ПИГМЕНТЫ

i В. Ф. Селеменев, О. Б. Рудаков,
Г. И. Славинская, Н. В. Дроздова
ПИГМЕНТЫ
ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ
В.Ф. Селеменев, О.Б. Рудаков,
Г.В. Славинская, Н.В. Дроздова
Пигменты пищевых
производств
(м е л а н о и д и н ы )
С.0£ЙС.ьМ6а№ЛТЬЖДАГЫFk„*>Ы
М
И
НАУЧНАЯЕИВЛИОТ.
Москва
ДеЛи принт
2008
УДК
ББК 35.745
С29
664.1.056 _
Рецензенты:
Зав. кафедрой органической химии Воронежской государственной
технологической академии, доктор технических наук,
профессор В. М. Болотов;
Зав. кафедрой химии Воронежского государственного аграрного
университета, доктор химических наук, профессор В.В. Котов
С29
Селеменев В.Ф., Рудаков О.Б., С лавинская Г.В., Дроздова Н.В.
Пигменты пищевых производств (меланоидины). - М.: ДеЛи
принт, 2008. - 246 с.
ISBN 978-5-94343-164-7
В монографии обобщены сведения об органических окрашенных
веществах пищевых производств - меланоидинах и близких к ним.по
строению веществ. Рассмотрены физико-химические свойства пигмен­
тов, образующихся в процессах производства сахара, аминокислот, ор­
ганических кислот, ферментов. Представлен генезис меланоидинов и
фульвокислот природных вод как единая цепь образования природных
пигментов при химической модификации растительного сырья. Показан
механизм изменения свойств пигментов при контакте с ионообменными
сорбентами. Приведено описание методов выделения, концентрирова­
ния, фракционирования и анализа пигментов (хроматографических, оп­
тических, электрохимических). Дана детальная трактовка полос погло­
щения в инфракрасных спектрах отдельных фракций меланоидинов.
Книга представляет интерес для научных работников, аспирантов и
студентов вузов пищевого профиля, а также для специалистов предпри­
ятий, производящих сахар и сахарные кондитерские изделия, аминокис­
лоты, а также экологов, работников испыт<
и тех­
нологов пищевых вртгсводсрв? С .Т о р а й г ы р о в
а т ы н д а г ы П М У -дщ
а к а д е м и к С .Б е й с е м б з'"
а т ы н д а г ы f ы лы м и
К 1ТА П Х А Н А Г и "
ISBN 978-5-94343-164-7
УДК 541.183; 664.1.056
Б Б К 35.745
О
Селеменев В.Ф., Рудаков О.Б.,
Славинская Г.В., Дроздова Н.В., 2008
© ООО «ДеЛи принт», 2008
Введение
Химическая модификация растительного сырья, сопровождающая
практически любую стадию его переработки, является одной из наибо­
лее важных проблем в пищевой промышленности. При этом проведение
технологических процессов зачастую связано с образованием различ­
ных групп красящих веществ из углеводов, белков, лигнина [1-99].
Синтез красящих веществ происходит под влиянием высокой темпера­
туры, кислорода воздуха, микроэлементов (выполняющих роль катали­
заторов в реакциях полимеризации и поликонденсации), ферментов и
других факторов. Основная масса красящих веществ образуется в ре­
зультате распада моносахаридов и полисахаридов, а также при взаимо­
действии последних и продуктов их разложения с аминами, аминокис­
лотами, орото-метоксифеноксильными радикалами лигнина.
Существует целый ряд классификаций красящих веществ. Одни из
них основаны на различиях физико-химических свойств [1, 79-84, 94];
другие - учитывают пути образования и модификации пигментов; тре­
тьи - область технологической переработки растительного сырья. По­
этому в литературе часто встречаются различные названия одних и тех
же групп пигментов [1, 21, 41, 75, 93]. Окрашенные комплексы полифенольных и хиноидных структур с железом (III) сахарного производства
имеют название «меланины». Слово «меланины» происходит от грече­
ского melas (род. падеж melanos - черный). Эти же комплексы, содер­
жащиеся в природных водах, входят в состав гуминовых веществ
[1, 93]. Хиноидные структуры и полифенолы также являются структур­
ными фрагментами лигнинов [91, 93]. Продукты щелочного распада
инвертного сахара именуют карамелями (безазотистые вещества, полу­
чающиеся при термическом воздействии на сахара) [1, 101]. Одним из
способов формирования гуминовых веществ, растворимых в воде
(фульвокислот), считают гипотезу меланоидинообразования, предпола­
гающую поликонденсацию моносахаридов и аминокислот [1-4, 94, 321].
Следует заметить, что красящие вещества пищевых производств, име­
нуемые в ряде случаев окрашенными веществами, пигментами расти­
тельного происхождения, гумусовыми соединениями, представляют
смесь трудноразделяемых окрашенных компонентов. Наибольшей
цветностью обладает группа природных высокомолекулярных азотсо­
держащих органических кислот, молекулы которых содержат аромати­
ческие группировки и способны существовать в виде биполярных ио­
нов. Эти вещества получили название «меланоидины» [1, 71, 83, 84] и
характеризуются полидисперсностью, неоднородностью состава и поликомпонентностью. Многообразие меланоидинов обусловлено нали­
чием сложного последовательно-параллельного механизма биохимиче­
4
ских реакций в естественных условиях в растительных клетках и хими­
ческих реакций в растительных остатках, различиями в природе источ­
ников их образования и условиях химической трансформации, харак­
терных для конкретных пищевых производств.
Получение аминокислот ферментацией или из гидролизатов жи­
вотного и растительного происхождения; получение гидроксикислот
сбраживанием мелассы; получение сахара; выделение и иммобилизация
биологически активных препаратов из ферментационных сред; выделе­
ние сапонинов из промывных и сточных вод сахарного производства;
получение нуклеиновых кислот из промывных вод дрожжевых произ­
водств; подготовка воды для тепловых, атомных электростанций и
предприятий электронной промышленности - вот далеко не полный
перечень отраслей промышленности, где меланоидины отрицательно
влияют на технологические процессы. Эти окрашенные вещества за­
трудняют получение чистых целевых продуктов, ухудшая их качество, а
в отдельных случаях вообще приводят к невозможности выделения
продукта в чистом виде [1, 15, 24, 33-48, 64-76].
С другой стороны, нельзя отрицать те полезные факторы, которые
несет в себе процесс меланоидинообразования. Процессы выпечки хле­
бобулочных и кондитерских изделий, пастеризация молочных продук­
тов и соков, копчение рыбных и мясных продуктов сопровождаются
образованием меланоидинов. При этом уменьшается содержание саха­
ра, азотсодержащих веществ, снижается pH, появляется неповторимый
аромат [1,21, 49, 97, 99,100].
Кроме того, меланоидинсодержащие растворы (такие как меласса са­
харного производства, крахмало-паточные оттеки) являются «продуктами
незавершенного производства» и выступают как исходное сырье при по­
лучении пищевого спирта, в кондитерской, хлебопекарной промышленно­
сти, в качестве составной части ферментационных смесей при получении
гидрокси- и аминокислот [1, 5, 8-12,20, 74,98]. Поэтому важным является
установление физико-химических свойств меланоидинов, содержащихся в
различных средах, вопросы их генезиса и некоторых функций.
Наиболее полно процессы меланоидинообразования в сахарных рас­
творах рассмотрены в монографии А.Р. Сапронова и Р.А. Колчевой [1].
Основополагающие аспекты гумификации, отдельные стадии которой
составляют образование меланинов, лигнина, меланоидинов и других
красящих компонентов с меланоидиноподобными фрагментами, изло­
жены в монографиях Д.С. Орлова [83] и Г.А. Калабина, Л .В. Каницкой,
Д.Ф. Кушнарева [93]. Однако о пигментах аминокислотных, гидроксикислотных, ферментационных производств информация ограничена;
имеются данные, характеризующие только сумму красящих веществ.
Перспективным является изучение свойств и поведения индивидуаль­
ных компонентов, содержащихся в пищевых пигментах. Исследования,
Введение
5
проведенные на кафедре аналитической химии Воронежского госуниверситета, показали возможность предварительного разделения мела­
ноидинов на отдельные фракции и индивидуальные компоненты ком­
бинированием различных сорбционных методов (гель-фильтрация,
электрофорез на бумаге, ионообменная, тонкослойная, бумажная хрома­
тография), их препаративного накопления и последующего изучения с
помощью оптических и химических методов анализа [71-75, 77, 88, 89].
Другим важным прикладным аспектом, который требует иннова­
ций, является процесс удаления пищевых пигментов из рабочих раство­
ров перерабатывающего производства. В этом плане представляют ин­
терес обобщения результатов, полученных за последние тридцать лет
научной школой Заслуженного деятеля науки России, профессора
В.Ф. Селеменева, одного из авторов данной монографии.
Контроль над процессом рафинации, его усовершенствование не­
возможно без современных методов разделения и анализа. Наряду с
хроматографическими и электрофоретическими методами для описания
таких супрамолекулярных систем как пищевые пигменты необходимо
использовать недеструктивные методики контроля. Поэтому в моногра­
фии достаточно полно представлены возможности УФ- и ИК-спектроскопии, а также данные, полученные с применением этих методов. Это
в определенной мере помогло преодолеть трудности, вызванные как
переменным составом и строением меланоидинов, так и их способно­
стью образовывать ассоциаты и межмолекулярные комплексы, обуслов­
ленные гидрофобными взаимодействиями, водородными связями, стеккинг-эффектами.
Метод ИК-спектроскопии на современных приборах с фурье-преобразованием является наиболее перспективным для разработки мето­
дик контроля пищевых пигментов в многокомпонентных матрицах, по­
этому база данных и обобщения по ИК-спектральным свойствам рас­
сматриваемых пигментов стали одним из наиболее ценных результатов
исследований, опубликованных в этой монографии.
Авторы выражают искреннюю признательность к.х.н. В.А. Углянской, к.х.н. А.А. Загороднему, к.х.н. Г.Ю. Орос, д.х.н. Д.Л. Котовой,
к.х.н. В.Ю. Хохлову, к.х.н. С.И. Карпову, инж. Т.А. Завьяловой за вклад
в совместные исследования в области химии и анализа пигментов пи­
щевых производств.
Глава 1. Химизм процессов образования
красящих веществ в ходе
свеклосахарного производства
Пигменты, образующиеся в процессе производства сахара, не
только снижают качество товарного продукта, но и значительно услож­
няют производство. В технологическую схему приходится вводить до­
полнительные стадии очистки. Это приводит к потерям целевого про­
дукта и его удорожанию. Для того, чтобы оптимально и эффективно
организовать очистку, необходимо как минимум знать химическую при­
роду красящих веществ.
Красящим веществам свеклосахарного производства посвящено
очень много исследований. Но в большинстве из них изучается кинети­
ка образования красящих веществ по нарастанию оптической плотно­
сти, а разрабатывается технология обесцвечивания сахарных сиропов
без стремления понять природу удаляемых веществ.
Попыток установить химическое строение красящих веществ тоже
было достаточно, но результаты достигнуты незначительные. В некото­
рых случаях выделены и идентифицированы предшественники и сдела­
ны предположения об их дальнейших превращениях, но сами красящие
вещества в индивидуальном состоянии не выделены и не идентифици­
рованы. Это связано с несколькими причинами.
Во-первых, при нагревании моносахаридов, а тем более в щелоч­
ной среде, образуется несколько десятков реакционноспособных карбо­
нилсодержащих веществ, способных при взаимодействии друг с другом
дать огромное число разнообразных окрашенных веществ. Поскольку
концентрация каждого из них в свеклосахарном сиропе незначительна,
это чрезвычайно затрудняет выделение и идентификацию индивидуаль­
ных компонентов.
Во-вторых, в большинстве случаев красящие вещества гидрофиль­
ны и чрезвычайно реакционноспособны. Поэтому их нельзя осадить аг­
рессивными реагентами, такими как кислоты и щелочи, а из-за высокой
гидрофильности для выделения нельзя использовать экстракцию, так как
неполярные растворители их не растворяют, а полярные растворители,
способные растворить красители, смешиваются с водой. Поэтому самым
эффективным методом выделения является жидкостная хроматография.
Однако и здесь возникает много сложностей, так как обычно исполь­
зуемые адсорбенты (активный уголь, оксид алюминия и др.) необратимо
адсорбируют красящие вещества и десорбировать их не удается. Наилуч­
шие результаты получаются при использовании специальных ионообмен­
ных смол, однако при этом теряются высокомолекулярные фракции, не
вымывающиеся из сорбента. Выделение красящих веществ можно прово­
Химизм процессов образования красящих веществ
7
дить диализом, но в этом случае, в зависимости от размера пор мембраны
диализатора, может быть потеряно до 60% красящих веществ, в основном
низкомолекулярных. Именно этим объясняется сильное расхождение ли­
тературных данных о молекулярной массе пигментов (от 300 до 18000).
В-третьих, поликонденсация низкомолекулярных окрашенных ком­
понентов приводит к образованию значительных количеств высокомоле­
кулярных фракций. Они содержат не один, а множество мономерных
фрагментов, что делает практически невозможным установление их
строения. Поэтому ниже приведены формулы и реакции, которые явля­
ются только более или менее обоснованными предположительными мо­
делями, показывающими, каким образом могут протекать процессы, если
известны исходные соединения и условия, в которых они образуются.
Диффузионный сок, полученный из кондиционной (неповрежден­
ной, не подгнившей) свеклы, практически бесцветен, следовательно, все
окрашенные вещества образуются в процессе переработки свеклы. Су­
ществует несколько источников и путей их образования:
1. окислительные превращения веществ, изначально присутствую­
щих в свекольном соке, с образованием меланинов;
2. образование комплексов фенольных соединений с ионами металлов;
3. расщепление моносахаридов (присутствующих в свекле изначаль­
но и образующихся в диффузионном соке в процессе производст­
ва) в щелочной среде с образованием карбонильных соединений,
которые далее вступают в конденсации типа кротоновой с образо­
ванием полиненасыщенных окрашенных соединений;
4. конденсация моносахаридов и других карбонильных соединений с
аминами и аминокислотами и дальнейшие превращения продуктов
реакции с образованием меланоидинов;
5. карамелизация сахарозы.
Образование меланинов. Сок в вакуолях свеклы бесцветен, но
свекловичная кашка на воздухе быстро темнеет, последовательно изме­
няя цвет: бесцветный —> кремовый —> розовый -> красный —» фиолето­
вый —> синий —> черный. Если свекловичную кашку хранить без досту­
па воздуха, то окрашивания не происходит. Потемнение сока не проис­
ходит и при предварительном прогреве свеклы выше 80 °С, когда раз­
рушаются ферменты. Отсюда следует вывод, что такого рода окрашива­
ние происходит за счет ферментативного окисления веществ, присутст­
вующих в свекольном соке.
Считается, что источником образования окрашенных веществ дан­
ного типа являются фенольные соединения свеклы - тирозин и пирока­
техин, содержание которых в свекле соответственно составляет ~0,005%
и ~0,02%. При соприкосновении с воздухом эти соединения подвергают­
ся биохимическому окислению с участием ферментов - тирозиноксидазы и полифенолоксидазы с образованием хиноидных продуктов. В слу­
8
Глава 1
чае тирозина на первой стадии происходит его гидрокснлирование тирозиноксидазой с образованием 3,4-дигидроксифенил-Ь-аланина (ДОФА),
который полифенолоксидазой окисляется до соответствующего о-хинона, имеющего интенсивную окраску. Далее происходит внутримолеку­
лярная реакция присоединения аминогруппы по хиноидному кольцу,
хорошо известная в химии хинонов. Образующаяся 2,3-дигидро-5,6-дигидрокси-2-индолкарбоновая кислота легко окисляется в красный пиг­
мент хиноидного строения, который после декарбоксилирования претер­
певает окислительно-восстановительный процесс, превращаясь в 5,6-дигидроксииндол. Последний через 5,6-индолхинон превращается в смесь
высокомолекулярных продуктов конденсации - меланинов:
f Y Y ° ° H J % H° Y ^ y ^ cooH [0]>
н о * ^ ^
h ' n'h
h ' n' h
“ t y v ™»^
н ^ 'н
“v y v o
н
ООН
н
но,
-СО,
но
х х >нI * и: х » нI ■
меланины
Во многом сходные процессы могут протекать и с пирокатехином,
который чрезвычайно легко, особенно в щелочной среде, окисляется до
1,2-бензохинона:
он
[0]
Он окрашен в красно-оранжевый цвет, а в щелочной среде спосо­
бен превращаться в другие, более темно окрашенные соединения. На­
пример, с пирокатехином конденсация протекает следующим образом:
С аминосоединениями, в том числе с аминокислотами, 1,2-бензохинон образует аминохиноны, окрашенные в различные оттенки крас­
но-коричневого цвета:
0^ ^ * ^
Н0^
+ HjN— R
O''
-
^NH—R .Q.
■■
HO'
■
R
'
'
Химизм процессов образования красящих веществ
9
Получившиеся соединения способны вступать в дальнейшие реак­
ции конденсации с образованием меланинов.
Все эти реакции протекают на подготовительных стадиях сахарно­
го производства - резки свеклы и частично на стадии получения диффу­
зионного сока, пока не используется нагрев. Начиная с диффузионного,
все последующие процессы проводятся при температуре выше 70 °С.
При этой температуре ферменты разрушаются, и процесс образования
меланинов прекращается.
Меланины не создают существенных проблем для производства,
так как в значительной степени осаждаются на стадии дефекации.
В сироп, вероятно, попадает только незначительная часть меланинов.
Комплексы фенолов с ионами металлов. Практически значимыми
являются комплексы соединений фенольного типа с ионом трехвалентно­
го железа, имеющие окраску от зеленой и фиолетовой до черной.
В качестве фенольного компонента в образовании комплексов могут уча­
ствовать как упомянутые выше пирокатехин, тирозин, дигидроксифенилапанин, так и другие фенольные соединения, например, образующиеся
при гидролизе лигнина сахарной свеклы, типа кониферилового спирта.
Структура этих комплексов достаточно сложна. Предполагается, что
в них, кроме валентных связей Fe-O, образуются донорно-акцепторные
связи за счет л-электронных облаков ароматического ядра и вакантных
орбиталей иона железа. Именно эти связи поглощают в видимой области
спектра и обусловливают окраску внутрикомплексных соединений. На­
пример, комплекс железа с пирокатехином можно представить следую­
щим образом:
Интенсивность окраски комплексов фенольных соединений с же­
лезом сильно зависит от pH и имеет наибольшие значения в нейтраль­
ной или слабощелочной среде. Красящие вещества этой группы при
известковой очистке разрушаются значительно меньше, чем меланины,
и попадают в очищенный сок. Однако не они обусловливают основную
цветность сахарного сиропа.
Конденсация продуктов щелочного разлож ения моносахаридов.
Эти продукты начинают накапливаться со стадии дефекации при обра­
10
Глава 1
ботке диффузионного сока известью и интенсивно образуются вплоть
до II сатурации.
В диффузионном соке всегда имеются моносахариды, одна часть
которых попадает в него из сырья, а вторая образуется в процессе его
переработки за счет гидролиза сахарозы и полисахаридов. В щелочной
среде кетозы, образующиеся из альдоз за счет перегруппировки Лобри
де Брюина-Ван Экенштейна, претерпевают далее ретроальдольное рас­
щепление с образованием глицеринового альдегида и дигидроксиацетона, связанных между собой равновесием эпимеризации. Далее в щелоч­
ной среде они превращаются в метилглиоксапь, молочную и пировиноградную кислоты, гидроксиацетон, уксусный альдегид. Такой набор
высокореакционноспособных карбонильных соединений способен
только за счет реакций альдольной и кротоновой конденсации дать де­
сятки полиненасыщенных соединений, большинство из которых будет
поглощать в видимой области спектра и иметь окраску.
Рассмотрим некоторые из такого рода превращений на примере одно­
го, самого реакционноспособного из названных соединений —метилглиоксаля. Он образуется из глицеринового альдегида при отщеплении молекулы
воды за счет подвижного атома водорода в a -положении к карбонильной
группе и гидроксила в P-положении. При этом получается неустойчивый
енол, который изомеризуется в метилглиоксаль (2-оксопропаналь):
он
н о
I
I
СН, — с — с — н
'
I
он
о
II
II
-нон
СН, = с — с — н
■
I
он
-*• сн,—с —с —н
II
о
Имея карбонильные группы и подвижный водород метильной
группы, в щелочной среде при высокой температуре на стадии образо­
вания альдоля он претерпевает кротоновую конденсацию, продукт ко­
торой способен конденсироваться с новыми молекулами метилглиоксаля с образованием полиненасыщенных соединений с сопряженными
двойными связями.
В такого рода превращениях могут принимать участие все присут­
ствующие в диффузионном соке карбонильные соединения, образуя
большое число полиненасыщенных продуктов конденсации с различной
молекулярной массой вплоть до высокомолекулярных. Эти соединения
поглощают свет в видимой области спектра и поэтому окрашены.
