Tsitologiya 56 (2)

Реклама
2014
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 56, ¹ 2
ÎÒÂÅÒ ÊËÅÒÎÊ ËÈÍÈÈ HeLa ÍÀ ÄÅÉÑÒÂÈÅ ÌÈÒÎÌÈÖÈÍÀ C.
III. ÀÍÀËÈÇ ßÄÐÛØÅÊ ÌÀÒÅÐÈÍÑÊÈÕ È ÄÎ×ÅÐÍÈÕ ÊËÅÒÎÊ
© Þ. Ï. Ïåòðîâ,1, * Þ. À. Íåãóëÿåâ,1, 2 Í. Â. Öóïêèíà1
Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã, è
2 Êàôåäðà ôèçèêî-õèìè÷åñêîé áèîëîãèè êëåòêè
Ñ.-Ïåòåðáóðãñêîãî ãîñóäàðñòâåííîãî ïîëèòåõíè÷åñêîãî óíèâåðñèòåòà;
* ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected]
1
Þ. Ï. Ïåòðîâ è äð.
Ïðîâåäåí ñðàâíèòåëüíûé àíàëèç êîëè÷åñòâà ÿäðûøåê â êëåòêàõ ïîñòîÿííîé ëèíèè M-HeLa äî è ïîñëå âîçäåéñòâèÿ íà íèõ ìèòîìèöèíà C â êîíöåíòðàöèè 10 ìêã/ìë â òå÷åíèå 2 ÷. Èñïîëüçóÿ öåéòðàôåðíóþ ñúåìêó, ïîäñ÷èòûâàëè ÿäðûøêè â ìàòåðèíñêèõ è â ñîîòâåòñòâóþùèõ èì äî÷åðíèõ êëåòêàõ. Ïîêàçàíî, ÷òî ó äî÷åðíèõ êëåòîê ñðåäíåå ÷èñëî ÿäðûøåê íà êëåòêó â öåëîì âûøå, ÷åì ó ìàòåðèíñêèõ, à ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå, íàïðîòèâ, óìåíüøàåòñÿ. Ñðåäíåå êîëè÷åñòâî ÿäðûøåê â äî÷åðíèõ êëåòêàõ,
ìàòåðèíñêèå êëåòêè êîòîðûõ áûëè îáðàáîòàíû ìèòîìèöèíîì, âûøå, ÷åì â ñîòâåòñòâóþùèõ êëåòêàõ
êîíòðîëüíîé ãðóïïû. Îòäåëüíûé àíàëèç áûë âûïîëíåí äëÿ êëåòîê, èìåþùèõ îò 1 äî 4 ÿäðûøåê. Ïîêàçàíî, ÷òî íåñëó÷àéíîå ïîëíîå ñîâïàäåíèå ÷èñëà ÿäðûøåê ó ìàòåðèíñêîé è äî÷åðíèõ êëåòîê ñîñòàâëÿåò
îêîëî 1/7 îò âñåé êëåòî÷íîé ïîïóëÿöèè. Ìèòîìèöèí ñíèæàåò ýòó âåëè÷èíó ïðèáëèçèòåëüíî â 1.5 ðàçà.
Îòâåò êëåòîê ëèíèè HeLa íà äåéñòâèå ìèòîìèöèíà Ñ. III.
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à : ÿäðî, ÿäðûøêî, äî÷åðíÿÿ êëåòêà, ìàòåðèíñêàÿ êëåòêà.
ëåêöèè êëåòî÷íûõ êóëüòóð ïîçâîíî÷íûõ Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ (Ñàíêò-Ïåòåðáóðã). Êóëüòèâèðîâàëè êëåòêè â
ïëàñòèêîâûõ ÷àøêàõ Ïåòðè (35 ìì; Nunk, Äàíèÿ) íà ñðåäå
ÄÌÅÌ (Gibco, ÑØÀ) â àòìîñôåðå 5 % CO2 ïðè 37 °C. Â
ïèòàòåëüíóþ ñðåäó äîáàâëÿëè 10 % ýìáðèîíàëüíîé ñûâîðîòêè êîðîâ (Gibco, ÑØÀ) è 40 ìêã/ìë ãåíòàìèöèíà. Êëåòêè ðàññåâàëè ñ ïëîòíîñòüþ (3—4)$103 êë./ñì2.
×åðåç 1 ñóò ïîñëå ïåðåñåâà îäíó ÷àøêó ñ êëåòêàìè
îñòàâëÿëè â èíêóáàòîðå, âòîðóþ ïîìåùàëè íà ñòîëèê
ìèêðîñêîïà AxioObserver.Z1 (Carl Zeiss MicroImaging
GmbH, Ãåðìàíèÿ), îáîðóäîâàííîãî óñòðîéñòâàìè äëÿ
äîëãîâðåìåííîãî ïðèæèçíåííîãî íàáëþäåíèÿ çà êëåòêàìè (ïîääåðæàíèå òåìïåðàòóðû, âëàæíîñòè è ÑÎ2). Åùå
÷åðåç 1 ñóò â ÷àøêó, íàõîäÿùóþñÿ â èíêóáàòîðå, äîáàâëÿëè ìèòîìèöèí C (Sigma, ÑØÀ) èç ðàñ÷åòà 10 ìêã/ìë è
êëåòêè êóëüòèâèðîâàëè åùå 2 ÷. Ïîñëå ýòîãî óäàëÿëè ñðåäó ñ ìèòîñòàòèêîì, äâàæäû îïîëàñêèâàëè êëåòêè PBS è
äîáàâëÿëè ñâåæóþ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó áåç ìèòîìèöèíà.
Êîíòðîëüíóþ ÷àøêó ñ êëåòêàìè óáèðàëè ñî ñòîëèêà ìèêðîñêîïà AxioObserver.Z1, à íà åå ìåñòî ïîìåùàëè ÷àøêó
ñ êëåòêàìè, ïîäâåðãíóòûìè îáðàáîòêå ìèòîìèöèíîì.
×àøêó ñ èíòàêòíûìè êëåòêàìè ïîìåùàëè â èíêóáàòîð.
×åðåç 2 ñóò ýêñïåðèìåíò çàâåðøàëè.
