мембраны и их роль в процессах компартментализации и

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ
РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ
МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ
На правах рукописи
ОРЛОВ Вячеслав Георгиевич
МЕМБРАНЫ И ИХ РОЛЬ
В ПРОЦЕССАХ
КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИИ
И АССОЦИАЦИИ РИБОСОМ
У БАКТЕРИЙ
03. 00. 07 — микробиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Ростов-на-Дону — 1992
V •
t
Работа выполнена в Кубанском медицинском институте имени Красной Арм1
Паучньн"! консультант — доктор биологических наук, профессор
Шакулов Р. С.
Официальные оппоненты:
доктор медицшюких наук, профессор Гамлешко X. П.
доктор биологических наук, профессор Островский Д. Н.
доктор биолотческих наук, профессор Рукавцов Б. И.
Ведущая организация — Ростовский научно-исследовательский
прстш'очум
институт
.
;
I"
'
Защита состоится « гл J?' •> /х%-//?'1^г^у_<^/>^-'^ 1992 г. в
7 СУ
ч
сов на заседании специализированного совета ДО84.53.01. при Ростовском орде
Дружбы народов медицинском институте (344700, Ростои-на-Дону, Нахичева
ский пер., 29.)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского медицинскс
института
/\'^^
•••• р • , ^
> '/, у
Автореферат разослан « / J
» {У-1 /-///А-С/YM\Ч'^2
г.
Ученый секретарь
снсциализиропанного совета
доцент
Н. Я. Корганов
РОССИЙС!СА.~
БИБЛИиТ£;<я
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Биологические мембраны отделяют клетку
от окружающей ее среды, следовательно, целостность их струк­
турной организации является основным условием существования
клетки как единого целого. Поэтому они являются исключитель­
но полифункциональными структурами и сопричастны почти ко
всем процессам, происходящим в клетке (Солтон, 1977).
Основными компонентами клеточных мембран являются белки
и фосфолипиды, которые образуют сложные структуры, в основе
строения которых лежит жидкостно-мозаичная модель их орга­
низации. Фосфолипиды образуют бислой, который является ос­
новной структурной единицей в организации биомембраи. Белки,
входящие в состав цитоплазматической мембраны бактериальной
клетки, выполняют разнообразные функции, которые включают:
транспорт веществ (Gronan, 1987), синтез ДНК (Чернова, Газиева, 1979; Firshein, 1989), РНК (Winstcn, Huang, 1972), белка
(Allen, Scott, 1979), липидов (Островский, Шакулов, 1973), липополисахаридов (Kanegasaki, 1974), циклического АМФ (Poll,
1977). Кроме того, в мембранах осуществляются процессы, обес­
печивающие клетку энергией (Скулачсв, 1989).
Одной из фундаментальных проблем мембранологии является
проблема участия мембран в биосинтезе и секреции экзобелков.
Эти процессы осуществляются в основном на мембраносвязанных
рибосомах.
Совершенно очевидно, что выяснение ассоциации рибосом с
мембранными структурами бактерий позволит более глубоко по­
нять особенности биосинтеза секретируемых белков, а также ряд
ключевых вопросов
участия биологических мембран в осталь­
ных процессах клеточной биологии.
Изучение этих вопросов будет способствовать решению целого
ряда практических задач современной биологии, связанных с
расшифровкой механизмов: канцерогенеза, анабиоза, радиационно­
го поражения клеток, регуляции активности работы мембранных
ферментов, механизма действия мембраноактивных антибиотиков
и многах другие не менее актуальных проблем.
Таким образом, все рассмотренные выше аспекты мембранологии определяют актуальность исследований в этом направле­
нии.
Цель исследования. Целью настоящего исследования было вы­
явление роли мембранных структур в процессах компартмента­
лизации и ассоциации рибосом у различных видов бактерий и
связанных с этими процессами биосинтеза и секреции белков.
Основные задачи исследования
Работа была направлена на решение следующих задач:
1. Изучение внутриклеточного размещения рибосом у различ­
ных штаммов кишечной палочки по основным субклеточным
фракциям: гиалоплазмснной, нуклеоидной и мембранной.
2. Сравнительное изучение стабильности рибосом к диссоциа­
ции при понижающихся концентрациях ионов магния как в
отдельных субклеточных фракциях, так и тотальных рибосом из
клеток, находящихся в различных физиологических состояниях.
3. Выявлена роль мембранных компонентов в ассоциации ри­
босом с MeM6paHaNm.
4. Установление роли прокарнотических рибосом и их ком­
понентов в процессе секреции белков.
5. Изучению молекулярных механизмов участия мембран, ле­
жащих в основе процессов компартментализации и ассоциации с
ними рибосом, а также возможной роли этих процессов в
секреции белков.
Новизна исследования
Впервые нами детально изучено распределение рибосом у ки­
шечной палочки между основными субклеточными фракциями
(гиалоплазмснной, нуклеоидной и мембранной). В результате
проведенных исследований мы показали, что остановка роста
культуры кишечной палочки сопровождается перераспределением
рибосом между указанными фракциями клеток: относителыюе
содержание рибосом в гиалоплазмс возрастает, а в мембранной
фракции уменьшается. Такое перераспределение рибосом можно
рассматривать как один из механизмов регулирования уровня
биосинтеза цитоплазматических и секрстируемых белков в клетке
адекватно условиям окружающей среды.
Используя сшивающие агенты и антитела к мембранным бел­
кам, нам удалось показать, что связывание с мембранными
структурами 70S рибосом, траспортирующих секреторные белки,
осуществляется 505-рибойомной субьеднницей за счет белок-бел­
ковых взаимодействий определенных белков 50S-pибocoмнoй
субъединицы с мембранными белками. При исследовании белко­
вого состава 508-рнбосомных субъеднниц, выделенных из грамотрицательных бактерий, нам впервые удалось обнаружить два
ассоциированных белка в структуре 508-рибосомных субъединиц
гаалоплазменной фракции. На основании полученных экспери­
ментальных данных о корреляции АТФазной активности 50S
субъеднниц с уровнем содержания в структуре субъединиц белка
с молекулярной массой 102 кД, а также четко выраженной
реакции преципитации этого белка с антисывороткой, получен­
ной против мембранных антигенов, мы предположили, что он
является продуктом гена Sec А.