11
Химизм процессов образования красящих веществ
Реакции конденсации метилглиоксаля:
о
о -4--------н
о
I
о
о о н н о о
II
II
0
0
сн,—с —с —н + СН,—с —с —н
о
II
II
II
-----►
II
I
..............
СН,—С—СН—сн—с —с —н -нон
„
сн.сосно
сн,—с —сн = с н —с —с —н
И
и
п
сн,сосн=о
II п II
----'-----------► и т.д.
— ► сн3—с —сн = с н —с —с н = с н —с —с —н
Конденсация может быть и внутримолекулярная. Например* про­
дукт конденсации двух молекул метилглиоксаля способен вступать во
внутримолекулярную кротоновую конденсацию с образованием и-бензохинона, окрашенного в желтый цвет и способного образовывать но­
вые, еще более интенсивно окрашенные соединения. Например, в ще­
лочной среде он может превратиться в 2-гидрокси-1,4-бензохинон, ко­
торый по аналогичной цепочке превращается в 2,5-дигидрокси-1,4-бензохинон. Эти соединения оранжевого цвета в щелочной среде имеют
красную окраску. л-Бензохинон способен по аналогичной реакции при­
соединять амины и аминокислоты, образуя 2-амино- и 2,5-диамино-1,4-бензохиноны темно-коричневого цвета:
01
о
о
II
II
сн = с н —с —с —н
он
¥ 1г *
-нон"
ч0U
о
н—R
Все рассмотренные соединения способны вступать в дальнейшие
реакции конденсации или циклизации с образованием более сложных
окрашенных структур.
В реакцию дегидратации аналогично глицериновому альдегиду мо­
гут вступать и другие моносахариды. Например, глюкоза может отще-
12
Глава 1
пить воду за сч ет п од ви ж н ого во д орода в a -п олож ен ии к ал ьд еги д н о й
ф у п п е и гидроксила в (3-положении. Э то т проц есс м о ж ет катал и зи р о ­
вать ион гидроксила:
Н
■г*(:ОН
Н
Н -ОН Н|
I
I
I
* -|
н — с — с — с — с- *- с—
I I I 7
он он он Н
I
ОН
Н
Н
Н
1 1 1
>>
- ► Н— с — с — с — с — с —
чн
-нон
|
i Т Т
ОН он он н ОН
I
П оскольку за с ч ет эф ф екта со п р яж ен и я стан ови тся под ви ж н ы м во ­
д о р о д у четвер то го ато м а углерода, м о ж ет о тщ еп и ться ещ е од н а м о л е­
кула воды .
Е нольн ая ф о р м а этого со еди нени я стаб и л и зи руется за сч ет взаи м о­
д ей стви я с С а(О Н )2.
^ О Н
Н Н Н
:
Н Н
I I
уО
|
|
J )
ы—с —с -^ с —с —с —с ;
■ » н —с —с —с - с —с —c z
| £-| I I I
-НОН
|
I I I
н о * о н о н н он
ОН
ОНН он
н
I
н
--------►
С
ОН
н
I
+Ca/OHV,
-нон
У3
С
С
I
он
он
чСа
, '
Н
I
О бразовавш ий ся ал ьдеги д за с ч ет ставш и х п од ви ж н ы м и атом ов
водорода у С 6 м ож ет вступить в кротоновую кон ден сац ию со сл ед у ю ­
щ ей м олекулой м оносахарида. П род укт р еакц и и ан ал оги ч н о вы ш еоп и ­
сан н ом у м о ж ет отщ еп и ть ещ е д ве м олекулы воды и кон ден си роваться
со следую щ ей м олекулой м оносахарида.
Д оп олни тельное уд ли н ен и е цепи со п р яж ен н ы х д во й н ы х связей
п риводит к см ещ ен ию м аксим ум а поглощ ен ия в д ли н н овол н овую об ­
л асть и уси л ен и ю интен си вности поглощ ен ия м олекулы . П оэтом у появ­
л ен и е каж дой новой дво й н о й связи п р и во ди т к у гл убл ен и ю окраски и
изм ен ен ию цвета о т ж елтого к красн ом у и коричневом у:
н н н онн
I I I I I
OHOHOHH ОН
н н н онн
I I I I I I I
OHOHOHH о н н OH
н
jo
Н
„к! н
о
I
ОН
+
онн
о
I I I
V . -2 Н0 Н
OHH OH H
ОН
Н
н
Ига i n
I
OH
но" t
н
Т
I
OH
Н
т
I
OH
н
г
I
OH
Н
М
l
OH
l
OH
О
“
н
Химизм процессов образования красящ их вещ еств
13
На стадии деф екации такого рода енольны е соединения сущ еству­
ют в виде кальциевы х солей. На стадии сатурации енольная ф орм а вы­
деляется в свободном состоянии и далее м ож ет изомеризоваться в Р-поликарбонильную форму. Н апример, для последнего соединения она
имеет следую щ ую структуру:
с -°
f YО YО YО YО YО "н
он
Пол икарбонильные соединения легко вступаю т в дальнейш ие межи внутримолекулярны е реакции конденсации. Н апример, один из вари­
антов внутрим олекулярной конденсации последнего соединения может
вклю чать стадии внутримолекулярной кротоновой конденсации и по­
следую щ ей изомеризации:
Подводя итог, необходимо отметить, что в этом разделе приведены
только некоторы е из возмож ны х направлений продуктов щ елочного
распада м оносахаридов. В реальном процессе м ож ет образоваться в де­
сятки раз больш е соединений. И менно поэтому возникаю т сложности с
установлением структуры реальны х красящ их веществ, так как каждое
вещ ество образуется в незначительны х количествах и его трудно выде­
лить в чистом виде.
О бразование м ела н о и д и но в (реакция М айяра) - один из возможных
путей образования красящих веществ в процессе свеклосахарного произ­
водства. Эту реакцию впервые исследовал М айяр (1912) и поэтому она
носит его имя. О бразование меланоидинов всегда происходит при нагре­
вании (обжарке) пищевых продуктов, содержащих в своем составе карбо­
нильные соединения (например, углеводы) и аминосоединения (например,
первичные амины и аминокислоты). Реакция сопровождается образовани­
ем высококонденсированных азотсодержащих красящих веществ и легко­
летучих соединений, часто обусловливающих аромат пищевых продуктов.
В модельных опытах при нагревании растворов глюкозы и амино­
кислот установлено, что реакция начинается с взаимодействия апьдоз с
аминокислотами. Это доказано тем, что образование красящих веществ
ингибируется веществами, реагирующ ими с карбонильными соедине­
ниями (цианиды, гидроксиламин, меркаптаны и др.). Например, несколь­
ко капель 2 -меркаптоэтанола, добавленные перед нагреванием, полно­
стью прекращаю т образование красящих веществ модельного раствора
Глава 1
14
глюкозы и аланина при 95 °С. Если же его добавить через некоторое вре­
мя после начала нагревания, то окраска раствора все равно появляется.
Это однозначно указывает на то, что окрашенные вещества образуются из
продукта взаимодействия углевода и аминокислоты, а не из них самих.
Установлено, что моносахариды при взаимодействии с аминами (в
том числе и с аминокислотами) отщепляют воду с образованием иминосоединения (основания Шиффа), которое способно мутаротировать и пре­
вращаться в гликозиламины. Они весьма реакционноспособны. Аналогич­
но эпимеризации моносахаридов гликозиламины через енольную форму
превращаются в I -амино-1-дезоксикетозы (перегруппировка Амадори).
Из свеклосахарной мелассы были выделены и идентифицированы
несколько аминодезоксифруктоз, образованных различными аминокис­
лотами. Считается, что именно они являются первичными бесцветными
продуктами меланоидинообразования, так как при нагревании их рас­
творов происходит постепенное нарастание цветности. Дальнейшие
превращения этих промежуточных продуктов могут происходить за
счет реакций дегидратации, циклизации, конденсации и приводить к
образованию окрашенных веществ, называемых меланоидинами. Нали­
чие в этих молекулах атома азота, легче отдающего неподеленную пару
электронов, чем кислород, способствует углублению окраски.
Типичная схема превращения мутаротирующих аминосахаров:
Н -С а О
с н ,о н
:н,о н
Н
•R
NH—R
Нl /^ h
|\ Н
Oh S L
ОН
— О, CH,NH—R
О)
m
- г1
н
Химизм процессов образования красящих веществ
15
В условиях свеклосахарного производства в аналогичные реакции
могут вступать и другие карбонильные соединения, образующиеся при
щелочном расщеплении моносахаридов. Первичными продуктами здесь
также являются основания Шиффа. Являясь алифатическими иминосоединениями, они легко вступают в реакции конденсации и полимериза­
ции с образованием высокомолекулярных окрашенных соединений.
Достоверных данных о структуре меланоидинов не имеется. Из­
вестно, что они содержат карбоксильные, спиртовые, фенольные и кар­
бонильные группы. Например, стандартный меланоидин Эндерса на
5 карбоксильных групп содержит 8 спиртовых и 2 фенольных гидро­
ксила и 2 карбонильные группы.
Образование меланоидинов начинается на стадии дефекации и
продолжается на всех последующих стадиях. Интенсивность их образо­
вания резко возрастает в условиях упаривания и уваривания, так как
увеличивается концентрация реагентов, температура и продолжитель­
ность нагревания.
Продукты карамелизации сахарозы. Карамелями называют ок­
рашенные продукты термического разложения сухой сахарозы. В усло­
виях свеклосахарного производства процесс карамелизации может про­
текать на поверхностях нагрева выпарных аппаратов и теплообменни­
ков на стадиях выпаривания и уваривания сахарного сиропа. Особенно
интенсивно этот процесс протекает при нарушениях режима нагрева,
когда температура превышает 140 °С.
При нагревании сухой сахарозы происходит прогрессирующее от­
щепление молекул воды, приводящее к образованию различных про­
дуктов в зависимости от степени дегидратации. При потере массы
10,5%, соответствующей отщеплению (в среднем) двух молекул воды от
одной молекулы сахарозы, образуется карамелан - вещество светло­
соломенного цвета, растворяющееся в холодной воде, этиловом и мети­
ловом спиртах, не растворяющееся в амиловом спирте, эфире и хлоро­
форме. При потере массы 14%, соответствующей отщеплению 2,7 моле­
кул воды на одну молекулу сахарозы, образуется карамелей, имеющий
ярко-коричневый цвет с рубиновым оттенком. Он растворяется в холод­
ной и кипящей воде, но не растворяется в этиловом и метиловом спир­
тах. При потере массы 18,4%, соответствующей отщеплению 3,5 моле­
кул воды на одну молекулу сахарозы, образуется темно-коричневое ве­
щество - карамелин, который растворяется только в горячей воде. При
дальнейшем длительном нагревании образуются гуминовые вещества,
растворимые только в щелочах.
Естественно, что все эти продукты не являются индивидуальными
веществами и представляют собой смесь самых разнообразных продук­
тов разложения сахарозы и последующих конденсаций. Например, в
карамелане только в среднем от сахарозы отщепилось две молекулы
16
Глава 1
воды, а в действительности - это неизбежная смесь сахарозы и продук­
тов дегидратации, потерявших одну, две и более молекул воды. Досто­
верные сведения об их структуре отсутствуют. Но, учитывая различную
подвижность атомов водорода в молекуле сахарозы, можно предполо­
жить, что начальные стадии этого процесса могут протекать следующим
образом (один из нескольких возможных вариантов):
н
он
он
и
н
он
н
Полученное производное у-пирона имеет активные метиленовые и
карбонильные группы и способно вступать в дальнейшие реакции кон­
денсации.
Глава 2. Методы выделения, концентрирования
и фракционирования пигментов
из природного сырья
2.1. Подготовка пигментов к анализу
Один из ответственных и труднейших этапов в изучении органиче­
ских пигментов, содержащихся в различных производственных раство­
рах и твердом сырье, - выделение их вначале в виде смеси (или индиви­
дуальных компонентов) без нарушения нативной, т. е. природной моле­
кулярной структуры. Подготовка окрашенных растворов для после­
дующего разделения, идентификации отдельных компонентов и уста­
новление их состава и свойств отличается рядом особенностей. Наряду
с пигментами в рабочих растворах содержатся низкомолекулярные ок­
рашенные и неокрашенные компоненты, а также коллоидные частицы,
оставшиеся после ферментации или образовавшиеся в результате ассо­
циации продуктов распада, конденсации или полимеризации. Поэтому
органические пигменты перед их хроматографическим фракционирова­
нием предварительно очищают. Для этого применяют экстракцию, оса­
ждение щелочами, кислотами с добавкой электролитов, солями пере­
ходных металлов, диализ [I, 21, 38,45, 49, 50, 55—61, 71-75, 88, 93].
Природа органических экстрагентов в значительной степени влияет
на полноту выделения пигментов [1, 71, 75, 88, 97]. Использование кон­
центрированных минеральных кислот (pH < 1,0) и оснований (pH > 12)
может привести к их химическому изменению, интенсивному появлению
новых окрашенных веществ, отличающихся от исходных меланоидинов
[1, 24, 54-65, 74, 89, 93]. Очистка пигментов диализом позволяет получить
их смесь, свободную от электролитов. Решающую роль при этом играют
размеры пор мембран диализатора, так как вместе с электролитами в диффузат могут попасть низкомолекулярные меланоидиноподобные вещества.
Наиболее эффективны мягкие способы концентрирования пигмен­
тов с помощью сорбентов. Однако такой метод приемлем тогда, когда
сохраняется обратимость сорбции - десорбции. Последнее условие со­
блюдается в случае низких энергий связи сорбента и сорбата, а также
отсутствия пространственных затруднений при десорбции пигментов
[98, 100, 102]. Высокой обратимостью сорбционного процесса и избира­
тельностью обладают макросетчатые сорбенты [106-108] и макропо­
ристые иониты [102, 103, 109, 112-114, 120-123].
Для выделения меланоидиновых пигментов из производственных
растворов наиболее перспективным является комплексное использова­
ние различных методов. Так, Т. Ямане и К. Сузуки для концентрирования меланоидинов из сахарк |>ix сиропов использовали анионит «Амберлит-401» в Cl-форме. В ка естве подвижной жидкой фазы (элюента)
М
/с * #
академик С.Бейсембсг
атындагы гылыми
К1ТАПХАНАГ>
18
Глава 2
авторы [57-59] применили 10%-ный раствор хлорида натрия. Соль вы­
кристаллизовывали при сгущении элюата и удаляли, а элюат пропуска­
ли через колонку с ионообменником «Ретардион 11А8». Пигменты из
ионита вымывали дистиллятом, диализовали в течение 24 ч через цел­
лофановую мембрану толщиной 0,03 мм, сгущали перегонкой под ва­
куумом и хранили в вакуум-эксикаторе.
В. Прей, Е. Хаммер, В. Браунштейнер [38, 55] использовали мето­
дику японских авторов [57-59] для извлечения пигментов из мелассы и
очищенного сока. Однако им пришлось преодолевать трудности при
отделении хлорида натрия от меланоидинов. Свободный от соли рас­
твор они получили путем дополнительного фракционирования на по­
ристом ионообменнике «Ретардион 11АБ», для синтеза которого ис­
пользован принцип «змеи в клетке». Смесь красящих веществ из мелас­
сы состояла из двух фракций - желтой и темно-коричневой. Аналогич­
ные пигменты выделены авторами [38] и из очищенного сока.
Методику, отличную от [38, 55, 57-59], для выделения пигментов
из свеклосахарных сиропов использовал X. Шивек [50]. Для элюирова­
ния адсорбированных на ионитах красящих веществ он использовал
смесь, состоящую из 0,2% гидроксида натрия и 7,5% хлорида натрия.
Хлорид натрия из элюата удаляли многократной кристаллизацией, а
концентрат пигментов порциями по 10 мл через коллодиевую мембрану
диализовали в течение 10 ч в батарее диализаторов при разности давле­
ния 0,067 МПа. Сухой остаток после выпаривания под вакуумом и озоления его (без серной кислоты как окислителя) составил 15,3%. Выде­
ленное окрашенное вещество после диализа являлось натриевой солью
красящей кислоты гомогенного состава [50].
И. Бугаенко с сотрудниками [68, 119] для выделения пигментов из
сахара-песка, полученного из тростникового сахара-сырца, использова­
ли гельпроникающую хроматографию. Были выделены две фракции,
отличающиеся интенсивностью окраски.
Исследования В. Прея [55, 61], Г. Чикина с сотрудниками [65],
И. Шамрицкой и К. Лепса [71-73] показали, что в ряде случаев наблю­
дается идентичность пигментов, выделенных из производственных рас­
творов пищевых производств и полученных в модельных системах. Это
дало основание изучать способы предподготовки для выделения пиг­
ментов, способы их разделения и идентификации в лабораторных усло­
виях на модельных системах.
Для получения меланоидиновых пигментов в модельных растворах
группа В.Ф. Селеменева с сотр. использовала следующую методику:
0,25 моль аминокислоты (глицина, лизина, глутаминовой кислоты) и
0,25 моль глюкозы растворяют в 625 мл дистиллята и кипятят в круго­
вой колбе с обратным холодильником на водяной бане 6- 8 ч до образо­
вания раствора темно-коричневого цвета. После доведения pH раствора
Методы выделения пигментов из природного сырья
19
до 6, его переносят в колбу с активным углем марки БАУ. Уголь пред­
варительно отмывают от мелких частиц дистиллированной водой. От­
мытый уголь кипятят в дистиллированной воде в течение часа для уда­
ления кислорода. После 48-часового контакта образовавшихся меланои­
динов с активным углем его промывают большим количеством дистил­
лированной воды (последние порции воды должны быть прозрачными).
Десорбцию меланоидинов из угля проводят 20-25% раствором свежеперегнанного пиридина, который отгоняют на водяной бане под вакуу­
мом. Полученные меланоидины измельчают в порошок и хранят в бюксе [65, 71]. Смесь окрашенных веществ из сахаро-рафинадных или свек­
лосахарных сиропов очищают по аналогии с выделением меланоидинов
из модельных растворов. Для этого производственный раствор, pH ко­
торого доводят до 6,0, приводят в контакт с активным углем БАУ, а за­
тем проводят вышеописанные операции по десорбции красящих ве­
ществ пиридином и получению их в виде порошка [112, 113].
Выделение пигментов из растворов производства лизина требует
предварительного отделения от коллоидов и биомассы. Для этого смеши­
вают культуральную жидкость с этиловым спиртом в соотношении 3 : 1 .
Выпавший осадок удаляют фильтрованием (фильтр «белая лента»);
обезвоживают окрашенные вещества под вакуумом и хранят в виде по­
рошка в плотно закрытых бюксах [74, 102, 103].
Пигменты из ферментационных растворов вымывают дистиллиро­
ванной водой, для чего ферментационную смесь (суспензию) помещают
в фильтр Шотта № 1 и промывают под вакуумом 5-кратным по объему
количеством воды.
Собранный фильтрат анализируют непосредственно на содержание
меланоидиновых пигментов хроматографическими методами [102, 114].
Предварительная очистка пигментов, содержащихся в маточных
растворах аминокислотных производств, заключается в пропускании их
через слой активного угля марки БАУ. Подобная очистка проводится по
аналогии с очисткой меланоидинов из модельных растворов сахарного
производства [65, 71]. Необходимо отметить, что представляется воз­
можным и непосредственное фракционирование хроматографическими
методами меланоидинов, содержащихся в маточных растворах. Однако,
в связи со значительными концентрациями пигментов и вязкостью ма­
точных растворов, их необходимо предварительно разбавлять дистил­
лированной водой. Степень разбавления в каждом конкретном случае
строго индивидуальна и определяется предварительным единичным
экспериментом по хроматографированию меланоидинов (электрофорез
на бумаге или распределительная хроматография) [71-74, 102, 103,111].
Выделение гумусовых кислот (содержащих меланоидиновые
фрагменты) из воды является более сложной задачей по сравнению со
20
Глава 2
способами, описанными выше. Это связано с невысоким содержанием
гумусовых примесей в природных водах (5—50 мг/л) [125, 126].
Оригинальные методы концентрирования гуминовых кислот и фуль­
вокислот из природных вод предложены Г.В. Славинской [75, 131-134].
В одном из методов используется концентрирование гумусовых веществ
соосаждением с минеральной, нерастворимой в воде солью. Для этого
растворяли 60 г карбоната натрия в одной порции речной воды объемом
10 л; в другой такого же объема - 100 г хлорида кальция. Приготовлен­
ные растворы реагентов соединяли. На свежеосажденном осадке карбона­
та кальция сорбируются гуминовые и фульвокислоты, содержащиеся в
природной воде. Значение pH общего раствора не должно превышать 7,0,
так как при более высоком значении pH гуминовые и фульвокислоты
осаждаются незначительно. После отстаивания воду декантировали, оса­
док собирали в отдельную емкость для последующей обработки. Осадок
растворяли небольшими порциями в соляной кислоте и доводили значе­
ние pH до = 1,0. Кислый раствор выдерживали в течение 10-12 сут. при
комнатной температуре, что приводило к коагуляции гумусовых кислот.