Ïîëó÷åííûå öèôðîâûå èçîáðàæåíèÿ êëåòîê àíàëèçèðîâàëè ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììû ImageJ 1.47j (Rasband,
W. S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda,
Maryland, ÑØÀ, http:/imagej.nih.gov/ij/). Ïîäñ÷èòûâàëè
÷èñëî ÿäðûøåê â ÿäðàõ ìàòåðèíñêèõ è äî÷åðíèõ êëåòîê.
Âûáîðêà ìàòåðèíñêèõ êëåòîê â êîíòðîëå ñîñòàâèëà
108 êëåòîê, â îïûòå ñ ìèòîìèöèíîì C — 53. Ñîîòâåòñòâåííî êîëè÷åñòâî äî÷åðíèõ êëåòîê â 2 ðàçà áîëüøå. Äëÿ
ñòàòèñòè÷åñêîé îáðàáîòêè äàííûõ è ïîñòðîåíèÿ äèàãðàìì èñïîëüçîâàëè Excel 2010 (MS Corporation, ÑØÀ).
Óñïåõè ðàçâèòèÿ áèîëîãèè êëåòîê â êóëüòóðå â çíà÷èòåëüíîé ñòåïåíè çàâèñÿò îò íàëè÷èÿ ìåòîäèê, äàþùèõ
âîçìîæíîñòü êîëè÷åñòâåííî îöåíèâàòü ñîñòîÿíèå êëåòî÷íîé ïîïóëÿöèè â öåëîì. ×åì áîëüøå íàáîð ðàçëè÷íûõ ïàðàìåòðîâ, õàðàêòåðèçóþùèõ ðàçíûå ñòîðîíû êëåòî÷íîé
ïîïóëÿöèè ïðè ñòàíäàðòíûõ (îáùåïðèíÿòûõ) óñëîâèÿõ
êóëüòèâèðîâàíèÿ, òåì âûøå êà÷åñòâî îöåíêè ìîðôîôóíêöèîíàëüíîãî ñîñòîÿíèÿ êëåòîê, êîòîðîå ìîæíî ïðèíÿòü
çà íîðìó äëÿ äàííîé êëåòî÷íîé ëèíèè. Òàêîé ïîäõîä îáëåã÷àåò èçó÷åíèå ðåàêöèè äàííîé êëåòî÷íîé ïîïóëÿöèè
êàê íà èçìåíåíèå óñëîâèé êóëüòèâèðîâàíèÿ, òàê è íà äåéñòâèå òåõ èëè èíûõ àãåíòîâ, âëèÿþùèõ íà êëåòêè èëè èõ
îòäåëüíûå ñòðóêòóðû.
Êàê ñëåäóåò èç íàøèõ ïðåäûäóùèõ ðàáîò (Ïåòðîâ,
2013; Ïåòðîâ è äð., 2013), äëÿ îöåíêè ñîñòîÿíèÿ êëåòîê â
êóëüòóðå, â ÷àñòíîñòè êëåòîê ëèíèè HeLa, ìîæíî èñïîëüçîâàòü èõ ÿäðûøêè.  ýòèõ êëåòêàõ ïðè îáû÷íîé ñâåòîâîé
ìèêðîñêîïèè áëàãîäàðÿ áîëåå âûñîêîé îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè õîðîøî èäåíòèôèöèðóþòñÿ íåìíîãî÷èñëåííûå (îáû÷íî
2—3 íà ÿäðî, ðåæå 4—5) êðóïíûå ÿäðûøêè. Ýòî äàåò âîçìîæíîñòü àíàëèçèðîâàòü èõ â æèâûõ êëåòêàõ. Â íàñòîÿùåé
ðàáîòå ïðîäîëæåí ñðàâíèòåëüíûé àíàëèç ñîñòîÿíèÿ êëåòîê
ëèíèè HeLa-M äî è ïîñëå âîçäåéñòâèÿ ìèòîìèöèíà C â êîíöåíòðàöèÿõ, èñïîëüçóåìûõ ïðè ïîëó÷åíèè ôèäåðíûõ êëåòîê. Âíóòðèêëåòî÷íûì îáúåêòîì èññëåäîâàíèÿ áûëè ÿäðûøêè òîëüêî äåëÿùèõñÿ êëåòîê è èõ äî÷åðíèõ ïîòîìêîâ.
Ìàòåðèàë è ìåòîä
Îáúåêòîì èññëåäîâàíèÿ ñëóæèëè êëåòêè ïîñòîÿííîé
ëèíèè M-HeLa (ýïèòåëèîèäíàÿ êàðöèíîìà øåéêè ìàòêè
÷åëîâåêà, ñóáëèíèÿ HeLa), ïîëó÷åííûå èç Ðîññèéñêîé êîë105
Þ. Ï. Ïåòðîâ è äð.
106
Ðåçóëüòàòû
 íàøåé ïðåäûäóùåé ðàáîòå áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ó
êëåòîê M-HeLa îáùàÿ ïëîùàäü ÿäðûøåê â ïðîöåññå ðîñòà êóëüòóðû â öåëîì èçìåíÿåòñÿ ïðîïîðöèîíàëüíî èçìåíåíèþ ïëîùàäè ÿäðà êàê â êîíòðîëå, òàê è ïðè âîçäåéñòâèè íà êëåòêè ìèòîìèöèíà C (Ïåòðîâ è äð., 2013). Ñðåäíåå ÷èñëî ÿäðûøåê íà êëåòêó â ïðîöåññå ðîñòà êóëüòóðû
íåìíîãî óâåëè÷èâàåòñÿ è òàêæå íå çàâèñèò îò âîçäåéñòâèÿ íà êëåòêè ìèòîìèöèíà Ñ. Ñëåäóåò çàìåòèòü, ÷òî ïîñëåäíèå äàííûå (î ÷èñëå ÿäðûøåê íà êëåòêó), õîòÿ îíè è
ïîëó÷åíû ñ èñïîëüçîâàíèåì áîëüøîé âûáîðêè êëåòîê,
ýòî óñðåäíåííûå äàííûå äëÿ äâóõ âðåìåíí*ûõ òî÷åê (0 è
1 ñóò, 0 è 2 ñóò), íèâåëèðóþùèå èíäèâèäóàëüíûå îñîáåííîñòè êëåòîê. Ïðè ýòîì ðåãèñòðàöèþ èçîáðàæåíèé êëåòîê
ïðîâîäèëè ïðè îáû÷íîé ñâåòîâîé ìèêðîñêîïèè.
