 4 Корреляционные взаимосвязи между иммунологическими и сердечно-сосудистыми показателями у больных ХЛЛ при ПХТ по схеме RFC Показатель ФВ ИММ ЛЖ Количество Ишемическое наджелудочковых смещение сегмента ST и желудочковых при СМ ЭКГ экстрасистол при СМ ЭКГ Е/А CD3+ 0,16 –0,13 –0,29 –0,28 –0,25 CD19+ 0,21 –0,26 –0,36 –0,49* –0,49* –0,53* CD20+ 0,13 –0,62* –0,37 –0,20 HLA-DR+ -0,59* 0,27 0,25 0,34* 0,61* IgG 0,25 –0,18 –0,22 –0,18 –0,27 IgA 0,29 –0,14 –0,18 –0,25 –0,18 IgM 0,11 –0,22 –0,28 –0,28 –0,38 НСТстим/НСТспонт 0,15 –0,32 –0,31 –0,19 –0,27 ФНО-α –0,51* 0,52* 0,26 0,42* 0,51* СD95+, пунктат костного мозга 0,43* –0,49* –0,18 –0,35 –0,59* Примечание: * — достоверные корреляционные связи при p < 0,05; ** — при p < 0,01; *** — при p < 0,001. тусе пациентов, проходящих курсы ПХТ RFC, и изменением состояния их ССС по сравнению с пациентами, проходящими ПХТ FCМ. Проведенное исследование позволило сделать следующие выводы: 1. в генезе кардиоваскулярных расстройств при ХЛЛ возможна роль дисфункции иммунной системы. Повышение уровня ФНО-α на фоне проведения химиотерапии при отсутствии активности основного заболевания и инфек- ционного процесса может трактоваться как неблагоприятный маркер развития значимых кардиоваскулярных нарушений; 2. выявленные иммунные нарушения у больных ХЛЛ: увеличение содержания ФНО-α в крови, количества клеток с HLA-DR+ и клеток с CD95+ в пунктате костного мозга коррелирует со степенью выраженности морфофункциональных изменений сердечнососудистой системы и более выражены у больных при полихимиотерапии по схеме FCM. Список литературы 1. Ватутин Н. Г., Калинкина Н. В. Профилактика кардиальных осложнений, вызванных применением противоопухолевых антибиотиков антрациклинового ряда//Украинский химиотерапевтический журнал. 1999.-№ 2.-С. 11–17. 2. Волкова М. А. — ред. Клиническая онкогематология. Издание второе. М. Медицина. 2007. С. 771–808. 3. Городецкий В. М. Осложнения противоопухолевой терапии//Гематология и трансфузиология.-1998.- т. 43.- № 1.- С. 11–15. 4. Демьянова А. В., Котов А. Ю., Симбирцев А. С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике//Цитокины и воспаление.2003. — Т. 2. — № 3.- С. 20–35. 5. Насонов Е. Л., Самсонов М. Ю. Новые аспекты патогенеза сердечной недостаточности: роль фактора некроза опухоли//Сердечная недостаточность. — 2000.Т. 1.-№ 4.-С. 139–143. 6. Орёл Н. Ф. Кардиотоксичность антрациклинов: возможности преодоления//Современная онкология.-№ 3.-Т. 6.-2004.С. 121–124. 7. Bellosillo B., Villamor N. Et al. In vitro evaluation of fludarabine in combination with cyclophosphamide and/or mitoxantrone in the treatment of resistant or relapsed chronic lymphocytic leukaemia//Blood.- 1998.Vol.94.- P. 2836–2843. 8. Bosch F., Ferrer A. et al. Fludarabine, cyclophosphamide and mitoxantrone in the treatment of resistant or relapsed chronic lymphocytic leukaemia//Br. J. Haematol.-2002.- Vol.119.- p. 976–977. 9. Gribben J. G. Лечение хронического лимфолейкоза в зависимости от факторов прогноза//Современная онкология. Экстравыпуск. MEDIA MEDICA. 2006. C.11–13 Проблемы терапии гормоночувствительного рака молочной железы у пациенток в постменопаузе 22 сентября 2012 года в Москве прошла научно-практическая конференция «Проблемы терапии гормоночувствительного рака молочной железы у пациенток в постменопаузе». Внимание онкологов акцентировано на новых возможностях помощи пациенткам с метастатическим ER+HER‑2‑позитивным раком молочной железы (далее — МРМЖ), характеризующимся агрессивным течением и неблагоприятным прогнозом. По данным ВОЗ, ежегодно диагностируется более 200 тыс. новых случаев ER+HER‑2‑позитивных форм рака молочной железы (далее — РМЖ), который в России, также как и в странах Европы и Америки, занимает первое место в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований среди женщин. Если на ранних стадиях РМЖ использование препаратов адъювантной и неоадъювантной терапии имеет целью повысить возможность излечения, то на поздних стадиях при распространении процесса задачей терапииявляется увеличение безрецидивного периода, продление жизни и максимально длительное сохранениеее качества. К сожалению, на сегодняшний день МРМЖ по-прежнему остается неизлечимым заболеванием. По международным данным, средняя продолжительность жизни с момента выявления метастазов составляет 2–3,5 года, 25–35 % пациенток живут более 5 лет и только 15 % свыше 10 лет. Основной вид лечения женщин, страдающих МРМЖ — эндокринная терапия. Однако почти у всех пациенток, у которых сначала отме- 40 чался ответ на терапию, в итоге развивается устойчивость к лечению, и единственно возможной опцией лечения является химиотерапия, которая влечёт за собой значительное ухудшение качества жизни пациенток. Кроме того, химиотерапия обладает серьёзным спектром побочных эффектов (тошнота, рвота, алопеция [облысение], поражение печени и т. д). Последние два десятилетия в медицинской науке и, в частности, в онкологии отмечены значительными достижениями в области молекулярной биологии, установлены механизмы контроля клеточного деления и клеточной смерти (апоптоза), выявлены белки, участвующие в канцерогенезе. Это позволило создать в онкологии новое направление в лечении злокачественных опухолей, так называемую таргетную терапию, которая направлена на тончайшие молекулярные механизмы жизнедеятельности опухолевой клетки. Таргетные препараты сейчас активно рассматриваются в качестве агентов для лечения МРМЖ как путь преодоления резистентности к эндокринной терапии. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected] Оптохин и его использование для идентификации Streptococcus pneumoniae Г. В. Белошицкий ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора Г. В. Белошицкий Резюме Оптохиновый тест наряду с определением растворимости в желчи (Bile solubility) и набуханием капсулы под действием специфической omni-сыворотки (Quellung reaction) входит в триаду основных дифференцирующих тестов для пневмококка от различных близкородственных видов стрептококков. Процессу разработки оптохинового теста, современной методике определения чувствительности к оптохину, проблеме обнаружения оптохинустойчивых штаммов пневмококков и причинам их образования посвящена данная статья. Ключевые слова: штаммы пневмококков, оптохин, зоны ингибиции, оптохиновый тест Б актерицидные свойства хинина и его деривативов в отношении пневмококка были открыты в 1911 году J. Morgenroth 1 и R. Levy и опубликованы в двух статьях, вышедших в августе и октябре месяце 1911 года под названием «Химиотерапия пневмококковой инфекции» в «Берлинском клиническом еженедельнике» [1]. Первые опыты с хинином выявили незначительный защитный эффект препарата при инокуляции мышам смертельной дозы пневмококков, однако у его производных — гидрохинина (метилгидрокупреина) и этилгидрокупреина (оптохина) пневмокококкоцидный эффект был значительно более выраженным. При одновременном введении мышам водных растворов этих препаратов во время инокуляции или в течение курса инъекций вирулентных пневмококков сохранялась жизнь значительному числу лабораторных животных. Эти эксперименты послужили толчком к изучению различных химических производных хинина с целью использования их в качестве тера- Summary Optochin test along with the determination of solubility in a bile and capsular swelling reaction with Omni serum (Quellung reaction) is included in the is atriad of major differentiating tests for pneumococcus. From various closely related species of Streptococcus. The process of the development optochin test, the modern method of determining the sensitivity to optochin, problem of the detection of optochin-resistant stocks of pneumococcus and reasons of their education the focus of this article. Key words: pneumococcal stocks, optochin, zones of inhibition, optochin test певтических средств для лечения различных форм пневмококковых инфекций у человека, и такие исследования продолжались практически до открытия сульфонамидов (пронтозила 2) и антибиотиков. Бактерицидный эффект оптохина на пневмококки in vitro был продемонстрирован в 1912 году в работе A. E. Weight, W. P. Morgan, L. Colebrook и R. W. Dodgson [2], а результаты подтверждены в 1914 году O. Schiemann и T. Ishiwara [3]. В 1915 году H. F. Moore выявил высокую специфичность избирательного действия оптохина на пневмококки среди других видов стрептококков, что позволяло использовать препарат для идентификации пневмококков [4]. А в 1921 году R. Bieling, используя лаковый кровяной агар (т. е. агар с добавлением лаковой крови), лаково‑оптохиновый кровяной агар и агар с добавлением вареной крови («шоколадный» агар), смог дифференцировать пневмококки от других типов стрептококков [5]. Однако ещё длительное время среди ученых продолжалась дискуссия о том, на- сколько специфично действие оптохина in vitro и in vivo на разные серотипы пневмококков (Kolmer J. A., 1920; Felton L. D., 1922), о влиянии вирулентных свойств возбудителя на чувствительность к препарату (Schiemann O., 1929). Кроме того, J. Morgenroth и M. Kaufmann показали, что четырехкратный пассаж пневмококков на животных, леченых оптохином, приводил к потере чувствительности к этому препарату [6], т. е. возникал вопрос: можно ли, используя оптохин, идентифицировать пневмококк, выделенный от больного, которого лечили препаратами хинина. Это был не праздный вопрос, так как в этот период многие легочные заболевания и различные лихорадки пытались лечить именно производными хинина, в том числе и пневмонии. В 1 9 2 9 год у в ы ш л а с т ат ь я H. D. Wright «Действие некоторых факторов на рост пневмококков», в которой была предложена четкая схема применения оптохина для идентификации штаммов пневмококков in vitro [7]. Тремя года- Юлиус Моргенрот (1871–1924) — немецкий иммунолог и химиотерапевт. Продемонстрировал литические свойства нормальной сыворотки на микробных возбудителях. Обосновал применение «антисыворотки» в терапевтических и диагностических целях. Впервые синтезировал и применил риванол в качестве антисептика против кокковой флоры. 