Их отделяли от раствора фульвокислот фильтрованием через бумажный
фильтр «синяя лента» в воронке Бюхнера. Для полноты отделения гуми­
новых кислот от фульвокислот осадок на фильтре промывали раствором
0,1 моль/л соляной кислоты.
В фильтрате, наряду с фульвокислотами, оставались хлориды натрия
и кальция и соляная кислота. Общее солесодержание очищаемого раство­
ра ФК составляло 30-32 г/л, в том числе свободной НС1 3,6-3,8 г/л.
Раствор фульвокислот деминерализовали в целлофановых мешочках
до отсутствия солей во внешнем растворе (контроль по удельному сопро­
тивлению воды). Для дальнейшей деминерализации этот раствор разбав­
ляли в 4 раза дистиллятом; затем через Н-катионитовую колонку пропус­
кали порцию жидкости до полного исчерпания емкости смолы. После ре­
генерации катионита эту процедуру повторяли многократно до постоянст­
ва содержания минеральных кислот в растворе на входе и выходе из слоя
ионита, что свидетельствовало об удалении всех катионов из раствора.
Н-катионированный фильтрат упаривали на водяной бане при темпе­
ратуре 30-35 °С. При этом соляная кислота вместе с водой испарялась. По­
лученный осадок растворяли в дистилляте и повторяли Н-катионирование
и упаривание до тех пор, пока фильтрат полностью не освобождался от
катионов щелочных и щелочноземельных металлов. Процесс деминера­
лизации завершался при отрицательном результате анализа раствора
фульвокислот на присутствие катионов металлов (фотометрия пламени
и атомно-абсорбционный анализ).
Другой метод [75] основан на выделении гумусовых веществ из
щелочных регенератов промышленных анионитовых фильтров устано­
Методы выделения пигментов из природного сырья
21
вок по глубокому обессоливанию воды. Десорбция окрашенных компо­
нентов гумусовой природы из анионита проводилась гидроксидом на­
трия (0,5 моль/л). Для удаления гумусовых кислот регенерат подкисляли
концентрированной соляной кислотой до pH «1,0; выдерживали
10-12 сут. и отделяли выпавшие в осадок кислоты фильтрованием.
В результате этой операции в подлежащем очистке растворе, наряду с
фульвокислотами, содержатся ионы натрия (0,5 моль/л), хлорид- и суль­
фат-ионы в виде натриевых солей (0,5 моль/л) и 0,1 моль/л соляной кисло­
ты. Поэтому для выделения фульвокислот из фильтратов требуется деми­
нерализация. Обычно эта операция связана с большими потерями целевого
продукта и считается, что получение препарата с зольностью 0,3% большая удача исследователей [115, 129]. Для этого Г. Варшал с сотруд­
никами использовала способ вымораживания с последующим фракциони­
рованием ФК на активном угле БАУ [80, 129]. Р. Обеноус [135] и
Н. Оберлендер [136] деминерализацию ФК осуществляли на Сефадексах,
промывая насыщенную ФК сорбционную колонку обессоленной водой.
Г.В. Славинская применила для деминерализации фульвокислот
сильносшитые ионообменники [75, 133], которые поглощают красящие
вещества в незначительной степени. Кроме того, ОН - анионит АВ-17-16
и Н-катионит КУ-2-16 предварительно насыщали фульвокислотами.
Вначале раствор пропускали через колонку с анионитом (защелачивание было до pH ~ 10-11), затем - через слой катионита (закисление
фильтрата). Деминерализация считалась достигнутой, когда pH фильт­
рата после контакта с ионообменниками не изменялся, что свидетельст­
вовало об отсутствии солей в растворе фульвокислот. Следует заметить,
что эти растворы при обессоливании необходимо пропускать через
анионит и катионит с максимально возможной скоростью (до 40 м/ч),
чтобы сократить время контакта ионитов и фульвокислот и предотвра­
тить адсорбцию препарата. Полноту деминерализации контролировали
измерением удельного электрического сопротивления в проточной
ячейке с платиновым электродом.
Полученные из речной воды р. Усманки и щелочных регенератов с
анионитовых фильтров промышленных ионообменных установок СанктПетербурга и Таллинна фульвокислоты в твердом виде оказались кри­
сталлами темно-фиолетового цвета со специфическим приятным запа­
хом. Полученные препараты можно хранить и в виде растворов. Раство­
ры фульвокислот упаривали под инфракрасной лампой при 30-35 °С или
под вакуумом во избежание деградации целевого вещества.
Меланины из сока свеклы экстрагировали смесью диоксан - вода в
соотношении (9 : 1). Пигменты обезвоживали под вакуумом и хранили в
виде порошка в плотно закрытых бюксах.
Глава 2
22
2.2. Хроматографические методы разделения
и анализа пигментов
Хроматографические методы, предложенные русским ботаником и
химиком М.С. Цветом [137], в настоящее время занимают доминирую­
щее положение при разделении, выделении, анализе веществ различных
классов. Более 80% всех выполняемых в мире и в России анализов свя­
зано с применением хроматографии. Хроматографические методы соче­
тают в себе два главных аспекта, необходимых в аналитической практи­
ке: способность к разделению и концентрированию целевых веществ
сочетается одновременно с возможностью анализа этих веществ с по­
мощью разнообразных универсальных или селективных детекторов.
Таким образом, хроматография выступает как метод установления каче­
ственного и количественного состава веществ.
Полученные в чистом виде или выделенные из производственных
растворов и природных сред пигменты представляют собой многокомпо­
нентную смесь, разделение которой невозможно с помощью экстракции
или соосаждения. Поэтому для идентификации отдельных компонентов в
пигментах используют жидкостную хроматографию на бумаге (БХ) и в
тонком слое (ТСХ); электрофорез на бумаге (ВЭФ); гель-фильтрацию и
гельпроникающую хроматографию (ГПХ); хроматографирование на макросетчатых сорбентах; ионообменную хроматографию (ИОХ).
2.2.1. Разделение методом распределительной
хроматографией
Распределительная хроматография - хроматография, в которой
неподвижной фазой служит, как правило, твердый адсорбент и разделе­
ние смеси веществ происходит в результате различия коэффициентов
распределения веществ (D) между подвижной и неподвижной фазами.
Методы разделения пигментов с помощью жидкостной распредели­
тельной хроматографии представлены в работах [73, 74, 75, 88, 89, 109,
138, 142, 143]. Одним из таких методов является бумажная хроматогра­
фия. Бумажная хроматография - планарная хроматография, в которой в
качестве сорбента используют специальную бумагу. Под планарной хро­
матографией понимают способ хроматографии, в котором процессы раз­
деления смеси веществ осуществляются в плоском слое сорбента.
Распределительная хроматография на бумаге используется как для
разделения, так и для определения некоторых физико-химических
свойств меланоидинов. БХ, открытая в 1944 г., до сих пор целесообраз­
на для применения в малобюджетных лабораториях на предприятиях
пищевой промышленности, поскольку является самым простым и деше­
вым хроматографическим методом. При стандартизованных условиях
(тип бумаги, природа растворителя, температура, время разгонки) при
Методы выделения пигментов из природного сырья
23
хроматографировании на бумаге характерной величиной для каждого
компонента пигментов является величина Rf [138]:
R{ = X/Y,
(2.1)
где X и Y - отрезки пути от начала движения до положения вещества и поло­
жения фронта растворителя (мм), соответственно.
Рис. 2.1. Определение R{ на тонкослойной хроматограмме:
1 —линия старта; 2 - пятно: 3 - фронт растворителя
Оборудование и реактивы.
Камеры. При хроматографировании используют герметически за­
крытые стеклянные камеры (кристаллизаторы) цилиндрической формы
высотой 60-75 см и диаметром 20 см, внутри которых создается атмо­
сфера, насыщенная парами растворителя.
Бумага. Хроматографическая бумага отличается от обычной фильтро­
ванной бумаги большей чистотой, более равномерной плотностью и тол­
щиной. При разделении пигментов сахарного производства нами использо­
вана бумага «Ленинградская средняя» и «Фильтрак № 1» (Германия).
Фракционирование пигментов производства лизина проводили на бумаге
«Ленинградская медленная», «Фильтрак № 5» (Германия) и «Ватман № 31»
(Англия). При работе с пигментами производства лимонной и глутамино­
вой кислоты использовали бумагу «Фильтрак № 11» (Германия). Иденти­
фикацию пигментов производства глюкоамилазы проводили на бумаге
24
Глава 2
«Фильтрак № 17» (Германия). Фракционирование фульвокислот, выделен­
ных из воды, осуществляли на бумаге «Ватман № 542» (Англия).
Р аст во р и т ели . С истемы растворителей подбирались таким обра­
зом, чтобы они удовлетворяли следую щ им требованиям:
1. Анализируемые вещества должны обладать значениями R( от 0,05 до
0,85. При разделении большого числа компонентов следует стремить­
ся, чтобы они распределялись по всей площади хроматограммы.
2. С истем а долж на обеспечивать различие R f двух (или более ве­
щ еств) близкого строения по крайней мере на 0,05.
3. С истем а не долж на вы зы вать химические изменения анализируе­
мых веществ.
4. Состав системы должен быть постоянным и легко воспроизводимым.
5. Растворитель долж ен бы ть чистым, бесцветным или мало окра­
шенным.
Для пигментов производств сахара, лимонной кислоты, глутамино­
вой кислоты, лизина и глюкоамилазы таким требованиям отвечает сис­
тема растворителей, состоящ ая из н-бутилового спирта, ледяной уксус­
ной кислоты и воды в соотнош ении 4 : 1 : 5 . После тщ ательного пере­
мешивания верхний слой (водный) отделяю т от нижнего и используют
для дальнейш их исследований. В качестве растворителя при разделении
фульвокислот применен 0,025% водный раствор аммиака.
П рояви т ели . В качестве проявителей меланоидиновых пигментов
использовали 0,5% раствор нингидрина в водно-спиртовой смеси (1 : 1).
Меланоидины даю т с этим реактивом продукты, имеющие окраску от
светло-соломенной до темно-фиолетовой. При выделении меланоиди­
нов вместе с ними могут находиться другие окрашенные вещества, от­
носящиеся к карамелям и продуктам щелочного распада инвертного
сахара. Поэтому в качестве проявителя карамелей использовали 10%
раствор мочевины в 1 М соляной кислоте (окрашивание в синий или
сине-зеленый цвет). Для проявления продуктов щелочного распада ин­
вертного сахара применяли 0,5% раствор нитропруссида натрия, под­
щелоченный едким калием (реактив Легаля) (желтая окраска в присут­
ствии альдегидных или кетонных групп). Кроме того, использовали ре­
акцию Селиванова (раствор резорцина в 12% соляной кислоте в присут­
ствии кетоз окрашивается в темно-красный цвет) [109, 143].
П роведение ф ракционирования. Хроматографическую бумагу го­
товят следующим образом. Листы бумаги форматом 58*18 см помеща­
ют на специальный хроматографический стол, снабженный освещени­
ем, вентилятором и подогревом. От нижнего края листа отмеряют 4 см и
отмечают простым карандашом линию старта. На стартовую линию
наносят шприцем или микропипеткой раствор пигментов, предвари­
тельно подготовленный по пункту 2.1. Количество нанесенного раство­
р а - 2 мл. Нанесение раствора осуществляют в 10 приемов. После каж-
Методы выделения пигментов из природного сырья
25
дого нанесения пробы по 0,2 мл бумагу подсушивают на хроматографи­
ческом столе или на воздухе, где есть освещение и вентиляция. От вы­
сушенного листа бумаги отрезают с правого и левого краев полоски
шириной 1,5-2,0 см, на которых в ходе подготовки пробы остаются от­
печатки пальцев оператора.
Бумагу прикрепляют в верхней части камеры, закрывают крышкой
и проводят хроматографирование в течение 15—20 часов. При погруже­
нии бумаги в растворитель стартовая линия должна находиться на 2 см
выше его поверхности. По истечении времени опыта бумагу вынимают
из камеры, кладут на стеклянную рамку и высушивают при слабом на­
гревании (не выше 40 °С) на хроматографическом столе или под тягой в
течение 15-20 минут. На первичных хроматограммах после высушивания
простым карандашом отмечают границы окрашенных (в видимой части
спектра) компонентов и границу растворителя. Хроматограммы помеща­
ют в УФ-камеру для обнаружения люминесцирующих веществ, зоны ко­
торых также отмечают. После этого на двух узких полосках (1,0-1,5 см),
вырезанных по длине хроматограммы, обрабатывают окрашенные ве­
щества растворами проявителей. Проявитель на полоски хроматограм­
мы наносится равномерно специальным пульверизатором. Места распо­
ложения окрашенных в видимой области зон, а также проявленных или
люминесцирующих в УФ-свете, отмечают на непроявленных частях
хроматограммы и используют их в дальнейшем для накопления пигмен­
тов и исследования последних химическими и оптическими методами.
Указанные зоны на непроявленных хроматограммах вырезают, измель­
чают и экстрагируют пигменты из них 5-10 мл дистиллированной воды
в бюксах, число которых равно количеству полученных зон после раз­
деления. Бумажную массу от элюата отделяют обычной фильтрацией.
В отдельных случаях используют в качестве подвижной жидкой фазы
растворы щелочей, аммиака, карбоната аммония, этиловый спирт, аце­
тон, уксусную кислоту [75, 138].
Недостаток данного метода разделения - длительность операций.
2 .2 .2 . Разделение методом тонкослойной
хроматографиии
Тонкослойная хроматография (ТСХ) - планарная жидкостная хро­
матография, в которой процессы разделения смеси веществ осуществ­
ляются в тонких слоях сорбента, нанесенного на инертную твердую
подложку, или в пленках пористого полимерного материала.
Разделение пигментов методом ТСХ описано в работах [88, 89, 139,
142-147, 149]. При выборе метода ТСХ исходят из доступности и нали­
чия оборудования, его стоимости и характера аналитической задачи. Пер­
спективно применение высокоэффективной тонкослойной хроматогра­
фии (ВЭТСХ). За счет создания принудительного движения подвижной
26
Глава 2
фазы с регулируемой скоростью, уменьшения размера частиц сорбента
(до 5-7 мкм) и насыщения пространства над пластинкой парами раство­
рителя удается существенно ускорить процесс и повысить четкость раз­
деления. Тонкослойная хроматография в настоящее время успешно кон­
курирует на рынке анализов с высокоэффективной жидкостной хромато­
графией (ВЭЖХ). В России большая часть рутинных жидкостно­
хроматографических анализов (до 80%) выполняется с помощью ТСХ.
Разделение и идентификацию меланоидиновых пигментов прово­
дили на пластинках «Силуфол» и «Сорбфил». В первом случае исполь­
зовали систему растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода в
соотношении 4 : 1 : 5; во втором - 4 : 2 : 1. Разделение проводили в од­
номерном варианте в насыщенных камерах. Детектирование осуществ­
ляли после обработки пятен нингидриновым реактивом. Количествен­
ное определение проводили спектрофотометрически по калибровочной
кривой после вымывания хроматографических зон с пластинки. Ошибка
определения составляла 6- 8%. Для сканирования хроматограмм был
также использован отечественный видеоденситометр «Сорбфил» (про­
изводство ЗАО «Сорбполимер»). Предназначенную для расчета хрома­
тограмму (на пластине ТСХ размером до 150x150 мм) помещают в ос­
ветительную камеру. Изображение хроматограммы, экспонируемое ви­
деокамерой, передается на компьютер, записывается и затем обрабаты­
вается по специальной программе. Результаты расчета, включая хрома­
тограмму, графики и т. д., сводятся в протокол, который хранится в па­
мяти компьютера, а также может быть распечатан на принтере или пе­
редан подобно любой другой информации [153].
В параллельных опытах после высушивания на воздухе детектирова­
ние (наряду с цветными реакциями) проводили с использованием УФ-камеры. Места расположения люминесцирующих и окрашивающихся (в пер­
вом опыте) компонентов отмечали простым карандашом, удаляли их со­
скабливанием с пластинки в отдельные бкжсы с элюентом. После накопле­
ния достаточного количества веществ каждой хроматографической зоны
отделяли их от носителя фильтрованием, а образцы полученных фракций
исследовали методами УФ-, ИК-спектроскопии и химическими методами.
2.2.3. Метод электрофоретического разделения
Электрофорез - метод разделения смеси диссоциирующих ве­
ществ, основанный на различии в электрофоретической подвижности их
ионов в растворе электролита, помещенного в электрическое поле.
Высоковольтный электрофорез (ВЭФ) позволяет определить заряд
компонентов, содержащихся в отдельных хроматографических зонах
пигментов, а также установить электрофоретическую скорость, электрокинетический потенциал и изоэлектрическую область существова­
ния различных форм пигментов [5, 31, 109]. Кроме того, методом элек­
Методы выделения пигментов из природного сырья
27
трофореза можно провести полную деминерализацию меланоидинов,
образующих отдельные хроматографические зоны [1,71, 102, 150].
Оборудование и реактивы. Для электрофоретического разделения
меланоидиновых пигментов применяли горизонтальный аппарат отече­
ственного (типа ЭФА-1) и венгерского производства (LFG).
В качестве носителя для разделения пигментов производств сахара,
лизина, лимонной, глутаминовой кислоты применяли хроматографиче­
скую бумагу «Ленинградская средняя» или «Фильтрак № 11» (Германия).
Электрофорез пигментов глюкоамилазного производства и фульвокислот
осуществляли на бумаге «Ленинградекая медленная» или «Фильтрак № 17»
(Германия). В качестве растворителя применяли смесь ледяной уксусной
кислоты и воды в соотношении 3 : 7 (pH = 1,8). Проявителями служили
растворы нингидрина, мочевины, растворы Легаля и Селиванова.
Проведение фракционирования. Пробу исследуемого раствора мик­
ропипеткой наносят на линию старта, находящуюся на середине листа (то
есть на отметке 22 см) хроматографической бумаги размером 44*24 см.
Линия старта отмечается простым карандашом. Нанесение раствора в
количестве 2 мл осуществляют в 10 приемов. Бумагу с пробой высуши­
вают на воздухе, после чего отрезают с правого и левого края листа по­
лоски шириной 2 см, на которых остаются отпечатки пальцев при нанесе­
нии пробы. Бумагу формата 40*24 см после высушивания пробы поме­
шают в электрофоретическую камеру так, чтобы концы находились в
специальных ваннах с буферным раствором, в которых находятся элек­
троды. С помощью маленького листа того же сорта бумаги увлажняют
весь лист бумаги буферным раствором, стараясь не размазать и даже не
касаться нанесенной пробы. Когда вся бумага пропитается буферным
раствором, плотно закрывают камеру крышкой и включают прибор.
Напряжение доводят до 600 В (в случае глюкоамилазных сред и
фульвокислот напряжение 1000 В). Время деления 4 ч, в течение кото­
рого напряжение не должно изменяться. По истечении времени прибор
отключают, бумагу осторожно вынимают с помощью двух стеклянных
палочек и кладут на стеклянную рамку. В вытяжном шкафу бумагу вы­
сушивают в течение 15-20 мин при слабом нагревании (не выше 45 °С).
Проявление с помощью проявителей и в УФ-свете проводят способом,
аналогичным используемому в бумажной хроматографии, см. п. 2.2.1.
2.2.4. Гельпроникающая хроматография
Гельпроникающая хроматография - частный случай эксклюзионной
хроматографии, в которой неподвижной фазой служит гель. Эксклюзионная (ситовая) хроматография - это жидкостная хроматография, в кото­
рой неподвижной фазой служит пористое тело или гель и разделение сме­
си веществ происходит в результате различия в размерах молекул ве­
ществ и (или) их форме и способности проникать в поры неподвижной
28
Глава 2
фазы. В названии метода отражен механизм процесса (от английского
термина «size exclusion», означающего исключение по размеру). В отли­
чие от остальных вариантов жидкостной хроматографии, где разделение
идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью
сорбента, роль твердого наполнителя в эксклюзионной хроматографии
заключается только в формировании пор определенного размера, а не­
подвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры.
Разделение пигментов методом гельпроникающей хроматографии и
гель-фильтрации проводят при пропускании освобожденных от биомассы
растворов [67,74,75,150,152]. В отдельных случаях (когда концентрация
пигментов высока) целесообразно проводить ГПХ фракций, выделенных
из отдельных хроматографических и электрофоретических зон.
Оборудование и реактивы. Колонки для гель-хроматографирования
представляют собой стеклянные трубки, оттянутые внизу (рис. 22).