Ðèñ. 1. Ñðåäíåå ÷èñëî ÿäðûøåê íà ÿäðî â êîíòðîëüíîé êëåòî÷íîé ïîïóëÿöèè (à) è â ïîïóëÿöèè êëåòîê ïîñëå 2 ÷ ýêñïîíèðîâàíèÿ â ñðåäå ñ 10 ìêã/ìë ìèòîìèöèíà C (á).
ì — ìàòåðèíñêèå êëåòêè, ä1 è ä2 — äî÷åðíèå êëåòêè (îòáîð â ãðóïïû
ïðîâåäåí ñëó÷àéíûì îáðàçîì); âåðòèêàëüíûå îòðåçêè — îøèáêà ñðåäíåãî.
Ðèñ. 2. Ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå ÷èñëà ÿäðûøåê íà ÿäðî â êîíòðîëüíûõ êëåòêàõ (à) è â êëåòêàõ ïîñëå 2-÷àñîâîãî äåéñòâèÿ
10 ìêã/ìë ìèòîìèöèíà C (á).
Îáîçíà÷åíèå òå æå, ÷òî è íà ðèñ. 1.
Öåéòðàôåðíàÿ ñúåìêà, ïîìèìî òîãî ÷òî ïîçâîëÿåò
çíà÷èòåëüíî óâåëè÷èòü ÷èñëî òî÷åê ðåãèñòðàöèè, äàåò
âîçìîæíîñòü ïðîñëåäèòü ñóäüáó îòäåëüíûõ êëåòîê. Òàêèì îáðàçîì, ìîæíî ñðàâíèâàòü ñîñòîÿíèå äàííîé ìàòåðèíñêîé êëåòêè ñ åå äî÷åðíèìè êëåòêàìè.  íàñòîÿùåé
ðàáîòå ïðè îäíèõ è òåõ æå óñëîâèÿõ êóëüòèâèðîâàíèÿ îäíîé è òîé æå êëåòî÷íîé ïîïóëÿöèè óäàëîñü ðåãèñòðèðîâàòü ÷èñëî ÿäðûøåê ó 108 ìàòåðèíñêèõ è ñîîòâåòñòâåííî
ñòîëüêèõ æå ïàð äî÷åðíèõ êëåòîê êîíòðîëüíîé ïîïóëÿöèè. Äëÿ ïîïóëÿöèè êëåòîê, îáðàáîòàííûõ ìèòîìèöèíîì,
ýòî ÷èñëî ñîñòàâèëî 53. Î÷åâèäíî, ÷òî óìåíüøåíèå âûáîðêè ñâÿçàíî ñ òåì, ÷òî â íåå ïîïàëè òîëüêî òå êëåòêè,
êîòîðûå ïîñëå îáðàáîòêè ìèòîìèöèíîì äàâàëè ôóíêöèîíàëüíî àêòèâíûå äî÷åðíèå êëåòêè. Äàííûå ïðåäñòàâëåíû
íà ðèñ. 1.
Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî â äàííîì ñëó÷àå ïàðû äî÷åðíèõ êëåòîê íå áûëè îáúåäèíåíû â îäíó ãðóïïó, à ïðåäñòàâëåíû äâóìÿ ãðóïïàìè ñëó÷àéíî îòîáðàííûõ êëåòîê.
Êàê è îæèäàëîñü, ðàçëè÷èÿ ìåæäó ãðóïïàìè äî÷åðíèõ
êëåòîê íåò íè â êîíòðîëå, íè â îïûòå. Ïðè ýòîì ÷èñëî ÿäðûøåê â äî÷åðíèõ êëåòêàõ âûøå, ÷åì â ìàòåðèíñêèõ
êëåòêàõ. Ïðàâäà, åñëè ïîäõîäèòü ôîðìàëüíî, òî äîñòîâåðíûå ðàçëè÷èÿ (P < 0.05) ìåæäó ìàòåðèíñêèìè è äî÷åðíèìè êëåòêàìè (êàæäîé ãðóïïû) âûÿâëÿþòñÿ òîëüêî äëÿ
êëåòî÷íîé ïîïóëÿöèè, îáðàáîòàííîé ìèòîìèöèíîì. Îäíàêî åñòü âñå îñíîâàíèÿ óòâåðæäàòü, ÷òî òåíäåíöèÿ ê óâåëè÷åíèþ ÷èñëà ÿäðûøåê â êëåòêàõ â ïðîöåññå ðîñòà êóëüòóðû îñòàåòñÿ, ïîñêîëüêó òàêèå äàííûå áûëè ïîëó÷åíû
ðàíåå (Ïåòðîâ è äð., 2013). Êñòàòè, åñëè â êîíòðîëå îáúåäèíèòü îáå ãðóïïû äî÷åðíèõ êëåòîê, òî ðàçëè÷èÿ ìåæäó
íèìè è ìàòåðèíñêèìè êëåòêàìè áóäóò òàêæå äîñòîâåðíû
è â ýòîì ñëó÷àå.
Åñëè èñõîäèòü èç ïðåäïîëîæåíèÿ î òîì, ÷òî âàðüèðîâàíèå ÷èñëà ÿäðûøåê íà êëåòêó îïèñûâàåòñÿ íîðìàëüíûì
ðàñïðåäåëåíèåì, òî íàðÿäó ñî ñðåäíèì çíà÷åíèåì èìååò
ñìûñë àíàëèçèðîâàòü åùå îäèí ïàðàìåòð — ñòàíäàðòíîå
îòêëîíåíèå. Òàêèå äàííûå ïðåäñòàâëåíû íà ðèñ. 2. Ôîðìàëüíî ïî ýòîìó ïàðàìåòðó çäåñü íåò äîñòîâåðíûõ ðàçëè÷èé ìåæäó ìàòåðèíñêèìè è äî÷åðíèìè êëåòêàìè. Òåì íå
ìåíåå ýòî äâå ïðèíöèïèàëüíî ðàçíûå ãðóïïû, ïîñêîëüêó
èõ äîñòîâåðíîå ðàçëè÷èå ïîäòâåðæäåíî ðàçëè÷èåì ñðåäíèõ. Ñëåäîâàòåëüíî, ìîæíî àíàëèçèðîâàòü îñîáåííîñòè
2-ãî ïàðàìåòðà íîðìàëüíîãî ðàñïðåäåëåíèÿ — ñòàíäàðòíîãî îòêëîíåíèÿ. Îò÷åòëèâî ïðîÿâëÿþòñÿ äâå òåíäåíöèè.