1 2 Пронтозил — первый эффективный противострептококковый препарат, открытый Герхардом Домагк (Domagk) в 1934 году, за что в 1939 году ему была присуждена Нобелевская премия. e-mail: [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 41 ми позднее F. E. Koch после года удачных экспериментов с кровянооптохиновым агаром Бейлинга (Bieling) рекомендовал данную питательную среду для дифференциации пневмококков и стрептококков [8]. Затем в 1943 году E. Morch повторно открыл, что оптохин в низких концентрациях (1: 50 000) при внесении в кровяной агар способен ингибировать рост пневмококков [9], т. е. может использоваться в качестве дифференцирующего теста от других стрептококков. Однако до середины 50‑х годов широкого распространения этот метод так и не получил. Только после публикаций M. K. Bowen [10] и E. Lund [11], предложивших использовать бумажные диски, содержащие оптохин, для наложения на посев культуры стрептококков на кровяном агаре и последующего определения зоны ингибиции вокруг диска, тест получил распространение в рутинной практике всех бактериологических лабораторий. Особую ценность метод приобрел после того как E. Lund было показано, что у штаммов пневмококковю, потерявших капсулу и не лизирующихся желчными кислотами, чувствительность к оптохину сохраняется [11]. Регламент по становки те ста с оптохином в различных странах в настоящее время практически одинаков и отличается только диаметром используемых бумажных дисков, концентрацией препарата на диске и методом нанесения культуры на чашку (газоном, сектором или длинным штрихом) в зависимости от рекомендаций производителя дисков. Кровяную среду с добавлением оптохина, на которую затем высевают тестируемые стрептококки, в настоящее время практически не используют. В России постановка теста с оптохином регламентируется Приказом № 535 от 22.04.85 г. МЗ СССР и МУК 4.2.1887–04, другие документы носят рекомендательный характер. Методика постановки оптохинового теста (Приказ МЗ СССР от 22.04.1985 № 535) [12] Чистую культуру засевают на агар, 42 содержащий 1:50 000–1:100 000 оптохина. На следующие сутки учитывают результат. Пневмококки не растут в присутствии оптохина. Можно использовать бумажные диски с 6 мкг оптохина, которые накладываются после посева на поверхность среды (посев лучше производить секторами). У пневмококков вокруг диска образуется зона задержки роста не менее 18 мм. Проба с оптохином (МУК 4.2.1887–04) [13] На чашку с кровяным агаром сплошным газоном засевают исследуемую культуру пневмококка. На поверхность среды помещают диск, содержащий 5 мкг оптохина. После инкубации при 37 °C в течение 18–24 ч. при 5 % СО2 вокруг диска образуется зона ингибиции роста >14 мм (диск диаметром 6 мм) или >16 мм (диск диаметром 10 мм). Положительный контроль — контрольная культура S. pneumoniae, отрицательный контроль — S. salivarius. После начала активного применения оптохинового теста в течение 30 лет сообщений о пневмококках, устойчивых к оптохину, практически не поступало. Только с 1987 года начали появляться сообщения об отдельных штаммах возбудителя с атипичными свойствами. О выработке устойчивости пневмококков к оптохину сообщали Kontiainen S., 1987; Philips G., 1988; Munoz R., 1990; Borek A., 1998; Nunes S., 2008 [14, 15, 16, 17, 18]. По данным различных авторов, доля пневмококков, имеющих сниженную чувствительность к оптохину, в среднем определяется на уровне 2,5 %, тогда как штаммы с полной устойчивостью к препарату составляют только 0,5 % [19]. Преимущественно такие культуры выделяются от здоровых носителей. В настоящее время определены два фенотипа устойчивости культур к оптохину: первый — штаммы с зоной лизиса менее установленной для дисков данного диаметра; второй — штаммы, абсолютно устойчивые к препарату, без зоны лизиса [17, 19]. При этом выявлена зави- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 симость изменения зоны ингибиции от используемой питательной среды и условий инкубации посева (в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа или в присутствии кислорода воздуха). Наиболее выраженная зона ингибиции (более 14 мм) роста пневмококков вокруг диска с оптохином образуется в атмосфере с кислородом, но при таких условиях чаще образуются сходные зоны лизиса у родственных стрептококков, входящих в группу Mitis. Так, по результатам исследования 87 штаммов пневмококков, выполненных Arbique J. et al. (2004), 97 % культур давали зону ингибиции более 14 мм при инкубации в атмосфере 5–8 % СО2, а в условиях доступа кислорода такая зона отмечалась у всех 100 % штаммов. При исследовании стрептококков группы Viridans в условиях повышенного содержания СО2 из 35 культур только у одного штамма была выявлена зона более 14 мм, тогда как в присутствии атмосферного кислорода — у трех штаммов [20]. Результаты оптохинового теста одних и тех же культур пневмококков могут значительно отличаться при использовании диагностических дисков, выпущенных разными производителями. По данным Kaijalainen T. (2006), при сравнении результатов исследований, проведенных с использованием дисков производства BIODISK, BBL, OXOID, ROSCO, наиболее качественными оказались диски BIODISK. Среди штаммов, определенных как «чувствительные» с использованием BIODISK, оценку «устойчивые» получили 6 % изолятов, протестированных дисками BBL, 14 % — OXOID и 2 % — ROSKO. Напротив, культуры, определенные как «устойчивые» с помощью BIODISK, оценивались как «чувствительные» у 2 % изолятов, тестируемых BBL, и 8 % — ROSCO [21]. Исследования штаммов, устойчивых к оптохину, выполненные Fenoll A. et al. (1990), позволили выявить ген, ответственный за чувствительность микроорганизма к оптохину. Сиквенсный анализ показал, что резистентность кодиe-mail: [email protected] руется F0‑комплексом на Н+-АТФазы [22]. Дальнейшие исследования определили, что фенотип устойчивых штаммов определяется мутациями в гене atpC, который кодирует молекулярную мишень — трансмембранную F 0F 1 АТФ-азу, участвующую в протонной транспортировке дыхательной цепи [19]. Выделяют три механизма приобретения устойчивости к оптохину штаммами пневмококков: • внутривидовая передача устойчивости между штаммами в клиническом материале; • генерирование спонтанных мутаций, обусловленных ростом Streptococcus pneumoniae в средах с ингибирующими концентрациями оптохина, а также в сыворотке крови при применении препаратов хинина для лечения и профилактики малярии; • использование Streptococcus pneumoniae генетического материала от Streptococcus oralis, обладающих устойчивостью к оптохину. Кроме того, по данным Rachel L. (2007), некоторое снижение чувствительности к оптохину выявлено у штаммов пневмококков, хранящихся в условиях глубокой заморозки (при –70 °C в триптиказо-соевом бульоне с добавлением 15 % глицерина) [23]. После проведения последовательных пересевов или выполнения пассажа на животных большинство таких штаммов способны восстановить свои свойства. Выработка устойчивости к оптохину не связана с одновременной устойчивостью к лекарственным препаратам и имеет другой механизм образования, но в то же время может зависеть от принадлежности к определенным серотипам и сиквенс-типам, включая интернациональные клоны Netherlands 3 ST180, Poland 6B ST315, Greece 6B ST273, Spain 9V ST156, Portugal 19F ST177 [17]. Выводы Чувствительность к оптохину остается надежным дифференцирующим тестом пневмококков от других зеленящих стрептококков при строгом соблюдении методики его e-mail: [email protected] постановки. В первую очередь это касается использования для теста регламентированной питательной среды (кровяного агара), так как на других средах возможны ошибки в интерпретации результата, условий инкубации с повышенным содержанием СО2, обязательной постановки положительного и отрицательного контроля с помощью тестовых культур. На сегодняшний день доля штаммов резистентных к оптохину остается небольшой и не является критичной для основной популяции пневмококков. При выявлении штаммов со сниженной чувствительностью к препарату необходима обязательная постановка тестов растворимости в желчи и реакции набухания капсулы. Восстановление чувствительности к оптохину, особенно если это не истинная устойчивость, можно добиться серией последовательных пересевов в питательный бульон и свежий кровяной агар. Штаммы, устойчивые к оптохину, требуют дальнейшего углубленного исследования генетическими методами. Список литературы Morgenroth, J., und Levy, R. Chemotherapie der Pneumokokkeninfection. Berl. klin. Wchnschr., 48 (34): 1560, Aug.21, 1911. 