В нижнюю узкую часть колонки помещают тампон из стекловаты, служа­
щий опорой для носителя. Вверху колонка имеет резервуар емкостью
30-40 мл. Длина колонки может быть различной, но эффективное разделе­
ние достигается с использованием колонок, соотношение длины и диаметра
которых лежит в пределах 10 :1-20 : 1. Объем фракций составляет 2-5% от
общего объема загруженного (подготовленного к работе) сорбента [98].
В качестве рабочих гель-носителей применимы различные марки
Сефадексов. Области их применения [162] определяются их пористо­
стью. Каждый тип Сефадекса в свою очередь подразделяется по порис­
тости и размерам частиц на несколько фракций.
Сверхтонкие фракции предназначены главным образом для тонкос­
лойной хроматографии, но их можно использовать и для колоночного
хроматографирования. Среднюю и тонкую фракции используют для пре­
паративного фракционирования на колонках. Сефадексы грубой фракции
предназначены для исследований с применением центрифугирования.
Сефадексы для набухания предварительно замачивают либо в воде, либо
в подходящем для дальнейшего фракционирования буферном растворе.
Время набухания для каждого типа Сефадекса различно (табл. 2.1).
Проведение фракционирования. Гельпроникающую хроматогра­
фию пигментов сахарного производства проводили на Сефадексах ма­
рок G-50; G-75; G-100. Пигменты производства лизина, глутаминовой и
лимонной кислот осуществляли на Сефадексах G-75, G-100 и G-200.
Пигменты глюкоамилазного производства делили на фракции с помо­
щью Сефадекса G-100; фульвокислоты - на Сефадексах G-50 и его ана­
логе Молселекте Г-50 (диаметр колонки 10 мм; высота слоя сорбента
300 мм; объем пробы 0,5 мл; скорость пропускания 0,2 мл/мин). Как
только 0,5 мл исследуемого раствора пройдет вниз по колонке, начина­
ют элюирование дистиллированной водой. Контролируют концентра­
цию раствора с помощью спектрофотометра, например, СФ-46. Макси­
Методы выделения пигментов из природного сырья
29
мум поглощения изучаемых растворов устанавливают предварительно.
Выпускается восемь типов Сефадексов, различающихся по степени на­
бухания (табл. 2.2).
2.1. Время набухания Сефадексов (в часах) при различной
температуре
Тип Сефадекса
G-10
G-15
G-25
G50
G-75
G-100
G150
G-200
25 °С
3
Время набухания, ч
100 °С (водяная баня)
1
24
72
3
5
2.2. Физико-химические свойства Сефадексов
Тип геля
Емкость
по воде,
мл/г
Полный М.м. пептидов, М.м. фрак­
объем ге­ разделяемых ции декстраля, мл/г
на сорбенте
на
1,0±0,1
1,5±0,1
2,5±0,2
2-3
2,3-3,5
4-6
О
«г»
J
О
G-10
G-15
G-25rp.
G-25cp.
G-25toh.
G-50rp.
G-50cp.
G-50toh.
G-75
G-100
G-150
G-200
Величина
частиц (в су­
хом состоя­
нии), мк
40-120
40-120
100-300
50-150
20-80
100-300
50-150
20-80
40-120
40-120
40-120
40-120
до 700
до 1500
до 70
до 1500
100-5-103
5,0±0,3
9-11
ю о -зю 3
500-1О4
7,5±0,5
10,0±1,0
15,0±1,5
20,0±2,0
12-15
15-20
20-30
30-40
3-105—7-104
4103-15104
5103-410*
510^-8-105
1 0 -3 1 04
Ю-’-Ю 5
10^-15-104
103—2-105
Гель-хроматографирование меланоидинов проводили также на сверхсшитом макросетчатом сорбенте «Стиросорб», синтезированном путем
структурирования полистирола монохлордиметиловым эфиром [13, 106—
108,121, 141]. Радиус микропор у этого сорбента составляет 25-30 А, а макропор 150-200 А, то есть он относится к бимодальным гелям. Для перевода
полимерной матрицы «Стиросорба» в гидратированное состояние требуется
предварительное набухание в ацетоне (8-12 ч) или этиловом спирте (4-6 ч).
Удельный объем сверхсшитого сорбента составляет 3,86 мл/г.
30
Глава 2
Рис. 2.2. Стеклянные хроматографические
колонки с резервуаром для подвижной фазы
Д иаметр хроматографической колонки (изготовленной из стекла)
был 10 мм; высота слоя набухшего сорбента 400 мм; объем пробы 5 мл;
скорость пропускания рабочего раствора 0,2 мл/мин. Как только 5 мл
исследуемого раствора пигментов пройдут вниз по колонке, проводят
элю ирование смеси дистиллированной водой. На «Стиросорбе» проис­
ходит фракционирование имеющихся в смеси аминокислот и разделе­
ние меланоидинов на отдельные хроматографические зоны. Фиксирова­
ние отдельны х компонентов проводят в УФ-свете, предварительно ус­
тановив максимумы поглощения пигментов. Кроме того, наличие мела­
ноидинов в аликвотах собираемых фракций фиксируется химическими
специфическими реакциями.
2 .3 . Определение физико-химических свойств
пигментов
2.3.1. Химический анализ
При установлении химического состава пигментов целесообразно
пользоваться качественными и количественными методами. При этом
необходимо помнить, что данные, полученные химическими методами,
не даю т исчерпывающего представления о свойствах и структуре пиг­
ментов. Эти данные полезны при сравнении с результатами оптических,
электрохимических, хроматографических методов.
Концевые аминогруппы -N H 2 в меланоидинах отдельных хроматогра­
фических зон определяют методами Сенгера и Эдмана [96, 138, 143, 163]
Методы выделения пигментов из природного сырья
31
с использованием фтординитробензола и фенилизоцианата. Концевые
карбоксигруппы -СООН в пигментах определяют восстановлением боргидрида натрия до а-аминоспирта [143, 163]. Бромное число характери­
зует наличие кратных связей в пигментах, а реакция с фторборатом 4-нитрофенилдиазония указывает на наличие оснований Шиффа в структуре
пигментов [143]. Гликозидные связи определяются окислением перйо­
датом натрия при 5 °С и pH = 3,5; лактонные циклы - действием нитропруссида натрия в присутствии гидроксида натрия [143] с последующим
фотометрированием при \ = 580 нм.
Меланоидины имеют в своем составе кислотные группы с различ­
ными степенями протолиза. Поэтому надежным способом установления
констант протолиза отдельных компонентов является потенциометриче­
ское титрование [75, 96, 102]. В связи с тем, что меланоидины являются
полиэлектролитами со слабо выраженными кислотными свойствами,
целесообразно использовать метод отдельных навесок [75, 102, 164, 166].
Согласно [165], минимальным содержанием компонента в пробе при
титровании может быть 10-5 моль в 10 см3 раствора (т. е. 0,005 моль/дм3
или 0,005 мг-экв/дм ). Это позволяет проводить определения констант
протолиза с использованием небольших количеств пигментов, накоп­
ленных при хроматографическом разделении и отборе фракций.
Следует отметить, что корректные результаты при потенциометри­
ческом титровании могут быть получены, если константа диссоциации
не ниже 10-6; а при титровании полипротолитов - если отношение кон­
стант протолиза Ki/Ki = 104 [164-166].
Для количественных расчетов при титровании используется урав­
нение Гендерсона-Гассельбаха [96]:
(2.2)
где знак « +» относится к кислотным, а «-» к основным группам. Параметр п
связан с электростатическим взаимодействием функциональных групп.
Из уравнения (2.2) следует, что, определив константу протолиза,
можно рассчитать степень протолиза функциональной группы меланоидина при любом значении pH.
Величина pH и рК; является линейной функцией lg
По отрезку, отсекаемому на оси pH прямой, находят кажущуюся кон­
станту протолиза, а по тангенсу угла наклона - величину п. При а = 0,5
(независимо от значения коэффициента п) рК = pH. Учитывая малую
скорость установления равновесия вблизи точки эквивалентности, мож­
но ограничиться фиксированием кривой титрования до а = 0,5.
32
Глава 2
Меланоидиновые пигменты (как отмечено выше) содержат карбок­
сильные группы, аминогруппы, фенольные радикалы. Поэтому для уста­
новления их рК перспективно титрование как в водных средах, так и в
неводных растворителях [96, 167, 168]. Измерение pH проводили с ис­
пользованием стеклянного электрода ЭСЛ-41Г-04 (электрод сравнения проточный хлорсеребряный). Раствор титрата (0,01М КОН) синтезиро­
вали из хлорида калия пропусканием раствора соли через высокооснов­
ный анионит АВ-17-8 в ОН-форме при 80 °С (чтобы не поглощалась уг­
лекислота воздуха) [75]. Обменная реакция:
R-OH + KCI — R-C1 + КОН
(2.3)
позволяла получить раствор гидроксида калия, не содержащий карбо­
нат-ионов.
Правильность настройки потенциостата и качества электродов про­
веряли пробным титрованием уксусной кислоты. В сухие колбы объе­
мом 50 см3 дозировали по 10 см растворов меланоидинов и вводили
0,01 моль/дм3 раствора гидроксида калия, увеличивая дозу на 0,1 см3 в
каждой последующей пробе. Колбы закрывали пробками с двумя отвода­
ми (для подачи и отвода аргона через раствор). После продувки краны на
отводах закрывали и изолированные от углекислого газа пробы выдержи­
вали в термостате при (20±1) °С 10 суток. После этого аликвоты растворов
переносили в ячейку для измерения pH, куда подавали ток аргона (изоля­
ция среды от СОг) и перемешивали с помощью магнитной мешалки.
Титрование в неводных средах проводили с использованием водноэтанольных, водно-ацетоновых смесей [75, 168] и в ДМСО (в последнем
случае начальная величина pH составляет 4,35, что исключает возмож­
ность определения рК ниже этой величины при титровании в ДМСО).
2.3.2. Параметры, определяемые для пигментов
методами планарной хроматографии
Рассмотрим информацию, которую можно получить о свойствах
пигментов с помощью методов планарной хроматографии - БХ и ТСХ
[145, 146, 149, 151]. Положение каждой хроматографической зоны ме­
ланоидинов в планарной хроматографии характеризуется величиной Rf
(rate fraction). Физический смысл Rf определяется отношением скорости
движения зоны пигмента и элюента.
На практике эти скорости трудно измерить, поэтому величину Rf
экспериментально определяют как отношение расстояния X, пройденно­
го веществом от линии старта до центра зоны, к расстоянию Y, прой­
денному элюентом от линии старта до линии фронта элюента за время
фракционирования, по формуле (2.1) (рис. 2.1).
Значение Rf является индивидуальной физико-химической характе­
ристикой соединения, хроматографируемого в данном растворителе, в
условиях опыта (изменяется от 0 до 1), но никакой информации о термо-
Методы выделения пигм ентов из природного сырья
33
динамике хроматографического процесса не дает. Поэтому вводят понятие
термодинамического значения подвижности R'f, которое учитывает про­
цесс распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами:
д 'г = -
: ‘п ф . . . = —
#ПФ "г ' #НФ
Ши* —
( 2 .4 )
.
т ПФ + т НФ
-----,
( / - R '( ) = — ^
п пф
(2.5)
+ ПНФ
где Ипф и пнф - число молей сорбата в подвижной и неподвижной фазе соот­
ветственно; Шпф и тнф - масса сорбата в подвижной и неподвижной фазах
соответственно.
С ледовательно, величина R \ определяет долю молекул м еланоиди­
нов в подвиж ной фазе.
У равнение (2.4) позволяет установить зависимость между коэффи­
циентом распределения D:
D = £ h*.
(2 .6 )
Г
*- п ф
и фазовым соотнош ением УНФ/УПФ (объемы неподвиж ной и подвижной
фаз соответственно):
R 'r =
т ПФ___________ Ом> ' *ПФ_______________*ПФ
т Т\Ф + т НФ
(-ПФ ' ^ПФ
^"нф ■^НФ
V
А. ( С НФ \ . у
КПФ
) КНФ
Пф
j ! ^НФ ^НФ
| ■ п ^НФ
ОтФ ^ПФ
^ПФ
(2.7)
так как УИФ/УПФ численно равно -^нф^пф - отнош ению фаз в сечении
слоя (фазовое отнош ение).
У равнение (2.7) получило название уравнения М артина-Синга и
применимо для жидкостно-ж идкостной ТСХ и распределительной хро­
матографии на бумаге (БХ).
Для жидкостно-адсорбционной ТС Х С найдером предложено урав­
нение (2 .8):
*-• i -------4
Г.
<2-8>
1+^G —
V
гм
где K q - коэффициент адсорбции; IVA - масса сорбента в неподвижной фазе;
VM - «мертвый» объем в слое перед элюированием без предварительного насы­
щения молекулами растворителя из газовой фазы в камере.
2—3196
Глава 2
34
Произведения D(Ah<i/A^) в уравнении (2.7) и Ко(1Уа/Ум) в уравне­
нии (2.8) равны к '- фактору удерживания. Поэтому
Л 'г = Г Т 7
1+ к'
(2-9)
и, соответственно,
(2 1 0 )
Таким образом, R Vопределяет не только долю молекул пигментов
в подвижной фазе (фактор D), но и среднюю вероятность пребывания
меланоидинов в подвижной фазе (фактор к1). Величина Л 7 из уравнения
(2. 10) пропорциональна количеству растворенного вещества в подвиж­
ной фазе, а величина (l-/?f) пропорциональна количеству растворенного
вещества в неподвижной фазе.
Как определить отношение (Ацф/Ацф) в уравнении (2.7)? Для этого
существуют два варианта. Если подвижной фазой является не очень
летучий растворитель, то используют гравиметрию, измеряя массу слоя
сорбента до и после элюирования. Второй вариант заключается в опре­
делении величины D экстракционным методом с последующим хрома­
тографированием меланоидинов на тонкослойной пластине и рассчиты­
вают соотношение (АНФ/АПФ) по уравнению (2.11):
А НФ
где R! -
I-*/
Л.
(2 . 11)
в идеальной системе.
В отдельных случаях измеренное значение R( можно считать тер­
модинамическим R'f.
• если состав слоя вдоль пластинки (или бумаги) неизменен;
• фазовое отношение вдоль слоя постоянно;
• скорости продвижения фронта подвижной фазы и растворителя в
месте нахождения одинаковы;
• если в слое перед началом элюирования не было молекул раство­
рителя или другой подвижной жидкости.
При несоблюдении этих условий R{ будет меньше значения
и
(2 .12)
где ^ - поправочный коэффициент, который принимает значения от 1,0 до 1,6.
Величина поправочного коэффициента ^ определяется природой сорбента и
растворителя, способом элюирования, продолжительностью предварительно­
го насыщения сорбента.
Методы выделения пигментов из природного сырья
35
Бейт-Смитом был введен параметр Rm, связанный со структурными
особенностями сорбата и находящийся в логарифмической зависимости
от значения R{
(2.13)
Используя уравнение (2.7), выражение (2.13) для жидкостно-жид­
костной, т. е. распределительной хроматографии можно представить как:
.
Rm = \ g ^ + \ g D ^ l g k ' .
(2.14)
"ПФ
Аналогично для адсорбционной хроматографии в соответствии с
(2.8) имеем:
w
Rm= \ g ( - ± ) + \ g D .
(2.15)
V
м
*м
Подставив в (2.14) вместо lgD выражение
приходим к уравнению Мартина:
(2.17)
где ДС° —изменение свободной энергии Гиббса при фазовом переходе одного
моля растворенного вещества при стандартных условиях. ДС/° отражает изменения в хроматографической системе pH, активности, природы раствори­
теля и т. д.
2.3.3. Определение заряда, пути пробега, скорости
перемещения, изоэлектрической точки
и электрокинетического потенциала
меланоидиновых пигментов
Метод электрофореза на бумаге позволяет определить заряд от­
дельных компонентов по зависимости от их миграции в анодную или
катодную области при фракционировании; величину пробега / (см, рас­
стояние середины зоны от линии старта); электрофоретическую ско­
рость U, зависящую от градиента потенциала Н, времени разгонки т,
напряжения в камере v, расстояния между электродами в электрофоре­
тической камере 5; изоэлектрическую точку pi [1,63, 71-74, 102,103].
Вещества, двигающиеся в анодную область, имеют отрицательный
заряд; пигменты, мигрирующие в катодную область, заряжены положи­
Глава 2
36
тельно. Если электрофоретическая зона остается на линии старта, то это
свидетельствует об электронейтральности вещества. Известно, что мела­
ноидины являются амфотерными соединениями [74, 102, ISO], способными
при определенном значении pH существовать в виде биполярных ионов:
СОО"
N H 3+
где R - высокомолекулярный радикал меланоидинов. Изоэлектрическая точка это значение pH, при котором амфотерные соединения не проводят электри­
ческий ток; ее обозначают как pi; кислотные и основные группы меланоидинов
в точке р! как бы «замкнуты» друг на друга. Именно при этом значении pH
биполярные ионы не склонны перемещаться под действием электрического
поля Тот компонент меланоидинов, который при заданном значении pH, опре­
деляемом составом растворителя, нейтрален, будет оставаться при элек­
трофорезе на линии старта.
Электрофорез положен в основу определения (хотя и достаточно
приближенного) величин pi отдельных компонентов меланоидинов. Для
этого из непроявленных химическими реагентами частей электрофореграммы вырезают отдельные зоны, измельчают их в виде квадратов
размером примерно 2*2 мм и экстрагируют пигменты из них 5-10 мл
дистиллированной воды в бюксах, число которых равно количеству ис­
следуемых компонентов. Бумажную массу отделяют от элюента после
4 -6 ч экстракции обычной фильтрацией (или на фильтре Шотта № 1).
Полученный раствор в количестве 2 мл (порциями по 0,2 мл) мик­
ропипеткой наносят в виде пятна на линию старта хроматографической
бумаги «Фильтрак № 11» (Германия). Одновременно при одном и том
же значении pH буферного раствора (используя метод нанесения проб в
виде пятен) можно исследовать несколько компонентов меланоидинов.
Расстояние между наносимыми пробами по ширине листа должно быть
не менее 40 мм.
В качестве буферных растворов со строго определенными значе­
ниями pH можно выбрать ацетатные или фосфатно-цитратные смеси.
Эти смеси используют поочередно для отдельных электрофоретических
разделений. Компоненты меланоидинов, существующие в виде цвиттерионов при заданном значении pH буферного раствора, при электрофоре­
зе (время разгонки 3-4 ч) будут фиксироваться на линии старта.
Электрофоретическую скорость U отдельных компонентов вычис­
ляют по формуле:
U ------ ,
тН
где S - путь, пройденный пигментами за время т, см.
(2.18)
Методы выделения пигментов из природного сырья
37
Скачок потенциала, измеренный в том случае, когда одна фаза
(пигменты) движется относительно другой (растворитель), называют
электрокинетическим потенциалом С,.
Для вычисления электрокинетического потенциала отдельных
фракций пигментов авторами [ 1] предложена методика по определению
скорости их электрофореза в зависимости от pH в градуированной U-образной трубке с кранами (рис. 2.3). Сечение отверстий в кранах равно
сечению трубки. Исследуемые пигменты растворяли в фосфатноцитратном буфере (с заданным pH и ионной силой J = 0,036) и помеща­
ли в трубку. Краны перекрывали и после промывания верхних концов
трубки туда наливали растворитель (боковая жидкость).
Электродами служили две узкие стеклянные трубочки, заполнен­
ные 3%-ным студнем агара, насыщенным хлоридом калия до выпадения
кристаллов. Каждую из трубочек одним концом помещали в открытое
колено U-образной трубки, а сверху в расширенную часть электродов
наливали 10%-ный раствор сульфата меди, в который помещали спи­
ральные медные проволочки.
Аппарат укрепляли в термостате при 6 °С, предварительно уравняв
соединительным краном боковую жидкость в трубке. Затем открывали оба
крана, подключали источник постоянного тока к электродам (напряже­
ние v) и, зафиксировав время начала опыта, наблюдали за перемещением
границы раздела между меланоидинами и боковой жидкостью [1]. Изме­
рив по оси U-образной трубки расстояние / (см) между концами агаровых
сифонов, погруженных в боковую жидкость, определяли величину гради­
ента потенциала Я по формуле (2.19); электрофоретическую скорость
300 /
(2.19)
где v —напряжение, В.
Электрокинетический потенциал вычисляли по уравнению Гельмгольца-Смолуховского:
£
(2 .20)
где К - коэффициент для сферических частиц, равный 6; р. —вязкость раство­
рителя, равная при 20 °С 1,005 мПа-с; е - диэлектрическая проницаемость рас­
творителя, равная 81; U - электрофоретическая скорость из (2.18).
Этот скачок потенциала наблюдается между растворителем, непо­
средственно связанным с ионами (молекулами) пигмента, и остальной его
массой. Чем больше толщина гидратной оболочки, защищающей частицы
от ассоциации (слипания), тем больше величина электрокинетического
потенциала (силы отталкивания между растворенными частицами).