 îáîèõ ñëó÷àÿõ ñòàíäàðòíîå îòêëîíåíèå, óêàçûâàþùåå
íà ñòåïåíü ðàçáðîñà çíà÷åíèé â âûáîðêå, ìåíüøå äëÿ äî÷åðíèõ êëåòîê (âî âñåõ ÷åòûðåõ ñëó÷àÿõ). Òî æå íàáëþäàëè ïðè ðîñòå êëåòî÷íîé êóëüòóðû â ïðåäûäóùåé ðàáîòå,
íî äàííûå íå áûëè îïóáëèêîâàíû. Ïðè÷åì óìåíüøåíèå
ñòàíäàðòíîãî îòêëîíåíèÿ äëÿ ïîïóëÿöèè êëåòîê-ïîòîìêîâ áûëî äîñòîâåðíî ìåíüøå, ÷åì äëÿ êëåòîê-ðîäèòåëåé.
Äðóãàÿ òåíäåíöèÿ îáíàðóæèâàåòñÿ ïðè ñðàâíåíèè
äàííûõ ðèñ. 1 è 2. Ýòî ðàçíîíàïðàâëåííîå èçìåíåíèå
ñðåäíåãî çíà÷åíèÿ è ñòàíäàðòíîãî îòêëîíåíèÿ êàê â êîíòðîëå, òàê è ïðè èñïîëüçîâàíèè ìèòîìèöèíà ïðè ñðàâíåíèè ÿäðûøåê ìàòåðèíñêèõ è äî÷åðíèõ êëåòîê, ò. å. äî÷åðíèå êëåòêè èìåþò òåíäåíöèþ ê óâåëè÷åíèþ ñðåäíåãî
÷èñëà ÿäðûøåê íà ÿäðî ïðè îäíîâðåìåííîì ñíèæåíèè âåëè÷èíû ñòàíäàðòíîãî îòêëîíåíèÿ. Òàêîé âàðèàíò òîæå
ãîâîðèò â ïîëüçó òîãî, ÷òî ìàòåðèíñêèå è äî÷åðíèå êëåòêè — ýòî ïðèíöèïèàëüíî ðàçëè÷íûå ãðóïïû ïî äàííîìó
ïðèçíàêó, ÷òî íåòðóäíî îáîñíîâàòü ëîãè÷åñêè. Ïðåäñòàâèì ãðóïïó îáúåêòîâ, êîòîðàÿ ïî äàííîìó ïàðàìåòðó ìîæåò áûòü îïèñàíà íîðìàëüíûì ðàñïðåäåëåíèåì. Åñëè íà
ýòó ãðóïïó ïîäåéñòâîâàòü êàêèì-ëèáî âíåøíèì ôàêòî-
Îòâåò êëåòîê ëèíèè HeLa íà äåéñòâèå ìèòîìèöèíà Ñ. III
ðîì, ïðèâîäÿùèì ê óâåëè÷åíèþ ñðåäíåãî çíà÷åíèÿ èññëåäóåìîãî ïàðàìåòðà, òî îäíîâðåìåííî ïðîèçîéäåò (êàê
ïðàâèëî, ïðîïîðöèîíàëüíîå) óâåëè÷åíèå (íî íå óìåíüøåíèå!) ñòàíäàðòíîãî îòêëîíåíèÿ.
Ðåãèñòðàöèÿ ïîâåäåíèÿ îòäåëüíî âçÿòîé êëåòêè ïðè
öåéòðàôåðíîé ñúåìêå ïîçâîëÿåò îöåíèòü ñòåïåíü ñîâïàäåíèÿ ÷èñëà ÿäðûøåê ó äî÷åðíèõ êëåòîê â ñðàâíåíèè ñ
ìàòåðèíñêîé. Ïîñêîëüêó îñíîâíàÿ ìàññà êëåòîê HeLa
èìååò íå áîëåå ÷åòûðåõ ÿäðûøåê, ýòî êîëè÷åñòâî áûëî
âçÿòî çà âåðõíèé ïðåäåë. Íèæíèé ñîîòâåòñòâåííî ðàâåí
1 ÿäðûøêó íà êëåòêó. Íåòðóäíî ïðåäñòàâèòü, ÷òî ÷èñëî
âàðèàíòîâ, ïðè êîòîðîì êîëè÷åñòâî ÿäðûøåê äëÿ ìàòåðèíñêîé è åå äî÷åðíèõ êëåòîê áóäåò îäíèì è òåì æå, ðàâíî 4. Ñëîæíåå ïðåäñòàâèòü, íî íåòðóäíî ðàññ÷èòàòü, ÷òî
êîëè÷åñòâî âàðèàíòîâ, ïðè êîòîðîì ÷èñëî ÿäðûøåê â äî÷åðíèõ êëåòêàõ îäíî è òî æå, íî îòëè÷àåòñÿ îò èõ ÷èñëà â
ñîîòâåòñòâóþùèõ ìàòåðèíñêèõ êëåòêàõ, áóäåò ðàâíî 12
(ïðè ìàêñèìàëüíîì ÷èñëå ÿäðûøåê íà êëåòêó 4). Ñîîòâåòñòâåííî íåñîâïàäåíèå ÷èñëà ÿäðûøåê ìåæäó òðåìÿ êëåòêàìè (ìàòåðèíñêîé è äâóìÿ åå äî÷åðíèìè) áóäåò òàêæå
ðàâíî 12. Åñëè ýòè ÷èñëà âûðàçèòü â %, òî îíè ñîñòàâÿò
ñîîòâåòñòâåííî 14, 43 è 43 %. Åñëè îáúåäèíèòü ïåðâûé è
âòîðîé âàðèàíòû ñîâïàäåíèé, òî ïîëó÷èì 57 è 43 %. Ýòî
î÷åíü âàæíûå îæèäàåìûå çíà÷åíèÿ, ñîâïàäåíèå êîòîðûõ
ñ ýêñïåðèìåíòàëüíûìè áóäåò îçíà÷àòü, ÷òî ÷èñëî ÿäðûøåê íàñëåäóåòñÿ ñëó÷àéíûì îáðàçîì.