63,512. 1. Weight, A. E., Morgan, W. P., Colebrook, L., and Dodgson, R. W. Observations on the pharmaco-therapy of pneumococcus infections. Lancet, 2 (4659): 1633, Dec. 14, 1912 483, 512. 2. Schiemann, O., und Ishiwara, T. Vergleichende Untersuchungen liber die Wirkung von chemotherapeutischen Praparaten und anderen Antiseptika auf Bakterien. Ztschr. f. Hyg. u. Infektionskr., 77:49, 1914 62,512. 3. Moore, H. F. The action of ethylhydrocuprein (optochin) on type strains of pneumococci in vitro and in vivo, and on some other microorganisms in vitro. J. Exper. Med., 22 (3): 269, Sept. 1915 513. 4. Bieling, R. Methoden zur Differenzierung der Streptokokken und Pneumokokken. Centralbl. f. Bakt., 1 Abt., Orig., 86 (4): 257, June 1921 48. 5. Morgenroth, J., und Kaufmann, M. Zur experimentellen Chemotherapie der Pneumokokkeninfektion. II. Mitteilung. Ztschr. f. Immunitatsforsch. u. exper. Therap., 29 (3/4):217, Mar. 1920. … 512,519. 6. Wright, H. D. The effect of certain factors upon the growth of the pneumococcus. J. Path. & Bact., 32 (2): 203, Apr. 1929 … 38,39. 7. Koch, F. E. Optochinblutagar zur Unterscheidung von Pneumokokken und Streptokokken. Zentralbl. f. Bakt., 1 Abt., Orig., 124 (5/6): 258, May 6, 1932 48. 8. Morch, E. 1943. Virulence of the pneumococcus types for mice, p. 193. In F. Richard (ed.), Serological studies on the pneumococci. Einar Munksgaard, Copenhagen, Denmark. 9. Bowen E. F., Jeffries L. R. Optochin in the identification of Str. pneumoniae. J Clin Path (1955), 8, 58. 10. Lund E. (1959) Diagnosis of pneumococci by the optochin and bile test. Acta Pathol Microbiol Scand 47:308–15. 11.Приказ Минздрава СССР от 22.04.1985 № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клиникодиагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений». 12.МУК 4.2.1887–04. Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов: Методические указания. — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2005. –48 с. 13. Kontiainen, S., and A. Sivonen.1987.Optochin resistance in Streptococcus pneumoniae strains isolated from blood and middle ear fluid. Eur. J. Clin. Micribiol. 6:422–424. 14. Philips, G., R. Barker, and O. Brogan.1988. Optochin-resistant Streptococcus pneumoniae. Lancet ii:281. 15.Munoz, R., A. F. Fenoll, D. Vicioso, and J. Casal. 1990. Optochin-resistant variants of Streptococcus pneumoniae. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 13:63–66. 16. Nunes, S., R. Sa-Leao, and H. de Lencastre. 2008. Optochin Resistance among Streptococcus pneumoniae Streins Colonizing Healthy Children in Portugal. J. Clin. Microbiol. No1, vol.46:321–324. 17. Borek A. P., Dressel D. C., Hussong J., Peterson L. R. Evolving clinical problems with Streptococcus pneumoniae: increasing resistance to antimicrobial agents, and failure of traditional optochin identification in Chicago, Illinois, between 1993 and 1996. Diagn. Microbiol. Infect. Dis; 1997 Dec; 29 (4):209–14. 18. Pikis A., Campos J. M., Rodriguez W. J., and Keith J. M. (2001) Optochin resistance in Streptococcus pneumoniae: mechanism, significance, and clinical implications. J. Infect. Dis. 184:582–90. 19.Arbique, J., C. Poyart, P. Trieu-Cuot, G. Quesne, M. G. S. Carvalho, A. G. Steigerwalt, R. E. Morey, D. Jackson, R. J. Davidson, and R. R. Facklam.2004. Accuracy of Phenotypic and Genotypic Testing for Identification of Streptococcus pneumoniae and Description of Streptococcus pseudopneumoniae sp. nov. J. Clin. Microbiol. N10;42:4686–4696. 20.Kaijalainen T. Identification of Streptococcus pneumoniae. Publication of the National Public Health Institute, A9/2009, 76 p. 21.Fenoll, A., R. Munoz, E. Garcia, and A. G. de la Campa. (1994) Molecular Basis of the optochin-sensitive phenotype of pneumococcus: characterization of the genes encoding the F0 complex of the Streptococcus pneumoniae and Streptococcus oralis H+ -ATPase. Mol. Microbiol.12:4;587–98. 22.Rachel L. Robson, Suzanne Essengue, Natalie A. Reed, Rebecca T. Horvat. Optochin resistance in Streptococcus pneumoniae induced by frozen storage in glycerol. Diagn. Microbiol. infect. Dis (June 2007) Vol.58 (2):185–190. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 43 Автоматизация в клинической микробиологии Л. О. Иноземцева, к. м. н. Е ще несколько лет назад словосочетание «полностью автоматизированная бактериологическая лаборатория» вызывало у специалистов если не улыбку, то явное недоумение. Представить себе, что классические приемы посева и обработки клинических образцов или приготовление мазка и пересев в бульон может выполнять автомат, было сложно, так как за последние 50 лет скольконибудь существенных изменений в бактериологии не наблюдалось. Те преобразования, которые все же происходили, были постепенными и не носили фундаментальный характер. Так, к примеру, с конца 70–80‑х годов прошлого века (и по сей день) довольно широко стали применяться различные автоматизированные системы идентификации микроорганизмов. Конечно, они значительно облегчили труд бактериолога, расширили возможности анализа, ускорили выдачу конечного результата, но кардинально изменить ситуацию все же не смогли. Ручной монотонный труд врача-лаборанта, связанный с посевом и выделением чистой культуры, как и во времена Пастера, остался незаменимым. Также оставалось непонятным, как стандартизировать и унифицировать столь нестандартную функцию: посев материала на питательную среду. Поэтому с сожалением пришлось признать, что сформировать современную технологическую цепочку классического бактериологического исследования, исключающую архаичный «ручной» труд, в обозримом будущем просто невозможно [2]. Однако в воздухе уже витали новые идеи, подрастало поколение специалистов, жаждущих перемен не только в частных, но и в глобальных вопросах лабораторной диагностики. И вскоре на мировой рынок буквально хлынул поток новых высокотехнологичных приборов, позволивших автоматизировать и усовершенствовать гематологические и биохимические исследования. На этом фоне появились сообщения о смене парадигмы и в бактериологии. Первоначальные изменения коснулись бактериологических лабораторий 44 в фармацевтической и пищевой промышленности. Но в скором времени о полной автоматизации заговорили и в медицине. Первые робкие попытки автоматизировать микробиологический посев были предприняты около 20 лет назад [5]. Тогда этот процесс носил однонаправленный ограниченный характер (посев мочи на чашку с агаром). Но спустя несколько лет появились приборы второй генерации, позволяющие уже выбирать чашку с питательной средой, осуществлять посев и маркировку материала. Для бактериологии в целом этот момент можно считать переломным: еще никогда автоматизация преаналитического этапа не была так возможна. Сегодня мировой и отечественный рынок активно завоевывают приборы автоматизированного посева третьего поколения [4]. Несколько компани-производителей предлагают свои версии высокотехнологичных инновационных инструментов данного типа. И если основная цель внедрения этих приборов в повседневную практику у всех одна — полная или частичная замена ручного труда в бактериологии, то подходы и способы реализации этой идеи существенно разнятся. Каждой лаборатории, принявшей решение об автоматизации бактериологических исследований, придется учитывать эти особенности и делать выбор в пользу той или иной системы в соответствии со своими задачами [3]. Прежде всего, необходимо определиться со степенью автоматизации. Так, аппараты, предусматривающие частичную замену ручного труда, не решают основных проблем лаборатории, хотя позволяют унифицировать процесс микробиологического посева. Стоит подчеркнуть, что приборы данной конфигурации работать без оператора просто не могут. Их функциональная эффективность напрямую зависит от присутствия человека, который должен обеспечить прибору беспрерывную подачу образцов и постоянно контролировать процесс посева. При полной автоматизации об- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 работка бактериологических проб происходит с минимальным участием лаборанта: ему необходимо только загрузить / выгрузить контейнеры с образцами и чашки со средами и запустить процедуру посева. Остальное время сотрудник имеет возможность посвятить решению других, более важных задач. Кроме того, аппарат может работать практически в непрерывном режиме: 24 часа в день, семь дней в неделю, что весьма полезно не только для крупных многофункциональных лабораторных центров, но и для небольших или частных лабораторий, где существует необходимость выполнения подобного рода исследований. С точки зрения трудозатрат, используя функциональный потенциал аппарата, можно повысить производительность лаборатории без увеличения нагрузки на персонал [4]. Еще один положительный аспект