ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ НЕКОТОРЫХ БЕЛКОВ

Реклама
2014
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 56, ¹ 11
ÈÌÌÓÍÎÕÈÌÈ×ÅÑÊÀß ËÎÊÀËÈÇÀÖÈß
ÍÅÊÎÒÎÐÛÕ ÁÅËÊΠßÄÅÐÍÎÃÎ ÌÀÒÐÈÊÑÀ
 ÑÎÑÒÀÂÅ ÎÊÎËÎßÄÐÛØÊÎÂÎÃÎ ÕÐÎÌÀÒÈÍÀ
© Ì. È. Ìóðàøåâà,1 Þ. Ñ. ×åíöîâ
Áèîëîãè÷åñêèé ôàêóëüòåò Ìîñêîâñêîãî ãîñóäàðñòâåííîãî óíèâåðñèòåòà èì. Ì. Â. Ëîìîíîñîâà;
1 ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected], [email protected]
Ì. È. Ìóðàøåâà, Þ. Ñ. ×åíöîâ
 ÿäðàõ èíòåðôàçíûõ êëåòîê êóëüòóðû ïî÷êè ýìáðèîíà ñâèíüè (ÑÏÝÂ) èíòåíñèâíàÿ ôëóîðåñöåíöèÿ ôëóîðîõðîìà DAPI íàáëþäàåòñÿ íà ïåðèôåðèè ÿäðûøåê â ðàéîíàõ îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà â
âèäå ÿðêî ôëóîðåñöèðóþùåãî îáîäêà. Àíòèòåëà ê áåëêàì ñ ìîë. ìàññàìè 27, 38, 40, 50 è 65 êÄà, ïîëó÷åííûå èç ñûâîðîòîê áîëüíûõ àóòîèììóííûìè çàáîëåâàíèÿìè, â èíòåðôàçíûõ êëåòêàõ îêðàøèâàþò òîëüêî ÿäðà â âèäå íåáîëüøèõ ñêîïëåíèé èëè ãðàíóë. Îíè íå îêðàøèâàþò ñàìè ÿäðûøêè, íî âûÿâëÿþòñÿ
íà èõ ïåðèôåðèè â âèäå ÿðêî ôëóîðåñöèðóþùåãî êîëüöà â çîíå îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà. Àíòèòåëà
ê ÿäðûøêîâûì áåëêàì ôèáðèëëàðèíó è Â23 ñïåöèôè÷åñêè îêðàøèâàþò òîëüêî ÿäðûøêè.  ÿäðàõ ïîñëå
óäàëåíèÿ ãèñòîíîâ è ÄÍÊ (ÿäåðíûé áåëêîâûé ìàòðèêñ, ßÁÌ) áåëîê ôèáðèëëàðèí ðàâíîìåðíî ðàñïðåäåëåí ïî îáúåìó îñòàòî÷íûõ ÿäðûøåê, à áåëîê Â23 îáíàðóæåí ëèøü íà èõ ïåðèôåðèè, ãäå ëîêàëèçóåòñÿ
îêîëîÿäðûøêîâûé õðîìàòèí. Àíòèòåëà ê áåëêàì ñ ìîëåêóëÿðíûìè ìàññàìè 40, 50 è 65 êÄà ñâÿçûâàþòñÿ ñ ïåðèôåðèåé îñòàòî÷íûõ ÿäðûøåê è â âèäå íåáîëüøèõ ñêîïëåíèé ðàñïîëàãàþòñÿ â êàðèîïëàçìå êëåòîê. Àíòèòåëà ê áåëêàì ñ ìîë. ìàññàìè 27 è 38 êÄà ñâÿçûâàþòñÿ òîëüêî ñ ïåðèôåðèåé îñòàòî÷íûõ ÿäðûøåê. Óñòàíîâëåíî, ÷òî áåëêè ÿäåðíîãî ìàòðèêñà ñ ìîë. ìàññàìè 27, 38, 40, 50 è 65 êÄà, à òàêæå áåëîê
Â23 âõîäÿò â ñîñòàâ îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà, êîòîðûé ìîæåò ÿâëÿòüñÿ îñîáûì õðîìîñîìíûì äîìåíîì, ñâÿçàííûì ñ ôóíêöèîíèðîâàíèåì ÿäðûøêà.
Èììóíîõèìè÷åñêàÿ ëîêàëèçàöèÿ íåêîòîðûõ áåëêîâ ÿäåðíîãî ìàòðèêñà
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: èíòåðôàçà, ÿäðî, ÿäðûøêî, õðîìàòèí, ÿäåðíûé áåëêîâûé ìàòðèêñ, îñòàòî÷íîå
ÿäðûøêî, èììóíîõèìèÿ.
Ï ð è í ÿ ò û å ñ î ê ð à ù å í è ÿ: ÀÑÌ — àòîìíî-ñèëîâàÿ ìèêðîñêîïèÿ, ÑÏÝ — êóëüòóðà ïî÷êè ýìáðèîíà ñâèíüè, ÒÝÀ — òðèýòàíîëàìèí, ßÁÌ — ÿäåðíûé áåëêîâûé ìàòðèêñ, PMSF — ôåíèëìåòàíñóëüôîíèëôòîðèä.
 ïðîñòðàíñòâå èíòåðôàçíîãî ÿäðà õðîìîñîìû ðàñïîëàãàþòñÿ ñòðîãî óïîðÿäî÷åííî, ÷òî íåîáõîäèìî äëÿ ðåãóëÿöèè ïðîöåññîâ ðåïëèêàöèè è òðàíñêðèïöèè õðîìàòèíà.
Äëÿ ýòèõ ïðîöåññîâ òðåáóåòñÿ êàðêàñíàÿ ñèñòåìà, êîòîðàÿ
áóäåò ñëóæèòü äëÿ îáúåäèíåíèÿ âñåõ ÿäåðíûõ êîìïîíåíòîâ: õðîìàòèíà, ÿäðûøêà è ÿäåðíîé îáîëî÷êè.
Òàêîé ñòðóêòóðîé ÿâëÿåòñÿ ÿäåðíûé áåëêîâûé ìàòðèêñ (ßÁÌ) — ãåòåðîãåííûé êîìïîíåíò, êîòîðûé âûÿâëÿåòñÿ ïîñëå ýêñòðàêöèè èç ÿäðà ÄÍÊ, ÐÍÊ è âñåõ ãèñòîíîâ.
Âïåðâûå êîìïîíåíòû ÿäåðíîãî ìàòðèêñà áûëè âûäåëåíû â 60—70-õ ãîäàõ ÕÕ â. Òîãäà è áûë ïðåäëîæåí
òåðìèí «ÿäåðíûé ìàòðèêñ» äëÿ îáîçíà÷åíèÿ îñòàòî÷íûõ ñòðóêòóð ÿäðà (Zbarsky, Georgiev, 1959; Georgiev,
Chentsov, 1962; Berezney, Coffey, 1977). Â ñòðóêòóðíîì
îòíîøåíèè ßÁÌ ïðåäñòàâëåí âíóòðèÿäåðíîé áåëêîâîé
ñåòüþ, îñòàòî÷íûìè ÿäðûøêàìè è ëàìèíîé è èìååò áîëüøîå çíà÷åíèå â ïðîñòðàíñòâåííîé îðãàíèçàöèè ñèíòåçà
ÄÍÊ è ÐÍÊ â èíòåðôàçíîì ÿäðå (Iarovaia, Razin, 1983;
Berezney et al., 1995). Îêàçàëîñü, ÷òî ÿäåðíûé ìàòðèêñ
ìëåêîïèòàþùèõ ñîäåðæèò îêîëî 300 áåëêîâ, íî ëèøü íåêîòîðûå èç íèõ âûäåëåíû è îõàðàêòåðèçîâàíû (Mika,
Rost, 2005).