Ïîñëå îáðàáîòêè ýêñïåðèìåíòàëüíûõ äàííûõ áûëè
ïîëó÷åíû ñëåäóþùèå ðåçóëüòàòû. Îáùåå ÷èñëî ñîâïàäåíèé êîëè÷åñòâà ÿäðûøåê êàê ó ïàð äî÷åðíèõ êëåòîê, òàê è
â ñî÷åòàíèè ñ ìàòåðèíñêîé êëåòêîé ñîñòàâèëî â êîíòðîëå
55 %, â ýêñïåðèìåíòå ñ ìèòîìèöèíîì — 57 %. Î÷åâèäíî,
ýòè âåëè÷èíû ñîèçìåðèìû ñ îæèäàåìûì çíà÷åíèåì 57 %,
÷òî óêàçûâàåò íà ñëó÷àéíûé õàðàêòåð ñîâïàäåíèé ÷èñëà
ÿäðûøåê ó êëåòîê ýòèõ ãðóïï. Îäíàêî åñëè ðàññìàòðèâàòü
âàðèàíò ñîâïàäåíèÿ äëÿ òðåõ êëåòîê (äâå äî÷åðíèå è ñîîòâåòñòâóþùàÿ ìàòåðèíñêàÿ), òî îáíàðóæèâàþòñÿ çíà÷èòåëüíûå (â 1.5—2 ðàçà) îòëè÷èÿ îò îæèäàåìîé âåëè÷èíû:
äëÿ êëåòîê â êîíòðîëå — 28 %, äëÿ êëåòîê, îáðàáîòàííûõ
ìèòîìèöèíîì, — 23 % ïðè îæèäàåìîì çíà÷åíèè 14 %.
Òàêèå ðàçëè÷èÿ óêàçûâàþò íà íåñëó÷àéíûé õàðàêòåð ñîâïàäåíèÿ ÷èñëà ÿäðûøåê ó áëèçêîðîäñòâåííûõ êëåòîê êàê
â êîíòðîëå, òàê è â ýêñïåðèìåíòå, õîòÿ êëåòêè, îáðàáîòàííûå ìèòîìèöèíîì, ïðîÿâëÿþò íåêîòîðóþ òåíäåíöèþ ê
óìåíüøåíèþ ñîâïàäåíèé ÷èñëà ÿäðûøåê.
Îáñóæäåíèå
Ñ ðàçâèòèåì âû÷èñëèòåëüíîé òåõíèêè â ìåäèêî-áèîëîãè÷åñêèå èññëåäîâàíèÿ ñòàë øèðîêî âíåäðÿòüñÿ êîìïüþòåðíûé àíàëèç öèôðîâûõ èçîáðàæåíèé ðàçëè÷íûõ áèîëîãè÷åñêèõ îáúåêòîâ, â ÷àñòíîñòè ÿäðûøåê (Kodiha et al.,
2011; Moore et al., 2011). Ìîðôîìåòðè÷åñêèé àíàëèç ÿäðûøåê øèðîêî èñïîëüçóþò â ïðàêòè÷åñêîé ìåäèöèíå ïðè
äèàãíîñòèêå íåêîòîðûõ çàáîëåâàíèé, â òîì ÷èñëå è îíêîëîãè÷åñêèõ (Aaltomaa et al., 1993; Olinici et.al., 1997;
Øòåéí è äð., 1999; Ëàçàðåâ è äð., 2002; Ìàìàåâ è äð.,
2002; Chen et al., 2002). Ñðàâíèâàþò ÿäðûøêè (ïëîùàäü,
÷èñëî è ò. ä.) îïóõîëåâûõ è çäîðîâûõ òêàíåé, äëÿ êîòîðûõ óñòàíîâëåíû íîðìàòèâíûå âåëè÷èíû ïî äàííîìó ÿäðûøêîâîìó ïàðàìåòðó. Íåñìîòðÿ íà òî ÷òî êëåòêè ïåðåâèâàåìûõ ëèíèé îòíîñÿòñÿ ê òðàíñôîðìèðîâàííûì è â
òåðìèíàõ ìåäèöèíû ÿâëÿþòñÿ ïàòîëîãèåé, ñ ïîçèöèé
áèîëîãèè êëåòîê â êóëüòóðå èõ ñîñòîÿíèå ïðè ñòàíäàðòíûõ (äëÿ äàííîé ëèíèè) óñëîâèÿõ êóëüòèâèðîâàíèÿ ìîæ-
107
íî ðàññìàòðèâàòü êàê íîðìàëüíîå. Ïî àíàëîãèè ñ òàêèìè
äèñöèïëèíàìè, êàê íàïðèìåð íîðìàëüíàÿ ôèçèîëîãèÿ
èëè íîðìàëüíàÿ àíàòîìèÿ, ðå÷ü èäåò î íîðìàëüíîé áèîëîãèè êëåòîê â êóëüòóðå. Äëÿ åå ñîçäàíèÿ íåîáõîäèìî
èìåòü îïðåäåëåííûé êîìïëåêò ìîðôîôóíêöèîíàëüíûõ
ïàðàìåòðîâ, õàðàêòåðèçóþùèõ êëåòêè äàííîé ëèíèè.
Ìîðôîìåòðè÷åñêèå õàðàêòåðèñòèêè ÿäðûøåê êóëüòèâèðóåìûõ êëåòîê, êàê è êëåòîê òêàíåé ìíîãîêëåòî÷íûõ, —
íàäåæíûé ïîêàçàòåëü äëÿ îöåíêè íîðìàëüíîãî ñîñòîÿíèÿ
ïîñòîÿííûõ êëåòî÷íûõ ëèíèé.
