- nashaucheba.ru

Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное агентство по образованию Российской Федерации
ГОУ ВПО «Алтайский государственный технический университет
имени И.И. Ползунова»
Общероссийская общественная организация
«Ассоциация инженерного образования России»
О. Ю. Сартакова
ПРОМЫШЛЕННАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
Учебное пособие
Изд-во АлтГТУ
Барнаул 2009
1
УДК 663.18(075.8)
Сартакова, О.Ю. Промышленная микробиология: учебное пособие по курсу «Основы микробиологии и биотехнологии» / О.Ю. Сартакова; Алт. гос.техн.ун-т им. И.И. Ползунова – Барнаул: Изд-во
АлтГТУ, 2009 . – 173 с.
В учебном пособии представлены общие сведения о микроорганизмах, их морфологические и физиологические характеристики; рассмотрены основы биотехнологического производства. Представлены
примеры и способы применения биотехнологических процессов в решении экологических задач, а также примеры получения важнейших
продуктов биотехнологии.
Учебное пособие по курсу “Основы микробиологии и биотехнологии” предназначено для студентов всех форм обучения специальности «Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов».
Рецензенты: О.В. Филатова, д.б.н., профессор кафедры «Физиологии
человека и животных» АГУ;
Ю.Г. Поморова, к.б.н., доцент кафедры «Безопасность
жизнедеятельности» АлтГТУ
Допущено научно-методическим советом АлтГТУ для
внутривузовского использования в качестве учебного пособия
для студентов специальности 280201 «Охрана окружающей
среды и рациональное использование природных ресурсов»
2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................... 6 1 ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ ................................................... 7 1.1 Общие сведения о микроорганизмах ................................... 8 1.2 Распространение микроорганизмов в природе ................. 9 1.3 Морфологическая характеристика отдельных групп микроорганизмов ....................................................................... 11 1.3.1 Структура эукариотической клетки.................................... 11 1.3.2 Структура прокариотической клетки ..................................... 15 1.3.3 Ультрамикробы ........................................................................ 18 1.3.4 Бактерии .................................................................................... 21 1.3.4.1 Спорообразование у бактерий ........................................ 24 1.3.4.2 Движение бактерий ......................................................... 25 1.3.4.3 Размножение бактерий .................................................... 25 1.3.4.4 Питание бактерий ............................................................ 26 1.3.4.5 Типы питания ................................................................... 26 1.3.4.6 Систематика бактерий .................................................... 26 1.3.5 Актиномицеты .......................................................................... 28 1.3.6 Грибы ........................................................................................ 29 1.3.7 Водоросли ................................................................................. 30 1.3.8 Простейшие .............................................................................. 33 1.3.9 Коловратки................................................................................ 41 2 ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ................................................... 42 2.1 Объекты биотехнологии ....................................................... 43 2.2 Прошлое и настоящее биотехнологии ................................ 44 2.3 Перспективы развития биотехнологии ............................... 47 2.4 Основные виды биотехнологической деятельности микроорганизмов ....................................................................... 48 2.5 Преимущества биотехнологических процессов ................. 50 3 ТИПОВАЯ СХЕМА И ОСНОВНЫЕ СТАДИИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ ................................... 50 4 ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ БИОКАТАЛИЗА И53 БИОТРАНСФОРМАЦИИ .............................................................. 53 4.1 Основные группы биотрансформаций ............................... 56 4.2 Основные виды реакций биокатализа ................................ 57 4.3 Классификация ферментов ................................................ 57 3
4.4 Преимущества и недостатки биокаталитических
процессов………………………………………………………………………… 58 4.5 Основные понятия иммобилизации ферментов ............... 58 4.6 Методы иммобилизации ферментов ................................. 60 4.7 Оценка качества иммобилизованных ферментов и метода иммобилизации ............................................................. 63 4.8 Примеры использования ферментов .................................. 64 5 ФЕРМЕНТАЦИЯ ....................................................................... 65 5.1 Классификация процессов ферментации .......................... 65 5.2 Основные параметры периодической ферментации ........ 66 5.3 Понятие скорости роста ........................................................ 67 5.4 Фазы периодической ферментации ................................... 67 5.5 Преимущества и недостатки периодической фермнтации……………………………………………………………………………. 69 6 ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ ........................... 69 6.1 Биотехнологические процессы в решении экологических задач ................................................................... 70 6.2 Примеры блок‐схем микробиологической очистки стоков и почвы ............................................................................ 74 6.3 Биохимические методы очистки воды ............................... 76 6.3.1 Микробная ассоциация и технологические условия методов
биохимической очистки воды .......................................................... 76 6.3.2 Очистка воды в аэротенках ..................................................... 80 6.3.3 Очистка воды в биофильтрах .................................................. 82 6.3.4 Комбинированные сооружения аэробной биохимической
очистки воды ..................................................................................... 83 6.3.5 Процессы нитрификации и денитрификации ........................ 84 6.3.6 Методы обработки осадка ....................................................... 88 6.3.7 Аэробная стабилизация осадка ............................................... 90 6.3.8 Метановое брожение (биометаногенез) ................................ 91 6.3.8.1 Этапы метанового брожения .......................................... 92 6.3.8.2 Химизм процесса метанового брожения ....................... 93 6.3.8.3 Микробная ассоциация биометаногенеза ...................... 93 6.3.8.4 Сырье биометаногенеза................................................... 94 6.3.8.5 Технологические режимы и аппаратурное
оформление процесса метанового брожения ............................ 94 6.4 Биоценозы как индикаторы сапробности водоемов ........ 98 4
6.5 Применение биотехнологии в медицине ......................... 101 6.5.1Антибиотики ............................................................................ 101 6.5.2. Гормоны ................................................................................. 103 6.5.3 Вакцины, иммунные сыворотки и иммуноглобулины........ 105 6.5.4 Ферменты ................................................................................ 106 6.5.5 Биодатчики в медицине ......................................................... 109 6.6 Применение биотехнологии в энергетике ....................... 110 6.6.1 Законы биоэнергетики ........................................................... 112 6.6.2 Биологические мембраны, как преобразователи энергии .. 113 6.6.3 Характеристика растительного сырья как источника
энергии ............................................................................................. 113 6.6.4 Альтернативные источники энергии и их получение ......... 114 6.7 Производство пищевых продуктов и напитков ................ 120 6.7.1 Биотехнологические процессы в хлебопекарном производстве .................................................................................... 124 6.7.2 Биотехнология приготовления пива .................................... 131 6.7.3 Производство вина и спиртсодержащих продуктов ........... 136 6.7.4 Биотехнология приготовления кисломолочных продуктов и сметаны ...................................................................... 141 6.7.5 Биотехнологические процессы в сыроделии ....................... 143 6.7.6 Биотехнология приготовления маргарина ........................... 144 6.8 Химическая промышленность и биотехнология .............. 146 6.9 Сельское хозяйство и биотехнология ................................ 151 6.10 Биогеотехнология ............................................................. 152 6.10.1 Биогидрометаллургия .......................................................... 154 6.10.2 Выщелачивание куч и отвалов ............................................ 156 6.10.3 Бактериальное выщелачивание in situ ................................ 158 6.10.4 Выщелачивание минеральных концентратов в аппаратах ....................................................................................... 158 6.10.5 Микробиологический способ извлечения золота .............. 159 6.10.6 Биосорбция металлов из растворов ................................... 160 6.10.7 Обогащение руд.................................................................... 160 6.10.8 Извлечение нефти ................................................................ 161 6.11 Безопасность биотехнологических процессов ............... 162 ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ...................................................... 163 ГЛОССАРИЙ ............................................................................... 166 ЛИТЕРТУРА ............................................................................... 172 5
ВВЕДЕНИЕ
Микроорганизмы самые древние существа на нашей планете. С
момента их появления (приблизительно 3,6 млрд. лет тому назад) минеральная история Земли идет параллельно и взаимосвязано с эволюцией живого. Именно в результате геохимической деятельности микроорганизмов в окружающей среде произошло накопление определенных минералов, появились необходимые условия для возникновения и развития растений и животных, а также, в конечном счете, сформировалась биосфера планеты. Основную роль в поддержании биосферы в более или менее устойчивом состоянии путем осуществления круговорота необходимых для жизни элементов продолжают выполнять
микроорганизмы и в наши дни.
Человек, постоянно находясь в окружении микробов, издавна
ощущал проявления их жизнедеятельности, а некоторые из них использовал в своей практике. Уже в 5-6-м тысячелетии до н. э. человек
пользовался плодами деятельности микроорганизмов, не зная об их существовании. С давних времен люди занимаются виноделием, пивоварением, выпечкой хлеба, вымачиванием льна и некоторыми другими
производствами, в основе которых лежат микробиологические процессы. Повсеместно в окружающей среде человека происходило и в настоящее время происходит разложение различных веществ. И, наконец, во все времена человечество страдало от микроорганизмов, вызывающих инфекционные заболевания. Тем не менее, о мире микробов
люди узнали сравнительно недавно, что объясняется, в первую очередь, ограниченностью наших органов чувств. Глаз человека имеет
разрешающую способность примерно 100 мкм, а размеры подавляющего большинства клеток бактерий составляют 2-5 мкм. Попытки
преодолеть созданный природой барьер и расширить возможности органов зрения человека были предприняты еще в Древнем Вавилоне, где
изготовлялись увеличивающие линзы. Можно считать, что с изготовлением этих линз человек сделал первый шаг на пути в микромир и
стал осознано использовать микробов в своей хозяйственной деятельности.
Биотехнология - одна из самых старых и одновременно одна из
самых молодых наук и отраслей промышленности. Биотехнология - это
организованная человеком деятельность микроорганизмов, направленная на получение определенного продукта. В настоящее время биотехнология является одним из приоритетных направлений науки, с которым связывают благосостояние всего человечества в обозримом буду-
6
щем. При этом содержание, которое вкладывается в этот термин, зачастую существенно различается. Например, многие под биотехнологией
понимают использование растениеводства и животноводства для народного хозяйства - то, что обычно называют сельскохозяйственным
производством. Другое направление, также определяемое термином
«биотехнология», - применение различных генетических манипуляций
для получения трансформированных геномов любых живых объектов от вирусов до человека. От этого направления ожидают революционных изменений в качестве жизни человечества, и эти надежды вполне
обоснованны.
Однако достижения биотехнологии становятся реальной помощью народному хозяйству и отдельным людям лишь тогда, когда на их
основе создаются промышленные производства, функционирование
которых направлено на разработку практически ценных продуктов в
заметных, а не микроскопических количествах. Именно эта сторона
деятельности человека охватывается дисциплиной «Промышленная
биотехнология». Знания по этой дисциплине нужны не только непосредственно инженерам-биотехнологам, но также и инженерам-механикам, имеющим дело с оборудованием биотехнологических производств, и инженерам-экологам при работе с этими производствами.
Изучение биотехнологических процессов невозможно без знаний
основ микробиологии, а именно морфологии и систематики микроорганизмов.
1 ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ
Микробиология прошла длинный путь развития, исчисляющийся
многими тысячелетиями. Микробиология зародилась задолго до нашей
эры, в своем развитии она прошла несколько этапов, не столько связанных хронологически, сколько обусловленных основными достижениями и открытиями. Историю развития микробиологии можно разделить
на пять этапов: эвристический, морфологический, физиологический,
иммунологический и молекулярно-генетический.
Эвристический период, 4-3 тыс. лет до н. э. – XVI в. н. э., связан
скорее с логическими и методическими приемами нахождения истины,
чем с какими-либо доказательствами и экспериментами.
С изобретением микроскопа Антони Ван Левенгуком начинается
следующий этап в развитии микробиологии, получивший название
морфологический. В 1695 году была издана книга «Тайны природы,
открытые Антонием Левенгуком». Этот период длится до второй половины XIX века.
7
XIX век, особенно его вторую половину, принято называть физиологическим периодом развития микробиологии. На этом этапе
проходят исследования по изучению жизнедеятельности микробов.
Этот период связан с именами Луи Пастера, Роберта Коха и Александра Флеминга.
Работы Луи Пастера по вакцинации открыли новый этап в развитии микробиологии, получившего название иммунологического. В
этот период в 1901 году создает фагоцитарную теорию иммунитета
И.И. Мечников, за которую ученый был удостоен Нобелевской премии.
С 50-х годов ХХ века начался молекулярно-генетический период развития микробиологии. Он связан с открытием новых антигенов,
например, опухолевых (Л.А. Зильбер), с расшифровкой строения антител – иммуноглобулинов, с получением вакцин (вакцина гепатита В,
малярии и др.), с разработкой принципиально новых способов диагностики инфекционных и неинфекционных болезней, созданием на основе этих способов тест-систем для идентификации микроорганизмов.
1.1 Общие сведения о микроорганизмах
Микробиология - это наука о микроорганизмах, относящихся к
различным систематическим группам - вирусам, бактериям, водорослям, грибам, простейшим. Общим признаком перечисленных организмов является их микроскопический размер на протяжении всей жизни.
Мир микроорганизмов очень разнообразен. Клетки одних микробов по
своей структуре напоминают животные клетки, у других сходны с растительными, третьи могут сочетать признаки тех и других клеток или
существенно отличаться от них.
Микроорганизмы, большинство которых состоит из одной клетки, отличаются от животных и растений простотой биологической организации. Это дало основание Э. Геккелю объединить их в третье
царство живой природы и дать ему название «царство протистов». Основу строения клеток всех протистов, как и клеток высших животных
и растений, составляют цитоплазма (или «живое вещество» клетки) и
ядро. Однако развитие электронной микроскопии позволило выявить
принципиальное различие в строении клеток протистов и разделить их
на две четко различающиеся группы: высшие протисты – эукариоты и
низшие протисты – прокариоты, или доядерные организмы. Важнейшими признаками, отличающими эукариотическую клетку от прока-
8
риотической, являются структурная организация ядерного материала и
способ его деления.
Клетки эукариотов имеют обособленное ядро, отделенное от
цитоплазмы мембраной. Наследственная информация заключена в хромосомах. Содержащих дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и белки особого типа. Деление ядра при размножении клеток происходит в
результате сложного процесса – митоза. К эукариотам относятся простейшие, водоросли (кроме сине-зеленых) и грибы.
В клетках прокариотов истинное ядро отсутствует, но есть
ядроподобные образования – нуклеоиды (от лат. nukleus – ядро). По
сравнению с ядрами клеток высших протистов они имеют более простое строение и не отделены от цитоплазмы оболочкой. Наследственную информацию несет одна хромосома, представляющая собой длинную молекулу ДНК. Группу низших протистов – прокариотов составляют бактерии и сине-зеленые водоросли, которые в настоящее время
чаще называют цианобактериями.
Вирусы, как неклеточные формы жизни, выделены в отдельную
группу.
1.2 Распространение микроорганизмов в природе
Вследствие малых размеров, а также способности усваивать самые разнообразные вещества в качестве источников питания, легко
приспосабливаться к условиям внешней среды, микроорганизмы широко распространены в природе и могут быть обнаружены там, где отсутствуют другие формы жизни. Естественной средой обитания микроорганизмов являются почва, вода и организмы человека и животных.
Воздух не является благоприятной средой для развития микробов, поскольку не содержит капельножидкой воды, но, попадая в воздух с поверхности земли или предметов вместе с пылью, многие микроорганизмы могут временно сохранять жизнеспособность.
Численность и видовой состав микроорганизмов, населяющих
почву, определяется наличием в ней влаги и питательных веществ, реакцией среды, температурой, степенью аэрации. Почва, кроме самого
верхнего слоя, служит микроорганизмам защитой от губительного действия прямых солнечных лучей. Почва является местом обитания разнообразных видов бактерий, водорослей, грибов, простейших. Наиболее богаты микроорганизмами хорошо обработанные почвы. Число
бактерий в 1 г почвы может составлять несколько миллионов, водорослей – до 100 тыс., грибов – десятки тысяч. Микроорганизмы, насе-
9
ляющие почву, обладают колоссальной общей поверхностью. Так, в
пахотном слое 1 га почвы поверхность микробных клеток составляет
около 500 га. Именно этим и объясняется чрезвычайно активное воздействие микроорганизмов на почву. Большинство бактерий развивается в верхнем слое почвы глубиной 15 – 20 см. Водоросли развиваются в слое до 10 см и иногда вызывают обильное цветение почвы.
Выделяя кислород в процессе жизнедеятельности, они способствуют
аэрации почвы. В условиях хорошей аэрации верхнего слоя интенсивно развиваются микроскопические грибы. В почве широко представлены черви и личинки насекомых, которые рыхлят почву, обеспечивая
проникание кислорода в более глубокие слои.
Микронаселение водных объектов, его численность и видовое
разнообразие определяются, прежде всего, степенью загрязненности
воды, т.е. наличием в ней органических веществ. Гидробионты - обитатели водной среды – относятся к различным систематическим группам. В природных водоемах могут развиваться водоросли, бактерии,
простейшие, грибы. Для глубоко залегающих артезианских вод благодаря защищенности водоносных слоев обычно характерно почти полное отсутствие микроорганизмов. Воды открытых водоемов отличаются разнообразием и непостоянством химического состава и микробного
населения. Численность последнего зависит от ряда причин: заселенности прибрежных районов, количества атмосферных осадков, времени года и т.д., поскольку они обусловливают характер и степень загрязненности водоема. Особенно много микроорганизмов в водных источниках вблизи крупных городов. Значительно возрастает число бактерий в водоемах после дождя и в период весеннего половодья. В зимний период численность гидробионтов резко уменьшается. Наиболее
богаты микроорганизмами сточные воды. Число бактерий в 1 мл сточной воды может превышать 1 млрд. Источником микроорганизмов
бытовых сточных вод являются физиологические выделения человека
и его хозяйственная деятельность. Некоторые виды производственных
сточных вод содержат специфические микроорганизмы, используемые
в технологическом процессе производства лекарственных препаратов,
спирта, молочнокислых продуктов и т.д. Ливневые сточные воды загрязнены микробами, вымываемыми из почвы.
Микрофлора человека и животных. Многие микроорганизмы временно или постоянно обитают в полостях тела или на теле человека и
животных. От стабильности сложившегося в ходе эволюции баланса
между организмом и его микрофлорой и равновесия внутри микроб-
10
ных ассоциаций существенно зависит ход разнообразных процессов в
организме и, в конечном счете, его здоровье.
Оценивая качественный и количественный состав микрофлоры
человека и животных, необходимо подчеркнуть особое ее обилие и
разнообразие в различных отделах пищеварительного тракта. Наибольшее количество микробов обитает в толстой кишке и нижних отделах тонких кишок. Много их на слизистых оболочках полости рта
(микрококки, пневмококки, стрептококки, лактобациллы, дрожжи, актиномицеты и др.) и в зубном налете (лактобациллы, стрептококки и
спирохеты). На коже человека и животных постоянно обнаруживаются
стафилококки, энтерококки, сарцины, кишечная палочка и др. виды
семейства энтеробактерий. Свободны или почти свободны от микроорганизмов нижние органы дыхания, пищевод и желудок.
В последние годы в связи с широким применением антибиотиков,
иммунодепресантов и многих других биологически активных веществ
участились нарушения в составе микрофлоры (дисбактериозы), являющиеся причиной заболевания человека.
1.3 Морфологическая характеристика отдельных групп
микроорганизмов
Морфология – наука, изучающая внешний вид, структуру, форму
и размеры организмов. В природных и сточных водах наиболее часто
встречаются следующие группы микроорганизмов: ультрамикробы
(вирусы и фаги); бактерии; актиномицеты; грибы; водоросли; простейшие; коловратки.
1.3.1 Структура эукариотической клетки
Группа высших протистов представлена достаточно разнородными организмами, клетки которых сходны либо с животными, либо с
растительными клетками (рис.1). Цитоплазма и ядро клетки в совокупности образуют протопласт, окруженный снаружи цитоплазматической мембраной, пропускающей внутрь клетки только воду, очень небольшие молекулы некоторых органических веществ и ионы.
Цитоплазматическая мембрана у всех клеток имеет сходную
структуру (рис.2). Она состоит в основном из белков (до 70 %) и липидов (до 40 %). Большинство мембран содержит 2-5 % углеводов. В
мембране различают три слоя: внутренний слой образован фосфолипидами. К нему с обеих сторон примыкают белковые слои. Слои
11
подвижны друг относительно друга. В липидном слое имеются белковые мостики, через которые движется регулируемый поток веществ.
Строение мембраны делает ее прочной, подвижной и обеспечивает
свойство полупроницаемости. Вещества, растворимые в воде и жирах,
проходят через нее легче, чем растворимые только в воде. У всех микроорганизмов в поверхностных мембранах локализуются некоторые
ферменты, например ферменты-переносчики. Трехслойные мембраны
окружают многие клеточные органоиды.
Из таких же мембран состоят стенки ретикулума или эндоплазматической сети. Ретикулум пронизывает всю цитоплазму клетки,
образуя многочисленные каналы и полости. По ним к клеточным органоидам поступают необходимые питательные вещества и отводятся
продукты обмены. На поверхности клетки эндоплазматическая сеть соединяется с цитоплазматической поверхностной мембраной, вследствие чего возрастает суммарная поверхность клетки. Увеличение удельной поверхности способствует более интенсивному обмену веществ
между клеткой и окружающей средой.
Цитоплазма клетки является бесцветной, прозрачной, слегка
вязкой. Она представляет собой коллоидное образование, в котором
дисперсионной средой является вода, а дисперсной фазой – частицы
различной химической природы. В состав цитоплазмы входят белки,
жиры, сера и другие включения. Цитоплазма эукариотической клетки
находится в постоянном движении. Внутреннее пространство клетки
делится мембранами на более или менее изолированные отсеки, в каждом из которых протекают определенные биохимические процессы.
Цитоплазма непрерывно изменяется, поглощая новые вещества, подвергая их разнообразным химическим превращениям. Она способна
обновлять свою внутреннюю структуру, переводя питательные вещества в сложную структуру живого вещества. Цитоплазма клетки неоднородна. В ней обнаружены жизненно важные структурные образования - органеллы, выполняющие различные функции. Это – рибосомы,
митохондрии, комплекс Гольджи, лизосомы.
Рибосомы имеют вид мелких зернышек, локализованных во внутриклеточных мембранах, образующих эндоплазматическую сеть. Рибосомы богаты рибонуклеиновой кислотой (РНК). В них осуществляется синтез белка.
Митохондрии имеют округлую, овальную или палочковидную
форму. Размер их колеблется от 0,22 до 7 мкм. В митохондриях протекают окислительные процессы, сопровождающиеся образованием
энергии (дыхание).
12
Рисунок 1 - Структура эукариотической клетки
13
1 — молекулы липидов:
а — гидрофильная "голова"; б — гидрофобный "хвост";
2 — молекулы белков:
в — интегральная; г — периферическая; д — поверхностная.
Рисунок 2 - Модель строения элементарной цитоплазматической мембраны
Комплекс Гольджи представляет собой тельца серповидной или
палочковидной формы. Важнейшей функцией комплекса Гольджи является накопление продуктов обмена перед выводом их из клетки. Одним из продуктов комплекса являются лизосомы – округлые включения диаметром около 1 мкм, внутри которых сосредоточены ферменты, способные расщеплять питательные вещества.
Лизосомы – клеточные структуры (маленькие мембранные пузырьки), содержащие ферменты, способные расщеплять органические
вещества. Они способны переваривать не только пищу, попавшую в
клетку, но и части самой клетки, вышедшие из строя. При разрыве
мембраны лизосом ферменты проникают в цитоплазму и вызывают
растворение клетки.
К числу характерных функциональных особенностей, свойственных только эукариотам, относятся явления пиноцитоза и фагоцитоза. Сущность этих явлений состоит в переносе небольших ка-
14
пелек жидкости (пиноцитоз) или твердых частиц (фагоцитоз) в клетку в результате втягивания участка цитоплазматической мембраны
внутрь, отрыва образовавшегося мешочка и превращения его в вакуоль, которая сливается с лизосомой, при этом вещества, попавшие в
клетку, подвергаются гидролизу.
1.3.2 Структура прокариотической клетки
Строение клеток низших прокариотов значительно более простое
(рис.3). При этом различное строение ядерного аппарата не является
единственным признаком, отличающим эукариотическую клетку от
прокариотической.
Рисунок 3 - Изображение прокариотической клетки
Одним из основных структурных компонентов клетки прокариотов является клеточная оболочка (рис. 4, 5). В состав клеточной оболочки бактерий входят сложные молекулярные комплексы, состоящие
из белков, полисахаридов и жироподобных веществ. Будучи жесткой,
она служит как бы скелетом клетки, придавая ей определенную форму.
Клеточная оболочка прокариотов образует своеобразный барьер на пути прохождения растворенных веществ из окружающей среды внутрь
клетки. Клетки цианобактерий покрыты эластичной пектиновой оболочкой. У некоторых видов бактерий на поверхности клетки образуется слой слизи, образующий как бы футляр – капсулу.
15
1 — цитоплазматическая мембрана; 2 — пептидогликан;
3 — периплазматическое пространство; 4 — наружная мембрана;
5 — цитоплазма, в центре которой расположена ДНК
Рисунок 4 - Клеточная стенка грамположительных (А)
и грамотрицательных (Б) бактерий
А. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий
1 — цитоплазматическая мембрана; 2 — пептидогликановый слой;
3 — периплазматическое пространство; 4 — молекулы белков;
5 — фосфолипид; 6 — липополисахарид.
Б. Строение молекулы липополисахарида
1 — липид А; 2 — внутреннее полисахаридное ядро;
3 — наружное полисахаридное ядро; 4 — О-антиген
Рисунок 5 - Клеточная стенка грамотрицательных бактерий (А) и
строение молекулы липополисахарида (Б)
Слизь, выделяемая бактериями, может частично диффундировать
в окружающую среду. Выделение слизи у отдельных видов бактерий
бывает настолько сильным, что капсулы отдельных клеток сливаются,
16
образуя зооглеи – скопления слизистой массы с вкрапленными в нее
клетками. Образование слизи характерно и для многих видов цианобактерий.
К числу поверхностных структур клеток многих бактерий относятся жгутики – органы движения, представляющие собой длинные
очень тонкие нити, спиральные, волнистые или изогнутые (рис. 6).
1 — нить; 2 — крюк; 3 — базальное тело; 4 — стержень;
5 — L-кольцо; 6 — P-кольцо; 7 — S-кольцо; 8 — M-кольцо;
9 — ЦПМ; 10 — периплазматическое пространство;
11 — пептидогликановый слой; 12 — наружная мембрана
Рисунок 6 - Строение жгутика грамотрицательных бактерий
Длина жгутиков может во много раз превышать длину тела бактерии. Количество и расположение жгутиков являются характерным видовым признаком. Некоторые виды бактерий имеют один жгутик (монотрихи), у других жгутики располагаются пучками на одном или
обоих концах клетки (лофотрихи), у третьих имеется по одному жгутику на обоих концах клетки (амфитрихи), у четвертых они покрывают всю поверхность клетки (перитрихи).
К оболочке вплотную прилегает цитоплазматическая мембрана.
Она обладает избирательной проницаемостью - пропускает внутрь
клетки и отводит из нее определенные вещества. Благодаря такой способности мембрана играет роль органнеллы, концентрирующей питательные вещества внутри клетки и способствующей выведению наружу продуктов жизнедеятельности. Внутри клетки всегда наблюдает-
17
ся повышенное по сравнению с окружающей средой осмотическое давление. Цитоплазматическая мембрана обеспечивает его постоянство.
Кроме того, она является местом локализации ряда ферментных систем, в частности окислительно-восстановительных ферментов, связанных с получением энергии (у эукариотов они находятся в митохондриях). В отличие от клеток эукариотов в прокариотической клетке отсутствует деление ее на отсеки. Клетки прокариотов не имеют ни комплекса Гольджи, ни митохондрий, не наблюдается у них и направленного движения цитоплазмы. Явления пиноцитоза и фагоцитоза
прокариотам не свойственны. Из органелл только рибосомы аналогичны рибосомам эукариотов.
Во многих бактериальных клетках обнаружены особые мембранные структуры – мезосомы, образовавшиеся в результате втягивания
цитоплазматической мембраны внутрь клетки. Роль их до сих пор
окончательно не выяснена. Существуют предположения об участии
мезосом в важнейших внутриклеточных процессах деления клетки,
синтеза веществ клеточной оболочки, в энергетическом обмене.
В цитоплазме прокариотов часто обнаруживаются твердые,
жидкие или газообразные включения. Один из них имеют приспособительные назначения: например, газовые вакуоли цианобактерий, позволяющие им регулировать плавучесть в вертикальной плоскости.
Другие включения играют роль запасных веществ и откладываются
клеткой в условиях обильного питания. В качестве запасных веществ в
клетках могут откладываться полисахариды (гликоген, крахмал, гранулеза), липиды (в виде гранул и капелек жира), полифосфаты (такие как
волютин), вещества белкового характера (цианофициновые гранулы у
цианобактерий). У многих серных бактерий в клетках откладывается
молекулярная сера.
Рассмотрим отличительные морфологические признаки основных
групп микроорганизмов.
1.3.3 Ультрамикробы
В группу ультрамикробов входят вирусы и фаги.
Вирусы (от лат. virus – яд) отличаются от других микроорганизмов отсутствием клеточной структуры. Они не имеют ни ядра, ни оболочки, ни цитоплазмы. Размеры структурных единиц вирусов (вирионов) колеблются от 10 до 300 нм. В состав вирионов входят молекулы
РНК или ДНК, окружённые белковой оболочкой. Вирусы имеют разнообразную форму: кубическую, сферическую, палочковидную и дру-
18
гую. Размножение вирусов осуществляется простым делением или более сложным путём только внутри клеток живого организма. Вирусы
обладают специфичностью действия, то есть отдельные группы вирусов поражают определённые живые организмы. У некоторых вирусов
"прописка" очень строгая. Например, вирус полиомиелита может жить
и размножаться только в клетках (да и то не во всех) человека и приматов. Это, в частности, означает, что заразиться полиомиелитом можно
только от людей. Кроме того, многие вирусы передаются через переносчиков, роль которых нередко выполняют членистоногие (например,
клещи). Такие вирусы могут иметь широкий спектр хозяев, включающий как позвоночных, так и беспозвоночных животных. Профилактика
и лечение вирусных болезней также требует учета разнообразия
свойств и «повадок» вирусов.
Первым был обнаружен вирус табачной мозаики (рис. 7). Наиболее часто в воде встречаются энтеровирусы, развивающиеся в пищеварительном тракте человека и животных. Вирионы энтеровирусов имеют малые размеры (17-32нм). Они состоят из молекулы
РНК и белковой оболочки. Энтеровирусы устойчивы к высушиванию,
могут образовывать кристаллы кубического типа симметрии.
Особую группу вирусов представляют паразитические формы
микроорганизмов – фаги. Фаги, развивающиеся в клетках бактерий,
называются бактериофагами, актиномицет – актинофаги, грибов –
микофаги, водорослей – альгофаги. Фаги имеют булавовидную форму
(рис.8).
Рисунок 7 - Вирус табачной мозаики
19
Рисунок 8 - Бактериофаг
Утолщённая часть фага называется головкой, суженная часть –
хвостовой. Размеры бактериофагов изменяются в пределах от 50 до
100 нм. Размножение фагов осуществляется только в живых клетках.
Адсорбируясь на поверхности клетки бактерии, фаги выделяют фермент, способствующий растворению оболочки, после чего молекулы
РНК или ДНК фагов поступают в клетку. При этом происходит изменение обмена веществ, заключающееся в том, что вместо образования
вещества клетки идёт образование вещества фагов. Через несколько
часов, оболочка клетки разрывается и во внешнюю среду поступает
большое количество новых фагов, порядка нескольких сотен и даже
тысяч. Фаги поражают только определённый вид или близкие к нему
виды микроорганизмов, то есть обладают избирательностью действия.
Поэтому бактериофагов используют как санитарно-показательные
микроорганизмы
20
Для индикации определённого вида бактерий в исследуемую воду
помещают небольшое количество определённого вида бактериофага и
через некоторое время определяют изменение числа бактериофагов в
определённом объёме жидкости – титр фага. Возрастание этого показателя указывает на присутствие в воде определённого вида бактерий.
Бактериофаги встречаются в воде водоёмов, сточных водах, почве, то есть там, где живут сопутствующие им виды микроорганизмов.
Бактериофаги играют определённую роль в формировании биоценозов
в природных водах.
1.3.4 Бактерии
Большинство из них являются одноклеточными формами. Размер
клеток бактерий обычно изменяется от 0,4 до 10 мкм. По форме клеток
бактерии делятся на группы (рис. 9): шаровидные, палочковидные и
извитые.
Среди бактерий шаровидной формы, кокков, имеются разновидности, отличающиеся порядком расположения клеток. Если после деления клетки отходят друг от друга, то образуются одиночные клетки –
микрококки. При делении, происходящем в одном направлении, кокки
могут оставаться соединёнными попарно, образуя диплококки, объединяться по четыре – тетракокки, по восемь и более клеток. Кокки,
соединённые в цепочку, называются стрептококками. При делении
клеток в трёх взаимно перпендикулярных направлениях происходит
образование групп клеток, отличающихся плотной упаковкой – сарцин. Если же деление клеток идёт беспорядочно, то образуются группы бактерий, напоминающих по внешнему виду виноградную гроздь –
стафилококки. Из кокковых форм бактерий в процессе минерализации органических веществ активно участвуют представители родов
Micrococcus, Sarcina, Streptococcus, и др.
Палочковидные формы бактерий также могут быть одиночными,
располагаться попарно или в виде цепочки. Средняя длина палочковидных бактерий составляет 2 – 7 мкм при диаметре 0,5 – 1 мкм. Среди
палочковидных бактерий есть подвижные и неподвижные формы. Орган движения – жгутик. Палочковидные формы могут иметь утолщение в различных частях клеток - споры. У некоторых видов диаметр
споры превышает ширину клетки, что придает ей форму веретена или
барабанной палочки в зависимости от места расположения споры. Веретенообразные спороносные бактерии называются клостридиями (от
англ. closter – веретено). Другие спороносные бактерии называются
21
бациллами. Все палочковидные формы, не образующие спор, называются бактериями.
1 — кокк; 2 — диплококк; 3 — сарцина; 4 —стрептококк;
5 — колония сферической формы: 6 — палочковидные бактерии
(одиночная клетка и цепочка клеток); 7 — спириллы; 8 — вибрион;
9 —бактерии, имеющие форму замкнутого или незамкнутого
кольца;10 — бактерии, образующие выросты (простеки);
11 — бактерия червеобразной формы; 12 — бактериальная клетка
в форме шестиугольной звезды; 13 — представитель
ктиномицетов; 14 — плодовое тело миксобактерии;15 — нитчатая
бактерия рода Caryophanon с латерально расположенными
жгутиками: 16 — нитчатая цианобактерия, образующая споры
(акинеты) и гетероцисты; 8, 15, 17, 18 — бактерии с разными
типами жгутикования; 19 — бактерии, образующая капсулу;
20 — нитчатые бактерии группы Sphaeroillus, заключенные в
чехол, инкрустированный гидратом окиси железа; 21 — бактерия,
образующая шипы; 22 — Galionella
Рисунок 9 - Разнообразие бактерий
22
Извитые формы отличаются количеством витков. Бактерии,
имеющие небольшой изгиб - до ¼ витка, называются вибрионами; с
одним или несколькими витками – спириллами; длинные, тонкие
клетки с большим количеством витков – спирохетами. Длина клетки
вибрионов не превышает 1 – 3 мкм. Длина тела спирилл колеблется от
5 до 30 мкм при толщине 0,25 – 1 мкм. Характерной особенностью
спирохет является крайне малый диаметр клетки (от 0,1 до 0,6 мкм)
при относительно большой (от 5 до 500 мкм) длине тела. Все извитые
бактерии двигаются с помощью жгутиков. В отличие от спирилл клеточная оболочка спирохет эластична, благодаря чему они способны
двигаться, винтообразно изгибая тело. Размножаются спирохеты делением клетки.
Несколько особняком стоят нитчатые бактерии, представляющие собой длинные нити из соединенных вместе палочковидных клеток, покрытых общим чехлом. Наиболее крупные их виды различимы
невооружённым глазом, диаметр нити составляет 1-5 мкм. Эти организмы отличаются от обычных бактерий только своими размерами. В
отличие от описанных выше форм бактерий, нитчатые бактерии являются многоклеточными организмами. В пределах нити, как и у остальных бактерий, клетки размножаются простым делением. Нитчатые
бактерии – типичные водные организмы, бывают свободно плавающими и прикреплёнными. Нитчатые бактерии размножаются при помощи
гонидий и конидий – особых спороподобных овальных телец, возникающих из концевых клеток нити. Гонидии – подвижные тельца,
имеющие жгутики. Конидии – неподвижные клетки. Гонидии и конидии созревают в материнской нити и отслаиваются от основной оболочки через образовавшееся к этому времени в конечной клетке отверстие. Те и другие могут и давать начало новой нити. Гонидии некоторых бактерий образуют новую нить простым делением, прикрепляясь к
подводным предметам. Они могут иногда прорастать, не выходя из материнской нити, тогда происходит как бы ветвление нитей.
Оба эти спороподобных образования устойчивы к высыханию,
действию солнечного света и некоторых слабых дезинфицирующих
веществ, но чувствительны к нагреванию.
К нитчатым формам бактерий относятся серобактерии и железобактерии. У некоторых нитчатых железобактерий нити покрыты слизистой оболочкой, которая представляет собой футляр или чехол, наполняющийся гидроксидом железа. Нитчатые бактерии приносят вред водоснабжению тем, что колонии железобактерий и продукты их жизнедеятельности заиливают трубы, затрудняя протекание по ним жидко-
23
сти. Серобактерии в процессе своей жизнедеятельности выделяют серную кислоту, которая вызывает сульфатную агрессивность воды, приводящую к разрушению железобетонных и деревянных конструкций.
В особую группу выделяются миксобактерии, которые близки к
истинным бактериям, имеют палочковидную форму. На раннем этапе
развития они представляют собой овальные, заострённые к концам
клетки с обособленным ядром. После размножения клетки образуют
слизистые колонии.
1.3.4.1 Спорообразование у бактерий
Спора – это покоящаяся стадия спорообразующих видов бактерий. Некоторые палочковидные бактерии, попав в неблагоприятные
условия, образуют внутри своих клеток тельца округлой или эллиптической формы, получившие название спор. На образование их затрачивается почти всё содержимое протоплазмы. Сначала образуется проспора, которая затем превращается в спору. Процесс образования споры занимает от 40-50 мин. до нескольких часов, а иногда затягивается
на целые сутки. Спороносные клетки теряют способность к размножению. После созревания споры остатки вегетативной клетки отмирают и
разрушаются. Наружная оболочка – экзина становится малопроницаемой для воды и растворённых в ней веществ. Внутренняя оболочка – интина играет важную роль в прорастании споры. Из неё строится оболочка для новой вегетативной клетки. Вода в споре находится в
особом состоянии, ферменты малоактивны, оболочка ограничивает
обмен спор с внешней средой – всё это позволяет спорам сохраняться в
жизнеспособном состоянии десятки и сотни лет. Следовательно, спора
является устойчивой формой бактерии к неблагоприятным условиям внешней среды. Например, при кипячении речной воды погибают все бактериальные клетки, кроме спорообразующих. Споры не погибают при высушивании, замораживании, действии прямых солнечных лучей и сильных химических ядов. Погибают споры при стерилизации их в автоклавах (120 - 140˚С). Однако одни и те же бактерии образуют споры различной устойчивости и часть спор можно убить длительным кипячением. Когда спора попадает в благоприятные условия,
она начинает прорастать. При этом она набухает, становится богаче
водой, увеличиваясь почти в два раза. Наружная оболочка разрывается
и через образовавшееся отверстие выходит проросток. У некоторых
бацилл активизация ферментов и формирование вегетативной клетки
завершается за 40-50 минут. Иногда при накапливании в среде ядови-
24
тых веществ, спороносные бациллы могут утратить способность к спорообразованию.