Âìåñòå ñ òåì ñóùåñòâóþò äàííûå î òîì, ÷òî â ñîñòàâ
ÿäåðíîãî ìàòðèêñà âõîäèò ðÿä áåëêîâ, íå òîëüêî ïðèíèìàþùèõ ó÷àñòèå â ïðîöåññå ðåïëèêàöèè è òðàíñêðèïöèè,
íî è îòâå÷àþùèõ çà ôîðìèðîâàíèå ðàçëè÷íûõ óðîâíåé
îðãàíèçàöèè ÄÍÊ (Grisendi et al., 2005; Yung, 2007).
Êîìïîíåíòû ÿäåðíîãî ìàòðèêñà â íàòèâíîé êëåòêå
ÿâëÿþòñÿ ëàáèëüíûìè ñòðóêòóðàìè. Ïîýòîìó ìîðôîëîãè÷åñêàÿ âûðàæåííîñòü êàæäîãî èç êîìïîíåíòîâ ÿäåðíîãî ìàòðèêñà ïîñëå åãî ïîëó÷åíèÿ çàâèñèò íå òîëüêî
îò óñëîâèé åãî âûäåëåíèÿ, íî òàêæå è îò ôóíêöèîíàëüíûõ îñîáåííîñòåé êëåòîê (He et al., 1990; Nickerson,
2001).
 íàøåé ðàáîòå áûëè èñïîëüçîâàíû ïîëèêëîíàëüíûå
àíòèòåëà ê áåëêàì ôèáðèëëàðèíó è Â23, ëîêàëèçóþùèìñÿ òîëüêî â èíòåðôàçíûõ ÿäðûøêàõ, à òàêæå àóòîèììóííûå àíòèòåëà ê íåêîòîðûì ïîëèïåïòèäàì, êîòîðûå,
ïî íàøèì ïðåäâàðèòåëüíûì äàííûì, ðàñïðåäåëåíû â
èíòåðôàçíîì ÿäðå âíå ÿäðûøåê. Çàäà÷åé ðàáîòû áûëî
îïèñàíèå ëîêàëèçàöèè èññëåäóåìûõ áåëêîâ â èíòåðôàçíûõ ÿäðàõ íåîáðàáîòàííûõ êëåòîê è â ÿäåðíîì áåëêîâîì
ìàòðèêñå ñ èñïîëüçîâàíèåì èììóíîôëóîðåñöåíòíîãî ìå÷åíèÿ.
809
Ì. È. Ìóðàøåâà, Þ. Ñ. ×åíöîâ
810
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
Ê ë å ò î ÷ í à ÿ ê ó ë ü ò ó ð à. Îáúåêòîì èññëåäîâàíèÿ
ñëóæèëè êëåòêè êóëüòóðû ÑÏÝ (ïî÷êè ýìáðèîíà ñâèíüè), âûðàùåííûå íà ïîêðîâíûõ ñòåêëàõ â ñðåäå 199 ñ
10 % ñûâîðîòêè êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà â ïðèñóòñòâèè
ãåíòàìèöèíà (100 ìêã/ìë). Êëåòêè êóëüòèâèðîâàëè ïðè
37 °Ñ íà ïîêðîâíûõ ñòåêëàõ â ÷àøêàõ Ïåòðè è èñïîëüçîâàëè íà âòîðîé äåíü ïîñëå ïîñàäêè.
 ðàáîòå áûëè èñïîëüçîâàíû ïîëèêëîíàëüíûå àíòèòåëà ê áåëêàì ôèáðèëëàðèíó è Â23 (Amersham Life Science, ÑØÀ), ëîêàëèçóþùèìñÿ â èíòåðôàçíûõ ÿäðûøêàõ.
Òàêæå èñïîëüçîâàëè íåîõàðàêòåðèçîâàííûå àíòèòåëà, ïîëó÷åííûå èç ñûâîðîòîê áîëüíûõ àóòîèììóííûìè çàáîëåâàíèÿìè, òàêèìè êàê êðàñíàÿ âîë÷àíêà è ñèñòåìíàÿ ñêëåðîäåðìèÿ (Èíñòèòóò ðåâìàòîëîãèè, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã),
êîòîðûå áûëè ëþáåçíî ïðåäîñòàâëåíû Î. Â. Çàöåïèíîé
(Èíñòèòóò áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè èì. àêàäåìèêîâ
Ì. Ì. Øåìÿêèíà è Þ. À. Îâ÷èííèêîâà ÐÀÍ, Ìîñêâà).
 íàøèõ ïðåäûäóùèõ èññëåäîâàíèÿõ íà êëåòêàõ êóëüòóðû ÑÏÝ ñ ïîìîùüþ Âåñòåðí-áëîòà áûëî ïîêàçàíî, ÷òî
àíòèòåëà ýòèõ àóòîèììóííûõ ñûâîðîòîê ñâÿçûâàþòñÿ â
ÿäðå ñ ðàíåå íåèçâåñòíûìè áåëêàìè ñ ìîë. ìàññàìè 27,
38, 40, 50 è 65 êÄà (×åíöîâ è äð., 2000; Ìóðàøåâà, ×åíöîâ 2010).
Äëÿ
âûÿâëåíèÿ
ñòàáèëèçèðîâàííîãî
ÿ ä å ð í î ã î á å ë ê î â î ã î ì à ò ð è ê ñ à èç êëåòîê óäàëÿëè
ÄÍÊ, ÐÍÊ è ãèñòîíû ïî ìîäèôèöèðîâàííîìó ìåòîäó
(Berezney, Coffey, 1977). Ïðè ýòîì êëåòêè, ðàñòóùèå íà
ïîêðîâíûõ ñòåêëàõ, îáðàáàòûâàëè ïåðìåàáèëèçèðóþùèì
ðàñòâîðîì (50 ìÌ ÒÝÀ (òðèýòàíîëàìèí), 5 ìÌ MgÑl2,
0.1 ìM PMSF (ôåíèëìåòàíñóëüôîíèëôòîðèä), 1 % Òðèòîíà Õ-100 è 1 ìÌ ÑuSO4, ðÍ 7.6) â òå÷åíèå 20 ìèí, çàòåì
ýêñòðàãèðîâàëè ãèñòîíû ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì 2 Ì
NaCl, 5 ìM ÝÄÒÀ è 20 ìM ÒÝÀ, (ðÍ 7.6), â òå÷åíèå 20 ìèí. ÄÍÊ è ÐÍÊ óäàëÿëè ñ ïîìîùüþ ÄÍÊàçû I
è ÐÍÊàçû À (50 ìÌ ÒÝÀ, 5 ìÌ ÌgCl2, 0.1 ìM PMSF,
100 ìêã/ìë ÄÍÊàçû I, 100 ìêã/ìë ÐÍÊàçû À è 1 ìM ÑuSO4) â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè 37 °Ñ. Ïîñëå òàêîé îáðàáîòêè
êëåòêè ïðîìûâàëè ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì 20 ìÌ ÒÝÀ è
1 ìÌ ÌgCl2 (ðÍ 7.6), è äëÿ èììóíîôëóîðåñöåíòíîãî âûÿâëåíèÿ áåëêîâ ôèêñèðîâàëè 20 ìèí õîëîäíûì ìåòàíîëîì (–20 °Ñ).