38
Глава 2
Рис. 2.3. Прибор для измерения скорости электрофореза меланоидинов [1]
Таким образом, электрокинетический потенциал характеризует ус­
тойчивость меланоидинов в растворах. Если он равен нулю, наступает
изоэлектрическое состояние пигментов и происходит их коагуляция.
2.3.4. Определение молекулярной массы и радиуса
молекул пигментов методом гельпроникающей
хроматографии
Помимо разделения [74, 75, 102, 353], метод гельпроникающей хро­
матографии может быть использован для определения молекулярной мас­
сы отдельных компонентов, содержащихся в пигментах, а также радиуса
их молекул [150, 162]. Часто используемыми носителями в ГПХ являются
различные марки Сефадексов, получаемых на основе гелей декстрана.
Декстран - сильно сшитый полисахарид, состоящий из трехмерной сетки с
различной пористостью. В значительном диапазоне объем удерживания KR
является практически линейной функцией логарифма величины молеку­
лярной массы (рис. 2.4). Поэтому для определения молекулярной массы
пигментов необходимо предварительно построить калибровочный график,
для чего используют белковые вещества, полисахариды или полиолы с
известными молекулярными массами и структурой, желательно близкой к
структуре исследуемых компонентов [150, 162,347].
lgM = C t - C 2V&,
(2.21)
где Сj и Ci - калибровочные коэффициенты, характеризующие данную хрома­
тографическую систему, найденные по набору стандартов; М - молекулярная
масса; Уц - объем удерживания (элюционный объем).
Подготовку декстрана к работе проводят в соответствии с методи­
кой, представленной в разделе 2.2.4. Для этого носителю с точно из-
Методы выделения пигментов из п риродного сырья
39
вестной массой т\ (взвеш ивание на аналитических весах с точностью
до ±0,0002 г) даю т набухнуть в воде (табл. 2.1). После этого Сефадекс
переносят в стеклянную колонку, в нижней части которой имеется там­
пон из стекловаты , служащ ий опорой для носителя.
Д ля дальнейш их расчетов необходимо знание массы набухш его ге­
ля m-i и количества поглощ енной воды ш. П оэтому при взятии рабочих
навесок параллельно берутся две пробы С еф адекса по 0,25 г (с точно­
стью ± 0,0002 г) и пикнометрически (или методом центрифугирования)
определяется м асса набухш его геля. С оответствую щ ий пересчет позво­
ляет определить величины т г и (о для навесок С еф адекса в колонках.
Рис. 2.4. Типичная частная калибровка для водной хроматографиической гельпроникающ ей системы с использованием геля
М олселект G 10:
Колонка 12,6x850 мм, расход 2 мл/мин [347]. Отрезок кривой АВ отсекает ли­
нейный участок калибровки
Для определения /«2 и со методом центрифугирования навески носи­
теля помещ аю т в плексигласовые или стеклянные пробирки (масса кото­
рых известна также с точностью до ± 0,002 г) с пористым дном и поме­
щ аю т в воду на 8 ч (температура опы та 70 °С). По истечении этого вре­
мени пробирки с сорбентом центрифугирую т со скоростью 3000 об/мин
до постоянной массы. М ассу воды, поглощ енной Сефадексом, рассчи­
ты ваю т по формуле:
( o - P i - P 2- P b
(2 .22)
где ш —масса воды в Сефадексе; Р\ - масса центрифужной пробирки с сорбен­
том, приведенным в равновесие с водой и освобожденным от избытка раство­
рителя центрифугированием; Рг - масса пустой пробирки; Pj - масса сухого
сорбента.
Глава 2
40
В качестве рабочих растворов использовали освобожденные от био­
массы растворы и растворы веществ из отдельных хроматографических
(или электрофоретических) зон (в соответствии с разделами 2.2.1-2.2.3).
Скорость пропускания 0,2 см3/мин. Объемы используемых растворов ме­
ланоидинов - 1 см3. Растворы наносят в верхнюю часть колонки с помо­
щью пипетки, не взмучивая слой Сефадекса. Элюирование пигментов
дистиллированной водой начинают немедленно после прохождения 1 см3
исследуемого раствора вниз по колонке. Объем отбираемых фракций на
выходе составляет S см . Контроль на присутствие пигментов в отдель­
ных фракциях проводят спектрофотометрически в УФ-области. Макси­
мум поглощения исходных растворов устанавливается предварительно.
В качестве стандартных веществ были выбраны белки с известными мо­
лекулярными массами (табл. 2.3), и для каждого из них определяли элюционный объем VR.
2.3. Растворы белков, выбранные в качестве стандартов, при гельхроматографировании на Сефадексах меланоидинов
Вещество
Глюкоамилаза
Цитохром С
Яичный альбумин
Сывороточный альбумин быка (мономер)
Альбумин человеческой сыворотки
Глюкозооксидаза
М.м.
100000
13000
45000
67000
69800
130000
1RM
5,0000
4,1139
4,6532
4,8261
4,8388
5,2100
Ун, см3
10,0
35,0
20,0
15,0
14,0
10,0
Для определения молекулярной массы пигментов пользовались ка­
либровочным графиком lgМ - Уц. Если есть возможность провести эле­
ментный и спектральный анализ компонентов, выделенных с помощью
гельпроникающей хроматографии, то можно установить ориентировоч­
ные формулы пигментов.
Метод ГПХ наряду с определением молекулярной массы пигмен­
тов позволяет найти размер их молекул. Для этой цели пользуются
формулой Огстона [67, 74, 162], сделав допущение, что молекулы мела­
ноидинов имеют сферическую форму:
К „ = e~ ^ {r+R)2,
(2.23)
где L — постоянная для каждой марки Сефадекса (для G-200 она составляет
3-1012 см/мл); г —радиус сферических полостей, доступных для стандартных
веществ (постоянная, равная 7-1(Г* см — 7 A); R - радиус полостей в Сефадексе, доступных для частиц изучаемого вещества (фактически радиус молекулы
определенного компонента меланоидинов).
В уравнении (2.23) неизвестны две величины: К„ и радиус опреде­
ляемых меланоидинов. Величина Кт не зависит от геометрической
41
Методы выделения пигм ентов из п риродного сырья
формы и плотности заполнения колонки и ее мож но определить по
уравнению :
(2.24)
где У0 - внешний объем, т. е. объем между гранулами, определяемый из соот­
ношения:
ffl,(! + <»)
(2.25)
т2
где От|. т2 —масса сухого и набухшего геля в колонке соответственно, г; со —
количество воды, поглощенной гелем, находящимся в колонке г; Гс - объем вы­
хода, определяемый как объем элюента, собранного с момента внесения опре­
деляемого вещества на колонку до момента его выхода из колонки с Сефадексом; Vx - общий объем слоя Сефадекса, устанавливаемый на основании геомет­
рических параметров колонки (диаметра и высоты слоя геля).
ГО
Гt
Поэтому для расчета Кю предварительно (перед гель-хроматографи­
рованием) определяют величины т ь тъ со и V,.
Рассчитав Kiv из (2.24), подставим его значение в уравнение (2.23)
и, логариф мируя последнее, приходим к квадратному уравнению отно­
сительно R:
\nK „ = -n L (r + R)2;
2,31gKav = -n L (r + R )2',
(2.26)
\
— + r 2 , получаем реш ение
О бозначая a
/
уравнения (2.26) в следую щ ем виде:
2
(2.27)
Подставляя численные значения г, K tv, L и к в уравнение (2.27), на­
ходим радиусы R м еланоидиноподобны х компонентов.
2.3.5. Анализ пигментов спектрофотометрическим
методом в видимой и ультрафиолетовой областях
спектра
Спектроф отометрические исследования пигментов описаны в ра­
ботах [1 ,4 4 , 61, 7 1 -7 5 , 114, 150]. Спектры поглощ ения в видимой и УФ области обусловлены изменением в электронном состоянии молекул и
получили название электронных. В видимой области меланоидины пи-
42
Глава 2
щевых, микробиологических, фармацевтических производств, фульво­
кислот имеют похожие спектры поглощения и различаются только ин­
тенсивностью цвета и наклоном кривых при построении зависимости
оптической плотности раствора от длины световой волны, D =ДХ).
Спектры поглощения меланоидинов в УФ-области имеют харак­
терные для отдельных компонентов интенсивные полосы светопоглощения. Так, меланоидины сахарного производства [1] образуют макси­
мум при 285-300 нм, минимум при 265 нм и слабовыраженную полосу
поглощения при 340-370 нм. Меланоидины производства лизина имеют
максимум при 275-280 нм, а отдельные компоненты - при 252-260 нм и
315-320 нм [74, 150]. Меланоидины производства лимонной кислоты
дают максимум при 280-285 нм и минимум при 255 нм [72, 73, 150].
Фульвокислоты флуоресцируют при 254 нм [75].
Полосы поглощения в электронном спектре характеризуются дли­
ной волны и интенсивностью поглощения. Длина волны полосы погло­
щения, отвечающая электронному переходу, соответствует энергии это­
го перехода. Интенсивность полос поглощения определяется вероятно­
стью перехода. На рис. 2.5 представлена последовательность энергети­
ческих уровней электронов в молекуле органических соединений.
^
о* - разрыхляющая орбиталь
п* - разрыхляющая орбиталь
п - несвязывающая орбиталь
л - связывающая орбиталь
о - связывающая орбиталь
Рис. 2.5. Схема возможных переходов электрона в органических
соединениях:
а и а —связывающая и разрыхляющая орбитали; п и л —связывающая и раз­
рыхляющая орбитали; п —несвязывающая орбиталь [169, 170]
Осуществление о —» о* переходов требует наибольшей энергии
возбуждения (соответствующие полосы поглощения наблюдаются в
вакуумной УФ-области, X < 200 нм); я —►о* и л —*• о* переходы также
лежат в области ниже 200 нм; л —►тг переходы только в случае сопря­
жения лежат выше 200 нм. Одной из причин поглощения в УФ-области
является наличие в органическом соединении хромофорных групп.
Электронные спектры соединений, содержащих систему сопряженных
Методы выделения пигментов из природного сырья
43
кратных связей, а также несопряженных соединений с гетероатомами,
имеют полосы переходов п —* л в области выше 200 нм [169, 170].
Положение полос поглощения зависит от структуры молекул и в
первую очередь от взаимного расположения хромофорных групп. В ре­
зультате систематических исследований [169, 170] собран общий мате­
риал о влиянии хромофорных групп на положение и интенсивность по­
лос поглощения в УФ-области. В электронной спектроскопии интенсив­
ность полос поглощения измеряется обычно значением молярного коэф­
фициента поглощения В максимуме ПОЛОСЫ (вшах ИЛИ IgSmax)- Полосы низ­
кой интенсивности (lge < 2) обусловлены карбонильными, тиокарбонильными, нитро- и нитрозогруппами. Полосы поглощения при 250300 нм с lge = 2-3 могут быть связаны с простыми бензольными группи­
ровками; интенсивные полосы поглощения с
> 200 нм и lge > 4 ха­
рактерны для соединений с сопряженными связями [169, 170].
Метод спектрофотометрии в УФ-области является весьма эффек­
тивным не только для изучения структуры пигментов, но и для опреде­
ления в них констант протолиза функциональных групп. При спектро­
фотометрическом определении рКа обычно полагают, что величины pH
исследуемых растворов заранее известны [169] (например, из потен­
циометрических определений) и собственно спектрофотометрической
задачей является нахождение концентраций меланоидинов С на ( в форме
кислоты) и СА(сопряженного кислоте основания пигмента) [167, 169].
В общем случае протолиз окрашенного компонента можно пред­
ставить как:
АН+ ?=Ь А+Н+ ,
характеризующийся константой
(2.28)
(2.29)
(заряд исходного и конечного вещества не указан) или
(2.30)
рКа = pH - \g(C а/С на)
Чаще всего для спектрофотометрического определения рК„ сни­
мают спектры исследуемого вещества в ряде буферных растворов с раз­
личными значениями pH при постоянной толщине кюветы и постоян­
ной суммарной концентрации НА и А. Это обеспечивается тем, что к
одинаковому объему буферных растворов с различным значением pH
добавляют одинаковое исходное количество А и НА. В этих условиях:
где D - оптическая плотность анализируемого раствора; £)А и ОцА- оптиче­
ские плотности раствора, содержащего только форму А и НА [!69\.
Глава 2
44
П одставляя (2.31) в (2.29), получаем:
(2.32)
или
(2.33)
П одобны й м етод применяется только в неослож ненны х случаях,
т. е. когда:
1. могут быть экспериментально определены оптические плотности рас­
творов, содержащих только одну кислотно-основную пару £>на и Da ;
2 . известны молярны е коэфф ициенты экстинкции для обеих кислот­
но-основны х форм.
О днако в нашем случае эти условия не вы полняю тся. П оэтому
протолиз окраш енны х компонентов необходимо изучать уж е не в бу­
ферны х растворах, а в растворах с известной ф ункцией кислотности
[169, 171]. П ри этом для процесса (2.28) ф ункцию кислотности Н мож но
записать как:
Я ' = - l g А' = - l g
[ ( cxh+ W /
ha)]
= pH - lg Ш
(2-34)
на )-
Уравнение (2.32) и (2.33) для определения Ка содерж ат три неизвест­
ных (К,,; Da и D Ha )- Для и х нахождения достаточно, зная оптические плот­
ности смеси при трех различных кислотностях, реш ить систему трех урав­
нений с различными значениями функции кислотности И\, Иъ А3 [171]:
D
_ ( D v - D 2W h \ - D i h ' 3) - ( D l - D i )(Dih \ - D 2h ' 2) .
**
( А - е д / » \ - А ’2) - ( Я 1-£>з)(А,1-Л ,2)
’
(Л’.- Л 'з Х Д - D 2) - ( / » ,I- A '3)(D IA'I- Z y I’2)
Имеется несколько работ [169, 171, 172], в которых рассм отрена
теория и практика построения функций кислотности, а такж е приведены
обш ирны е таблицы с их значениями. Н аиболее полными и достоверны ­
ми являю тся данны е для водны х растворов, содерж ащ их серную кисло­
ту. Д ля определения К„ меланоидинов, наиболее подходящ ей является
функция кислотности ЬГR [171] (табл. 2.4).
45
Методы выделения пигментов из природного сырья
2.4. Ф ункция кислотности водных растворов серной кислоты
Содержание H2SO4, %
5
10
15
20
25
30
35
40
Н1R
-0,06
-0,69
-1,28
-1,86
-2,46
-3,10
-3,82
-4,55
Содержание H2SO4, %
45
50
55
60
65
70
80
95
Wr
-5,31
-6,15
-7,07
-8,13
-9,13
-10,16
-11,84
-13,61
Практически для определения Ка меланоидинов, элюированных из
отдельных хроматографических зон, используют растворы при трех раз­
личных кислотностях. Для этого готовят 15%, 20% и 25% растворы сер­
ной кислоты и к каждому раствору добавляют по 1 мл анализируемого
раствора. Функции кислотности каждой смеси Л,',
рассчитывают
по уравнению (2.34). Каждую смесь исследуют спектрофотометрически
в УФ-области и определяют оптические плотности D\, D2 и D3 при одной
и той же длине волны, которая соответствует максимальному поглоще­
нию. Величину К„ рассчитывают, используя формулы (2.35-2.37).
2 .3 .6 . Определение функциональных групп и связей в
пигментах методом инфракрасной спектроскопии
ИК-спектроскопия является одним из эффективных методов при
изучении структуры органических соединений, в том числе и меланоиди­
нов [1, 71-75,77, 98, 102, 103, 110, 113, 114, 131, 148, 170, 172-189].
ИК-спектры, как известно [1, 71, 102, 172-188], обусловлены переходами
между колебательными уровнями молекулы, находящейся в основном
электронном состоянии. Существует два вида основных колебаний - ва­
лентные (растяжение и сжатие отдельных связей между атомами) и де­
формационные (изменение углов между связями).
В ИК-спектроскопии для структурного анализа используются по­
лосы поглощения с так называемыми характеристическими частотами.
Экспериментальные исследования большого числа молекул, обладаю­
щих одними и теми же функциональными группами, показали, что не­
зависимо от изменений в остальной части молекулы, эти одинаковые
группы поглощают свет в узком интервале частот. Такие частоты и по­
лучили название характеристических, или групповых. Наличие этих
частот вызвано тем, что в подобном колебании наибольшее участие
принимает некоторая группа атомов; вклад остальной части молекулы
мал. На положение полос поглощения влияют внутри- и межмолекулярные взаимодействия, геометрия молекулы, растворители, масса присое­
диненных атомов, электронные эффекты и др. [172-189]. Обнаружение
46
Глава 2
отдельных функциональных групп и различных связей проводят по вы­
шеупомянутым характеристическим частотам. При этом руководству­
ются обширным экспериментальным материалом, систематизирован­
ным в специальных таблицах и картах [170, 173-189].
Анализ меланоидиновых пигментов проводится в образцах, приготов­
ленных в виде суспензий (взвесей) с вазелиновым маслом (нуйолом); пле­
нок на окошке кюветы; таблеток с бромистым калием. Суспензию меланоидинов готовят тщательным растиранием в агатовой ступке. Получен­
ную пасту равномерно распределяют между пластинками из КВ г. Однако,
вазелиновое масло интенсивно поглощает свет в интервале 1380-1450 см'1,
искажая результаты анализа. Поэтому, если позволяет конструкция спек­
трофотометра, для компенсации поглощения вазелинового масла в канал
сравнения помещают кювету с чистым вазелиновым маслом.
Одним из способов подготовки образцов пигментов является прес­
сование вещества с бромистым калием под высоким давлением. При
использовании таблеток с КВг возможно несколько источников ошибок.
Во-первых, если в наполнителе содержится небольшое количество во­
ды, то она может гидратировать меланоидины (как в гомогенном рас­
творе, так и в сорбированном состоянии на ионитах), что приводит к
смещению некоторых полос поглощения во времени. Во-вторых, тонко
измельченный бромид калия способен поглощать примеси. В-третьих,
интенсивность многих полос поглощения (в частности для воды) в таб­
летках с КВг пропорциональна содержанию компонентов в образцах
только при полной прозрачности таблеток [175-177]. Поэтому для ис­
ключения рассмотренных ошибок, измельченный бромид калия (специ­
ально предназначенный для спектральных работ) высушивают в инди­
видуальном сушильном шкафу. Проверку на чистоту и отсутствие влаги
в КВг проводят путем записи спектрограмм. Подготовленный бромид
калия хранят в бюксе с крышкой, помещенной в эксикатор.
Приготовление образцов пигментов проводят в агатовой ступке
смешиванием с порошком КВг в соотношении 1 : 100 и прессованием
смеси под давлением 150 кГ/см2. При высоком давлении, достигаемом
на пресс-форме (рис. 2.6), кристаллы бромида калия становятся пла­
стичными и образуют прозрачную матрицу, в которой равномерно рас­
пределен порошок исследуемого сорбента. Бромид калия не имеет по­
лос поглощения в интервале волновых чисел от 4000 до 400 см' . Если
таблетка из КВг приготовлена при относительной влажности атмосферы
0-10%, то она остается прозрачной более трех месяцев. Таблетки, при­
готовленные при влажности воздуха 10-16%, мутнеют через 7 сут.
Для качественного анализа пигментов образцы готовят в виде сус­
пензий, таблеток и пленок, чтобы проверить идентичность их спектров.
Полученные ИК-спектры для меланоидинов (в сорбированном на анио­
ните АН-22-6 состоянии) имеют общие полосы поглощения. Некоторые
Методы выделения пигментов из природного сырья
47
различия в интенсивности полос в спектрах (рис. 2.7) вызваны неодина­
ковым содержанием вещества в анализируемых пробах, приготовлен­
ных различными способами.
Рис. 2.6. Пресс-форма с прямоугольной рабочей поверхностью
(о, —вид сбоку и сверху, соответственно):
б
1 —рабочие пластинки; 2 —держатель пластин; 3 —регулировочные винты
Аналогичное сравнение ИК-спектра катионита КУ-2-8 (используе­
мого в дальнейшем для сорбции меланоидинов), приготовленного в ви­
де таблеток с бромидом калия, со спектром специально приготовленной
пленки полистиролсульфоновой кислоты [102, 179] показало их полную
идентичность (рис. 2.7).
Использование образцов в виде таблеток дает достоверные результаты
в количественном анализе меланоидинов, так как возможны точная дози­
ровка исследуемого вещества в таблетке и определение ее толщины. При
хорошем диспергировании пигмента (при толщине таблетки 0,5 мм) опти­
мальная концентрация его равна 1%, что позволяет получать в большинст­
ве случаев максимумы поглощения в спектре от 20 до 80% поглощения.