1.3.4.2 Движение бактерий
Некоторые представители группы бактерий способны передвигаться. Передвижение осуществляется с помощью жгутиков. Только
подвижные спирохеты перемещаются ритмичными колебаниями всего
тела. Жгутики – цитоплазматические выросты, не втягивающиеся
внутрь при плазмолизе. Скорость движения - 10-20 мкм/с. По расположению жгутиков подвижные бактерии делят на четыре группы:
1) монотрихи, имеющие один полярный жгутик;
2) амфитрихи, имеющие по одному жгутику на обоих концах
клетки;
3) лофотрихи, имеющие жгутики на одном или обоих концах
клетки;
4) перетрихи, имеющие жгутики, расположенные по всей поверхности клетки.
Иногда у бактерий чередуются подвижные и неподвижные стадии. Например, нитритные бактерии, окисляющие азот аммонийных
солей в соли азотистой кислоты, попав в свежую питательную среду,
развиваются в виде неподвижных коротких палочек. При истощении
питательной среды они переходят в подвижную форму, у них появляется жгутик. В этом виде нитритные бактерии усиленно окисляют
оставшиеся аммонийные соли. Затем они теряют жгутики и оседают на
дно, образуя плотные зооглеи. У нитратного микроба, возбудителя второй фазы нитрификации, известна лишь неподвижная стадия.
1.3.4.3 Размножение бактерий
Размножение бактерий происходит делением клетки пополам.
Вначале в середине тела бактерии появляются выросты, которые затем
кольцеобразно вдавливаются внутрь клетки и делят её пополам. Миксобактерии размножаются путём перешнуровывания клетки без образования клеточной перегородки. Каждая половинка быстро вырастает до размеров материнской клетки и снова делится пополам. При благоприятных условиях размножение идёт очень быстро. Считают, что
бактерия делится пополам каждые 20-30 минут. Микробы обладают
очень большой удельной поверхностью, то есть поверхностью, прихо-
25
дящейся на единицу массы. У человека общая поверхность 1 кг массы
составляет 0,04 м2, у бактерий суммарная поверхность 1 кг массы равна 4000 м2. Этим определяется высокая активность бактерий и их чрезвычайная чувствительность к изменению условий существования.
1.3.4.4 Питание бактерий
Бактерия не имеет специальных органов пищеварения. Все необходимые вещества попадают в клетку путём осмотического всасывания через мельчайшие поры клеточной оболочки. Микробная клетка
в момент акта питания выделяет в среду биологические катализаторы –
ферменты, которые растворяют питательные вещества до состояния,
позволяющего им пройти через клеточную оболочку. Поступившие в
клетку питательные вещества используются для синтеза белков, жиров
и углеводов. Часть их идёт на рост клетки, другая расходуется в процессе дыхания. Вещества, которые не могут быть использованы клеткой, переводятся в растворимое состояние и выбрасываются через поры клетки в среду.
1.3.4.5 Типы питания
По типу питания микроорганизмы подразделяют на:
1) Автотрофы (autos – сам; trophe – пища) – микроорганизмы,
использующие в качестве источника питания углерод неорганических
соединений. Они в свою очередь подразделяются на:
• фотоавтортрофы – получают энергию при фотосинтезе;
• хемоавтотрофы - энергию получают при хемосинтезе (окисление NH4+; O2-; S; Fe2+);
2) Гетеротрофы (heteros – другой) – микроорганизмы для синтеза своего тела требуют готовые органические вещества;
3) Паратрофы (паразиты) – нуждаются в живом белке, то есть
питаются органическим веществом, входящим в состав живого организма.
1.3.4.6 Систематика бактерий
Для систематики бактерий наряду с морфологическими признаками, используются и физиологические, например, способность расти
на различных питательных средах, отношение к источникам углерода и
26
азота, потребность в кислороде. Систематика бактерий производится
на основании определённых признаков у группы микроорганизмов.
Для выделения бактерий в определённую группу необходимо тщательное изучение морфологии, способности к перемещению, спорообразованию. Отличительным признаком служит отношение клетки
к окрашиванию в зависимости от химического состава оболочки клетки. Наиболее употребительным методом дифференциации клеток микроорганизмов является окрашивание по Грамму. Сущность метода
заключается в выяснении возможности удерживания клеткой красителя, состоящего из комплекса кристаллический фиолетовый – йод, при
последующей обработки препарата спиртом. Этим методом выделяют
две группы микроорганизмов: грамположительные, сохраняющие
окраску, и грамотрицательные, обесцвечивающиеся при обработке
препарата спиртом.
Наименьшей систематической единицей является вид. Основа
концепции вида – критерий скрещиваемости. Вид – это группа особей,
репродуктивно изолированная от других таких групп. Род объединяет
близкие по морфологическим и физиологическим признакам микроорганизмы, но имеющие некоторые особые черты, например, разный
цвет колоний, вырастающих на питательных средах. Роды объединяются в семейства, а семейства – в группы. Группы объединяются в
царство.
Латинское название микроорганизма состоит из названия рода
(первое слово пишется с прописной буквы) и вида. Например, Bacteria
coli. Первое слово указывает на то, что кишечная палочка относится к
грамотрицательным бактериям, имеет небольшую длину клетки, не образует спор, а название вида указывает на её естественную среду обитания.
В 1870 г. была сделана попытка объединить бактерии по видам.
По этому вопросу существовало две точки зрения. Одна получила название мономорфизма. В её основе лежало представление о том, что у
бактерий имеются хорошо разграниченные виды, отличающиеся
большим постоянством.
Второе направление – полиморфизм – допускало более широкие
границы для видовой изменчивости и не считало виды бактерий столь
резко разграниченными. Сторонники этой теории полагали, что в зависимости от условий выращивания бактерии могут резко изменять свои
морфологические и физиологические особенности.
Работы Роберта Коха примерили эти две полярные точки зрения.
Он доказал, что у бактерий существуют строго разграниченные виды.
27
Но также и то, что бактерии легко изменяют свои свойства в зависимости от состава среды и под влиянием различных физических, химических и биологических факторов. Условия жизни накладывают определённый отпечаток на морфологию и физиологию микроорганизмов и
вызывают их адаптацию, что может привести к образованию новой
разновидности, или штамма.
Например, длительное воздействие климатических условий приводит к образованию географических рас бактерий, обладающих определённым комплексом признаков, устойчиво передающихся по наследству. Бактерии северных морей лучше развиваются при температуре до
10˚С в среде, содержащей соли. Большинство бактерий живёт в средах
с концентрацией солей до 1%. Морские бактерии требуют для своего
развития концентрацию солей до 10%. В Закавказье живут бактерии,
приспособившиеся к концентрации солей 36%. Группа микробов, живущая в водах с высокой концентрацией солей, называется галлофилами.
Из всех микроорганизмов наиболее лёгкой изменчивости подвержены вирусы. Изменчивость вирусов объясняется их паразитизмом.
Они слабо защищены от внешних воздействий, поэтому легко претерпевают изменения.
1.3.5 Актиномицеты
Актиномицеты – лучистые грибы – занимают промежуточное
положение между бактериями и грибами. Вегетативное тело их называется мицелием. Нити мицелия образуют гифы диаметром 0,2-1,5
мкм. Типичные актиномицеты имеют одноклеточный разветвлённый
мицелий, не содержащий обособленных ядер. Одна часть мицелия образуется в питательной среде (субстратный мицелий), а другая выступает над ней (воздушный мицелий). На поверхности воздушного
мицелия образуются спороносцы. Размножаются актиномицеты делением мицелия и спорами. К актиномицетам близки микобактерии,
представляющие собой одиночные палочковидные клетки, иногда ветвящиеся. Спор они не образуют. Некоторые представители актиномицетов (род Micromonospora) не имеют воздушного мицелия и образуют
по одной споре на субстратном мицелии. Основной средой обитания
актиномицетов является почва. Они участвуют в трансформации многих органических веществ. Развитие их идёт в присутствии кислорода.
Источником питания служат органические вещества. Продукты жизне-
28
деятельности актиномицетов, особенно в условиях затруднённой аэрации, могут вызывать появление запахов и привкусов у воды.
1.3.6 Грибы
Грибы относятся к бесхлорофилловым растениям. Они обитают в
почвах, воде, на растениях и животных, на очистных сооружениях.
Клетки грибов подобны клеткам других растений, но не содержат пластид. У грибов основным систематическим признаком служат органы
плодоношения и споры. В водной среде грибы редко образуют органы
плодоношения и потому распознавание водных грибов часто затруднительно. Грибы, встречающиеся в пресных водоёмах, имеют мицелий
(грибницу). Он может быть одноклеточным и многоклеточным. Одноклеточные грибы имеют мицелий, представляющий собой одну
очень длинную клетку, не разделённую перегородками. В этой клетке
содержится большое количество ядер. Такой мицелий называется многоядерным.
У грибов наблюдается многообразие способов размножения. Они
могут размножаться простым делением, почкованием, с помощью спор
и половым путём, с помощью обрывков гиф.
Плесневые грибы (Aspergillum и Penicillium) имеют многоклеточный мицелий, размножаются спорами. Грибы, развивающиеся в виде
одноклеточных элементов, называются дрожжами (рис.10). Они размножаются чаще всего почкованием, реже делением и с помощью
спор. Резко разграничивать дрожжи от плесени нельзя. Некоторые из
них могут расти и в виде дрожжей и в виде нитей с образованием мицелия. Это зависит от внешних условий среды. Например, низкие температуры благоприятствуют образованию плесени, тогда как некоторые вещества, входящие в состав питательных сред, и кислород способствуют развитию дрожжеподобных клеток. Существуют различные
вещества, например, сивушные масла, ионы кобальта, камфара и др.,
способствующие переходу из дрожжеподобной формы в мицелярную.
Дрожжи и плесени отличаются от простейших наличием толстой твёрдой клеточной оболочки. У дрожжей оболочка состоит из целлюлозы, а у плесеней – из хитина и родственных ему веществ. Кроме
этого, они отличаются способом питания, отсутствием подвижности,
вегетативным способом роста – рост происходит непрерывно независимо от размеров, и характерной морфологии. Дрожжи и плесени обладают высокой ферментативной активностью, что используется в промышленности и санитарной технике. Некоторые виды дрожжей вызывают брожение с выходом ценных продуктов, например спиртов, аце-
29
тонов, а другие разрушают органические вещества растительных и животных остатков. Плесени используются для получения антибиотиков.
А
Б
А. Плесени: 1 – Aspergillus; 2 – Penicillium; Б. Дрожжи
Рисунок 10 – Микроскопические грибы
1.3.7 Водоросли
Характерный признак водорослей - наличие зелёного пигмента
хлорофилла. Кроме хлорофилла, водоросли могут содержать следующие пигменты: синий - фикоциан, бурый - фукоксантин, красный фикоэритрин, оранжевые - каротин и ксантофилл. Дополнительные
пигменты влияют на цвет водорослей и служат важным систематическим признаком. Водоросли подразделяются на несколько типов. Типичные представители микроскопических водорослей представлены на
рисунке 11.
Зелёные водоросли – широко распространены в поверхностных
водоёмах. Среди них встречаются одно-, многоклеточные и колониальные формы. Пигменты сосредоточены в особых плазменных телах различной формы – хроматофорах. Размножаются делением цитоплазмы с
образованием дочерних клеток или половым путём. Некоторые виды
размножаются путём образования подвижных спор. Колонии образуются в результате бесполого деления, при котором дочерние клетки
30
остаются связанными друг с другом. Клетки зелёных водорослей имеют разнообразную форму: шаровидную, овальную, серповидную, треугольную и т.д.. Их клетки содержат органоиды, характерные для клеток высших растений. Ядро дифференцировано. Оболочка состоит из
целлюлозы. В цитоплазме могут содержаться зёрна крахмала, который
является продуктом фотосинтеза. Наиболее часто в пресных водоёмах
встречаются из одноклеточных форм хлорелла (Chlorella vulgaris),
хламидомонады (Chlamidomonas), из колониальных – вольвокс (Volvox
aureus), гониум (Gonium pectorale), из многоклеточных – улотриксовые. Зелёные водоросли встречаются в водоёмах с чистой и грязной
водой, с медленным и быстрым течением, в различных ямах, лужах,
наполняющихся после дождя, а так же на почве.
А
Б
В
А. Диатомовые водоросли Б. Сине-зеленые водоросли,
В. Зеленая водоросль (Хламидомонада)
Рисунок 11 – Микроскопические водоросли
Сине-зелёные водоросли (цианобактерии) считают древнейшим
из существующих в настоящее время растений. Это одно- или много-
31
клеточные организмы, наиболее просто организованные, характеризуются особым строением клетки. В ней нет типичного ядра и хроматофоров. Протоплазма сине-зелёных водорослей дифференцирована на
периферически-окрашенный слой – хромотоплазма, и центральную
часть – центроплазма. Ассимилирующие светочувствительных пигменты – хлорофилл, фикоцин, фикоэритрин и каротин. В зависимости
от количественного соотношения пигментов меняется и окраска клеток. В ячейках лежат особые тельца – эндопласты плотной или вязкой
консистенции. В плазматических стенках ячей между эндопластами
находится «хроматиновое вещество», красящееся ядерными красками.
В клетках сине-зелёных водорослей отсутствуют вакуоли, заполненные
клеточным соком. В связи с этим при плазмолизе клетка съёживается
целиком. В клетках этих организмов имеются газовые вакуоли, что
способствует всплыванию их на поверхность. Клетки сине-зелёных водорослей имеют оболочку. Она может быть тонкой и едва заметной
или же утолщённой. Оболочки клеток часто покрываются слизью, что
приводит к образованию колоний за счёт слипания этой слизи. В состав оболочек входят главным образом пектины. Как правило, колонии
не имеют определенной формы. У нитчатых ряды клеток заключены в
полый цилиндрический чехол, закрывающий весь ряд клеток. Совокупность клеток с чехлом называется нитью. Клетки в пределах одной нити могут быть одинаковыми или разными по величине и форме. Сверху
клетки нити покрыты общим слизистым чехлом. У некоторых видов
нити способны ветвиться. Часто наблюдается образование гетероцист, расположенных в нити через определенное число клеток. Гетероцисты образуются из вегетативных клеток, но по размеру значительно превосходят их. Они имеют плотную оболочку, но через поры
сообщаются с соседними клетками. Предполагают, что гетероцисты –
специализированные клетки, осуществляющие фиксацию азота.
Многие виды цианобактерий способны образовывать споры. У
одних видов споры, как у истинных бактерий, являются формой, наиболее устойчивой к неблагоприятным условиям. В этом случае из одной клетки образуется только одна спора. У других цианобактерий
споры, как у грибов, служат способом размножения. В этом случае
внутри материнской клетки формируется множество мелких спор, освобождающихся при разрыве оболочки. Сине-зелёные водоросли очень
распространены в природе: они развиваются в водоёмах с солёной и
пресной водой, в почвах и на скалах, в Арктике и пустыне. Это способствует чрезвычайная устойчивость к неблагоприятным условиям и нетребовательность к питательным веществам.
32
Диатомовые водоросли (Diatomea). Они представляют собой одноклеточные микроскопические организмы. Некоторые виды образуют
колонии в виде нитей, лент, кустиков. Клетки имеют размеры от 4 до
1500 мкм, а колонии иногда достигают нескольких сантиметров. В
клетках диатомовых водорослей обнаруживаются оформленное ядро и
хлоропласты. Последние кроме хлорофилла содержат бурые пигменты,
поэтому цвет водорослей желтоватый или темно-бурый. Клетки имеют
пектиновую оболочку и панцирь, состоящий из кремнезема. Оболочка
клетки состоит из двух половинок, которые не срастаются и могут раздвигаться. Протоплазма располагается тонким слоем вдоль стенок, образуя у многих видов в середине клетки протоплазматический мостик,
остальное пространство клетки заполнено клеточным соком, ядро одно. Хроматофоры разнообразны по форме. Продуктами ассимиляции
является масло, волютин, лейкозин. Размножаются простым делением
и с помощью спор. При вегетативном делении каждая часть получает
материнскую створку, а недостающая вырастает заново при развитии
клетки. Строение кремниевого панциря является отличительным признаком вида. Диатомовые водоросли группы Pennales встречаются
преимущественно среди обрастаний донных предметов и в грунте.
1.3.8 Простейшие
Простейшие (Protozoa) - это одноклеточные организмы животного происхождения, по размерам в сотни раз больше многих бактерий.
Размеры их колеблются в широких пределах (от 2 мкм до 2 мм) и зависят от видовой принадлежности и физиологического состояния. Общее
число видов простейших превышает 15 тыс.
Простейшие обитают в сточных водах, в иле, в испражнениях,
на почве, в воде рек, озёр, океанов, на очистных сооружениях, работающих в аэробных условиях. Принимают активное участие в минерализации органических веществ в естественных и искусственных
условиях очистки природных и сточных вод. Некоторые являются возбудителями заболеваний человека и животных.
Они лишены твёрдой оболочки, имеют мягкую или гибкую и относительно хрупкую внешнюю клеточную мембрану. Под оболочкой
простейших находятся обособленное ядро и цитоплазма, в которой содержатся вакуоли, выполняющие различные функции.
Простейшие дышат растворённым в воде кислородом. Вредные
вещества выводятся из организма через всю поверхность и через сократительную вакуоль. Сократительная вакуоль представляет собой пе-
33
риодически нарастающий пузырек жидкости, который, достигая определенных размеров, подходит к оболочке клетки и выбрасывает свое
содержимое наружу. В окружающей среде концентрация солей обычно
меньше, чем внутри клетки. В соответствии с законами осмотического
давления, вода стремится проникнуть в клетку. Сократительная вакуоль, удаляя избыток воды, действует как откачивающий аппарат и
поддерживает внутри клетки постоянное осмотическое давление. Из
запасных веществ в клетках большинства простейших откладывается
гликоген, в некоторых – жир. Окрашенные простейшие накапливают
крахмал.
Простейшие лишены сложно дифференцированных органов
чувств, но они чувствительны к действию тепла, света, различных химических веществ, а также к действию силы тяжести и электричества.
Большинству простейших свойственен голозойный способ питания, то
есть используют только растворимые вещества, в которые они превращают пищу при пищеварении.
Размножаются Protozoa простым делением клеток (бесполое размножение) или в результате сложного полового процесса – конъюгации. Для жгутиковых характерно продольное деление, для ресничных
– поперечное. Каждая часть клетки обладает всеми физиологическими
свойствами и генетическими потенциями родительской клетки. У некоторых простейших имеется также половой способ размножения. Ряд
простейших при попадании в неблагоприятные условия превращаются
в цисты, имеющие плотную оболочку, за счёт которой приобретают
устойчивость к воздействию вредных факторов окружающей среды.
Процесс образования цист называется инцистированием и заключается
в уменьшении объема тела, которое принимает округлую форму и покрывается плотной оболочкой, в результате чего приобретает устойчивость к воздействию вредных факторов внешней среды. Цисты многих
простейших способны переносить полное высыхание в течение нескольких лет. При пересыхании мелких водоемов и луж, цисты остаются в иле, превращающемся в пыль. Ветер вместе с пылью переносит
их на большие расстояния, способствуя расселению Protozoa. Цисты
могут существовать без влаги в течение нескольких лет. Цисты дизентерийных и кишечных амёб способны переживать до 3-4 месяцев.
Местом обитания простейших являются моря и пресные воды,
почва, организмы человека и животных. Широкое распространение
обусловлено их способностью к быстрому и интенсивному размножению, способностью переносить неблагоприятные условия в виде цист,
34
разнообразием средств распространения (водные и воздушные течения, с помощью птиц и насекомых).
Многие виды Protozoa являются болезнетворными, вызывающими такие заболевания, как амебная дизентерия, малярия, африканская
сонная болезнь и др.
В основу классификации простейших положены главным образом
способы их передвижения. Тип Protozoa делится на несколько классов.
В практике очистки природных и сточных вод наибольшее значение
имеют три из них: Sarcodina, Mastigophora, Infusoria. Каждый из классов делится на подклассы, отряды, роды, виды.
В активном иле и биоплёнке встречаются представители саркодовых (Sarcodina), бесцветных жгутиковых (Flagellata), ресничных инфузорий (Ciliata) и сосущих инфузорий (Suctoria).
Sarcodina. Представители этого класса простейших (рис.12) во
взрослом состоянии передвигаются с помощью особых, меняющих
форму, выростов тела, которые носят название ложноножек или псевдоподий. У различных видов саркодовых псевдоподии весьма разнообразны по числу и форме. Некоторые из них имеют ложноножки широкие лопастевидные, другие – напоминающие сплетение корней дерева, третьи – в виде прямых тонких лучей.
В пресных природных водах и на очистных сооружениях канализации наиболее распространены подклассы Rhisopoda (корненожки) и
Testacea (раковинные).
Рисунок 12 – Sarcodina
35
К корненожкам относятся одни из самых простых по морфологическому строению организмов – голые амебы (Amoeba). Низшие формы их лишены скелета и представляют собой голый комочек цитоплазмы. В ней различают внутренний жидкий, зернистый слой (эндоплазма) и более вязкий, плотный, тонкий ободок (эктоплазма). При
движении амеба выпускает ложноножки в определенном направлении.
Движение состоит как бы в медленном перетекании массы тела. Питание амебы происходит за счет явления фагоцитоза. Вокруг пищевого
комка образуется пищеварительная вакуоль, внутри которой питательные вещества переводятся в растворимое состояние и через стенку вакуоли просачиваются наружу в любой точке тела. Размножаются амебы простым делением клетки.
Раковинные амебы отличаются от голых амеб наличием овальной или круглой раковины с отверстием (устьем) для псевдоподий. У
одних амеб раковины построены из хитиноподобных веществ, образующихся в теле амебы, у других – из посторонних частиц, например
мельчайших песчинок, склеенных выделениями цитоплазмы. Поступает пища, и выводятся непереваренные остатки через устье раковины. Размножаются раковинные амебы делением клетки, но этому
предшествует образование внутри тела запасных веществ, из которых затем строится раковина новой амебы. При делении примерно
половина цитоплазмы с запасными веществами выходит через устье
раковины наружу и окружается новой раковиной. Основным местом
обитания раковинных амеб являются пресные воды.
Пищей амебам служат главным образом бактерии, другие простейшие и водоросли. Амебы способны захватывать частицы, значительно превышающие размеры их тела.
Кишечные амебы человека и животных питаются бактериальным
содержимым кишечника. Большинство их видов безвредно, но некоторые, например дизентерийная амеба, вызывают тяжелые заболевания.
Поселяясь под слизистой оболочкой кишок, амеба вызывает образование язв. Цисты ее сохраняют в воде жизнеспособность в течение 9 мес.
Один больной в сутки выделяет до 300 млн. цист. Заражение амебной
дизентерией происходит через воду.
К классу Mastigobhora относятся жгутиковые инфузории - бесцветные Flagellata и окрашенные формы, например Euglena.
Mastigophora. Органами движения для представителей этого
класса служат жгутики - тонкие нитевидные выросты цитоплазмы.
Клетки имеют от одного до восьми жгутиков.
36
Класс жгутиковых объединяет разнообразные по способам питания простейшие организмы. Окрашенные формы жгутиковых имеют
светочувствительные пигменты (например, хлорофилл) и могут питаться как зеленые растения. Массовое развитие окрашенных жгутиковых вызывает иногда «цветение» мелких водоемов. Пищей Mastigophora других видов служат растворенные органические вещества, поступающие в клетку через всю ее поверхность. Наконец, среди жгутиковых есть формы, имеющие ротовое отверстие, расположенное у основания жгута. Жгутики для них служат не только органами движения, но и способствуют захвату пищи. Такие жгутиковые способны питаться бактериями, мелкими водорослями. Некоторые из окрашенных
жгутиковых способны изменять способ питания в зависимости от условий. На свету они питаются как растения, а в темноте начинают интенсивно поглощать органические вещества. При размножении клетки
делятся в продольном направлении
Зелёная Euglena обитает в стоячей воде. Тело имеет вытянутую
форму. На одном конце есть жгутик, с помощью которого она перемещается в среде. Цитоплазма содержит ядро и многочисленные (более
20) зелёные овальные хлоропласты, придающие ей зелёный цвет. В
хлоропластах содержится хлорофилл, с помощью которого она синтезирует клеточное вещество, как растения. Хлорофилл исчезает, когда
эвглена попадает в темноту. В этих условиях она усваивает растворённые органические вещества. Следовательно, на свету она проявляет
признаки растения, а в темноте – животного. Размножается простым
делением. Образует цисты.
На очистных сооружениях канализации чаще всего встречаются
мелкие бесцветные жгутиковые, некоторые представители которых
изображены на рисунке 13.
Бесцветные инфузории Flagellata имеют более или менее постоянную форму тела. Питаются бактериями. Размножаются делением
клетки пополам. Развиваются в присутствии значительного количества
органических веществ и бактерий. Их насчитывается более 7000 видов.
К этому классу относятся наиболее высокоорганизованные представители простейших, органами, движения которых являются реснички –
короткие волосовидные выросты плазмы (рис.14). Второй характерный
признак инфузорий – наличие в их клетках двух ядер, различных по
своим размерам и функциям. Большому ядру приписывается основная
роль в регуляции обменных процессов, в частности синтеза белка. Малое ядро контролирует передачу наследственных признаков.
37
А—Д — эвгленовые: А — зеленая эвглена (Euglena
iridis);1, 2 — жгутик; 3 — резервуар сократительной
вакуоли; 4 — стигма; 5 — сократительная вакуоль;
6 — хроматофоры; 7 — ядро; Б — Е-oxyuris; В — Е- acus;
Г — Е- gracilis; Д— Phacus longicauda;
E—К — панцирные: Е — Peridinium; Ж — Ceratium tripos;
3 — Ornithocercus; И — Ceratium hirudinella;
К — ночесветка (Noctiluea, miliaris).
Рисунок 13 - Различные жгутиковые
Класс инфузорий делится на два подкласса: ресничные инфузории (Ciliata), сосущие инфузории (Suctoria). Наиболее многочислен
первый класс, насчитывающий более 3000 видов. Ресничные инфузории весьма разнообразны по форме, размерам, способам питания и образу жизни. Чаще всего инфузории имеют продолговато-овальную
форму, тело некоторых (например, трубача) вытянуто в виде граммофонной трубы, иные напоминают колокольчики.
38
Рисунок 14 - Инфузории
Одни инфузории плавают в воде, другие прикрепляются к водным растениям и другим предметам, третьи ползают.
Пищей большинству инфузорий служат бактерии и мелкие водоросли, но есть среди них организмы, питающиеся другими простейшими, в том числе и инфузориями. Немало инфузорий ведет паразитический образ жизни в организмах человека, животных и рыб.
Тело инфузорий покрыто тонкой, эластичной, очень прочной оболочкой – пелликулой. Благодаря эластичности пелликулы многие инфузории способны изгибать тело, сжиматься, принимать шарообразную форму.
Все инфузории, кроме некоторых паразитических форм, имеют
ротовое отверстие, расположенное на дне околоротовой впадины. Вокруг рта расположены реснички, обычно более мощные и длинные,
чем на других участках тела. С помощью этих ресничек пищевые частицы подгоняются ко рту и проглатываются инфузорией. Далее пища
поступает в короткий канал (глотку), иногда выстланный ресничками.
Пищевой комок у внутреннего края глотки обволакивается капелькой
39
жидкости, выделяемой лизосомой. Так образуется пищеварительная
вакуоль. По мере поступления пищи образуются новые вакуоли. При
обилии питания этот процесс повторяется каждые 1 – 2 мин. Отрываясь от глотки, пищеварительная вакуоль подхватывается током цитоплазмы и совершает в клетке определенный путь, в течение которого
происходит переваривание и всасывание растворенных веществ в цитоплазму. Длительность процесса пищеварения различна; у инфузории-туфельки она составляет около 1 часа, вакуоли с непереваренными
остатками пищи собираются около порошицы, сливаются в одну вакуоль и выбрасываются наружу каждые 7 - 10 мин. Жидкие продукты
обмена удаляются с помощью сократительной вакуоли.
У ресничных инфузорий чередуются бесполое и половое размножение. При этом клетка делится в поперечном направлении. Половой
процесс наступает периодически через несколько поколений.
Подкласс ресничных инфузорий делится на несколько отрядов,
характеризующихся различным строением ресничного аппарата.
Отряд равноресничных инфузорий наиболее многочисленный.
Тело этих инфузорий равномерно покрыто ресничками. Типичными
представителями, широко распространенными в водоемах и на очистных сооружениях, являются инфузории рода Paramecium (инфузориятуфелька) (рис.14).
Отряд разноресничных инфузорий характеризуется наличием
спирально расположенного около ротового отверстия пояса ресничек.
К этому отряду относятся один из самых крупных инфузорий пресных
вод – трубачи (Stentor).
Представители отряда брюхоресничных инфузорий кроме околоротового пояса ресничек имеют на брюшной стороне особые плотные щетинки, представляющие собой пучки склеенных ресничек. Благодаря им инфузории могут ползать по субстрату (Stylonichia, Oxytricha, Euplotes).
Подавляющее большинство представителей отряда кругоресничных инфузорий ведет сидячий образ жизни. Реснички расположены
только около ротового отверстия. Движением ресничек создается водоворот в форме воронки, узкий конец которой обращен к ротовому отверстию. Взвешенные частицы осаждаются в нижней части воронки.
Такой способ добывания пищи носит название седиментации и характерен для многих видов инфузорий – седиментаторов. С помощью
длинных стебельков инфузории прикрепляются к растениям, раковинам, моллюскам, хлопочкам ила. Среди кругоресничных инфузорий
40
есть как одиночные (Vorticella convallaria), так и колониальные формы
(Opercularia glomerata).
Подкласс сосущих инфузорий (Suctoria) представлен сидячими
формами, лишенными во взрослом состоянии ресничек и не имеющими рта. Сосущие формы инфузорий ведут сидячий образ жизни, прикрепляясь несократительным стебельком к растениям, раковинам
моллюсков, хлопьям ила. Ведут паразитический образ жизни. Питаются эти инфузории с помощью особых сосательных щупалец – тонких
трубочек с внутренним каналом и отверстием на конце, которыми они
ловят добычу (главным образом ресничных инфузорий). Присасывающая сила очень велика. Пелликула пойманной инфузории растворяется, и эндоплазма по каналу щупалец перетекает внутрь сосущей инфузории.
1.3.9 Коловратки
Коловратки (Rotatoria) - представители животного мира, имеют
более сложное строение, чем простейшие. Это многоклеточные организмы, имеющие членистое строение панциря. Размер их достигает
2 мм. Относятся к седиментаторам, т.е. метод введения в организм пищи основан на осаждении (седиментации) взвеси (рис. 15). В передней
части имеется ротовое отверстие округлой формы, окружённое многочисленными ресничками. У коловратки имеется примитивная пищеварительная система. Продукты обмена удаляются с помощью выделительных органов. Мерцательный аппарат (реснички) служит для создания направленного тока воды, в которой присутствуют микроорганизмы, частицы взвешенного органического вещества, составляющие пищу коловраток. Движутся с помощью коловращательного аппарата
ноги, выступающей из панциря в задней части. Нога используется также для прикрепления к субстрату. У большинства коловраток имеются
глаза в виде красных пятен. Коловратки – аэробы, чувствительны к недостатку кислорода. Предельно высокой для них является температура
50˚С. При неблагоприятных условиях, животное образует цисты, при
этом голова и ноги втягиваются в панцирь. Коловратки чувствительны
к изменению активной реакции среды. Они используются как индикаторные организмы при оценке работы очистных сооружений в аэробных условиях.
41
Рисунок 15 - Коловратки
2 ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Биотехнология предполагает использование в промышленной
практике биологических систем или процессов.
Согласно определению Европейской ассоциации биотехнологов
(третий съезд, Мюнхен, 1984 г): Биотехнология - это интегрированное
использование биохимии, микробиологии и инженерных наук с целью
технологического применения способностей микроорганизмов. Она
создает возможность получения с помощью легко доступных и возобновляемых ресурсов тех веществ и соединений, которые важны для
жизни и благосостояния людей.
Согласно определению Европейской биотехнологической федерации, созданной в 1987 г., биотехнология на основе применения знаний
и методов биохимии, микробиологии, генетики и химической техники
позволяет извлекать выгоду в технологических процессах из свойств
микроорганизмов и клеточных культур.
Использование научных достижений в биотехнологии тесно связано с фундаментальными исследованиями в различных областях знаний и осуществляется на самом высоком уровне современной науки. В
течение последних десятилетий в нашей стране создана новая отрасль
– микробиологическая промышленность с самой большой в мире мощностью производства кормовых дрожжей и парафинов. Разработано
отечественное производство кормового лизина, различных ферментных препаратов и др. Развивается производство микробиологических
продуктов на предприятиях медицинской и микробиологической, пи-
42
щевой промышленности, а также в сельском хозяйстве и на заводах
химреактивов в химической промышленности.
Многоликость биотехнологии видна из того, что она охватывает
многие науки, такие как: генетика, микробиология, технология пищевых продуктов, химическая технология, электроника. Все они вносят
вклад в развитие биотехнологии.
В промышленном масштабе подобная биотехнология представляет собой уже биоиндустрию. Последняя включает в себя, с одной
стороны, отрасли, в которых биотехнологические методы могут с успехом заменить широко используемые в настоящее время традиционные
методы, а с другой – отрасли, в которых биотехнология играет ведущую роль.
Среди первых в области химической промышленности можно назвать синтез искусственных приправ, полимеров и сырья для текстильной промышленности, в области энергетики – получение метанола,
этанола, биогаза и водорода, в области биометаллургии – извлечение
некоторых металлов.
Во второй группе отраслей биотехнология охватывает: производство продовольствия (широкомасштабное выращивание дрожжей,
водорослей и бактерий для получения белков, аминокислот, витаминов, а так же для использования их ферментов); увеличение продуктивности сельского хозяйства (клонирование и селекция сортов растений,
исходя из тканевых и клеточных культур, производство биоинсектицидов); фармацевтическую промышленность (разработка вакцин, синтез
гормонов, интерферонов и антибиотиков); защиту окружающей среды
и уменьшение ее загрязнения (очистка сточных вод, переработка хозяйственных отходов, изготовление компоста, а так же производство
соединений, поддающихся расщеплению микроорганизмами).
Тесно связана с биотехнологией биоинженерия. Ее задачи - создание аппаратуры биотехнологических процессов (биореакторов, специфичных систем аэрации, теплообмена, перемешивания, стерилизации питательных сред и воздуха), разработка контрольной и измерительной техники, а также масштабирование и моделирование биотехнологических процессов.
2.1 Объекты биотехнологии
Объектами биотехнологии являются отдельные части клеток (митохондрии, рибосомы, хромосомы, мембраны и т.д.), сами клетки и их
коллективы - клеточные культуры, отдельные микроорганизмы (грибы,
43
водоросли, бактерии, простейшие, вирусы и т.д.), и их колонии, а также - самостоятельные многоклеточные растительные и животные микроорганизмы.
Микроорганизмы - это удивительно совершенные творения природы. Микробная клетка в состоянии жить и размножаться, используя
в качестве источника питания часто только один-единственный органический субстрат и минеральные соли. Бактерии способны жить в
аэробных и анаэробных условиях при температурах, близких к 0 и
+80 ОС. Отдельные виды микроорганизмов находят в струях гейзеров
при температурах 105 ОС, в сверхсоленых озерах, например в знаменитом Мертвом море, в вечной мерзлоте Арктики, в океане на глубине 11 км, в атмосфере на высоте 41 км. Некоторые бактерии прекрасно себя чувствуют в воде, охлаждающей ядерные реакторы, остаются жизнеспособными, получив дозу радиации в 10 тысяч раз превышающую смертельную дозу для человека. Они выдерживают двухнедельное пребывание в глубоком вакууме, не погибают в открытом
космосе в течение 18 ч под смертоносным воздействием солнечной радиации. Совершенный, точно регулируемый метаболизм микробной
клетки позволяет ей расти с огромной скоростью. Так деление бактерий Escherichia coli (кишечная палочка), при росте на полноценной
среде, происходит каждые 30 мин. Если сравнить клетку с машиной, то
это очень совершенная машина, имеющая коэффициент полезного действия до 70 % (превращение углерода субстрата в углерод клеточной
биомассы).
Быстрый рост численности населения нашей планеты и исчерпание природных ресурсов - источников питания, кормов и сырья для перерабатывающей промышленности - не позволяют развивать народное
хозяйство традиционными методами. Это определяет актуальность
развития биотехнологических процессов сегодня и позволяет считать
их наиболее перспективными.
2.2 Прошлое и настоящее биотехнологии
Человек использовал биотехнологию многие тысячи лет. По свидетельству легенд и народных сказаний древности, люди с незапамятных времен готовили из сока винограда вино, делали сыр из скисшего
молока, поражали врагов и диких зверей стрелами, наконечники которых были пропитаны смертельным ядом. Археологические раскопки в
Двуречье помогли найти сохранившиеся остатки пекарен и пивоварен,
которые были построены соответственно за 6000 и 2000 лет до н.э.
44
Человек наблюдал многие удивительные явления, происходящие
в живых организмах, таких как: свертывание крови, дозревание и разложение мясных, рыбных и растительных продуктов. Почему все это
происходило, он долгое время не мог объяснить. Наши предки не имели представления о процессах, лежащих в основе знакомых им технологий домашнего производства продуктов питания и их хранения. Они
действовали интуитивно, пользуясь микроорганизмами, не догадываясь об их существовании. Но в течение тысячелетий успешно применяли метод микробиологической ферментации для приготовления и
сохранения пищи.
И лишь в начале 19 века, были обнаружены вещества, вызывающие подобные превращения. Они получили названия ферментов. Люди
научились делать мыло из жиров, изготавливать простейшие лекарства
и перерабатывать отходы.
Становлению и развитию биотехнологии как науки предшествовали открытия в области микробиологии таких ученых как: Хук, Левенгук, Женнер, Пастер, Кох и др.
Первым из людей, заглянувших в таинственный мир микроорганизмов, стал голландский естествоиспытатель Антони ван Левенгук
(1632 г. - 1723 г.). Он изготовил линзы, которые увеличивали в 100-300
раз. Самостоятельно шлифуя оптические стекла, он добился превосходного качества. Рассматривая с их помощью растворы и настои,
он увидел причудливых "зверушек", постоянно снующих в разные стороны. Левенгук назвал их "анималькулюс", что по латыни означает
"зверушка". Он первым описал и зарисовал микроорганизмы. В письме
№ 17 в Лондонское королевское общество он так описывает это открытие: «После всех попыток узнать, какие силы в корне действуют на
язык и вызывают его раздражение, я положил приблизительно полунции корня в воду: в размягченном состоянии его лучше изучать. Кусочек корня оставался в воде около трех недель. 24 апреля 1676 г. я посмотрел на эту воду под микроскопом и с большим удивлением увидел
в ней огромное количество мельчайших живых существ».
В конце 19 века благодаря трудам французского ученого Луи Пастера были созданы реальные предпосылки для дальнейшего развития
прикладной микробиологии, а также в значительной мере и биотехнологии. Пастер всегда стремился к тому, чтобы его работы непосредственно служили людям. Он знал, какую огромную роль играет виноделие в развитии экономики Франции. Порча вина приносила стране и
виноделам большие убытки. Требовалось найти научное объяснение
причинам вызывающим это явление. Будучи ценителем и любителем
45
вина, Пастер стал изучать процесс брожения, который считался многими учеными чисто химическим явлением. Ученый сделал вывод о том,
что брожение происходит только в присутствии живых организмов дрожжей и является биологическим явлением. Порчу вина он объяснил
тем, что при попадании бактерий в вино происходит вытеснение
дрожжей и вино превращается в уксус. Для предотвращения порчи Пастер предложил сразу по окончании брожения подогревать вино до
60 ОС - 70 ОС, не доводя до кипения. Вкус вина при этом сохраняется, а
бактерии погибают. Этот процесс теперь называют пастеризацией. Так
обрабатывают молоко, пиво, вино.