полной автоматизации — безопасность для оператора и снижение риска перекрестной контаминации образцов. В свете принятой в ноябре 2011 года Национальной концепции профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, создание безопасной среды обитания для пациентов и персонала в организациях, осуществляющих медицинскую деятельность, есть стратегическая задача здравоохранения. Автоматизация бактериологических исследований — один из способов реализации профилактических мероприятии, предусмотренных данным документом. Следующий критерий, имеющий принципиальное значение, — стандартизация микробиологических исследований. Как бы ни старались противники автоматизации убедить общественность в ненужности подобного рода затеи, аргументируя свои соображения приверженностью к классическим ручным методикам посева, но возражать против стандартизации микробиологических исследований, они не могут. Действительно, вряд ли кто будет утверждать, что e-mail: [email protected] так называемый человеческий фактор не оказывает влияния на скорость, эффективность, в конце концов, правильность и точность манипуляции, связанной с выполнением утомительной, подчас скучной, монотонной работы по посеву микробиологических образцов. Прибор же при этом сохраняет беспристрастность, независимо от времени суток, дня недели, количества посевов и их сложности, а также от тех событий, которые могут вызвать эмоциональный дискомфорт у человека. Однако и здесь есть моменты, на которые стоит обратить внимание при выборе системы автоматизированного посева. Эти моменты на мой взгляд являются ключевыми, и поэтому достойны, чтобы о них упомянуть отдельно. Речь пойдет о так называемой концепции Liquid Based Microbiology (LBM — «микробиология на жидкостной основе» или концепция жидких транспортных сред), которая положена в основу стандартизации микробиологических исследований. По сути — это революционное преобразование в микробиологии, несмотря на всю ее кажущуюся простоту и очевидность. Автоматизированные технологии, использующие данный подход, не только высокоэффективны, но и максимально достоверно отражают истинную картину микробной обсемененности исследуемого образца. Как и каким образом это происходит? Известно, что в микробиологии клинический образец часто имеет различную консистенцию, а объем собранного материала не всегда можно измерить. Именно для того, чтобы любой исследуемый объект, будь то тампон с материалом, фекалии или мокрота, можно было представить как некую универсальную субстанцию, содержащую определенное количество инфекционного агента, причем максимально соответствующее его истинному содержанию в исследуемом материале, была разработана концепция жидких транспортных сред. Суть концепции состоит в том, чтобы сделать стандартной не только процедуру посева образцов, но и процесс сбора биологического материала. Для этого было предложено использовать универсальные и специальe-mail: [email protected] ные жидкие транспортные среды, разлитые в определенном объеме (1 мл) в стандартные контейнеры. А чтобы количество собранного материала максимально элюировалось из тампона в транспортную среду, предлагается использовать специально разработанные, так называемые, велюр-тампоны. Благодаря такому подходу любой исследуемый образец приобретает черты универсальности и единообразия, а в перечень процедур так называемой автоматической обработки образца можно включить не только посев материала на питательную среду, но и приготовление мазка для окраски по Граму, а также пересев в бульон с целью накопления культуры. Дальнейшие манипуляции с образцом, связанные с инкубацией посевов, изучением выросших колоний и их идентификацией, сегодня также автоматизированы. Правда, полносборная система, дополненная аэробным и анаэробным инкубаторами, системой оптического цифрового сканирования посевов (т. н. телебактериология), довольно дорога и в России еще не представлена, но имеет большие перспективы. Чтобы сделать процесс микробиологического исследования максимально отвечающим потребностям практического здравоохранения, разработчики предлагают использовать модульную систему автоматизированной баклаборатории. Благодаря такому подходу каждая лаборатория может сама для себя подбирать те модули, которые ей необходимы. С точки зрения ближайших перспектив и тенденций развития, надо также принимать во внимание, что современная бактериологическая диагностика продолжает совершенствоваться, особенно с использованием данных протеомики и геномики. Так, новейшие инновационные технологии идентификации культур микроорганизмов на основе масспектрометрии очень органично вписываются в концепцию полностью автоматизированной бактериологической лаборатории. Совместное использование данных технологий имеет не только функциональную, экономическую, но и стратегическую основу, поскольку позволяет развиваться современным лаборато- риям в направлении многофункциональных лабораторных централизованных комплексов. Централизация исследований в условиях единого информационного пространства — лабораторной информационной системы (LIS) — является одной из бизнес-моделей, предлагаемой сегодня как вариант развития лабораторной службы [1]. Таким образом, имеющие ся на сегодняшний день технологии позволяют с уверенностью говорить о том, что в микробиологической диагностике произошли глобальные изменения, связанные с внедрением в повседневную практику автоматизированных процессов обработки образцов. Их применение в ближайшей перспективе позволит перевести всю систему бактериологической диагностики в России на качественно иной уровень, а также решить не только частные, но и общие долгосрочные задачи всей лабораторной службы, среди которых: • повышение качества лабораторных исследований; • полная замена трудоемких ручных методов на автоматизированные; • в с е с т о р о н н я я и н ф о р м ат и з а ция и интеграция исследований на основе развития компьютерных технологий; • переход медицинских диагностических технологий на объективные количественные методы исследований; • разработка комплекса мер по управлению качеством лабораторных исследований. Список литературы: 1. Берестовская В. С., А. В. Козлов. Централизация исследований как этап развития лабораторной службы.//Медицинский алфавит. Современная лаборатория.-2012.-№ 2.-с. 3–6. 2. Сидоренко С. В. Будущее клинической микробиологии как лабораторной службы.//Антибиотики и химиотерапия.- 1999.№ 10.- с. 3–7. 3. G . G r e u b a n d G . P r o d ’ h o m . A u t o mation in clinical bacteriology: what system to choose?//Сlin.Microbiol.infect.2011;17:655–660. 4. Paul P. Bourbeau/First Evaluation of the WASP, a new automated microbiology plating instrument. J. Clin.Microbiol.April 2009, p.1101–1106. 5. Tilton R. C., Ryan R. W. Evaluation of an automated agar plate streaker. J. Clin.Microbiol.1978;7:298–304. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 45 Антимюллеров гормон —тест фертильности Биологический возраст женщины отражает её способность к деторождению, но не всегда соответствует её реальному возрасту. Биологический возраст можно определить по оценке овариального резерва. Планировать ли беременность сейчас? Есть ли у меня достаточно времени для планирования карьеры и профессионального роста или мне уже следует планировать беременность? Вопрос распространенный в наши дни. Трёхступенчатая модель «образование-работа-семья» приводит фактически к тому, что женщины откладывают материнство на более старший возраст. Средний возраст первородящей в Европе сейчас 26–28 лет в сравнении с 22–24 лет четверть века тому назад, и этот процесс, похоже, необратим. Отложенное материнство связано с меньшей вероятностью наступления беременности для многих пар. К сожалению, число фолликулов в яичниках (ооцитов), также как и их качество, снижается с возрастом. Это связано с рядом таких факторов как генетические, инфекционные, перенесенные хирургические операции, а также курением, условиями окружающей среды, массой тела и др. Таким образом, у многих пар есть только ограниченный период времени для осуществления желания иметь ребёнка. Биологические часы идут, и вероятность наступления беременности быстро снижается у женщины после 30 лет. Сколько времени я могу это откладывать? Снижение овариального резерва с возрастом происходит за счет снижения числа фолликулов. Предполагают, что 40–100 фолликулов исчезают в течение одного менструального цикла. Однако этот процесс очень индивидуален. Часто реальный возраст женщины не соответствует её биологическому возрасту, т. е. её способности забеременеть. Как показано на графике, число фолликулов и, соответственно, женская фертильность, начинают резко уменьшаться после 30 лет. Красные точки выше зеленой линии показывают, что часть обследованных женщин имеет овариальный резерв выше среднего для данного возраста. Их шанс забеременеть остается высоким даже в старшем возрасте. Значение концентрации антимюллерова гормона (АМГ) надежно отражает овариальный резерв, и это знание может быть полезно женщине в планировании беременности. Могу я оценить мою фертильность? Определение АМГ позволяет оценить индивидуальный овариальный резерв фолликулов и биологический возраст. Чем старше женщина, тем меньше у неё фолликулов и меньше концентрация АМГ в крови. Если концентрация АМГ в пределах нормального диапазона, это означает, что женщина фертильна, и есть достаточно хорошая вероятность наступления беременности. Следовательно, анализ АМГ даёт полезную информацию прогноза успешной беременности. Женщины с низким уровнем АМГ имеют сниженный овариальный резерв и маленький шанс наступления беременности. Таким образом, концентрация АМГ — очень важный прогностический маркер фертильности. Основные приложения теста АМГ Оценка овариального резерва яичников в препубертате, в период полового созревания, у женщин фертильного возраста, в перименопазе. Определение АМГ позволяет контролировать репродуктивную функцию в следующих случаях: восстановление активности яичников после болезни (анорексия nervosa, ожирение, химиотерапия, аутотрансплантация ткани яичника, выбор протокола и дозы гонадотропинов в цикле стимуляции гиперовуляции, планирование беременности, прогноз скорого наступления менопаузы, диагностика синдрома поликистозных яичников [предполагается включение уровня АМГ выше 5 нг/мл в диагностические критерии СПКЯ], выявление преждевременного или замедленного полового созревания у обоих полов, дифференциальная диагностика интерсексуальных состояний). 