Èììóíîôëóîðåñöåíòíîå
î ê ð à ø è â à í è å.
Êàê èñõîäíûå êëåòêè, òàê è êëåòêè ïîñëå ýêñòðàêöèè
ÄÍÊ, ÐÍÊ è ãèñòîíîâ îòìûâàëè 30 ìèí ðàñòâîðîì PBS,
ñîäåðæàùèì 0.1 % Tween 20 è 1 % áû÷üåãî ñûâîðîòî÷íîãî àëüáóìèíà (BSA). Äëÿ èììóíîõèìè÷åñêîãî àíàëèçà
êëåòêè îáðàáàòûâàëè ïåðâûìè àíòèòåëàìè (îäíîé èç
àóòîèììóííûõ ñûâîðîòîê èëè àíòèòåëàìè ê ôèáðèëëàðèíó è Â23), ðàçâåäåííûìè â ñîîòíîøåíèè 1 : 50 ðàñòâîðîì
PBS, ñîäåðæàùèì 0.1 % Tween 20 è 1 % áû÷üåãî ñûâîðîòî÷íîãî àëüáóìèíà, â òå÷åíèå 40 ìèí ïðè 37 °Ñ. Çàòåì
êëåòêè ïðîìûâàëè ýòèì æå ðàñòâîðîì 3 ðàçà ïî 5 ìèí.
 êà÷åñòâå âòîðûõ àíòèòåë èñïîëüçîâàëè êðîëè÷üè àíòèòåëà ê èììóíîãëîáóëèíàì ÷åëîâåêà, êîíúþãèðîâàííûå ñ
ôëóîðåñöåíòíûì êðàñèòåëåì ôëóîðåñöåèí-5-èçîòèîöèàíàòîì (ÔÈÒÖ). Âòîðûå àíòèòåëà èñïîëüçîâàëè â ðàçâåäåíèè 1 : 100 ïðè 37 °C â òå÷åíèå 30 ìèí.  êà÷åñòâå îòðèöàòåëüíîãî êîíòðîëÿ â êàæäîì îïûòå èñïîëüçîâàëè îêðàøèâàíèå êëåòîê òîëüêî ñ ïîìîùüþ âòîðûõ àíòèòåë. Äëÿ
âûÿâëåíèÿ ÄÍÊ ïðåïàðàòû îêðàøèâàëè ôëóîðîõðîìîì
DAPI (4, 6-äèàìèäèíî-2-ôåíèëèíäîë) â êîíöåíòðàöèè
1 ìêã/ìë ïî ñòàíäàðòíîé ìåòîäèêå. Çàòåì ïðåïàðàòû ïðîìûâàëè è çàêëþ÷àëè â çàëèâî÷íóþ ñðåäó Moviol. Ïðåïà-
ðàòû ïðîñìàòðèâàëè è ôîòîãðàôèðîâàëè â ëþìèíåñöåíòíîì ìèêðîñêîïå Zeiss Àxiovert 200M, èñïîëüçóÿ îáúåêòèâ
ñ óâåëè÷åíèåì 100%1.25.
 ðàáîòå èñïîëüçîâàëè ñëåäóþùèå ðåàêòèâû: ñðåäà
199, ðàñòâîð Õåíêñà è ñûâîðîòêà êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà
(Èíñòèòóò ïîëèîìèåëèòà è âèðóñíûõ ýíöåôàëèòîâ, Ðîññèÿ); ãåíòàìèöèí (Õåìîôàðì, Þãîñëàâèÿ); Moviol 488
(Calbiochem, ÑØÀ); PBS, Òðèòîí Õ-100, Tween 20, ÒÝÀ,
PMSF, ÝÄÒÀ, BSA, DAPI, ìåòàíîë, ÄÍÊàçà I è ÐÍÊàçà À
(Sigma, ÑØÀ); àíòèòåëà ê Â23 è ôèáðèëëàðèíó (Amersham Life Science, ÑØÀ); êðîëè÷üè àíòèòåëà ê èììóíîãëîáóëèíàì ÷åëîâåêà, êîíúþãèðîâàííûå ñ ÔÈÒÖ (Amersham
Life Science, ÑØÀ).
Ðåçóëüòàòû
Èíòåðôàçíûå ÿäðà íåîáðàáîòàííûõ êëåò î ê. Ôëóîðîõðîì DAPI â èíòåðôàçíûõ ÿäðàõ êëåòîê
êóëüòóðû ÑÏÝ äèôôóçíî îêðàøèâàåò âñå ÿäðî, â êîòîðîì âñòðå÷àþòñÿ íåáîëüøèå ñèëüíî ôëóîðåñöèðóþùèå
ãëûáêè õðîìàòèíà. Èíòåíñèâíàÿ ôëóîðåñöåíöèÿ íàáëþäàåòñÿ íà ïåðèôåðèè ÿäðûøåê â ðàéîíàõ îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà, â òî âðåìÿ êàê ñàìè òåëà ÿäðûøåê íå
îêðàøèâàþòñÿ (ðèñ. 1—7, à).
Ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê ôèáðèëëàðèíó â èíòåðôàçíûõ
ÿäðàõ âûÿâëÿþòñÿ ðàâíîìåðíî îêðàøåííûå ÿäðûøêè, à â
êàðèîïëàçìå êëåòîê ôëóîðåñöåíöèè íå íàáëþäàåòñÿ
(ðèñ. 1, á).
 ÿäðàõ èíòåðôàçíûõ êëåòîê ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê
áåëêó Â23 òàêæå âûÿâëÿþòñÿ ðàâíîìåðíî îêðàøåííûå
ÿäðûøêè (ðèñ. 2, á).
Ïðè èñïîëüçîâàíèè àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé
27 êÄà íà ôîíå íåðàâíîìåðíî îêðàøåííîé êàðèîïëàçìû
âûÿâëÿåòñÿ èíòåíñèâíàÿ ôëóîðåñöåíöèÿ â çîíå îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà (ðèñ. 3, á).
Ïðè îêðàøèâàíèè ÿäåð ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ
ìîë. ìàññîé 38 êÄà íà ôîíå äèôôóçíî ôëóîðåñöèðóþùåé
êàðèîïëàçìû âûÿâëÿþòñÿ áîëüøîå êîëè÷åñòâî ÿðêèõ
ìåëêèõ ãðàíóë, à òàêæå èíòåíñèâíàÿ ôëóîðåñöåíöèÿ íà
ïåðèôåðèè ÿäðûøêà â çîíå îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà (ðèñ. 4, á).
Ïðèìåíåíèå àíòèòåë ê áåëêàì ñ ìîë. ìàññîé 40 êÄà
ïîçâîëÿåò âûÿâèòü â êàðèîïëàçìå íåáîëüøèå îêðóãëûå
ñâåòÿùèåñÿ ãðàíóëû, à òàêæå çíà÷èòåëüíûå ñêîïëåíèÿ
ôëóîðåñöèðóþùåãî ìàòåðèàëà âîêðóã ÿäðûøåê â çîíå
îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà (ðèñ. 5, á).