Кроме того, в структуре 508-рнбосомных субъединиц мемб­
ранной фракции обнаружен ассоциированный рибосомный белок,
образующий интенсивную полосу. Молекулярная масса этого бел­
ка 52 кД, почти соответствует расчетной молекулярной массе
интегрального мембранного белка Sec Y. Этот белок играет
важную роль в процессе секреции белков.
Научно-практическое значение работы
Выявление роли мембранных структур в процессе компартментализацни и ассоциации рибосом с мембранными структурами
позволит более глубоко понять особенности биосинтеза и меха­
низмы сскрец1П1 белков, синтез которых осуществляется мембраносвязанными рибосомами. Эти данные могут быть использованы
в качестве теоретических основ при разработке методов получе­
ния различных экзобелков бактериальных клеток и их промыш­
ленного производства, в том чиате белков эукарпотических кле­
ток, гены которых клонированы в прокариотические клетки.
Сформулировано новое представление о возможном механизме
участия белков Sec А, триггсрного фактора и белка Sec Y в
процессах, лежащих в основе секреции белков.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на 2-ом Всесоюзном сове­
щании
«Структурно-функциональная
организация
микробной
клетки» — (Пущино, 28-30 декабря 1987 г.), на Всесоюзном
семинаре «Современные проблемы антибиотикорезистентности» —
(Москва, 23-24 марта 1988г.), на 3-м рабочем совещании «Сек­
реция белков у микроорганизмов» — (Пущино, 19-21 апреля
1988 г.), на Всесоюзной конференции «Регуляция микробного
метаболизма» — (Пущино, 12-14 июня 1989 г.), на Всесоюзной
конференции «Физ1Юлогия пищеварения и всасывания» — (Крас­
нодар, 27-29 сентября 1990г.), на И Международном симпозиуме
«Реабилитация иммунной системы» — (Дагомыс, 9-11 октября
1990).
Структура работы
Диссертация изложена на 331 странице, состоит из введения,
2 глав литературного обзора, 4 глав собственных исследований
с описанием методов, результатов исследований, заключения, вы­
водов и библиографии. Работа иллюстрирована 18 таблицами и
63 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования
Использованные в работе штаммы бактерий приведены в таб­
лице 1.
Среды и условия роста
Бактерии выращивали на жидкой среде М9 (Миллер, 1976).
Необходимые аминокислоты добавляли в среду из расчета 20
мкг/мл относительно L-форм, тиамин — в концентрации 2
мкг/мл. Для выделения из клеток рибосом и мембранных струк­
тур их выращивали на среде М9 с добавлением МПБ при
интенсивной аэращш в режиме рН-стата до середины экспонен­
циальной фазы роста. Выращенные клетки собирали центрифу­
гированием и промывали буфером № 1, а затем буфером №
3.
Основные буферные растворы, использованные в работе
В работе использованы буферные растворы следующего соста­
ва: № 1 — 20 мМ трис'нС!, рН 7,5,1 М NH4CI, 20 мМ
ацетата магния, 100 мкг/мл хлорамфеникола; № 2 — тот же,
что и № 1, но без хлорамфеникола; № 3 — 10 мМ трис —
НС1 рН 7,5, 100 мМ KCI, 10 мМ ацетата магния, 100 мкг/мл
хлорамфеникола; № 4 — тот же, что и № 3, но без хло­
рамфеникола; № 5 — тот же, что и № 4, но с 1 мМ
ацетата магния; № 6 — тот же, что и № 5, с добавлением
Таблица I
Характеристика и ироисхомсичше И1таммов бактерий, исиользоваппых а работе
Штамм
Генотип
Е. соМ MRE600
Дикий
Е. coli
Tlir leu his argil
СР78
Е. coli .ММ52
Получен от P. С. Шакулова
ВНИИ генетика
ihlA relA
Гага D139 lac И169 thi
relA rspL mol (SecA) SI is
Получен от М. А. Несмея­
новой ИБФМ
Пущино на Оке
Музей ВНИИ
Е. coli К12 S
Е. coli К12 S
ро1Л
pel A-
Р.
Viilraris
Дикий
Р.
aeruginosa
S. aureus
Происхождение
генетика
Получен из ГИСК
Л. Тарасевича
им. Л.
209Р
Б. siibtilis'
1
1
М. Iiiicus
ft,
Е. coli М
Выделен
рии
и нашей
лаборато­
Е. coli 34
Выделен от больного
Е. coli 629
Е. coli 630
Е. coli 358
Е. coli 381
Е. coli 018
Е. coli 0151
Р. Vulgaris
1010
Е. соП J53
,
Получен
генетики
из
музей
ВНИИ
200 мкг/мл пуромицина; № 7 — 10 мМ трис-НС1 рН 7,5,
100 мМ KCI, 1мМ ацетата магния, 2-мкг/мл пуромицина,
ДНКаза 1 мкг/мл, РНКаза 1 мкг/мл; № 8 — 1 мМ —
трис-НС1 рН 7,5, 100 мМ КС1, 1 мМ ацетата магния, 1 мМ
фенилметилсульфонилфторид; № 9 — стандартный буферный
раствор (10 мМ трис-НС1 рН 7,5, 10 мМ КС1, 10 мМ ацетата
магния); № 10 — 10 мМ трнс-НС! рН 7,5, 100 мМ КС1,
ацетата магния 0,5 мМ — 1,0 мМ — 5 мМб 0,5% сахарозы.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ
КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР
Методы разрушения клеток
Ферментативное разрушение клеток проводш1и с помощью лизоцима (Costerlon et. al., 1967). Баллистическую дезинтеграцию
осуществляли в планетарной мельнице, установленной в рефри­
жераторной центрифуге ЦЛР-1 при 1500 об/мин.
Экструзионную дезинтеграцию проводили из замороженного
состояния (Ратнер и др., 1972). Для этих целен был исполь­
зован Х-пресс фирмы ЛКБ (Швеция).