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М. В. Ломоносова, тел.: 8 (495)-6472740, Группа компаний «БиоХимМак», e‑mail: [email protected], www.biochemmack.ru 46 Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected] e-mail: [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 47 Опыт модернизации клинико-диагностической лаборатории ФГБУ «Поликлиника № 1» Управления делами президента Российской Федерации Л. В. Кудрявцева, д. м. н., проф., зав. КДЛ ФГБУ «Поликлиника № 1» Управления делами президента РФ Cтатья впервые была напечатана в журнале «Лабораторная служба» № 1/2012. К линическая лабораторная диагностика — одна из самых быстроразвивающихся отраслей современной медицины. Она располагает огромным количеством лабораторных методов диагностики, в том числе новых высокотехнологичных, для проведения которых могут быть использованы как ручные, полуавтоматические, так и автоматические методики исследований, как качественные, так полуколичественные и количественные, для проведения которых требуются сложная аппаратура и наличие высококвалифицированного медицинского персонала. Все это привело к тому, что в настоящее время отсутствуют лаборатории, которые могут в полном объеме выполнять весь спектр лабораторных исследований. В связи с этим практически все современные лаборатории как государственные, так и коммерческие с целью расширения спектра лабораторных услуг вынуждены заключать договоры между собой. Клинико-диагностическая лаборатория ФГБУ «Поликлиника № 1» Управления делами президента Российской Федерации не исключение (рис. 1, 2). Однако несмотря на то, что выполнение лабораторных исследований в сторонних лабораториях позволяет расширить спектр и увеличить количество исследований, оно имеет и ряд существенных недостатков, с которыми сталкиваются практически все клинико-диагностические лаборатории, а именно: •на преаналитическом этапе за счет увеличения периода от момента взятия биологического материала до непосредственного выполнения лабораторного исследования возможны нарушения правил транспортировки биологического материала; отсутствие возможности в динамике оценить качество проведения пробоподготовки в сторонней лаборатории; 48 •на аналитическом этапе отсутствие информации о методике, которая использовалась при проведении исследования (во время проведения исследования в случае отсутствия реактивов и реагентов лаборатории могут временно заменить методику выполнения исследования, например, ИФА — плашечный формат или анализатор); возможны случаи, когда сторонняя лаборатория, с которой заключен госконтракт, работает как посредник, а именно, выполняет исследования в других, сторонних лабораториях; отсутствие возможности отследить внутрилабораторный контроль качества и уровень подготовки специалистов сторонней лаборатории в динамике; •на постаналитическом этапе увеличение сроков выдачи результатов лабораторных исследований; невозможность сопоставления результатов исследований, выполненных в нескольких лабораториях (использование различных методик и, как следствие, разные единицы измерения). В 2010 г. и первой половине 2011 г. клинико-диагностическая лаборатория нашей поликлиники в рамках заключенных госконтрактов работала с шестью сторонними лабораториями, три из них были коммерческими и три находились в составе медицинских учреждений Главного медицинского управления Управления делами президента Российской Федерации. При работе с таким числом сторонних лабораторий клиникодиагностическая лаборатория столкнулась с достаточно большим количеством проблем на этапе сбора, транспортировки биологического материала, а также при получении и выдаче результатов исследований. Не секрет, что требования к составу и свойствам расходного материала, Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 Рис. 1. Поликлиника № 1 Управления делами президента Российской Федерации. а также условия и время транспортировки биологического материала напрямую зависят от технологии, используемой при выполнении того или иного лабораторного исследования. В связи с этим лабораторииисполнители в рамках госконтракта в большинстве случаев предоставляют свой расходный материал для сбора и транспортировки биологического материала (пробирки, контейнеры и т. д.). Все это, особенно на начальном этапе работы со сторонними лабораториями, привело к определенной путанице, и биологический материал зачастую забирался не в ту тару для транспортировки и отправляется не в ту лабораторию. Как правило, это влекло за собой повторный забор биологического материала и значительно удлиняло сроки получения результатов исследований. С целью повышения качества лабораторных исследований в 2011 г. перед клинико-диагностической лабораторией поликлиники была поставлена задача ее модернизации. Для этого, начиная с марта 2011 г., в лаборатории был проведен ряд мероприятий, которые можно разделить на две большие группы: 1)мероприятия административного характера, не требующие финансовых вложений; 2)мероприятия, направленные на модернизацию клинико-диагностической лаборатории, требующие финансовых вложений. e-mail: [email protected] В части административных мероприятий было выполнено следующее. 1. Совершенствование информационных технологий. Доработано программное обеспечение клинико-диагностической лаборатории (лабораторная информационная система «АЛТЭЙ»; рис. 3): •вход в программу «АЛТЭЙ» сотрудников лаборатории под индивидуальными кодами повысил ответственность работников лаборатории за достоверность информации, вносимой в программу; •ограничен несанкционированный ввод заказов лабораторных услуг (возможность ввода заказов на лабораторные исследования только прикрепленному контингенту поликлиники); •введение модуля «Патология» позволило проводить мониторинг лабораторных исследований у пациентов поликлиники в динамике (за последние три года) и в большинстве случаев исключить проблемы, связанные с гипо- и гипердиагностикой на аналитическом этапе, в режиме реального времени организовать передачу истинно патологических результатов врачам клинических подразделений поликлиники, а также вести статистический учет патологических отклонений; •подключение анализаторов к программе «АЛТЭЙ» и автоматическая выдача результатов лабораторных исследований позволили максимально исключить ошибки и сократить сроки выдачи результатов лабораторных исследований; •открытие диалогового окна со сторонней лабораторией также позволило максимально сократить сроки выдачи результатов лабораторных исследований (все результаты лабораторных исследований, выполненных непосредственно в клинико-диагностической лаборатории и в сторонней лаборатории, врачи поликлиники видят в режиме реального времени), а также организовать выдачу результатов лабораторных исследований, выполненных в сторонней лаборатории только на бланках поликлиники; •открытие «личного кабинета» позволило прикрепленному контингенту поликлиники получать e-mail: [email protected] результаты лабораторных исследований в режиме реального времени. 2. Организация взаимодействия клинико-диагностической лаборатории с клиническими подразделениями поликлиники. С целью повышения качества оказания медицинской помощи прикрепленному контингенту поликлиники организована передача патологических результатов лабораторных исследований в клинические подразделения поликлиники в режиме реального времени. 3. Оптимизация работы клиникодиагностической лаборатории. 