Ïðè èñïîëüçîâàíèè àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé
50 êÄà â ÿäðå îáíàðóæåíû íåáîëüøèå ôëóîðåñöèðóþùèå
ñêîïëåíèÿ, èíòåíñèâíàÿ ôëóîðåñöåíöèÿ íàáëþäàåòñÿ â
çîíå îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà (ðèñ. 6, á).
Ïðè îêðàøèâàíèè ÿäåð ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ
ìîë. ìàññîé 65 êÄà â ÿäðå âûÿâëÿþòñÿ ñêîïëåíèÿ ôëóîðåñöèðóþùåãî ìàòåðèàëà. Èíòåíñèâíàÿ ôëóîðåñöåíöèÿ
îáíàðóæèâàåòñÿ òàêæå â çîíå îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà (ðèñ. 7, á).
Òàêèì îáðàçîì, â íåîáðàáîòàííûõ èíòåðôàçíûõ êëåòêàõ èññëåäóåìûå àóòîèììóííûå àíòèòåëà ê áåëêàì ñ ìîë.
ìàññàìè 27, 38, 40, 50 è 65 êÄà èçáèðàòåëüíî ñâÿçûâàþòñÿ ñ çîíîé îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà, íå îêðàøèâàÿ
îñíîâíóþ ÷àñòü ÿäðûøêà â îòëè÷èå îò àíòèòåë ê áåëêàì
ôèáðèëëàðèíó è Â23. Âìåñòå ñ òåì àíòèòåëà ê áåëêàì ñ
ìîë. ìàññàìè 40, 50 è 65 êÄà â âèäå íåáîëüøèõ ñêîïëåíèé âûÿâëÿþòñÿ è â êàðèîïëàçìå êëåòîê.
Èììóíîõèìè÷åñêàÿ ëîêàëèçàöèÿ íåêîòîðûõ áåëêîâ ÿäåðíîãî ìàòðèêñà
811
Ðèñ. 1. Ëîêàëèçàöèÿ àíòèòåë ê ôèáðèëëàðèíó â èíòåðôàçíûõ êëåòêàõ êóëüòóðû ÑÏÝÂ.
à, á — íåîáðàáîòàííûå êëåòêè: à — îêðàñêà DAPI, á — îêðàñêà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê ôèáðèëëàðèíó; â — îêðàñêà ÿäåðíîãî áåëêîâîãî ìàòðèêñà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê ôèáðèëëàðèíó. Îá. 100%.
Ðèñ. 2. Ëîêàëèçàöèÿ àíòèòåë ê áåëêó B23 â èíòåðôàçíûõ êëåòêàõ êóëüòóðû ÑÏÝÂ.
à, á — íåîáðàáîòàííûå êëåòêè: à — îêðàñêà DAPI, á — îêðàñêà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó B23; â — îêðàñêà ÿäåðíîãî áåëêîâîãî ìàòðèêñà ñ ïîìîùüþ
àíòèòåë ê áåëêó B23. Îá. 100%.
Ðèñ. 3. Ëîêàëèçàöèÿ àíòèòåë ê áåëêó ÿäåðíîãî ìàòðèêñà ñ ìîë. ìàññîé 27 êÄà â èíòåðôàçíûõ êëåòêàõ êóëüòóðû ÑÏÝÂ.
à, á — íåîáðàáîòàííûå êëåòêè: à — îêðàñêà DAPI, á — îêðàñêà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 27 êÄà; â — îêðàñêà ÿäåðíîãî áåëêîâîãî ìàòðèêñà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 27 êÄà; â — îêðàñêà ÿäåðíîãî áåëêîâîãî ìàòðèêñà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 27 êÄà.
Îá. 100%.
812
Ì. È. Ìóðàøåâà, Þ. Ñ. ×åíöîâ
Ðèñ. 4. Ëîêàëèçàöèÿ àíòèòåë ê áåëêó ÿäåðíîãî ìàòðèêñà ñ ìîë. ìàññîé 38 êÄà â èíòåðôàçíûõ êëåòêàõ êóëüòóðû ÑÏÝÂ.
à, á — íåîáðàáîòàííûå êëåòêè: à — îêðàñêà DAPI, á — îêðàñêà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 38 êÄà; â — îêðàñêà ÿäåðíîãî áåëêîâîãî ìàòðèêñà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 38 êÄà. Îá. 100%.
Ðèñ. 5. Ëîêàëèçàöèÿ àíòèòåë ê áåëêó ÿäåðíîãî ìàòðèêñà ñ ìîë. ìàññîé 40 êÄà â èíòåðôàçíûõ êëåòêàõ êóëüòóðû ÑÏÝÂ.
à, á — íåîáðàáîòàííûå êëåòêè: à — îêðàñêà DAPI, á — îêðàñêà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 40 êÄà. â — îêðàñêà ÿäåðíîãî áåëêîâîãî ìàòðèêñà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 40 êÄà. Îá. 100%.
Ðèñ. 6. Ëîêàëèçàöèÿ àíòèòåë ê áåëêó ÿäåðíîãî ìàòðèêñà ñ ìîë. ìàññîé 50 êÄà â èíòåðôàçíûõ êëåòêàõ êóëüòóðû ÑÏÝÂ.
à, á — íåîáðàáîòàííûå êëåòêè: à — îêðàñêà DAPI, á — îêðàñêà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 50 êÄà. â — îêðàñêà ÿäåðíîãî áåëêîâîãî ìàòðèêñà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 50 êÄà. Îá. 100%.
Âàæíî âûÿñíèòü, ÿâëÿþòñÿ ëè áåëêè, âûÿâëÿåìûå c
ïîìîùüþ èñïîëüçîâàííûõ àíòèòåë, êîìïîíåíòàìè ÿäåðíîãî áåëêîâîãî ìàòðèêñà è â ñîñòàâ êàêèõ åãî ñòðóêòóð
(âíóòðèÿäåðíàÿ áåëêîâàÿ ñåòü, îñòàòî÷íûå ÿäðûøêè èëè
ëàìèíà) îíè âõîäÿò.
Ï ð å ï à ð à ò û ÿ ä å ð í î ã î á å ë ê î â î ã î ì à ò ð è ê ñ à.
Ïîñëå îáðàáîòêè êëåòîê ðàñòâîðàìè 2 Ì NaCl, ÄÍÊàçû I
è ÐÍÊàçû À è îêðàøèâàíèÿ èõ ôëóîðîõðîìîì DAPI
îêðàñêà êîìïîíåíòîâ õðîìàòèíà èíòåðôàçíûõ ÿäåð ïîë-
íîñòüþ îòñóòñòâîâàëà, ÷òî ãîâîðèò î ïîëíîì óäàëåíèè èç
ÿäåð ÄÍÊ.
Ïðè èñïîëüçîâàíèèè àíòèòåë ê ôèáðèëëàðèíó â ßÁÌ
ðàâíîìåðíî îêðàøèâàþòñÿ îñòàòî÷íûå ÿäðûøêè (ðèñ. 1, â).
Ïðè îêðàøèâàíèè ßÁÌ ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó
Â23 îêðàøèâàåòñÿ ïåðèôåðèÿ îñòàòî÷íîãî ÿäðûøêà â
âèäå ÿðêî ôëóîðåñöèðóþùåãî îáîäêà (ðèñ. 2, â).