Разделение наружной и цитоплазматической мембраны прово­
дили в ступенчатом градиенте концентрации сахарозы по Осборн
(Osborn et. al., 1972).
Во всех случаях выделения мембранных структур буферные
растворы содержали ингибитор протеаз фенилметилсульфонилфто­
рид.
Определение транслирующей
активности рибосом
Транслирующая активность рибосом была проверена в бескле­
точной белоксинтезирующей системе стандартного состава.
Все компоненты бесклеточной белоксинтезирующей системы
смешивали на ледяной бане, а затем пробы инкубировали 20
мин. при 37 град. С (рН 7,5). Реакцию останавливали добав­
лением холодной 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Пробы на­
гревали при 90 град. С в течение 15 минут, охлаждали и
фильтровали через ультрафильтры № 4. Каждый осадок на
фильтре промывали 50 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты,
высушивали и определяли радиоактивность синтезированного пол­
ипептида на сцинтилляционном счетчике с использованием стан­
дартного толуольного сцинтиллятора с тритоном Х-100.
8
Аналитический электрофорез белков в ПААГ проводили в
пластинах градиентного ПААГ (7 — 15%) в присутствии додецилсульфата в системе Лэмли (Laemli, 1970).
Определение белка в препаратах мембран и рибосом прово­
дили по методу Лоурн (Lowry, 1951).
Получение мембранных антигенов
Препараты цитоплазматических и наружных мембран ресуспендировали в буфере № 7 и озвучивали на высокочастотном
ультразвуковом генераторе. После озвучивания препараты наруж­
ных н внутренних мембран разводили буфером № 5 и осаж­
дали в роторе SW — 55 Ti при 40000 об/мин. центрифуги
L8-70. Осадки последовательно промывали буфером № 5 и ди­
стиллированной водой. Осаждение препаратов после промывки
осуществляли в указанном выше режиме. Осадки мембран лиофильно высушивали и использовали для иммунизации кроликов.
Получение антисыворотки проводили как описано в руковод­
стве «Иммунологические методы» (Фримель, 1987).
Двухмерный перекрестный иммуноэлектрофорез проводили как
описано в работе (Adler, Arvidson, 1984).
Аналитические методы
Постановка реакции связывания
мембранными структурами рибосом
Для постановки этой реакции использованы рибосомы, мече­
ные (' С) урацилом.
Для присоединения рибосом к мембранам, с которых рибосо­
мы были предварительно удалены обработкой буфером № б,
суспензию мембран в 0,5 мл буфера № 10 соединяли с О, 5
мл суспензии рибосом в том же буфере и инкубировали 30
мин. при 37 град. С. После инкубации материал охлаждали на
ледяной бане и наслапвалн на линейный градиент концентрации
сахарозы 5-20% с подслойкой 50% сахарозы и центрифугиро­
вали 30 мин. при 25000 об/мин. при изучении связывания
наружными мембранами рибосом и 60 мин. при изучении свя­
зывания внутренними мембранами рибосом при том же режиме
центрифугирования.
Полосу мембранных структур, видимую в проходящем свете
в зоне подслойки 50% сахарозы, отбирали перистальтическим
насосом. Затем разводили буфером № 4 и осаждали на дно
пробирки в роторе SW-55Ti ультрацентрифуги L8-70. После
центрифугирования осадок споласкивали холодной дистиллирован­
ной водой и ресуспендировали его в 200 мкл дистиллированной
воды. В 100 мл определяли радиоактивность, обусловленную
присоединившимися к мембранам рибосомами, а 50 мл пробы
использовали для определения количества белка в ней. По
удельной радиоактивности рибосом, использованных в данном
опыте, высчитывали количество рибосом, связавшихся с мембран­
ными структурами в данной пробе. Из величины белка в пробе
вычитали количество белка, приходящегося на долю рибосом,
связавшихся с мембранными структурами в данном опыте, а
оставшееся количество белка принимали за мембранный белок.
На количество этого белка и определяли долю связавшихся с
мембранными структурами рибосом из расчета на 1 мг мемб­
ранного белка.
Определение количества РНК в рибосомах
Количество РНК в рибосомах рассчитывали как разницу со­
держания РНК во фракциях экстракта до и после осаждения
рибосом. Эту величину использовали при анализе распределения
рибосом по фракциям. Для определения РНК материал фракци­
онировали
по методу
Шмидта
и Таннгаузера
(Schmidt,
Thannhauser, 1945). Содержание РНК в пробах определяли спектрофотометрически по Спирину (Спирин, 1958).
Определение АТФазной активности
Активность АТФазы определяли по скорости гидролиза АТФ
до ортофосфата и АДФ. Для определения количества образовав­
шегося ортофосфата использовали стандартный набор реактивов,
поставляемых фирмой «Хемапол».
Электронномикроскопическое исследование
мембранных структур
Для электронномикроскопических исследований препарат мем­
бранных структур промывали в 10 мл аммонийно-фосфатном
буфере рН 6,0. Осадок мембранных структур ресуспендировали
в том же буфере и наносили на сетки с формваровой подлож­
кой. Сетки высушивали при комнатной температуре, а затем
конрастировали фосфорно-вольфрамовой кислотой. Образцы иссле­
довали в электронном микроскопе УЗМВ-ЮОВ при увеличении
45000.
10
РЕЗУЛЬТАТЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
1. ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ РАЗМЕЩЕНИЕ РИБОСОМ
И ИХ НЕКОТОРЫЕ- ХАРАКТЕРИСТИКИ
1.1. Локализация рибосом в субклеточных фракциях
Относительное распределение рибосомного материала, наГщенное в результате фракционирования протопластов различных
штаммов кишечной палочки, приведено в табл. 2. Как видно
из данных, приведенных в табл. 2, остановка роста культуры
кишечной палочки сопровождается перераспределением рибосом
между указанными фракциями клеток: относительное содержание
рибосом в гиалоплазменной фракции возрастает, а в мембранной
фракции — уменьшается. Такое перераспределение рибосом яв­
ляется одним из механизмов регуляции уровня биосинтеза цитоплазматических и секретируемых белков в клетках адекватно
условиям окружающей среды.