Таким образом, Луи Пастер установил, что микробы играют ключевую роль в процессах брожения, и показал, что в образовании отдельных продуктов участвуют различные их виды. Его исследования
послужили основой развития в конце 19 и начале 20 веков бродильного
производства органических растворителей (ацетона, этанола, бутанола
и изопропанола) и других химических веществ, где использовались
разнообразные виды микроорганизмов. И сегодня многие химические
соединения получают путем брожения, самым выгодным с экономической точки зрения способом.
Пастер открыл возможность жизни без кислорода. Так живут, в
частности, масляно-кислые бактерии, делающие горьким вино, молоко,
пиво.
К дальнейшему изучению микроорганизмов Пастера подтолкнула
смерть дочери Жанны от тифа. Он предположил, что бактерии вызывают не только "болезни вина", но и людей. Пастер доказал, что, прививая ослабленных микроорганизмов - возбудителей, можно создавать у
организма невосприимчивость к болезни - иммунитет. Прививочный
материал Пастер назвал вакциной. Открыл вакцину против бешенства.
В настоящее время процессы биохимической технологии широко
используются при производстве ценных биологически активных веществ (антибиотиков, ферментов, гормонов и др.), для предотвращения
загрязнения окружающей среды, защиты растений от болезней и вредителей, в крупномасштабном производстве белков и аминокислот,
предназначенных в качестве добавок к кормам в животноводстве.
Новая биотехнология началась после открытия Дж. Уотсоном и
Ф. Криком строения ДНК. Главным объектом исследований до сих
пор остается живая клетка, но центральное место в экспериментах занимают манипуляции с ДНК. Пользуясь методами генетической инженерии, создаются искусственные, заранее запрограммированные структуры в виде рекомбинантных ДНК, осуществляют трансплантацию ге-
46
нов между разными видами микробных клеток, а также между клетками одноклеточных и многоклеточных организмов. Многообразны биотехнологические манипуляции с клеточными структурами и протопластами. Развитие генетической и клеточной инженерии позволило получать ранее недоступные вещества - в первую очередь лекарственные
препараты (интерфероны, гормоны роста, инсулин человека и др.). Разработка методов генетической инженерии, основанных на создании рекомбинантных ДНК, привела к "биологическому буму", свидетелями
которого мы являемся. Эти методы не только открывают возможности
улучшения уже освоенных процессов и продуктов, но и дают нам совершенно оригинальные способы получения новых веществ, позволяют осуществлять новые процессы.
На третьем съезде Европейской ассоциации биотехнологов
(Мюнхен, 1984г) голландский ученый Е. Хаувинк разделил историю
развития биотехнологии на пять периодов, учитывая основные
открытия, способствующие ее развитию:
− допастеровская эра (до 1858г);
− послепастеровская эра (1858 г. – 1949 г.);
− эра антибиотиков (1941 г. – 1960 г.);
− эра управляемого биосинтеза (1961 г.- 1975 г.);
− новая эра (после 1975 г.).
2.3 Перспективы развития биотехнологии
Дальнейший прогресс человечества связывают с активным внедрением во все сферы жизни электроники и биотехнологии.
Биотехнология должна решать глобальные проблемы современной цивилизации: угроза экологического и энергетического кризисов,
истощение запасов полезных ископаемых, нехватка продовольствия.
Сфера применения методов биотехнологии расширится и будет
охватывать такие области, как:
• пищевая промышленность (продукты питания и пищевые добавки);
• сельскохозяйственное производство (выведение новых и продуктивных видов сельскохозяйственных растений и животных и переработка сельскохозяйственных отходов, борьба с болезнями растений и
животных);
47
• здравоохранение (диагностика, профилактика и лечение заболеваний с применением современных медикаментов и медицинской
техники);
• химическая промышленность (производство клеев, детергентов, красителей, волокон, вкусовых добавок, желирующих веществ, загустителей, душистых веществ, пигментов, смазок, восков и др.);
• биоэнергетика (применение и использование нетрадиционных
источников энергии);
• мониторинг и охрана окружающей среды (воздух, вода и почва), обезвреживание твердых отходов, очистка сточных вод и газовых
выбросов;
• биогеотехнология - добыча минерального сырья на суше и в
море;
• биоэлектроника, фотография, аналитические приборы.
2.4 Основные виды биотехнологической деятельности
микроорганизмов
Представим виды биохимической деятельности микрообъектов,
используемые в биотехнологии.
1. Наращивание клеточной массы, которая и представляет собой
продукт. К такому классу технологий относится получение пекарских
дрожжей, кормовых дрожжей, многих вакцин.
2. Образование (биосинтез) в процессе роста и развития клеток
ценных биохимических продуктов. Некоторые из них выделяются в
среду (внеклеточные продукты), некоторые накапливаются в биомассе
(внутриклеточные продукты). В этих случаях производство существует
ради получения таких продуктов, а не самой биомассы, которая часто
является балластом.
3. Биотрансформация - процесс, в результате которого под воздействием биохимической деятельности микроорганизмов или ферментов происходит изменение химического состава исходного химического вещества. Кроме того, в процессе биотрансформации используют
обычно уже готовый биологический агент — клетки микроорганизмов
или ферменты, в ходе самого процесса биотрансформации они не образуются.
Пример процесса биотрансформации — превращение глюкозы во
фруктозу под воздействием фермента глюкозоизомеразы. Оба сахара
имеют одну формулу С6Н12О6, но различную пространственную структуру молекулы.
48
Интересно, что подобный процесс в природе осуществляют пчелы (если кормить их глюкозой). Но поскольку здесь в операции принимает участие макроорганизм — пчела, мы не можем данный процесс
назвать биотехнологическим.
Или другой пример. Глицерин, представляющий собой трехатомный спирт, под воздействием клеток глюконобактерий превращается в
диоксиацетон:
С Н2-ОН
|
СН-ОН →
|
С Н2-ОН
Н С 2-ОН
|
С=О
+ Н2
|
С Н 2-ОН
Как следует из схемы реакции, небольшое изменение в структуре
молекулы (уходят два атома водорода, то есть происходит дегидрирование) приводит к образованию нового вещества, по своим свойствам
заметно отличающегося от исходного — глицерина.
4. Потребление микроорганизмами из жидких сред различных веществ, которые являются нежелательными примесями (загрязнениями). Здесь биомасса микроорганизмов служит промежуточным
агентом, по окончании процесса она становится ненужной. Такие процессы применяют при биологической очистке сточных вод. Продуктом
здесь является очищенная вода, а биомасса активного ила, которая потребляет загрязнения, все время отводится от системы и затем обезвреживается или перерабатывается для получения из нее других полезных
продуктов.
5. Выщелачивание с помощью микроорганизмов, то есть перевод
в растворенное состояние некоторых веществ, находящихся в твердых
телах. Примером является микробиологическое выщелачивание ценных металлов из руд — меди, цинка, урана и др.
6. Особым случаем является использование биохимической деятельности микроорганизмов с целью образования газов и за счет этого
создания, например, пористых материалов. Так, для этого используют
дрожжи при приготовлении хлеба. Одно из назначений дрожжей при
получении пива или шампанского — также создать в среде высокую
концентрацию растворенного диоксида углерода, чтобы вино или пиво
хорошо пенилось.
49
Рассмотренные шесть основных направлений биохимической деятельности микроорганизмов являются основой для получения широкого класса продуктов биотехнологии.
2.5 Преимущества биотехнологических процессов
По сравнению с химической технологией, биотехнология имеет
следующие основные преимущества:
1)
возможность получения специфичных и уникальных
природных веществ, часть из которых (например, белки, ДНК) еще не
удается получать путем химического синтеза;
2)
проведение биотехнологических процессов при относительно невысоких температурах и давлениях;
3)
микроорганизмы имеют значительно более высокие скорости роста и накопления клеточной массы, чем другие организмы. Например, с помощью микроорганизмов в ферментаторе объемом 300 м3
за сутки можно выработать 1 т белка (365 т/год). Чтобы такое же количество белка в год выработать с помощью крупного рогатого скота,
нужно иметь стадо 30 000 голов. Если же использовать для получения
белка с такой же скоростью производства бобовые растения, например
горох, то потребуется иметь поле гороха площадью 5400 га;
4)
в качестве сырья в процессах биотехнологии можно использовать дешевые отходы сельского хозяйства и промышленности;
5)
биотехнологические процессы по сравнению с химическими обычно более экологичны, имеют меньше вредных отходов,
близки к протекающим в природе естественным процессам;
6)
как правило, технология и аппаратура в биотехнологических производствах более просты и дешевы.
3 ТИПОВАЯ СХЕМА И ОСНОВНЫЕ СТАДИИ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ
Продукты биотехнологии получают по индивидуальным технологиям со своими биологическими агентами, сырьем, числом стадий
производства и их технологическими режимами. Тем не менее, можно
представить себе обобщенную типовую схему биотехнологических
производств.
50
Схема состоит из стадий, в каждой из которых сырье претерпевает определенные технологические воздействия и последовательно превращается во все более сложные полупродукты и, наконец,
в конечный продукт. Общий вид такой типовой схемы представлен на
рисунке 16.
газ
Подготовительные
стадии
Приготовление
среды
Стерилизация среды
Подготовка и
стерилизация газов
(воздуха)
Подготовка посевного
материала
Приготовление
биокатализатора
Предварительная
обработка сырья
Биотехнологические
стадии
Ферментация
Биотрансформация
Биокатализ (реакции с
ферментами)
Бноокисление
Местановое брожение
Биокомпостирование
Биосорбция
Бактериальное
выщелачивание
Биодеградация
Выделение внеклеточных продуктов
Разделение жидкости и
биомассы
Отстаивание
Фильтрация
Сепарация
Центрифугирование
Микрофильтрация
Ультрафильтрация
Коагуляция
Флотация
Биодеградация
Очистка
воздуха
Выделение внутриклеточных продуктов
Экстракция и экстрагирование Осаждение
Центрифугирование
Адсорбция
Ионный обмен
Отгонка, ректификация
Дезинтеграция
Гидролиз
Ультрафильтрация
Ферментолиз
Концентрирование
продукта
Выпаривание
Сушка
Осаждение
Кристаллизация
Фильтрация
Ультрафильтрация
Нанофильтрация
Изготовление
готовой формы
продукта
Экстракция
Осаждение
Адсорбция
Ионный обмен
Хроматография
Диализ
Ультрафильтрация
Обратный осмос
Ферментолиз
Кристаллизация
Ректификация
Гранулирование
Дражирование
Таблетирование
Розлив
Фасовка
Ампулированне
Рисунок 16 - Типовая схема, основные стадии и технологические процессы в биотехнологических производствах
51
Основная стадия биотехнологического производства. Основной
стадией является собственно биотехнологическая стадия, на которой с
использованием того или иного биологического агента (микроорганизмов, изолированных клеток, ферментов или клеточных органелл) происходит преобразование сырья в тот или иной целевой продукт.
Обычно главной задачей биотехнологической стадии является получение определенного органического вещества.
Однако биотехнологическая стадия, как правило, включает в себя
не только синтез новых органических соединений, но и ряд других
биотехнологических процессов, перечисленных далее.
Ферментация — процесс, осуществляемый с помощью культивирования микроорганизмов.
Биотрансформация — процесс изменения химической структуры вещества под действием ферментативной активности клеток микроорганизмов или готовых ферментов. В этом процессе обычно не
происходит накопления клеток микроорганизмов, а химическая структура вещества меняется незначительно. Вещество как бы уже в основном готово, биотрансформация осуществляет его химическую модификацию: добавляет или отнимает радикалы, гидроксильные ионы, дегидрирует и т. п.
Биокатализ — химические превращения вещества, протекающие
с использованием биокатализаторов-ферментов.
Биоокисление — потребление загрязняющих веществ с помощью
микроорганизмов или ассоциации микроорганизмов в аэробных условиях.
Метановое брожение — переработка органических отходов с
помощью ассоциации метаногенных микроорганизмов в анаэробных
условиях.
Биокомпостирование — снижение содержания вредных органических веществ ассоциацией микроорганизмов в твердых отходах, которым придана специальная взрыхленная структура для обеспечения
доступа воздуха и равномерного увлажнения.
Биосорбция — сорбция вредных примесей из газов или жидкостей микроорганизмами, обычно закрепленными на специальных твердых носителях.
Бактериальное выщелачивание — процесс перевода нерастворимых в воде соединений металлов в растворенное состояние под действием специальных микроорганизмов.
Биодеградация — деструкция вредных соединений под воздействием микроорганизмов – биодеструкторов.
52
Обычно биотехнологическая стадия имеет в качестве выходных
потоков один жидкостной поток и один газовый, иногда только один
— жидкостной.
В случае если процесс протекает в твердой фазе (например, созревание сыра или биокомпостирование отходов) выходом является
поток переработанного твердого продукта.
4 ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ БИОКАТАЛИЗА И
БИОТРАНСФОРМАЦИИ
Известно, что биокатализ и биотрансформация являются процессами химического превращения одного или более веществ, протекающими под действием катализаторов - ферментов, применяемых в очищенном виде или в составе клеток микроорганизмов, либо изолированных животных или растительных клеток. При этом биотрансформация
— это относительно неглубокое химическое превращение уже в основном сформированного химического соединения под влиянием ферментов. При биокатализе же возможен синтез нового вещества из различных по структуре реагентов или разложение сложного вещества под
действием ферментов. Объединяет их, прежде всего использование
специфических катализаторов — молекул фермента, имеющих белковую природу. Ферменты также называют энзимами. Наука, изучающая
ферменты и ферментативные реакции, называется энзимологией.
В клетках микроорганизмов одновременно протекает множество
биохимических реакций. Ферменты, ускоряющие биохимические реакции, имеют высокую каталитическую активность, то есть эффективно
снижают энергию активации, необходимую для осуществления реакции, благодаря тому, что способствуют образованию промежуточных
продуктов, требующих меньшей энергии.
Ферменты вырабатываются клеткой в соответствии с ее потребностями, их содержание может колебаться в значительной степени.
Ферменты имеют высокую специфичность, а их активность зависит от
различных факторов (температуры, рН, состава питательной среды,
наличия токсичных веществ).
Природа фермента оказывает решающее влияние на кинетику
ферментативных реакций.
В общем случае, механизм действия фермента может быть
выражен следующими структурными схемами:
для одного субстрата S
S + Е ↔ES→ P+E;
53
для двух субстратов S1 и S2
S1 + S2 + Е ↔E S1 S2→ P+E
В обоих случаях реакции превращения субстрата (S) в продукт
(P) протекают через промежуточную стадию взаимодействия энзима
(E) с субстратом (S) и образования фермент-субстратных комплексов
(ES).
Молекула фермента — очень длинный закрученный белок, к тому
же свернутый в виде пространственного упругого клубка причудливой
формы (рис. 17).
Рисунок 17 - Пространственная конформация молекулы
фермента
Спутанность и беспорядок белка не случайны — они строго обусловлены чередованием аминокислот в молекуле фермента. В этой
структуре есть участки, куда легко притягивается определенная форма
молекулы субстрата.
Доказано, что скорость реакции на ферменте в 10 млрд. раз больше, чем без него. Вот почему ферменты запросто осуществляют многие процессы, которые кажутся нереальными без них, например взаимодействие атмосферного азота с водой, с образованием аммонийных
соединений.
Специфичность действия ферментов
Ферменты имеют разную специфичность и по отношению к субстратам. По степени специфичности ферменты делятся на следующие
основные виды, упоминаемые в порядке снижения специфичности.
1. Стериометрическая субстратная специфичность – фермент катализирует превращение только одного из возможных стереоизомеров субстрата. Это крайний случай специфичности. Например,
фумаратгидратаза катализирует превращение только фумаровой кислоты (присоединение к ней молекулы воды), но не её стереоизомера –
малеиновой кислоты.
54
2. Абсолютная субстратная специфичность – фермент катализирует превращение только одного субстрата. Например, уреаза
катализирует превращение только мочевины.
3. Абсолютная групповая субстратная специфичность –
фермент катализирует превращение исходной группы субстратов.
Например, алкогольдегидрогеназа катализирует превращение не только этанола, но и других алифатических спиртов, хотя и с разной скоростью.
4. Относительная групповая субстратная специфичность
– фермент специфически действует не на группу молекул субстрата, а
на отдельные связи определенной группы субстратов. Например, пищеварительные ферменты – пепсин, трипсин – специфичны по отношению к пептидным связям, образованным определенными аминокислотами в различных белках.
5. Относительная субстратная специфичность – фермент
катализирует превращение субстратов, принадлежащих к разным
группам химических соединений. Например, фермент цитохром Р450
участвует в гидроксилировании разных соединений (около 7000 наименований). Это наименее специфичная ферментная система, участвующая в превращении природных веществ, лекарств и ядов.
Чем же объясняется специфичность действия ферментов? На
этот счет существует две точки зрения. Одна из них – гипотеза Э. Фишера, или, как её называют “ключа в замке”, или “шаблона”, что в
основе специфичности лежит строгое стерическое соответствие субстрата и активного центра фермента. По Фишеру, фермент является
жесткой структурой, активный центр которого представляет собой
слепок субстрата. Если субстрат подходит к активному центру, как
ключ к замку, то реакция произойдет. Если же субстрат (“ключ”) несколько изменен, то он не соответствует активному центру (“замку”), и
реакция становится невозможной. Гипотеза Фишера привлекает своей
простотой в объяснении специфичности действия ферментов. Однако с
позиции гипотезы “шаблона” трудно объяснимы, скажем, абсолютная
и относительная групповая субстратная специфичность, поскольку
слишком разнообразная конфигурация “ключей” (субстратов), которые
подходят к одному и тому же “замку”.
Объясняет эти внешние противоречия другая гипотеза, предложенная Кошлендом. Она получила название “вынужденного соответствия”. По мнению Кошленда, молекула фермента не жесткая,
а гибкая, эластичная (что подтверждается современными методами исследования); конформация фермента и его активного центра изменя-
55
ется при присоединении субстрата или других лигандов; и, наконец,
активный центр – не жесткий слепок субстрата, а субстрат вынуждает
его принять соответствующую форму в момент присоединения (отсюда и название гипотезы “вынужденного соответствия”).
Иными словами, “замочная скважина”, по Кошленду, сделана из
податливого материала и поэтому принимает окончательную форму
“ключа” при их контакте. Эта гипотеза также позволяет объяснить, почему происходит превращение близких аналогов субстратов. Если
“ложный” субстрат (квазисубстрат) слабо отличается от природного, и
активный центр принимает конформацию, близкую к истинной, то расстановка каталитических групп в таком фермент-субстратном комплексе позволит осуществиться реакции. Этот “обман” фермент как бы
не замечает. Однако ферментативная реакция пойдет не так быстро,
как с истинным субстратом, поскольку нет идеального расположения
каталитических групп в активном центре фермента. Только в том случае, если конфигурация квазисубстрата не позволяет правильно разместиться каталитическим группам, то реакция не пойдет. Очевидно,
неодинаковая степень специфичности разных ферментов отражает как
бы диапазон конформационных перестроек активного центра. Если он
ограничен вплоть до естественно возможной конформации, то фермент
высоко специфичен. Если возможности перестройки велики, то фермент срабатывает и на квазисубстраты.
4.1 Основные группы биотрансформаций
Рассмотрим основные группы технически важных биотрансформаций:
• гидроксилирование различных позиций молекулы вещества
−
(добавление гидроксильной группы ОН );
• введение двойной связи в том или ином месте;
• обрыв боковых цепей у разветвленных молекул;
• окисление молекул спиртов до кетонов;
• дегидрирование;
• изомеризация;
• ароматизация (появление ароматических углеводородных радикалов).
56
4.2 Основные виды реакций биокатализа
Назовем основные виды реакций биокатализа (практически они
будут совпадать с наименованиями основных групп ферментов) :
• окисление и восстановление;
• перенос химических функциональных групп от одних молекул
на другие;
• гидролиз;
• реакции с участием двойных связей (образование или, наоборот, присоединение к ним химических групп);
• изомеризация, или структурные изменения в пределах одной
молекулы;
• синтез сложных соединений (как правило, требующий энергетических затрат).
Как видно из приведенных перечислений, биотрансформация и
биокатализ являются процессами, сходными по своей природе.
4.3 Классификация ферментов
Существует классификация ферментов, ускоряющих биохимические превращения. Все ферменты могут классифицироваться в зависимости от реакций, которые они ускоряют:
• Оксиредуктазы - ускоряют окислительно-восстановительные
реакции;
• Трансферазы - ускоряют перенос атомной группы радикалов
от одного соединения к другому;
• Гидролазы - ускоряют процесс разложения, протекающие с
участием воды;
• Дегидрогеназы- осуществляют перенос Н;
• Изомеразы – способны ускорять процессы внутренней перегруппировки молекул;
• Синтетазы – определяют возможность синтеза сложных соединений из простых.
57
4.4 Преимущества и недостатки биокаталитических
процессов
Рассмотрим преимущества и недостатки биокаталитических процессов, по сравнению с превращениями в присутствии химических катализаторов.
Преимущества
1.Каталитическая активность ферментов высокоспецифична и ограничивается одним типом реакций, так что не происходит побочных
реакций.
2. Ферменты могут сразу атаковать исходную молекулу и осуществлять превращение, для которого потребовалось бы несколько вспомогательных многоступенчатых химических синтезов.
3. Химические преобразования вещества упрощаются — одна или
две ступени вместо многоступенчатого синтеза.
4. Ферментативные реакции могут протекать с большой скоростью в мягких условиях.
Недостатки
1. Для получения чистого продукта нужен и чистый фермент, а
его выделение очень дорого.
2. В выходящем из реактора продукте сохраняется фермент, который продолжает действовать.
3. Дорогостоящий фермент используется только однократно.
4. Свободный фермент быстро инактивируется (то есть разрушается).
5. В отличие от биомассы, которая самовоспроизводится в процессе непрерывной ферментации, фермент в непрерывном процессе
нужно все время вводить, так как он вымывается с продуктом реакции.
4.5 Основные понятия иммобилизации ферментов
Чтобы преодолеть описанные ранее недостатки процессов с использованием свободных ферментов, надо придумать способ удержания ферментов в аппарате или легкий способ их выделения из реакционной жидкости после завершения процесса.
58
1 - биореактор, 2- проточный мембранный модуль
Рисунок 18 - Схема мембранного биореактора с выносным
модулем
Возможно отделение ферментов с помощью ультрафильтрации.
Схема установки для проведения процесса биотрансформации с ультрафильтрационным выносным модулем представлена на рисунке 18.
Реакционная жидкость может циркулировать через ультрафильтрационный модуль, который задерживает выход фермента, не
мешая выходу продукта. Получается непрерывный процесс, в который
не требуется добавлять фермент. Этот способ, однако, тоже имеет недостатки:
- мембранные установки часто выходят из строя, и при их использовании часть ферментов «проскакивает», а часть может «застре
вать» на мембране, ухудшая фильтрацию, и, приводя к необратимой
потере фермента;
- многие ферменты, будучи в свободном состоянии (растворенном в
жидкости или в виде взвешенных коллоидных частиц), подвержены
довольно быстрой инактивации, так что срок службы фермента небольшой и необходимость расходования свежего фермента, стоимость
которого высока, сохраняется.
Поэтому такой путь совершенствования процессов биотрансформации большого применения не нашел. Только если сам субстрат нерастворим или находится в коллоидном состоянии, применение подобных систем имеет смысл.
В середине 1950-х годов возникла блестящая идея создания «нерастворимых», или «прикрепленных к матрице», или «связанных» ферментов, которые позднее стали называть иммобилизованными.
К этой идее и ее реализации имел отношение бывший президент
Израиля Э. Качальский-Катцир. Мы привыкли, что президентами ста-
59
новятся политики, хозяйственники, юристы. Но этот человек до своего
избрания был ученым-биохимиком и после пребывания на президентском посту вернулся в науку и до своей смерти в 1995 г. возглавлял
институт биотехнологии в Тель-Авиве. Термин иммобилизация происходит от латинского слова «immobilis», что означает неподвижный.
Иммобилизация - это прикрепление фермента к некоторому нерастворимому носителю, причем таким образом, чтобы фермент мог
обмениваться с раствором молекулами субстрата и продукта.
Легко можно оценить красоту этого способа. Во-первых, появляется простая возможность отделять и многократно использовать такой иммобилизованный фермент. Во-вторых, оказалось, что закрепленный фермент сохраняется в активном состоянии гораздо дольше, чем
свободный, растворенный.
4.6 Методы иммобилизации ферментов
Существуют различные способы закрепления ферментов на носителе, основные из которых перечислены ниже.
1. Адсорбция на носителе (рис.19). Носителями могут быть: неорганические материалы (стекло, силикагель, бентонит, оксид алюминия, диоксид титана и др.); природные полимеры (целлюлоза, коллаген); синтетические полимеры (нейлон, полиэтилен, полипропилен).
1— гранула носителя; 2 —молекулы фермента
Рисунок 19 – Иммобилизация фермента методом адсорбции
на носителе
60
2.Включение в гель агар-агара, альгинатов, карагинана (рис. 20).
Молекулы фермента сидят в порах геля. Гель проницаем для молекул
субстрата и продуктов реакции за счет молекулярной диффузии.
Рисунок 20 - Иммобилизация фермента методом включения
в гель
3. Ковалентное связывание с носителем. Носителем в этом случае является полимерный материал, длинные молекулы которого в
разных местах связаны химическими ковалентными связями с молекулами фермента (рис. 21).
Рисунок 21 - Иммобилизация фермента методом ковалентного связывания с носителем
4. Поперечная «сшивка» молекул фермента при помощи бифункциональных реагентов. Молекулы фермента, свободно перемещающиеся в растворе, соединяются между собой различными своими
участками с помощью определенных реагентов (рис.22).
61
Рисунок 22 - Иммобилизация фермента методом поперечной
«сшивки»
Получается некое пространственное образование, включающее
активные молекулы фермента и довольно большие пространства между ними, удобные для диффузии молекул субстрата и продукта реакции.
5.Адсорбция на носителе с последующей поперечной «сшивкой».
Этот способ сочетает в себе способы 1 и 4. По сравнению с обычной
адсорбцией на носителе получается более глубокий слой молекул фермента, доступных для субстрата и продукта, а по сравнению с обычной
«сшивкой» — более прочная гранула, имеющая жесткий остов в центре (рис. 23).
Рисунок 23 - Иммобилизация фермента методом адсорбции
на носителе с последующей поперечной “сшивкой”
6. Включение в полупроницаемые капсулы. Внутри капсулы
(рис.24) как бы существует коллоидный раствор фермента. Внешняя
оболочка капсулы довольно прочная, непроницаема для фермента, но
проницаема для продукта и субстрата.
62
1 — капсула с полупроницаемой стенкой;
2 —молекулы фермента, взвешенные в растворе внутри
капсулы
Рисунок 24 - мобилизация фермента методом включения в
полупроницаемые капсулы
7. Сополимеризация фермента и полимера-носителя. Напоминает включение в гель, но матрица создается путем сополимеризации
полифункционального реагента и фермента (фермент не просто находится в «клетке» геля, но и сцеплен с ней). Этот способ является сочетанием способов 2 и 4. Примером является широко распространенный
полиакриламидный гель, в котором в качестве реагента используется
глутаровый альдегид.
8. Физическое смешение — перемешивание фермента и порошка носителя. Метод довольно прост, но не очень надежен. Фермент
может отслаиваться от носителя и переходить в раствор.
4.7 Оценка качества иммобилизованных ферментов и
метода иммобилизации
Разработка иммобилизованного фермента (биокатализатора) —
это целое искусство. Здесь важны и рецептура входящих в биокатализатор компонентов, и режим температуры, рН, перемешивания, при котором осуществляется иммобилизация, и методы отмывки свободного
фермента и остатков не прореагировавшего мономера или реагентов.
63
Эта технология часто является надежно охраняемым секретом
фирм. При оценке метода иммобилизации обычно учитывают три характеристики получаемого биокатализатора:
1) потеря активности при иммобилизации. Иммобилизация — это
всегда некоторое насилие над ферментом. Это особенно справедливо в
методах, где в процессе иммобилизации используют химические реагенты, экстремальные для фермента значения рН и температуры. Поэтому сразу после иммобилизации суммарная активность фермента
ниже, чем до нее;
2) стабильность биокатализатора. Это его способность противостоять деградации молекул фермента в процессе последующей его
работы и хранения. Наиболее надежно, конечно, проверить образцы
биокатализаторов при длительной работе, хотя в практике часто используют ускоренные методы старения и оценки стабильности;
3) активность биокатализатора. Она зависит не только от первого
показателя — потери активности, но также и от того, насколько активен был исходный фермент, то есть насколько хорошо и много удалось
«затолкать» фермента в биокатализатор.
Разные оценки качества биокатализатора часто бывают противоречивыми. Выбирать приходится на основе экономического сравнения — сколько продукта, и с какой производительностью может дать
тот, или иной биокатализатор и какова при этом получается его цена.
4.8 Примеры использования ферментов
Наиболее известные примеры использования ферментов.
1. Получение глюкозо-фруктозных сиропов из крахмала. Здесь
используется 3 фермента: амилаза — для разжижения крахмала, глюкоамилаза — для осахаривания крахмала (трансформации в глюкозу) и
глюкозоизомераза — для изомеризации глюкозы в более сладкий сахар
фруктозу.
2. Обработка молочной сыворотки. Фермент бета-галактозидаза
способствует расщеплению молочного сахара лактозы на глюкозу и галактозу.
Тот же фермент используется для обработки молока и получения
безлактозного молока.
3. Производство этанола, пива. Здесь используют те же ферменты, что и для получения глюкозо-фруктозных сиропов (кроме глюкозоизомеразы) — амилаза и глюкоамилаза.
64
4. Обработка молока при получении творога и сыров. Здесь используется молокосвертывающий фермент.
5. Стиральные порошки с биодобавками. Используются ферменты протеазы.
6. Производство вина и соков. Здесь используется фермент пектиназа, который позволяет превращать взвешенные частицы виноградной
или фруктовой мезги в растворимые сахара.
7. Получение L-аминокислот, преимущественно усваиваемых животными, из D-аминокислот, которые получаются при химическом
синтезе. Такую изомеризацию осуществляют ферменты аминоацилазы.
8. Очистка кожи от волос в кожевенной промышленности. Эта
операция осуществляется с использованием ферментов протеаза, коллагеназа.
9. Осуществление превращений стероидов (например, превращение гидрокортизона в преднизолон). Используется иммобилизованный
фермент дегидрогеназа.
10. Модификация природных антибиотиков. Мы уже упоминали
практически важный процесс получения 6-аминопеницилла-новой кислоты (6-АПК) из пенициллина. Используется фермент пенициллинамидаза или иммобилизованные клетки бактерий, продуцирующих этот
фермент.
5 ФЕРМЕНТАЦИЯ
Ферментация – это процесс, в котором происходит преобразование исходного сырья в продукт с использованием биохимической деятельности микроорганизмов или изолированных клеток. Практически
синонимами слова «ферментация» можно считать такие термины, как
выращивание микробов, культивирование, биосинтез.
Следует отличать ферментацию от биотрансформации и биокатализа.
Исходную среду в процессах ферментации или ее основной компонент часто обозначают словом «субстрат».
5.1 Классификация процессов ферментации
По признаку целевого продукта процесса, ферментация может
быть следующих типов:
65
1) ферментация, в которой целевым продуктом является сама биомасса микроорганизмов; именно такие процессы часто обозначают
словами «культивирование», «выращивание»;
2) целевым продуктом является не сама биомасса, а продукты метаболизма — внеклеточные или внутриклеточные; такие процессы часто называют процессами биосинтеза;
3) задачей ферментации является утилизация определенных компонентов исходной среды; к таким процессам относятся биоокисление,
метановое брожение, биокомпостирование и биодеградация.
По основной среде, в которой протекает процесс,
ферментация бывает:
1)
поверхностная (твердофазная);
2)
глубинная (жидкофазная);
3)
газофазная ферментация.
По числу видов микроорганизмов различают:
1)
ферментацию на основе монокультуры;
2)
смешанное культивирование, где участвует микробная ассоциация двух и более культур.
По способу организации во времени:
1)
периодическая;
2)
непрерывная;
3)
многоциклическая;
4)
отъемно-доливная;
5)
периодическая с подпиткой субстрата;
6)
полунепрерывная с подпиткой субстрата.
Рассмотрим более подробно периодическую ферментацию.
5.2 Основные параметры периодической ферментации
В периодических процессах загрузка сырья и посевного материала в аппарат производится единовременно, затем в аппарате в течение
определенного времени идет процесс, а после его завершения полученная ферментационная жидкость выгружается из аппарата.
После того как в аппарат загрузили среду, создали необходимую
температуру, добавили посевной материал и стали подавать воздух для
аэрации, собственно говоря, и начался процесс ферментации. Как следить за протеканием этого процесса? Для этого необходимо время от
66
времени или непрерывно определять, какие изменения происходят в
ферментационной среде.
Обычно состояние процесса характеризуется следующими основными параметрами:
− концентрация биомассы микроорганизмов X;
− концентрация субстрата S;
− концентрация продукта Р.
Все эти концентрации приведены к единице объема среды.
5.3 Понятие скорости роста
Прирост биомассы зависит от изменения размеров отдельных
клеток и от увеличения числа клеток.
Абсолютная скорость роста (валовая) характеризуется приростом биомассы за единицу времени
V = dm / dt.
Относительная скорость роста (удельная) – это абсолютная
скорость роста культуры отнесенная к единице исходной биомассы
M = V / m.
В идеальном случае рост микробной культуры идет с постоянной
удельной скоростью. В этом случае через определенный промежуток
времени из каждой клетки образуется две других, через следующий
промежуток времени разделяется уже две клетки и вся биомасса увеличивается дважды в два раза
N 1 = 2 n N0 ,
где n - число генераций (делений клетки);
N1 – число клеток в определенный момент времени;
N0 - число клеток в начальный момент времени.
5.4 Фазы периодической ферментации
Рассмотрим, как изменяется концентрация биомассы в процессе
периодической ферментации (рис.25).
67
I —лаг-фаза; II — фаза ускорения роста; III — фаза экспоненциального
роста;IV — фаза замедления роста; V — стационарная фаза;
VI — фаза отмирания.
Рисунок 25 - Определение фаз ферментации по кривой роста
биомассы во времени
В начале ферментации некоторое время микроорганизмы как бы
приспосабливаются к новой среде, их концентрация не меняется. Этот
период называется лаг-фаза. В этот период клетки не только адаптируются к новым условиям, но и частично изменяют среду, делая ее
пригодной для себя. Чем полноценнее субстрат, тем короче лаг-фаза.
Далее начинается рост клеток — это фаза ускорения роста. Третья
фаза — экспоненциального роста, это фаза наиболее интенсивного
роста клеток, здесь происходит наибольший относительный прирост
биомассы. Затем относительная скорость роста начинает уменьшаться
— это фаза замедления роста. Достигнув некоторой максимальной
величины, концентрация биомассы далее перестает возрастать. В этой
фазе — стационарной — в среде истощаются питательные вещества и
накапливаются продукты обмена, тормозящие рост. Биомасса растет и
одновременно происходит гибель части клеток (автолиз), так что общая концентрация клеток сохраняется постоянной. Наконец в фазе
отмирания автолиз начинает преобладать над ростом, и концентрация
биомассы микроорганизмов снижается.
В процессе роста культуры изменяется морфология клеток, их химический состав и физиологическое состояние. Культура может неопределенно долго задержаться на стадии интенсивного роста и высокой
физиологической активности. Это определяется действием факторов
68
среды. Создавая соответствующие условия, можно остановить развитие культуры на любой точке кривой роста и таким образом заставить
микроорганизмы «работать» с наибольшей интенсивностью.
5.5 Преимущества и недостатки периодической ферментации
Преимущества:
−
−
−
−
−
малая стоимость аппарата и системы управления;
гибкость – возможность наработки в одном биореакторе
разных продуктов;
процесс менее подвержен инфицированию и мутациям
клеток из-за отсутствия протока и притока и из-за относительно малого времени ферментации;
условия культивирования можно поддерживать в оптимуме, как в фазе роста биомассы, так и в фазе биосинтеза
продукта;
процесс удобен для реализации биосинтеза вторичных
метаболитов.
Недостатки:
−
−
−
необходимость приготовления посевного материала;
велико непродуктивное время ферментации; производительность по биомассе и продукту часто ниже, чем при
непрерывном процессе;
труднее поддерживать необходимые параметры из-за нестационарности процесса.
6 ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ
Биотехнологические процессы широко представлены в таких отраслях народного хозяйства как энергетика, гидрометаллургия, электроника, медицина, химическая, пищевая промышленность, они вносят
существенный вклад в природоохранные технологии, позволяя с помощью микробных ассоциаций восстанавливать загрязненные в результате антропогенного воздействия естественные среды обитания
живых организмов — гидро-, лито- и атмосферу.
69
6.1 Биотехнологические процессы в решении
экологических задач
Окружающая среда и биотехнология. По мере того как увеличивается население Земли и развивается промышленность, все более серьезной становится проблема защиты окружающей среды. В решении
такого рода задач биотехнология играет все возрастающую роль, в частности, в том, что касается разработки новых или усовершенствовании существующих способов переработки отходов. Новейшие процессы переработки необычных отходов будут основаны на использовании
микроорганизмов, обладающих новыми, неизвестными ранее или искусственно созданными катаболическими способностями.
Процесс минерализации органических отбросов, основанный на
использовании активного ила, был разработан в 1914 году. С тех пор
он был существенно модернизирован, стал более сложным и производительным и используется сегодня во всем мире для переработки стоков.
Также большие надежды возлагаются и на биоинженерию. Разработка биодатчиков поможет осуществлять мониторинг и контролировать условия среды. Биоиндикаторами называются живые организмы
или их сообщества, жизненные функции которых тесно коррелируют с
определенными факторами среды, что могут применяться для их оценки.
Методы очистки стоков и выбросов, обезвреживания твердых отходов, а также вопросы биоиндикации и биотестирования, методов
оценивающих состояние природной среды по реакциям живых организмов будут рассмотрены более подробно в последующем в соответствующих разделах специальных дисциплин: «Технология очистки
воды», «Технология очистки газов», «Промышленная экология»,
«Мониторинг».
Назовем основные биотехнологические процессы, используемые
в практике природоохранных технологий.
Биологическая очистка стоков. Существуют микроорганизмы,
для которых загрязнения, содержащиеся в сточных водах, являются
питательными веществами. В начале XX века произошла революция в
городском хозяйстве, когда был предложен метод аэробной биологической очистки сточных вод с помощью активного ила — сложной смеси
микроорганизмов. Хотя при этом требуется перемешивать жидкость и
непрерывно аэрировать ее воздухом, такой способ позволяет перераба-
70
тывать большие объемы стоков с самыми разнообразными загрязнениями — от хозяйственно-бытовых до промышленных.
Биосорбция тяжелых металлов из стоков. Обычная очистка стоков удаляет из них в основном органические загрязнения. Если же в
стоках содержатся тяжелые металлы, такие, как медь, никель, хром,
свинец и другие, то требуются дополнительные методы очистки, например биотехнологические. Имеются определенные виды микроорганизмов, которые способны осаждать на себе (сорбировать) металлы,
растворенные в жидкости. Концентрация металлов при этом возрастает
настолько, что после тепловой обработки биосорбент можно рассматривать как сырье для получения цветных металлов.
Биокомпостирование твердых отходов. Аналогом аэробной
очистки стоков является аэробное биокомпостирование твердых отходов. Твердые отходы смешиваются с микроорганизмами, разлагающими вредные загрязнения, и балластным материалом типа торфа,
который обеспечивает доступ кислорода к микроорганизмам. Это позволяет превратить отходы в удобрение или просто использовать их в
качестве подсыпки для дорог, в строительстве и в других случаях.