ИК-спектры меланоидинов можно получать путем исследования их
растворов в виде тонких пленок, получаемых сдавливанием капли жидко­
сти между двумя пластинками, изготовленными из гапогенидов щелочных
или щелочноземельных металлов (КВг, CaF2, LiF). Исследуемый раствор
помещают в кюветы, состоящие из двух пластинок (или окошек из КВг,
CaF2, LiF). Между ними находится тефлоновая прокладка, задающая тол­
щину поглощающего слоя. Прокладки имеют фиксированную толщину от
0,01 до 1 мм. Растворы вводятся и выводятся из кювет через специальные
отверстия. В работе [190] предложена методика получения ИК-спектров
физиологически активных веществ, осажденных на оптически прозрачной
48
Глава 2
подложке из монокристаллического кремния, которая позволила проводить
более точное определение частот колебаний функциональных групп мела­
ноидинов при различном значении pH и при сорбции ионитами (с участием
ион-ионных, ион-дипольных и диполь-дипольных взаимодействий).
Рис. 2.7. ИК-спектры анионита АН-22-6, насыщенного меланоидинами (а):
1 —суспензия в ССЦ —кювета 4,026 мм; 2 —осадочная пленка из CCU; 3 —таб­
летка с КВг.
ИК-спектры катионита КУ-2-8 (б) в области колебаний сульфогруппы:
I - калиевая соль полистиролсульфоновой кислоты; 2 - катионит КУ-2-8 в
калиевой форме
Методы выделения пигментов из природного сырья
49
Получение спектров. Исследование структуры, гидратации, зако­
номерностей сорбции меланоидинов проводили, с одной стороны, на ос­
новании смещения ИК-максимумов функциональных группировок (срав­
нение с литературными данными), а с другой стороны, с использованием
численных методов (для разделения суммарных полос на составляющие).
ИК-спектры снимали на спектрофотометрах Specord-IR-75 (Герма­
ния), ИКС-14А и Инфралюм ФТ-02 (Россия). Предварительная градуи­
ровка приборов Specord-IR-75 и ИКС-14А проводилась в интервале
волновых чисел 8000-600 см-1 по пленке полистирола толщиной 0,3 мм.
Масштаб градуировочных графиков выбрали таким, чтобы рассчиты­
вать волновые числа с точностью, превышающей допуск на точность
градуировки. Параметры записи на приборе Specord-IR-75 следующие:
скорость - 12 мм/с; ширина щели - 3 мм; подавление шумов - 10; время
записи - 12 мин; усиление автоматическое. Запись спектрограмм анали­
зируемых проб на приборе ИКС-14А проводили в компенсационном
режиме (таблетка из чистого бромида калия). Затем, используя калибро­
вочные графики, обрабатывали спектрограммы, рассчитывая положение
максимумов (см- ) в спектре исследуемого образца. В фурье-спектрометре Инфралюм ФТ-02 вместо монохроматоров использован интерфе­
рометр. Регистрируемая детектором интерферограмма обрабатывается
компьютером и преобразуется им в обычный ИК-спектр (фурье-преобразование) [167]. По сравнению со сканирующими ИК-спектрометрами
фурье-спектрометры обладают большей разрешающей способностью
(регистрируются ИК-спектры разбавленных растворов и сорбированных
монослоев веществ).
Разделение суммарных полос в ИК-спектре на их составляющие
численными методами. Меланоидины способны существовать в раз­
личных ионных сферах [1, 102, 150, 189], что приводит к изменению со­
стояния гидратной воды. С одной стороны, будет наблюдаться разупорядочивание структуры растворителя. С другой стороны, будет происхо­
дить упрочение водородных связей за счет взаимодействий «вода - гид­
рофильные группы пигмента». Подобные процессы в ряде случаев при­
водят к появлению в ИК-спектрах широких, слаборазрешенных полос
поглощения [172-186]. Поэтому при проведении исследований методом
ИК-спектроскопии возникает необходимость в раздельном рассмотрении
частично или полностью слившихся пиков. С целью получения более
корректных сведений о состоянии равновесий «меланоидин - вода» це­
лесообразна обработка полученных данных численными методами с
применением ЭВМ. Для обработки подобных ИК-спектров применима
УПОС (Универсальная программа обработки спектров) [182-184].
Разделение спектра F(x) на составляющие проводится по методу
дифференциальных моментов [182], который основан на совокупности
следующих операций: вычисление крыльев соседних максимумов, ин­
Глава 2
50
версия интенсивности, разложение в ряд Тейлора получаемой функ­
ции G(x). Коэффициенты разложения в такой ряд Алт (где п - порядок
производной; т - номер полосы в спектре) являются характеристиками
индивидуальных пиков, называются дифференциальными моментами и
определяются согласно уравнению:
вШ
Яш
п\ dx.
1р
где Аот - нулевой дифференциальный момент; Аот = F (В„); Вт- точка, в ко­
торой первый дифференциальный момент А\т = 0, т. е. максимум интенсивно­
сти [306].
Описание аналитического вида составляющих полос осуществля­
ется путем использования обратного биквадратного трехчлена, который
описывает достаточно точно максимумы лоренцевой формы. При опи­
сании гауссовой кривой максимальная ошибка не превышает 6%. При­
меняемый алгоритм обсчета позволяет как разделить суммарные пики,
так и сгладить шумы, имеющиеся на экспериментальных кривых.
При первичной обработке проводилось сглаживание [183]. Для серии
ИК-спектров первоначально определяли количество полос в них. С этой
целью каждый спектр обрабатывали отдельно в автоматическом режиме.
Полученные данные второй производной анализировались вместе для всей
изучаемой серии. Если минимум на графике второй производной, соответ­
ствующий некоторому пику [184], присутствует на всех графиках, то он
считается достоверным. Присутствие минимума лишь на отдельных гра­
фиках позволяет характеризовать его как шум. В дальнейшем обработка
серии спектров включала получение параметров всех реально сущест­
вующих пиков и их анализ. При неизменности параметров (положение,
форма, ширина) во всей серии находили и фиксировали их средние значе­
ния. Если параметр менялся, полагали, что зависимость его от состава сис­
темы должна быть гладкой. Поэтому аппроксимировали эту зависимость
плавной кривой и при дальнейших расчетах брали с нее значения пара­
метров, чтобы избежать их случайного разброса.
Конечная обработка результатов включала варьирование в серии
только интенсивности полос. Точность полученных результатов кон­
тролировали как по средним квадратичным отклонениям между экспе­
риментальным спектром и модельным, так и непосредственно - по раз­
ности между этими спектрами, которая выводится на график вместе с
экспериментальным и модельным спектрами и полученными индивиду­
альными пиками. Разность между модельными и экспериментальными
спектрами, как правило, не превышала 7%.
Структурно-групповой анализ и идентификация функциональ­
ных групп меланоидинов по ИК-спектрам. Выделение и концентриро­
вание отдельных компонентов меланоидинов в большинстве случаев со-
Методы выделения пигментов из природного сырья
51
провождается изменением их ионного состояния. При этом по виду ИКспектра можно сделать заключение о протолизе пигмента, о его ионном
состоянии, а также о характере гидратации. Спектрально-структурные
корреляции при этом проводят на основе данных, приведенных в работах
[73-75, 113, 170, 172-190]. Особого внимания заслуживают области спек­
тра 1300-600 см- [167, 170]. В эту область попадают пики, отвечающие
колебаниям одинарных связей С-С; C-N; С-О, а также многим деформа­
ционным колебаниям. В результате взаимодействия этих колебаний отне­
сение полос к отдельным связям затруднено. Однако весь набор макси­
мумов в этой области представляет характеристику остова молекулы в
целом (область «отпечатков пальцев»). По колебательным спектрам в
области 1300-600 см' можно идентифицировать даже изомеры.
Для катионов и биполярных ионов пигментов характерна полоса по-
+
глощения 3130-3030 см-1, обусловленная группой - NH3 (асимметричные
валентные колебания). Валентные симметричные колебания этой же груп­
пы проявляются в интервале 3000-2900 см“ . Максимумы в интервалах
1660-1610 см-1 и 1550-1485 см-1 характеризуют деформационные колеба-
+
ния (асимметричные и симметричные соответственно) NH3-группировок.
+
В биполярных ионах, наряду с колебаниями NH3-группы, прояв­
ляются колебания ионного карбоксила в области 1600-1550 см-1 и
1400 см '1, соответствующие асимметричным и симметричным колебани­
ям -СОО". Кроме того, в интервале 2700-2530 см-1 проявляется погло­
щение в виде широких размытых полос за счет СОО~-группировок, ассо­
циированных с аминогруппами или молекулами воды. Слабые колебания
карбоксилат-аниона проявляются также при 2140-1080 см '1.
Для катионов пигментов в интервале 1755-1690 см' 1 проявляются
полосы v(C=0) в недиссоциированных карбоксильных группах. Вто­
рая полоса, характерная для недиссоциированной карбоксильной
группы -СООН, обусловлена колебанием с участием растяжения оди­
нарной связи С -0 и проявляется в области 1200-1000 см [170, 180,
191]. При 2760-2730 см' 1 наблюдается слабое поглощение за счет ко­
лебания -ОН в СООН-группировках.
Анионы пигментов, помимо колебаний ионного карбоксила -СОО(проявляющегося и в биполярных ионах), обусловливают поглощение в
области 3370-3500 см' 1 (v - колебания свободных аминогрупп -NH2) и
3200-3000 см' (v - колебания ассоциированных аминогрупп).
Необходимо отметить, что важнейшее значение в процессах про­
толиза и сорбции меланоидинов имеет гидратация их ионов. Поэтому
перспективно рассмотрение ИК-спектров пигментов различной степени
гидратированности. Это наблюдение достигается термостатированием
52
Глава 2
исследуемых образцов при различной температуре (298, 333, 373К).
Учитывая вышеприведенные корреляционные данные, можно полагать,
что область деформационных колебаний воды (1645 с м '1) малопригодна
для исследования гидратации меланоидинов, так как она слабо чувстви­
тельна к изменениям интенсивности поглощения растворителя и, кроме
того, в области 1640 см” поглощает NH,. Интенсивность полос 5150 и
6900 см- (область обертонов «связанной» меланоидинами воды) не все­
гда бывает достаточна для получения корректных результатов (особен­
но для малорастворимых компонентов). При этом необходимым усло­
вием является дифференциальная запись спектров [191].
Максимумы поглощения при 3700-3260 см-1 для количественной
характеристики гидратации не всегда могут быть использованы, так как
в этой же области наблюдаются полосы поглощения валентных колеба­
ний NH2-rpynm>i. В этом случае необходимо разложение сложного кон­
тура ИК полосы на компоненты с помощью ЭВМ. Однако область ос­
новных валентных колебаний (3700-3260 см-1) в большинстве случаев
дает богатую информацию о типах водородной связи между растворите­
лем и функциональными фуппами меланоидинов, что позволяет сделать
корректные выводы о структурных воздействиях пигментов на воду.
Изучение гидратации ионов меланоидинов показало, что в ИК-спект­
рах наблюдаются также широкие полосы в интервале 2400-2290 см-1
(с основным максимумом около 2350 см-1), которые могут быть отнесены к
колебаниям групп -СОО- или -СООН, ассоциированных водородными
связями с Н20 [185, 189].
Необходимо отметить, что в твердом состоянии -СООН и -N H 2 группы меланоидинов образуют различные водородные связи. Типы
этих связей определяются наличием в ионах пигментов -СОО", -N H 3;
+
=М ^; >С=0; -ОН; гидратной воды и т. д. [1, 102, 173]. Их длина и соот­
ветствующие им углы X -Y Z (Y - донор; Z - акцептор; X - атом, с ко­
торым Y связан ковалентно) варьируют в зависимости от типа Y и Z.
Многообразие протоноакцепторных и протонодонорных групп в гидра­
тированных меланоидинах вызывает необходимость расчета возможных
колебаний по известным R a ...b (расстояние между акцептором и доно­
ром, участвующими в образовании водородной связи) [186].
Данные, представленные в табл. 2.5 для модельной системы тиро­
зин - анионит АВ-17-2П, свидетельствуют о правомерности такого
подхода, что позволяет четко выделить колебания, характерные для ассоциатов воды, содержащихся в аминокислотах (рис. 2.8). Эти данные
позволяют говорить о корректности выбранного подхода при исследо­
Методы выделения пигментов из природного сырья
53
вании гидратации пигментов, что в дальнейшем было использовано для
изучения взаимодействий «меланоидин-вода».
2.5. Отнесение колебаний для р а зличны х связей в системе тирозин
( Г ) - анионит А В -17-2П (температура т ермостатирования
Об1!?азиа 298К)
Положение пика, см~'
№
Отнесение колебаний
R
a...в »А
Расчет по
пиков
УПОС
Ra. в
1
2448
2,56
2436
Водородная связь Н 0-Н ...‘0-С = 0 в
кристаллогидратных структурах
2"
2462
2502
Водородная связь Н 0-Н ..."0-С =0 в
3
2,58
2496
кристаллогидратных структурах
4
2554
2565
Водородная связь Н 0-Н...0=С-0~ в
2,59
кристаллогидратных структурах
2636
Водородная связь НО-Н...“О—
Ат в
5
2,61
2611
кристаллогидратных структурах
6"
2619
2655
Т
8”
2673
9
2,74
2680
2703
Водородная связь-О-Н...ОН2 в кри­
сталлогидратных структурах
2729
10”
11
2790
vs СН2 в алканах
2824
12’'“
vs СН3 в группах f-N+(СН3)31
2887
13
2964
vas СН2 в алканах
14
vMСН3 в группах [—N+(CH3)3]
2992
15
3052
16
v C h в ароматическом кольце
171"1
3103
3131
18
Vch в фенольном радикале
3171
19”
3214
20"
3219
3232
21
2,74
НО-Н...ОН2 вблизи группы "0-С=0
3260
3276
НО-Н...ОН2 вблизи группы ~0-Аг
22
2,76
n - h ...o h 2
3295
3298
2,90
23
3325
24"
3354
H-N...H-OH
2,84
3346
25
3385
3379
НО-Н...-ООС26
2,77
3427
3408
N -H ...O O C 3,07
27
3458
3453
НО-Н... ОН2
28
2,79
3486
3496
НО-Н... ОН2у ионной пары К 1-.. ГО-Аг
2,82
29
3525
3542
HO-H... OH2у ионной пары 1^Г.. ГООС30
2,83
* R a ~.. b расстояние между донором А и акцептором В, участвующими в образова­
нии водородной связи. Расчет частот валентных колебаний проведен по [113,186]:
54
Глава 2
а) для системы ОН...0 по Av = 4,43 10 (2,84 - R0 ...0 ), гДе А \ = v0- v4; v0= 3675 см-1;
б) для систем [N-H...O] по A v - 0,548-10.3 (3,21 - Rn...o); где v0= 3675 см-1.
♦♦Интенсивность максимумов мала и их интерпретация не проводилась.
1
V , см
Рис. 2.8. ИК-спектр двухзарядного аниона тирозина, сорбированного
анионитом АВ-17-2П ( / —экспериментальная спектрограмма)
В процессе подготовки образцов меланоидинов при контакте с во­
дой и ионитами их выдерживали в эксикаторах над солями с контроли­
руемыми значениями р/р0 (давление паров растворителя). В ряде подоб­
ных опытов использовали также термостатирование при определенной
температуре. На основании смещения пиков, вызванных водородными
связями, и эмпирических формул расчета можно получить термодина­
мические параметры гидратации меланоидинов (табл. 2.6).
Применение формул, представленных в табл. 2.6, для расчета пара­
метров водородного мостика правомерно при однозначной интерпретации
максимумов, характеризующих наличие водородной связи в меланоидинах.
ИК-спектры пригодны для количественного определения веществ.
Определение одного компонента методом ИК-спектроскопии базирует­
ся на законе Бугера-Ламберта-Бера. Для нивелировки перекрывания
пика соседними полосами поглощения и для внесения поправок на час­
тичное рассеивание инфракрасного излучения используют метод базис­
ной (базовой) линии [167, 170].
На рис. 2.9 представлены способы проведения базовой линии (а и б).
Из этих рисунков следует, что отношение высоты пиков АС и отрезков
АВ отождествляется с соотношением /0к / (интенсивности световых пото­
ков, падающих на образец и на выходе из него) и после логарифмирова­
ния получают:
Методы выделения пигментов из природного сырья
(1 \
A = \g 1о = - l g Т .
I
55
(2.39)
2.6. Ф ормулы для расчет ов парам ет ров водородного м ост ика
по вели чи н е см ещ ения Av в И К -спект рах м еланоидинов
Параметр
Символ
Энергия Н-связи
Энтальпия
Ен
ДН
Силовая постоян­
ная Н-связи
Кн
Силовая постоян­
ная ОН-связи
Кон
Удлинение кова­
лентной связи
Длина водород­
ного мостика*
Дгон
К*он...о
«OH...N
' RnH...O
RnH... N
Единица
Формула для расчета
измерения
кДж/моль - Ы \ ° он = Ен 1,6 10"2 [194]
кДж/моль -ДН = 2,9 ДА1/2
Ду = [ДА1/2]2 80 [195]
см"
Кн - (5,5±1,2) 104 ЕН
[196]
см"2
-Кон = 8,63 (5,5± 1,2)-104 Ен12,879 10? [196]
А
Дгон = 5,3 10“5 Av[186]
А
А
А
А
Av = 4,4 103(2,84-Ro о) [186]
Av = 6,92 102(3,04-Ro n) [186]
Av = 5,48 102(3,21-RN o) [186]
Av= 1,05 103(3,38-RN. n) [186]
v0 для Rnh...n = 3300 см" ; v0 для Roh...n = 3400 см
Интенсивность максимумов в ИК-спектрах с использованием базовой
линии может быть рассчитана не только по высоте пика А, но по полуши­
рине его (1/2 Г) (рис. 2.9, в) и по площади максимума S (рис. 2.9, в и г).
Причем площадь максимума определяется несколькими способами:
1) метод графических построений, приводящий к отождествлению
площади пика S с площадью равнобедренного треугольника Д К Р (г);
2) расчет S пика интегральным методом по огибающей, ограничен­
ной базисной линией;
3) метод взвешивания (устаревший), когда контуры пика переносят
на кальку, вырезают контур на кальке и взвешивают на аналитических
весах. Соотношение /и,- - / тах (где т { - масса взвешенной кальки /-того
образца; /тах - интенсивность пика) для стандартных образцов позволя­
ет построить калибровочный график и определить по нему /х и соответ­
ственно концентрацию определяемых функциональных групп в иссле­
дуемом образце. Необходимым условием является при этом использо­
вание для всей серии экспериментов кальки одной партии (унификация
кальки по толщине).
В ряде случаев эффективным способом получения данных из ИКспектров является отнесение интенсивности максимумов, характерных
56
Глава 2
для целевых функциональных групп, к интенсивности полосы поглоще­
ния, не меняющей концентрации в серии опытов (например, к v металь­
ных и метиленовых групп при -2880 и ~2964 см ) [71, 74, 102] для ме­
ланоидинов и аминокислот.
т. %
"—^ ^
Ли
W\У
*
\
1р
|/
\ !/
г
V/IV
//2
I
D
V
V
Рис. 2.9. Способы построения базовой линии А —\gAC/AB (а, 6); И и 1/2высота и полуширина полосы поглощения (в); графические
построения для расчета площади S пика, близкого к площади
треугольника DKP (г); АС = /0; АВ = /
Таким образом, метод ИК-спектроскопии позволяет получить ин­
формацию о присутствии (или отсутствии) функциональных групп и
связей в пигментах. Используя эти данные о характеристичности частот
в совокупности с результатами УФ-поглощения, с результатами хими­
ческих специфических реакций, с результатами элементного анализа, с
хроматографическими характеристиками, можно установить структуру
меланоидинов.
Глава 3. Представления об образовании,
строении и свойствах
меланоидиновых пигментов
Меланоидины - продукты химической модификации при перера­
ботке растительного сырья (сахаров, пептидов, белков), а также при по­
лучении гидроксикислот, аминокислот, нуклеиновых кислот, ферментов,
витаминов, антибиотиков микробиологическими методами. Процесс об­
разования меланоидинов - это сложный окислительно-восстановитель­
ный процесс между веществами, содержащими свободные карбонильные
группы (или гликозидный гидроксил), с аминосоединениями (аминокис­
лотами, аминами, пуриновыми, пиримидиновыми основаниями), приво­
дящий к появлению вначале низкомолекулярных промежуточных соеди­
нений, а затем высококонденсированных азотсодержащих окрашенных
компонентов. По своему молекулярному строению они относятся к ве­
ществам нерегулярной (стохастической) структуры, что затрудняет ин­
терпретацию физико-химических результатов исследования. Для обос­
нования закономерностей изменения состава и строения меланоидинов
различных пищевых и микробиологических производств целесообразно
рассмотрение данных по теории меланоидинообразования.
