на правах рукописи УДК 577.3 ЕВСЕЕВ АЛЕКСЕЙ ИГОРЕВИЧ
advertisement
на правах рукописи УДК 577.3 ЕВСЕЕВ АЛЕКСЕЙ ИГОРЕВИЧ Деление липидной нанотрубки осмотическим давлением. Специальность 02.00.05 – «электрохимия» автореферат на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2010 Работа выполнена в Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН. Научный руководитель: кандидат физико-математических наук Павел Викторович Башкиров. Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук Александр Николаевич Тихонов доктор химических наук Валерий Вениаминович Малев Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН Защита состоится 21 сентября 2010 г. в 11 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.259.03 Института Физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН по адресу: 119991, Москва, Ленинский проспект 31/5 Автореферат разослан 20 августа 2010г. Ученый секретарь диссертационного совета Г.М. Корначева Введение. Актуальность исследования. Мембрана является важнейшим селективным барьером, отделяющим содержимое клетки и ее органелл от окружающего раствора. Она играет ключевую роль, как в структурной организации, так и в функционировании клетки. В клетке постоянно происходит обмен веществом с внешней средой и между различными органеллами. Роль переносчиков в этих процессах играют маленькие мембранные пузырьки — везикулы. Транспортируемые вещества могут содержаться как внутри везикул, так и в их мембране. Везикулы образуются на поверхности органелл или плазматической мембраны клетки в процессе эндоцитоза, в котором принимает участие большое количество специализированных белков. Часть из этих белков отвечает за образование первоначальной инвагинации клеточной мембраны (эпсины) [Hinrichsen L. et. al. (2006)], другие обеспечивают формирование самой везикулы (клатрин, кавеолин, COP-комплексы) [McMahon H.T. (2007)]. При этом везикула остается связанной с материнской мембраной посредством тонкого мембранного перешейка. Отщепление везикулы от образующей поверхности происходит в результате деления соединяющего их перешейка. Помимо эндоцитоза деление мембран лежит в основе целого ряда фундаментальных клеточных процессов, таких как митоз, мейоз, формирование новых органелл и т.д. Деление мембран является непрерывным процессом вплоть до формирования двух замкнутых поверхностей вместо одной, что позволяет предотвратить утечку содержимого образующихся мембранных компартментов. Поэтому деление мембранного перешейка, соединяющего разделяющиеся объемы, идет через образование небислойной структуры полуделения, когда внутренний монослой перешейка локально сливается, а внешний остается интактным [Kozlovsky Y., Kozlov M. (2003)]. Эти перестройки сопряжены с концентрацией большой изгибной энергии на маленьком мембранном перешейке. В клеточных системах эта энергия аккумулируется в мембранном перешейке благодаря кооперативному взаимодействию специализированных белковых машин, собирающихся на его поверхности [Lee and Schekman, (2004)]. Несмотря на большое количество 3 исследований, посвященных изучению механизмов работы белков деления, до сих пор остается открытым вопрос, чем определяется формирование структуры полуделения, является ли это внутренним свойством сильноизогнутого липидного бислоя, или происходит исключительно за счет локального сжатия перешейка белками до нулевого радиуса просвета. Большинство исследователей склонны считать, что основную роль здесь играют именно белки, и практически не учитывают липидный бислой. В тоже время в работе [Kozlovsky Y. and Kozlov M., (2003)] было показано, что формирование структуры полуделения может быть энергетически выгодно, когда радиус мембранного перешейка становится соизмеримым с полутолщиной липидной бислоя (2 нм.). Однако существующие на сегодняшний день экспериментальные методы не позволяют изучать in vivo стабильность и критическое поведение сильноизогнутого контролируемым липидного образом бислоя, изменять чей вплоть радиус до кривизны значений можно сравнимых с полутолщиной липидного бислоя. Поэтому исследования механизма деления мембран проводятся в модельных системах с использованием клеточных белков деления, которые за счет белок-белковых и белок-мембранных взаимодействий сильно затрудняют интерпретацию роли липидной компоненты в процессе деления мембран. Для развития теории деления мембран существует необходимость в разработке экспериментальной системы, позволяющей без использования белков контролируемым образом изменять радиус кривизны поверхности цилиндрической мембраны вплоть до ее полного деления. Это позволяет