1. целью оптимизации работы лаборатории на преаналитическом этапе и повышения качества выполнения лабораторных исследований разработаны и утверждены приказом главного врача поликлиники «Правила взятия и доставки биологического материала в клинико-диагностическую лабораторию поликлиники»; 2. введение электронной очереди в клинико-диагностической лаборатории, упорядочение процесса взятия крови в процедурных кабинетах (разведение потоков пациентов на отдельные группы: работающий бюджетный контингент, неработающий бюджетный контингент; коммерческий прикрепленный контингент, исследования по cito) позволило отменить запись пациентов на лабораторные исследования и сократить время ожидания пациента от момента его регистрации до момента взятия крови в среднем не более 30 минут. 4. Проведена аккредитация лаборатории на право проведения независимых технических испытаний реагентов и реактивов для клинической лабораторной диагностики, и создан Испытательный центр продукции. В части модернизации клиникодиагностической лаборатории выполнено следующее. 1. Расширен спектр лабораторных исследований, выполняемых непосредственно в клинико-диагностической лаборатории: •проведена дополнительная закупка новых реагентов, и расширен спектр лабораторных исследований; Рис. 2. Клинико-диагностическая лаборатория. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 49 Рис. 3. Лабораторная информационная система «АЛТЭЙ». Рис. 5. Architekt (Abbott, США). Рис. 4. Immulite 2000 (Simens, Германия). •приобретены тест-системы для выделения, идентификации грибов и определения их чувствительности к противогрибковым антибиотикам; •приобретены автоматические анализаторы закрытого типа Immulite 2000 (Siemens, Германия; рис. 4) и Architekt (Abbott, США; рис. 5). Приобретение высокотехнологических автоматических анализаторов позволило не только повысить внутрилабораторный контроль качества выполнения лабораторных исследований на гормоны, онкомаркеры и ряд инфекций, сократить время выполнения исследований, но и снизить себестоимость тестов. 2. Внедрение новых технологий: •приобретена цитоцентрифуга (Cellspin II; рис. 5), и внедрен новый метод ранней диагностики рака шейки матки — жидкостная цитология. 50 3. Дооснащение клинико-диагностической лаборатории: •приобретены более объемный термостат и ламинарный шкаф для микологического участка. Открытие микологического участка и выполнение микроскопического исследования и посева на грибы, выдача результатов микроскопического исследования в режиме реального времени в течение трех часов с момента поступления биологического материала на исследование позволило клинико-диагностической лаборатории заключить договоры на проведение микологических исследований со сторонними коммерческими лабораториями. 4. Совершенствование информационных технологий: •внедрено штрих-кодирование (рис. 6); •приобретена программа внутрилабораторного контроля качества. 5. Приобретена и запущена в эксплуатацию холодовая камера. Дооснащение клинико-диагностической лаборатории новым лабораторным оборудованием и выполнение большей части лабораторных исследований непосредственно в лаборатории значительно увеличило объемы закупок реагентов и реактивов. С целью удобства хранения реагентов и реактивов (как правило, трехмесячный запас), контроля за соблюдением температурного режима и условий хранения, сокращения единиц холодильного оборудования, установленного непосредственно в клинико-диагностической лаборатории, была приобретена холодовая камера. 6. В помещении холодовой камеры организована раздевалка для фельдшеров‑лаборантов. Проведение вышеизложенных мероприятий в клинико-диагностической лаборатории позволило не только повысить качество выполнения лабораторных исследований, значительно сократить время выполнения и выдачи результатов — результаты общеклинических, биохимических исследований, исследования гемостаза, онкомаркеров, гормонов, аллергенов и инфекций (ВИЧ, сифилис, гепатит, краснуха, токсоплазмоз и т. д.) вы- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 Рис. 6. Жидкостная центрифуга (Cellspin II). даются в день взятия биологического материала, — но и значительно снизить их стоимость. С целью повышения качества лабораторных исследований, сокращения сроков выполнения и снижения их стоимости в рамках госконтракта подготовлен и проведен конкурс на оказание услуг по осуществлению лабораторных исследований в 2012 г. В контракте предусмотрено наличие одной сторонней лаборатории. Это позволило не только снизить стоимость контракта за счет большого числа исследований, повысить контроль за качеством выполняемых сторонней лабораторией лабораторных исследований, но и максимально сократить сроки доставки и получения результатов. Кроме того, модернизация клинико-диагностической лаборатории позволила за счет расширения спектра и количества лабораторных исследований сохранить и увеличить кадровый состав работников лаборатории, а это целая школа клинической лабораторной диагностики со своими традициями — высококвалифицированные кадры врачей и фельдшеров‑лаборантов. В связи с доукомплектацией клинико-диагностической лаборатории высококвалифицированными кадрами врачей и фельдшеров‑лаборантов дорогостоящие и весьма востребованные микологические и цитологические исследования в настоящее время выполняются непосредственно в лаборатории в полном объеме, что позволило поликлинике отказаться от дорогостоящих контрактов на выполнение данных лабораторных услуг сторонними лабораториями. В связи с получением аккредитации на право проведения независимых технических испытаний реагентов и реактивов для клинической e-mail: [email protected] лабораторной диагностики на базе клинико-диагностической лаборатории приказом главного врача организован Испытательный центр продукции. В декабре 2011 г. проведены первые технические испытания. Несмотря на то, что мероприятия по модернизации клинико-диагностической лаборатории были начаты в марте 2011 г., результат их реализации можно оценить уже сегодня. Так, если в 2010 г. в клинико-диагностической лаборатории выполнялось 84 % от всего объема лабораторных исследований, то по итогам 2011 г. их количество увеличилось до 94 %. Выполнение лабораторных исследований прикрепленному бюджетному контингенту непосредственно в клинико-диагностической лаборатории позволило не только сэкономить средства федерального бюджета, выделяемые на диагностику и лечение этой группы пациентов, но и сократить сроки выполнения лабораторных исследований, необходимых для госпитализации пациентов, а следовательно, и сроки ожидания пациентом плановой госпитализации. Проведение единого конкурса на выполнение лабораторных услуг, заключение госконтракта с одной крупной сторонней лабораторией дало возможность практически полностью устранить проблемы на преаналитическом, аналитическом и постаналитическом этапах выполнения лабораторных исследований, сократить время выдачи результатов, значительно снизить их стоимость. Наиболее показательно работу модуля «Патология» можно оценить при анализе частоты выявления патологических результатов лабораторных исследований при исследовании онкомаркеров. При анализе частоты патологических результатов при исследовании онкомаркеров обращает внимание, что в связи с увеличением количества исследований онкомаркеров произошло и увеличение частоты выявления патологических результатов. Так, при исследовании СА‑15,3 в 2010 г. выявлено 21,9 % патологических результатов, а в 2011 г. — 23,9 %; РЭА — 9,5 % в 2010 г. и 12,5 % в 2011 г.; ПСА общий — 15,9 % в 2010 г., 20,2 % — в 2011 г., ПСА свободный 30,7 % — в 2010 г., 35 % — в 2011 г. e-mail: [email protected] Рис. 7. Штрих-кодирование. Рис. 8. Трудовой коллектив клинико-диагностической лаборатории. В результате модернизации лаборатории улучшились показатели и ее финансово‑хозяйственной деятельности в сторону роста доходов и их преобладанием над темпами роста расходов. Несмотря на то что в связи с увеличением количества лабораторных исследований, выполняемых в клинико-диагностической лаборатории, увеличились расходы поликлиники на расходные материалы реагенты и реактивы, тем не менее увеличение количества лабораторных исследований, выполняемых в лаборатории, привело к значительному снижению средств, выделяемых поликлиникой на оплату лабораторных исследований в сторонних лабораториях. Кроме того, по сравнению с 2010 г. в клинико-диагностической лаборатории была снижена средняя цена лабораторной услуги. В целом в результате модернизации клинико-диагностической лаборатории, которая началась в марте 2011 г., общий доход лаборатории по сравнению с таковым в 2010 г. увеличился в три раза. В заключение следует отметить, что клинико-диагностическая лаборатория — одно из самых крупных подразделений ФГБУ «Поликлиника № 1» УД президента РФ. Кадровый и научный потенциал лаборатории, который представлен ведущими специалистами в области цитологических, микологических, иммунологических и молекулярно-биологических исследований (рис. 8), простые, но в то же время эффективные решения в сфере лабораторной диагностики, включившие современные методы анализа, оснащение клинико-диагностической лаборатории высокотехнологичным парком диагностического оборудования, многоуровневый контроль качества позволили нам не только в полном объеме обеспечить потребность пациентов поликлиники в лабораторных исследованиях на самом высоком современном уровне, но за счет высокой скорости и точности выполнения лабораторных исследований составить значительную конкуренцию крупным коммерческим лабораториям на рынке лабораторных услуг. Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 51 52 Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected] e-mail: [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 53 Современные методы организации процесса мониторинга параметров микроклимата в лабораториях В последнее время на деятельность предприятий разных отраслей все большее влияние оказывает необходимость следовать международным стандартам, таким как GMP, ISO, HACCP и др. Принципы, заложенные в этих стандартах, предъявляют особые требования к процедуре контроля производственных процессов, что, безусловно, повышает необходимость документирования разного рода параметров и подтверждения их соответствия допустимым значениям. В соответствии с этим, зачастую стал необходим пересмотр традиционных методов измерения, документирования и дальнейшей работы с такого рода данными в сторону автоматизации процесса. Не обошла стороной эта тенденция и лаборатории. Она стала особенно актуальной в свете прохождения процедуры международной аккредитации. В рамках деятельности лаборатории (будь то лаборатория контроля качества фармацевтического предприятия или медицинская аналитическая лаборатория) одними из важнейших параметров, подлежащих контролю и документированию, являются параметры условий хранения (например, реактивов, различных субстанций, образцов) и параметры микроклимата окружающей среды, при которых производятся исследования. Очевидно, что с возросшими требованиями в части проведения измерений, ведения журналов измеренных значений и предоставления разного рода отчетов контролирующим и лицензирующим органам, также возросла нагрузка на персонал. В связи с этим, традиционный метод мониторинга, а именно снятие показаний приборов и запись их в журнал измерений «вручную», уже не является эффективным. К тому же при таком подходе нельзя исключить влияние «человеческого фактора» на процедуру измерения и документирования, 54 что в отдельных случаях может поставить под сомнение результаты всей процедуры мониторинга, а, возможно, и работы лаборатории в целом. Для приведения методов и процедур мониторинга параметров микроклимата в соответствие с новыми требованиями, а также для нивелирования негативных факторов, свойственных традиционным методам, отдельные процедуры или весь процесс целиком автоматизируются. Наиболее популярными решениями в этой области на данный момент являются системы с использованием логгеров данных в качестве устройств автоматической регистрации или решения с более высокой степенью автоматизации — полностью автоматизированные системы сбора, анализа и документирования измеренных значений. Оба этих решения на российском рынке представляет ООО «ТэстоРус», официальное представительство немецкого концерна Testo AG. Семейство логгеров Testo представляет собой электронные измерительные приборы с функцией записи измеренных значений через определенный (как правило, задаваемый пользователем) временной интервал. Схема применения логгеров для организации мониторинга в помещениях лаборатории и оборудовании (холодильники, морозильники, термостаты и т. д.) выглядит в общем случае следующим образом: • приборы размещаются непосредственно внутри оборудования или монтируются на внешних стенках оборудования, а внутрь помещается выносной сенсор (этот вариант предпочтительней, так как есть возможность визуального контроля параметров на дисплее). Для мониторинга параметров микроклимата в помещении логгеры вешаются на стену помещения вдали от кондиционеров, решеток приточной вентиляции и дверей. В этом поло- Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 жении приборы автоматически с заданным пользователем промежутком времени записывают во встроенную память измеренные значения параметров микроклимата; • с определенным интерва лом времени сотрудникам необходимо изъять логгер с места замера и считать с помощью специального программного обеспечения данные. Измеренные значения при этом сохраняются в файле с защищенным от изменения форматом данных. Каждому логгеру будет соответствовать свой файл; • по окончании процедуры считывания сотрудник возвращает прибор на место замера; • пользователь по мере необходимости с помощью того же программного обеспечения производит анализ данных и может сформировать отчет (в формате pdf) и далее распечатать его или выслать по электронной почте. Такая схема организации мониторинга имеет следующие преимущества: • точность. Электронные приборы точнее аналоговых психрометров и термометров; • скорость. Нет необходимости тратить время на обход всех точек замера и записи данных в журнал; • достоверность. Повышается достоверность данных, так как «человеческий фактор» из процесса измерения и документирования исключен; • цена. Данный способ организации мониторинга достаточно дешев. Для осуществления мониторинга в рамках этой концепции ООО «ТэстоРус» предлагает пользователям линейку логгеров Testo 174 и Testo 175. Модель одноканального логгера Testo 174T предназначена для регистрации значений температуры e-mail: [email protected] в диапазонах от –30 до +70 °C. Данный прибор обладает следующими характеристиками: • встроенный сенсор температуры NTC с погрешностью +/– 0,5 °C во всем диапазоне; • память на 16 000 значений; • ЖК-дисплей для индикации последнего измеренного значения, максимума и минимума, а так же выхода параметров за верхний или нижний предел, заданный пользователем; • высокий класс защиты IP65. Следующий прибор модельного ряда логгеров Testo 174 — двухканальный логгер Testo 174H. Данный логгер помимо температуры в диапазоне от –20 до +70 °C также регистрирует значения относительной влажности в диапазоне от 0 до 100 % ОВ (без образования конденсата). Данный прибор обладает следующими характеристиками: • встроенный сенсор температуры NTC с погрешностью +/– 0,5 °C во всем диапазоне; • всторенный емкостной сенсор влажности testo с погрешностью 3 % ОВ во всем диапазоне; • п а м я т ь н а 1 6 0 0 0 з н ач е н и й (по 8 000 значений на каждый канал); • ЖК-дисплей для индикации для каждого канала последнего измеренного значения, максимума и минимума, а также выхода параметров за верхний или нижний предел, заданный пользователем. В качестве элементов питания этих логгеров служат стандартные батареи CR 2032 («таблетки») со сроком службы до 500 дней (при цикле измерений 15 мин.). Также в комплект поставки входит настенный кронштейн. Следует обратить особое внимание на то, что логгеры этого модельного ряда не оснащены встроенным интерфейсом связи с компьютером. Для этой цели используется внешний интерфейс, с помощью которого пользователь поочередно может извлечь данные со всей группы логгеров. Данный интерфейс не входит в комплект поставки и заказывается отдельно. Данные логгеры являются бюджетным решением проблемы мониторинга, однако в связи с тем, что e-mail: [email protected] Testo 175H1 Testo 175T2 логгеры помещаются в оборудование целиком, у пользователей нет возможности визуального контроля параметров на дисплее без извлечения прибора с места замера. Следующая линейка логгеров Testo представлена более функциональными приборами. Прежде всего это логгеры моделей 175 Т1, 175 Т2 и 175 Н1. Логгер 175 Т1 является аналогом логгера 174 Т. Он обладает большей по сравнению с ним памятью (до 1 млн значений), большим дисплеем и ресурсом батарей до трех лет (в качестве элементов питания используются «пальчиковые» батарейки ААА). Также этот прибор, как и все приборы линейки Testo 175, оснащен встроенным USB-интерфейсом для связи с ПК и слотом для SD-карты, которую можно использовать в качестве носителя информации, чтобы не снимать логгеры с мест замера. Основные технические характеристики прибора следующие: • встроенный сенсор температуры NTC с погрешностью +/– 0,5 °C во всем диапазоне (–35…+55 °C); • память на 1 млн значений; • ЖК-дисплей для индикации для каждого канала последнего измеренного значения, максимума и минимума, а также выхода параметров за верхний или нижний предел, заданный пользователем; • светодиодные индикаторы на фронтальной панели для индикации статуса прибора и выхода значений за разрешенные границы. Следующим в линейке логгеров Testo 175 является двухканальный логгер Testo 175 T2. Его технические характеристики аналогичны Testo 175 T1, но в дополнение этот прибор имеет разъем для подключения внешних зондов NTC с диапазоном измерений от –50 до 150 °C. Это делает его идеальным для мониторинга температуры воздуха в помещении (при помощи встроенного датчика) одновременно с мониторингом температуры в холодильниках, морозильниках (до –50 °C), термостатах и прочем оборудовании при помощи внешнего датчика. При этом сохраняется возможность визуального контроля температуры в оборудовании посредством ЖК-дисплея, так как сам прибор монтируется снаружи оборудования, а внутрь помещается лишь выносной зонд. Также с помощью данного прибора можно проводить мониторинг температуры в различных процессах (например, с помощью внешнего погружного зонда можно мониторить процесс нагрева жидкости). Еще