Метановое сбраживание твердых отходов. Еще в 1776 г. Вольта обнаружил, что в болотном газе содержится метан. Но только значительно позже была определена роль анаэробных микроорганизмов в
этом процессе. С1901 г. успешно применяют анаэробное сбраживание
осадка избыточного активного ила, образующегося при работе установок биологической очистки сточных вод. В результате сбраживания
получают газ, содержащий 65 % метана и 30 % диоксида углерода, который вполне может быть использован для отопления. Процесс протекает в специальных аппаратах — метантенках, где накапливающийся
газ находится под некоторым давлением. Сброженный осадок, если
только он не содержит повышенных концентраций тяжелых металлов,
успешно используют как удобрение. Он лучше исходного осадка по составу, и в нем почти полностью отсутствуют болезнетворные микроорганизмы.
Метановое брожение применяют также и для переработки концентрированных жидких отходов, хотя скорость его протекания меньше, чем в случае аэробной биологической очистки активным илом. С
середины XX века процесс анаэробного сбраживания с получением
биогаза стал очень популярен применительно к отходам животноводческих ферм, особенно в теплых странах, таких, как Китай и Индия.
Биологическая очистка газовых выбросов. Многие выбросы в
атмосферу содержат вредные или дурно пахнущие примеси. Для их
71
очистки применяют биофильтры, заполненные насадкой, на которой
закреплены специальные микроорганизмы. Вредные примеси сорбируются на насадке и затем потребляются и обезвреживаются микроорганизмами.
Биодеградация нефтяных загрязнений на почве и воде. При аварийных разливах нефти используют биотехнологические способы восстановления загрязненных территорий, которые обрабатывают специально выращенными нефтеокисляющими микроорганизмами, внося
различные добавки для их азотистого и фосфорного питания, что позволяет утилизировать углеводороды нефти, превращая их в биомассу
микроорганизмов и диоксид углерода.
Биодеградация химических пестицидов и инсектицидов. Для
борьбы с сорняками и вредителями растений часто используют химические пестициды и инсектициды. Они действуют жестко и в короткое
время ликвидируют сорняки и вредителей на обработанном участке.
Однако в дальнейшем возникают проблемы: пестициды создают химическую опасность, сохраняясь на растениях или попадая в поверхностные природные воды. Чтобы это исключить, разработаны биопрепараты из специфических микроорганизмов или ферментов, позволяющих
ускорить деградацию пестицидов.
Борьба с накоплением метана в шахтах. Мы часто слышим о
взрывах в шахтах, вызванных нарушением условий эксплуатации. От
метана в шахтах трудно освободиться: нужна очень сильная вентиляция, чтобы снизить концентрацию ниже взрывоопасного предела. Биотехнологи предложили вносить в шахты — в отработанные штреки —
суспензию микроорганизмов, способных потреблять метан. Это позволяет снижать концентрацию метана. Рассматривались также проекты
использования метана, отсасываемого вентиляцией из шахт, для непрерывного выращивания этих микроорганизмов, а их избыток использовать для получения кормового белка.
Обессеривание нефти и каменного угля. Имеются микроорганизмы, способные переводить серу из сульфидов и меркаптанов в элементную серу. На основе использования таких микроорганизмов разрабатывают технологии обессеривания угля и нефти. В результате и топливо электростанций, и моторное топливо автомобилей становится более экологичным — дает меньше выбросов диоксида серы в атмосферу.
Обогащение воздуха кислородом. Хотя диоксид углерода — продукт дыхания многих живых существ — считается безвредным, все же
в повышенных концентрациях он оказывает неблагоприятное воздей-
72
ствие на животный мир и человека. Работа многих промышленных
предприятий, тепловых электростанций приводит к постепенному повышению его концентрации в атмосфере. Следствием этого может
стать глобальное потепление на Земле, связанное с так называемым
«парниковым эффектом». Это влечет за собой многие весьма неприятные последствия для обитателей Земли.
Сейчас роль очистителя атмосферы от диоксида углерода играют
травянистые растения и деревья, но уменьшение зеленого покрова в
связи с урбанизацией подрывает сами основы существования человечества.
В компактной форме эти проблемы возникают при организации
систем жизнеобеспечения на космических кораблях, подводных лодках
и, вообще, в замкнутых пространствах обитания людей. Для поглощения выдыхаемого диоксида углерода и восполнения убыли кислорода
на таких объектах уже давно предлагалось культивирование микроводорослей (или цианобактерий) хлорелла, которые под действием солнечного света позволяют решать эту задачу. Может быть, этот прием в
дальнейшем будут использовать и в более крупных масштабах, например для улавливания углекислоты в выбросах тепловых электростанций.
Биоразлагаемые полимеры. Вещи из полиэтилена, полипропилена и других пластмасс, в буквальном смысле слова, окружают нас повсюду. Особенно много пластиковой упаковки, которую после использования чаще всего просто выбрасывают. И здесь ее, в принципе ценное, свойство — устойчивость к разложению влагой, светом, холодом
и теплом, почвенными микроорганизмами — играет отрицательную
роль. Земной шар буквально переполнен использованной пластмассовой упаковкой. Поэтому в некоторых странах, заботящихся об
экологии (США, Германии, Англии), уже действуют ограничения на
использование пластмассовой упаковки. Взамен предлагается упаковка
на основе полигидроксибутирата, либо полилактата, или специальным
образом обработанного крахмала, в смеси с целлюлозой. Биотехнология может помочь в создании таких материалов, хотя они и будут дороже. Выброшенные пакеты или флаконы из таких материалов при
взаимодействии с почвенными микроорганизмами будут превращаться
в воду, диоксид углерода и биомассу этих самых микроорганизмов,
предохраняя планету от отходов.
Стиральные порошки с ферментами. Сейчас уже не новость
это достижение биотехнологии, хотя появилось оно чуть больше 30 лет
73
назад. Ферменты для таких порошков (протеазы) производятся биотехнологическими методами.
Вермикультивирование и копрокультивирование. Многие отходы сельскохозяйственного производства и пищевой промышленности могут перерабатываться не только с помощью микроорганизмов
(биокомпостирование или метановое брожение), но и с помощью низших организмов — червей. Среди них есть очень эффективные виды
— калифорнийские красные черви, которые «перемалывают» землю с
разными органическими отходами в прекрасное удобрение. Нормальное состояние кладбищ также невозможно без червей. Это направление
переработки отходов называют вермикультивированием. Кстати, если
при этом поблизости иметь подсобное хозяйство для разведения птиц,
то избыток червей вполне может служить пищей курам, гусям и прочей птице.
Вермикультивирование чем-то напоминает разведение личинок
мух (нельзя давать им превращаться в летающих мух). Известно, что
мухи откладывают огромное количество яиц, которые весьма быстро
растут, превращаясь в личинки мух и при этом перерабатывая всевозможные гнилые отходы. Показано, что личинки являются превосходным кормом для птиц, а при определенной обработке — также для свиней и пушных зверей (норок, например). Это направление называют
копрокультивированием.
Хотя эти два направления, строго говоря, не подпадают под наше
определение биотехнологии, все же о них стоит вспомнить, так как они
могут применяться в сочетании с биокомпостированием.
6.2 Примеры блок-схем микробиологической очистки стоков
и почвы
Практически полным биотехнологическим производством является биологическая очистка стоков (рис. 26). Здесь представлено
большое число подготовительных стадий (усреднение стоков, их нейтрализация до необходимой величины рН, очистка от механических
примесей фильтрованием или отстаиванием, очистка от нефтепродуктов в нефтеловушке, коагуляция реагентами растворенных примесей;
отделение образовавшегося осадка отстаиванием). Подготовленный
сток поступает на стадию биоокисления, на которой происходит изъятие растворенных органических веществ активным илом. Это и есть
собственно биотехнологическая стадия, протекающая в аэротенках с
подачей воздуха. Далее активный ил отделяется от жидкости отстаива-
74
нием, и очищенный сток поступает в водоем. Сгущенный активный ил
частично возвращается на стадию биоокисления. Избыточное количество активного ила утилизируют одним из трех способов.
Усреднение
стоков
Нейтрализация
стоков
Очистка от
механических
примесей
шлам
воздух
биоокисление
отстаивание
флотация
Распределение
на иловых
площадках
Кормовой
продукт или
удобрение
флотат
Сушка активного ила
коагуляция
отстаивание
осадок
Осветленная
вода
Активный ил
Метановон
брожение
Сушка осадка
Биогаз
удобрение
Рисунок 26 - Блок-схема биологической очистки стоков
Первый и самый неэкологичный — распределение на так называемых «иловых площадках», где он долго сушится на открытом воздухе, занимая большие площади и распространяя вокруг запахи.
Второй способ предполагает концентрирование ила с помощью
флотации. Концентрат активного ила поступает на сушку. Высушенный ил используют в качестве удобрения или кормового продукта — в
зависимости от его загрязненности.
И наконец, третий способ: концентрат активного ила перерабатывается метановым брожением в биогаз, а образовавшийся осадок высушивается и также применяется как удобрение.
На рисунке 27 представлена блок-схема очистки почвы от загрязнений нефтью. Эта технология весьма напоминает сельскохозяйственную. Сначала загрязненный участок подвергают рыхлению путем
вспашки. Далее в него вносят удобрение и биопрепарат (живые неф-
75
теокисляющие микроорганизмы). После этого начинается биокомпостирование, в процессе которого обработанный участок периодически
взрыхляют для обеспечения доступа воздуха к микроорганизмам, проводят дополнительные подкормки удобрениями. При этом нефтеокисляющие микроорганизмы размножаются и в процессе своего роста потребляют нефтяные загрязнения, разлагая их до диоксида углерода и
воды. Когда их содержание снизится до определенного уровня, проводят посев травяных культур, которые дополнительно восстанавливают
структуру загрязненной почвы.
Рисунок 27 - Блок-схема микробиологической очистка почв
от загрязнения нефтью
6.3 Биохимические методы очистки воды
Биохимические процессы используются на завершающей стадии
технологической схемы очистки сточных вод. Они позволяют произвести деструкцию органических загрязнителей воды с помощью биологической системы. Особая роль в этом процессе отводится микроорганизмам, малый размер которых обуславливает высокую поверхность
контакта их с окружающей средой, поэтому обменные процессы протекают очень активно.
6.3.1 Микробная ассоциация и технологические условия методов биохимической очистки воды
Способность микроорганизмов (вирусов, фагов, бактерий, водорослей, грибов, простейших) использовать в процессе своей жизнедея-
76
тельности в качестве питания различные органические и минеральные
вещества сточных вод является основой процессов биологической очистки. Микроорганизмы имеют очень разнообразные физиологические
возможности в отношении питательных веществ и условий окружающей среды, что позволяет удалять из сточных вод практически любые органические соединения.
В процессах биологической очистки наибольшая роль отводится
бактериям. Все необходимые питательные вещества бактерии получают из сточной воды, поэтому ее качественный и количественный состав, а также условия проведения очистки - концентрация растворенного кислорода, рН, температура, наличие токсических примесей - имеют
большое значение для получения высоких и устойчивых показателей
качества очищенной воды.
Бактериальное разложение органических веществ может происходить в анаэробных и в аэробных условиях (то есть в бескислородной
среде и в присутствии кислорода).
Аэробы разлагают органические вещества, окисляя их кислородом, который потребляют из воздуха или из химических соединений.
Некоторые виды бактерий растут и размножаются в отсутствии свободного кислорода, получая энергию при анаэробном разложении органических веществ и накапливая частично окисленные промежуточные продукты.
Процессы биохимической деструкции веществ в сточных водах
реализуются в естественных условиях: на полях фильтрации, орошения; биологических прудах, а также в искусственных условиях: в аэротенках и биофильтрах (аэробные методы) и в метантенках (анаэробные методы).
Потребное для полного окисления количество кислорода биохимическая потребность в кислороде (БПК) является мерой количества
органического вещества, способного окисляться бактериями в аэробных условиях. При оценке степени разложения органического вещества в анаэробных условиях и определении эффективности работы анаэробных сооружений, где кислород не потребляется, показатель БПК
применяться не должен.
При очистке сточных вод, содержащих разнообразные органические и минеральные вещества, используют сообщество микроорганизмов, которое обладает широким спектром физиологических возможностей и устойчивостью к воздействию внешних факторов. При этом некоторые бактерии участвуют в нескольких этапах разложения вещества: например, могут использовать белки, а затем углеводы, окислять
77
спирты, а затем альдегиды, элементарный, а затем связанный азот и
т.д. Как известно, большинство бактерий могут потреблять только определенные вещества, не используя другие. Одни виды бактерий могут
вести окисление органического вещества до конца - до образования углекислого газа и воды, то есть реализовать полное окисление, другие до промежуточных продуктов, которые в свою очередь могут являться
субстратом для других видов бактерий.
Активный ил и биопленка представляют собой сообщество организмов, основную часть которого составляют бактерии, в незначительном количестве присутствуют различные виды простейших, коловратки, некоторые виды червей.
Активный ил – это свободно перемещающиеся в очищаемой воде микроорганизмы. Активный ил применяется в аэротенках.
Биопленка – сообщество прикрепленных (иммобилизованных) на
специальной загрузке микроорганизмов. Биопленка развивается в биофильтрах.
Простейшие, присутствующие в активном иле и в биопленке, непосредственного участия в окислении органического вещества не принимают. Они питаются бактериями и мельчайшими взвешенными веществами, находящимися в воде. Это обуславливает их специфическую регулирующую роль в очистке сточной воды: поедая клетки бактерий, простейшие способствуют омоложению активного ила, присутствие простейших стимулирует рост бактерий, простейшие снижают
общее количество единичных бактериальных клеток в очищенной воде, в том числе и патогенных. На разных этапах очистки, при разных
условиях ее проведения преобладают разные группы простейших, что
позволяет с большой степенью достоверности использовать их в качестве индикаторных организмов и судить о полноте очистки. Например,
в условиях работы аэротенков в режиме полного окисления с интенсивным процессом аэрации в активном иле в массовом количестве
присутствуют такие простейшие как, кругло- и брюхоресничные инфузории, а также – коловратки и малощетинковые черви. При органической перегрузке, недостатке кислорода и др. появляются другие
простейшие - бесцветные жгутиковые, равноресничные инфузории,
переносящие повышенную концентрацию органических веществ и дефицит кислорода в воде.
Условная химическая формула активного ила, которая варьирует
в зависимости от условий процесса очистки, имеет вид C5ОH7О2N.
Основными химическими соединениями органического вещества ак-
78
тивного ила являются белки - 56-58%, жиры - 21-22%, углеводы - 4-5%
от общего органического вещества активного ила.
Отрицательное воздействие на физиологическое состояние активного ила оказывает недостаток биогенных элементов: азота, фосфора,
калия, магния, кальция, серы и др. Как правило, в хозяйственно-бытовых сточных водах недостатка этих элементов не бывает. Более того,
эти элементы, особенно азот и фосфор присутствуют в избытке, и основная задача состоит в том, чтобы удалить их из очищаемой воды.
Эффективность очистки сточных вод активным илом в значительной степени зависит от температуры воды. Считается, что оптимальный диапазон температур 20°С - 25°С. Повышение температуры, особенно резкое, до 28°С и выше ведет к изменениям в структуре активного ила и ухудшению его седиментационных свойств, что нарушает
работу, следующих за аэротенком , вторичных отстойников. Температура выше критической, которая может привести к гибели бактериальных клеток, практически не встречается при очистке хозяйственнобытовых сточных вод. Значительно чаще на очистные сооружения поступает вода с пониженной температурой. По существующим нормативам на биологическую очистку не следует подавать сточную воду с
температурой ниже 6 °С. При низкой температуре, замедляется скорость окисления органического вещества, скорость адаптации микроорганизмов к новым загрязняющим веществам, поступающим на очистку. Особенно сильное воздействие пониженная температура оказывает на скорость процессов нитрификации и денитрификации (эти
процессы будут рассмотрены ниже). При низкой температуре ухудшаются седиментационные свойства активного ила.
На физиологическую активность микроорганизмов активного ила
оказывает влияние величина рН. При рН среды менее 6 и более 9 эффективность очистки сточных вод резко снижается, что объясняется
влиянием активной реакции среды на скорость ферментативных процессов. В условиях резко щелочной или кислой среды может произойти необратимая денатурация белков бактериальных клеток. Величина
рН, поступающей на очистку сточной воды, обычно около 7. За счет
процессов, происходящих в аэротенке, особенно нитрификации и денитрификации, активная реакция среды изменяется - при высокой эффективности очистки достигает 8 - 8,5. Это зависит также от буферности системы, в частности от величины щелочности сточной воды.
Отрицательное действие на процесс биологической очистки оказывают различные токсические вещества органического и неорганического происхождения: соли тяжелых металлов (медь, ртуть, свинец,
79
хром и др.), четыреххлористый углерод, амиловый спирт, гидрохинон,
хлорбензол, хлорвинил и др. Степень влияния токсических веществ
зависит от адаптированности активного ила, его дозы, температуры,
рН, количества и вида других загрязнений. Токсические органические
вещества в концентрациях ниже предельно допустимых могут использоваться бактериями активного ила в качестве питательного субстрата
и таким образом удаляться из сточной воды. Поэтому так важно устройство на промышленных предприятиях локальных очистных сооружений и соблюдение требований, предъявляемых к производственным
сточным водам при приеме их на городские очистные сооружения.
Механизм действия токсических веществ различен. Например,
малые концентрации синильной кислоты или ее солей инактивируют
один из дыхательных ферментов - цитохромоксидазу; ПАВ снижают
поверхностное натяжение, что создает неблагоприятные условия для
микроорганизмов.
6.3.2 Очистка воды в аэротенках
Стадия аэробной биохимической очистки воды реализуется в
комплексе сооружений аэротенк – вторичный отстойник (рис.28).
1
2
Сточная вода
Очищенная вода
Возвратный активный ил
Избыточный активный ил
1-аэротенк, 2-вторичный отстойник
Рисунок 28 - Схема работы аэротенки в комплексе с вторичным
отстойником
При окислении органического вещества в аэротенке часть его
идет на построение клеток бактерий, то есть увеличение биомассы активного ила. Образующийся в результате прироста избыточный активный ил должен регулярно удаляться из системы для поддержания заданной дозы и нормальной работы вторичного отстойника.
Важным свойством активного ила, позволяющим поддерживать
нормальный режим работы комплекса и относительно высокую биомассу бактерий в аэротенке, является способность ила образовывать
80
крупные, хорошо оседающие (при отстаивании иловой смеси во вторичном отстойнике) хлопья. Величина хлопка, его плотность, компактность зависят при прочих благоприятных условиях, прежде всего от
величины органической нагрузки на ил - количества органического
вещества по БПКполн. в мг, приходящегося на 1 г органического вещества активного ила в сутки.
Обычно аэротенки работают при нагрузках 400-500 мг/(г. сут).
При нагрузке ниже 30 мг/(г. сут) активный ил теряет способность к
хлопьеобразованию, хлопок распадается на отдельные бактериальные
клетки, не оседающие во вторичных отстойниках, и в аэротенке невозможно поддерживать необходимую конентрацию активного ила.
Обычно в аэротенках поддерживается доза активного ила 1,5-3 г/л, а
при благоприятных условиях - до 4-6 г/л.
Количество растворенного кислорода, поступающего в иловую
смесь, должно быть достаточным для окисления поступающего органического вещества и эндогенного дыхания бактерий.
Концентрация кислорода в иловой смеси, для поддержания благоприятных условий очистки, рассчитывается исходя из БПКполн сточной
воды. После аэробного окисления на выходе из вторичного отстойника
концентрация растворенного кислорода в воде должна быть не ниже 2
мг/л. Этот показатель контролируется и свидетельствует о нормальной
работе комплекса.
Аэротенки, работающие при нагрузках менее 150 мг/(г.сут), называются аэротенками полного окисления или аэротенками с продленной аэрацией. В отличие от обычных аэротенков, в аэротенках полного окисления происходит более глубокая очистка сточных вод (содержание растворенных органических веществ по БПКполн. составляет
около 6 мг/л). Однако, за счет более высокой концентрации взвешенных веществ БПК очищенной воды возрастает в 2 и более раз. Интенсивно идет процесс нитрификации, образуется значительно меньше избыточного активного ила, причем образующийся осадок минерализован и не требует дополнительной стабилизации.
Удельный расход подаваемого в аэротенк воздуха производится
по количеству органического вещества по БПК, подлежащего удалению из обрабатываемой сточной воды. Способ подачи воздуха в аэротенк пневматический или механический, иногда применяют комбинированную систему.
Пневматическая аэрационная система может быть представлена
перфорированными трубами, пористыми дисковыми и трубчатыми
элементами. Механический способ подачи воздуха предполагает ис-
81
пользование различных механических аэраторов - механических перемешивающих устройств турбинного, лопастного и пропеллерного типов. Схема работы аэротенка с пневматической системой аэрации
представлена на рисунке 29.
Активный
ил
Смесь воды с
отработанным
илом
Загрязненная
вода
Сжатый
воздух
Рисунок 29 – Устройство аэротенка
6.3.3 Очистка воды в биофильтрах
В большинстве мелких населенных пунктов используются очистные сооружения с биофильтрами, в качестве загрузки которых применяется щебень или другие сорбционные материалы-носители, на которых развивается активная биопленка.
Метод биосорбции сочетает преимущества физико-химических и
биохимических методов очистки. В биофильтрах одновременно протекают процессы адсорбции и биохимического окисления органических
веществ. Использование пористых фильтрующих материалов позволяет значительно интенсифицировать процессы биохимической очистки
за счет адсорбции примесей и закрепления на поверхности материалов
биопленки.
Выбор адсорбционных материалов является сложной задачей, так
как они должны соответствовать определенным технологическим и
экономическим требованиям. Загрузочные материалы должны обладать достаточной сорбционной емкостью, механической прочностью,
82
быть доступными и дешевыми. Эффективно в качестве сорбента использовать пластмассовую плоскостную загрузку (рис.30).
а)
б)
1
2
3
5
4
1-ороситель; 2- подача воды на очистку; 3- блоки насадки;
4- отвод воды;5- подача воздуха
а- секция биофильтра; б- насадка
Рисунок 30 - Биофильтр с пластмассовой насадкой
На биофильтрах контакт сточной воды с биопленкой осуществляется в течение нескольких минут. За это время происходит в основном сорбция органических веществ и не может осуществляться
глубокое удаление из воды растворенных органических загрязнений.
Сорбированные вещества затем окисляются бактериями, образующими
биопленку.
6.3.4 Комбинированные сооружения аэробной биохимической
очистки воды
В большинстве случаев, качество очищенной на биофильтре воды
не соответствует современным требованиям. Но их особенность - образование биопленки на поверхности загрузочного материала - используется для усовершенствования технологии очистки в аэротенках.
Объединив преимущества биофильтра и аэротенка, можно получить
сооружение, в котором всегда есть запас биомассы микроорганизмов, и
обеспечивается более высокое качество очищенной воды - аэротенки с
прикрепленной микрофлорой (или аэротенки с затопленной загрузкой).
При использовании аэротенков-вытеснителей с прикрепленной
(иммобилизованной) микрофлорой по длине аэротенка на затопленной
83
загрузке развивается биопленка, адаптированная к различным органическим нагрузкам: к высокой - в начале аэротенка, к понижающейся по
мере очистки сточных вод - в конце аэротенка. Скорость биологических процессов в прикрепленной микрофлоре зависит прежде всего от
поверхности контакта биопленки с очищаемой водой. Свободный
внутренний объем пористых загрузочных материалов зарастает бактериальной массой, а при увеличении толщины биопленки необходимо
учитывать диффузионные процессы переноса органического вещества
сточных вод во внутренние слои биопленки. Во внутренних слоях может образовываться дефицит кислорода, что вызывает процесс денитрификации.
Сооружения с прикрепленной микрофлорой могут обеспечить
снижение концентрации органического вещества до величин менее
3 мг/л по БПКполн. и взвешенным веществам, а также азота аммонийного менее 0,5 мг/л, что зависит в основном от продолжительности глубокой очистки.
Весьма интересной и перспективной является технология глубокой очистки, объединяющая использование пористой листовой или волокнистой загрузки с добавлением осаждаемого на ней активированного угля.
При изучении глубокой очистки сточных вод с использованием
прикрепленной микрофлоры обнаружен эффект удаления из воды
фосфатов в присутствии металлических элементов загрузки. Данный
эффект объясняют тем, что в процессе жизнедеятельности микроорганизмы биопленки при окислении органических веществ подкисляют
воду и на границе контакта биопленки со сточной водой образуется
микрозона с кислой реакцией среды. В этой микрозоне происходит
процесс перехода в воду ионов металла, которые образуют с фосфатами нерастворимые соединения, выпадающие в осадок. В аэротенке с
загрузкой, армированной металлом, содержание фосфатов через сутки
снижалось до 0,24 мг/л. Данный способ очистки стоков называется
биогальваническим.
6.3.5 Процессы нитрификации и денитрификации
Удаление из сточных вод аммонийного азота происходит в результате процесса нитрификации, которая осуществляется автотрофными бактериями, использующими для питания неорганический углерод (углекислоту, карбонаты, бикарбонаты). Присутствие в воде органических веществ может тормозить развитие нитрифицирующих бак-
84
терий. Это связано с тем, что нитрифицирующие бактерии способны
потреблять только тот азот, который не использован гетеротрофными
микроорганизмами, развивающимися при наличии органических веществ и потребляющими азот в процессе конструктивного обмена.
Кроме того, гетеротрофные бактерии усиленно поглощают кислород,
необходимый нитрификаторам.
На первой стадии процесса бактерии рода Nitrosomonas окисляют азот аммонийный до нитритов. В качестве субстрата
Nitrosomonas может использовать аммонийный азот, мочевину, гуанин,
но органическая часть молекулы не потребляется. На второй стадии
бактерии рода Nitrobacter окисляют нитриты до нитратов.
Реакции окисления азота аммонийного:
1) NH4+ + 3O2 = 2 NO2- + 2H2O + 4H+
2) 2 NO2- + О2 = 2 N03При нитрификации в качестве источника кислорода бактериями
используются также гидрокарбонаты - НСОз-, при этом увеличивается
концентрация угольной кислоты - Н2СО3 и следовательно, снижается
рН среды. Степень снижения рН зависит от величины щелочности воды: на 1 мг окисленного азота используется 8,7 мг щелочности.
При условии осуществления нитрификации в аэротенке необходимо учитывать дополнительный расход кислорода из расчета 4,6 мг
О2 на 1 мг окисленного азота.
Прирост биомассы бактерий при нитрификации составляет примерно 0,16 мг на 1 мг окисленного азота, причем основная часть приходится на Nitrosomonas. Около 98% азота окисляется при этом до нитратов, остальное количество входит в состав клеточной биомассы. Доля нитрифицирующих бактерий в общей биомассе активного ила может составлять от 0,5% до 2,5%, по абсолютной величине - от 17 мг/л
до 55 мг/л.
Основным требованием к процессу нитрификации, при осуществлении его в аэротенках, является наличие достаточной биомассы
бактерий-нитрификаторов. Поскольку скорость роста автотрофов значительно ниже чем, гетеротрофов, ведущих процесс разложения органических загрязнений, при осуществлении процесса нитрификации в
одном сооружении с окислением органических загрязнений требуется
увеличение продолжительности очистки или снижение органической
нагрузки. Скорость прироста бактерий-нитрификаторов определяет
минимальный возраст активного ила в аэротенке, ниже которого эти
85
бактерии будут просто изыматься из аэротенка с избыточным активным илом.
Содержание различных форм азота в очищенной воде зависит от
технологических параметров работы очистных сооружений. При традиционных режимах, обеспечивающих полную биологическую очистку и частичную нитрификацию, то есть при нагрузках 400 - 500 мг
БПК на 1 г беззольного вещества ила в сутки концентрация аммонийного азота снижается не более, чем на 40%. Очищенные сточные воды
содержат не менее 10-15 мг/л аммонийного азота и не более 3-4 мг/л
нитратов. В этом режиме в настоящее время работает большинство
очистных сооружений.
В аэротенках полного окисления (продленной аэрации) нитрификация проходит довольно полно, так как возраст ила в этих сооружениях достигает 30 суток и более. Здесь отмечается высокое содержание
нитратов в очищенной воде (до 8-10 мг/л) и соответственно более низкие концентрации солей аммония (1-2 мг/л). Более глубокую нитрификацию (NH4 до 0,5 мг/л) можно осуществить в аэротенках с прикрепленной микрофлорой, оснащенных различной загрузкой. Применение
аэротенков полного окисления на станциях большой производительности ранее не применялось по технико-экономическим показателям
(увеличение объемов аэротенков и количества подаваемого в них воздуха).
Однако считается, что этот метод наиболее перспективен, особенно с учетом современных требований к степени удаления из воды соединений азота (при применении обычных аэротенков все равно необходимо предусматривать дополнительные сооружения для проведения
нитрификации).
Достоинством аэротенков полного окисления, особенно при использовании затопленной загрузки, является также то, что в них одновременно протекает процесс денитрификации, эффективность которой может достигать 60% - 80%.
Скорость процесса нитрификации зависит от рН среды и температуры. Так при рН менее 6 и температуре менее 10 °С интенсивность
нитрификации значительно снижается, присутствие свободного аммиака и солей тяжелых металлов ингибируют процесс . Оптимальными являются температура 20 °С - 25 °С и рН более 8,4.
Для удаления из воды окисленных форм азота - нитритов и нитратов, образующихся в результате нитрификации, осуществляется процесс денитрификации, сущность которого заключается в том, что гетеротрофные бактерии - денитрификаторы (Tluoresccus, Denitrificans,
86
Pyacvaneum) в процессе своей жизнедеятельности для окисления органического вещества используют связанный кислород нитратов и
нитритов, восстанавливая их до молекулярного азота.
Процесс биологической денитрификации проводится в анаэробных условиях в присутствии органических веществ, необходимых для
жизнедеятельности бактерий. Органические вещества окисляются кислородом, который был извлечен из нитритов и нитратов. Окисляются в
основном легкоокисляемые вещества: углеводы, органические кислоты, спирты. Денитрифицирующие бактерии не могут использовать высокомолекулярные полимерные соединения.
Максимальная интенсивность процесса достигается при рН 7.0 8.2. При значениях рН ниже 6,1 и выше 9,6 процесс полностью затормаживается. Повышение температуры интенсифицирует процесс.
Денитрификация происходит согласно следующей схеме:
+ 4H+ → N2O + 2OH- + H2O
2NO3- + 4H+ → 2NO2- + 2H2O
+ 6H+ → N2 + 2OH- + 2H2O
+ 12H+ → 2NH3 +2OH- + 2H2O
Следует отметить, что аммиака и оксидов азота в процессе образуется немного.
Для эффективной денитрификации необходимо присутствие легко окисляемых органических веществ (спиртов, низкомолекулярных
органических кислот) в качестве источника углеродного питания. Для
этой цели может быть использована неочищенная сточная вода, количество которой определяется из необходимого соотношения содержания органического вещества по БПК и нитратного азота, равного
(3-6):1, сброженный осадок (отстой из метантенков фазы кислого брожения) или избыточный активный ил.
Процессы нитрификации и денитрификации проходят в аэротенке
одновременно, так как в активном иле всегда есть аэрируемые зоны и
зоны с дефицитом кислорода, где образовавшиеся в процессе нитрификации нитриты и нитраты восстанавливаются.
87
Разделение процессов нитрификации и денитрификации позволяет улучшить условия проведения каждого из них и, соответственно,
обеспечить глубокое удаление азота.
6.3.6 Методы обработки осадка
Обработка и утилизация осадка в нашей стране является одной из
самых острых и актуальных проблем.
Органами санитарно-эпидемиологического надзора и охраны природы предъявляются очень жесткие, часто практически невыполнимые
требования к качеству очищенной воды, которое может превышать качество воды водоема-приемника. При этом некоторые населенные
пункты открыто сбрасывают избыточный активный ил и другой осадок
в те же водоемы, что в значительной степени снижает, или сводит на
нет экологический эффект, получаемый при очистке сточных вод. В
результате такой экологической политики многие очистные станции не
имеют полной мощности сооружений по обработке осадка.
Приемлемыми способами ликвидации обработанного осадка могут быть только сельскохозяйственное использование или хранение
(депонирование) осадка. Сельскохозяйственное использование чаще
всего не применяется из-за высокой концентрации в осадках солей тяжелых металлов. Для решения этой проблемы нужно за счет локальной
очистки исключить или хотя бы снизить поступление тяжелых металлов со сточными водами, либо разрабатывать технологии по выделению из осадков тяжелых металлов, то есть по детоксикации осадков.
В настоящее время применяется много различных методов по обработке осадков с целью их последующего использования в хозяйственной деятельности или ликвидации. При обработке осадков
достигается их стабилизация (или минерализация), обезвоживание
(уменьшение объема) и обеззараживание. Применение одного какоголибо метода, как правило, не позволяет решить общую проблему и
приходится использовать сочетание методов применительно к конкретному составу сточных вод, технологической схеме очистки, условиям эксплуатации очистных сооружений и практической возможности использования осадков. В таблице 1 представлены возможности
наиболее распространенных методов обработки осадков, которые следует рассматривать как отдельные процессы в схемах полной обработки осадков.
88
Таблица 1 - Результат обработки осадков различными способами
Результат обработки
Метод обработки осадка
обезвоживание
стабилизация
Гравитационное уплотнение
+
-
Флотация
Анаэробное сбраживание:
мезофильное;
термофильное
Аэробная стабилизация
Компостирование
Сушка на иловых площадках
Вакуум-фильтрация
Фильтр-прессование
Центрифугирование
Тепловая обработка
Термическая сушка
Сжигание
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Для уменьшения объема активного ила, образующегося на очистных сооружениях, используется его уплотнение. Уплотнение одновременно с уменьшением объема приводит к увеличению удельного сопротивления и, следовательно, к снижению эффективности обезвоживания. Активный ил без уплотнения из-за его малой концентрации
обезвоживать нерационально с экономической точки зрения, но, учитывая, что его удельное сопротивление при уплотнении возрастает
очень резко, следует выбирать оптимальную степень уплотнения. Наиболее распространенным и экономичным методом уплотнения осадка
является гравитационное уплотнение в илоуплотнителях различных
89
конструкций. Продолжительность уплотнения от 5 до 15 часов, влажность активного ила после уплотнения составляет 97% - 98%. Другим
способом уплотнения является флотационное сгущение, осуществляемое методом напорной флотации при непосредственном насыщении
воздухом осадка или при насыщении рециркулирующей части осветленной воды. Влажность уплотненного этим методом активного ила
составляет в среднем 94,5%-96,5%. Флотационное уплотнение из-за
относительно сложной технологии применяется редко и расчетные параметры установок следует определять экспериментально.
Стабилизация осадка различными методами применяется для
предотвращения его загнивания при хранении в естественных условиях, а также для уменьшения объема осадка в результате разложения
органического вещества.
Стабилизация или минерализация органического вещества осадка
может осуществляться в анаэробных условиях (метановое брожение) и
в аэробных условиях (окисление органического вещества бактериями
при аэрации осадка воздухом).
6.3.7 Аэробная стабилизация осадка
Процесс аэробной стабилизации осадка значительно проще и безопаснее анаэробных процессов и конструктивно, и в эксплуатации.
Аэробная стабилизация осуществляется в резервуарах типа аэротенков
при длительной аэрации осадка воздухом.
При аэробной стабилизации осадки приобретают хорошую водоотдачу. Стабилизации подвергаются, как правило, активный ил или
смесь активного ила с осадком первичных отстойников.
Процесс при температуре около 20 °С длится от 2 до 15 суток в
зависимости от вида осадка. При изменении температуры на 10 °С аналогично другим биологическим процессам продолжительность стабилизации изменяется в 2-2,5 раза. Длительность процесса зависит от состава осадка, температуры, интенсивности аэрации и необходимой
степени распада органического вещества для получения максимальной
зольности и улучшения водоотдачи. Распад органического вещества
колеблется в широких пределах в зависимости от свойств осадка: от
5% до 50%.
Расход воздуха, подаваемого в аэробные стабилизаторы, принимается 1-2 м3/ч на 1 м3 объема стабилизатора. Интенсивность аэрации не ниже 6 м3/(м2ч) для поддержания осадка во взвешенном состоянии.
90
Объем аэробного стабилизатора для активного ила (W) определяется из соотношения:
W=GT/C,
где G - суточное количество сухого вещества осадка, подаваемого
стабилизатор, т/сут;
Т - требуемая продолжительность сбраживания, сут;
С - концентрация сухого вещества, поддерживаемая в сооружении, т/м3.
в
Для увеличения концентрации осадка в стабилизаторе выделяется
успокоительная зона, из которой отводится иловая вода. Более высокой концентрации (до 20 г/л) можно достичь сочетанием аэробного
стабилизатора и уплотнителя, связанных аналогично аэротенку и вторичному отстойнику системой возврата осадка. Влажность осадка после аэробной стабилизации 98%-99%, а из уплотнителя - 96,5%-97%.
6.3.8 Метановое брожение (биометаногенез)
Биометаногенез, или метановое «брожение» – давно известный
процесс превращения биомассы в энергию. Он был открыт в 1876 г.
Вольтой, установившим наличие метана в болотном газе. Биогаз, получаемый из органического сырья, в ходе биометаногенеза при участии смешанной микробной ассоциации, представляет собой смесь из
65%-75% метана и 20%-35% углекислоты, а также незначительных количеств сероводорода, азота, водорода. Теплотворная способность
биогаза зависит от соотношения метана и углекислоты и составляет
5 ккал/м3 - 7 ккал/м3.
Неочищенный биогаз используют в быту для обогрева жилищ и
приготовления пищи, а также применяют в качестве топлива в стационарных установках, вырабатывающих электроэнергию. Компримированный газ можно транспортировать и использовать (после предварительной очистки) в качестве горючего для двигателей внутреннего сгорания.
Толчком к созданию данного эффективного биотехнологического
направления послужил энергетический кризис, разразившийся в середине 70-х гг. Производство биогаза стало одним из основных принципов энергетической политики ряда стран тихоокеанского региона: Китая, Индии, Филиппин, Израиля, латинской Америки, в 70-е годы ин-
91
терес проявили страны Европы, особенно ФРГ, Франция и страны Африки. Производство биогаза путем метанового брожения отходов – одно из возможных решений энергетической проблемы в большинстве
сельских районов развивающихся стран. Метаногенные ассоциации с
успехом используют для очистки сточных вод от органических соединений с одновременным получением высококалорийного топлива.
6.3.8.1 Этапы метанового брожения
Этапы анаэробного метанового брожения можно схематически
представить следующим образом
Биополимеры (углеводы, липиды, белки)
Органические кислоты, спирты, NH3, CO2,
H2
Ацетат, формиат, CO2, H2
Биогаз (СН4, CO2 )
92
6.3.8.2 Химизм процесса метанового брожения
Химизм процесса метанового брожения состоит из следующих
реакций
1. Брожение органических кислот:
4Н−СООН = СН4 + ЗСО2 + 2Н2О;
СН3 − СООН = СН4 + СО2 .
2. Брожение спиртов:
4СН3−ОН = 3СН4 + СО2 + 2Н2О;
2СН3−СН2−ОН + СО2
= СН4 + 2СН3СООН .
3. Восстановление оксидов углерода
СО2 + 4Н2 = СН4 + 2Н2О;
4СО + 2Н2О = СН4 +3СО2 .
6.3.8.3 Микробная ассоциация биометаногенеза
В сложных процессах деструкции органических субстратов и образования метана участвует микробная ассоциация различных микроорганизмов. В ассоциации присутствуют следующие группы микроорганизмов: деструкторы, вызывающие гидролиз сложной органической массы с образованием органических кислот (масляной, пропионовой, молочной), а также низших спиртов, аммиака, водорода; ацетогены, превращающие эти кислоты в уксусную кислоту, водород и оксиды углерода; метаногены – микроорганизмы, восстанавливающие
водородом кислоты, спирты и оксиды углерода в метан.
С биохимической точки зрения метановое «брожение» – это процесс анаэробного дыхания, в ходе которого электроны с органического
вещества переносятся на углекислоту; последняя затем восстанавливается до метана (при истинном брожении конечным акцептором электронов служит молекула органического вещества, являющегося конечным продуктом брожения). Донором электронов для метаногенов является водород, а также уксусная кислота.