3 .1 . Генезис
Начало систематическим исследованиям по анализу меланоидинов
было положено Майяром [2-4] почти 100 лет назад. Затем реакцию ме­
ланоидинообразования изучали Эйлер [35, 36], Ходж [19, 32], Вальтер
[31], Прей [38], Пономарева [21], Забродский [20], Сапронов [1]. Однако
до сих пор важнейшие вопросы генезиса меланоидинов являются от­
крытыми, поэтому столь многочисленны публикации по данному во­
просу в настоящее время [49, 102, 110, 154-161, 189, 197-221]. Причин
здесь может быть несколько, но можно выделить три главных.
Во-первых, при образовании меланоидинов отсутствует единая
цепь химических реакций, а имеется множество сопряженных процес­
сов, дающих большое число промежуточных продуктов.
Во-вторых, научные приоритеты современности смещены пре­
имущественно к исследованию процессов биотехнологии, селекции,
медицины, генной инженерии, т. е. к генезису биоорганических моле­
кул. Синтез таких высокомолекулярных органических веществ в живых
организмах происходит на основе генетического кода, в результате чего
получаются структуры, которые в большинстве случаев можно отнести
к индивидуальным компонентам.
Нарушение генетического кода рассматривается как прекращение
основного синтеза, как патология, ведущая к гибели организма. В основе
58
Глава 3
синтеза меланоидинов лежит отбор структур, которые в технологических
условиях (а затем в условиях биосферы) приобретают устойчивые свой­
ства, а сами пигменты должны выполнять функции, несколько отличаю­
щиеся от функций веществ, синтезированных по генетическому коду.
В-третьих, меланоидины легко вступают в реакции комплексообразования с переходными металлами (координационные связи), а также
с органическими компонентами (образование межмолекулярных ком­
плексов за счет Н-связей, гидрофобных взаимодействий, стеккингэффектов и др.). Последнее затрудняет в ряде случаев идентификацию
меланоидинов как индивидуальных компонентов.
Можно выделить несколько основных этапов в изучении путей об­
разования меланоидинов. Следует отметить гипотезу М. Майяра, пред­
полагающую конденсацию аминокислот и моносахаридов [2-4]. Хотя
отдельные толкования и формулировки М. Майяра не бесспорны, они
до сих пор используются рядом авторов [154, 200, 209, 210, 215, 217,
323, 327, 328]. В. Кретович и Р. Токарева [25] предложили схему реак­
ции меланоидинообразования, предусматривающую на первом этапе
разложение белков и углеводов с образованием аминокислот, пептидов
и моносахаридов в результате гидролиза и микробиологических процес­
сов; на последующих этапах, благодаря перегруппировке Амадори, идет
образование фурфурола, оксиметилфурфурола, ацетальдегида, метилглиоксаля, изовалерианового альдегида и др., а также реакции конденса­
ции (альдегид-аминная полимеризация).
В 1953 г. Д. Ходжем [19, 32] был предложен механизм образования
меланоидинов, предусматривающий семь основных типов реакций и
три последовательно идущие стадии с нарастанием цветности. Чаще
всего образование продуктов взаимодействия идет параллельно по всем
трем стадиям. С увеличением продолжительности реакции количество
окрашенных компонентов возрастает, а продуктов начальной и проме­
жуточной стадии - убывает [19,21, 81].
Можно полагать, что формирование меланоидинов не всегда тре­
бует обязательной деградации биологических компонентов до мономе­
ров. В реакции меланоидинообразования на первых этапах могут участ­
вовать и природные высокополимеры (или олигомеры), входящие в со­
став перерабатываемого сырья. При этом трансформация образовав­
шихся окрашенных веществ происходит непрерывно и возможно не
только нарастание, но и уменьшение их молекулярной массы.
Трансформация меланоидинов, по-видимому, включает перегруп­
пировки азотсодержащих фрагментов, перестройку основного каркаса
молекулы, нарастание степени ароматичности и снижение доли алифа­
тических цепей [71, 74, 75, 102, 189]. В этом плане процессы меланои­
динообразования идентичны процессам образования фульвокислот из
гуминовых кислот [76, 78-85].
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
59
В связи с тем, что одними из основных компонентов меланоидинообразования выступают аминокислоты и моносахариды, представляется
необходимым рассмотреть их химические свойства.
3.1.1. Растворы аминокислот
Относясь к соединениям биполярного типа, аминокислоты обла­
дают в водных растворах рядом свойств, присущих как истинным, так и
макромолекулярным смесям, а также обладают некоторыми свойствами
полиэлектролитов [222-272]. Учитывая гидратацию и диссоциацию
функциональных групп, процесс внутримолекулярного протолиза ами­
нокислот можно представить следующим образом:
/N H 2
/NH^OH
—R CH + НОН —— R СН
\Ю 0 Н
\Ю 0 Н
/ NH3
R СН + НОН
€00“
(3.1)
Таким образом, диссоциируя с одновременным отщеплением ио­
нов Н+ и ОН', аминокислоты находятся в виде биполярных ионов (цвиттер-ионов). Максимальное количество их содержится в изоэлектрической точке (pi).
Кислотно-основные свойства аминокислот полнее всего интерпре­
тируются на основе теории Бренстеда, согласно которой одно и то же
вещество может проявлять себя и как кислота, и как основание в зави­
симости от условий. Простая моноаминомонокарбоновая кислота в пол­
ностью протонированной форме является двухосновной кислотой. При
полном титровании она может отдать два протона:
Н , N CHRCOOH------>Н, N CHRCOO- + Н+
3+
3
(3.2)
Н j N CHRCOO"------>HjNCHRCOO" + Н+
(Н}0* - ион обозначен как п ) .
В рассматриваемом случае цвиттер-ион (А*) может быть донором
(превращаясь в А~) и акцептором протонов (превращаясь в А*). Протолиз
аминокислот по уравнению (3.1) характеризуется константой протолизаК ь протолиз по схеме (3.2) - константой протолиза К2. В общем виде
для любой реакции между кислотой и основанием, согласно теории Брен­
стеда, применимо уравнение Гендерсона-Хассельбаха [96, 171], которое
запишем в виде:
рН = рК ,-ь1е 1АЩ еПТОрН1.
(3.3)
[ДонорЩ
Это уравнение дает возможность (см. раздел 2.3.1) рассчитать ве­
личины рК аминокислот, исходя из молярного соотношения различных
ионных форм цвиттерлита при данном pH; молярное соотношение ион-
60
Глава 3
ных форм аминокислоты (р) при заданных значениях pH и рК; pH со­
пряженной кислотно-основной пары при выбранном соотношении до­
нора и акцептора протона и данном рК.
Константы протолиза моноаминомонокарбоновых кислот составляют:
(3.4)
К, =
Уравнение баланса имеет следующий вид:
S \ —С ± + с + + с
А
А
А
А
,
(3.5)
где SA - концентрация аминокислоты, определенная аналитическими метода­
ми. Из зависимостей (3.4) и (3.5) получаем уравнения, выражающие концентра­
ции отдельных форм аминокислоты как функции кислотности раствора и кон­
стант протолиза:
А+
с1+к{сн++к{кг
/ ( С н) ;
(3.6)
(3.7)
(3.8)
АСн) =(С>++ -сн++К х • К 2) 1 С н+ .
(3.9)
Необходимо отметить, что группы -СООН аминокислот обладают
большей кислотностью (рК( от 1,7 до 2,6), чем карбоксильные группы
соответствующих карбоновых кислот (рК уксусной и молочной кислот
составляют 4,76 и 3,86). Более высокая кислотность карбоксильной
группы аминокислот объясняется наличием положительного заряда у
+
NH3-группы, который оттягивает электроны от группы -СООН и уси­
ливает ее диссоциацию.
Аминогруппы моноаминомонокарбоновых кислот также обладают
более сильно выраженной основностью, чем аминогруппы соответст­
вующих им алифатических аминов [96, 172]. Важным свойством амино­
кислот является проявление ими буферной емкости, причем pH этих рас­
творов несколько отличается у различных аминокислот [96, 223]. Мак­
симальные значения буферной емкости обнаруживаются при pH, близ­
ких к величинам их рК, т. е. в интервалах pH = 1,3-3,3 и pH = 8,6-10,6.
Значительной буферной емкостью в интервале pH = 6,0-8,0 обладают
только две аминокислоты, а именно гистидин и карнозин, благодаря
протолизу +NH2 имидазольного кольца [95].
Название (код)
Растворимость,
г/100 г H20 при
25 °C
3.1. А м инокислот ы с неполярны ми, незаряж енными полярны м и и заряж енными при p H = 6 -7 R-группам и
Pi
3
297
4
16,6
5
6,11
6
2,35
9,87
неполярная
^СОО
(CHJXH-CH +
NH,
^СОО
C2HSCH(CHJXH +
^NHj
•>COO
(CHJXH-CHfCH +
315
8,8
6,0
2,29
9,72
неполярная
284
4,1
6,04
2,32
9,76
неполярная
287
2,2
6,04
2,33
9,75
неполярная
,,coo~
CHjSfCHJfCHГ +
NH}
283
3,4
5,74
2,28
9,21
неполярная
—
уСОО-
284
3,0
5,91
2,58
9,24
неполярная
'— '
NH3
Структура
2
1
Аланин (Ala)
у.СОО~
т рмл<ш, °c
pK протолиза
pKi
COOH
pKi
+NHj
7
R-rpynna
pK] (pK4)
8
CHfiH +
NH3
Валин (Val)
Изолейцин (iLe)
Лейцин (Leu)
Nw,
Метионин (Met)
Фенилаланин
(Phe)
Продолжение таблицы 3.1
1
Амино-масляная
кислота*
Саркозин*
2
3
292
У СОО
CHfCHfCH
4
5
5,98
6
7
8
неполярная
щ
"f"
_
неполярная
6,00
CHr NH2-CH2-COO
Пролин (Pro)
222
162,3
6,30
2,00
10,60
неполярная
290
25,0
6,20
2,35
9,78
неполярная
228
5,0
5,68
2,21
9,15
незаряженная
полярная
344
0,05
5,63
2,20
10,07
270
36,1
5,82
1,92
9,73
незаряженная
полярная;
9,11
незаряженная
полярная
253
20,5
5,59
2,63
10,43
r “t\ - c o o -
1
Глицин (Gly)
Серии (Ser)
у сО о~
Н -С Н
+
NH,
ХОСТ
HO-CHfChf +
NH3
Тирозин (Туг)
/С О О
уснгсн.
ног \
Оксипролин (Нурго)
r " t\ - c o o -
1
н о '^ - У
Треонин (Thr)
СН3—СН—СН'
J
XT’
NH3
3,4-Диокси-фенилапанин (ДОФА)*
/г \
/ со°
н о - # \ - с н г сн,
У **
НО
ч)щ
3
незаряженная
полярная
незаряженная
полярная
2
1
^СООГ
HOCHfC^ +
\ NH,
а-Метилсерин
сн3 3
Цистеин (Cys)
sC O C T
HS-CH2-CH +
NH3
Цистин (Cys- Cys)
[S-CH2-CH
Аспарагин (AspNH2)
sCOO~
+ ]2
NH3
H //\
s C0°
C—CH2—CH
o'
Глутамин (GI11NH 2)
w //\
,
/ CO°
C - ( C H j 2- C H +
m
у соо
o'
Триптофан (Try)
O^
c NH
7
CH^
Серотонин
° ' O
Гистидин (His)
c r W r '"''
yCOOT
HN----- C—CH2—CH
II II
CH
4 /
НС
NH
Nfc.
NH3
Продолжение таблицы 3.1
3
4
5
6
7
8
незаряженная
полярная
178
о.р.л.
5,05
1,71
10,78
261
0,01
5,02
1,04
10,25
236
2,5
4,38
2,20
9,19
незаряженная
полярная;
8,33
незаряженная
полярная,
2,0
(рК4=8,0)
незаряженная
полярная
4,2
4,40
2,17
9,13
незаряженная
полярная
га
5,88
2,38
9,49
незаряженная
полярная;
11,60
282
заряженная
полярная
277
4,19
7,64
1,77
9,18
заряженная
полярная;
5,92
(рК4= 10,9)
Продолжение таблицы 3.1
2
1
Карнозин
Лизин (Lys)
3
4
5
6
7
8
заряженная
полярная
224
о.р.л.
9,47
2,18
8,95
заряженная
полярная;
10,53
заряженная
полярная
238
15,0
10,76
2,17
9,04
270
0,5
2,98
2,10
10,14
249
0,9
3,08
2,10
9,93
заряженная
полярная;
12,48
заряженная
полярная;
4,18
заряженная
полярная;
4,53
+
/ с° °
HjN—fCHjJj—C—CHj—CH
,
уСОСГ
HjN-fCHJs-CH
Орнитин
Аргинин (Arg)
Аспарагиновая ки­
слота (Asp)
Глутаминовая кисло­
та (Glu)
щ
+
уСОО
HjN—(CHJj—СН
NH,
■f
я /Ч +
/ со°
C-NH-(CHJ3-CH
HjN
NH3
J сосГ
оос—сн,—сн ,
NH,
.сосГ
OOC-fCH^-CH
NH3
Примечание: * - аминокислоты, не встречающиеся в белках
140
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
65
В настоящее время выделено более 80 аминокислот, из них в бел­
ках встречаются в основном 22 разновидности. Каждая кислота содер­
жит характерную R-группу. Существуют различные способы классифи­
кации аминокислот, основанные на природе и структурных особенно­
стях их R-групп. Наиболее рациональный способ учитывает различия в
полярности R-групп аминокислот, которые подразделяются на четыре
основных класса: гидрофобные (или неполярные); полярные, но неза­
ряженные при pH = 6,0-7,0; отрицательно заряженные и положительно
заряженные при pH = 6,0-7,0.
В пределах любого из названных классов R-группы значительно
отличаются по полярности, размерам, структуре (см. табл. 3.1).
В табл. 3.1 амино- и карбоксильные группы представлены в ионизиро­
ванной форме, в которой они находятся при pH = 6-7.
Для аминокислот с гидрофобными R-группами (кроме пролина,
представляющего собой а-иминокислоту) общим признаком является их
низкая растворимость в воде.
Аминокислоты с незаряженными полярными R-группами могут об­
разовывать Н-связи с молекулами воды [222-224], но растворимость их
различна и зависит от структуры радикала. В отличие от моноаминомонокарбоновых кислот аспарагиновая, глутаминовая кислоты, цистин,
цистеин, тирозин, триптофан, ДОФА [96, 222, 225, 226] способны суще­
ствовать в виде двухзарядных анионов, а гистидин, лизин, орнитин, ар­
гинин, карнозин, цистин - в виде двухзарядных катионов за счет прото­
лиза -СООН-группы, фенильного, сульфгидрильного, индольного, имидазольного радикалов и аминогрупп соответственно (рис. 3.1, б).
Данные этого рисунка получены, исходя из представлений полипротонных рановесий [165-167] в зависимости от pH, и несколько отли­
чаются от расчетов А+, А± и А" (катиона, цвиттер-иона, аниона) для моноаминомонокарбоновых кислот (уравнения 3.6-3.9). Для Asp, Glu, Cys,
Туг, Try, к примеру, это можно представить следующим образом:
S.А =СА ++СА +
+СА 4-СА Я
*
[А+] = | | -5А; [А*]Щ Ц
(3.10)
;[А '] = Р2 -SA; [А2 ] = рз -SA;
Ро+Р, +Р?+Рз - ^V
[А*] = /С, -[А+]/[Н+] ;
[А- ] =
К2 [А+]/[Н+]2 ;[А2'] = К} • К2 ■К} [А+]/[Н+]3; (3.11)
I
•*»Н
[Н+]
[Н+]2
В
а » , Н
■
[Н+]3
66
Глава 3
+l2
■ V m
[А +] = ■
{[Н+]3 + К, [Н+]2 + К1 К2 [Н+] + Кг К2 К3} ’
{[Н+]3 +АГ, [ н +]2 + к х- к 2 [H+]+Kt к 2 a:3} = / [ h +] •
(зл з)
Ро =[Н +]3/Л Н +]; р, = К, [Н+]2//[ Н +];
p2= K r* 2 [H+]//[H+];
(3.14)
h = K r K 2 - K3/ f [ H +] .
Система уравнений (3.14) позволяет построить диаграммы состоя­
ния «мольная доля Pi - pH» для моноаминодикарбоновых кислот.
7 2 4
6 8
10 12 14
pH
0
pH
а
___
■Л (
V
Л
1Y
2
«
%
/
/
\
V
О 2 4
, у
6 8
1 » Ч—1
1
10 12 14
pH
1
0.8
0,6
,0.4
0,2
0
О 2 4
в
О 2 4
6 8
д
6 8
10 12 14
pH
г
10 12 14
pH
О 2 4
6 8
10 12 14
pH
е
Рис. 3.1 а. Диаграммы равновесий в растворах аланина ( а ), валина (б),
лейцина (в), фенилаланина (г), пролина ( д ), серина (е):
1, 2, 3 —однозарядный катион, цвиттер-ион и однозарядный анион аминокис­
лот, соответственно
67
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
8 10 12 14
pH
Рис. 3.1 б. Диаграммы равновесий в растворах тирозина (а), триптофана
(б), глутаминовой кислоты (в), лизина (г), гистидина (д):
I, 2, 3, 4, 5 —двухзарядный, однозарядный катионы, цвиттер-ион и одно- и
двухзарядный анионы аминокислот, соответственно
Наличие в молекулах аминокислот при различных значениях pH
ионизированных групп -NH3+; = N H j; -COO"; -О Н '; -O '; -NH2;
-COOH; -S '; -SH и неполярных углеводородных фрагментов в боковых
радикалах приводит к сложной картине гидратации.
Общепринятым является, что при растворении цвиттерлитов в воде
наблюдается электрострикция по причине сильного электростатическо­
го притяжения ионизированными группами молекул воды, в результате
чего происходит их уплотнение. Все аминокислоты как биполярные
соединения обладают большими дипольными моментами [227-234].
Дипольный момент цвиттер-иона аминокислот обычно составляет вели­
чину не меньшую чем 15 дебай. Представляет интерес, что при раство­
рении в воде аминокислот диэлектрическая постоянная D растворителя
увеличивается, причем в определенном интервале концентраций на­
блюдается линейная зависимость «С-D» [235].
68
Глава 3
Данные по измерению теплот ионизации подтверждают различный
характер взаимодействия функциональных групп аминокислот с дипо­
лями воды [229,236-238].
Вычисляя ДЯ из температурного коэффициента констант протоли­
за по уравнению Вант-Гоффа:
ЛЯ = /?Пп — - = -2,303Я Г 2^ ^ ,
дТ
дТ
(3.15)
Лахири и Шакраворти [236, 239] установили, что изменение рК| амино­
кислот при возрастании температуры незначительно, в то время как рК2
заметно уменьшается (например, для валина рК2 смещается от 9,72 до
8,90). Соответственно, вторая ступень диссоциации АК характеризуется
значительно большей теплотой ионизации, чем первая (в случае глици­
на ЛЯ| = 1159 кал/моль; ДЯ2 = 10806 кап/моль). Аналогичный эффект
наблюдается для большинства аминокислот при переходе от водных к
спиртовых растворам. Уменьшение рК2 при этом достигает 1,5-2,3 еди­
ницы при 8 = 20.
Следует отметить, что растворимость аминокислот минимальна в
изоэлектрической области. Добавление кислоты или гидроксида к рас­
твору цвиттерлита ведет к увеличению его растворимости. Раствори­
мость цвиттер-ионов в отдельных случаях может быть увеличена добав­
лением небольших количеств солей [240, 241]. С ростом ионной силы
раствора растворимость аминокислот вначале растет и, достигая макси­
мума, уменьшается. Таким образом, при небольшой ионной силе имеет
место «всаливающий», а при большей - высаливающий эффект. При­
чем, в случае полизарядных ионов высаливающий эффект проявляется
при меньших значениях ионной силы, чем в случае однозарядных ио­
нов. Следовательно, зависимость растворимости цвиттер-ионов при до­
бавлении минеральных солей не может быть описана полностью на ос­
нове теории Дебая-Хюккеля, так как кроме взаимодействия растворите­
ля с добавленными ионами (высаливание) необходимо учитывать взаи­
модействие диполей амфолита с ионами электролита, ведущее к увели­
чению растворимости амфолита (всаливающий фактор) [228,230, 242].