Ïðè èñïîëüçîâàíèè àíòèòåë ê áåëêàì ñ ìîë. ìàññàìè
27 è 38 êÄà â ßÁÌ âûÿâëÿåòñÿ ëèøü ïåðèôåðèÿ îñòàòî÷-
Èììóíîõèìè÷åñêàÿ ëîêàëèçàöèÿ íåêîòîðûõ áåëêîâ ÿäåðíîãî ìàòðèêñà
813
Ðèñ. 7. Ëîêàëèçàöèÿ àíòèòåë ê áåëêó ÿäåðíîãî ìàòðèêñà ñ ìîë. ìàññîé 65 êÄà â èíòåðôàçíûõ êëåòêàõ êóëüòóðû ÑÏÝÂ.
à, á — íåîáðàáîòàííûå êëåòêè: à — îêðàñêà DAPI, á — îêðàñêà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 65 êÄà. â — îêðàñêà ÿäåðíîãî áåëêîâîãî ìàòðèêñà ñ ïîìîùüþ àíòèòåë ê áåëêó ñ ìîë. ìàññîé 65 êÄà. Îá. 100%.
íûõ ÿäðûøåê â âèäå ÿðêî ôëóîðåñöèðóþùåãî îáîäêà
(ðèñ. 3, 4, â).
Àíòèòåëà ê áåëêàì ñ ìîë. ìàññîé 40, 50 è 65 êÄà âûÿâëÿþòñÿ â ßÁÌ â âèäå ñêîïëåíèé ôëóîðåñöèðóþùåãî
ìàòåðèàëà è ôëóîðåñöèðóþùåãî îáîäêà íà ïåðèôåðèè
îñòàòî÷íûõ ÿäðûøåê (ðèñ. 5—7, â).
Îáñóæäåíèå
Èçâåñòíî, ÷òî ÿäðûøêîâûé áåëîê ôèáðèëëàðèí ñâÿçàí ñ òðàíñêðèïöèåé ðèáîñîìíûõ ÐÍÊ è, ïî äàííûì ëèòåðàòóðû, ëîêàëèçóåòñÿ â ÿäðûøêàõ èíòàêòíûõ èíòåðôàçíûõ êëåòîê, êàê è äðóãîé îáÿçàòåëüíûé êîìïîíåíò ÿäðûøêà, áåëîê íóêëåîôîçìèí, èëè Â23, êîòîðûé ó÷àñòâóåò
â ïðîöåññèíãå ðèáîñîìíûõ ÐÍÊ (Ìóõàðüÿìîâà è Çàöåïèíà, 1993; Martin et al., 2007).
 íàñòîÿùåé ðàáîòå íà èíòàêòíûõ èíòåðôàçíûõ êëåòêàõ ÑÏÝ ñ ïîìîùüþ ïîëèêëîíàëüíûõ àíòèòåë ê áåëêàì
ôèáðèëëàðèíó è Â23 ìû ïîêàçàëè, ÷òî îáà ýòè áåëêà ðàâíîìåðíî ðàñïðåäåëÿþòñÿ ïî âñåìó ÿäðûøêó. Íàøè ðåçóëüòàòû ñîãëàñóþòñÿ ñ äàííûìè Ìóõàðüÿìîâîé è Çàöåïèíîé (1993).
 ïîñëåäíåå âðåìÿ â áèîëîãè÷åñêèõ èññëåäîâàíèÿõ
íà÷àëè èñïîëüçîâàòü ìåòîäû ìå÷åíèÿ áåëêîâ â æèâûõ
êëåòêàõ. Íà êóëüòóðàõ êëåòîê HeLa-Ì (êàðöèíîìà øåéêè
ìàòêè) è 3T3 (ìûøèíûå ôèáðîáëàñòû) äëÿ ôëóîðåñöåíòíîãî ìå÷åíèÿ áåëêîâ ÿäðûøåê â æèâûõ êëåòêàõ áûë èñïîëüçîâàí ìåòîä ïðîíèêàþùèõ ÷åðåç ìåìáðàíó ïåïòèäîâ
(Martin et al., 2007). Â ýòîé ðàáîòå àâòîðû ïîìåòèëè ôëóîðîõðîìîì áåëêè Â23 è ôèáðèëëàðèí è ïîêàçàëè, ÷òî îáà
áåëêà ëîêàëèçóþòñÿ â ÿäðûøêå. Ïðè ýòîì Â23 îêðàøèâàë
ïåðèôåðè÷åñêóþ çîíó ÿäðûøêà, ò. å. çîíó îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà, à ôèáðèëëàðèí ðàñïîëàãàëñÿ ïî âñåìó
ÿäðûøêó â âèäå êðóïíûõ ñêîïëåíèé ôëóîðåñöèðóþùåãî
ìàòåðèàëà.
Ïîñëåäíèå òåõíè÷åñêèå ðàçðàáîòêè, â òîì ÷èñëå ðàçâèòèå àòîìíî-ñèëîâîé ìèêðîñêîïèè (ÀÑÌ), ñîçäàëè âîçìîæíîñòè äëÿ áîëåå äåòàëüíûõ èññëåäîâàíèé ñòðîåíèÿ
ÿäðà, â òîì ÷èñëå ñòðóêòóðû ÿäåðíîãî ìàòðèêñà. Ïðè èññëåäîâàíèè ñ ïîìîùüþ ÀÑÌ ÿäåðíîãî ìàòðèêñà â êëåòêàõ êóëüòóðû HeLa áûëî ïîêàçàíî, ÷òî îí ñîñòîèò èç
ïëîòíî ïåðåïëåòåííûõ ôèáðèëë è ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé
ñòðóêòóðó ñ îòäåëüíûìè îòñåêàìè äëÿ ñâîáîäíîé äèôôóçèè ìîëåêóë â ÿäðå (Hirano et al., 2008).
Îäíèì èç íàèìåíåå èçó÷åííûõ êîìïîíåíòîâ ÿäåðíîãî ìàòðèêñà ÿâëÿåòñÿ îñòàòî÷íîå ÿäðûøêî — ïëîòíàÿ
ñòðóêòóðà, ïîâòîðÿþùàÿ ïî ñâîåé ôîðìå ÿäðûøêî.
 ñâîèõ ðàáîòàõ Ôðàíêå ñ ñîàâòîðàìè (Franke et al.,
1981) äëÿ ïîëó÷åíèÿ êîìïîíåíòîâ ÿäåðíîãî ìàòðèêñà îá-
ðàáàòûâàëè ÿäðà, âûäåëåííûå èç îîöèòîâ Xenopus laevis,
áóôåðàìè ñ ðàçëè÷íûì ñîäåðæàíèåì áèâàëåíòíûõ êàòèîíîâ, â ÷àñòíîñòè Ìg2+, è ïîëó÷àëè êîðòèêàëüíûå ñòðóêòóðû ÿäðûøåê. Ïî èõ ìíåíèþ, îñòàòî÷íûå ÿäðûøêè îîöèòîâ X. laevis ñîñòîÿò èç ïëîòíî óëîæåííûõ ôèáðèëë —
áåëêîâûõ ôèëàìåíòîâ ÿäðûøêîâîãî ñêåëåòà.
 ëèòåðàòóðå ñóùåñòâóþò ïîõîæèå ðàáîòû, â êîòîðûõ îñòàòî÷íûå ÿäðûøêè èçó÷àëè ñ ïîìîùüþ ýëåêòðîííîãî ìèêðîñêîïà è ïîêàçàëè, ÷òî îíè âûãëÿäÿò êàê ñåòü
òîíêèõ ôèáðèëë. Ýòè ñòðóêòóðû, âûäåëåííûå èç ðàçíûõ
òèïîâ êëåòîê, òàêèõ êàê ÂÍÊ—21 (ïî÷êà íîâîðîæäåííîãî õîìÿêà), êëåòîê ïå÷åíè ìûøè è êëåòîê êóëüòóðû HeLa,
ñõîæè ïî ñòðîåíèþ (Chen et. al., 1999).