93
«Венцом» метанового сообщества являются собственно метаногенные или метанообразующие бактерии (архебактерии), катализирующие восстановительные реакции, приводящие к синтезу метана. Субстратами для реализации этих реакций являются водород и углекислота, а также окись углерода и вода, муравьиная кислота, метанол и др.
Несмотря на то, что метанобразующие бактерии выделены и описаны совсем недавно, в середине 80-х гг., их возникновение относят к
архею и возраст оценивают в 3,0-3,5 млрд. лет. Эти микроорганизмы
достаточно широко распространены в природе в анаэробных зонах и
вместе с другими микроорганизмами активно участвуют в деструкции
органических веществ, с образованием биогаза в морских осадках, болотах, речных и озерных илах.
К настоящему времени выделены в чистой культуре и описаны
около 30 метанообразующих бактерий; список этот непрерывно пополняется. Наиболее изученными являются следующие: Methanobacterium
thermoautotrophicum, Methanosarcina barkerii, Methanobrevibacter ruminantium. Все метаногены – строгие анаэробы, среди них встречаются как
мезофильные, так и термофильные формы, гетеротрофы и автотрофы.
Особенностью метанобразующих бактерий является также способность активно развиваться в тесном симбиозе с другими группами микроорганизмов, обеспечивающими метаногенов условиями и субстратами для образования метана.
6.3.8.4 Сырье биометаногенеза
В процессах метаногенеза можно переработать самое разнообразное сырье – различную растительную биомассу, включая отходы древесины и несъедобные части сельскохозяйственных растений, отходы
перерабатывающей промышленности, специально выращенные культуры (водяной гиацинт, гигантские бурые водоросли), жидкие отходы
сельскохозяйственных форм, промышленные и бытовые стоки, ил очистных сооружений, а также мусор городских свалок. Важно, что сырье
с высоким содержанием целлюлозы, трудно поддающееся переработке,
также эффективно сбраживается и трансформируется в биогаз.
6.3.8.5 Технологические режимы и аппаратурное оформление
процесса метанового брожения
Установки для биометаногенеза с учетом их объемов и производительности можно подразделить на несколько категорий:
94
− реакторы для небольших ферм сельской местности от 1 м3до
20 м ;
− реакторы для ферм развитых стран от 50 м3 до 500 м3;
− реакторы для переработки промышленных отходов от 500 м3
до 1000 м3;
− для переработки твердого мусора городских свалок от 1 м3
до100 м3.
Реакторы называются метантенки (рис. 31).
3
Рисунок 31 - Устройство метантенка
Метантенк представляет собой герметическую емкость, частично погружённую в землю для теплоизоляции и снабженную для
дозированной подачи и подогрева сырья, а также газгольдером – емкостью переменного объема для сбора газа.
Метантенки могут изготавливаться из металла или железобетона.
Имеют различную форму: кубическую, цилиндрическую и даже яйцевидную. Метантенки классической, европейской, англо-американской
и яйцевидной формы представлены на рисунке 32. Несмотря на внешнее различие внутреннее устройство метантенков схоже.
Очень важным в конструкции метантенков является обеспечение
требуемого уровня перемешивания всего гетерогенного содержимого
аппарата. Вместе с тем известно, что максимальное выделение метана
наблюдается в системах со слабым перемешиванием. Поэтому в отличие от аэробных процессов, требующих интенсивной аэрации и пе-
95
ремешивания, перемешивание при метаногенезе, главным образом,
должно обеспечивать гомогенизацию бродящей массы, препятствовать
оседанию твердых частиц и образованию твердой плавающей корки.
При переработке жидких отходов животноводческих ферм соотношение между твердыми компонентами и водой в загружаемой массе
должно составлять примерно 1:1, что соответствует концентрации
твердых веществ от 8% до 11% по весу. Смесь материала обычно засевают аценогенными и метанобразующими микроорганизмами из отстоя сброженной массы от предыдущего цикла или из другого метантенка.
В ходе сбраживания органической массы на первой, так называемой «кислотной», фазе в результате образования органических кислот
рН среды снижается. При резком сдвиге рН среды в кислую сторону
возможно ингибирование метаногенов. Поэтому процесс ведут при
рН 7,0-8,5. Против закисления используют известь. Снижение рН среды является своеобразным сигналом, свидетельствующим о том, что
процесс деструкции органики с образованием кислот закончен, то есть
в аппарат можно подавать новую партию сырья для переработки. Оптимальное соотношение C:N в перерабатываемой органической массе
находится в диапазоне (11-16):1. При изменении соотношения C:N в
исходном материале в сторону увеличения содержания.
а- anglo-american b- classical c- egg-shaped d- european-plain
Рисунок 32 - Разновидности конструкций метантенков
Очень важным в конструкции метанотенков является обеспечение
требуемого уровня перемешивания всего гетерогенного содержимого
аппарата. Вместе с тем известно, что максимальное выделение метана
наблюдается в системах со слабым перемешиванием. Поэтому в отличие от аэробных процессов, требующих интенсивной аэрации и перемешивания, перемешивание при метаногенезе, главным образом,
96
должно обеспечивать гомогенизацию бродящей массы, препятствовать
оседанию твердых частиц и образованию твердой плавающей корки.
Процессы, протекающие при метановом брожении, эндотермические и требуют подвода энергии в виде тепла извне. Для подогрева загружаемого сырья и стабилизации температуры процесса на требуемом
уровне обычно сжигают часть образуемого биогаза. В зависимости от
температуры процесса количество биогаза, идущего на обогрев процесса, может достигать 30% от объема получаемого. Температура и, следовательно, скорость протекания процесса зависят от вида используемого метанового сообщества. Для термофильных организмов процесс
реализуется при 50-60 оС, для мезофильных – при 30-40 оС и около
20 оС – для психрофильных организмов. При повышенных температурах скорость процесса в 2-3 раза выше по сравнению с мезофильными
условиями. Для нормальной работы метантенков осадок в них должен
поступать равномерно и при сбраживании подогреваться до заданной
температуры. Количество осадка, подаваемого ежесуточно в метантенки должно составлять при мезофильном режиме от 7% до 10% от объема метантенка, при термофильном режиме от14% до19%. Продолжительность сбраживания в мезофильных условиях от 10 до14 суток, в
термофильных условиях от 5 до7 суток. Величина максимально возможного сбраживания для разных по химическому составу осадков в
среднем составляет:
для осадка первичных отстойников до 53%,
-
для активного ила - до 44%.
Термофильное сбраживание требует большего расхода тепла, а
образующийся осадок плохо отдает воду и требует более тщательной
подготовки к обезвоживанию, чем осадок, полученный в мезофильных
условиях. С другой стороны, при термофильном сбраживании происходит обеззараживание осадка.
Скорость подачи субстрата в метантенк должна быть равной скорости роста бактерий метанового сообщества, при этом концентрация
субстрата (по органически веществам) должна быть стабилизирована
на уровне не ниже 2%. Нормы загрузки сырья в существующих процессах метаногенеза колеблются в пределах от 7% до 20% объема субстрата от объема биореактора в сутки. При этом цикличность процесса
составляет 5-14 суток. Обычно время сбраживания животноводческих
отходов составляет около 2 недель. Растительные отходы перерабатываются дольше (20 суток и более). Наиболее трудны для переработки
твердые отходы, поэтому время их переработки больше.
97
Цикличность процесса может быть сокращена до 5-15 ч при увеличении скорости загрузки соответственно до 150%-400% от общего
объема/сутки.
Сбраживание в метантенках - процесс довольно сложный в конструктивном исполнении и в обслуживании, требует больших капитальных и эксплуатационных затрат, образующийся газ взрывоопасен.
Объем метантенков может достигать 25% объема всех очистных сооружений. Однако до сих пор сохранился большой удельный вес метантенков среди сооружений по обработке осадка на очистных станциях,
построенных 25-30 лет назад, когда этот метод был наиболее изученным и широко применяемым.
Процессы анаэробного сбраживания до сих пор детально изучаются с целью сокращения продолжительности сбраживания, повышения выхода биогаза и увеличения в нем содержания метана,
улучшения водоотдающих свойств сброженного осадка.
Основными путями интенсификации технологии анаэробного
сбраживания являются:
1) оптимизация исходной влажности осадка и нагрузки на метантенки;
2) конструктивное разделение двух свойственных процессу фаз кислого брожения и метанового брожения - на две и более ступени;
3) повышение температуры сбраживания и улучшение условий
перемешивания содержимого метантенков.
При фазовом разделении анаэробного сбраживания на две ступени и более общая продолжительность процесса может быть сокращена
до 3 - 4 суток. В целом, анаэробное сбраживание целесообразно применять для крупных очистных станций.
6.4 Биоценозы как индикаторы сапробности водоемов
Вода водоемов – естественная среда обитания микроорганизмов.
Выделяют две экологические группы микроорганизмов – автохтонную (самостоятельная, первоначально существующая микрофлора, для
которой данный водоем является естественной средой обитания) и аллохтонную (микроорганизмы, поступившие извне). Между микробами
этих зон возникают антагонистические отношения, что ускоряет отмирание аллохтонной группы. Количество микроорганизмов в водоеме
связано с содержанием органических веществ, которые подвергаются
биологической минерализации.
98
Процесс самоочищения загрязненных водоемов в естественных
условиях проходит несколько последовательных стадий, называемых
зонами сапробности.
По определению Никитинского и Долгова «сапробность – это
комплекс физиологических свойств данного организма, обуславливающий его способность развиваться в воде с тем или иным содержанием органического вещества, с той или иной степенью загрязнения».
Поступающие в водоем загрязнения в результате самоочищающей способности водоемов постепенно разбавляются и разрушаются. В
результате постепенной деструкции загрязнений в водоеме постепенно
восстанавливаются условия, которые в нем первоначально существовали. Это длительный процесс и его продолжительность зависит от многих факторов – от соотношения объемов сточных вод и и речной воды,
от концентрации и качества загрязнителей, от скорости течения воды и
других факторов. В зависимости от степени загрязненности воды водоем проходит последовательно до полного очищения следующие стадии
– зоны: полисапробную, альфа–мезосапробную, бета-мезосапробную,
олигосапробную.
Полисапробная зона характерна для свежезагрязненной воды с
большим содержанием нестойких органических веществ, продуктов их
анаэробного распада, белков, углеводов. БПК составляете десятки мг/л,
кислород в воде практически не обнаруживается, процессы носят восстановительный характер. Вода содержит метан, сероводород, углекислоту, то есть продукты брожения. Для этой зоны характерна сапрофитная микрофлора, автотрофы отсутствуют. Основные обитатели –
различные бактериальные зооглеи, инфузории, бесцветные жгутиковые. Количество бактерий достигает сотен миллионов в 1 мл воды.
Их разнообразие при этом ограничено.
В альфа-мезосапробной зоне продолжается минерализация органического вещества. Наряду с восстановительными процессами, протекают и окислительные процессы, с образованием аммиака и аминосоединений. Кислород содержится в малых количествах, метан и сероводород отсутствуют. БПК все еще десятки мг/л. Кроме бактерий развиваются некоторые виды инфузорий и коловраток, пожирающих бактерий. Появляются единичные виды зеленых растений. Разнообразие
видов становится больше. Много окрашенных и бесцветных жгутиковых.
Бета–мезосапробная зона свободна от нестойких органических
веществ. Здесь окислительные процессы преобладают над восстанови-
99
тельными. Благодаря интенсивному развитию водорослей происходит
повышение концентрации кислорода. Концентрации кислорода и углекислого газа сильно колеблются в течение суток: в дневное время содержание кислорода доходит до насыщения, а углекислота может полностью исчезать, в ночное – наблюдается дефицит кислорода. Количество сапрофитных бактерий – тысячи – десятки тысяч в 1 мл и резко
увеличивается в период отмирания водных растений. Отмечается
большое видовое разнообразие организмов при невысоком общем их
количестве. Развиваются автотрофы, фитопланктон, наблюдается цветение водоема. Главнейшими группами являются различные водоросли, инфузории, коловратки, низшие ракообразные и насекомые.
Олигосапробная зона характеризуются полным завершением самоочищения, она характерна для практически чистых водоемов. Завершается процесс окисления азотсодержащих веществ, в результате
которых преобладают нитраты. Органические вещества имеются либо
в незначительном количестве, либо совсем отсутствуют. Содержание
кислорода и углекислого газа в течение суток остается практически
неизменным. Цветение воды не наблюдается. Количество бактерий составляет десятки и сотни в 1 мл. Население этой зоны отличается
большим разнообразием. Показателем высокой степени чистоты воды
в этой зоне служат некоторые красные водоросли, водные мхи.
Для оценки влияния токсичности веществ промышленных стоков
на процесс самоочищения водоемов предложены три шкалы оценки
загрязнения: по степени сапробности, токсобности, сапротоксобности.
Токсобность характеризует свойство гидробионтов выживать в
водах с различной степенью загрязнения токсичными веществами.
Аналогично зонам сапробности выделяют поли- меза- и олиготоксобные зоны. Водоемы или их зоны, где невозможна жизнь гидробионтов,
из-за высокого загрязнения токсичными веществами относятся к гипертоксобным.
Наличие в водоеме определенных группировок организмов является показателем степени загрязненности воды. Существует список
показательных организмов – биоиндикаторов для каждой зоны сапробности. Обнаружить эти организмы можно с помощью биологического
метода анализа воды водоема. Метод основан на регулярном осмотре и
изучении отдельных участков водоема, отборе проб для изучения
планктона, бентоса и перифитона.
Планктон исследуется или непосредственно в некотором объеме
взятой воды, или собирается в водоеме с помощью приспособлений.
100
Перифитон изучают путем сбора и осмотра подводных предметов.
Для изучения бентоса либо соскребают биообъекты со дна, либо
снимают поверхностный слой грунта со дна вместе с находящимися в
нем микроорганизмами. Образцы проб микроскопируют.
6.5 Применение биотехнологии в медицине
Медицинская микробиология изучает патогенные для человека
микроорганизмы (бактерии, вирусы, грибы, простейшие), вызываемые
ими заболевания, а также разрабатывает технологию получения из микроорганизмов разнообразных продуктов – антибиотиков, вакцин, ферментов, белков, витаминов. Последние представляют наибольший интерес в терапевтической практике человека и животных. Получение
этих продуктов с улучшенными свойствами (не аллергенных, не токсичных, устойчивых в условиях окружающей среды) сегодня очень актуально.
6.5.1Антибиотики
Антибиотики - это специфические продукты жизнедеятельности, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов и к злокачественным
опухолям, задерживающие их рост.
Антибиотики (греч. anti - против, bios - жизнь) – вещества микробного, животного или растительного происхождения, избирательно
подавляющие жизнеспособность микроорганизмов.
Термин «антибиотики» предложен Ваксманом в 1942 году.
Первые попытки выделения антибиотика были сделаны Эммерихом (1889г.), изолировавшим из культур синегнойной палочки вещество, которое он назвал пиоциназой, обладавшее бактерицидными
свойствами в отношении возбудителей сибирской язвы, брюшного тифа, дифтерии, чумы и стафилококков. Переворот в учении об антибиотиках произошел в результате открытия А. Флемингом пенициллина.
В 1940 г. Флори и Чейн разработали метод извлечения пенициллина
из культуральной жидкости Penicillium notatum. Вскоре была выявлена
высокая терапевтическая активность этого препарата.
После открытия пенициллина начались интенсивные поиски новых антибиотиков, которые продолжаются до сих пор. Сегодня из-
101
вестно более 7000 антибиотиков, продуцируемых грибами, актиномицетами, бактериями и другими микроорганизмами.
Механизм действия антибиотиков. По характеру действия антибиотиков на бактерии их можно разделить на две группы: антибиотики бактериостатического действия и антибиотики бактерицидного
действия. Бактериостатические антибиотики в концентрациях, которые можно создать в организме, задерживают рост микробов, но не
убивают их, тогда как воздействие бактерицидных антибиотиков в
аналогичных концентрациях приводит к гибели клетки. Однако в более
высоких концентрациях бактериостатические антибиотики могут оказывать также и бактерицидное действие.
За последние годы большие успехи были достигнуты в изучении
механизма действия антибиотиков на молекулярном уровне. Пенициллин, ристомицин (ристоцетин), ванкомицин, новобиоцин, Д-циклосерин нарушают синтез клеточной стенки бактерий, то есть эти антибиотики действуют лишь на развивающиеся бактерии и практически
неактивны в отношении покоящихся микробов.
Механизм действия других антибактериальных антибиотиков –
левомицетина, макролидов, тетрациклинов – заключается в нарушении
синтеза белка бактериальной клетки на уровне рибосом.
Противогрибковые антибиотики полиены нарушают целостность
цитоплазматической мембраны у грибковой клетки, в результате чего
эта мембрана теряет свойства барьера между содержимым клетки и
внешней средой, обеспечивающего избирательную проницаемость. В
отличие от пенициллина, полиены активны и в отношении покоящихся
клеток грибков.
Противоопухолевые антибиотики, в отличие от антибактериальных, нарушают синтез нуклеиновых кислот в бактериальных и животных клетках. Антибиотики актиномицины и производные ауреоловой кислоты подавляют синтез ДНК-зависимой РНК, связываясь с
ДНК, служащей матрицей для синтеза РНК.
Получение антибиотиков. Продуцент выращивают в 10-50 тонных ферментерах в условиях оптимальных (достаточное содержание
азота, углерода) для образования антибиотиков. Для лучшей аэрации
среда постоянно перемешивается, и через нее пропускают стерильный
воздух. Штаммы продуцентов, выделенные из окружающей среды,
обычно из почвы, как правило, малопродуктивны. Путем их селекции
удается получить штаммы продуцентов в десятки и сотни раз более
продуктивные, чем исходный «дикий» штамм. Большинство антибиотиков, представляющих интерес для медицины, накапливается в куль-
102
туральной жидкости. По окончании выращивания продуцента культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрованием и антибиотик,
содержащийся в жидкости, выделяют различными методами в зависимости от его природы. Существуют два основных метода выделения
антибиотика. Первый метод заключается в экстракции антибиотика из
культуральной жидкости органическими растворителями, второй – основан на способности антибиотика адсорбироваться на ионообменных
смолах. Для очистки препарата используют, в зависимости от природы
антибиотика, различные физико-химические методы.
Важнейшие антибиотики, применяемые сегодня, часто вызывают
побочные реакции:
- пенициллины, цефалоспорины вызывают аллергические реакции;
- стрептомицин, канамицин, амикацин оказывают разрушающее
действие на слуховой нерв и почки;
- тетрациклины, эритромицины, грамицидин вызывают интоксикацию организма и др.
Токсичность существующих препаратов является причиной повышенного внимания к развитию класса новых антибиотиков. Новые антибиотики, такие как рокситромицин, султамицин, лифоран и другие
характеризуются высоким уровнем безопасности.
6.5.2. Гормоны
Гормоны (от греч. hormao-возбуждаю, привожу в движение), биологически активные вещества, вырабатываемые в организме специализированными клетками или органами (железами внутренней секреции)
и оказывающие целенаправленное влияние на деятельность других органов и тканей. Термин «гормоны» предложил в 1905 г. английский
физиолог Э. Старлинг.
Гормоны влияют на все виды обмена веществ в организме, активность генов, рост и дифференцировку тканей, формирование пола и
размножения, адаптацию к условиям среды, поддержание постоянства
внутренней среды организма (гомеостаз), поведение и многие другие
процессы. Совокупность регулирующего воздействия различных гормонов на функции организма называется гормональной регуляцией.
Получение и применение гормонов. Гормоны - продукты, получаемые из органов и тканей животных и человека (крови донора, удаленных при операциях органов, трупного материала). Полипептидные
и белковые гормоны выделяют путем экстракции из желез домашнего
103
скота с последующей очисткой. Разработана процедура получения некоторых гормонов с помощью методов генной инженерии. Многие непептидные гормоны получают с помощью химического синтеза.
Гормоны нашли широкое применение в акушерстве и гинекологии. Хорионический гонадотропин помогает при лечении бесплодия,
окситоцин используют для усиления родовой деятельности. Стероидные половые гормоны или их аналоги применяют при нарушениях в
половой сфере, в качестве противозачаточных средств и т.д. Гормоны
коры надпочечников используют для лечения аллергических заболеваний, их назначают при артрите, при воспалительных процессах. Гормоны, вырабатываемые вилочковой железой (тимусом), применяют
для лечения онкологических заболеваний, при нарушениях иммунитета.
Гормон роста - соматотропин, ранее этот гормон получали из
гипофиза человека. Каждый гипофиз содержит его не более 4 мг. Для
лечения одного ребенка карлика требуется 7 мг в неделю. С применением генно-инженерных штаммов Е-coli стало возможно продуцировать 100 мг гормона роста на 1 л среды культивирования. Данная технология получения соматотропина сделала применение его в терапевтической практике более доступным.
Инсулин - гормон поджелудочной железы, основное средство
лечения сахарного диабета. Раньше получали из поджелудочной железы быка и свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина тремя аминокислотными звеньями, что вызывало аллергические реакции
при его применении. Путем генно-инженерных модификаций животного инсулина удалось получить продукт неотличимый от человеческого инсулина.
Интерфероны – вещества, выделяемые клетками человека и животных в ответ на инфицирование вирусами. Обладают антивирусной
активностью, стимулируют деятельность иммунной системы и препятствуют развитию рака.
Интерферон ранее получали из крови в количестве до 1 мкг из 1 л
крови, что соответствовало одной дозе. В настоящее время его получают с применением генно-инженерных штаммов Е-coli, причем из такого же объема культуры кишечной палочки (1 л), извлекают тысячу доз
продукта.
104
6.5.3 Вакцины, иммунные сыворотки и иммуноглобулины
Одним из важнейших направлений прикладной микробиологии
является создание эффективных препаратов для иммунопрофилактики
и иммунотерапии инфекционных заболеваний.
Вакцины и анатоксины – препараты для индукции в организме
специфического иммунного ответа с формированием активного противоинфекционного иммунитета (от англ. immunity – невосприимчивость) за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти.
Вакцины изготавливают на основе ослабленных, инактивированных возбудителей болезней. Разработка современных вакцин основана на генно-инженерном подходе. Вакцины стимулируют ответ иммунной системы так, как будто имеет место реальная инфекция. Иммунная система затем борется с "инфекцией" и запоминает микроорганизм, который ее вызвал. При этом если микроб вновь попадает в организм, эффективно борется с ним.
Вакцинация (прививка, иммунизация, от лат. vaccus – корова) —
создание искусственного иммунитета к некоторым болезням. Для этого
используются относительно безобидные антигены, которые являются
частью микроорганизмов, вызывающих болезни. Микроорганизмами
могут быть вирусы или бактерии.
Хорошо известны вакцины первого поколения — вакцина против
бешенства, полиомиелита, кори туберкулеза, чумы, сибирской язвы;
убитые вакцины — вакцина против коклюша, клещевого энцефалита;
вакцины второго поколения (химические), примером может служить
холерная вакцина; а также субъеденичные вакцины — противогриппозная вакцина.
Иммунные сыворотки и иммуноглобулины – биологические
препараты, содержащие готовые специфические антитела (иммуноглобулины), введение которых в организм приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции. Иммунные сыворотки и
получаемые из них иммуноглобулины предназначены для создания
пассивного антитоксического, антибактериального или антивирусного
иммунитета у человека.
Иммунные сыворотки и иммуноглобулины используются как
средства серопрофилактики и серотерапии. В первом случае сывороточные препараты вводятся до возможного заражения или непосредственно после него, пока еще не появились признаки заболевания, а пациент не обладает собственными антителами, способными защитить
105
его от заражения. Во втором случае препараты вводятся для лечения –
нейтрализации токсинов или вирусов, усиления антимикробной защиты.
Все сывороточные препараты делятся на две группы: гетерологичные, полученные из крови животных (чаще лошадей), и гомологичные, полученные из крови человека. Преимущество гетерологичных
препаратов в том, что интенсивная иммунизация животных позволяет
достичь высокой концентрации антител.
В качестве профилактических и лечебных препаратов могут использоваться «чистые антитела» - иммуноглобулины, полученные
сорбцией антител на антигенных сорбентах.
6.5.4 Ферменты
Ферменты (от лат. fermentum - брожение, закваска), специфические белки, присутствующие во всех живых клетках и играющие
роль биологических катализаторов.
Ферменты являются регуляторами скорости химических реакций,
строго контролируют процессы синтеза и распада индивидуальных
химических компонентов клетки и всего организма в целом. Благодаря
этому свойству ферментов живые системы сохраняют постоянство
внутренней среды (так называемый гомеостаз). Ферменты выполняют
важные защитные функции, обезвреживая как экзогенные (поступающие из внешней среды), так и эндогенные (образующиеся в самом организме) токсические вещества. Последние подвергаются под действием ферментов различным реакциям окисления, восстановления и, наконец, распада на продукты, теряющие свои токсические свойства.
Методы выделения и очистки ферментов. Хотя уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов - рибонуклеазы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома - С, трудно ожидать, что синтетическое
получение ферментов получит широкое распространение в ближайшие
десятилетия ввиду его сложности и дороговизны, поэтому единственный реальный в настоящее время способ получения ферментов - это
выделение их из биологических объектов.
Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные
свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в
осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше -10°С
тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу отно-
106
сится также получение ферментов путем адсорбции с последующей
элюцией (снятием) с адсорбента. Наряду с ними широко применяют
метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Особое внимание при
выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях,
исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с потерей ферментативной активности. Этому способствует проведение операций в присутствии защитных добавок, в частности HS-содержащих
соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.).
Переломным моментом в усовершенствовании методов получения высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов было открытие способности их кристаллизоваться, осуществленное впервые в
1906 г. А. Д. Розенфельдом (им была получена в виде кристаллов оксидаза из корней редьки) и приобретшее с 1926 г. широкую известность после работы Д. Самнера по получению кристаллической
уреазы из бобов канавалии.
Медицинская энзимология. Существуют три основных направления исследований в области медицинской энзимологии: энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия.
Энзимопатология призвана изучать молекулярные основы развития патологического процесса, основанные на данных нарушениях
механизмов регуляции активности или синтеза индивидуального фермента, или группы ферментов. Так как, чаще всего, развитие болезни
непосредственно связано с наследственной недостаточностью или полным отсутствием синтеза одного единственного фермента в организме
больного.
Так, например, развитие тяжелого наследственного заболевания –
галактоземии (непереносимость молочного сахара) связано с отсутствием синтеза в клетках печени фермента, катализирующего превращение галактозы в глюкозу.
Энзимодиагностика призвана заниматься разработкой ферментных тестов, основанных на определении активности (уровня) ферментов и изоферментов в биологических жидкостях организма больного (сыворотка крови, желудочный сок, спинномозговая жидкость, моча
и др.).
В настоящее время разработаны количественные методы анализа
многих распространенных ферментов, выявляемых в биологических
жидкостях при поражении разных органов. Для каждого из этих фер-
107
ментов определены контрольные величины (уровни) активности и пределы колебания в норме как в сыворотке крови, так и в самом органе.
Диагностическая энзимология достигла значительных успехов
при постановке диагноза болезней многих органов, в частности почек,
сердца, поджелудочной железы, желудка, кишечника и легких. Ферментная диагностика может служить основой не только для постановки правильного и, что самое главное, своевременного диагноза болезни, но и для проверки эффективности применяемого метода лечения.
Обладая высокой специфичностью действия, ферменты применяются в качестве самых тонких и избирательных инструментов в направленном воздействии на течение любой патологии. О степени поражения органов, биомембран клеток и субклеточных структур, о тяжести патологического процесса можно судить по появлению (или резкому повышению уровня) органотропных ферментов и изоферментов в
сыворотке крови больных, что составляет предмет диагностической энзимологии.
Энзимотерапия. Ферменты используются для лечения различных заболеваний, в том числе и наследственных, вызванных нарушением синтеза того или иного фермента или резким перепадом субстрата, на который организм не смог среагировать по причине, например,
ослабленного иммунитета. Также ферменты применяют для лучшего
вживания и устойчивости в организме искусственных органов, протезов, их применяют в различных перевязочных материалах для ускорения заживления ран и ожогов, для разрушения тромбов.
Основной проблемой при использовании ферментов является их
быстрая инактивация, аллергенность, токсичность (так как по существу
они чужеродны для данного организма), доставка точно в пораженный
орган или ткань. Для решения этих проблем применяют методы иммобилизации ферментов, разработанные инженерной энзимологии.
Иммобилизация ферментов заключается в их физическом (адсорбционном) и (или) химическом (ковалентном) связывании с некой матрицей носителя, который защищает фермент от инактивирующего воздействия и не влияет на его активные центры.
Основные требования к иммобилизованным ферментам:
- иммобилизованные ферменты должны сохранять свою активность в течение максимально возможного времени;
- введенные в организм вещества должны быть мало подвержены
действию антител и естественных ингибиторов;
- не должны оказывать негативного воздействия на организм в целом;
108
- носитель, с которым связан фермент, должен обеспечивать не
только устойчивость, но и направленную доставку исключительно или
хотя бы предпочтительно в зону поражения.
Таким образом, если присутствие данного фермента необходимо
во всех органах и тканях организма или он необходим для длительной
циркуляции в кровотоке, то целесообразно применять растворимые
препараты, то есть связывать фермент с неким растворимым носителем
(растворимые капсулы, или «искусственные клетки»). В некоторых
случаях идут по пути создания биоразлагаемых и биосовместимых
производных ферментов в виде микрочастиц, гранул или таблеток, которые способны «добираться» к местам поражения и в течение определенного времени диффундировать необходимый фермент. Для наружного применения соответствующий фермент иммобилизуют на поверхности или в объеме перевязочных материалов, защитных пленок,
дренажа или добавляют содержащие его микрокапсулы в различные
мази и кремы.
6.5.5 Биодатчики в медицине
Большое влияние на развитие медицины оказывает биоэлектроника и биоэлектрохимия. В последние годы здесь достигнуты заметные
успехи. Создан ряд чувствительных биодатчиков. Действие большинства разработанных на сегодня датчиков основано на улавливании
продуктов действия ферментов. Для этого используются обычные
электроды с иммобилилизованной на них биологической системой,
называемые - биодатчики, биосенсоры. Под термином биосенсор следует понимать устройство, в котором чувствительный слой, содержащий биологический материал: ферменты, ткани, бактерии, дрожжи,
антигены, липосомы, органелы, рецепторы, ДНК, непосредственно
реагирующий на присутствие определяемого компонента, генерирует
сигнал, функционально связанный с концентрацией этого компонента.
Конструктивно биосенсор представляет собой комбинированное устройство, состоящее из двух преобразователей (трансдъюсеров) биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг с
другом.
Новые подходы в этой области ставят своей целью создание более чувствительных и эффективных приборов и расширение сферы их
применения. В основе работы таких устройств лежит процесс прямого
переноса электронов между электродами и окислительно-восстановительными центрами белков.
109
Так, в медицине широко применяются ферментсодержащие
датчики для определения содержания глюкозы. Основное применение
они находят при регуляции содержания сахара в крови у больных сахарным диабетом. Недостаточно точный контроль уровня сахара при
этой болезни приводит к развитию опасных для жизни побочных процессов диабета.
6.6 Применение биотехнологии в энергетике
Биоэнергетика - это область биотехнологии связанная с эффективным использованием энергии, запасенной при фотосинтезе биомассой.
В последние годы, часто говорят об "энергетическом кризисе"запасы ископаемого топлива ограничены, а население планеты растет,
и потребление энергии все увеличивается.
Известно, что около 99,4%, доступной нам не ядерной энергии
мы получаем от Солнца, и часть ее аккумулируется в биомассе, хотя и
с малой эффективностью. Усредненная максимальная эффективность
превращения энергии при фотосинтезе составляет от 5% до 6%. В зонах с умеренным климатом эффективность преобразования энергии
составляет от 0,5% до 1,3%. Растения используют свет с длиной волны
от 400 до 700 нм, то есть доля фотосинтетически активной радиации
(ФАР) составляет 50% всего солнечного света.
Основные процессы фотосинтеза протекают в хлоропластах, которые поглощают СО2, поступающий в растение путем диффузии.
Фотосинтез состоит из двух этапов:
- преобразование энергии фотонов в химическую энергию, которая накапливается в форме АТФ и комплекса водорода связанного с
коферментом НАДФ;
•
Фотолиз - образование углеводов из СО2 с участием Н2 и АТФ
12 Н2О
•
свет
12 [Н2] + 6 О2 + АТФ
Фотоассимилиция
6 СО2 + 12 [Н2] темнота, АТФ
110
С6Н12О6 + 6 Н2О
Преимущество использования солнечной энергии, заключенной в
биомассе, в том, что она запасается в форме органических веществ и
поэтому ее можно хранить и перемещать во времени и в пространстве.
Биомассу можно сжигать или довольно простыми способами при
помощи микроорганизмов превращать в жидкое или газообразное топливо (метан, этиловый спирт или водород). По этой причине биомасса
представляет собой постоянно возобновляемый источник энергии.
Сырье, используемое для производства биотоплива: древесина,
масленичные растения, водоросли.
Ранее основным путем использования растительного сырья в качестве топлива во всем мире было прямое сжигание. В настоящее время - это система термической модификации такого сырья: пиролиз, газификация и гидрогенизация.
При всем разнообразии жизненных функций, связанных с потреблением энергии, в их основе лежат три вида трансформации энергии:
• энергия АТФ – энергия химических связей стабильных биологических соединений;
• энергия АТФ – механическая работа;
• энергия АТФ – осмотическая работа.
Первый вид использования энергии АТФ составляет основу синтезов разнообразных химических соединений, в том числе и биополимеров – нуклеиновых кислот, белков и полисахаридов (анаболическая ветвь метаболизма). Их энергообеспечение достигается сопряжением реакций, протекающих на одном ферменте («энергия из рук в
руки»). При этом запасы энергии в одном из участков реакции повышаются за счёт распада макроэргических соединений с понижением
запасов энергии системы в целом.
Второй вид - использование энергии АТФ для осуществления
механической работы. Этот процесс лежит в основе разнообразных
форм двигательной активности организмов и клеток: сокращение
мышц у животных, движение листьев и цветков у растений, работы
жгутиков и ресничек у простейших, перемещения ядерного аппарата
при делении клеток и т.п. Коэффициент полезного действия трансформации энергии в мышце составляет около 40%. Решающую роль в таких механо-химических процессах играют сократительные белки, способные перестраивать свою структуру и взаиморасположение, что находит свое внешнее проявление в макроскопическом эффекте – сокращении мышцы.
Третий вид использования энергии АТФ – осмотическая работа. В ее основе лежит генерация и поддержание концентрационных
111
перепадов (градиентов) различных веществ, и, прежде всего, ионов натрия и калия в системах: клетка – окружающая среда или клеточные
органоиды – цитоплазма. Перенос веществ, связанный с расходом богатых энергией соединений, получил название активного транспорта.
Благодаря активному транспорту в клетках поддерживается необходимое постоянство ионного состава и ионная поляризация мембран возбудимых (нервные, мышечные) клеток – мембранный потенциал, или
потенциал покоя. Это является основной предпосылкой для возникновения и распространения нервного импульса – потенциала действия.
Наконец, энергия АТФ может с высокой эффективностью
трансформироваться в световую энергию. Это имеет место в явлении биолюминесценции. Значительно меньшую роль в биоэнергетике
играют процессы чисто физического переноса энергии. Наибольшее
функциональное значение миграция энергии имеет в процессе фотосинтеза: с ее помощью осуществляется перенос энергии квантов света,
поглощенных различными пигментами, к реакционным центрам, с помощью которых энергия электронного возбуждения трансформируется
в химическую энергию продуктов фотосинтеза.
6.6.1 Законы биоэнергетики
Первый закон биоэнергетики. Живая клетка избегает прямого
использования энергии внешних ресурсов для совершения полезной
работы. Она сначала превращает их в одну из трех конвертируемых
форм энергии («энергетических валют»), а именно в АТФ, ∆ µН+ или
∆µNa+, которые затем расходуются для осуществления различных
энергоемких процессов.
Второй закон биоэнергетики. Любая живая клетка всегда располагает как минимум двумя «энергетическими валютами»: водорастворимой (АТФ) и связанной (∆µН+ , либо ∆µNa+).
У морских бактерий имеются, по меньшей мере, АТФ и ∆µNa+, но
очень часто также и ∆µН+. У пресноводных бактерий, «валютой» служат АТФ ∆µН+. Что касается ∆µNa+, то она, как правило, отсутствует
из-за низкой концентрации Na+ в среде обитания.
Третий закон биоэнергетики. «Энергетические валюты» клетки
могут превращаться одна в другую. Поэтому получения хотя бы одной
из них за счет внешних ресурсов достаточно для поддержания жизнедеятельности.
Так, анаэробные бактерии могут за счет гликолиза производить
АТФ, который затем используется в процессах энергообеспечения ли-
112
бо непосредственно, либо после превращения в ∆µН+ или ∆µNa+. Железобактерии способны окислять кислородом ион Fe2+ в ион Fe3+, образуя ∆µН+. Эта единственная реакция дыхания питает все потребляющие энергию процессы, в том числе синтез АТФ из АДФ и Н3РО4.
Описаны бактерии, использующие только свет в качестве энергетических ресурсов. Но, пожалуй, наиболее удивительна энергетика
бактерии Propionigenium modestum, обнаруженной недавно в иле морского пролива неподалеку от Венеции. У этой бактерии нет ни фотосинтеза, ни дыхания, ни гликолиза. Вся необходимая энергия черпается из единственной реакции декарбоксилирования янтарной кислоты в пропионовую. Этот процесс сопряжен с генерацией ∆µNa+, которая утилизируется для совершения осмотической работы, либо превращается в АТФ посредством Na+-АТФ-синтазы. Propionigenium modestum живет в анаэробных условиях вместе с другими бактериями, образующими янтарную кислоту- конечный продукт брожения.
6.6.2 Биологические мембраны, как преобразователи энергии
Протоплазма любой живой клетки окружена мембраной – тончайшей (около 60 Å) пленкой, состоящей из жироподобных веществ –
фосфолипидов и либо прикрепленных к ним, либо погруженных в
фосфолипиды белков. Эта мембрана называется плазмалеммой. Плазмалемма, внутренняя мембрана митохондрий, мембраны тидакоидов,
вакуолей, секреторных гранул, лизосом и эндосом служат не только барьерами, отделяющими клетку от внешней среды или одни внутриклеточные отсеки от других, но также и важнейшими преобразователями
энергии, играющими ключевую роль в запасании энергии света и дыхания и производстве определенных типов полезной работы. Во всех
этих случаях посредником между энергетическими ресурсами и работой служит не АТФ, а протонный или натриевый потенциал:
∆µН+ и ∆µNa+
6.6.3 Характеристика растительного сырья как источника
энергии
Древесина. Достоинства древесины: выход продукции в пересчете на гектар очень высок (подсчитано, что лесоводческая "энергоферма" может ежегодно давать около 10 - 30 тонн биомассы с гектара);
113
разведение лесов требует гораздо меньше вложений, чем выращивание других культур. Недостатки древесины: длительность роста; главный компонент древесины лигноцеллюлоза, очень сложна для переработки.
Bодоросли. После сбора проводят анаэробную ферментацию водорослей с получением биогаза. Достоинства: быстрый рост и легкость
сбора с поверхности водоема (ежегодный выход составляет 50 - 80
тонн с гектара); при выращивании водорослей на жидких и полутвердых отходах решается одновременно две задачи: обезвреживание
отходов и получение биогаза. Недостаток - большое содержание влаги,
что препятствует прямому сжиганию. Из зеленой водоросли Botryococcus braunii получают вещество аналогичное дизельному топливу, поскольку 75% сухой массы представлено углеводородами от С17 до
С34. После сбора водорослей эти углеводороды легко отделить экстракцией каким-либо растворителем или методом деструктивной отгонки.