экспериментально выявить и охарактеризовать критические параметры липидного бислоя, определяющие его стабильность и путь его реорганизации в процессе деления. В нашей лаборатории была разработана методика вытягивания цилиндрических нанотрубок (НТ) из плоской бислойной липидной мембраны с помощью пэтчпипетки [Frolov V.A. et al (2003)] в растворе электролита. Радиус получаемых таким образом НТ сопоставим с радиусом мембранного перешейка, образующегося в результате эндоцитоза. Электрохимические методы позволяют 4 вести наблюдение за ионной проводимостью внутреннего просвета НТ в режиме реального времени, а также определять геометрические и механические параметры НТ [Башкиров П.В. (2007)]. Поэтому мембранные НТ представляют собой удобную модель для разработки экспериментальной методики “безбелкового” деления липидного бислоя и выявления его критических параметров. Предлагаемая методика основана на использовании осмотического давления, возникающего за счет увеличения концентрации соли в окружающем НТ растворе электролита, которое позволяет контролируемым образом менять радиус внутреннего просвета НТ вплоть до формирования структуры полуделения и последующего полного деления НТ. С использованием данной методики были впервые определены значения критического радиуса деления липидного бислоя и его зависимость от липидного состава мембраны. На основании полученных данных предложена модель, описывающая процесс “безбелкового” деления НТ. Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в исследовании механизма “безбелкового” деления липидного бислоя и в определении критических параметров данного процесса с использованием электрохимических методов в модельной системе, представляющей собой липидную НТ, вытянутую из плоской бислойной мембраны. Для этого была разработана экспериментальная система, позволяющая контролируемым образом изменять радиус кривизны НТ вплоть до ее деления. Сжатие осуществлялось с помощью осмотического давления. В ходе работы были поставлены следующие задачи: 1) Исследовать возможность использования разности концентрации соли между растворами электролита внутри и снаружи НТ для контролируемого изменения радиуса ее внутреннего экспериментальные условия просвета. для Подобрать проведения наиболее работ по оптимальные исследованию “безбелкового” деления НТ. 2) Определить зависимость механических свойств НТ от липидного состава и ионной силы раствора электролита. 5 3) Исследовать особенности процесса ”безбелкового” деления НТ и определить его критические параметры в зависимости от липидного состава мембраны. 4) На основе полученных и литературных данных предложить модель ”безбелкового” деления НТ. Новизна исследования и его научно-прикладное значение. Исследования по делению мембран проводятся либо на клетках с помощью флуоресцентной или криоэлектронной микроскопии, либо на модельных системах с использованием белков деления. Это дало возможность определить набор белков деления и предложить возможные механизмы их действия. Для дальнейшего изучения работы белков и развития теории, описывающей процесс деления мембран, необходимо иметь детальное представление о поведении и устойчивости сильноизогнутого липидного бислоя и пути его реорганизации в процессе деления. В представленной работе впервые проводятся исследования такого рода. В качестве исследуемого объекта используются липидные НТ, критическое сужение которых обеспечивается осмотическим давлением. Особенность формирования таких НТ позволяет с помощью электрохимических измерений следить за изменением их формы в режиме реального времени с разрешением до 10 мкс. Показано, что “безбелковое” деление также как и “белковое” происходило в результате самопроизвольного образования структуры полуделения после сжатия НТ до некоторого критического радиуса просвета. Величина критического радиуса составляла 1,4 нм и не зависела от значений модуля изгиба мембраны и начального радиуса НТ, которые варьировали путем добавления холестерина. Полученные данные позволяют лучше понять механизм действия белков деления и роль липидного бислоя в процессе деления. Апробация диссертационной работы. Основные результаты, изложенные в диссертационной работе, докладывались и обсуждались на научных семинарах лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН 6 (2007-2010), на конференции молодых ученых ИФХЭ РАН (2007, 2008), на XX зимней международной молодежной научной школе «ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ» ИБХ РАН (2008), на 54-ом съезде американского сообщества биофизиков (Сан Франциско, США 2010). Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 2 печатных работах. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов работы, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 85 страницах, включает 26 иллюстраций. Библиография включает 90 работ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Формирование мембраны. Бислойная липидная мембрана (БЛМ) формировалась по методу Мюллера-Рудина на отверстии в тонкой тефлоновой пленке в специальной использовались ячейке, следующие заполненной электролитом. В работе липиды: 1,2-диолиалил-sn-глицеро-3- фосфатидилхолин (DOPC), 1,2-диолиалил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин (DOPE) и холестерин (Cholesterol) (Avanti Polar Lipids Inc., США). Использовались буферные растворы с различной ионной силой от 0.01 M KCl до 0.5 M KCl, 10 мM HEPES pH 7.0. Формирование НТ и определение ее радиуса. Для формирования НТ и исследования ее свойств использовали установку на основе пэтч-кламп усилителя EPC-8 (HEKA, Германия). В режиме фиксации потенциала на мембрану подавалось постоянное либо переменное напряжение. Данные: ток через НТ, преобразованный пэтч-кламп усилителем в напряжение (коэффициенты усиления 7 от 1мВ/пА до 30мВ/пА), командные потенциалы и данные с индикатора пьезоконтролера, записывались на жесткий диск компьютера после предварительной оцифровки с помощью АЦП L-305/L-1210 (L-card, Россия). Общая схема установки представлена на рис. 1. Рис. 1 Схема формирования нанотрубок а – образования плотного контакта между пипеткой и мембраной б – формирование МТ в – формирование НТ. С помощью микроконтроллера µ-Drive Controller ESA-CSA (Newport, США) пэтч-пипетка подводилась вплотную к мембране до образования плотного контакта между кончиком микропипетки и мембраной (сопротивление контакта более 1 ГОм). Далее мембрана в пипетке разрушалась скачком гидростатического давления. Для контролируемого смещения пипетки по вертикальной оси использовался пьезоконроллер, позволяющий изменять положение пипетки с точностью до 50 нм. Пэтч-пипетка равномерно отводилась от БЛМ, в результате формировалась катеноидальная мембранная микротрубка (МТ) [Frolov V.A. et. al., (2003)]. При достижении некоторой критической длины происходит коллапс МТ и в некоторых случаях между пэтч-пиптекой и БЛМ может сформироваться цилиндрическая мембранная нанотрубка. При переходе МТ в НТ измеряемая проводимость резко (~1 мс) падала на 4-5 порядков. Затем пипетку обратно приближали к БЛМ и наблюдали за изменением проводимости; ее увеличение свидетельствовало о наличии НТ между пипеткой и БЛМ. 8 Рис. 2 Экспериментальная зависимость проводимости нанотрубки от длины, аппроксимированная гиперболой. Для определения радиуса НТ, строили зависимость измеряемой проводимости G от смещения микропипетки ∆L (рис. 2), которую аппроксимировали гиперболической функцией общего вида: G= p1 + p3 (∆L + p 2 ) (1), где параметры p2 – соответствует неизвестной начальной длине НТ, p3 – проводимость утечки в месте контакта пэтч-пипетки и мембраны, p1 = πr 2 – ρ удельная проводимость НТ единичной длины, r – внутренний радиус НТ, а ρ – удельное сопротивление раствора. Аппроксимация проводилась методом наименьших квадратов, из найденного значения параметра p1 определяли внутренний радиус НТ. Измерение механических параметров НТ. Для измерения механических параметров НТ анализировали зависимость формы НТ от разности электрических потенциалов, приложенной к ее концам [Башкиров (2007)]. Известно, что значение радиуса мембранного цилиндра определяется исключительно механическими параметрами мембраны: 2σ β = 1 h (r + )2 2 2), где σ – латеральное натяжение БЛМ, β – модуль изгиба мембраны, h – толщина гидрофобной части БЛМ. 9 Согласно уравнению электрокапиллярности Липпмана латеральное натяжение зависит от трансмембранного напряжения U: σ =σ0 − C mU 2 2 (3), где σ0 – натяжение в плоской части мембраны, Cm – удельная емкость мембраны. Когда разность потенциалов U прикладывается к концам НТ, то значение трансмембранного напряжения меняется вдоль НТ от U на одном конце до нуля на другом, в результате чего форма НТ отклоняется от цилиндрической, но сохраняет гиперболическую зависимость ионной проводимости от длины. Связь эффективного радиуса reff НТ с величиной приложенного напряжения U задается выражением: 1 h ( reff + ) 2 2 = 2σ 0 β − Cm 2 U 3β (4). Рис. 3 Зависимость обратного квадрата радиуса НТ от квадрата напряжения, подаваемого на мембрану. Из угла наклона находится значение локального модуля изгиба, а из точки пересечения с осью ординат значение латерального натяжения. Как следует из выражения (9) обратный квадрат радиуса эффективного цилиндра линейно зависит от квадрата приложенной к его концам разности потенциалов. В процессе измерений на мембрану подавалось напряжение от 25 до 200 мВ и определялись эффективные радиусы нанотрубок, соответствующие приложенному напряжению. Строилась зависимость 1/(reff+h/2)2 от U2, которую аппроксимировали линейной функцией (рис. 3). Далее из наклона прямой находили значение β, а из точки ее пересечения с осью ординат значение σ0. 