Èç äàííûõ ëèòåðàòóðû èçâåñòíî, ÷òî ÷èñëî ÿäðûøåê
è èõ ðàçìåð óâåëè÷èâàþòñÿ ïðè òðàíñôîðìàöèè íîðìàëüíûõ êëåòîê â îïóõîëåâûå (Derenzini et al., 2009; Áîëãîâà
è äð., 2012). Ýòîò ôåíîìåí ñâÿçûâàþò ñ óñèëåíèåì áåëêîâîãî ñèíòåçà â ðàêîâûõ êëåòêàõ. Îäíàêî îòíîñèòåëüíî
êëåòîê HeLa òàêóþ èíòåðïðåòàöèþ íåëüçÿ ñ÷èòàòü óäîâëåòâîðèòåëüíîé. Ýòè êëåòêè óæå òðàíñôîðìèðîâàíû.
Åñòü äàííûå, óêàçûâàþùèå íà êîððåëÿöèþ ìåæäó ÷èñëîì
ÿäðûøåê è ïëîèäíîñòüþ êëåòîê (Àíèñèìîâà, Àíèñèìîâ,
2005). Êàê èçâåñòíî, êëåòêè ïîñòîÿííûõ ëèíèé (è HeLa â
òîì ÷èñëå) â îòëè÷èå îò êëåòîê â îðãàíèçìå íå èìåþò ïîñòîÿííîãî ÷èñëà õðîìîñîì. Äëÿ òàêèõ ëèíèé ñîîòíîøåíèå êëåòîê ñ ðàçíûì êàðèîòèïîì ïðè ïðî÷èõ ðàâíûõ
óñëîâèÿõ âåëè÷èíà ïîñòîÿííàÿ. Ïðè èçìåíåíèè óñëîâèé
êóëüòèâèðîâàíèÿ îíà ìîæåò èçìåíÿòüñÿ, íî ñî âðåìåíåì
âîçâðàùàåòñÿ ê ïåðâîíà÷àëüíîìó ñîñòîÿíèþ (Ïîëÿíñêàÿ,
Êîëüöîâà, 2013).
Åñëè ýòè ôàêòû ñâÿçàòü ñ òåì, ÷òî ÿäðûøêîâûå îðãàíèçàòîðû èìåþò íå âñå õðîìîñîìû ÷åëîâåêà (10 íà äèïëîèäíûé íàáîð), òî ëîãè÷íî ïðåäñòàâëåííûå â íàñòîÿùåé
ðàáîòå äàííûå ðàññìàòðèâàòü â ïðåäïîëîæåíèè ñâÿçè
ìåæäó ÷èñëîì ÿäðûøåê è ÷èñëîì õðîìîñîì â êëåòêå.
Èíûìè ñëîâàìè, ïî ÷èñëó ÿäðûøåê íà ÿäðî ìîæíî ñóäèòü î ÷èñëå ÿäðûøêîâûõ îðãàíèçàòîðîâ, à ñëåäîâàòåëüíî, è îá îòíîñèòåëüíîì ÷èñëå õðîìîñîì â êëåòêå.
Ïðèíèìàÿ âî âíèìàíèå ñêàçàííîå, ðàññìîòðèì ðåçóëüòàòû íàñòîÿùåé ðàáîòû. Â êîíòðîëüíîé ïîïóëÿöèè
êëåòîê ìîæíî îòìåòèòü òåíäåíöèþ ê ðîñòó ÷èñëà ÿäðûøåê ó äî÷åðíèõ êëåòîê. Ýòî óêàçûâàåò íà òî, ÷òî â ïåðâîì
æå ïîêîëåíèè äàæå ïðè îáû÷íûõ óñëîâèÿõ êóëüòèâèðîâàíèÿ â ïîïóëÿöèè êëåòîê HeLa íàðóøàåòñÿ ïîñòîÿíñòâî
ñîîòíîøåíèÿ êëåòîê ñ ðàçëè÷íûì êàðèîòèïîì è, ïî-âèäèìîìó, âîçðàñòàåò ÷èñëî êëåòîê ñ áîëüøèì ÷èñëîì õðîìîñîì. Ìèòîìèöèí C óñèëèâàåò ýòîò ýôôåêò. Ñòðîãî ãîâîðÿ, ýòî íå ñòîëüêî äåéñòâèå ìèòîìèöèíà, ñêîëüêî åãî ïîñëåäåéñòâèå, ïîñêîëüêó äàííûå ïîëó÷åíû íà êëåòêàõ,
îòìûòûõ îò ýòîãî àíòèáèîòèêà. Òàê êàê ìèòîìèöèí ñâÿçûâàåòñÿ ñ ÄÍÊ â åå ìàëîé áîðîçäêå, îí ìîæåò èçìåíÿòü
íàòèâíóþ ñòðóêòóðó ÄÍÊ è òåì ñàìûì âëèÿòü íà ñîîòíîøåíèå êëåòîê ñ ðàçíûì êàðèîòèïîì.
Ïðåäñòàâëåííûå ðåçóëüòàòû óêàçûâàþò íà ñïåöèôè÷íîñòü ïîñëåäåéñòâèÿ ìèòîìèöèíà. Âî-ïåðâûõ, óìåíüøåíèå ñòàíäàðòíîãî îòêëîíåíèÿ ïðè óâåëè÷åíèè ñðåäíåãî
çíà÷åíèÿ îçíà÷àåò, ÷òî äèñïåðñèÿ êëåòîê ïî ÷èñëó ÿäðûøåê ó êëåòîê, îáðàáîòàííûõ ìèòîìèöèíîì, óìåíüøàåòñÿ.
Óìåíüøåíèå ìîæåò ïðîèçîéòè òîëüêî â òîì ñëó÷àå, åñëè
â ïîïóëÿöèè áóäóò ïðåîáëàäàòü êëåòêè ñ êàêèì-òî ïðåäïî÷òèòåëüíûì êàðèîòèïîì. Äàííûõ î ïðåäïî÷òèòåëüíîì
âçàèìîäåéñòâèè ìèòîìèöèíà ñ òåìè èëè èíûìè õðîìîñîìàìè â ëèòåðàòóðå íåò. Áîëåå âåðîÿòíûì ìîæíî ñ÷èòàòü
ïðåäïîëîæåíèå î òîì, ÷òî èçìåíåíèå êàêèõ-òî îïðåäåëåííûõ õðîìîñîì ìàòåðèíñêîé êëåòêè ïîñëå åå îáðàáîòêè ìèòîìèöèíîì ñíèæàåò æèçíåñïîñîáíîñòü åå äî÷åðíèõ
êëåòîê, ò. å. ñïåöèôè÷íîñòü äåéñòâèÿ ìèòîìèöèíà âòîðè÷íà. Ýòîò ôàêò ìîæåò áûòü ïîëåçíûì äëÿ èçó÷åíèÿ
Þ. Ï. Ïåòðîâ è äð.