1. 2. Сравнительное изучение стабильности рибосом кишечной
палочки на различных этапах ее роста
Как видно из данных, приведенных в табл. 3, содержание
активных, то есть непосредственно занятых в трансляции, рибо­
сом в бактериальной клетке в значительной мере зависит от
стадии роста культуры. Клетки, находящиеся в экспоненциальной
фазе роста, содержат значительно большее количество активных
рибосом, чем клетки, находящиеся в стационарной фазе роста.
В стационарной фазе роста культуры или в условиях дефицита
в среде необходимых аминокислот в гиалоплазменной, нуклеоидной и мембранной фракциях уменьшается доля рибосом, не
диссоциирующих на субъединицы, при понижении концентрации
ионов магния в буферном растБсрс. Остапспкл роста культуры
добавлением в среду хлорамфеннкола приводит к увеличению
доли стабильных рибосом по сравнению с экспоненциально рас­
тущей культурой.
Полученные результаты подтверждают данные о том, что
между скоростью б1юсинтеза рибосомной РНК и содержанием
активных рибосом в бактериальной клетке существует определен­
ная корреляция.
Изучение распределения рибосом между тремя субклеточными
фракциями — гиалоплазменной, нуклеоидной и мембранной и
изменение характера диссоциации рибосом при понижении кон­
центрации ионов магния в окружающей среде следует признать
наиболее важными критериями изменения их состояния in vitro.
11
Содержание рРНК в различных субклеточных фракци
процент от суммы в трех фракци51х
Культура, фаза роста, среда
Е. coli MRE600
Фракция
Гиалоплазмениая
11уклеоидиая
Мембранная
Сумма
нуклеоидиои и
мембранной
экспо­
ненци­
альная
стацио­
нарная
МПБ
Е. coli М
экспо­
ненци­
альная
экспо­
ненци­
альная
стацио­
нарная
экспо­
ненци­
альная
стац
нар
МПБ
МПБ
+ХФ
МПБ
МПБ
М-9+
глюкоза
Мглюк
16
50
39
27
41
17
44
37
30
30
32
23
20
14
47
84
20
50
31
61
41
73
36
59
63
83
42
56
Примечание: АК — аминокислоты, ХФ
тиамина, (-) — отсутствие аминоксилот.
хлорамфеникол, В — тиамин,
yQc
днссоциац ия piiuocuM с . сип «'.«..oin, 70S + 5 0 S + 3 0 S
Состояние
культуры
Таблица 3
Л)/о
Концентрация Mg-H- В мМ
Фракция
1
0,5
Экспоненциальная
фаза
Гиалоплазма
Нуклеоид
Мембраны
Среднее значение
37
38
46
40
16
22
29
22
Стационарная
фаза (5 часов)
Гиалоплазма
Нуклеоид
Мембраны
Среднее значение
36
31
28
32
14
14
9
12
Стационарная
фаза (22 часа)
Гиалоплазма
Нуклеоид
Мембраны
Среднее значение
27
19
24
23
0
0
0
0
Экспоненциальная
фаза
+
100
мкг/мл хлорамфеникола
Гихюплазма
Нуклеоид
Мембраны
Среднее значение
52
58
52
54
39
44
41
41
2. РОЛЬ МЕМБРАННЫХ КОМПОНЕНТОВ
В АССОЦИАЦИИ РИБОСОМ С МЕМБРАНАМИ
2.1. Прочность связывания 70S рибосом с бактериальными
мембранами
Рибосомы в прокариотических клетках достаточно прочно свя­
заны с мембранами. При обработке мембранного материала протеолитическнми ферментами, сульфгидрильными реагентами и
РИКазой не удается полностью отделить рибосомный материал
от мембранных структур, что наиболее вероятно может быть
объяснено тем, что рибосомы не просто ассоциированы с мем­
бранами, а часть их заключена в мембранные пузырьки, обна­
руженные нами на электронограммах.
2.2. Связывание мембранами 70S рибосом in vitro
Мембраны, рибосомы с которых предварительно удалены пуромицнном и КС1 в высокой концентрации, вновь связывают
рибосомы in vitro. Связывание мембранами рибосом стимулиру­
ется 1юнами магния и угнетается КС1.
13
Эффективность связывания мембранами рибосом in vitro зави­
сит от степени вывернутости внутренних мембранных везикул,
поэтому можно полагать, что места связывания рибосом на
мембранах локализуются на внутренней стороне цитоплазматической мембраны бактериальной клетки. Подтверждением этому
служит тот факт, что наружные мембраны грамотрицательных
бактерий практически не связывают рибосом (табл. 4).
На основании полученных нами данных о том, что связыва­
ние 508-рибосомных субьединиц с мембранными стуктурами эф­
фективно подавляется антителами к мембранным антигенам, а
эффективность связывания 305-рибосомных субьединиц мало чув­
ствительна к такой обработке, можно сказать, что связывание
308-рибосомных субъединиц с мембранными структурами носит
неспецифический характер.
Связывание с мембранными структурами 70S рибосом, транс­
лирующих секреторные белки, осуществляется, очевидно, 50S
субъединицей за счет белок-белковых взаимодействий строго оп­
ределенных белков 50S субъединицы с мембранным белком Sec
Y, а возможно, и с другими интегральными мембранными бел­
ками, являющимися продуктами генов Sec D и Sec E(Rigs et.
al., 1988).
2.3. Перекрестное связывание in vitro 70S рибосом, выделен­
ных из грамотрицательных и грамположительных микроорганиз­
мов с мембранами грамотрицательных и грамположительных бак­
терий
Как видно из результатов, приведенных в табл. 5, мембрань
из М. luteus связывают 70S рибосомы из Е. соИ MRE600 с
такой же эффективностью, как и рибосомы, выделенные и;
собственного штамма. Внутренние мембраны из Е. соИ MRE60(
связывают рибосомы, выделенные из М. luteus, как и в случа<
перекрестного связывания рибосом мембранами М. luteus, прак
тическн с одинаковой эффективностью.
На основании того, что мембранные структуры грамотрица
тельных и грамположительных бактерий одинаково эффективн<
связывают гомологичные и гетерологичные рибосомы, можн(
предположить, что аппарат секреции грамотрицательных и грам
положительных бактерий, видимо, имеет общий принцип органи
зации.