10 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Возможность использования осмотического давления для сжатия и деления НТ. Для деления НТ необходимо обеспечить ее значительное сужение [Kozlov M.M. 1999, Bashkirov et. al. 2008]. В клетках такое сужение осуществляется специализированными белковыми машинами. В представленной работе сжатие НТ осуществлялось осмотическим давлением, путем повышения концентрации соли в окружающем НТ растворе. Проницаемость бислойной липидной мембраны для воды намного превосходит проницаемость для небольших ионов, поэтому при увеличении концентрации соли в растворе электролита, окружающем НТ, возникает осмотический поток воды сквозь мембрану НТ из ее внутреннего канала наружу. В свою очередь отток воды из просвета НТ компенсируется ее притоком с отрытых концов нанотрубки. При этом за счет трения воды о стенки НТ, внутри ее развивается отрицательное избыточное давление, –P, которое сжимает НТ. Как будет видно дальше в общем случае это давление меньше предельного осмотического и приближается к последнему для длинных трубок. Рис. 4 Схема движения воды в НТ при появлении разности концентраций соли между внутренним просветом НТ и наружным раствором. Все дальнейшие вычисления будем вести в двух приближениях, что форма НТ мало отличается от цилиндрической, d2r/dz2 << 1/r и радиус трубки, r = r0 + ∆r, мало отклоняется от радиуса, r0, при нулевом осмотическом дисбалансе, ∆r << r0. 11 Радиус НТ, r(x), и давление внутри, P0 – P(z), определяются двумя условиями: балансом потоков воды и механическим равновесием мембраны. В стационарном случае для любого элементарного объема внутри трубки втекающий через верхнее сечение поток, Jin, равен вытекающему через нижнее сечение и стенки НТ, Jout , (Рис. 4), т.е. Jin – Jout = 0, что в наших приближениях записывается как πr 4 d 2P P + 2πrVw p f (∆C − )=0 2 RT dz (5), где P – разность давлений снаружи и внутри НТ, η – вязкость воды, Vw – молярный объем воды, pf – коэффициент проницаемости липидного бислоя для воды, ∆C – разница концентрации электролита снаружи и внутри НТ. Далее, помещая начало координат в центр НТ и считая длину НТ равной 2L и P(±L) = 0, из (8) находим зависимость гидростатического давления на стенки НТ от продольной координаты z cosh z L ch P( z ) = ∆CRT 1 − cosh L L ch (6), где Lch – характерная длина, определяющая минимальное значение полудлины НТ, для которой будет наблюдаться эффект осмотического давления. r 3 RT L ch = 16ηVw p f (7). Так, при L >> Lch избыточное давление в центре НТ P(0) = Posm= ∆CRT. Таким образом, заметное сжатие НТ возможно при фиксации НТ на длине, заведомо превышающей Lch и при создании достаточной разности концентраций соли между внутренним просветом НТ и окружающим раствором. Таким образом, из (6) видно, что избыточное давление, P, которое сжимает НТ, максимально в центре нанотрубки и равно нулю на ее концах. Следовательно, радиус НТ будет уменьшаться от ее концов и достигать наименьшего значения в середине НТ. 12 Условие механического равновесия задает связь между избыточным давлением, P и параметрами НТ σ0 r − β 2r 3 = P [Попов С.В. и др. (1991)] (8). Для случая малых отклонений ∆r радиуса нанотрубки r от равновесного значения r0 зависит как r = r0 + ∆r . Из выражений (6) и (8) и уравнения связи равновесного радиуса НТ с механическими параметрами мембраны (2) получим отклонение формы НТ от цилиндрической cosh z L ∆CRTβ β ch ∆r = P = 1 − 2 2 4σ 0 4σ 0 L cosh L ch (9). Зависимость геометрических и механических параметров НТ от ионной силы раствора. В основе экспериментов по делению НТ лежит создание разности концентраций соли между ее внутренним просветом и окружающим раствором. Рис. 5 Зависимость определяемых геометрических и механических параметров нанотрубки от ионной силы раствора. а - зависимость радиуса нанотрубки от концентрации электролита б - зависимость локального модуля изгиба от концентрации электролита Известно, что в некоторых случаях, например, когда мембрана обладает свободным поверхностным зарядом, изменение ионной силы раствора может оказывать существенное влияние на величину ее