 íàñòîÿùåå âðåìÿ ñ ïîìîùüþ ÀÑÌ ìîæíî íàáëþäàòü ôèáðèëëû ÿäðûøêîâîãî ñêåëåòà, êîòîðûå, ïåðåïëåòàÿñü, ñîçäàþò ñòðóêòóðó, ïîõîæóþ íà ãóáêó ñ îòäåëüíûìè ÿ÷åéêàìè, â êîòîðûõ â ÿäðûøêå ìîãóò ñâîáîäíî ïðîõîäèòü ñèíòåòè÷åñêèå ïðîöåññû (Hirano et al., 2008).
Óòâåðæäàåòñÿ òàêæå, ÷òî îñòàòî÷íûå ÿäðûøêè â êëåòêàõ
HeLa ÿâëÿþòñÿ óñòîé÷èâîé ñòðóêòóðîé ê äåéñòâèþ ðàñòâîðîâ ñ âûñîêèì è íèçêèì ñîäåðæàíèåì ñîëåé, à òàêæå
íóêëåàç.
Êàê ìû âèäèì, îñòàòî÷íîå ÿäðûøêî — ðåàëüíî ñóùåñòâóþùàÿ êàðêàñíàÿ ñèñòåìà ÿäðûøêà, ïëîòíàÿ ñòðóêòóðà, ñîñòîÿùàÿ èç ìíîæåñòâà áåëêîâ è ñõîæàÿ ó ðàçëè÷íûõ
òèïîâ êëåòîê.
Îïðåäåëåíèå â îñòàòî÷íûõ ÿäðûøêàõ áåëêîâ ôèáðèëëàðèíà è íóêëåîôîçìèíà (Â23) â íàøåé ðàáîòå ïîêàçàëî
èõ ðàçíóþ ëîêàëèçàöèþ: áåëîê Â23 ëîêàëèçîâàí ïðåèìóùåñòâåííî íà ïåðèôåðèè îñòàòî÷íîãî ÿäðûøêà, òàì, ãäå
äî ýêñòðàêöèè ÄÍÊ íàõîäèëñÿ îêîëîÿäðûøêîâûé õðîìàòèí, à áåëîê ôèáðèëëàðèí ðàâíîìåðíî ðàñïðåäåëåí ïî
âñåìó îñòàòî÷íîìó ÿäðûøêó. Ñõîäíàÿ ëîêàëèçàöèÿ ôèáðèëëàðèíà â îñòàòî÷íûõ ÿäðûøêàõ îïèñàíà ñ ïîìîùüþ
ìåòîäà èììóíîôëóîðåñöåíòíîé ìèêðîñêîïèè è â äðóãèõ
ðàáîòàõ (Ochs, Smetana, 1991; Hirano et al., 2008). Èçâåñòíî òàêæå (Chen et al., 1999), ÷òî â ñîñòàâ áåëêîâ îñòàòî÷íûõ ÿäðûøåê âõîäèò 6—7 ïîëèïåïòèäîâ. Îäíèì èç
îñíîâíûõ áåëêîâûõ êîìïîíåíòîâ ÿäðûøêîãî ñêåëåòà ÿâëÿåòñÿ ôèáðèëëàðèí, êîòîðûé ðàâíîìåðíî ðàñïðåäåëÿåòñÿ ïî îñòàòî÷íîìó ÿäðûøêó.
Ïî äàííûì ëèòåðàòóðû, ïðèñóòñòâèå B23 â ÿäðûøêå
ñâÿçàíî íå òîëüêî ñ ñîçðåâàíèåì ðÐÍÊ, íî è ñî ìíîãèìè
äðóãèìè ðåãóëÿòîðíûìè ïðîöåññàìè. Òàê, Â23 èãðàåò
âàæíóþ ðîëü â ðåãóëÿöèè êëåòî÷íîãî îòâåòà ïðè àêòèâàöèè ðàçëè÷íûõ îíêîãåííûõ ôàêòîðîâ, ïîñêîëüêó îí
ñâÿçûâàåòñÿ ñ áåëêàìè P53 è ARF (Itahana, 2003; Lindström, Zhang, 2006), íåïîñðåäñòâåííî ó÷àñòâóåò â ðåãóëÿöèè ïàòîãåíåçà (Grisendi et al., 2005; Grisendi et al., 2006),
íåîáõîäèì äëÿ íîðìàëüíîãî ðàçâèòèÿ êëåòîê â ýìáðèî-
814
Ì. È. Ìóðàøåâà, Þ. Ñ. ×åíöîâ
íàëüíîì ïåðèîäå (Naoe et al., 2006; Yung, 2007), à òàêæå
èãðàåò âàæíóþ ðîëü â ñáîðêå ôóíêöèîíèðóþùåãî êîìïëåêñà êèíåòîõîðà (Chun et al., 2011). Ñåé÷àñ â ëèòåðàòóðå
B23 íàçûâàþò ìíîãîôóíêöèîíàëüíûì ñèãíàëüíûì áåëêîì, ëîêàëèçóþùèìñÿ â ÿäðûøêå (Gjerset, 2006; Yung,
2007).
 òî âðåìÿ êàê ôóíêöèè ÿäðûøêîâûõ áåëêîâ âûçûâàþò èíòåðåñ áîëüøîãî ÷èñëà èññëåäîâàòåëåé, íåÿäðûøêîâûå áåëêè ßÁÌ èçó÷åíû ìàëî (Earnshaw, Bernat, 1991;
Dundr et al., 1997). Îáíàðóæåíî, ÷òî ýòè áåëêè èìåþò
ãëàâíûì îáðàçîì ïåðèôåðè÷åñêîå èëè äèôôóçíîå ðàñïðåäåëåíèå â èíòåðôàçíûõ ÿäðàõ (Zbarsky, Georgiev,
1959; Chaly et al., 1984; Cai, Zhai, 1994). Èçâåñòíî òàêæå,
÷òî ìîë. ìàññà ýòèõ áåëêîâ ìîæåò âàðüèðîâàòü îò 25 äî
280 êÄà (Berezney, Coffee, 1977; Van Hooser et al., 2005),
÷òî ãîâîðèò îá èõ áîëüøîì ðàçíîîáðàçèè.