14
Эффективность связывания 70S рибосом из Е. coli MRE600 внутренни
выделенными из различных штаммов бактерий, в мкг рРНК/
Эффективность связыва­
ния 70S рибосом мемб­
ранными структурами
в мкг рРНК/мг мемб­
ранного белка
Внутренние
Наружные
Е. coli
34
Е. соИ
629
249
:з,7
266
±4,1
23
±4.9
19
±3,8
Е. coli
630
260
Ьз,9
27
±5.2
Е. coli
358
Е. coli
018
257
±3.5
243
±3.7
17
±4.1
21
±3.1
Примечание: данные представляют среднее из трех определений и средн
* Стандартный штамм вульгарного протея, полученный из Всесоюзного
6иологическ1а и медицинских препаратов им. Л. Л. Тарасевича.
** Дикий штамм вульгарного протея. 1010 — номер в журнале регистра
бактерий на кафедру микробиологии Кубанского медицинского института.
Таблица 5
Перекрестное сиязываиис 70S рибосом, выделенных из грамотрицательиых
и грамположитсльных микроорга1П13мов, с мембранами грамотрицательных
и грамположительных бактерий в присутствии 5 мМ ацетата магния
и 50 мМ KCI в буферном растворе в мкг рРНК/мг мембранного белка
Мембраны
Е. coli MRE600
Эффективность связыва­
ний 70S рибосом из
Е. соИ MRE600
Эффективность связыва­
ния 70S рибосом из
М. luteus
257
±3.0
277
±3,5
М. luteus
264
265
±3,2
±3,7
Примечание: данные представляют среднее из трех определений и среднеквадратические ошибки.
3. РОЛЬ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ РИБОСОМ
И ИХ КОМПОНЕНТОВ В ПРОЦЕССЕ СЕКРЕЦИИ БЕЛКОВ
Какую роль играют основные рибосомные белки и рРНК в
процессах секреции неизвестно. Однако в последние годы рядом
авторов, в том числе и исследованиями, проведенными в нашей
лаборатории, в структуре рибосом, кроме основных структурных
белков, обнаружены белки, ассощнфованные и рибосомами, моЛЬкулярная масса которых значительно больше основных рибосомных белков. Прочность связывания белков, ассоциированных
с рибосомами, и выполняемые ими функции во многом остают­
ся неясными.
Процесс секреции белков и эукариотических клеток изучен
более детально, чем у прокариотических. Рибосомы, синтезиру­
ющие секреторные белки в эукариотических клетках, направля­
ются в систему эндоплазматического ретикулума с помощью
специального класса рибонуклеопротеидных частиц, получивших
название сигнальных узнающих частиц (SRP-частиц), которые в
клетке проделывают для этих целей специальный цикл (Walter
et. al., 1984). Структур, аналогичных SPR-частицам, в прока­
риотических клетках не обнаружено.
Универсальной моделью для изучения секреции белков у про­
кариот является кишечная палочка. У нее к настоящему вре­
мени картировано более 20 генов, мутации в которых приводят
к частичной или полной остановке процесса секреции.
16
Цитоплазма
АЗР+Pi
Цатоплазнатаческая мембрана
периплазма
Рис. 1. Схема взаимодействия белковых компонентов секреторного аппарата
у кишечной палочки на примере секреции Отр А белка (Yill et al., 19S9)i. Т.
•Ф. — триггерный фактор. Sec А, Sec Y — белковые факторы секреции,
рОтр А — предшествешшк Отр Л.
17
Некоторые продукты этих генов в настоящее время выделены
в чистом виде и в большей или меньшей степени изучены их
свойства. Так, одним из продуктов генов, которые контролируют
процесс секреции у прокариот, является белок с молекулярной
массой около 70 кД, обнаруженный в составе 505-рибосомных
субьединиц (Сгооке et al., 1988, а, в; Yill et al., 1988). Два
других белка являются продуктами генов Sec А и Sec Y. Белок
Sec А — поверхностный мембранный белок с молекулярной
массой 101, 9 кД, обладающий АТФазной активностью (Schmidt
et al.l988; Kawasaki et al., 1989). Белок Sec Y является ин­
тегральным мембранным белком с сильно выраженными гидро­
фобными свойствами и молекулярной массой 49 кД (Cerrectti et
al., 1983). Выделены продукты и некоторых других генов, кон­
тролирующих процессы секреции, однако их свойства и выпол­
няемые ими функции изучены еще не в полной мере.
Предложена схема взаимодействия описанных выше компонен­
тов в процессе транслокации белка через фосфолипидный бислой
in vitro на примере белка наружной мембраны кишечной па­
лочки Отр А (рис. 1). Согласно этой модели, на рибосоме
образуется комплекс синтезирующегося пре Отр А белка с
триггерным фактором. После завершения синтеза пре Отр А
этот комплекс покидает рибосому, после чего он связывается с
белками Sec А и Sec Y на мембране. Это в свою очередь
приводит к стимуляции гидролиза АТФ белков Sec А, и секретируемый белок транслоцируется через мембрану. После этого
триггерный фактор освобождается из комплекса, попадает в ци­
топлазму и может вновь связываться с рибосомами, которые
синтезируют секреторный белок.
При исследовании белкового состава 50S субъединиц Е. соИ
MRE600 трех субклеточных фракций: гиалоплазменной, нуклеоидной и мембранной — нами обнаружено в структуре 50S
субъединиц гиалоплазменной фракции два дополнительных белка
с молекулярной массой 102 кД и 72 кД. В нуклеоидной и
мембранной фракциях эти белки представлены минорными поло­
сами. Молекулярные массы обнаруженных нами белков очень
близки молекулярным массам белка Sec А и триггерного фак­
тора. Учитывая, что белок Sec А обладает АТФазной активно­
стью и почти полное совпадение молекулярной массы обнару­
женного нами белка с молекулярной массой белка Sec А, пред­
ставляло интерес определить АТФазную активность 50S-PH6OCOMных субъединиц всех субклеточных фракций.