Масленичные растения. Растительные масла могут быть использованы в качестве топлива и получены из сои, подсолнечников, пальм,
кокосовых орехов, арахиса, тыквы, эвкалипта и т.д. Эти масла используются как топливо в чистом виде или в смеси с дизельным топливом
для применения в двигателях компрессионного зажигания. Ежегодный
выход продукции составляет 1-5 тонн масла с гектара посевов подсолнечника и сои. Однако, прежде чем принимать решение об использовании этих масел как топлива, необходимо оценить их стоимость, а также количество энергии, необходимое для выращивания масленичных
растений и переработки сырья. Нет смысла выращивать растения и получать из них литр растительного масла, если при этом затрачивается
два литра первосортного горючего.
Перспективы развития биоэнергетики биотехнологи видят в
следующем:
- повышение эффективности конверсии солнечного света в биомассу, например, путем выращивания водорослей при высокой концентрации углекислого газа и ограниченной освещенности в биореакторах
со строго контролируемыми условиями роста;
- использование нетрадиционных источников энергии.
6.6.4 Альтернативные источники энергии и их получение
Этанол. Это экологически чистое топливо, дающее при сгорании
СО2 и Н2О. Теплота сгорания этанола 30 кДж/г. Его используют в дви-
114
гателях внутреннего сгорания в чистом виде или как 10 - 20% добавку
к бензину – газохол. В США газохол заменяет 10% потребляемого
бензина. Широкое внедрение газохола планируется в странах Западной
Европы. Хотя этиловый спирт можно использовать для приготовления
пищи, обогрева, освещения или производства пара и электричества,
особой выгоды получить, здесь не удается. Дело в том, что в процессе
превращения биомассы в топливо происходит значительная потеря
энергии. Энергия тратиться на всех стадиях переработки спирта.
Больше всего ее тратиться на концентрирование и обезвоживание
спирта при перегонке. Энергию эту можно получать из отходов растительного сырья (багассы, соломы и т.д.), сжигая древесину или ископаемое топливо, газ, нефть или уголь. Энергозатраты на переработку
сырья близки к количеству энергии, получаемой в форме спирта. По
этой причине энергообеспечение всего процесса должно идти либо за
счет переработки отходов, либо за счет использования самого дешевого топлива.
Химизм и технологические аспекты спиртового брожения.
Основной продукт спиртового брожения - этиловый спирт, в незначительных количествах образуются и другие спирты. В основе
процесса лежит сбраживание сахаров до пировиноградной кислоты,
которая затем декарбоксилируется с образованием ацетальдегида и
углекислого газа:
СН3О = С2Н4О + СО2
Ацетальдегид принимает водород от комплекса кофермента НАД
с водородом и превращается в этиловый спирт:
С2Н4О + Н2 = С2Н5ОН
Основной возбудитель спиртового брожения - дрожжи рода
Sacсhаromyces, но способностью к сбраживанию углеводов и образованию спиртов обладают и другие низшие грибы и бактерии.
Дрожжи разнообразны по морфологическим признакам. Лучше
всего дрожжи развиваются при температуре +25-30 0С в условиях слабокислой реакции среды (рН 4-6) и могут доводить концентрацию
спирта в среде до 15-17 %. Дрожжи - классический пример зависимости обмена веществ от условий окружающей среды. Это аэробные организмы, поэтому при получении хлебопекарных и кормовых
дрожжей применяется интенсивная аэрация. При отсутствии кислорода
115
дрожжи переходят к брожению. По этой причине технология производства вина, пива, спирта предусматривает анаэробные условия. В качестве субстрата все дрожжи потребляют гексозу. Полисахариды
дрожжи, как правило, не используют, но они сбраживают образующиеся в результате гидролиза моносахариды. При гидролизе клетчатки образуются гексозы, а при расщеплении гемицеллюлоз - пентозы. На гексозах выращивают спиртовые дрожжи. Для выращивания кормовых
дрожжей пригодны сточные воды многих производств. Используются,
например, сточные воды производства лимонной кислоты, расширяется культивирование кормовых дрожжей на отходах нефтепродуктов, то
есть их производство решает одновременно две задачи:
1) получение ценного кормового продукта;
2) снижение концентрации загрязнения в сточных водах.
Основная масса спирта вырабатываемого на крупных предприятиях получают с помощью дрожжей Saccharomyces, обычно
S.cerevisiave, но иногда и S.uvarum и S.diastaticus. Первая задача здесь
заключается в подборе соответствующих видов дрожжей подходящих
для переработки данного субстрата. Дрожжи S.cerevisiae могут расти
на глюкозе, фруктозе, мальтозе и мальтотриозе, то есть на сахарах, содержащихся в
крахмалсодержащих растениях. Вид дрожжей
S.diastaticus может также использовать декстрины, а виды
Kluyveromuces fragilis и K.lactus - лактозу.
Как было отмечено, образование этилового спирта дрожжами это анаэробный процесс, но для их размножения нужен кислород. В
следовых количествах кислород нужен и для поддержания жизнедеятельности клеток, образующих этанол. В ходе метаболизма осуществляется сложная регуляция образования этанола из глюкозы. Сам
процесс метаболизма, жизнеспособность клеток, их рост, деление и образование спирта зависят от концентрации субстрата, кислорода и конечного продукта.
Существует три основных способа сбраживания сахарсодержащего сырья: периодический, периодический с повторным использованием
клеток и непрерывный.
При периодическом процессе субстрат сбраживается после внесения в него свежевыращенной закваски, полученной в аэробных условиях. Брожение протекает в анаэробных условиях, и весь оставшийся
субстрат превращается при этом в спирт. После завершения брожения
дрожжи удаляют, и для следующего цикла получения спирта выращивают новую порцию закваски. Размножение дрожжей является дорогостоящей процедурой, так как расходуется много субстрата. При ис-
116
пользовании дрожжей по периодической схеме около 5% сахара расходуется на рост клеток и обеспечение энергией синтеза других соединений: глицерола, уксусной кислоты, ацетальдегида и сивушных масел. По этой причине максимальный выход составляет около 48% от
субстрата по массе. При использовании дрожжей продуктивность
варьирует в пределах от 1г до 2 г этилового спирта в 1час на 1грамм
клеток (сухого вещества).
Недостатки периодического процесса (длительное сбраживания и
неполное использование субстрата) можно частично устранить, применяя периодическую схему с повторным использованием клеток. При
этом в конце цикла дрожжевые клетки отделяют от сбреженной пульпы и сохраняют для использования в следующем цикле. По завершении сбраживания концентрация спирта составляет от 6% до 12%. Она
зависит от штамма дрожжей и начальной концентрации сахара.
Повышение выхода спирта и стабилизация активности его продуцентов могут быть достигнуты путем иммобилизации клеток. Так эффективный синтез этанола осуществлен с применением клеток
Z.mobilis, иммобилизованных на хлопчатобумажных волокнах.
В большинстве случаев, поскольку за пищевой спирт нужно платить большой налог, алкоголь денатурируют. Для этого в спирт добавляют вещества, придающие ему горький вкус, или смешивают его с
бензином.
Главным побочным продуктом производства являются углекислый газ, сивушные масла и кубовые остатки. Каждый из них имеет определенную ценность, но переработка жидких остатков может быть затруднена. Производство этанола из растительного сырья не является
безотходным, на каждый литр спирта приходится от 12 литров до 14
литров сточных вод с высокой концентрацией отходов, опасных для
природных экосистем.
Метан. Получение метана - важный путь утилизации сельскохозяйственных отходов. При переработке сырья в анаэробных условиях
участвует смешанная популяция микроорганизмов.
Процесс анаэробного сбраживания отходов, в результате, которого образуется биогаз (смесь метана и углекислого газа) называют биометаногенез. Содержание метана в биогазе составляет от 50 до 85 %.
Присутствие углекислого газа ограничивает теплотворную способность биогаза, которая в зависимости от содержания СО2 составляет от
20,9 кДж/м3 до 33,4 кДж/м3. Количество образующегося метана в биогазе зависит от содержания белка в сырье: чем оно больше, тем богаче
биогаз метаном. Обычно биогаз образуется со скоростью 0,5м3 на ки-
117
лограмм сухой массы летучих компонентов, время удержания составляет около 15 суток.
Неочищенный биогаз используют для приготовления пищи и освещения. Его можно применять как топливо в стационарных установках, вырабатывающих электроэнергию. Сжатый газ в баллонах пригоден как топливо для машин и тракторов. Его можно подавать в газораспределительную сеть. В последнем случае требуется некоторая
очистка биогаза: осушка, удаление углекислоты и сероводорода.
Процесс метанообразования отличается высокой эффективностью: от 90% до 95% используемого углерода переходит в метан.
Толчком к созданию данного эффективного биотехнологического направления послужил энергетический кризис, разразившийся в
середине 70-х гг. Производство биогаза стало одним из основных
принципов энергетической политики ряда стран тихоокеанского региона: Китая, Индии, Филиппин, Израиля, латинской Америки, в 70-е годы интерес проявили страны Европы, особенно ФРГ, Франция, НьюЙорк и страны Африки.
Производство биогаза путем метанового «брожения» отходов
– одно из возможных решений энергетической проблемы в большинстве сельских районов развивающихся стран. И хотя при использовании коровьего навоза только четверть органического материала превращается в биогаз, последний выделяет тепла на 20% больше, чем его можно получить при полном сгорании навоза.
В Китае, Индии, ряде других стран эксплуатируются небольшие
установки, в которые вносят подручный материал (солому, навоз и
др.), что исключает затраты на доставку сырья. В Китае действует более 7 млн. малых установок вместимостью от 10 литров до 15 литров,
достаточных для удовлетворения энергетических потребностей семьи
из пяти человек.
Наиболее крупными установками для синтеза метана можно считать свалки бытового мусора. О самой возможности использования метана, образующегося в таких мусорных кучах, задумались, когда стали
искать способы для предотвращения взрывов и пожаров, возникающие
в результате выделения в них газа. Кислород, оказавшийся в мусоре
при образовании куч, быстро используется аэробными бактериями и
грибами, в результате чего условия в них становятся анаэробными.
Влажность поддерживается либо просачивающейся дождевой водой,
либо грунтовыми водами. Если буферная способность материала достаточна для поддержания нейтральных значений рН, то складываются
благоприятные условия для образования метана. Газ выделяется в сме-
118
си с углекислым газом. Собирают его при помощи труб, проложенных
в толще мусора под пленкой.
Водород. Водород это абсолютно чистое топливо, дающее при
сгорании лишь воду. Отличается исключительно высокой теплотворной способностью 143 кДж/г. Химические и электрохимические методы получения водорода неэкономичны, поэтому весьма актуально использование микроорганизмов способных выделять водород в процессе своей жизнедеятельности.
Перспективным считается модификация самого процесса фотосинтеза, в результате которой энергия света с максимальной эффективностью используется на образование водорода или другого топлива,
минуя стадию фотоассимиляции СО2 и синтеза компонентов клетки.
Биотехнологи изучают возможность получения водорода путем
расщепления воды при участии фотосистемы фотосинтезирующих организмов, то есть путем биофотолиза.
Биофотолиз - процесс образования водорода Н2 и кислорода О2
из воды с помощью микроорганизмов.
Более тридцати лет назад было сделано замечательное открытие.
Установлено, что если взять мембраны, содержащие хлорофилл, и добавить к окружающему раствору ферменты (гидрогеназы), действующие как катализаторы, то на свету будет происходить разложение воды
на водород и кислород. Сегодня уже созданы небольшие фотореакторы, в которых при надлежащих условиях образование водорода идет с
надлежащей скоростью, до нескольких литров водорода в минуту. Однако фотобиологический способ получения водорода еще не вышел из
стен лаборатории.
Технически проще всего получить водород, используя интактные
сине-зеленые водоросли или процессы ферментации (брожения).
Опыты с цианобактериями (сине-зелеными водорослями) и зелеными водорослями показали, что они способны образовывать водород
и кислород путем прямого фотолиза воды. Лежащий в основе этого явления процесс фотосинтеза сформировался в результате генно-инженерной деятельности Природы. Процесс выделения водорода водорослями протекает с участием ферментов гидрогеназы или нитрогеназы.
Фотосинтезирующие бактерии не способны разлагать воду, но
могут на свету образовывать большие количества водорода (без примесей кислорода) или аммиака. Для этого им нужны только простые органические и неорганические субстраты. Такие вещества содержатся в
промышленных отходах, и поэтому превращение солнечной энергии
119
фотосинтезирующими бактериями вполне может быть сопряжено с переработкой отходов.
Высокоэффективными продуцентами водорода являются пурпурные фототрофные бактерии, например Rhodopseudomonas sp., которые
при иммобилизации (закреплении) в агарозном теле дают до 180 мкмоль водорода за 1 час в пересчете на 1 мг бактериохролофилла.
6.7 Производство пищевых продуктов и напитков
Основой современного пищевого производства является биотехнология, базирующаяся на достижениях микробиологии, биохимии,
химической технологии, молекулярной биологии, генной инженерии и
генетики. Пищевая промышленность, в настоящее время, представляет
собой совокупность базовых технологий, которые существуют уже
столетия (выпечка хлеба, заквашивание молока, сыроделие, виноделие
и т.д.) и современных научных разработок, которые становятся все совершеннее. Благодаря этому заметно улучшается качество продукции,
появляется возможность влиять на тот или иной процесс в зависимости
от заданных параметров продукта, вследствие чего давно знакомые
нам продукты приобретают новые свойства. Так, например, молочные
продукты становятся не только разнообразнее и вкуснее, но и приобретают массу полезных для организма человека свойств, которые обеспечиваются введением в сырье полезной микрофлоры.
Главным звеном биотехнологического процесса является клетка миниатюрный химический завод, работающий с колоссальной производительностью, предельной согласованностью и по заданной программе. Новые перспективы для исследователей и работников пищевой промышленности возникают в теоретических и практических
аспектах биотехнологии в результате выяснения механизмов регуляции метаболизма живой клетки и возможности управлять ходом ферментативных процессов, как в самой клетке, так и вне ее организма.
Применение новых видов ферментных препаратов позволяет с наибольшим эффектом осуществлять все производственные процессы,
наиболее правильно регулировать их направленность, получать совершенные виды пищевой продукции высокого качества с заданными
свойствами.
Традиционно использование микроорганизмов при производстве
различных продуктов совершенствовались тысячелетиями. Сегодня
еще трудно говорить о том, каких успехов удастся достичь в этой об-
120
ласти с помощью биотехнологии, но самые общие тенденции вырисовываются довольно ясно.
Во-первых, на смену традиционным способам приготовления
пищи постепенно придут биореакторы, в которых будут расти клетки
животных или растений и микроорганизмов. Дело в том что, выход
продукции при использовании ферментеров или биореакторов может
быть существенно выше, чем в сельском хозяйстве: идущие в них процессы гораздо более интенсивны. Развитию этого направления способствуют и все возрастающая конкуренция за земельные ресурсы. Вовторых, эта альтернативная технология будет становиться все более
производительной благодаря использованию методов генной инженерии, которые позволяют получать улучшенные линии клеток и штаммы микроорганизмов. В основе всех этих производств лежат реакции
обмена веществ, происходящие при росте и размножении некоторых
микроорганизмов.
Из пищевых продуктов большое значение приобретают полученные биотехнологией заменители сахара - фруктоза и мультимер аспартама (слаще сахарозы в 10000 раз). Другие подсластители - сахарин, сорбит, ксилит, маннит, стевозид, тауматин и др. Биотехнологическими процессами получают ценные пищевые добавки. Наиболее яркий пример - производство лимонной кислоты. Сегодня ее получают
главным образом микробиологическим методом, а не из цитрусовых. В
результате земельные площади не приходится занимать посадками лимонных деревьев. Производство уксусной кислоты, являющейся первым продуктом, полученным с помощью иммобилизованных клеток. В
большом количестве вырабатывается глутамат натрия, который служит усилителем вкусом, и лизин, который используют как пищевую
добавку.
Биотехнология активно внедряется в производство кормов необходимых в животноводстве. Микроорганизмы могут превращать
растительную биомассу с низким содержанием белка в пищевые продукты с высоким его содержанием. У нас в стране первые исследования в этом направлении начались в 30-е годы. Были построены первые
заводы по получению кормовых дрожжей на гидролизатах древесины, сельскохозяйственных отходах. В 1963 г. создан Всесоюзный НИИ
биосинтеза белковых веществ. Началось крупномасштабное производство белкововитаминного концентрата (БВК). В 60-х годах ряд нефтяных компаний начали исследования и разработки по созданию новых
процессов получения БВК, в зарубежной промышленности чаще употребляют термин белок одноклеточных организмов (БОО), предназна-
121
ченного для употребления в пищу животных и людей. В качестве субстрата использовали нефть, метан, метанол, крахмал. Процессы на основе крахмала и метанола оказались наиболее конкурентоспособными.
В крупных промышленных масштабах этот процесс использовался в
Германии: там, в ходе первой мировой войны выращивали дрожжи
Sacchromyces cerevisiae, которые добавляли главным образом в колбасу и супы. Таким путем удалось компенсировать около 60 % довоенного импорта пищевых продуктов. Один из немногих высококачественных продуктов из БВК, пригодных для человека производится в Англии фирмой Rank Hovis McDougal. Его вырабатывают из гриба, выращиваемого на содержащем углеводы сырье. Основные принципы получения белка в пищу людям те же, что и для производства кормового
белка для животных, однако круг допустимых субстратов ограничен, а
требования к продукту более жесткие. Необходимы предварительные
медико-биологические исследования и клинические испытания пищевых препаратов биомассы. Психологический барьер производства микробной пищи связан не только с риском интоксикации, но и с сомнительными вкусовыми достоинствами этой пищи. Эксперт по проблемам питания заметил: "Пища имеет все те свойства, которыми должна
обладать новая человеческая пища: не имеет ни запаха, ни цвета, ни
структуры, ни вкуса". Поэтому в такую пищу необходимо вводить
вкусовые, ароматизирующие и структурирующие добавки. Перспективным является культивирование грибов Fusarium, цианобактерий
Spirulina, зеленых водорослей Chlorella имеющих консистенцию и другие органолептические свойства более привычные для человека.
В производстве важных продуктов современной пищевой промышленности важное место занимают процессы брожения. Различают
следующие типы брожения: спиртовое, молочнокислое (гомо- и гетероферментативное), масляное, уксуснокислое, пропионовокислое,
бутиленгликолевое, ацетонобутиловое. Химизм процессов в начальной стадии одинаков для всех типов брожения. Он начинается с разложения моносахаридов, среди которых ведущее значение отводится
глюкозе. Процесс начального этапа брожения называется гликолиз
(греческое ”glicus“ – сладкий и латинское “lizis” – разложение, распад).
Это очень сложный, многостадийный процесс, протекающий в анаэробных условиях. Выделяют 10 стадий гликолиза, которые катализируются различными ферментами. Продукт реакции каждого предыдущего фермента является субстратом для последующего. Конечным
продуктом гликолиза служит пировиноградная кислота или пируват.
Реакции гликолиза сопровождаются высвобождением энергии, которая
122
аккумулируется в АТФ. Далее пути брожений расходятся, названия
различных типов брожений даны по конечным продуктам. Представим
химизм основных типов брожений, которые инициируются различными микроорганизмами.
Спиртовое брожение:
С6Н12О6 = 2С2Н5ОН + 2СО2 + 94 кДж (28ккал).
Глюкоза
Этанол
При доступе кислорода спиртовое брожение вытесняется полным окислением углеводов до диоксида углерода и воды с выделением
значительного количества энергии:
С6Н12О6 + ЗО2
Глюкоза
=
6Н2О + 6СО2 + 2830,8 кДж.
Гомоферментативное молочнокислое брожение:
С6Н12О6 = 2СН3СНСООН.
Глюкоза
Молочная кислота
Гетероферментативное молочнокислое брожение:
С6Н12О6 = СН3СНСООН + СООНСН2СН2СООН +
Глюкоза
Молочная
Янтарная
кислота
кислота
+ СН3СООН + СН3СН2ОН + СO2+ H2.
Уксусная
Этиловый
кислота
спирт
Маслянокислое брожение:
С6Н12О6 = СН3СН2СН2СООН + 2СО2 + 2Н2 + Дж.
Глюкоза
Масляная кислота
Пропионовое брожение:
С6Н12О6 = 4СН3СН2СООН+2СН3СООН+2СО2+2Н2О+Дж.
Глюкоза Пропионовая
Уксусная
кислота
кислота
123
Бутиленгликолевое брожение:
С6Н12О6 = CH3CH2OHCH2OHCH3 + HCOOH +
Глюкоза
2,3-бутиленгликоль
Муравьиная
кислота
+ CH3COOH + C2H5OH + COOHCH2CH2COOH + CH3CHCOOH.
Уксусная Этиловый
Янтарная кислота
Молочная
кислота
спирт
кислота
Ацетонобутиловое брожение:
3 С6Н12О6 = CH3COCH3 + CH3CH2CH2CH2OH +
Глюкоза
Ацетон
Бутиловый спирт
+ CH3CH2OH + CH3CHOHCH3 + H2 + 6CO2
Этиловый
Изопропиловый
спирт
спирт
+ 2H2O.
Наибольшую востребованность в пищевой промышленности нашли молочнокислое, спиртовое, уксуснокислое и маслянокислое брожение, эти процессы лежат в основе производства важнейших продуктов питания.
Традиционные пивоварение, виноделие, хлебопечение, получение
кисломолочных продуктов до сих пор остаются наиболее важными
производствами, приносящими отрасли хороший доход. Представим
некоторые технологические аспекты указанных производств.
6.7.1 Биотехнологические процессы в хлебопекарном
производстве
Среди древнейших созданий человеческого разума и рук есть
творение, значимость которого с годами не уменьшается, а увеличивается. Это – хлеб. И не только потому, что «без хлеба нет обеда». Хлеб
издавна символизировал народное благополучие.
Когда «родился» хлеб? Ученые утверждают, что еще во времена
мезолита (10-15 тыс. лет назад) человек начал возделывать злаки, которые были прародителями ячменя, пшеницы, овса, ржи. На Ближнем
Востоке лепешки выпекали из крутого пресного теста на горячих камнях, в золе или на раскаленных стенках печек, имевших форму пчелиных улиев. Лепешки были жёсткими и сухими, но зато долго сохра-
124
нялись. Подобные печки – тандыры сохранились и поныне в Средней
Азии и в Закавказье.
Прошло ещё много столетий, прежде чем в тесто начали добавлять дрожжи, превратившее жесткую лепешку в пышную и мягкую
булку. Историки считают, что кислое тесто впервые появилось у
египтян, которым был известен способ приготовления пива, а значит и
процесс брожения, приблизительно в середине второго тысячелетия
до нашей эры.
Хлебопекарные дрожжи – это скопление клеток семейства
грибов-сахаромицетов. Они вызывают спиртовое брожение сахаров
теста, в результате чего образуется спирт и углекислый газ. Применение дрожжей в хлебопечении основано на том, что при брожении углекислый газ разрыхляет тесто, придает ему пористую структуру. Углекислый газ как бы растягивает, расширяет тесто, делает его пышным. В
процессе брожения в тесте накапливаются сложнейшие органические
соединения, которые при выпечке под влиянием высоких температур
предают хлебу великолепный вкус и аромат.
Зерно имеет в своем составе разнообразный комплекс ферментов,
которые влияют на качество хлеба. Низшие сорта муки отличаются
большим содержанием и активностью ферментов, чем высшие, так
как ферменты сосредоточены в зародыше и периферийных частях зерна. Ферментная активность отдельных партий муки одного и того же
сорта зависит от многих факторов: условий произрастания, хранения и
сушки, режима кондиционирования, продолжительности хранения
зерна или муки. Повышенная ферментная активность наблюдается
у муки, полученной из зерна недозревшего, морозобойного, проросшего или пораженного клопом-черепашкой, а низкая - у муки, полученной из зерна, чрезмерно перегретого при сушке. При хранении муки
(зерна) активность ферментов несколько снижается. Ферментативные
процессы в полуфабрикатах при их брожении или выпечке должны
протекать с определенной скоростью в зависимости от биологических
процессов, качества муки и режимов приготовления теста. При повышенной или пониженной (по сравнению с обычным значением) ферментной активности муки осложняется технологический процесс, возникают дефекты хлеба. В технологическом процессе производства
хлеба наиболее важны ферменты, гидролизующие главные вещества
муки - белки и крахмал. Интенсивность, с которой сложные вещества
муки разлагаются под действием ее собственных ферментов, характеризует автолитическую активность муки (автолиз - саморазложение).
125
Роль дрожжей сахаромицетов в хлебопечении. Дрожжи сахаромицеты выполняют в основном роль разрыхлителей теста, оказывая
существенное влияние на объем готового хлеба и пористость мякиша.
Сбраживая сахара муки и мальтозу, образующуюся из крахмала муки
под действием амилаз, они образуют углекислый газ и спирт. Химизм
спиртового брожения в настоящее время изучен детально. Известно,
что наряду с главными продуктами брожения получаются побочные,
например - уксусный альдегид, спирты (бутиловый, изобутиловый,
изоамиловый), органические кислоты (молочная, янтарная, винная,
щавелевая) и некоторые другие вещества, придающие хлебу специфический вкус и аромат. Кроме того, небольшое количество спирта, которое остается после выпечки в готовом хлебе (до 0,5%), также значительно улучшает вкус и аромат хлеба.
Для разрыхления пшеничного теста применяют дрожжи
Saccharomyces cerevisiae. Их вносят в виде прессованных дрожжей,
дрожжевого молока, сгущенных или жидких дрожжей. В брожении
ржаных заквасок участвуют два вида дрожжей сахаромицетов:
Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces minor.
Технология приготовления теста
Замес теста. Замес теста - важнейшая технологическая операция, от которой в значительной степени зависит дальнейший ход технологического процесса и качество хлеба. При замесе из муки, воды,
дрожжей, соли и других составных частей получают однородную массу с определенной структурой и физическими свойствами, чтобы в последующем при брожении, разделке, расстойке, тесто хорошо перерабатывалось. Количество воды на замес берут с учетом сорта муки и её
влажности. При избытке воды тесто имеет слабую консистенцию и
расплывается. Если в тесте недостаточно воды, оно уплотняется, медленно созревает и не достигает нужного объема. Тесто при замесе
тщательно перемешивают. Это, во-первых, необходимо для того, чтобы смешать основное и вспомогательное сырье и получить плотную
однородную массу, а во-вторых, во время перемешивания тесто обогащается кислородом, который необходим для нормального брожения.
Плохо перемешанное тесто имеет неоднородную массу, неравномерно
бродит и созревает. Если тесто перемешивать слишком долго, из него
будет удален воздух, без которого нарушается нормальное брожение
теста, то есть тесто не будет иметь подъемной силы. В результате изделия получатся небольшими по объему, с плотным не разрыхленным
мякишем. Продолжительность замеса теста зависит от ряда условий, в
том числе от количества муки, ее влажности и других физических
126
свойств. С начала замеса в полуфабрикатах происходят различные
процессы - физические, биохимические и др. Существенная роль в образовании пшеничного теста принадлежит белковым веществам. Нерастворимые в воде белки муки, соединяясь с водой при замесе, набухают и образуют клейковину. При этом белки связывают воду в количестве, примерно в два раза большем по сравнению со своей массой;
75% этой воды связывается осмотически. Набухшие белковые вещества муки образуют "каркас теста" губчатой структуры - клейковину,
что и определяет растяжимость и эластичность теста. Основная часть
муки (зерна крахмала) адсорбционно связывает большое количество
воды. Значительная её часть поглощается пентозанами муки. Тесто
представляет собой полидисперсную систему, состоящую из твердой, жидкой и газообразной фаз. От соотношения фаз в этой полидисперсной системе зависят физические свойства теста. Наряду с физическими и коллоидными процессами в тесте под действием ферментов муки и дрожжей начинают проходить и биохимические процессы.
Наиболее значительное влияние оказывают ферменты муки, которые
дезагрегируют белок. Соприкосновение теста во время замеса с кислородом воздуха снижает дезагрегационное влияние ферментов. В меньшей мере действуют и ферменты, расщепляющие крахмал.
Разрыхление теста. Чтобы получить вкусный пористый, с хорошим мякишем хлеб, следует предварительно разрыхлить тесто. В
основном используется биологический способ разрыхления. Он основан на спиртовом брожении сахара. Дрожжи образуют в тесте углекислый газ, который разрыхляет хлебные полуфабрикаты.
Брожение. Процессы брожения в тесте начинаются с момента
замеса и продолжаются до полного прогревания его в печи. Брожение
теста можно разделить на два этапа: от замеса до разделки и от начала
разделки до выпечки. На первом этапе происходит созревание его, накопление вкусовых и ароматических веществ и оптимальное изменение физических свойств. Разрыхление теста на этой стадии брожения
существенного значения не имеет, так как углекислый газ во время разделки практически полностью удаляется из тестовых заготовок. Созревшее тесто направляют на разделку. На втором этапе в тесте продолжается брожение. При разделке, расстойке и в начале выпечки тесто разрыхляется образующимся в нем углекислым газом, что необходимо для получения хлеба с хорошо разрыхленным и пористым мякишем. В пшеничном тесте преобладает спиртовое брожение, однако наряду с ним всегда протекает и молочнокислое брожение.
127
Спиртовое брожение вызывается дрожжами. При приготовлении опары или теста дрожжи развиваются, питаются, размножаются,
сбраживают основные сахара. В течение первых 1,5-2 часов брожения
дрожжи разлагают сахара муки - глюкозу, фруктозу, сахарозу. Последняя под действием ферментов, содержащихся в дрожжах (фермент сахарозы), превращается во фруктозу и глюкозу, которые затем также
сбраживаются дрожжами. Скорость превращения сахарозы муки в
глюкозу и фруктозу очень велика. Уже через несколько минут после
замеса теста собственные сахара муки сбраживаются и могут играть
существенную роль только в первый период брожения теста. В дальнейшем дрожжи сбраживают мальтозу. Прессованные дрожжи, как
правило, выращивают на средах, не содержащих мальтозы, поэтому
для сбраживания ее ферментная система дрожжевой клетки должна
быть в течение определенного периода перестроена. Часть сахара, находящегося в тесте, затрачивается на увеличение дрожжевой массы
при размножении дрожжей в опаре или заквасках. На интенсивность
размножения дрожжей в полуфабрикатах влияют их исходные количества, консистенция полуфабриката, его температура, влажность и содержание питательных веществ, необходимых клетке. В густых полуфабрикатах дрожжи размножаются медленнее, чем в жидких, так как
обмен веществ в густой среде затруднен. Решающее влияние на ход
спиртового брожения оказывает температура полуфабриката. Она колеблется от 23 0С до 35 0С. Чем выше температура полуфабриката, тем
интенсивнее совершается спиртовое брожение. Так, при температуре
35 0С интенсивность брожения в два раза выше, чем при температуре
25 0С. Процесс брожения во многом зависит от содержания в полуфабрикатах растворимых азотистых веществ, минеральных соединений, сахара и витаминов, необходимых дрожжам, а также рН среды и
концентрации поваренной соли. В ряде стран набор минеральных, азотистых и ростовых веществ является обязательным компонентом пшеничного теста. рН теста обычно совпадает с оптимальным для спиртового брожения значением (4-6). Весьма небольшие дозировки поваренной соли (около 0,1% к массе муки) положительно влияют на жизнедеятельность дрожжей.
Молочнокислое брожение. Значительную роль в созревании полуфабрикатов хлебопекарного производства играют молочнокислые
бактерии, представляющие обширную группу микроорганизмов, образующих в результате брожения молочную кислоту и другие вещества.
По ферментативной деятельности молочнокислые бактерии разделяют
на гомоферментативные и гетероферментативные. При гомофермен-
128
тативном брожении образуется от 85% до 90% молочной кислоты, при гетероферментативном образуется около 20% - 40%. При
молочнокислом брожении, помимо молочной кислоты, образуются уксусная кислота, муравьиная кислота, этиловый спирт, диоксид углерода и другие вещества. Важным является спиртоустойчивость молочнокислых бактерий при совместном использовании их с дрожжами. Гетероферментативные молочнокислые бактерии и некоторые виды
Lactobacillus plantarum сбраживают пентозы. Дрожжи сбраживают
глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, простые декстрины, не сбраживают лактозу, крахмал, клетчатку. Они усваивают этиловый спирт,
молочную кислоту, уксусную кислоту. В пшеничное тесто молочнокислые бактерии попадают с мукой, другим сырьем (например, с
дрожжами) и из воздуха. В ржаное тесто они вносятся с заквасками.
Содержание молочнокислых бактерий в заквасках весьма значительное, поэтому молочнокислое брожение в ржаных полуфабрикатах протекает очень интенсивно. В накоплении кислот в пшеничном и ржаном тесте принимают участие молочнокислые бактерии, которые образуют кислоты: уксусную, щавелевую, винную, муравьиную и прочие.
В пшеничном тесте образуется в основном молочная кислота. Доля же
всех остальных кислот сравнительно невелика от 25% до 30%. В ржаном тесте, вследствие специфических особенностей микрофлоры ржаных заквасок, доля молочной кислоты составляет около 30%, а в основном образуется уксусная кислота. На интенсивность кислотообразования в бродящих полуфабрикатах и на состав кислот, прежде
всего, влияет температура, а также консистенция полуфабрикатов и исходное количество кислотообразующих бактерий. Процесс
кислотонакопления в густых средах идет более интенсивно, чем в жидких заквасках. Молочнокислые бактерии расщепляют собственные
сахара муки, вносимую по рецептуре сахарозу, а также мальтозу, образующуюся из крахмала. В молочнокислом брожении при обычной
температуре тестоведения от 28 0С до З0 0С основное значение
имеют нетермофильные бактерии с оптимумом действия около 350С.
Изменения в степени кислотности теста и состава кислот, образующихся при брожении, влияют на ферментативные и коллоидные процессы, жизнедеятельность микрофлоры теста и на образование аромата
и вкуса хлеба. При повышении кислотности теста ускоряются процессы набухания и пептизации белков, молочная кислота препятствует
развитию вредной микрофлоры. На повышение кислотности теста
влияют прессованные дрожжи, в которых содержится некоторое количество кислотообразующих бактерий. Накопление кислот в определен-
129
ном количестве и соотношении их в совокупности со спиртами, образующимися при брожении, определяют вкус и аромат хлеба. Повышение кислотности теста снижает активность основных ферментов муки:
амилолитических и протеолитических. Конечная кислотность опары и
теста есть основной способ определения готовности теста.
При брожении теста наряду с вышеописанными продолжаются
коллоидные и физические процессы: интенсивное набухание коллоидов, набухание и пептизация белковых веществ. В благоприятных условиях при повышении кислотности теста и накоплении спирта увеличивается гидрофильность коллоидов теста. Набухание белков может
проходить с различной интенсивностью и скоростью. В тесте из сильной муки набухание проходит медленно, ограниченно, заканчивается
только к концу брожения. Это уменьшает количество жидкой фазы в
тесте и улучшает его физические свойства. Обминка теста из сильной
муки ускоряет процесс набухания белков и также улучшает физические свойства теста. В тесте из слабой муки структура белков непрочная, поэтому набухание происходит очень быстро, а белки частично
пептизируются. Это приводит к быстрому увеличению количества
жидкой фазы в тесте и его разжижению, что ухудшает физические
свойства теста. Тесто из слабой муки не следует интенсивно обминать,
так как при механическом воздействии указанные выше процессы ускоряются и могут ухудшить физические свойства теста. При брожении теста изменяется структура его клейковинного каркаса. В результате разрыхления теста углекислым газом, образующимся при спиртовом брожении, увеличивается его объем и клейковинные пленки из набухших белков муки растягиваются. При дальнейшем механическом
воздействии в технологическом процессе (обминка и разделка теста)
клейковинные пленки вновь слипаются, образуя в тесте новую структуру клейковинного губчатого каркаса. Новая структура способствует
газоудержанию и сохранению формы изделий при окончательной расстойке и выпечке хлеба. Мякиш выпеченного хлеба приобретает равномерную, тонкостенную и мелкую пористость. Таким образом, в процессе брожения теста основные составные части его (крахмал, белки)
претерпевают значительные изменения. В процессе брожения температура теста повышается на 1 - 20С. Это обусловлено тем, что разложение сахара сопровождается положительным тепловым эффектом. Кроме того, адсорбционное связывание влаги крахмалом и другими веществами муки также сопровождается выделением тепла. Масса теста изменяется и к концу брожения уменьшается на 2-3%, поскольку в окружающую среду улетучивается часть углекислого газа, спирта, летучих
130
кислот и испаряется вода. В основном эти потери происходят за счет
сухого вещества теста (сахара), который при спиртовом брожении разлагается на спирт и углекислый газ.
Выпечка хлеба. В период выпечки интенсивно протекают процессы ферментативного гидролиза углеводов, когда под действием
амилаз крахмал переходит в глюкозу.
Новые разработки клеточной инженерии по созданию высокопродуктивных штаммов хлебопекарных дрожжей и молочнокислых бактерий способствуют интенсификации производственных процессов. В
основе процессов приготовления хлебобулочных изделий лежит совокупность сложнейших изменений сырья под воздействием микроорганизмов. Современный хлебозавод представляет собой предприятие,
основные отделения которого полностью механизированы (рис. 33).
6.7.2 Биотехнология приготовления пива
Пиво – старинный слабоалкогольный ячменно-солодовый напиток, обладающий приятной горечью, ароматом хмеля, способностью
вспениваться при наполнении бокала и долгое время удерживать на поверхности слой компактной пены. Пиво относится к слабоалкогольным
напиткам. Слабоалкогольными называют напитки, содержащие не
более 7% этилового спирта. Благодаря приятному вкусу, тонизирующему, жаждоутоляющему действию, пиво пользуется большим спросом у населения. В зависимости от сорта пиво содержит от 4% до 10%
легкоусвояемых питательных веществ, главным образом углеводов,
небольшое количество аминокислот и другие продукты расщепления
белка, а также минеральные вещества. Кроме того, в нем содержится
от 1,5% до 7% спирта, до 0,4% углекислого газа, горькие и дубильные
вещества хмеля, органические кислоты.
131
1-компрессор для подачи муки; 2-устройство для подъема мешков;
3-устройство для приема муки; 4-рукав разгрузочный; 5,8-компрессоры для аэрации; 6-питатель; 7-бункер для муки; 9-просеиватель;
10-компрессор пневмосистемы управления; 11-автомукомер; 12-поворотный шнек для подачи муки в дежу месильной машины; 13-дозатортемператор воды; 14-бойлер; 15-тестосмесительная машина; 16-тестоделитель; 17-тестоокруглитель; 18-конвейерный шкаф предварительной расстойки; 19-формующая машина; 20-конвейеры с пекарскими
листами; 21-рогликовая машина; 22-делительно-округлительная машина; 23-конвейер для хлеба; 24-ротационная электрическая печь;
25-камера окончательной расстойки.
Рисунок 33 - Аппаратурно-технологическая схема
производства хлебобулочных изделий
В пиве содержится В2 – рибофлавин, Н – биотин, В6 – пиридоксин и значительно больше витамина РР. Калорийность 1 л пива находится в пределах 400-800 ккал. Около половины этой калорийности
приходится на углеводы и белки, а половина на спирт. Производство
пива основано на процессе спиртового брожения с помощью дрожжей,
обмен веществ которых в значительной степени определяет и качество
пива. В связи с этим исключительное значение имеет выбор нужной
расы и ее поддержание.
Основные технологические стадии пивоварения
132
Технология производства пива, или собственно пивоварение, характеризуется большим числом разнообразных, последовательно протекающих технологических процессов, которые можно объединить в
такие стадии: получение солода из ячменя, приготовление пивного сусла, брожение пивного сусла, дображивание и выдержка, (созревание)
пива, фильтрация и розлив готового пива. Технология производства
пива – длительный и сложный процесс, который продолжается 60-100
дней. Рассмотрим каждую стадию отдельно.