одним прибором в линейке логгеров Testo 175 является двухканальный логгер температуры и влажности Testo 175 Н1. По сути он также является более функциональным аналогом логгера «младшего» класса Testo 174H. Обладая, как и все логгеры линейки Testo 175, памятью в 1 млн значений, встроенным USBинтерфейсом и слотом для SD карты, данный логгер имеет более высокую Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 55 точность по влажности (погрешность 2 % ОВ) по сравнению с Testo 174H, а также меньшее время реакции сенсора за счет использования интегрированного внешнего комбинированного сенсора температуры/влажности. Ко всему прочему данный логгер способен не только измерять относительную влажность, но и переводить ее в такие параметры как точка росы и абсолютная влажность. Помимо этих приборов, в линейке логгеров Testo присутствуют также высокоточные логгеры с зондами Pt 100 с погрешностью от +/– 0,15 °C, логгеры для регистрации параметров в широком диапазоне температур (от –200 до +1 000 °C), а также приборы, регистрирующие не только температуру и влажность, но и абсолютное давление. Для работы со всеми логгерами Testo ООО «ТэстоРус» предлагает бесплатное ПО ComSoftBasic 5, которое можно скачать с сайта компании www.testo.ru. Данное ПО предназначено для конфигурирования приборов и снятия с них показаний с последующим анализом, обработкой и формированием отчетов. Следует обратить внимание, что схема организации мониторинга параметров микроклимата с использованием логгеров данных имеет ряд особенностей: • данные, извлеченные из логгеров, носят лишь информационный характер в том смысле, что логгер только регистрирует параметры и не высылает сигнал тревоги в случае выхода параметра за разрешенные пределы. Таким образом, если какой-либо параметр вышел за безопасные границы, пользователь увидит это только при снятии показаний и ему лишь останется проанализировать степень воздействия негативного фактора на продукт (вплоть до признания продукта негодным для дальнейшего использования) или результат работы; • большая степень вовлеченности персонала в процесс снятия информации и ее обработки; • в связи с тем, что каждому сеансу снятия показаний с каждого логгера соответствует отдельный файл, со временем становится сложно организовать быстрый доступ к архиву данных, а также создать кон56 солидированный отчет по нескольким логгерам сразу (это возможно только путем выгрузки данных в Excel, что приводит к потере достоверности данных, так как в этом формате возможны изменения данных пользователем). Этих особенностей лишена автоматизированная система мониторинга параметров микроклимата testoSaveris. Схема организации мониторинга с помощью этой системы выглядит следующим образом: • датчики системы размещаются в местах замера аналогично логгерам с той лишь разницей, что датчики имеют возможность передачи измеренных значений на управляющий модуль (Базу), где происходит их анализ в соответствии с параметрами, заданными пользователем (верхние и нижние граничные значения задаются для каждого датчика). В случае, если измеряемый параметр приблизился или вышел за граничное значение, система инициирует сигнальное оповещение об этом и отсылает его по электронной почте или опционально по СМС ответственному сотруднику (или сотрудникам). Соответственно персонал может оперативно вмешаться в процесс и не допустить долговременного воздействия негативных факторов; • данные, переданные на Базу, сохраняются в единой базе данных, организованной с помощью программного обеспечения. Также с помощью программного обеспечения осуществляется визуализация значений на экране ПК в виде графиков и таблиц. Причем, в отличие от логгеров, пользователь может по своему усмотрению агрегировать данные с датчиков и, соответственно, создавать удобное ему представление данных. Также средствами программного обеспечения можно создавать консолидированные отчеты по нескольким датчикам или группам датчиков; • функция работы с архивом данных позволяет быстро найти и отфильтровать данные за любой промежуток времени по любой группе датчиков; • функция автоматического создания отчетов позволяет полностью исключить вовлеченность Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 персонала в процесс мониторинга и, соответственно, высвободить человеко-часы; • также система проводит самодиагностику и оповещает в случае каких-либо сбоев в ее работе. В качестве измерительных модулей могут применяться как модули со встроенными датчиками температуры или температуры/влажности, так и с внешними подключаемыми зондами. Также, в зависимости от топологии системы, пользователь может применять как датчики, передающие измеренные значения на Базу по радиоканалу, так и Ethernet-датчики, использующие для этой цели локальную вычислительную сеть. Технические характеристики датчиков системы Saveris во многом совпадают с характеристиками логгеров данных с той лишь разницей, что датчики обладают модулем передачи измеренных значений на Базу системы без вмешательства оператора, а встроенная память датчиков (6 500 значений) служит промежуточным хранилищем информации и необходима для того, чтобы в случае потери связи с Базой измерение и документирование не прерывалось до момента восстановления связи. Важной особенностью предлагаемых ООО «ТэстоРус» решений является то, что логгеры Testo и система testoSaveris внесены в Госреестр средств измерений и разработаны в соответствии с HACCP и GMP. В заключение хотелось бы отметить, что, прежде чем выбирать ту или иную схему организации процесса мониторинга, необходимо прежде всего оценить риски, возникающие в рамках ежедневого рабочего процесса лаборатории, и, уже исходя из этого, выбирать степень автоматизации. Однако не вызывает сомнения тот факт, что внедрение подобных автоматизированных методов мониторинга позволит в дальнейшем не только формально соответствовать международным требованиям, но и оптимизировать весь процесс в целом за счет снижения рисков утраты образцов, реактивов или иных термолабильных продуктов. Это, безусловно, повысит качество работы лаборатории. e-mail: [email protected] e-mail: [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 57 58 Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected] e-mail: [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 59 60 Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected] e-mail: [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 61 Подписка БЛАНК-ЗАКАЗ на подписку на журнал на 2012 год Название организации (или Ф.И.О.) ____________________________________________________________________________________ Адрес (с почтовым индексом) ______________________________________________________________________________________________________ Телефон:________________E-mail: ____________________Контактное лицо:_______________________________________________________________ Номера журнала:(не менее 2) ______________________________________________________________________________________________________ □ «Медицинский алфавит. Современная лаборатория» — 4 выпуска в год (800 руб. в год) □ «Медицинский алфавит. Эпидемиология и гигиена» — 4 выпуска в год (800 руб. в год) □ «Медицинский алфавит. Больница» — 4 выпуска в год (800 руб. в год) □ «Медицинский алфавит. Стоматология» — 4 выпуска в год (1200 руб. в год) □ «Медицинский алфавит. Неотложная медицина» — 4 выпуска в год (800 руб. в год) □ «Медицинский алфавит. Диагностическая радиология» — 4 выпуска в год (800 руб. в год) Наш индекс в каталоге «РОСПЕЧАТЬ» 36228 НДС — 0% ООО «Альфмед» (наименование получателя платежа) 7716213348 (ИНН получателя платежа) Рс № 40702810738090108773 (номер счета получателя платежа) в Московский банк Сбербанка России (наименование банка и банковские реквизиты) ОАО «СБЕРБАНК РОССИИ» г. МОСКВА Извещение К/с 30101810400000000225 БИК 044525225 Годовая подписка на журнал «Медицинский алфавит. ...................................» на 2012 год. Адрес доставки (наименование платежа) Дата ______________ Сумма платежа ______________________ (подпись) Адрес доставки: ООО «Альфмед» Кассир Квитанция (наименование получателя платежа) 7716213348 (ИНН получателя платежа) Рс № 40702810738090108773 (номер счета получателя платежа) в Московский банк Сбербанка России (наименование банка и банковские реквизиты) ОАО «СБЕРБАНК РОССИИ» г. МОСКВА К/с 30101810400000000225 БИК 044525225 Годовая подписка на журнал «Медицинский алфавит. ...................................» на 2012 год. Адрес доставки (наименование платежа) Дата ______________ Сумма платежа ______________________ (подпись) Адрес доставки: Кассир Как подписаться 1. Заполнить прилагаемый бланк-заказ и квитанцию об оплате. 2. Оплатить квитанцию в банке. 3. Отправить бланк-заказ и квитанцию (или их копии) по почте по адресу: 129344, Москва, ул. Верхоянская, д.18 к. 2. или по факсу: (495) 616-48-00, 221-76-48, или по E-mail: 62 [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected] e-mail: [email protected] Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 63 64 Медицинский алфавит. Современная лаборатория 3 / 2012 e-mail: [email protected]