модуля изгиба [Claessens et al (2004)]. Поэтому существовала необходимость в проведении исследования 13 влияния ионной силы раствора на механические параметры мембраны для использующихся липидных составов. Основными компонентами БЛМ, из которых вытягивали НТ, являлись незаряженные фосфолипиды DOPC и DOPE а также холестерин. Для получения зависимости радиуса НТ и модуля изгиба мембраны от ионной силы раствора измерения проводились на НТ, сформированных из DOPC с добавлением 40% холестерина, в растворах с различной концентрацией хлорида калия, которую варьировали от 10 до 500 мМ. Из графиков, представленных на рис. 5, видно, что полученные значения радиуса НТ и модуля изгиба мембраны в пределах погрешности измерений 8% не зависят от величины ионной силы растворов, в которых проводились измерения, и составляют r = 6,5±0,27 нм, β = 21±2 kT. Добавление другого фосфолипида DOPE или изменение концентрации холестерина в мембране вряд ли приведет к изменению наблюдаемого эффекта. Следовательно, можно утверждать, что, в отличие от модуля изгиба заряженных мембран, жесткость нейтральных мембран остается постоянной при изменении ионной силы раствора. Такое различие может быть связано с отсутствием у мембран, сформированных из нейтральных липидов, эффекта экранирования заряженных молекул липида ионами электролита, который существенным образом зависит от ионной силы раствора. Осмотическое деление НТ. Для исследования деления НТ осмотическим давлением использовали НТ, вытягиваемые из БЛМ состоящих из фосфолипидов DOPC, DOPE и холестерина, чья концентрация варьировалась от 4 до 7 нм. Радиусы таких НТ составляют, примерно, 5 нм. Из выражения (7) следует, что для T = 300 K, η = 1 сПуаз, r = 5 нм, Vw = 18 мл/моль, pf = 50µм/с [Olbrich K et al 2000], Lch = 0,8 µм. Для наблюдения эффекта, оказываемого изменением концентрации соли снаружи НТ на ее форму, длину НТ подбирали таким образом, чтобы ее значение превышало 2Lch и одновременно с этим отношение сигнала к шуму превышало 10. Обычно длина НТ составляла 2-3 мкм. Необходимая для деления НТ концентрация соли оценивалась по формуле (9), в предположении, что при этом 14 изменение радиуса НТ ∆r в самом узком месте (в середине НТ) должно быть порядка начального радиуса r0, т.е. ∆CRTr02 β r0 ~ ∆r = P≈ 2σ 0 4σ 02 (10). Для полудлины НТ L = 1.5 мкм получается, что ∆C должно быть порядка 1М. Необходимая концентрация соли в окружающем НТ растворе создавалась подведением к ней перфузионной пипетки с диаметром кончика 10 - 20 µм, заполненной концентрированным раствором хлорида калия 3М (рис 6). Разница гидростатического давления на границе кончика перфузионной пипетки с раствором равнялась нулю, так что концентрация KCl около НТ увеличивалась только за счет диффузионных потоков. Пипетка подводилась сверху с помощью микромотора, а ее положение в горизонтальной плоскости регулировалось микровинтами. Пипетку подводили к НТ так, что расстояние от ее кончика до НТ составляло 10 - 20 µм, одновременно с этим регистрировали изменение проводимости G. Рис. 6 Схема опыта по делению НТ. 1 – подведение пипетки с концентрированным раствором соли к НТ. 2 – Разница концентраций соли внутри и снаружи НТ приводит к появлению сжимающего давления. 3 – Деление сжатой НТ. Изначально фиксированная на определенной длине 2L НТ имела стационарную проводимость G0 (рис. 7а). Приложение внешнего давления (отмечено стрелкой на рис. 5) приводило к постепенному (порядка 10 с) уменьшению проводимости до некоторого нового стационарного значения проводимости G*. После чего через 15 некоторое время ожидания, которое варьировалось от 2 до 25 секунд проводимость резко (порядка 1 мс) и необратимо падала до 0, что свидетельствовало о делении НТ. Стоит отметить, что во всех экспериментах деление НТ не сопровождалось формированием проводящих дефектов, что свидетельствует о том, что деление НТ вызванное осмотическим сжатием, как и в клеточных системах, идет через образование структуры полуделения. Рис. 7 а. Зависимость проводимости НТ от времени при делении. Приложение внешнего давления приводит к сжатию НТ до критического радиуса и последующему делению. б. Изменение проводимости НТ при подведении пипетки с дистиллятом. Первая стрелка – подведение дистиллята, за которым следует повышение проводимости НТ. Вторая стрелка – отведение дистиллята с последующим снижением проводимости. Так как длина НТ в ходе всего эксперимента фиксирована, то изменение проводимости обусловлено расширением или сжатием НТ. То есть в результате приложения внешнего давления НТ сжимается с исходного равновесного радиуса r до