Получение солода. Производство солода включает очистку и сортировку ячменя, его замачивание и проращивание, сушку сырого (зеленого) солода и очистку его от ростков, которые содержат горькие вещества и при попадании в затор придают пиву неприятный грубый
привкус. При проращивании зерна возрастает активность ферментов и
происходит гидролиз запасных веществ эндосперма, что облегчает перевод их в сусло. Следовательно, основная цель соложения – привести
в активное состояние ферменты зерна и подготовить вещества эндосперма к получению пивного сусла заданного состава. В зависимости от режима сушки солод приобретает светлый или темный цвет. В
пивоварении солод играет роль источника не только активных ферментов, но и того комплекса органических и минеральных веществ, который позволяет с участием этих ферментов получить пивное сусло, пригодное для сбраживания.
Для приготовления солода ячмень замачивают в специальных чанах водой с температурой от 120С до 170С. По мере возрастания влажности в зерне активизируются ферменты и катализируемые ими биохимические процессы. Замачивание прекращают по достижении зерном влажности от 42% до 45% - для светлого солода и от 45% до 47%
для темного. Из ферментов наибольшую активность приобретают
амилолитические и протеолитические. Замоченное зерно направляют
для проращивания в солодовни различных конструкций (ящики или
барабанные установки). Солодоращение протекает при температуре от
150С до 190С и хорошей аэрации в течение 5-8 суток. Эндосперм зерна
к концу соложения размягчается и легко растирается. За счет гидролиза крахмала амилазами, а гемицеллюлоз – цитазой в зерне накапливаются растворимые сахара – мальтоза, гексозы и пентозы, придающие
солоду сладковатый вкус. В результате активизации протеиназ, пептидаз и амидаз азотистые соединения гидролизуются с образованием
растворимых белков, пептонов, аминокислот, аммиака. Проращивание
зерна связано с процессами синтетического характера. Так, в соложеном ячмене накапливаются витамины группы В, токоферолы, аскорби-
133
новая кислота. Особенно возрастает содержание рибофлавина (до
210 мг на 100 г сухого вещества). В результате химического взаимодействия продуктов гидролиза в солоде синтезируются новые, свойственные проросшему зерну ароматические и вкусовые вещества. Из сырого (зеленого) солода нельзя получить пива. Для придания необходимых свойств и хорошей сохраняемости его сушат до остаточной влажности от 2% до 3,5%. Различные температурные режимы и продолжительность сушки позволяют получить солод с разными технологическими свойствами, что в свою очередь обуславливает возможность
приготовления пива широкого ассортимента. Для производства пива
отечественных сортов вырабатывают солод следующих видов.
Светлый солод получают высушиванием проросшего ячменя в
течении 16 ч при постепенном повышении температуры с 25-30 0С до
75-80 0С. В готовом виде он имеет светлую окраску, сладковатый вкус,
солодовый аромат, рыхлый мучнистый эндосперм и высокую осахаривающую способность. Используют его для большинства сортов пива.
Для получения темного солода проросшее зерно сушат 24-48 ч
при более высокой температуре, достигающей 105 0С в конце процесса.
Помимо коричнево-желтой окраски, темный солод отличается от светлого хрупкостью эндосперма и меньшей осахаривающей способностью. Используют его для темных сортов пива.
Диафарин – высокоферментативный солод – получают при наиболее мягком температурном режиме, постепенно возрастающем до
50-60 0С, и активной вентиляции. Это позволяет сохранить у солода
светлую окраску и максимальную ферментативную активность.
Карамельный солод по окраске делят на светлый, средний и темный. Для его приготовления сухой или зеленый солод с повышенным
содержанием сахаров обжаривают при температуре от 1200С до 1700С.
Жженый солод – наиболее интенсивно окрашенный продукт. Его
готовят из сухого белого солода путем обжаривания при температуре
от 210 0С до 260 0С после предварительного увлажнения.
Приготовление сусла. Дробленый солод и несоложеные материалы смешивают с горячей водой в соотношении 1:4. Полученную
смесь медленно перемешивают при подогревании до температуры от
500С -520С в течение от10 минут до 30 минут. При этом от 15% до 20%
растворимых веществ солода переходят в раствор без ферментативной
обработки и происходит ферментативное расщепление водонерастворимых азотистых веществ и фитина. Затем смесь переводят в заторные
чаны, где под действием ферментов солода происходит дальнейшее
превращение нерастворимых веществ сырья в растворимые, образую-
134
щие экстракт будущего сусла. Чтобы обеспечить максимальный переход веществ в раствор, затор медленно нагревают от 700С до 720С при
постоянном перемешивании (настойный метод). При втором (декокционном) способе 1/3 затора перекачивают в кипятильный котел, где кипят от 15 минут до 30 минут, после чего объединяют и перемешивают
с остальной частью затора. Повторяя эту операцию 2-3 раза, доводят
температуру всего затора до требуемого уровня. Весь процесс приготовления затора продолжается от 3 ч до 3,5 ч. Затирание солода необходимо для ферментативного гидролиза крахмала. Схема последовательных превращений при гидролизе крахмала под действием амилаз:
крахмал — амилодекстрины — эритродекстрины — ахродекстринымальтодекстрины - мальтоза. Еще до полного осахаривания крахмала в
заторе завершается протеолиз белка, продукты которого играют большую роль в формировании органолептических свойств и устойчивости
пива при хранении. Осахаренный затор направляют на фильтрование
для отделения сладкого сусла от твердой фазы затора. При этом
фильтрующий слой образует самую твердую фазу затора – пивную
дробину (выщелоченные зерноприпасы, мякинные оболочки, свернувшиеся белки), оседающая на стенках фильтрационных чанов, фильтрпроцессов или центрифуг, применяемых для фильтрования пивного
сусла. Отфильтрованное сусло и полученные после промывания дробины воды переводят в сусловарочный котел для кипячения с хмелем,
упаривания до нужной концентрации и стерилизации. Источником
своеобразной горечи, свойственной пиву, является в основном хмелевая кислота – гумулон, которая при кипячении переходит в изогумулон, хорошо растворимый в воде. Растворимость кислоты незначительна, а мягкая смола гидролизуется с образованием – смолы и отщеплением изобутилового альдегида и уксусной кислоты, участвующих в
формировании специфического аромата и вкуса сусла и пива.
Сбраживание сусла. Этот процесс происходит в открытых или
закрытых деревянных или металлических емкостях специальными расами дрожжей, преимущественно низового брожения, относящихся к
семейству Sacharomycetaceae, роду Sacharomyces, и виду Carlsbergensis.
Для специальных сортов белого и светлого пива, например белого
пшеничного, применяют дрожжи верхового брожения. Через 15-20 ч
после внесения дрожжей на поверхности сусла появляется полоса белой пены (стадия забела), а затем вся поверхность бродящего сусла покрывается мелкоячеистой пеной с постепенно увеличивающимися завитками. Достигнув максимума, завитки опадают, пена уплотняется и
становится коричневой. Из-за горького вкуса осевшую пенку (деку)
135
обязательно удаляют с поверхности сусла. Дрожжи оседают на дно.
Осветленная жидкость называется зеленым (молодым) пивом. В нем,
помимо этилового спирта и углекислого газа, в процессе брожения накапливается ряд побочных продуктов, участвующих в создании вкуса и
аромата пива. Процесс главного брожения завершается за 7-9 суток. К
этому времени в пиве остаются несброженными около 1,5 % сахаров.
Выдержка (дображивание) пива. Эта операция способствует
окончательному формированию потребительских свойств пива. Для
дображивания молодое пиво перекачивают в герметично закрывающиеся металлические танки, внутренняя поверхность которых покрыта
специальным лаком. Выдерживают пиво при температуре от 0 0С до
30С в течение 11-100 суток в зависимости от сорта. В результате дображивания остаточного экстракта несколько возрастает крепость пива,
происходит насыщение его углекислотой и осветление. Взаимодействие разнообразных первичных и вторичных продуктов главного и побочных процессов приводит к образованию новых веществ, обуславливающих вкус и аромат зрелого пива, а также его сортовые особенности.
Обработка и розлив пива. После лабораторного и органолептического анализов, подтверждающих готовность пива, его обрабатывают и разливают. Для придания прозрачности пиво фильтруют через
прессованные пластины из различных фильтрующих масс. Лучшими
являются диатомитовые фильтры. В процессе осветления пиво теряет
значительную часть СО2, поэтому допускается дополнительная его
карбонизация перед розливом с последующей выдержкой в течение 412 ч для ассимиляции углекислоты.
Технологическая схема ресторанного мини-пивзавода представлена на рисунке 34 .
6.7.3 Производство вина и спиртсодержащих продуктов
Биотехнология позволяет получать большое разнообразие алкогольсодержащих напитков. Из традиционных алкогольных напитков,
можно упомянуть русский хлебный квас, содержащий менее 0,5% этанола, популярный в Японии алкогольный продукт саке с содержанием
этанола от 12% до 24%, таэте - алкогольный напиток, приготовляемый из молока и с давних пор применяемый в Скандинавских странах содержит менее 2% этанола, а также большое разнообразие французских, испанских и других вин. Спиртовое брожение лежит в основе
виноделия.
136
Вино – исключительно сложный напиток. Вино не является простым спиртовым раствором. На сегодняшний день определены и измерены около шестисот его составляющих. Оно содержит большое количество летучих и нелетучих веществ, пропорции которых различны в
зависимости от разнообразия почв, сортов винограда, солнца. В винах,
кроме этанола, содержатся: белки, пигменты, неорганические соли, летучие и нелетучие органические кислоты, танин, в некоторых сортах углеводы, глицерин.
1-весы для солода; 2-солододробилка; 3-заторный/сусловарочный котел; 4-фильтрационный чан; 5-вирпул; 6-холодильник для сусла;
7-вентилятор для сусла; 8-бродильные и лагерные танки; 9-фильтр для
пива; 10-напорный танк; 11-стойка для продажи пива; 12-наполнение
сифонов; 13-розлив пива в бочки; 14-насос; 15-танк CIP; 21-выработка
пара; 22-компрессор сжатого воздуха; 23-холодильник для производства ледяной воды; 24-конденсатор испарений; 25-танк горячей воды; А-холодная вода; В-горячая вода; С-хмель; D-дробина; E-труб; Fдрожжи; G-кизельгур; H-сжатый воздух; I-ледяная вода.
Рисунок 34 - Схема технологического процесса ресторанного
мини-пивзавода
Употребление вина дает организму добавочное количество питательных и энергетических веществ. Сопутствующие алкоголю по-
137
лезные компоненты содержатся больше в красных винах, чем в белых.
Вино улучшает обмен липидов, способствует правильному балансу липопротеидов в крови, что является профилактикой атеросклероза,
улучшает пищеварение и обмен веществ. В основе виноделия лежит
спиртовое брожение. Вина обычно получают из сока спелого неиспорченного винограда, отделенного или неотделенного от мезги. Индукторами брожения являются различные расы Saccharomyces cerevisiae.
Вина классифицируют по-разному. Различают: сортовые - по
сорту винограда, купажные - из смеси сортов; сладкие и сухие - по
содержанию сахара; натуральные и крепленые, столовые и десертные - по содержанию спирта; игристые и неигристые - по содержанию - углекислоты; белые и красные - по цвету; ординарные и
марочные - по срокам выдержки. В сухом вине сахар фактически
полностью сброжен, а если он имеется, то в таком количестве, что не
ощущается на вкус. В сладких винах сахар ощущается на вкус. Натуральные вина содержат, как правило, от 9% до 11% этанола, реже—
13%. В крепленые сухие вина добавляют коньяк или винный спирт.
Столовые вина содержат менее 14% спирта, десертные - более 14% (в
среднем около 20%) и некоторое количество сахара. Игристые вина
содержат значительное количество диоксида углерода, образующегося
при дображивании вина в толстостенных сосудах или добавляемого к
натуральным винам; к игристым относят шампанское - продукт вторичного брожения вина, когда к недобродившему вину перед розливом
в герметизированные бутылки добавляют ликер до содержания сахара
2,2%. Вина, выпускаемые в продажу на первом году после изготовления, называют ординарными, а выдержанные не менее 1,5 лет и сохраняющие свои высокие качества - марочными. Известны так называемые плодовые вина (кроме виноградных), получаемых при спиртовом
брожении соков зрелых плодов: ягодное, яблочное и др.
Некоторые технологические аспекты виноделия.
Различают пять этапов изготовления вин: образование, формирование, созревание, старение, отмирание. Такое деление условно, поскольку четкое разграничение этапов при изготовлении вина
осуществить трудно. Спиртовое брожение длится 9–15 дней, иногда
до трех недель, при строго контролируемой температуре – не выше +30
0
С. Дорогое вино выдерживается в погребе в дубовых бочках, придающих ему дополнительные ароматы. Старение длится от 1 до 2х лет
и более. После выдержки вино осветляют при помощи «оклейки»: в
него вводят казеин и яичный белок, образующие нерастворимый оса-
138
док с нежелательными веществами. Затем вино пропускают через механический фильтр и разливают по бутылкам.
Белые вина получают как из белого, так и из красного винограда.
Основное отличие производства белых вин заключается в том, что раздавленные ягоды прессуют до брожения, и сусло бродит без кожицы.
Температура брожение от +130С до +200С.
Розовое вино изготавливается из красного винограда, при этом
сусло остается в контакте с кожицей несколько часов, затем ее отделяют. В вине непрерывно совершаются сложные физико-химические и
биохимические процессы.
Важное значение среди процессов формирования вина отводится
яблочно-молочнокислому брожению, в результате которого в винах,
богатых яблочной кислотой, исчезает резкая «зеленая» кислотность и
вкус их становится более мягким и гармоничным. При формировании
вина продолжаются автолитические процессы, следствием которых является обогащение молодого вина продуктами распада дрожжей–азотистыми веществами, полисахаридами, липидами, витаминами, ферментами (протеиназы, фруктофуранозидазы, эстеразы) и др. За период
созревания вина им потребляется кислорода от 20 мг/дм3 до 200
мг/дм3. В процессе созревания вина активность ферментов постепенно
снижается. Содержание витаминов и минеральных веществ в результате их частичного окисления уменьшается. В состав бродильных отделений винзаводов входят отстойники, бродильные аппараты, аппараты
для приготовления чистой культуры и разводки дрожжей, представляющие собой резервуары, оснащенные мешалками, теплообменными
элементами в виде рубашек, змеевиков и прочие реакторы, сульфитодозаторы, смесители и др. (рис.35).
На виноградных ягодах поселяются различные микроорганизмы
(дрожжи, нитчатые грибы, бактерии), которые необходимо подавить,
так как в противном случае будет трудно гарантировать получение вина высокого качества. Как ингибитор микробов - контаминантов давно
и эффективно используют сернистый газ или сульфит, например, в виде метабисульфита калия (примерно от 0,1% до 0,2% SO2), не подавляющих производственный штамм дрожжей в его активную фазу. Пастеризация здесь оказывается менее благоприятной. Концентрация сахара в винограде - важный фактор для ферментации (концентрация его
в сусле выше 28% будет тормозить брожение). Определенную роль играют исходное значение рН и температура.
139
1-кран; 2-обратный клапан; 3- насос; 4- бродильные резервуары;
5-рубашки; 6-поплавковое реле; 7- контактное реле; 8,14,18-газовые
трубы; 9-труба подъема сусла;10-переточный бак; 11-гидравлический
запор; 12-переливная труба; 13, 20-сливные трубы; 15-соленоидный
вентиль; 16-трубная крестовина; 17-сливной бак; 19-труба для отвода
виноматериала.
Рисунок 35 - Бродильная установка производства вина
Чтобы избежать повышенной кислотности готового вина, рН
сусла необходимо поддерживать не ниже 3,6; оптимальная температура для большинства рас дрожжей от 27 0С до 29 0С, но есть и психрофильные виды, сбраживающие виноградное сусло при 10 0С. При низкой температуре и медленном брожении формируется более яркий букет вина, чем при кратковременном брожении и повышенной температуре.
Аэрирование сусла возможно и целесообразно в самом начале
процесса, чтобы быстрее наросла биомасса клеток для ведения последующего анаэробного процесса. Количество привносимой в сусло суспензии дрожжей обычно составляет 1% по объему.
В случае применения биореакторов больших емкостей для производства столовых вин бродящий сок принудительно охлаждают, используя теплообменники, змеевики или другие устройства. Мезга (оболочки виноградных ягод, семена, частички стеблей и т. п.) привносит
140
определенные сложности в связи с теплообменом при брожении - образование "шапки".
Очистка вин, при естественном хранен и созревании, не всегда
завершается его полным осветлением. В этих случаях используется
очистка путем осветления, старения и созревания до розлива в бутылки. Дополнением к осветлению является фильтрация (в том числе - стерилизующая), пастеризация, охлаждение - для удаления винного камня
и коллоидов.
6.7.4 Биотехнология приготовления кисломолочных
продуктов и сметаны
Технология производства кисломолочных продуктов основана на
использовании различных видов брожения лактозы под действием
микроорганизмов - заквасок. Кисломолочные продукты получают путем сквашивания молочного сырья с заквасками молочнокислых бактерий. К кисломолочным напиткам относятся: простокваша, кефир, кумыс, ацидофильные напитки, кисломолочные напитки с солодовым
экстрактом.
Технологический процесс производства кисломолочных напитков
состоит из следующих технологических операций: подготовки сырья,
нормализации, пастеризации, гомогенизации, охлаждения, заквашивания, сквашивания в специальных емкостях, охлаждения сгустка, созревания сгустка (кефир, кумыс), фасовки.
При производстве всех кисломолочных напитков, кроме ряженки
и варенца, исходное сырье пастеризуется при температуре от 850С до
87оС с выдержкой 5 минут –10 минут или при температуре 900С – 92оС
с выдержкой 2–3 минуты; ряженки и варенца при температуре 950С –
98оС с выдержкой 2-3 ч. Тепловая обработка молока сочетается с гомогенизацией, в результате которой при температуре 550С - 600С и давлении 17,5 МПа улучшается консистенция кисломолочных продуктов
и предупреждается отделение сыворотки. После пастеризации и гомогенизации молоко охлаждается до температуры заквашивания. При
использовании закваски, приготовленной на термофильных бактериях,
молоко охлаждается до 500С -550С, на мезофильных – до 300С -350С и
на кефирной закваске– до 180С -250С . В охлажденное до температуры
заквашивания молоко должна быть немедленно внесена закваска, соответствующая виду продукта. В процессе сквашивания происходит размножение микрофлоры закваски, нарастает кислотность, коагулирует
казеин и образуется сгусток. По окончании сквашивания продукт не-
141
медленно охлаждается. Кисломолочные продукты, вырабатываемые
без созревания, немедленно направляются на охлаждение. Технологическая линия производства кисломолочных напитков резервуарным
способом представлена на рисунке 36 .
1-емкость для сырого молока; 2-насосы; 3-балансировочный бачок; 4-пластинчатая пастеризационно-охладительная установка;
5-пульт управления; 6-возвратный клапан; 7-сепараторнормализатор; 8-гомогенизатор; 9-емкость выдерживания молока; 10емкость кисломолочных напитков; 11-смеситель; 12-заквасочник.
Рисунок 36 - Технологическая линия производства
кисломолочных напитков
Сметану получают из нормализованных пастеризованных сливок
путем сквашивания их закваской, приготовленной на чистых культурах
молочнокислых бактерий, и созревания при низких температурах. Технологический процесс производства сметаны состоит из следующих
технологических операций: приемки и сепарирования молока, нормализации сливок, пастеризации, гомогенизации и охлаждения сливок,
заквашивания и сквашивания сливок, перемешивания сквашенных
сливок, фасовки, охлаждения и созревания сметаны. Сливки сквашиваются закваской в количестве от 1% до 5 %. Для сметаны 20%-ной и
30%-ной жирности используют закваску, приготовленную на чистых
культурах мезофильных молочнокислых стрептококков, для сметаны
диетической и 15%-ной жирности – на чистых культурах мезофильных
и термофильных молочнокислых стрептококков, а для ацидофильной –
на чистых культурах ацидофильной палочки и ароматобразующего
стрептококка. Для заквашивания сливок используют также бактери-
142
альный концентрат. Сквашивание сливок проводят до образования
сгустка и достижения определенной степени кислотности. Длительность процесса сквашивания составляет от 6ч до16ч. в зависимости от
вида сметаны. После сквашивания сливки перемешиваются в течение
3-15 мин и направляются на фасовку самотеком или насосами. Технологический процесс производства сметаны осуществляется на линии,
представленной на рисунке 37.
1-емкость для сливок; 2-насос; 3-уравнительный бак;
4-пластинчатая пастеризационно-охладительная установка;
5-гомогенизатор; 6-выдерживатель; 7-емкость для выработки кисломолочных продуктов; 8-автомат для фасовки.
Рисунок 37 - Технологическая линия производства сметаны
6.7.5 Биотехнологические процессы в сыроделии
Наиболее сложным из пищевых производств является сыроделие. Здесь тесно связаны и взаимосвязаны физические, химические и
биологические факторы. Сыры – это пищевые продукты, получаемые
путем концентрирования и биотрансформации основных компонентов
молока под воздействием энзимов, микроорганизмов и физических
факторов. Производство сыров включает коагуляцию молока, отделение сырной массы от сыворотки, формование прессованием под действием внешних нагрузок или собственного веса, посолку. Употребление в пищу производится сразу после выработки (в свежем виде) или
после созревания (выдержки) при определенной температуре и влажности в анаэробных или аэробных условиях. Работа по совершенствованию технологических процессов производства различных
видов сыра с целью создания высокоэффективных, малооперационных
143
и ресурсосберегающих технологий проводятся на всех этапах технологического процесса, направлены на решение частных задач с помощью
биотехнологических методов. Технологический поток состоит из нескольких технологических операций преобразования исходного сырья
и процессов транспортирования его промежуточных продуктов между
операциями (рис. 38 ).
1-насос самовсасывающий; 2-фильтр; 3-воздухоотделитель; 4-счетчик
молока; 5-весы; 6-резервуар молокогреющий; 7-электронасос;
8-резервуар хранения молока; 9-подогреватель; 10-сепаратормолокоочиститель; 11-охладитель; 12-сепаратор молокоотделитель-пастеризатор;13-установка пастеризационноотделительная; 14-заквасочник; 15-ванна сыродельная; 16-формовочный аппарат; 17-отделитель
сыворотки; 18-тележка с формами; 19-пресс; 20-контейнер для посолки; 21-бассейн посолки сыра; 22-контейнер для хранения и созревания
сыра; 23- мойка сыра; 24- сушка сыра; 25-парафинар.
Рисунок 38 - Технологическая линия производства сыра
6.7.6 Биотехнология приготовления маргарина
Маргарин представляет собой физико-химическую систему, в которой один из основных компонентов – вода (дисперсная фаза) распределен в другом – жире (дисперсионной среде) в виде мельчайших
капелек, образуя эмульсию типа «вода в жире». По физико-химическим показателям маргарин должен содержать не менее 82% жира. В
144
настоящее время выпускается маргарин с низким содержанием жира
(70%–80%), его можно использовать для диетического питания.
Основным сырьем служат высококачественные пищевые растительные масла–жидкие (подсолнечное, хлопковое, соевое) и твердые
(кокосовое, пальмовое), а также животные жиры (сливочное масло).
Молоко, добавляемое в маргарин, предварительно пастеризуют и сквашивают молочнокислыми бактериями, что сообщает продукту молочный вкус и аромат.
Закваски состоят из нескольких чистых культур молочнокислых бактерий (заквасочные наборы). В их состав входят мезофильные молочнокислые стрептококки: ароматобразующий
(Streptococcus diacetilactis), молочный (S. lactis) и сливочный (S.
cremoris), которые являются активными кислотообразователями. Молочный и сливочный стрептококки относятся к гомоферментативным
молочнокислым бактериям и в процессе брожения образуют только
молочную кислоту. Ароматобразующий стрептококк играет большую
роль в образовании вкуса и аромата при сквашивании молока. Он относится к гетероферментативным молочнокислым бактериям и образует
при брожении CO2 , летучие жирные кислоты. Технологический процесс производства маргарина включает: подготовку жирового сырья,
подготовку молока, сквашивание молока, приготовление эмульсии, получение маргарина и его пластическую обработку, фасование и упаковывание продукции (рис.39) .
1-весы для жира; 2-весы для вводно-молочной фазы; 3-смесители;
4-уравнительный бак; 5-насос высокого давления; 6 - переохладитель;
7-распределительное устройство; 8-фильтр; 9-кристаллизатор;
10-фасовочный автомат; 11-автомат для укладки пачек в короба;
12-автомат обандероливания коробок.
Рисунок 39 - Производство маргарина методом
переохлаждения
145
6.8 Химическая промышленность и биотехнология
Предвосхищая грядущий расцвет биотехнологии еще в 1929 г
Дж. Холдейн говорил: "Зачем брать на себя труд изготовления химических соединений, если микроб может сделать это за нас?" Не
случайно современные биотехнологи, употребляя микроорганизмы для
трансформации органических соединений, то есть, уподобляя их химическим реагентам, называют иммобилизованные биообъекты "закованными в цепи рабами".
Многие органические растворители, широко применяемые в химической промышленности, получают путем брожения - биохимического процесса протекающего в анаэробных условиях. Химизм основных видов брожений был представлен выше. В каждом случае процессы инициируются специфичной микробной культурой и проводятся
при определенных условиях.
Химическая промышленность органических соединений базируется сегодня в значительной мере на нефти, а большинство производимых ею продуктов переработки нефти получают путем частичного окисления сырья. Достичь специфического контролируемого и
частичного окисления при помощи существующих катализаторов довольно сложно, а микроорганизмы осуществляют эти типы реакций мастерски, без труда. По этой причине особая роль в решении поставленных задач отводится биокатализу. За последние годы значительно
возросло производство ферментов.
Ферменты во многих отношениях превосходят искусственные
катализаторы, и в первую очередь - по силе действия. Тысячи химических реакций протекают в живых организмах при участии ферментов в
мягких условиях (температура и давление атмосферные). Скорость
этих реакций в миллиарды раз быстрее, чем в присутствии лучших химических катализаторов. От искусственных катализаторов они отличаются рациональностью своих действий, строго направленных и максимально эффективных.
До сих пор химикам не удалось создать катализаторы, превосходящие по своей эффективности и специфичности биологические катализаторы.
Несмотря на широкое использование биокатализаторов в промышленности, все же в целом рынок ферментов оставался сравнительно небольшим до появления иммобилизованных ферментов.
146
Основные причины такого относительно медленного развития нестабильность ферментов, сложность выделения продуктов переработки из гомогенных растворов, содержащих ферменты.
Получение иммобилизованных ферментов существенно расширило спектр их применения наряду с традиционными областями.
Как известно, иммобилизация ферментов обнаруживает ряд солидных преимуществ в сопоставлении с обычным ферментом. Она
позволяет остановить реакцию на любой стадии, повторно использовать катализатор, получать продукт незагрязненный ферментом, гетерогенный процесс можно вести непрерывно и регулировать скорость реакции. Существует множество способов иммобилизации ферментов, основные из которых были представлены выше.
Производство химических веществ на основе биокатализа
имеет следующие преимущества: специфичность, легкость контроля, работа при низких температурах, совместимость с окружающей средой и простота.
Существует три главных способа синтеза химических соединений на основе биокатализа:
- путем использования культур клеток растений или животных,
образующих дорогостоящие вещества;
- путем использования микроорганизмов, при необходимости измененных методами генетической инженерии, для биосинтеза или модификации химических веществ;
- путем использования измененных методами генетической
инженерии микроорганизмов в качестве "устройств" для экспрессии
генов растений и животных, что позволяет синтезировать в больших
количествах особые, присущие только высшим организмам химические соединения.
Многие материалы химической технологии, используемые для
строительства инженерных сооружений, аппаратов, трубопроводов
подвержены биоповреждениям.
Разработка новых стойких к биоповреждениям веществ - актуальная задача химической технологии, которая может быть решена методами биотехнологии. Новые материалы должны быть устойчивыми к
биоповреждениям, также как и к механическим, химическим и другим
воздействиям.
Биоповреждение - это любое нежелательное изменение
свойств какого-либо материала, вызванное жизнедеятельностью
различных микроорганизмов.
147
Биоповреждения - неизбежное следствие важнейшей роли микроорганизмов в круговороте элементов в биосфере. Проявления биоповреждений весьма разнообразны: от порчи пищевых продуктов до
загрязнения смазочных масел и топливных систем, разрушения бетона,
резины, пластмасс и эластомеров, развития процессов электрохимической коррозии.
Биоповреждение следует отличать от биодеградации. Биоповреждение - процесс нежелательный, а биодеградация или биоразложение
обычно рассматриваются как положительные процессы.
Биодеградация - это разрушение какого - либо продукта, попавшего в окружающую среду при участии биоассоциации.
Производство этилового спирта. Как известно, этанол широко
используется в химической промышленности. Из него получают
большое разнообразие органических растворителей - этилхлорид,
этиламин, бутадиен, этилен, ацетальдегид, ацетон и другие, которые, в свою очередь, являются сырьем для производства важнейших продуктов органического синтеза.
Этиловый спирт должен быть бесцветным, прозрачным, без посторонних частиц. Вкус и запах, характерные для каждого вида спирта,
выработанного из соответствующего сырья, без посторонних привкуса
и запаха. Чем выше сорт этилового спирта, тем меньше примесей он
содержит, тем выше его крепость. Питьевой этиловый спирт производят разбавлением спирта-ректификата высшей очистки умягченной
водой до крепости 95%. По расходу сырья производство этилового
спирта самое крупное биотехнологическое производство в мире. Однако по стоимости валового продукта этанол занимает третье место среди крупнотоннажной продукции. Биотехнологические бродильные
процессы изучены сравнительно давно. Возбудителями спиртового
брожения могут быть дрожжи - сахаромицеты, некоторые мицелиальные грибы (Aspergillus oryzae) и бактерии (Erwinia amylovora, Sarcinaventricula, Zymomonas mobilis, Z. Anacrobia). В качестве сырья
для производства этанола в различных странах используют национальные доступные растительные источники: зерновые, картофель и свекловичная масса - в России, Украине, Беларуси; сахарозу и тростниковую мелассу - в США; рис - в Японии и т.д. В обозримом будущем любой источник растительного сырья может использоваться для производства этанола; целлюлоза в древесине, соломе, торфе и т.д. Поэтому
сульфитные щёлока - отходы целлюлозно-бумажной промышленности
находят всё более широкое применение в биотехнологии этилового
148
спирта. Важным вопросом в крупнотоннажном производстве этанола,
является выбор сырья. Во внимание принимают главным образом экономические аспекты - доля затрат на сырье в общей себестоимости.
Существенное значение имеет количество этанола, которое получают
из растительного сырья, выращенного на 1 га. Из сахарного тростника
получается максимальное количество этанола - 4032 л/га, из мелассы 878 л/га, из картофеля -166 л/га. Из этанола получают этилен - традиционное сырье для органического синтеза. Из 3,8 кг сахара можно получить 1,7 кг этанола, из него - 1 кг этилена. Этанол как жидкое топливо пока не может конкурировать с бензином, поскольку, например в
США, полученный из зерна этанол в 2-3 раза дороже бензина. Существуют национальные программы замены части бензина (до 20%) этанолом как топлива для автомобильного транспорта, что позволит
уменьшить импорт нефти. Необходимо отметить, что производство
спирта - одна из самых старых отраслей биотехнологии и известно
много способов его получения.
Рассмотрим наиболее известные способы получения этанола.
Технология комплексной переработки мелассы
В настоящее время у нас на производство этанола расходуется более половины ресурсов растительной мелассы. Отечественными биотехнологами разработана технология комплексной переработки мелассы с получением из 1 т мелассы от 310 л до 320 л этанола, 100 кг прессованных хлебопекарных дрожжей, от 80 кг до 85 кг кормовых дрожжей (сухих), от 10 кг до 13 кг диоксида углерода. Кроме того, после
дрожжевую барду, содержащую 7 % сухих веществ, можно упаривать
до 60 % и использовать как кормовую добавку или как сырье для получения гранулированного органо-минерального удобрения. При дистилляции спирта получают еще и сивушные масла в количестве 1 л на
200 кг этанола. Сивушные масла содержат спирты изоамиловый (62%),
пропиловый (12%) и изобутиловый (15%). Перед перегонкой из бражки выделяют хлебопекарные дрожжи, а на барде выращивают кормовые дрожжи.
Замкнутая безотходная технология получения этанола (Метод Ямомото)
Ученый Ямомото (Япония) экспериментально доказал, что полученный из микромицетов рода Rhizopus комплексный ферментный
препарат, обладающий амилазной и пектиназной активностью, при добавлении к дрожжам хорошо конвертирует крахмал растертой массы
катофеля в этанол. Процесс реализуется при рН 4,2 и температуре
25 0С. В этой технологии не требуется разваривать картофель и от-
149
дельно осахаривать массу. После мойки картофель измельчают и проводят одностадийную ферментацию. Этанол дистиллируют, а барду
вместе с ботвой направляют на метановое брожение. Биогаз используют для дистилляции этанола, а ферментированную жидкую фракцию
после метанового брожения со всеми минеральными компонентами
урожая возвращают на поле в качестве удобрения. Согласно данной
технологии с 1 га поля можно получить 270 л этанола за один цикл. Из
ферментированного субстрата с содержанием этанола 6-10% об. последний выделяют в перегонных аппаратах, получая технический продукт (сырец) с содержанием этанола 85 % . После ректификации получают продукт, содержащий 96,5% этанола. В среднем для получения 1
л этанола тратится 4 кг пара.
Получение этанола из синтетического газа
В связи с ограничением ресурсов традиционного сырья для производства этанола сейчас разрабатываются процессы на основе новых
заменителей сахара. К ним можно отнести синтетический газ, получаемый из угля. Как известно, этот газ состоит из СО, Н2 и СО2. Выделены бактерии, способные конвертировать СО и Н2 до этанола согласно уравнениям :
6СО +ЗН2О=С2Н5ОН + 4СО2;
6Н2 + 2СО2 = С2Н5ОН + ЗН2О.
При получении этанола из синтетического газа большое значение
имеет оптимизация массообмена между газовой, жидкой и твердой фазами. В колонном аппарате можно получить концентрацию этанола от
2% до 3 %.
Биоконверсиия ксилозы в этанол
Во многих лабораториях у нас и за рубежом интенсивно изучается бактериальный синтез этанола с использованием целлюлозосодержащих видов сырья. Предполагается, что термофильная анаэробная
ферментация целлюлозосодержащих субстратов рентабельна при концентрации этанола выше 4,5 %. Однако в настоящее время испытывают методы интенсификации спиртового производства, основанные на
использовании различных штаммов дрожжей. 75 % мирового производства биоэтанола получают в периодическом процессе при средней
длительности цикла 36 ч и содержании этанола в среде 6% (47 г/л).
Можно отметить следующие методы интенсификации спиртового брожения:
1) непрерывная ферментация (вместо периодической), что позволяет увеличить продуктивность системы по этанолу до 5-6 г/л
150
2)
3)
4)
5)
6)
в час вместо 1,8-2,5 г/(л- ч). Длительная ферментация приводит к возникновению малопродуктивных, но быстрорастущих
мутантов, при этом скорость образования этанола лимитируется вследствие его ингибирующего действия;
непрерывная ферментация с применением флокулирующих
продуцентов, что позволяет повысить концентрацию биомассы
дрожжей до 40-80 г/л и увеличить продуктивность системы до
30-50 г/(л- ч);
непрерывная ферментация с рециркуляцией биомассы, что
обеспечивает продуктивность 30-40 г/(л- ч);
непрерывная ферментация с использованием иммобилизованных клеток, что обеспечивает продуктивность системы
2530 г/(л- ч);
вакуумная ферментация при разрежении 32-35 мм рт. ст. с целью удаления этанола и уменьшения его ингибирующего действия. Продуктивность системы достигает 80 г/(л- ч). Недостатком этого метода является накапливание в среде нелетучих
продуктов, что затрудняет газообмен и вызывает опасность
контаминации;
применение флеш-ферментации увеличивает продуктивность
до 80 г/(л-ч)
Производство метилового спирта
Метиловый спирт является продуктом распада пектина - метилового эфира полигалактуроновой кислоты, который содержится в растительных тканях. Производство метанола состоит из следующих стадий:
− подготовительного - очистка сырья от примесей, приготовление солода или культур плесневых грибов;
− основного этапа - разваривание крахмалистого сырья,
− осахаривание крахмала;
− сбраживание осахаренной массы;
− перегонка бражки и получение сырого спирта;
− завершающего этапа - ректификация.
6.9 Сельское хозяйство и биотехнология
Точки соприкосновения биотехнологии и сельского хозяйства
весьма многообразны. Большая часть продукции сельского хозяйства
служит сырьем для пищевой промышленности. В качестве сырья могут
использоваться и отходы сельского хозяйства: в частности, большое
151
внимание уделяется возможности получение топливного газа из навоза
с сохранением его ценности как удобрения.
В ветеринарии биотехнология используется для получения вакцин и сывороток. Для увеличения выхода мяса могут использоваться
гормоны роста. Современная биотехнология дает нам и корм для скота,
например БВК.
Биотехнология, используя методы генной и клеточной инженерии, поможет разработать новые улучшенные культуры, как по урожайности, так и по качеству. Наибольший вклад биотехнологии в сельское хозяйство следует ожидать за счет улучшения свойств растений,
путем использования методов рекомбинантных ДНК и протопластов
растений.
Перспективным видится решение задачи передачи способности к
фиксации азота непосредственно отдельным сельскохозяйственным
культурам путем введения в них гена нитрогеназы. Биологическая
фиксация азота позволит сэкономить энергию, затрачиваемую сегодня
при химическом синтезе аммиака, в производстве дорогостоящих химических удобрений.
6.10 Биогеотехнология
Биогеотехнология занимается вопросами добычи, обогащения
и переработки руд, отделения и концентрирования металлов из
сточных вод как вторичного сырья, экстракции остаточных порций нефти из иссякающих месторождений.
Большую роль в этих процессах играют микроорганизмы, способные жить в недрах Земли и осуществлять там химические превращения.
Биотехнология играет все возрастающую роль при добыче нефти из сложных в эксплуатации залежей с помощью микроорганизмов. Во-первых, в нефтяной промышленности используются поверхностно-активные вещества микробного происхождения. Бактерии - деэмульгаторы, например Nokardia sp, Rhodococeos rhodochrous, разделяют водную и нефтяную фазы, что может быть использовано как для
концентрирования нефти, так и для очистки сточных вод от нефтяных
примесей, создающих угрозу для окружающей среды. Во-вторых, некоторые образуемые микроорганизмами полимеры, особенно производные ксантана можно использовать в качестве компонентов закачиваемых в пласт растворов, обладающих нужными реологическими характеристиками, для добычи остаточной нефти. Ксантан, внеклеточ-
152
ный полисахарид бактерии Xanthomonas campestris. Остаточные порции нефти обычно адсорбируются на различных породах, содержащихся в нефтеносных пластах, и не вымываются из них водой. Раствор
ксантана в воде обладает высокой вязкостью и при закачке в пласты
под повышенным давлением высвобождает капли нефти из всех трещин нефтеносных пород.
Как микробиологи, так и геологи давно осознали тот факт, что
микроорганизмы играют важную роль в концентрировании и распределении химических элементов в литосфере. Это особенно справедливо для многих металлов, которые, являясь существенными компонентами сложных биологических реакций, необходимы для поддержания метаболизма у большинства микроорганизмов. Металлы непосредственно включаются во внутриклеточные биохимические реакции,
вследствие этого микроорганизмы могут их накапливать или выделять
в концентрированном виде.
Способностью переводить металлы в растворимые соединения
(выщелачивать металлы из руд) обладают различные бактерии. Например: Chromobakterium violaceum растворяет золото по схеме Au Au(CN)2;
Thiobacillus ferrooxydans выщелачивает железо, медь, цинк,
уран и другие металлы, окисляя их серной кислотой, которая образуется этой бактерией из сульфидов.
Технологии подобных процессов подкупают своей простотой:
для извлечения остатков меди, урана, никеля из "пустых" пород
горнорудного производства их обливают водой и собирают вытекающие продукты жизнедеятельности микроорганизмов - растворимые соединения (CuSO4, UO2 и т.д.).