108
âàæíîñòè òîé èëè èíîé õðîìîñîìû äëÿ âûæèâàíèÿ êëåòîê ëèíèè HeLa ïðè ñòàíäàðòíûõ óñëîâèÿõ êóëüòèâèðîâàíèÿ.
Âî-âòîðûõ, ïðè îòñóòñòâèè ñïåöèôè÷åñêîãî ýôôåêòà
ìèòîìèöèí íå äîëæåí áûë áû âëèÿòü íà ñîîòíîøåíèå íàñëåäóåìîñòè ÷èñëà ÿäðûøåê. Êàê ñëåäóåò èç ïðåäñòàâëåííûõ äàííûõ, âåðîÿòíîñòü ñîâïàäåíèÿ ÷èñëà ÿäðûøåê â
ìàòåðèíñêèõ è äî÷åðíèõ êëåòêàõ â êîíòðîëå â 2 ðàçà
âûøå ïî ñðàâíåíèþ ñ îæèäàåìûì (28 % ïðîòèâ 14).
 ñëó÷àå ìèòîìèöèíà ñëó÷àéíîñòü òàêîãî ñîâïàäåíèÿ
âîçðàñòàåò (23 % ïðîòèâ 14). Ýòîò ðåçóëüòàò ìîæíî èíòåïðåòèðîâàòü êàê ñíèæåíèå òî÷íîñòè ðàñõîæäåíèÿ õðîìàòèä ñ «ìèòîìèöèíîâûìè» ÄÍÊ ó ìàòåðèíñêèõ êëåòîê.
Îòíîñèòåëüíàÿ ïðîñòîòà ìîðôîëîãèè ÿäðûøåê, âèäèìàÿ â ñâåòîâîé ìèêðîñêîï, áåçóñëîâíî, íå îòðàæàåò èõ
ñëîæíîãî ôóíêöèîíàëüíîãî ñîñòîÿíèÿ. Ê òîìó æå ÿäðûøêè — î÷åíü äèíàìè÷íûå ñòðóêòóðû, èñ÷åçàþùèå,
êàê è õðîìîñîìû, âî âðåìÿ ìèòîçà (Æàðñêàÿ, Çàöåïèíà,
2007). Ïîýòîìó íåëüçÿ äåëàòü êàòåãîðè÷íûå óòâåðæäåíèÿ
íà îñíîâàíèè îäíîé ðàáîòû. Îäíàêî ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî â íîðìå (ïðè ïðî÷èõ ðàâíûõ óñëîâèÿõ) äîëÿ
êëåòîê ëèíèè M-HeLa, ó êîòîðûõ â ïåðâîì ïîêîëåíèè
÷èñëî ÿäðûøåê â äî÷åðíèõ êëåòêàõ òàêîå æå, êàê â ìàòåðèíñêèõ, ñîñòàâëÿåò ïðèáëèçèòåëüíî 1/7 îò âñåé êëåòî÷íîé ïîïóëÿöèè (28 – 14 = 14 (%), ò. å. îêîëî 1/7).
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Àíèñèìîâà À. À., Àíèñèìîâ À. Ï. 2005. Ìîðôîôóíêöèîíàëüíûå ïàðàìåòðû ÿäðûøåê ïîëèïëîèäíûõ ñëèçèñòûõ è áåëêîâûõ êëåòîê ñëþííîé æåëåçû óëèòêè Succinea lauta. Öèòîëîãèÿ. 47 (1) : 14—22. (Anisimova A. A., Anisimov A. P. 2005. Morpho-functional parameters of nucleoli in polyploid mucous and
albumen cells of salivary gland in the snail Succinea lauta. Tsitologiya. 47 (1) : 14—22.)
Áîëãîâà Ë. Ñ., Òóãàíîâà Ò. Í., Àëåêñååíêî Î. È. 2012. Ìîðôîôóíêöèîíàëüíûå òèïû ÿäðûøåê ïðè äèñïëàçèÿõ öèëèíäðè÷åñêîãî ýïèòåëèÿ è æåëåçèñòîì ðàêå øåéêè ìàòêè. Êëèí. îíêîëîãèÿ. 5 (1) : 158—162. (Bolgova L. S., Tuganova T. N., Alekseenko O. I. 2012. Morphofunctional types of nucleoli in dysplasia of
columnar epithelium and cervical adenocarcinoma. Klin. Oncologiya. 5 (1) : 158—162.)
Æàðñêàÿ Î. Î., Çàöåïèíà Î. Â. 2007. Äèíàìèêà è ìåõàíèçìû ðåîðãàíèçàöèè ÿäðûøêà â ìèòîçå. Öèòîëîãèÿ. 49 (5) :
355—369. (Zharskayaa O. O., Zatsepina O. V. 2007. The dynamics and mechanisms of nucleolar reorganization during mitosis.
Cell Tissue Biol. 1 (4) : 277—290.)
Ëàçàðåâ À. Ô., Êëèìà÷åâ Â. Â., Áîáðîâ È. Ï., Ëóáåííèêîâ Â. À. 2002. Õàðàêòåðèñòèêà ÿäðûøêîâîãî àïïàðàòà îïóõîëåâûõ êëåòîê ïðè ðàêå æåëóäêà. Àðõèâ ïàòîëîãèè. 64 (6) :
30—32. (Lasarev A. F., Klimachev V. V., Bobrov I. P., Lubennikov V. A. 2002. The characteristic of the nucleolar apparatus of tumour cells at a gastric cancer. Arhiv Pathologii. 64 (6) : 30—32.)