18
Фосфогидролазная активность* 505-рибосомных субъединиц рахличны
Фосфогидролазная активность
Фракция 505-рибосо.мных субъединиц
Нативные
505-риб
Обработанные
50
мкМ/мл
ДЦК
100
Л**
р***
Л
Г
А
Гиалоплазменные
37,2
±1,2
6,4
±0.6
35,4
±1,1
5,9
±0.5
38,2
±1,3
Нуклеоидные
11,9
±1.1
2,0
±0,3
10,6
±0,9
1,8
±0.2
11,2
±0.9
Мембранные
12.3
±1,2
2,1
±0,2
11,8
±1,1
1.9
±0.2
12,2
±0.9
Примечапис:* — фосфогидролазная активность выражена в нМ Pi/мин.
А** — АТФазная активность;
Г*** — ГТФазная активность.
Данные представляют среднее из трех определений и среднеквадратичны
Как видно из табл. 6, АТФазная активность 50S субъединиц
гиалоплазмы составляет 37 нМ Pi/мин. на мг белка, а 50S
субъединиц нуклеоидной и мембранной фракций 1169 и 12,3
нМ Pi/мин. белка соответственно.
Как видно, АТФазная активность коррелирует с уровнем со­
держания в 505-рибосомных субъединнц белка с молекулярной
массой 102 кД.
При фракционировании рибосом на субклеточные фракции не
исключена возможность загрязнения их Н — АТФазным ком­
плексом или растворимой АТФазой (комплекс Fi). Для исклю­
чения этой возможности АТФазная активность 508 субъединиц
была изучена в присутствии N, N — дициклогексилкарбомида
(ДЦКД), который блокирует активность протонной АТФазы и в
присутствии азида натрия, который является известным ингиби­
тором фактора Fi. Ни ДЦКД, ни азид натрия не блокировали
АТФазной активности 505-рибосомных субъединиц. Трехкратное
промывание 508-рибосомных субъединиц буферным раствором,
содержащим 1 М хлорида аммония, приводит к полному уда­
лению дополнительных белков из рибосомных субъединиц. Рибосомные субъединицы, лишенные дополнительных белков, полно­
стью теряют АТФазную активность. Таким образом, АТФазная
активность 505-субъединиц обусловлена наличием в их структу­
ре дополнительных белков.
Использовав метод перекрестного иммуноэлектрофореза, нам
удалось показать, что белок с молекулярной массой 102 кД
образует выраженный пик преципитации с антисывороткой, пол­
ученной против антигенов внутренних мембран Е. coli MRE600.
Этот факт свидетельствует о том, что этот белок присутствует
как в структуре 505-рибосомных субъединиц, так и в структуре
внутренних мембран Е. coli MRE600.
На основании этих данных можно предположить, что после
программирования рибосомы мРНК, кодирующей синтез секретор­
ного белка, синтез его начинается в цитоплазме. Появление за
пределами рибосомы последовательности из 15-30 аминокислот­
ных остатков служит сигналом для распознавания такой рибо­
сомы белков Sec А и триггерным фактором. Это приводит к
замедлению или остановке процесса трансляции. Следующим
этапом является распознавание таким комплексом интегрального
мембранного белка Sec Y, а возможно, и других интегральных
белков мембраны, таких, как Sec D и Sec Е с переходом
20
белка Sec А из структуры рибосомы в состояние поверхностного
мембранного белка. Его АТФазная активность может быть ис­
пользована для поддержания в активном состоянии трансляционно-транслокационного комплекса, а таже триггерного фактора и
белков Sec В и Gro El, обладающих анфолдазной активностью.
Мы предлагаем следующую схему, отражающую последова­
тельность описанных выше событий, происходящих в процессе
взаимодействия компонентов аппарата секреции у кишечной па­
лочки (рис. 2).
Таким образом, из приведенных данных очевидно, что до­
полнительные рнбосомные белки играют важную роль в процес­
сах секреции у прокариот.
Как уже говорилось выше, в структуре рибосом грамотрицательных и грамположительных бактерий, выделенных без исполь­
зования в буферном растворе хлорида аммония, обнаружены
ассоциированные с ними белки. Используя антисыворотку, пол­
ученную к препаратам бактериальных мембран с помощью ме­
тода перекрестного иммунофореза и двойной радиальной иммунодпффузни по Ухтерлони, обнаружено иммунологическое родст­
во Р[ибосомных белков с белками мембранных структур бакте­
рий. Дополнительные белки рибосом удаляются
из них
трехкратным промыванием рибосом буфером, содержащим 1М
хлорида аммония. Удаление дополнительных рибосомных белков
буфером, содержащим 1М хлорида амония, приводит к утрате
иммунологического родства таких рибосом к антисыворотке, пол­
ученной против препарата бактериальных мембран. Отделенные
хлоридом аммония дополнительные рнбосомные белки, после
удаления их путем диализа против буфера, не содержащего
хлорида аммония, вновь встраиваются в структуру рибосом. Ре­
конструированные таким образом рибосомы восстанавливают им­
мунологическое родство к антисыворотке против препарата бак­
териальных мембран.
^ Полученные результаты свидетельствуют о том, что именно
днссоциированные с рибосомами белки определяют иммунологи­
ческое родство рибосом с мембранными белками.
Полученные данные необходимо учитывать при разработке
высокоэффективных рибосомных вакцин против различных возбу­
дителей инфекционных заболеваний. Разработкой таких вакцин
в настоящее время занимается ряд исследователей в США,
СССР, Канаде, Японии, Франции и ряде других стран.
21
/75РИПЛАЬЬЛ^
Рис 2. Схема взаимодействия белковых компонентов секреторного аппарата
у кишечной палочки Т. Ф. — трнггерный фактор. Sec А, Sec Y —
белковые факторы секреции, КЛ — кардиолипин, ФГ — фосфатидилглицерни, ФК — фосфатидная кислота, LP — лидерная пептидаза.