Èç íàøèõ ðåçóëüòàòîâ ñëåäóåò, ÷òî íåÿäðûøêîâûå
áåëêè ñ ìîë. ìàññàìè 27, 38, 40, 50 è 65 êÄà â íåîáðàáîòàííûõ êëåòêàõ çàïîëíÿþò âñå ÿäðî â âèäå íåáîëüøèõ
ñêîïëåíèé èëè ãðàíóë, íî ïðåèìóùåñòâåííî ëîêàëèçîâàíû íà ïåðèôåðèè èíòåðôàçíûõ ÿäðûøåê â çîíå îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà. Ïîñëå óäàëåíèÿ ÄÍÊ, ÐÍÊ è ãèñòîíîâ áåëêè ñ ìîë. ìàññàìè 27 è 38 êÄà â ÿäåðíîì ìàòðèêñå ëîêàëèçóþòñÿ òîëüêî íà ïåðèôåðèè îñòàòî÷íûõ
ÿäðûøåê, òàì, ãäå äî ýêñòðàêöèè ÄÍÊ íàõîäèëñÿ îêîëîÿäðûøêîâûé õðîìàòèí. Ýòîò ôàêò ìîæåò ñâèäåòåëüñòâîâàòü î òîì, ÷òî èññëåäóåìûå áåëêè ñ ìîë. ìàññàìè 27 è
38 êÄà â íàòèâíîì ÿäðå ñâÿçàíû ñ ÐÍÊ è ÄÍÊ è óäàëÿþòñÿ ïðè èõ ýêñòðàêöèè. Òàêèì îáðàçîì, ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî áåëêè ñ ìîë. ìàññàìè 27 è 38 êÄà, êàê è áåëîê Â23, ó÷àñòâóþò â ðåãóëÿòîðíûõ ïðîöåññàõ, ïðîòåêàþùèõ â ÿäðå, òàêèõ êàê ðåïëèêàöèÿ ÄÍÊ, òðàíñêðèïöèÿ è
ïðîöåññèíã ÐÍÊ. Áåëêè æå ñ ìîë. ìàññàìè 40, 50 è 65 êÄà
ïîñëå óäàëåíèÿ ÄÍÊ, ÐÍÊ è ãèñòîíîâ íå òîëüêî ñîäåðæàòñÿ â áîëüøîì êîëè÷åñòâå íà ïåðèôåðèè îñòàòî÷íûõ ÿäðûøåê, íî è îáðàçóþò ìíîãî÷èñëåííûå íåáîëüøèå ñêîïëåíèÿ â êàðèîïëàçìå êëåòîê, ò. å., âèäèìî, âõîäÿò â ñîñòàâ âíóòðåííåé áåëêîâîé ñåòè ÿäåðíîãî
ìàòðèêñà. Ýòè äàííûå ïîäòâåðæäàþò ìíåíèå äðóãèõ àâòîðîâ (Franke et al., 1981; Hirano et al., 2008) î òîì, ÷òî
áåëêîâûé ìàòðèêñ ñîñòîèò èç ïåðåïëåòåííûõ áåëêîâûõ
ôèëàìåíòîâ, êîòîðûå îáðàçóþò ñòðóêòóðó äëÿ ðàñïðåäåëåíèÿ ìîëåêóë â ÿäðå. Âìåñòå ñ òåì îñòàåòñÿ íåÿñíûì, ÿâëÿþòñÿ ýòè áåëêè òîëüêî êàðêàñíûìè ñòðóêòóðàìè è îáðàçóþò ÿ÷åéêè ñåòè ÿäåðíîãî áåëêîâîãî ìàòðèêñà èëè îíè
òàêæå ó÷àñòâóþò â ðåãóëÿòîðíûõ ïðîöåññàõ, ïðîòåêàþùèõ â ÿäðå.
Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî âñå èññëåäóåìûå áåëêè — ÿäðûøêîâûé Â23 è íåÿäðûøêîâûå áåëêè ñ ìîë. ìàññàìè 27,
38, 40, 50 è 65 êÄà — ëîêàëèçóþòñÿ â ïåðèôåðè÷åñêîé
çîíå îñòàòî÷íûõ ÿäðûøåê ÿäåðíîãî ìàòðèêñà, ãäå äî ýêñòðàêöèè íàõîäèëñÿ îêîëîÿäðûøêîâûé õðîìàòèí.
Âìåñòå ñ òåì ðàéîí îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà
ñ÷èòàþò ìåñòîì, ãäå â íîðìå â âèäå ãåòåðîõðîìàòèíà ñîñðåäîòî÷åíû «ìîë÷àùèå» ãåíû, êîòîðûå àêòèâèðóþòñÿ
ïðè ðàçëè÷íûõ âîçäåéñòâèÿõ íà êëåòêè (Gjerset, 2006;
Grisendi et al., 2006). Íåêîòîðûå àâòîðû ïðÿìî íàçûâàþò
ñëîé êîìïàêòíîãî õðîìàòèíà, íàõîäÿùåãîñÿ íà ïåðèôåðèè ÿäðûøåê, ïåðèíóêëåàðíûì ãåòåðîõðîìàòèíîì (Mao
et al., 2011). Íàëè÷èå ãåòåðîõðîìàòèíîâûõ êîìïîíåíòîâ â
ðàéîíàõ îêîëîÿäðûøêîâîãî õðîìàòèíà ïîêàçàëà åùå
Ïðîêîôüåâà-Áåëüãîâñêàÿ (1986).
Òàêèì îáðàçîì, ìîæíî ñäåëàòü çàêëþ÷åíèå î òîì, ÷òî
áåëêè ÿäåðíîãî ìàòðèêñà ñ ìîë. ìàññàìè 27, 38, 40, 50 è
65 êÄà, à òàêæå áåëîê Â23 âõîäÿò â ñîñòàâ îêîëîÿäðûø-
êîâîãî õðîìàòèíà, êîòîðûé ìîæåò ÿâëÿòüñÿ îñîáûì õðîìîñîìíûì ãåòåðîõðîìàòèíîâûì äîìåíîì, ñâÿçàííûì íå
òîëüêî ñ ñèíòåçîì ðèáîñîìíûõ ÐÍÊ.
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Ìóðàøåâà Ì. È., ×åíöîâ Þ. Ñ. 2010 Áåëêè ÿäðûøêîâîãî
ìàòðèêñà ñ ìîë. ìàññàìè 50 è 38 êÄà ïåðåíîñÿòñÿ â ñîñòàâå ïåðèôåðè÷åñêîãî õðîìîñîìíîãî ìàòåðèàëà. Öèòîëîãèÿ. 52 (9) :
760—769. (Murasheva M. I., Chentsov Yu. S. 2010. The nuclear
matrix proteins (mol. mass 38 and 50 kDa) are transported by chromosomes in mitosis. Tsitologiya. 52 (9) : 760—769.)
Ìóõàðüÿìîâà Ê. Ø., Çàöåïèíà Î. Â. 1993. Ñòðóêòóðíûå è
èììóíîöèòîõèìè÷åñêèå îñîáåííîñòè ÿäðûøåê, ôîðìèðóþùèõñÿ â óñëîâèÿõ ïðîñòðàíñòâåííîãî ðàçîáùåíèÿ ÿäðûøêîîáðàçóþùèõ õðîìîñîì. Öèòîëîãèÿ. 35 (5) : 3—9. (Mukhar’iamova K. Sh., Zatsepina O. V. 1993. The structural and immunocytochemical characteristics of nucleoli formed under conditions of the
3-dimensional separation of nucleolar organizer chromosomes. Tsitologiya. 35 (5) : 3—9.)
Ïðîêîôüåâà-Áåëüãîâñêàÿ À. À. 1986. Ãåòåðîõðîìàòè÷åñêèå ðàéîíû õðîìîñîì. Ì.: Íàóêà. 430 ñ. (Prokofyeva-Bel’govskaya A. A. Heterochromatic regions of chromosomes. M.: Nauka.
430 p.)
×åíöîâ Þ. Ñ., Áóðàêîâ Â. Â., Êîñûõ Ì. È. 1999. Ïåðåíîñ
áåëêîâ ÿäåðíîãî ìàòðèêñà â ñîñòàâå ïåðèôåðè÷åñêîãî ìàòåðèàëà ìèòîòè÷åñêèõ õðîìîñîì. Áèîë. ìåìáðàíû. 16 (6) : 647—656.