Ìàìàåâ H. H., Ãèíäèíà Ò. Ë., Ñêîðîõîä È. À., Êîíäàêîâà Å. Â., Ïîäîëüöåâà Ý. È. 2002. Êîëè÷åñòâåííàÿ õàðàêòåðèñòèêà ãåìîïîýçà ó áîëüíûõ ìíîæåñòâåííîé ìèåëîìîé ïî äàííûì
ñåðåáðåíèÿ ÿäðûøåê. Ãåìàòîëîãèÿ è òðàíñôóçèîëîãèÿ. 47 (4) :
24—27. (Mamaev N. N., Gindina T. L., Skorokhod I. A., Kondakova E. V., Podoltseva E. I. 2002. Hematologiya and Transfusiologiya. 47 (4) : 24—27.)
Ïåòðîâ Þ. Ï. 2013. Îòâåò êëåòîê ëèíèè HeLa íà äåéñòâèå
ìèòîìèöèíà C. I. Äåëåíèå êëåòîê. Öèòîëîãèÿ. 55 (12) : 874—
878. (Petrov Yu. P. 2014. Response of HeLa cells to mitomycine C.
I. Cell division. Cell Tissue Biol. 8 (2) : 000—000.)
Ïåòðîâ Þ. Ï., Íåãóëÿåâ Þ. À., Öóïêèíà Í. Â. 2014. Îòâåò
êëåòîê ëèíèè HeLa íà äåéñòâèå ìèòîìèöèíà C. II. Ìîðôîìåòðèÿ êëåòîê. Öèòîëîãèÿ. 55 (12) : 879—885. (Petrov Yu. P., Negulyaev Yu. A., Tsupkina N. N. 2014. Response of HeLa cells to mitomycine C. II. Morphometry of the cells. Cell Tissue Biol. 8 (2) :
115—120.)
Ïîëÿíñêàÿ Ã. Ã., Êîëüöîâà À. Ì. 2013. Âëèÿíèå ñóáñòðàòà,
âêëþ÷àþùåãî â ñåáÿ áåëêè âíåêëåòî÷íîãî ìàòðèêñà, íà êàðèîòèïè÷åñêóþ èçìåí÷èâîñòü â äâóõ êëåòî÷íûõ ëèíèÿõ ôèáðîáëàñòîâ êîæè èíäèéñêîãî ìóíòæàêà. Öèòîëîãèÿ. 55 (7) : 463—471.
(Poljanskaya G. G., Koltsova A. M. 2013. The Influence of a substrate including extracellular matrix proteins on karyotypic variability in two cell lines of indian muntjac skin fibroblasts. Cell Tissue
Biol. 7 (5) : 417—425.)
Øòåéí Ã. È., Êóäðÿâöåâà Ì. Â., Êóäðÿâöåâ Á. Í. 1999. Èçìåíåíèå ìîðôîìåòðè÷åñêèõ ïàðàìåòðîâ îêðàøåííûõ ñåðåáðîì
ÿäðûøåê ãåïàòîöèòîâ êðûñ ïðè öèððîçå ïå÷åíè è â ïðîöåññå åå
ðåàáèëèòàöèè. Öèòîëîãèÿ. 41 (7) : 574—579. (Stein G. I., Kudryavtseva M. V., Kudryavtsev B. N. 1999. Change of morphometric parametres of the rat hepatocyte nucleoluses dyed by silver during hepatocirrhosis and rehabilitation. Tsitologiya. 41 (7) : 574—
579.)
Aaltomaa S., Lipponen P., Syrjanen K. 1993. Nucleolar organizer regions related to morphometry, flow cytology, sex steroid receptor content, tumor histology and prognosis in female breast cancer. Path. Res. Pract. 189 : 415—421.
Chen M., Lee J. C., Wu X., Lo S. 2002. Morphometric analysis
of AgNORs in nonkeratinizing carcinoma and adjacent normal
epithelia in the nasopharynx. Anal. Quant. Cytol. Histol. 24 : 173—
177.
Derenzini M., Montanaro L., Trere D. 2009. What the nucleolus says to a tumour pathologist. Histopathology. 54 : 753—
762.
Kodiha M., Bañski P., Stochaj U. 2011. Computer-based fluorescence quantification: a novel approach to study nucleolar biology. BMC Cell Biol. 3 : 12—25.
Moore H. M., Bai B., Boisvert F. M., Latonen L., Rantanen V.,
Simpson J. C., Pepperkok R., Lamond A. I., Laiho M. 2011. Quantitative proteomics and dynamic imaging of the nucleolus reveal distinct responses to UV and ionizing radiation. Mol. Cell Proteomics.
10 : 1—14.
Olinici C. D., Crisan D., Olinici C. I., Vaida M. 1997. Computer-based image analysis of nucleoli in prostate carcinoma. Rom. J.
Morphol. Embryol. 43 : 163—167.
Ïîñòóïèëà 4 IX 2013
Îòâåò êëåòîê ëèíèè HeLa íà äåéñòâèå ìèòîìèöèíà Ñ. III
RESPONSE OF HeLa CELLS TO MITOMYCINE C. III. THE ANALYSIS OF NUCLEOLI
OF MOTHER AND DAUGHTER CELLS
Yu. P. Petrov,1, * Yu. A. Negulyaev,1, 2 N. V. Tsupkina1
1
Institute of Cytology RAS, St. Petersburg, and 2 Chair of Physical and Chemical Biology of the Cell,
St. Petersburg State Polytechnical University;
* e-mail: [email protected]
The comparative analysis of the number of nucleoli in cells of the established HeLa-M line was carried out
before and after exposure to mitomycin C in a concentration of 10 mg/ml for 2 h. Using time-lapse microscopy,
nucleoli in mother and their respective daughter cells were computed. It has been shown that the average number of nucleoli per cell is generally higher in daughter cells than in mother cells, and a standard deviation, on
the contrary, decreases. An average number of nucleoli in daughter cells, whose mother cells had been treated
with mitomycin C, was higher than in corresponding cells of control group. The separate analysis has been performed for the cells having from 1 to 4 nucleoli. Nonrandom complete coincidence of the number of nucleoli in
mather and daughter cells has been typicaly shown for about 1/7 of the total cell population. Mitomycin C reduces this value of about 1.5 times.
K e y w o r d s: a nucleus, a nucleolus, a daughter cell, a mother cell.
109
Скачать