22
Иммуногенность бактериальных рибосом была описана в 1965
г. (Youmans А., Youmans J,. 1965). Исследовались иммуногенные
свойства рибосом сальмонелл, кишечной палочки различных шигелл, клебсибелл, синегнойной палочки, менингококков, гонокок­
ков, стрептококков, включая стрептококки пневмонии, стафило­
кокков, гемофильной палочки, возбудителей туляремии, бруцел­
леза, чумы, коклюша, холерного вибриона, лептоспир, простей­
ших грибов (Левинсон и др., 1978; Левинсон, Субботина, 19781
Субботина и др., 1979; Angerman, Eisensten, 1980; Джикидзе и
др., 1981; Thomas, Weiss, 1981; Левинсон и др., 1984).
Особенности механизма защитного действия рибосомных вак­
цин нельзя считать окончательно выясненными.
По мнению одних авторов, рРНК попадает в клетки и
репродуцируется в них с помощью обратной транскриптазы. Та­
ким образом, по их мнению, возникает резистентность к бак­
териям, независимо от антител и факторов клеточного иммуни­
тета (Youmans А., Youmans J., 1965).
При изучении ряда других экспериментальных инфекций за­
щитный эффект рибосомных препаратов имеет иммунологическую
природу с участием как гуморальных, так и клеточных факто­
ров иммунитета. Вторая пгаотеза о механизме действия рибо­
сомных вакцин была предложена при разработке вакцины 'из
S. tuphimurium. Авторы считают, что главным иммуногенным
фактором являются рибосомные белки (Angerman, Eisensten,
1980).
Высказывается и третье предположение, которое основывается
на данных о том, что препараты рибосом содержат то или
иное количество антигенов клеточной оболочки, капсульные пол­
исахариды, белки клеточной стенки и др. Авторы предполагают,
что «контраминирующие» антигены как раз и обуславливают
иммуногенное действие рибосомных вакцин (Thomas, Weiss,
1981).
На основании данных, полученных нами и рядом других
авторов, о наличии дополнительных белков в структуре бакте­
риальных рибосом, иммунолотчески родственных мембранным
белкам, можно полагать, что эти белки играют существенную
роль в нммуногениости рибосом.
Таким образом, вопрос о протективном факторе рибосомных
вакцин весьма противоречив и далек от разрешения.
Можно полагать, что одним из этапов исследований в этом
направлении будет изучение иммуногенности и протективной ак23
тивности рибосом прокариотических и эукариотнческих клеток,
находящихся на тех или иных этапах их экспериментальной
разборки с различным количеством белков в их структуре.
Препараты таких рибосом, возможно, могут быть использованы
для реабилитации иммунной системы как при инфекционных
заболеваниях, так и при иммунодефицитах различного характе­
ра.
ВЫВОДЫ
в работе изучена роль мембранных структур в процессах
компартментализации и ассоциации рибосом у бактерий, в ре­
зультате чего выявлен ряд новых закономерностей этого явле­
ния.
1. Установлено, что рибосомы не только ассоциированы с
мембранами, но и заключены в мембранные пузырьки, обнару­
живаемые на элекронограммах. Практически полное отделение
рибосом от мембран происходит в результате обработки их уль­
тразвуком в буферном растворе, содержащем ДНКазу, РНКазу
и пуромицин.
2. Показано, что наибольшее количество рибосом на всех
стадиях роста обнаруживается в нуклеоидной и мембранной
фракциях. Остановка роста бактерий сопровождается перераспре­
делением рибосом между фракциями клеток — относительное
содержание рибосом в гиалоплазме возрастает, а в мембранной
фракции уменьшается.
Такое перераспределение рибосом говорит о том, что в экс­
поненциально растущих клетках синтез секретируемых белков
осуществляется более интенсивно, чем в клетках, находящихся
в стационарной фазе роста.
3. Содержание активных, т. е. непосредственно занятых в
трансляции рибосом в бактериальной клетке в значительной ме­
ре зависит от стадии роста культуры. Клетки, находящиеся в
экспоненциальной фазе роста, содержат значительно большее ко­
личество активных рибосом (60-70%) по сравнению с клетками,
находящимися в стационарной фазе роста (40-50%).
4. Установлено, что наружные мембраны кишечной палочки
in vitro в 10 раз хуже связывают 50S субъединицы, чем
внутренние. Это свидетельствует о наличии в структуре внут­
ренних мембран бактериальной клетки участков, расположенных
24
с внутренней стороны, с которыми связываются 50S субъедини­
цы рибосом.
5. Обработка внутренних мембран антителами, полученными
против мембранных белков, почти в 4 раза снижает эффектив­
ность связывания 50S субъединиц, поэтому можно полагать, что
эти участки представлены белками или белком.
6. В структуре рибосомных субъединиц 70S рибосом обнару­
жены ассоциированные с ними белки. Эти белки обнаруживают
иммунологическое родство с определенными мембранными белка­
ми.
Поэтому они, выполняя свои функции в процессе секреции
белка, могут находиться определенное время в структуре рибо­
сом, и на последующих этапах транслокации белка через фосфолипидный бислой становиться поверхностными белками мемб­
ран.
7. Ассоциированные с рибосомами белки могут быть удалены
из их структуры промыванием препарата буферным раствором,
содержащим 1М хлорида аммония. Эта процедура приводит бо­
лее чем к трехкратному снижению эффективности связывания
505-рибосомных субъединиц с мембранными структурами. Следо­
вательно, белкам, ассоциированным с рибосомами, принадлежит
существенная роль в удержании их на поверхности мембраны
в процессе секреции белков.
8. Предложена модель секреции белка, предусматривающая
участие в этом процессе ассоциированных с рибосомами белков,
мембранных белков, а также фосфолипидов. Она построена с
учетом моделей, предложенных другими авторами.
9. Установленный нами факт наличия в структуре рибосом
зактерпй ассоциированных с ними белков необходимо учитывать
лри получении препаратов рибосомных вакцин, производство ко­
торых в последние годы разрабатывается как в СССР, так и
за рубежом. При детальном изучении иммуногениых свойств
зибосом они могут быть использованы как препараты для имк1унореабилнтации больных, у которых заболевания сопровожда­
ется развитием иммунодсфпцитов.
.25
с п и с о к РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Эффективность биосинтеза рибосомами белка у Е. соИ
(Коротяев А. И.). — //Микробиология. 1969. Т. 37, № 2,
с.205-210.