критического радиуса r*, при достижении которого происходит переход к делению. В нашем случае, как сказано выше, сжатие происходит неравномерно. Наибольшее сжатие достигается в середине НТ, в то время как на концах значение радиуса практически не меняется. Как видно из выражения (9) отклонение формы НТ от цилиндрической прямо пропорционально приложенному давлению P(z) (6). Разложив в ряд эту зависимость и ограничившись первым неисчезающим порядком, получаем квадратичную зависимость радиуса от координаты z вдоль 16 вертикальной оси НТ вида r ( z ) = r * +(r − r*) z2 , удовлетворяющую граничным L2 условиям r (0) = r*; r ( L) = r . Такое приближение хорошо описывает функцию гиперболического косинуса, давая при L ~ Lch погрешность в определяемой величине менее 5%. Воспользовавшись этим приближением, можно аналитически вычислить электрическое сопротивление неравномерно сжатой НТ: R= 2ρ π L ∫ 0 dz (r * +(r0 − r*) z2 2 ) L2 = ( 2 ρL 1 1 arcsin 1 − α + 2 πr0 α α (1 − α ) );α = rr * 0 (11), Подставляя в это выражение R = 1/G*, соответствующее проводимости сжатой НТ перед делением, получаем 1 α + 1 α (1 − α ) Численное ( ) arcsin 1 − α = решение πr 2 2 ρLG * этого (12). уравнения и подстановка экспериментально измеряемых величин дают значение критического радиуса r* = 1.4±0.25 нм в самом узком месте. Подведение пипетки с дистиллятом к НТ приводило к локальному понижению концентрации соли в окружающем растворе. Вследствие чего возникает положительное гидростатическое давление внутри НТ, которое приводит к незначительному расширению НТ, в результате которого, как видно на рис. 7б, происходит увеличение проводимости НТ. Зависимость величины критического радиуса от липидного состава мембраны. При исследовании процесса деления НТ необходимо учитывать ее свойства, которые, прежде всего, зависят от состава мембраны, из которой они образованы. Применяемые в работе электрохимические методы дают возможность определить, как будут изменяться свойства НТ при варьировании содержания каждого компонента в составе мембраны. Это позволяет контролируемым образом менять радиус просвета и жесткость получаемых НТ. Для определения зависимости свойств НТ от фосфолипидного состава в мембранообразующей смеси варьировалось соотношение липидов DOPC:DOPE от 1:2 до 3:1. Молекулы DOPC и DOPE имеют почти одинаковую структуру и 17 отличаются химической группой гидрофильной головки, что влияет на их геометрию. DOPC имеет форму цилиндра, его спонтанная кривизна близка к нулю. Головка DOPE меньше, поэтому молекула по форме ближе к конусу и обладает отрицательной спонтанной кривизной. Содержание холестерина оставалось постоянным, 20%. Рис. 8 Зависимость определяемых геометрических и механических параметров нанотрубки от фосфолипидного состава. а - зависимость радиуса НТ от концентрации DOPC б - зависимость локального модуля изгиба от концентрации DOPC Определяемые значения радиуса НТ и модуля изгиба не зависят от соотношения DOPC:DOPE в мембране. Значение радиуса НТ зависит от соотношения жесткости и натяжения мембраны. Спонтанная кривизна может влиять на величину поверхностного натяжения, которое в свою очередь зависит от концентрации липида в мениске и варьируется от эксперимента к эксперименту. Поэтому оценить вклад спонтанной кривизны в определяемый радиус НТ не представляется возможным. Отсутствие зависимости измеряемого модуля изгиба от спонтанной кривизны липидов в данном случае подтверждает тот факт, что изгибная жесткость незаряженной мембраны в первую очередь зависит от длины и насыщенности углеводородных хвостов [Rawicz W et al (2000)]. Контролируемое изменение радиуса НТ можно было получить при варьировании количества холестерина в мембране в пределах физиологических значений (от 0 до 20% с шагом 5%, соотношение фосфолипидов в мембране DOPC:DOPE 1:1). 18 Рис. 9 Зависимость определяемых геометрических и механических параметров нанотрубки оот содержания холестерина в мембране. а - зависимость радиуса НТ от концентрации холестерина б - зависимость локального модуля изгиба от концентрации холестерина Из графика на рис. 9б видна монотонно возрастающая зависимость локального модуля изгиба от содержания холестерина. Холестерин в качестве регулятора геометрических и механических параметров дает возможность варьировать радиус НТ в пределах от 4 до 7 нм., увеличивая их жесткость. Так же он может влиять и на критические параметры деления мембран. Решено было исследовать, как будут влиять исходный размер и жесткость НТ на величину критического радиуса. Для этого была проведена серия опытов по делению НТ с различным содержанием холестерина. Рис. 10 Зависимость критического радиуса от содержания холестерина. Начальный радиус НТ (квадраты) увеличивается с ростом содержания холестерина, в то время как значение критического радиуса (треугольники) не меняется. 