Метод бактериального выщелачивания позволяет рассматривать
разработку бедных месторождений как экономически выгодное предприятие. В США бедные никелевые руды, содержащие всего около 1
кг никеля на 1 т породы, предполагают разрабатывать с применением
бактериального выщелачивания.
При извлечении металлов из сточных вод большое значение
придается таким микроорганизмам, как Citrobacter sp., Zoogloea
ramigera, клетки и внеклеточные полисахариды которой извлекают U,
Cu, Cd.
Высокая хелирующая способность грибной биомассы, учитывая
сравнительную дешевизну ее наработки в больших количествах, открывает перспективы не только для концентрирования металлов (Pb,
Hg, Zn, Cu, Ni, Co, Mn, Cr, Ag, Au, Pt, Pd) из растворов, где они присут-
153
ствуют в следовых количествах, но и для освобождения растворов от
радиоактивных примесей (дезактивации).
Способность микроорганизмов принимать участие в круговороте
металлов положена в основу нового направления биогеотехнологии
металлов.
Биогеотехнология металлов – это процессы извлечения металлов из руд, концентратов, горных пород, растворов под действием микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности при нормальном
давлении и физиологической температуре (от 50С до 900С).
Составными частями биогеотехнологии являются:
• биогидрометаллургия или бактериальное выщелачивание;
• биосорбция металлов из растворов;
• обогащение руд.
6.10.1Биогидрометаллургия
Еще древние римляне, финикийцы и люди иных ранних цивилизаций извлекали медь из рудничных вод. В средние века в Испании и
Англии применяли метод выщелачивания для получения меди из медьсодержащих минералов. Естественно, древние горняки не догадывались, что в процессе принимают участие микроорганизмы. В настоящее время метод бактериального выщелачивания руд хорошо изучен и
применяется достаточно широко. Главным производителем меди добытой таким способом является США. В 1947 г. в США Коллири и
Хинкли выделили из шахтных дренажных вод микроорганизмы,
окисляющие железо и восстанавливающие серу. Микроорганизмы
были идентифицированы как Thiobacillus ferroxidans. Было доказано, что эти железоокисляющие бактерии в процессе окисления переводят медь из рудных минералов в раствор. Затем были выделены и описаны многие другие микроорганизмы, участвующие в окислении сульфидных минералов. А спустя несколько лет, в 1958 г. В США зарегистрирован первый патент на получение металлов из концентратов с
помощью железобактерий.
Позже было доказано, что в сульфидных рудах распространены и
другие бактерии, окисляющие Fe2+, S0 и сульфидные минералы, Leptospirillum ferrooxidans, Thiobacillus organopatus, Thiobacillus thiooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans и др. Leptospirillum ferrooxidans окисляет Fe2+, а при совместном присутствии с Thiobacillus thiooxidans или Thiobacillus organoparus – сульфидные минералы при pH 1,54,5 и температуре около 28 0С. Sulfobacillus thermosulfidooxidans окис-
154
ляет Fe2+, S0 и сульфидные минералы при рН 1,9-3,5 и температуре
500С. Ряд других термофильных бактерий окисляет Fe2+, S0 и сульфидные минералы при рН 1,4-3,0 и температуре от 500С до 800С. Процессы окисления неорганических субстратов служат для этих бактерий
единственным источником энергии. Углерод для синтеза органического вещества клеток они получают из СО2, а другие элементы – из руд и
растворов.
При бактериальном выщелачивании руд цветных металлов
широко используются тионовые бактерии Thiobacillus oxidans, которые непосредственно окисляют сульфидные минералы, серу и железо и образуют химический окислитель Fe3+ и растворитель – серную
кислоту. Поэтому расход H2SO4 при бактериальном выщелачивании
снижается.
Скорость окисления сульфидных минералов в присутствии бактерий возрастает в сотни и тысячи раз по сравнению с химическим процессом. Селективность процесса бактериального выщелачивания цветных металлов определяется как кристаллохимическими особенностями, так и электрохимическим взаимодействием. Редкие элементы входят в кристаллические решетки сульфидных минералов или вмещающих пород и при их разрушении переходят в раствор и выщелачиваются. Следовательно, в выщелачивании редких элементов бактерии играют косвенную роль.
В процессе выщелачивания марганца из карбонатных руд участвуют нитрифицирующие бактерии из родов Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrobakteria, Nitrococcus.
Сульфатвосстанавливающие бактерии в анаэробных условиях
восстанавливают сульфаты, сульфиты, тиосульфаты, иногда серу.
В процессе разрушения горных пород участвуют также некоторые гетеротрофные микроорганизмы, использующие в качестве источника энергии органические вещества и выделяющие в качестве метаболитов органические кислоты. Так, силикатные породы разрушаются представителями рода Bacillus, Aspergillus, Penicillium и др.
Процесс выщелачивания осуществляется, как правило, с участием
бактериальной ассоциации микроорганизмов, выделенной из того же
месторождения, что и минералы, которые должны быть переработаны.
Часто употребляют термины “прямые” и “непрямые” методы бактериального окисления металлов. Эти понятия относятся к растворению сульфидных пород непосредственно бактериями и с помощью
железа Fe3+, образовавшегося при бактериальном окислении железа. В
ходе непрямого окисления образуется сера, которая вновь окисляется
155
бактериями до серной кислоты. Бактериальное окисление является
сложным процессом, включающим:
• адсорбцию микроорганизмов на поверхности минерала или горной породы;
• деструкцию кристаллической решетки;
• транспорт в клетку минеральных элементов;
• внутриклеточное окисление.
Процесс реализуется по законам электрохимической коррозии.
Бактериальное выщелачивание, называемое также биогидрометаллургией или биоэкстрактивной металлургией в промышленности.
Бактериаьное выщелачивание может быть осуществлено
следующими способами:
• извлечение металлов из бедных руд в кучах, отвалах;
• выщелачивание руды in situ (подземное выщелачивание);
• полное выщелачивание концентратов фильтрацией через неподвижный слой или в реакторе с перемешиванием;
• частичное выщелачивание концентратов для удаления или для
предварительной подготовки к переработке другими технологиями.
6.10.2 Выщелачивание куч и отвалов
Выщелачивание куч и отвалов в основном сводится к извлечению металлов из отходов горнорудной промышленности или побочных
медных руд, переработка которых обычными способами неэкономична. Сущность кучного выщелачивания заключается в просачивании
растворителя через рудный штабель (кучу) для перевода ценных компонентов в раствор. Полученные фильтраты направляются на извлечение металлов, а растворы повторно используются. На водонепроницаемое наклонное основание укладывают кучи из измельченной руды и насосами наверх кучи подают выщелачивающую жидкость
в виде кислого, содержащего бактерии раствора сульфата трехвалентного железа, которая просачивается сквозь нее. Обогащенные металлами растворы, стекающие из отвалов и куч, направляются в специальные пруды и водоемы для сбора и извлечения металлов.
Скорость извлечения металла при промышленном выщелачивании куч и отвалов зависит от многих факторов: активности культуры
микроорганизмов, качества руды и степени ее дисперсности, скорости
фильтрации выщелачивающего раствора, аэрации (рис. 40).
156
157
Рисунок 40 - Технологическая схема опытно-промышленной установки по бактериальному
выщелачиванию меди
1-регенератор растворов; 2-насосная оборотных растворов; 3-трубопровод выщелачивающих растворов; 4-вентили;
5-подающие трубопроводы; 6-оросительные шланги; 7-скважины-оросители; 8-блок с замагазинированной рудой;
9-выработка для сбора продуктивных растворов; 10-насосная продуктивных растворов; 11-сгуститель; 12-цементационные
желоба; 13-сушка цементной меди; 14-транспортные пути; 15-компрессорная станция; 16-железный скрап.
6.10.3 Бактериальное выщелачивание in situ
Выщелачивание in situ (подземное выщелачивание) используется в тех случаях, когда минералы могут подвергаться выщелачиванию без извлечения их из земли с помощью шахт. Такой метод находит применение в старых подземных разработках и бедных месторождениях, где извлечение руды невыгодно. В Канаде этот метод применяют для извлечения урана на выработанных площадках. Для экстракции урана бактерии применяются реже. Для того чтобы при выщелачивании урана можно было использовать микробиологическую технологию, руда и/или связанные с ней породы должны быть богаты сульфидными минералами и не слишком интенсивно поглощать кислоту.
Бактериальное выщелачивание применялось в Канаде и в качестве
первичного средства для получения урана. Рудное тело разрушали
взрывом и осуществляли выщелачивание in situ. Выщелачивание in situ
используют для извлечения урана из песчаниковых формаций с низким
содержанием рудного минерала. Выщелачивающие растворы вводят в
не разрушенное урансодержащее рудное тело через инъекционную
скважину. Эти растворы, содержащие химический окислитель (например, перекись водорода), взаимодействуют с минералом, окисляя уран
и переводя его в растворимую форму. Далее урансодержащие растворы
выкачивают из минерализованной зоны через выходные скважины. На
западе США и в южном Техасе, где широко практикуется выщелачивание in situ, применяют карбонатные растворы с нейтральным pH. По
всей видимости, бактерии в этом процессе экстракции не участвуют.
Подземное выщелачивание испытано на золотоносных песках. Установлено, что наиболее благоприятными объектами являются мерзлые
россыпи, так как есть возможность создать изолированные водонепроницаемые полигоны. Перспективными для такой технологии являются
россыпи погребенных речных долин, расположенных в каньонообразном русле, сложенном плотными, водонепроницаемыми породами.
6.10.4 Выщелачивание минеральных концентратов
в аппаратах
Бактериальное выщелачивание сульфидных концентратов имеет
несомненное преимущество, так как оно может быть организовано непосредственно в месте получения концентрата в районе разрабатываемых месторождений без больших транспортных расходов. Для интенсификации процесса выщелачивания предложены технологии обработ-
158
ки руд в проточном режиме в серии последовательно соединенных аппаратов большого объема с перемешиванием, аэрацией, контролем рН,
температуры и концентрации микроорганизмов в пульпе. Эта технология получила название чановое выщелачивание.
6.10.5 Микробиологический способ извлечения золота
Эта идея пришла к ученым Украины на основе открытия, сделанного ими еще в 80 -е годы прошлого века: золото можно извлекать
из руды с помощью микроорганизмов, содержащихся в руде. Однако
по сей день во всем мире золото добывается экологически опасным
цианидным способом. С помощью микробов можно обезвредить цианидсодержащие стоки действующих золотоизвлекающих предприятий.
Совместно сотрудники АН Украины и лаборатории “Кыргызгеологии” испытали данную технологию извлечения золота и убедились в ее эффективности. На комбинате “Макмалзолото” провели укрупненные опыты по биообезвреживанию воды хвостохранилища: в
течение пяти суток содержание цианидов в стоках снизилось с 15,6 до
0,02 миллиграмма в литре.
Суть цианидного способа извлечения золота в следующем: руду
измельчают до определенного размера частиц и подвергают гравитационному обогащению, полученный концентрат отправляют на
промывку. Так называемые хвосты после гравитационного обогащения
доизмельчают до 74 микронов частиц, потом подвергают цианированию, т.е. растворяют мелкие частицы золота в цианидном растворе, после чего оно улавливается различными сорбентами.
Этот метод отталкивается от того, что в составе золотой руды
есть живые клетки-бактерии, и некоторые из них обладают способностью активно функционировать в среде с высоким содержанием металлов. С помощью бактерий можно также разрушать кристаллы минералов, в которых, как в клетку, заключено золото.
Метод биогеотехнологического извлечения золота особенно перспективен в тех случаях, когда золото находится в ультрадисперсной
форме, то есть в кристаллических решетках, и не извлекается обычными способами. Внедрение этой технологии позволяет дополнительно получать от 10% до 12% мелкодисперсного золота, остающегося
сегодня в хвостах. И самое главное – микробиологический способ извлечения золота экологически безопасен.
Промышленное применение нашел биотехнологический метод
удаления серы из угля. Предварительная обработка угля бактериями T.
159
Ferrooxidans приводит к окислению значительной доли серы (в виде
пирита) до серной кислоты (60%-98%) за 7-10 суток. Обработку угля
проводят открытым способом, но ведется поиск методов введения микроорганизмов в пласты угля.
6.10.6 Биосорбция металлов из растворов
Биологические методы находят все более широкое применение
для извлечения металлов из природных, промышленных и бытовых
сточных вод. Эти методы в отличие от дорогостоящих физико-химических характеризуются достаточной простотой и эффективностью.
Обычно для этих целей загрязненные металлами воды собирают в отстойниках и прудах со слабым течением, в которых происходит развитие микроорганизмов и водорослей. Эти организмы накапливают растворенные металлы внутриклеточно или, выделяя специфические продукты обмена, переводят их в нерастворимую форму и вызывают осаждение. Многие микроорганизмы способны накапливать металлы в
больших количествах, особенно высокой концентрирующей способностью отличаются микроводоросли. Процесс извлечения металлов из
водных растворов микроводорослями осуществляется следующими
путями:
• адсорбцией металлов на поверхности клеток, сопровождаемой
пассивным, диффузно контролируемым переносом металлов в цитоплазму со скоростями, пропорциональными концентрации поверхностно связанного металла;
• связыванием поступающих из внешней среды металлов в комплексы с металлотионеином и другими веществами непосредственно
внутри клетки;
• связывание металлов метаболитами, экскретируемыми водорослями.
Основными процессами извлечения металлов из растворов с участием микроорганизмов являются: биосорбция, осаждение металлов в
виде сульфидов, восстановление шестивалентного хрома. Биосорбцией
можно из разбавленных растворов извлечь 100% свинца, ртути, меди,
никеля, хрома, урана и 90% - золота, серебра, платины, селена.
6.10.7 Обогащение руд
К перспективным направлениям биогеотехнологии металлов относится направление, ориентированное на обогащение руд и концен-
160
тратов. Весьма эффективным представляется применение для этих целей сульфатредуцирующих бактерий, на основе чего можно разработать принципиально новые процессы и существенно улучшить их.
При проведении процессов флотации окисленных минералов
свинца и сурьмы применение сульфатредуцирующих бактерий повышает на 6%-8% извлечение минералов в результате сульфидизации
окислов; в процессах флотации церуссита (PbCO3) извлечение свинца
возрастает на 20-25%. Применение сульфатредуцирующих бактерий
для десорбции ксантогената позволяет селективно разделить некоторые минералы (CuFeS2 и MoS2, PbS и ZnS).
Таким образом, биотехнологические методы активно дополняют, а в некоторых случаях являются единственными традиционными методами горнодобывающей промышленности. Методами
кучного и подземного выщелачивания сегодня добывают медь, уран,
кобальт, марганец. С помощью чанового выщелачивания добывают
драгметаллы – золото, серебро.
Применение биотехнологических методов позволяет увеличить
сырьевые ресурсы, обеспечить комплексность извлечения металлов,
при этом не требуется сложная горная техника, процессы поддаются
регулированию и автоматизации, позволяют решать многие природоохранные задачи. Важным направлением биотехнологических исследований является разработка новых технологий защиты окружающей
среды от загрязнения отходами различных промышленных производств и очистка уже загрязненных территорий.
6.10.8 Извлечение нефти
Биотехнологии, основанные на использовании различных групп
микроорганизмов, находят все большее применение при добыче нефти
и при очистке объектов окружающей среды от нефтяного загрязнения.
Острота проблемы разработки новых методов повышения нефтеотдачи
объясняется тем, что при современном уровне технологии нефтедобычи средняя величина нефтеотдачи составляет всего от 40% до 45% от
разведанных нефтяных запасов. А на месторождениях с карбонатными
коллекторами нефтеотдача составляет часто лишь от 8% до 10% от запасов нефти. Микробиологические методы повышения нефтеотдачи
основаны на способности микроорганизмов продуцировать такие нефтевытесняющие вещества как газы, растворители и т.д. Кроме того,
многие микроорганизмы окисляют нефтяные углеводороды с образованием углекислоты и низкомолекулярных органических кислот, кото-
161
рые растворяют карбонатные минералы нефтяного пласта коллектора,
увеличивая его пористость, что также благоприятно влияет на повышение нефтеотдачи. Закрепленные на поверхностях раздела (жидкость
– твердое тело и жидкость - жидкость) микроорганизмы применяют
для увеличения добычи нефти. Интенсификация добычи нефти осуществляется микроорганизмами и продуктами их жизнедеятельности. Для
этого используют стимуляцию деятельности природной микрофлоры
путем введения в скважины питательных растворов (мелассы, молочной сыворотки), микроорганизмов, продуцирующих нужные метаболиты, а также введением определенных биопродуктов, выработанных
вне месторождений. Ксантан, внеклеточный полисахарид бактерии
Xanthomonas campestris, может применяться для извлечения нефти из
иссякающих месторождений. Ксантан был первым микробным полисахаридом, который начали производить в промышленном масштабе
(1967 г.). Остаточные порции нефти обычно адсорбируются на различных породах, содержащихся в нефтеносных пластах, и не вымываются
из них водой. Раствор ксантана в воде обладает высокой вязкостью и
при закачке в пласты под повышенным давлением высвобождает капли
нефти из всех трещин и углублений нефтеносных пород.
Бактерии - деэмульгаторы, например Nocardia sp, разделяют водную и нефтяную фазы, что может быть использовано как для концентрирования нефти, так и для очистки сточных вод от нефтяных
примесей, создающих угрозу для окружающей среды.
6.11 Безопасность биотехнологических процессов
Биотехнология должна служить на благо человека и повышать
его уровень жизни. Всегда ли биообъекты, созданные по заранее заданным параметрам служат на благо? Современный потенциал биотехнологии - это обоюдоострый меч, который может принести не только
пользу, но и вред при бесконтрольном, неосторожном неумелом и тем
более злонамеренном применении.
Так в распространении методов генной инженерии видят угрозу
заражения людей болезнетворными "генетическими монстрами", создание разновидностей злостных сорняков и даже выведения "стандартных людей" по заранее заданным программам.
Потенциальную угрозу биотехнологии нельзя ни преувеличивать,
ни преуменьшать. Она в значительной степени определяется этическими и социально-политическими факторами.
162
ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ
Глава 1
1. Микробиология, объект изучения, этапы развития науки
2. Морфология и систематика микроорганизмов
3. Различие в строении эукариот и прокариот
4. Функции и строение цитоплазматической мембраны
5. Химический состав и функции цитоплазмы
6. Роль митохондрий, рибосом, лизосом, комплекса Гольджи в живой
клетке.
7. Ретикулум, его функции в живой клетке
8. Явление пино-и фагоцитоза
9. Строение и функции клеточной стенки
10. Ядро, его роль в живой клетки
11. Строение вирусов, вирусные заболевания
12. Морфология и классификация фагов
13. Титр фага, роль фагов.
14. Бактерии, их классификация
15. Кокковые формы бактерий
16. Палочковидные бактерии
17. Извитые бактерии
18. Нитчатые формы бактерий
19. Споры, их устойчивость к неблагоприятным факторам
20. Спорообразование у бактерий
21. Движение бактерий, классификация бактерий по расположению
жгутиков
22. Размножение бактерий
23. Классификация микроорганизмов по типу питания
24. Полиморфизм и мономорфизм
25. Морфология актиомицет
26. Грибы, морфология дрожжевых форм, их роль в природе и в производстве
27. Грибы, морфология плесневых форм. Их роль в природе и в производстве
28. Водоросли, их характерные светочувствительные пигменты, классификация
29. Зеленые водоросли их строение, роль в природе
30. Диатомовые водоросли, особенности строения, роль в природе
31. Простейшие, их классификация, способ размножения
163
32. Морфология амеб
33. Морфология эвглены, особенности поведения в различных условиях.
34. Инфузории их строение, и роль в природе
35. Морфология и роль коловраток
Главы 2, 3
1. Биотехнология, объекты биотехнологии
2. Что изучает биоинженерия
3. Пять периодов в истории развития биотехнологии
4. Перспективы развития биотехнологии
5. Преимущества биотехнологических процессов
6. Виды биохимической деятельности микрообъектов используемые в
биотехнологии.
7. Назвать основные стадии биотехнологических производств
8. Перечислить подготовительные стадии биотехнологических производств
Глава 4
1. Дать определение понятий биокатализ, биотрансформация
2. Дать определение понятий биодеградация, биоокисление, биосорбция
3. Дать определение понятий биокомпостирование, бактериальное
выщелачивание
4. Биокатализ, преимущества и недостатки биокатализа
5. Ферменты, их классификация
6. Механизм действия ферментов, модель Фишера, модель Кошленда
7. Иммобилизация ферментов, три характеристики иммобилизованного фермента
8. Способы иммобилизации ферментов
1.
2.
3.
4.
5.
Глава 5
Ферментация, классификация процессов ферментации
Понятие абсолютной и относительной скорости роста
Кривая роста, фазы периодической ферментации
Преимущества периодической ферментации
Недостатки периодической ферментации
164
Глава 6
1. Аэробные методы очистки воды, активный ил и биопленка в сооружениях аэробной очистки воды
2. Очистка воды в аэротенках
3. Очистка воды в биофильтрах
4. Процесс нитрификации
5. Процесс денитрификации
6. Аэробная стабилизация осадка
7. Биометаногенез, химизм процесса, микробная ассоциация
8. Аппаратура и технологические режимы метанового брожения
9. Сапробность водоемов по Никитиноскому
10. Описать полисапробную и мезасапрбную зоны водоема
11. Дать характеристику олигосапробной зоны, токсобность, зоны токсобности
12. Применение биотехнологии в медицине, основные продукты биотехнологии применяемые в диагностики и лечении заболеваний
13. Биотехнология и энергетика, альтернативные источники энергии
14. Основные продукты биотехнологии в пищевой промышленности
15. Основные виды брожений, химизм процессов
16. Биотехнология приготовления пива
17. Роль биотехнологических процессов в химической промышленности
18. Сельское хозяйство и биотехнология
19. Процессы биогеотехнологии
165
ГЛОССАРИЙ
Биотехнология - это организованная человеком деятельность микроорганизмов, направленная на получение определенного продукта.
Микробиология - это наука о микроорганизмах, относящихся к различным систематическим группам - вирусам, бактериям, водорослям, грибам, простейшим, имеющим бесконечно малый размер.
Эукариоты и прокариоты. Клетки эукариотов имеют обособленное ядро, отделенное от цитоплазмы мембраной. В клетках прокариотов истинное ядро
отсутствует, но есть ядроподобные образования – нуклеоиды.
Морфология – наука, изучающая внешний вид, структуру, форму и размеры организмов.
Протопласт - цитоплазма и ядро клетки в совокупности образуют протопласт, окруженный снаружи цитоплазматической мембраной,
Цитоплазматическая мембрана обладает избирательной проницаемостью - пропускает внутрь клетки и отводит из нее определенные вещества.
Благодаря такой способности мембрана играет роль органнеллы, концентрирующей питательные вещества внутри клетки и способствующей выведению
наружу продуктов жизнедеятельности.
Ретикулум (эндоплазматическая сеть) пронизывает всю цитоплазму клетки, образуя многочисленные каналы и полости. Ретикулум состоит из цитоплазматических мембран.
Рибосомы имеют вид мелких зернышек, локализованных во внутриклеточных мембранах, образующих эндоплазматическую сеть. Рибосомы богаты
рибонуклеиновой кислотой (РНК). В них осуществляется синтез белка.
В митохондриях протекают окислительные процессы, сопровождающиеся образованием энергии (дыхание).
Комплекс Гольджи представляет собой тельца серповидной или палочковидной формы. Важнейшей функцией комплекса Гольджи является накопление продуктов обмена перед выводом их из клетки. Одним из продуктов комплекса являются лизосомы – округлые включения диаметром около 1 мкм,
внутри которых сосредоточены ферменты, способные расщеплять питательные
вещества.
Лизосомы – клеточные структуры (маленькие мембранные пузырьки),
содержащие ферменты, способные расщеплять органические вещества. Они
способны переваривать не только пищу, попавшую в клетку, но и части самой
клетки, вышедшие из строя. При разрыве мембраны лизосом ферменты проникают в цитоплазму и вызывают растворение клетки.
Явления пиноцитоза и фагоцитоза. Сущность этих явлений состоит в
переносе небольших капелек жидкости (пиноцитоз) или твердых частиц (фаго-
166
цитоз) в клетку в результате втягивания участка цитоплазматической мембраны
внутрь, отрыва образовавшегося мешочка и превращения его в вакуоль, которая
сливается с лизосомой, при этом вещества, попавшие в клетку, подвергаются
гидролизу.
Вирусы (от лат. virus – яд) отличаются от других микроорганизмов отсутствием клеточной структуры. Они не имеют ни ядра, ни оболочки, ни цитоплазмы. Размеры структурных единиц вирусов (вирионов) колеблются от 10 до 300
нм.
Фаги, развивающиеся в клетках бактерий, называются бактериофагами,
актиномицет – актинофаги, грибов – микофаги, водорослей – альгофаги.
Бактерии. Размер клеток бактерий обычно изменяется от 0,4 до 10 мкм.
По форме клеток бактерии делятся на группы шаровидные, палочковидные и
извитые.
Классификация бактерий шаровидной формы (кокков). Если после деления клетки отходят друг от друга, то образуются одиночные клетки – микрококки. При делении, происходящем в одном направлении, кокки могут оставаться соединёнными попарно, образуя диплококки, объединяться по четыре –
тетракокки, по восемь и более клеток. Кокки, соединённые в цепочку, называются стрептококками. При делении клеток в трёх взаимно перпендикулярных
направлениях происходит образование групп клеток, отличающихся плотной
упаковкой – сарцин. Если же деление клеток идёт беспорядочно, то образуются
группы бактерий, напоминающих по внешнему виду виноградную гроздь –
стафилококки.
Палочковидные бактерии по наличию жгутиков классифицируются на
монотрихи - имеют один жгутик, лофотрихи - жгутики располагаются пучками
на одном или обоих концах клетки, амфитрихи - имеется по одному жгутику на
обоих концах клетки, перитрихи - жгутики покрывают всю поверхность клетки.
Клостридии (от англ. closter – веретено) - веретенообразные спороносные
палочковидные бактерии.
Бациллы - спороносные палочковидные бактерии.
Извитые формы отличаются количеством витков и классифицируются
на три группы. Бактерии, имеющие небольшой изгиб - до ¼ витка, называются
вибрионами; с одним или несколькими витками – спириллами; длинные, тонкие клетки с большим количеством витков – спирохетами.
Нитчатые бактерии размножаются при помощи гонидий и конидий –
особых спороподобных овальных телец, возникающих из концевых клеток нити. Гонидии – подвижные тельца, имеющие жгутики. Конидии – неподвижные
клетки.
Автотрофы (autos – сам; trophe – пища) – бактерии использующие углерод неорганических соединений. Они в свою очередь подраз-
167
деляются на: фотоавтортрофы – получают энергию при фотосинтезе;
хемоавтотрофы - энергию получают при хемосинтезе (окисление
NH4+; O2-; S; Fe2+)
Гетеротрофы (heteros – другой) – бактерии для синтеза своего
тела требуют готовые органические вещества;
Паратрофы (паразиты) – нуждаются в живом белке, т.е. питаются органическим веществом, входящим в состав живого организма.
Фотосинтезирующие пигменты водорослей: зеленый — хлорофилл,
синий - фикоциан, бурый - фукоксантин, красный - фикоэритрин, оранжевые
- каротин и ксантофилл.
Биотехнология - это интегрированное использование биохимии,
микробиологии и инженерных наук с целью технологического применения способностей микроорганизмов. Многоликость биотехнологии видна из того, что она охватывает многие науки, такие как: генетика, микробиология, технология пищевых продуктов, химическая технология, электроника.
Задачи Биоинженерии: создание аппаратуры биотехнологических процессов (биореакторов, специфичных систем аэрации, теплообмена, перемешивания, стерилизации питательных сред и воздуха),
разработка контрольной и измерительной техники, а также масштабирование и моделирование биотехнологических процессов.
Объектами биотехнологии являются отдельные части клеток
(митохондрии, рибосомы, хромосомы, мембраны и т.д.), сами клетки и
их коллективы - клеточные культуры, отдельные микроорганизмы
(грибы, водоросли, бактерии, простейшие, вирусы и т. д.), и их колонии, а также - самостоятельные многоклеточные растительные и животные микроорганизмы.
Периоды развития биотехнологии. На третьем съезде Европейской ассоциации биотехнологов (Мюнхен, 1984г) голландский ученый
Е. Хаувинк разделил историю развития биотехнологии на пять периодов, учитывая основные открытия, способствующие ее развитию:
допастеровская эра (до 1858г); послепастеровская эра (1858 г. – 1949
г.); эра антибиотиков (1941 г. – 1960 г.); эра управляемого биосинтеза
(1961 г.- 1975 г.); новая эра (после 1975 г.).
Биотрансформация — процесс изменения химической структуры
вещества под действием ферментативной активности клеток микроорганизмов или готовых ферментов.
Биотрансформация - процесс, в результате которого под воздействием биохимической деятельности микроорганизмов или ферментов происходит изменение химического состава исходного химического вещества.
168
Кроме того, в процессе биотрансформации используют обычно уже готовый биологический агент — клетки микроорганизмов или ферменты, в
ходе самого процесса биотрансформации они не образуются.
Ферментация – это процесс, в котором происходит преобразование исходного сырья в продукт с использованием биохимической деятельности микроорганизмов или изолированных клеток.
Биокатализ — химические превращения вещества, протекающие с
использованием биокатализаторов-ферментов.
Биоокисление — потребление загрязняющих веществ с помощью
микроорганизмов или ассоциации микроорганизмов в аэробных условиях.
Метановое брожение — переработка органических отходов с помощью ассоциации метаногенных микроорганизмов в анаэробных условиях.
Биокомпостирование — снижение содержания вредных органических веществ ассоциацией микроорганизмов в твердых отходах, которым придана специальная взрыхленная структура для обеспечения доступа воздуха и равномерного увлажнения.
Биосорбция — сорбция вредных примесей из газов или жидкостей
микроорганизмами, обычно закрепленными на специальных твердых
носителях.
Бактериальное выщелачивание — процесс перевода нерастворимых
в воде соединений металлов в растворенное состояние под действием
специальных микроорганизмов.
Биодеградация — деструкция вредных соединений под воздействием микроорганизмов – биодеструкторов.
Ферменты специфические катализаторы, имеющих белковую природу.
Ферменты также называют энзимами. Наука, изучающая ферменты и ферментативные реакции называется энзимологией.
Классификация ферментов. Все ферменты могут классифицироваться
в зависимости от реакций которые они ускоряют: оксиредуктазы - ускоряют
окислительно-восстановительные реакции; трансферазы - ускоряют перенос
атомной группы радикалов от одного соединения к другому; гидролазы - ускоряют процесс разложения, протекающие с участием воды; дегидрогеназыосуществляют перенос Н; изомеразы – способны ускорять процессы внутренней перегруппировки молекул; синтетазы – определяют возможность синтеза сложных соединений из простых.
Иммобилизация - это прикрепление фермента к некоторому нерастворимому носителю, причем таким образом, чтобы фермент мог обмениваться с раствором молекулами субстрата и продукта.
169
Методы иммобилизации ферментов: адсорбция на носителе, включение в гель,ковалентное связывание с носителем, поперечная «сшивка» молекул фермента при помощи бифункциональных реагентов, адсорбция на носителе с последующей поперечной «сшивкой», включение в полупроницаемые капсулы, сополимеризация фермента и полимера-носителя, физическое смешение.
Абсолютная скорость роста (валовая) характеризуется приростом
биомассы за единицу времени V = dm / dt.
Относительная скорость роста (удельная) – это абсолютная скорость роста культуры отнесенная к единицы исходной биомассы M = V / m.
Фазы периодической ферментации - лаг-фаза,фаза ускорения роста, фаза экспоненциального роста,фаза замедления роста, стационарная
фаза,фаза отмирания.
БПК - (биохимическая потребность в кислороде) - потребное
для полного окисления органических веществ количество кислорода,
БПК является мерой количества органического вещества, способного
окисляться бактериями в аэробных условиях.
Активный ил и биопленка представляют собой сообщество
микроорганизмов, основную часть которого составляют бактерии, в
незначительном количестве присутствуют различные виды простейших, коловратки, некоторые виды червей.
Активный ил – это свободно перемещающиеся в очищаемой воде микроорганизмы. Активный ил применяется в аэротенках.
Биопленка – сообщество прикрепленных (иммобилизованных)
на специальной загрузке микроорганизмов. Биопленка развивается в
биофильтрах.
Сапробность – это комплекс физиологических свойств данного
организма, обуславливающий его способность развиваться в воде с тем
или иным содержанием органического вещества, с той или иной степенью загрязнения».
Токсобность -это свойство гидробионтов выживать в водах с
различной степенью загрязнения токсичными веществами.
Медицинская микробиология изучает патогенные для человека
микроорганизмы (бактерии, вирусы, грибы, простейшие), вызываемые
ими заболевания, а также разрабатывает технологию получения из
микроорганизмов разнообразных продуктов – антибиотиков, вакцин,
ферментов, белков, витаминов.
Нитрификация - удаление из сточных вод аммонийного азота
осуществляется автотрофными бактериями, использующими для питания неорганический углерод (углекислоту, карбонаты, бикарбонаты).
170
Денитрификация - удаление из воды окисленных форм азота нитритов и нитратов, в анаэробных условиях. Процесс осуществляется
в присутствии органических веществ, необходимых для жизнедеятельности бактерий. Сущность процесса заключается в том, что гетеротрофные бактерии - денитрификаторы (Tluoresccus, Denitrificans,
Pyacvaneum) в процессе своей жизнедеятельности для окисления органического вещества используют связанный кислород нитратов и
нитритов, восстанавливая их до молекулярного азота. Биоэнергетика это область биотехнологии связанная с эффективным использованием
энергии, запасенной при фотосинтезе биомассой.
Биометаногенез - процесс анаэробного сбраживания жидких и
твердых отходов, в результате, которого образуется биогаз (смесь метана и углекислого газа). Для термофильных организмов процесс реализуется при температуре от 50 оС до 60оС, для мезофильных – при
температуре от 30 оС до 40оС и для психрофильных организмов – при
температуре около 20о С.
Биофотолиз - процесс образования водорода Н2 и кислорода О2 из
воды с помощью микроорганизмов.
Биоповреждение - это любое нежелательное изменение свойств какого-либо материала, вызванное жизнедеятельностью различных микроорганизмов.
Биодеградация - это разрушение какого - либо продукта, попавшего в
окружающую среду при участии биоассоциации.
Биогеотехнология занимается вопросами добычи, обогащения и переработки руд, отделения и концентрирования металлов из сточных вод как
вторичного сырья, экстракции остаточных порций нефти из иссякающих месторождений.
Биоиндикаторы водоемов - санитарно-показательные организмы, характерные для каждой зоны сапробности.
171
ЛИТЕРТУРА
1. Алиханян, С.И. Общая генетика. / С.И. Алиханян. – М.: Высшая школа, 1985.–97 с.
2. Бароян, О.В. Блики на портрете./О.В.Бароян – 2-е изд. – М.:
Мол. гвардия, 1982. – 160 с.: ил.
3. Биотехнология: учеб. пособие для вузов в 8 кн./под ред.
Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова – М.: Высш. шк., 1987. – кн.1: ил.
4. Биотехнология: принципы и применение./ Г. Бич [и др.]; пер. с
англ./ – М.: Мир,1988. – 480 с.: ил.
5. Большая медицинская энциклопедия./гл. ред. Б.В.Петровский. 3-е изд.: в 30-ти т. – М.: Сов. энцикл., 1975. -Т. 2.
6. Большая медицинская энциклопедия./гл. ред. Б.В.Петровский.3-е изд. : в 30-ти т. – М.: Сов. энцикл., 1976.-Т. 3.
7. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммуноология. / Л.Б. Борисов – М.: ООО «Медицинское информационное
агентство», 2002. – 736 с.: ил.
8. Бредихин, С.А. Технология и техника переработки молока./
С.А. Бредихин, Ю.В. Космодемьянский, В.Н. Юрин. – М.: Колосс,
2003. – 400 с.: ил.
9. Брюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии./
В.В. Брюков – М.: Колос, 2004.-296.: ил.
10. Гапонов, К.П. Процессы и аппараты. Микробиология производства/К.П.Гапонов. – М., 1981. – 256 с.
11. Горная энциклопедия: в 5 т. /гл. ред. Е.А.Козловский. – М.:
Современная энциклопедия, 1984 –Т.1.
12. Ельцев, В.Т. Микробиология./ В.Т. Ельцев , В.К. Шильникова
– М.: Агропромиздат, 1990. – 191 с.: ил.: – (Сер. Учебники и учеб. пособия для учащихся техникумов).
13. Зайчик, Ц.Р. Технологическое оборудование винодельческих
предприятий./ С.Р.Зайчик. – М.: ДеЛи принт, 2001. – 62 с.
14. Кунце, Вольфган. Технология солода и пива /Вольфган Кунце;
пер. с нем. яз. – СПб.: Профессия, 2001. – 912 с.: ил.
15. Литвиненко, С.Н. Защита нефтепродуктов от действия микроорганизмов./ С.Н. Литвиненко - М.: Химия, 1997. – 143 с.: ил.
16. Мармузова, Л.В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены производства хлебобулочных изделий./ Л.В. Мармузова – М.:
ПрофОбрИздат, - 1995. - 268 с.: ил.
17. Нейман, Б.Л. Индустрия микробов./ Б.Л.Нейман - М.: Знание,
- 1983. – 86 с.
172
18. Самин, Д.К. 100 великих ученых./ Д.К. Самин - М.: Вече,
2000. – 592 с.
19. Самин, Д.К. 100 великих научных открытий./Д.К. Самин - М.:
Вече, 2002. - 480 с.
20. Сартакова, О.Ю., Чистая вода: традиции и новации: учеб.
пос./ О.Ю. Сартакова, О.М. Горелова;- Алт. гос. техн. ун-т
им. И.И. Позунова – Барнаул: Изд-во АлтГТУ, 2002. – 178 с.
21. Саруханов, А.В. Оборудование микробиологического производства. Справочник/А.В.Саруханов, В.А. Быков - М., 1993. - 389 с.
22. Сассон, Альберт. Биотехнология: свершения и надежды
/Альберт Сассон ; пер. с англ.– М.: Мир, 1987. – 411 с.: ил.
23. Скулачев, В.П. Законы биоэнергетики// Соросовский образовательный журнал. - 1997. - № 1. - С. 9–14.
24. Степанова, Л.И. Справочник технолога молочного производства.: в 2 т./ Л.И.Степанова. - СПб: ГИОРД, 2000. – Т. 1.
25. Торчилин, В. П. Иммобилизованные ферменты в медицине. М., 1986. – 37 с.: ил.
26. Хомченко, Г.Л. Химия для поступающих в ВУЗы: учеб. пособие. - М.: Высшая школа, 1993. – 42 с.
27. Циганкова, Т.Б. Технология хлебопекарного производства. –
М.: ПрофОбрИздат, 2002. – 428 с., ил.
28. Чубинидзе, Б.Н. Оборудование предприятий масложировой
промышленности./Б.Н.Чубнидзе, В.Х. Паронян, А.В. Луговой – М.:
Агропромиздат; 1985. – 304 с.
29. Шлегель, Г.Г. История микробиологии / Г.Г. Шлегель; пер. с
нем. яз.– М.: Едиториал УРСС, 2002. – 302 с.: ил.
30. Щетинин, М.П. Технологическая линия производства сычужных сыров/Система машин и технологических комплексов/М.П. Щетинин ; Алт. гос. техн. ун-т им. И.И. Позунова– Барнаул: Изд-во АлтГТУ,
2000. – 126 с.: ил.
173
Подписано в печать 03.03.09. Формат 60×84 1/16.
Печать - цифровая. Усл.п.л. 10.
Тираж 100 экз. Заказ 2009 − 128
Отпечатано в типографии АлтГТУ,
656038, г. Барнаул, пр-т Ленина, 46
тел.: (8-3852) 36-84-61
Лицензия на полиграфическую деятельность
ПЛД №28-35 от 15.07.97 г.
174