2. Кинетика основных бносинтетических процессов у рекомбинантов Е. соИ и Sh. sonnei, содержащих различные типы
R-(l)aKTopoB (Коротяев А. И., Астапов А. А.). — //Всесоюзное
совещание «Внехромосомиые факторы наследственности у бакте­
рий», — М., 1969, С.39.
3. Необычный характер изменения массы ДНК у некоторых
штаммов Е. coli. (Коротяев А. И., Максимов В. Ф., Ширяева
М. Н. и др.). — //Докл. АНСССР, 1970, т.7 194, № 6,
с.1433-1436.
4. Влияние антибиотиков на биосинтез белка и нуклеиновых
кислот в антактных клетках кишечной палочки, несущих Rфакторы (Коротяев А. И., Астапов А. А.), //Антибиотики, 1971,
№ 9, с.797-801.
5. Активность белоксинтезирующей системы и характер выра­
жения генома у Е. coli (Коротяев А. И., Карасева Э. В.).
//Биолог, науки, 1971, № 5, с.86-90.
6. Универсальная постоянная белоксинтезирующей системы Е.
coli (Коротяев А. И., Фукшанский Л. Я., Положенцев Б. И.,
Карасева Э. В.). //Микробиология, 1972, т.11, № 4, с.607-612.
7. Некоторые характеристики рибосом Е. coli после прекра­
щения роста культуры (Клячко Е. В., Шакулов Р. С ) . //Би­
охимия, 1974, т. 39, № 2, с.426-431.
8. Рибосомальный аппарат бактерий. Активная регуляция со­
держания рибосом (Коротяев А. И., Лищенко Н. Н.). //V съезд
Всесоюзного, микробиологического общества. Тез. докл., Ереван,
1975, с. 15-16.
9. Скорость синтеза полипептидной цепи и механизм функ­
ционирования рибосом у бактерий (Коротяев А. И.). //V съезд
26
Всесоюзного микробиологического общества. Тез. докл., Ереван,
1975, с.29-30/
10. Внутриклеточное размещение рибосом у Е. соИ. (Коротяев
А. И, Лищенко Н. Н., Журавлев Ю. Н.). //Молекулярная
биология и медицинская генетика. Симферополь, 1975, т. 66,
вып. 1, C.I5-19.
И. Сравнительное изучение стабильности рибосом кишечной
палочки на различных этапах ее роста (Зенцова О. А.). / /
Молекулярная биология бактерий. Краснодар, 1977, с.57-64.
12. Регуляция содержания рибосом у бактерий в зависимости
от условий их культивирования (Князев А. И., Лищенко Н.
Н., Наумов Г. Н.). //Вопросы биохимии и физиологии микро­
организмов. Саратов, 1977, с. 91-102.
13. О природе щелочелабильности ДНК (Коротяев А. И.,
Кроличенко Т. П.). //Биохимия и биофизика микрорганизмов.
Горький, 1978, с.15-18.
14. РНК-фрагменты в ДНК бактерий (Коротяев А. И., Кро­
личенко Т. П.). //VI съезд Всесоюзного микробиологического
общества. Метаболизм микроорганизмов и его регуляция. Тез.
докл. Рига, 1980, Т. 3, с.47.
15. Итоги 10-летних исследований бактериальной ДНК (Ко­
ротяев А. И., Кроличенко Т. П.). / / Т е з . докл. к науч. конф.
ин-та. Краснодар, 1980. с. 236-238.
16. Присоединение 70S рибосом к мембранным структурам Е.
соИ (Коротяев А. И., Кроличенко Т. П.). Биохимия, 1980, т.
3, вып. 8, с.1481-1487.
17. О присутствии в составе бактериальной ДНК ковалентно
связанных с ней фрагментов РНК (Коротяев А. И., Кроличенко
Т. П.). //Виол, науки, 1983, № 12, с. 27-31.
18. Связывание 3 0 S - и 505-рибосомных субъединиц с мем­
бранами Е. соИ in vitro. //VII Сев.-Кав. конф. по иммунол. и
молекул, биол. Тез. докл. Краснодар, 1983. с. 240-241.
19. Роль белок-белковых взаимодействии в связывании 3 0 S и 505-рибосомных субъедитщ с внутренними мембранами ки­
шечной Г1алочки. //Функция иммунной системы в инфекционном
и неннфекционном процессе. Молекулярная биология бактерий.
Краснодар, 1984. С. 134-138.
20. Хромосомы, рибосомы и клеточный цикл у бактерий
(Кроличенко Т. П., Лищенко Н. Н.). //Достижения микробио­
логии на практике: Тез. VII Всесоюзн. микробиол. об-ва. Гене­
тика и генная инженерия. Алма-Ата, 1985, т. 3, с.40.
27
21. Характеристика штаммов кишечной палочки, резистентных
к полимексину (Сидоров И. А., Дорохина О. В., Караева Л.
Д,). //Всесоюзный семинар «Современные проблемы антибиотикорезистентности». М., 1988, с. 37.
22. Связывание 505-рибосомных субъединиц с внутренними
мембранами кишечной палочки. //Актуальные вопросы иммуно­
логии и иммунопатологии. Изд-во Ростовского университета,
1988. с. 35-36.
23. Специфичность связывания 505-рибосомных субъединиц с
плазматическими мембранами кишечной палочки. //Регуляция
микробного метаболизма. Всссоюзн. конф. Пущино, 1988. с.80.
24. Особенности механизма секреции белков эукариотическими
и прокарнотичсскими клетками. //Физиология пищеварения и
всасывания. Тез. докл. XV Всесоюзн. конф. Краснодар, 1990, с.
208-209.
25. Иммунологическая специфичность рибосом бактерий, со­
держащих дополнительные белки. //Реабилитация иммунной си­
стемы. Тез. II Международного симпозиума. Дагомыс, 9-11 ок­
тября 1990 г., C.362.
26. Белки, ассоциированные с 508-рибосомными субъединица­
ми Е. соИ MRE600 (Наумов Г. Н.). //Мол. генетика, 1992. №
1, с.3-7.
КЧПО 357100, г. Черкесск, ул. Первомайская, 47.
Заказ № 2869.
28