19 На рис. 10 показана зависимость значений равновесного и критического радиусов НТ в зависимости от содержания холестерина в составе мембраны. Видно, что при различных начальных размерах НТ, критический радиус, начиная с которого происходит самопроизвольное деление, остается постоянным. Это может быть связано с наличием перераспределения липидов в монослоях НТ, которое необходимо учитывать. В составе мембраны находятся липиды с различной молекулярной геометрией. Их содержание во внешнем и внутреннем монослоях НТ может быть различным в силу того, что внутренний монослой имеет отрицательную кривизну, а внешний положительную. Перераспределение возможно благодаря наличию резервуара липида в мениске, с которым происходит свободный обмен веществом за счет латеральной подвижности липидов. Большая кривизна сжатой трубки стимулирует увеличение доли липидов с отрицательной спонтанной кривизной во внутреннем монослое и с положительной во внешнем. Так понижается свободная энергия системы и уменьшается эффективный модуль изгиба. Перераспределение липида может приводить к тому, что липидный состав сильно сжатой НТ, а соответственно и свойства мембраны в месте наибольшего сжатия, почти не зависят от состава плоской мембраны. Поэтому величина критического радиуса, как видно из полученных данных, не зависит от липидного состава мембранообразующей смеси. На основании полученных данных предложена модель деления НТ. На основании этой модели процесс деления состоит из нескольких стадий. В исходном состоянии размеры НТ определяются соотношением натяжения мембраны и ее модулем изгиба. Приложение внешнего давления на первой стадии приводит к сжатию НТ до критического радиуса. Время, за которое происходит это сжатие, определяется скоростью ухода липида из НТ через плоскую часть мембраны в мениск. Она зависит от величины приложенного давления и силы трения, возникающей из-за взаимодействия молекул липида в монослое (внутримонослойное трение) и скольжения одного монослоя относительно другого (межмонослойное трение). Последнее обусловлено тем, что объем 20 уходящего липида в монослоях одинаков. Однако площадь сечения, через которое проходит объем липида, во внутреннем монослое меньше, поэтому скорость выхода липида в нем больше. Оценка времени выхода липида при сжатии НТ дает величину 10с. при коэффициенте межмонослойного трения порядка 1016 Н·с/м, что согласуется с известными литературными данными [Evans et al (1992)]. Рис. 11 Стадии деления НТ. 1 – исходная НТ 2 – сжатие внешним давлением до критического радиуса 3 – самопроизвольное слияние внутренних монослоев с образованием структуры полуделения 4 – завершение деления НТ После выхода липида НТ некоторое время остается сжатой до критического радиуса. В этот момент энергия сжатой трубки сопоставима с величиной энергетического образования барьера, структуры который системе полуделения. необходимо Энергетический преодолеть барьер для обусловлен разностью топологий сжатой НТ и структуры полуделения. Для перехода необходимо перезамыкание внутреннего монослоя, связанное с переходом гидрофобных хвостов через гидрофильную область липидных головок и заполненную водой область внутреннего просвета НТ. Переход осуществляется за счет тепловых флуктуаций и происходит через некоторое время, называемое временем ожидания деления. Время ожидания деления зависит от соотношения энергии сжатой НТ и величины энергетического барьера. Теоретические расчеты дают величину 21 энергетического барьера около 20 kT. Расчет времени для преодоления энергетического барьера 40 kT дает величину порядка 1 мин. [P. Kuzmin et al (2001)]. В силу этого полученное в работе время ожидания деления порядка 10с., необходимое для преодоления энергетического барьера 20kT, согласуется с имеющимися литературными данными. Рис. 12 Гистограмма распределения времен ожидания деления НТ. Продолжительность времени ожидания имеет положительную корреляцию с величиной критического сжатия, до которой сжата НТ. Увеличение энергии трубки при сжатии ведет к уменьшению разности между свободной энергией системы и высотой энергетического барьера, что уменьшает время его преодоления. Иными словами, чем сильнее сжата трубка, тем быстрее происходит переход к делению. При этом время ожидания не зависит от липидного состава мембраны, что обусловлено наличием перераспределения липида в сжатой трубке и понижением эффективного модуля изгиба. На последней, третьей стадии происходит преодоление энергетического барьера и слияние внутреннего монослоя, в то время как внешний монослой остается интактным. Образуется структура полуделения, что обеспечивает замкнутость делящихся структур, не допуская смешивания содержимого клетки с окружающим раствором в процессах образования везикул путем эндоцитоза или баддинга и делении клетки. После этого происходит окончательное разделение мембран. Переход между сжатой НТ и окончательным разделением мембран происходит очень быстро, менее чем за 2мс, и безутечечно. 