(Chentsov Yu. S., Burakov V. V., Kosykh M. I. 2000. Nuclear matrix
proteins are carried within peripheral material of mitotic chromosomes. Membr. Cell Biol. 13 (6) : 799—810.)
Berezney R., Coffey D. S. 1977. Nuclear matrix: isolation and
characterization of a structure from rat liver nuclei. J. Cell Biol.
73 : 616—637.
Berezney R., Mortillaro M. J., Ma H., Wei X., Samarabandu J.
1995. The nuclear matrix: a structural for genomic function. Int.
Rev. Cytol. 162 : 1—65.
Cai S.-T., Zhai Z.-H. 1994. Behaviour of 280 kD nuclear matrix protein in mitotic HeLa cells. Chin. Sci. Bull. 39 : 1656—1658.
Chaly N., Bladon T., Setterfield G., Little J. E., Kaplan J. G.,
Brown D. L. 1984. Changes in distribution of nuclear matrix antigens during the mitotic cell cycle. J. Cell Biol. 99 : 661—671.
Chen J., Shen Y., Jiao R., Zhai Z. 1999. Composition and
structure of nucleolar skeleton (nucleolar matrix): actin and fibrillarin are two main protein components of nucleolar skeleton. Sci.
China C. Life Sci. 42 : 34—42.
Chun Y., Park B., Koh W., Lee S., Cheon Y., Kim R., Che L.,
Lee S. 2011. New centromeric component CENP-W is an RNA-associated nuclear matrix protein that interacts with nucleophosmin/B23 protein. J. Biol. Chem. 286 : 42 758—42 769.
Dundr M., Meier U. T., Lewis N., Rekoch D., Hammarskjold M. L., Olson M. O. 1997. A class of noribosomal nuclear components is located in chromosomal periphery and in nucleolus-derived foci during anaphase and telophase. Chromosoma. 105 :
407—417.
Earnshaw W. C., Bernat R. L. 1991. Chromosomal passenger:
towards an integrated view of mitosis. Chromosoma. 100 :
139—146.
Franke W. W., Kleinschmidt J. A., Spring H., Krohne G.,
Grund C., Trendelenburg M. F., Stoehr M., Scheer U. 1981. A nucleolar skeleton of protein filaments demonstrated in amplified nucleoli of Xenopus laevis. J. Cell Biol. 90 : 289—299.
Georgiev G. P., Chentsov Y. S. 1962. The structural organization of nucleolochromosomal ribonucleoproteins. Exp. Cell Res.
27 : 570—572.
Gjerset R. A. 2006. DNA damage, p14ARF, nucleophosmin
(NPM/B23), and cancer. J. Mol. Histol. 37 : 239—251.
Grisendi S., Bernardi R., Rossi M., Cheng K., Khandker L.,
Manova K., Pandolfi P. P. 2005. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437 : 147—153.
Grisendi S., Mecucci C., Falini B., Pandolfi P. P. 2006. Oncogenic role of nucleophosmin/B23. Nat. Rev. Cancer. 6 : 493—505.
Èììóíîõèìè÷åñêàÿ ëîêàëèçàöèÿ íåêîòîðûõ áåëêîâ ÿäåðíîãî ìàòðèêñà
He D. , Nickerson J., Penman S. 1990. Core filaments of the
nuclear matrix. J. Cell Biol. 110 : 569—580.
Hirano Y., Takahashi H., Kumeta M., Hizume K., Hirai Y., Otsuka S., Yoshimura S. H., Takeyasu K. 2008. Nuclear architecture
and chromatin dynamics revealed by atomic force microscopy in
combination with biochemistry and cell biology. Pflug. Arch. 56 :
139—153.
Iarovaia O. V., Razin S. V. 1983. Two types of attachment points of DNA to the nuclear skeleton in Ehrlich ascites carcinoma
cells. Mol. Biol. 17 : 303—313.
Itahana K., Bhat K. P., Jin A., Itahana Y., Hawke D., Kobayashi R., Zhang Y. 2003. Tumor suppressor ARF degrades B23, a
nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Mol. Cell. 12 :1151—1164.
Lindström M. S., Zhang Y. 2006. B23 and ARF: friends or
foes. Cell Biochem. Biophys. 46 : 79—90.
Mao Y. S., Zhang B., Spector D. L. 2011. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends Genet. 27 : 295—306.
Martin R. M., Tunnemann G., Leonhardt H., Cardoso M. C.
2007. Nucleolar marker for living cells. Histochem. Cell Biol. 127 :
243—251.
815
Mika S., Rost B. 2005. NMPdb: database of nuclear matrix
proteins. Nucleic Acids Res. 33 : 160—163.
Naoe T., Suzuki T., Kiyoi H., Urano T. 2006. Nucleophosmin:
a versatile molecule associated with hematological malignancies.
Cancer Sci. 97 : 963—969.
Nickerson J. 2001. Experimental observations of a nuclear
matrix. J. Cell Sci. 114 : 463—474.
Ochs R. L., Smetana K. 1991. Detection of fibrillarin in nucleolar remhants and nucleolar matrix. Exp. Cell Res. 197 : 183—190.
Van Hooser A. A., Yuh P., Heald R. 2005. The perichromosomal layer. Chromosoma. 114 : 377—388.
Yung B. Y. 2007. Nucleophosmin and cancer. Chang Gung
Med. J. 4 : 285—293.
Zbarsky Y. B., Georgiev G. P. 1959. Cytological characteristic
of protein and nucleoprotein of cell nuclei. Biochim. biophys. acta.
32 : 301—302.
Ïîñòóïèëà 6 VI 2014
IMMUNOCHEMICAL STUDY OF NUCLEAR MATRIX PROTEINS
LOCALIZATION IN THE STRUCTURE OF PERINUCLEOLAR CHROMATIN
M. I. Murasheva,1 Yu. S. Chentsov
Biology Department of M. V. Lomonosov Moscow State University;
1 e-mail: [email protected], [email protected]
Immunofluorescence labeling of proteins with molecular mass of 27, 38 , 40, 50 and 65 kDa obtained from
serum of patients with autoimmune disease demonstrated different patterns (small clusters or granules) in interphase nuclei of pig kidney cells. It was remarkable that there was no staining inside the nucleoli, but the proteins immunoreactivity was detected around them in the regions of perinucleolar chromatin. Moreover, expression of nucleolar proteins, such as fibrillarin and B23, was found only in nucleoli. After extraction of DNA, PNA
and histones, the proteins with molecular mass 27 and 38 kDa were found in the periphery of residual nucleoli,
and proteins with molecular mass 40, 50 and 65 kDa had similar localization and were also present in karyoplasm of cells as small clusters. According to our data, nucleolar protein, fibrillarin, was distributed regularly
throughout the whole volume of residual nucleoli. At the same time, B23 protein was revealed only at their periphery, where perinucleolar chromatin had localized before treatment. Thus, it has been revealed that the proteins of nuclear matrix with molecular mass 27, 38, 40, 50 and 65 kDa, as well as nucleolar protein B23 are the
parts of perinucleolar chromatin, which could be considered as special chromosomal domain associated with
the functioning of the nucleolus.
K e y w o r d s: nucleus, nucleolus, chromatin, nuclear protein matrix, residual nucleolus, immunochemistry.
Скачать