22 Изложенные выше результаты позволяют лучше понять механизм действия белков деления. На последней стадии клеточных процессов, связанных с делением мембран, делящиеся структуры остаются связанными тонким мембранным перешейком. Как показано в данной работе, для его деления необходимо сжатие его до критического радиуса, отличного от нуля. После чего деление происходит самопроизвольно в силу свойств липидного бислоя. Можно предположить, что задача белков деления заключается именно в совершении работы по сжатию мембранного перешейка до критического состояния. Так, динамин в процессе эндоцитоза полимеризуется, накручиваясь на мембранный перешеек, и сжимает его до критического радиуса в результате кооперативного гидролиза молекул ГТФ [Bashkirov P. et al (2008)]. Белковые комплексы COP и ESCRT участвуют как в формировании начальной инвагинации мембраны, так и в критическом сужении образовавшегося перешейка в процессах эдоцитоза, формирования новых вирионов и клеточного деления [Y. Kozlovsky and M. Kozlov (2003), G. Fabrikant et al (2009)]. ВЫВОДЫ. 1. Определена зависимость геометрических и механических параметров нанотрубки от липидного состава мембраны. Радиусы получаемых нанотрубок и жесткость мембраны возрастают с увеличением концентрации холестерина, поверхностное натяжение остается постоянным. 2. Разработан метод безбелкового деления липидной нанотрубки, позволяющий наблюдать кинетику процесса. 3. Изучен процесс деления липидной нанотрубки. Показано, что деление происходит самопроизвольно при достижении критического радиуса. Его значение составило 1,4 ± 0,25 нм. При этом в момент деления не наблюдается увеличения проводимости утечки, промежуточной стадии полуделения. 23 что говорит в пользу наличия 4. Показано, что значение критического радиуса одинаково для НТ различного исходного размера и жесткости. Это может быть связано с перераспределением липидов и изменением эффективного модуля изгиба в сильно сжатой НТ. РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ДИССЕРТАЦИИ Печатные статьи 1. А.И. Евсеев, П.В. Башкиров. 2008. Деление мембранной нанотрубки, вызванное осмотическим давлением. Биологические мембраны 2008 Том 25 № 4 стр. 308– 313. версия на английском A.I. Evseev, P.V. Bashkirov. Fission of membrane nanotube induced by osmotic pressure. Biochemistry (Moscow) Supplemental Series A: Membrane and Cell Biology 2008 Vol. 2 No. 3 pp. 271-275. 2. Pavel V. Bashkirov, Sergey A. Akimov, Alexey I. Evseev, Sandra L. Schmid, Joshua Zimmerberg and Vadim A. Frolov. GTPase Cycle of Dynamin Is Coupled to Membrane Squeeze and Release, Leading to Spontaneous Fission. Cell 2008 No. 135(7) pp. 1276-1286. Материалы конференций 1. А.И. Евсеев, П.В. Башкиров. Деление липидной нанотрубки осмотическим давлением. Конференция молодых ученых Института Физической Химии и Электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН 2007, 2008 2. А.И. Евсеев, П.В. Башкиров. Деление липидной нанотрубки. XX зимняя международная молодежная научная школа "ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ". Москва. 11-15 февраля 2008. 3. Bashkirov P.V., Akimov S.A., Evseev A.I., Schmid S.L., Zimmerberg J. and Frolov V.A. Pathway of dynamin-driven membrane fission revealed with lipid nanotubes. Pavia, Italy. The Golgi Meeting. 4-9 September 2008. 4. Bashkirov P.V., Akimov S.A., Evseev A.I., Schmid S.L., Zimmerberg J. and Frolov V.A. Mechanism of membrane fission: lessons from lipid nanotubes and dynamin. Pavia, Italy. The Golgi Meeting. 4-9 September 2008. 5. Евсеев А.И., Батищев О.В., Инденбом А.В. Экспериментальные и теоретические исследования самоорганизации сложных белковых структур. Международная научная конференция "ИОННЫЕ КАНАЛЫ: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ". Санкт-Петербург 17-18 марта 2009. 6. Evseev A.I., Bashkirov P.V. Fission of lipid nanotubes caused by osmotic stress San Francisco, USA Biophysical Society 54th Annual Meeting 20-24 February 2010. 24