Растворимость аминокислоты увеличивается в присутствии других
аминокислот, пептидов, белков. Это увеличение растворимости может
быть объяснено влиянием биполярных ионов на диэлектрическую по­
стоянную среды [230, 243]. Для характеристики гидратации аминокис­
лот используются различные термодинамические соотношения, которые
поддаются прямому экспериментальному определению (Л (/tj>;
ДЯ°; -AS0; парциальные молярные теплоемкости ЛѰРи ДС°у; коэффи­
циенты изотермической сжимаемости х° '■
>коэффициенты расширения
Ла°; парциальные избыточные объемы Л У0). Исследования термодина­
мических функций водных растворов аминокислот [244-246] показы­
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
69
вают, что свойства их в большей степени определяются длиной и изо­
мерным строением углеводородной цепи и в меньшей степени зависят
от взаимного расположения NH3+ и СОСГ (а, р, у-изомеры), т. е. дипольного конфигурационного момента. В ряде работ [230, 243, 247-250] про­
водится оценка энергетических вкладов гидрофобной части аминокислот
при рассмотрении переноса их из Н20 в D20 или другие растворители,
которые могут имитировать внутреннюю область глобулярного белка или
индуцировать денатурацию пептидов. Нозаки и Танфорд [251] составили
шкалу гидрофобности аминокислот, где A/i характеризует энергию, необ­
ходимую для переноса боковой цепи цвиттерлитов из 100% органическо­
го растворителя (диоксана) в воду при 25 °С (табл. 3.2).
3.2. Шкала гидрофобности боковых цепей аминокислот
Аминокислота
Серии
Треонин
Аланин
Ги с т ИДИН
Метионин
Валин
Лейцин
Тирозин
Фенилаланин
Норлейцин
Триптофан
Д/i, кал/моль
300
400
500
500
1300
1500
1800
2300
2500
2600
3400
Наиболее полное и систематическое исследование по оценке адди­
тивных вкладов на процесс переноса аминокислот в различных раство­
рителях проведено Кабани с сотр. [248-250]. Путем сравнения молекул,
различающихся той или иной функциональной группой, им удалось оце­
нить их вклад в термодинамику переноса. Особого внимания заслужи­
вают эффекты, создаваемые СН2-группой, вводимой между двумя ион­
ными группами для зондирования толщины гидратной оболочки иона.
Интересные данные представлены в работах Спинка и Вадсо [228,
229], которые определили предельные парциальные молярные теплоем­
кости Ср ряда аминокислот и сделали заключение о слабой ассоциации
между цвиттерлитами, близкими по своей гидрофобности к фенилалани­
ну и лейцину, вплоть до почти насыщенных растворов. Это заключение,
однако, мало оправдано, поскольку величины AG ( т 2), которые являются
более точной мерой межмолекулярных эффектов, свидетельствуют о
возможности гидрофобной ассоциации рассматриваемых аминокислот.
Следует заметить, что наряду с гидрофобными и ионными взаимо­
действиями цвиттер-ионов в литературе освещены и вопросы гидрата-
70
Глава 3
ции гидрофильных групп аминокислот [227, 231-234, 242, 248-250].
При этом большинство авторов считает, что если неполярная часть мо­
лекулы аминокислоты укрепляет льдоподобную структуру воды, то их
полярные группы разрушают льдоподобный каркас растворителя.
В ряде случаев для рассмотрения межмолекулярных взаимодейст­
вий в системе «вода-аминокислота» необходимо знание строения функ­
циональных группировок АК: аминогрупп, карбоксильных групп и ра­
дикалов R (табл. 3.3). Следует заметить, что у одних аминокислот ионы
СОО' почти симметричны относительно С-О связей, у других наблюда­
ется заметная стабилизация одной из резонансных форм:
I
.О
,0 '
\//
\//
Степень и направление стабилизации в отдельных случаях можно
объяснить распределением Н-связей относительно двух атомов кисло­
рода. Включение атома кислорода в сильную водородную связь приво­
дит к уменьшению двоесвязанности связи С-О.
В неионизированных СООН-группах резонирующими формами
являются
R—С
R—С
П\ ) Н +
но степень резонанса этих групп незначительна (вклад последней фор­
мы составляет 15-20%). Эти отклонения от кратных связей объясняют­
ся, как и в случае с карбоксильными ионами, наличием Н-ассоциатов.
При образовании сильной Н-связи О-H ...X -Y , связь О-Н как бы
нарушается и возникает некоторая двоесвязанность С-О-группы, в то
время как для связи X-Y степень двоесвязанности может уменьшиться.
Основные структурные данные по строению аминогрупп в аминокисло+
тах (табл. 3.4) свидетельствуют о наличии в них NH3-группировок (за
’+
исключением пролина и оксипролина, имеющих N H 2-группу). Сред­
нее значение длины C-N-связей в цвиттерлитах, равное 1,49 А, увели­
чено по сравнению со стандартом одинарной C -N - группы (1,47 А).
Подобный эффект обычно связывают с некоторым оттягиванием атома
азота тетраэдрически расположенными Н-связями и отрицательно заря­
женными группами соседних молекул.
Соединение
3.3. Структурные параметры для а-карбоксилатных групп
>СН-СОО' и карбоксильных групп >СН-СООН в аминокислотах /222/
Длина
связи
С'-С";
L, A
Валент­
ный угол
C'O'O";
град.
2
Ala*
1,536
4
125,4
Ser*
1,528
125,3
Pro*
1,520
120,0
Туг*
1,542
123,0
Glu*
1,550
127,0
Lys*
1,529
125,5
His*
1,520
125,8
Val*
1,500
121,0
1
Длина
связей
С'-С1;
С'-С";
L, А
5
1,273
1,211
1,261
1,268
1,280
1,260
1,256
1,228
1.270
1,240
1,250
1,246
1,240
1,265
1,350
1,230
Степень двоесвязанности
и вычисленные теорети­
чески длины связей при
стандартах
Lc-o= 1,425 А
L o o = 1,205 А
А
%
7
6
1,296
32
68
1,239
1,257
52
1,264
48
47
53
45
55
1,260
1,238
1,270
1,250
Степень двоесвя­
Валентные занности и вычис­
углы
ленные теоретиче­
ски валентные
О'-С'-С";
Oi'-C'-C";
углы
О'-С'-С"; 0 ||-С|-См
град.
град.
%
8
113,2
121,3
117,2
117,4
119,0
121,0
114,2
117,6
115.0
117,0
116,8
117,7
120,0
114,2
112,0
127,0
9
24
76
49
51
47
53
45
55
10
113,3
121,4
117,2
117,5
116,0
118,3
116,5
118,0
Ен...о»
кДж
моль
И
31,5
18,9
29,4
29,4
27,3
21,0
33,6
27,3
37,8
29,4
28,6
26,0
29,9
25,1
Длина
Н-связей,
А'"*
12
2,67
2,94
3,00
2,56
2,82
2,54"
2,67
2,71
2,80*’
2,63
2,745
Продолжение таблицы 3.3
Val
1
2
1,490
4
116,0
Leu
1,580
125,2
Phe
1,500
124,0
Туг-HCI
1,510
121,0
Glu
1,570
130,0
GlurHCl
1,510
124,0
Glu„HCl
1,540
125,0
HisHCI
1,530
123,8
5
1,300
1,270
1,420
1,190
1,340
1,170
1,270
1,265
1,240
1,190
1,310
1,210
1,320
1,200
1,210
1,259
6
7
95
1,19
20
80
15
85
1,30
1,20
1,32
1,20
8
121,0
123,0
130,4
103,8
109.0
127.0
122,0
118,0
108,0
122.0
114.0
123.0
112,0
124,0
Примечание:
>С' Н-С'О О11- обозначения атомов в карбоксилатной группе;
Н-связь «вода-вода» для лизина;«СОО-...НООС» для глутаминовой кислоты;
*** стандарты для групп -СООН: Lc.0 = 1,395 А ; Lc-o = 1,185 А;
стандарты для карбоксильных групп -СООН... ОН2
9
10
11
12
3,19
5
95
20
80
15
85
110
134
113
122
112
123
37,8
10,5
37,8
12,6
37,8
2,57
35,1
26,9
2,59
2,80
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
73
Общим для всех а-цвиттерлитов является образование водородных
связей между амино- и карбоксильными группами. Причем, для моноаминомонокарбоновых (валин, лейцин) и ароматических кислот без
других активных групп в R-радикале (фенилаланин) структурообразование по Н-связям идет исключительно между вышеназванными груп­
пами. В этом случае возникают двумерные сетки водородных связей, а
структура такого типа имеет сложный характер; между двойными слоя­
ми действуют слабые силы Ван-дер-Ваальса. В структурах аминокис­
лот, которые имеют дополнительные группировки, способные к образо­
ванию Н-связей, независимо от размера молекул, действуют пронизы­
вающие весь каркас трехмерные сетки водородных ассоциатов. Заслу­
живает внимания тот факт, что в формировании таких трехмерных
структур цвиттерлитов участвуют и молекулы воды (табл. 3.4).
Наряду с термодинамическими исследованиями, гидратация цвит­
терлитов успешно изучалась различными физико-химическими метода­
ми (УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопия, диэлектрическая релаксация, ульт­
развуковая интерферометрия). Изучение самодиффузии [252, 253], ди­
электрических [231-233] и интерферометрических свойств в условиях
изменения температуры [254] позволило авторам исследований выде­
лить в растворах аминокислот три типа гидратации: ионных, гидрофоб­
ных и гидрофильных групп. Причем прочность связывания молекул
воды группами NH2, *NH3, COO", СООН, ОН, SH велика и в ряде случа­
ев превышает энергию связи Н20 ...Н 20 . Гусев с сотр. [231—233] пред­
полагает вероятность существования в растворах глицина, аланина, валина, норвалина, изолейцина, лизина, гистидина, аргинина трех облас­
тей, ориентационная подвижность молекул воды в которых различна.
В первом гидратном слое молекулы воды сильно связаны, мало­
подвижны и их диэлектрическая константа падает до 2,2. Количество
молекул воды в этом слое невелико и колеблется от 2 (аланин, глицин)
до 4,8—5,3 (лизин, гистидин). Во втором слое вода разупорядочена, а
Н-связи ослаблены. За слоем разупорядоченной воды следует вода с
неизменной структурой. Для растворов пролина и оксипролина [232]
авторы предполагают мономолекулярную гидратацию, когда за гидратным слоем следует слой обычного растворителя.
Одной из количественных характеристик являются числа гидратации
аминокислот. Однако, полученные различными методами эти числа отли­
чаются между собой [191, 231-233, 252, 253, 255], так как учитывают раз­
личные координационные оболочки. Наиболее полные данные по этому
вопросу представлены Сидоровой [191] и Гусевым [231—233], которые
установили независимость (в пределах точности эксперимента) чисел гид­
ратации в первом гидратном слое от температуры в интервале 20-50 °С и
от концентрации в интервале значений 0,2—1,4 моля аминокислоты. В то
же время с увеличением pH среды от 1 до 12 наблюдается рост гидратационных чисел (п) цвиттерлитов в первой гидратной оболочке (табл. 3.5).
Глава 3
74
3.4. Структурные особенности для а-аминогрупп ( =C,,-H -+NH3)
в аминокислотах \222\
Отклонение
Длина Валент­ связи С11связи
ный
>1Нз
Соедине­
угол от плоскости
C11ние • ^ Н 3; c'-c"СООН
L, A
"NH,.
(СОО-), А
град.
А град.
0,390
Длина Н-связей, А
и
О
01
X
Z
Ь я
& .°:
ч “
X|
Z &
Z 6
Ala
1,496
108,3
ValHCl
1,490
105,0
2,97
ValHCl•Н20
LeuHBrН20
Phe-HCl
1,490
108,0
2,87
1,580
103,5
2,82
1,480
106,0
0,058
2
Pro
1,530
107,4
0,230
2
Ser
1,491
110,0
Tyr-HCl
1,480
108,0
компланарна 2,81
2,87
0,71
2,79
Try
Gly
Gly-HCl
1,470
1,450
1,520
112,0
109,0
111,0
15
X
а
О
X
Z
2,80
2,84
2,88
3,06
3,30
2,69
2,71
2,79
3,20
3,38
3,17
3,26
3,26
3,41
3,13
3,23
3,01
2,90
3.31
3.32
2,89 3,18
2,86
2,92
2,94
1,484
3,22 2,81
109,7 0,446
2,79
LysHCl3,17
1,480* 110,9
2,89
•2H20
3,35
2,74 2,81 3,21 2,81
1,495
109,4
Hys-HCl
2,82** 2,85**
Примечание: * е-аминогруппа; атом азота имидазольного цикла
0,99
0,44
43
18
СГ...НО
(в спир­
тов. или
СООН
группах)
3,17
3,17
2,94
3,11
3,06
3,22
3,25
3,186
Исследуя гидратацию аминокислотных остатков, Булл [256] при­
шел к выводу, что существует соотношение между количеством связан­
ной воды и характером гидратируемой группы. Гидрофильные группы
были разделены автором на четыре класса: алифатические (серин, трео­
нин) и ароматические (тирозин, ДОФА) гидроксилы; группа карбоксила
(глутаминовая, аспарагиновая кислоты); основные группы (аргинин,
75
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
лизин, гистидин, а-аминогруппа); амидная группировка (аспарагин, глу­
тамин). Гидроксипьные, карбоксильные и основные группы ассоцииру­
ют около 6 молей воды на 1 моль остатка. Амиды, по мнению Булла, не
только не присоединяют воду, но, по всей вероятности, препятствуют
связыванию воды другими полярными группами.
3.5. Числа гидратации аминокислот при различных значениях pH
растворов [191\
Аминокислота
Аланин
pH
4,15
6,40
8,55
9,00
11,65
п
0,5
1,3
2,6
2,8
4,5
Аминокислота
Пролин
pH
2,30
2,95
6,70
9,50
10,85
п
0,8
1,0
1,6
2,3
3,7
Влияние природы боковых радикалов аминокислот на воду, а также
зарядности их ионов было изучено в работах [257, 261] на основании
измерений вязкости, плотности и ИК-спектров растворов. Высокие зна­
чения динамической вязкости rjs растворов валина, глицина, фенилала­
нина в анионной форме (Лд-) по сравнению с катионной (г|А^) и биполяр­
ной ( tja*) формой указывают на сильное упрочнение структуры воды А".
Различие между катионами и анионами во взаимодействии с моле­
кулами воды объясняется особенностями структуры растворителя.
В одной из вершин треугольника, образованного атомами дипольной
молекулы, расположен атом кислорода, который, благодаря притяжению
электронов ковалентной связи, является отрицательным полюсом диполя.
В двух других вершинах треугольника находятся атомы водорода,
центр тяжести которых является положительным полюсом. Структура
двух полюсов диполя воды неодинакова. Молекула воды поворачивает­
ся в результате гидратации своими полюсами к ионам АК, отсюда раз­
личное влияние типов ионов на структуру воды. Одновременное при­
сутствие противоположных зарядов в биполярном ионе делает его уни­
кальной системой, что видно из уменьшения вязкости по сравнению с
другими ионными формами. Положительный заряд на ^ЫНз-группе
уменьшает отрицательный заряд на другом конце иона, приводя к
уменьшению вязкости (исключением является глицин: вязкость раство­
ра, содержащего катион, максимальна, что объясняется способностью
образовывать димеры катион-катион).
В ряду Gly, Ala, Val, iLe, Leu, Phe наибольшие значения вязкости
характерны для растворов фенилаланина, а минимальные - для глицина.
Глицин выступает как вещество, разрушающее структуру Н-связей в
76
Глава 3
воде и создающее область низкой вязкости. Фенилаланин упорядочи­
ван и е влияет на структуру воды за счет наличия гидрофобного бензоль­
ного кольца. Наличие гидрофобной части вблизи тетраэдрически связан­
ных молекул воды приводит к снижению энергии Ван-дер-Ваальсовой
связи, ориентированной по отношению к растворенной молекуле, что
стабилизирует тетраэдрически связанное размещение, т. е. структура
воды упрочняется. Основываясь на критерии В/У^ [(5 - коэффициент
уравнения Джонса-Дола (дм3/моль) для водных растворов АК; У° - ка­
жущиеся молярные объемы аминокислот (см3/моль)] глицин (4,2), ала­
нин (4,7), валин (4,8), изолейцин (5,2), лейцин (5,2), фенилаланин (7,2),
все они относятся к классу «гидратированных», имеющих первичную
гидратную оболочку.
По дифференциальным ИК-спектрам Сидоровой [191] определены
«разностные» числа гидратации второй гидратной оболочки (Ал), кото­
рые показывают, на сколько молекул Н20 больше связано в оболочке
одной АК по сравнению с другой. В табл. 3.6 приведены значения Ап
при pH < pi, пересчитанные относительно глицина, занимающего осо­
бое место среди аминокислот по строению бокового радикала. Установ­
лено возрастание абсолютных значений чисел гидратации второго слоя
АК при увеличении pH > pi и неизменность их при pH < pi. При темпе­
ратуре 20 °С структурирующее действие на воду аланина, валина, трео­
нина, серина возрастает с уменьшением pH ниже pi в отличие от глици­
на и пролина. При понижении температуры от 20 до 0 °С в кислой среде
возрастает структурирующее действие на Н20 аланина, валина, глута­
миновой кислоты по сравнению с глицином.
3.6. «Разностные» числа гидратации второго гидратного слоя
аминокислот \191\
Аминокислота
ГИСТ ИДИН
Лейцин
Глицин
Серии
Ап
-3,4
-3,2
0
0,6
Аминокислота
Цистеин
Аланин
Валин
Пролин
Ап
Аминокислота
1,9 Фенилаланин
2,0 DL-треонин
2,0 Лизин
2,6
Ап
2,6
4,0
7,8
Заслуживает внимания факт вращения молекул АК в растворах как
единого целого [231-233] во внешнем электрическом поле. Наиболее
вероятным является вращение гистидина, лизина, аргинина (эллипсо­
видная форма) вокруг большой оси.
ИК-спектры водных растворов АК состоят из максимумов погло­
щения атомных группировок цвиттерлита и воды, причем параметры
максимумов несут определенную информацию о характере гидратации.
При рассмотрении ИК-спектров необходимо учитывать ионное состоя-
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
77
ние аминокислот в растворе [170-186, 261, 283]. Для катионов амино­
кислот характерна полоса поглощения 3130-3030 см-1, обусловленная
колебаниями группы *NH3 (асимметричные колебания) (рис. 3.2, 3.3).
Валентные симметричные колебания группы *>Шз появляются в интер­
вале 3000-2000 см- . Максимумы в интервале 1660-1610 и 1550-1485 см"1
характеризуют деформационные колебания (асимметричные и симмет­
ричные соответственно) ^Нз-группировок.
В биполярных ионах, наряду с колебаниями ^ЫНз-группы, прояв­
ляются колебания ионного карбоксила в области 1660-1550 и 1400 см-1
(антисимметричные и симметричные валентные колебания СОО-). Кро­
ме того, в интервале 2700-2530 см-1 проявляется поглощение в виде
широких размытых полос за счет -СОО-, ассоциированных с амино­
группами или молекулами Н20 (рис. 3.2, 3.3 и табл. 3.7-3.9). Слабые
колебания ионного карбоксила проявляются также при 2140-2080 см- .
Для катионов АК* в интервале 1754-1690 см-1 характерно поглоще­
ние С=0 в недиссоциированных СООН-группах. При 2760-2730 см-1 име­
ется слабое поглощение за счет колебаний -ОН в СООН. Анионы амино­
кислот, помимо колебаний ионного карбоксила (проявляющегося и в би­
полярных ионах), обусловливают поглощение в области 3370-3500 см-1
(v колебания ассоциированных NH2 групп).
Изучение гидратации ионов аминокислот показало, что в ИК-спектрах (наряду с максимумами при 3700-3190 см"') наблюдаются также ши­
рокие полосы в интервале 2400-2290 см-1, которые могут быть отнесены
к колебаниям СОО" или СООН-групп, ассоциированных Н-связями с
Н20 . Наблюдаемый большой сдвиг частоты от 3700 см- (свободная
ОН-группа в Н20 ) до 2350 см-1 указывает на то, что Н-связи в рассматри­
ваемом случае сильны и энергия их составляет 125-130 кДж/моль.
Следует учитывать не только взаимодействия растворителя с *NH3 и
СОО--группами в a-группировке АК, но и с боковым радикалом. Механизм
взаимодействия гидрофильного радикала с водой может носить солевой
характер или идти с образованием Н-связей (рис. 3.3, табл. 3.7-3.9). Нали­
чие гидрофобного радикала (аланин, валин, лейцин, фенилаланин) услож­
няет наблюдаемое явление тем, что подвижность молекул воды в результа­
те гидрофобного влияния снижается, а структура Н20 упрочняется.
Характеризуя спектральные свойства цвиттер-ионов, следует отме­
тить, что заметным поглощением в УФ-области обладает тирозин, трип­
тофан (276 нм), фенилаланин (256 нм), цистин (240 нм) в виде биполяр­
ных ионов, что было использовано для удобного и быстрого способа их
определения в рабочих растворах [96, 275, 282]. Изменение pH среды в
ряде случаев приводит к смещению максимумов [275,276,282,285].
78
Глава 3
А ?340\
' \3392
Рис. 3.2. ИК-спектры валина в формах Val+(/), Val* (2), Val" (5);
глутаминовой кислоты Glu+ (4), Glu* (5), Glu- (б) и Glu2- (7)
79
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
3600 2800
1600
1200
800
,
U , СД7
-1
Рис. 3.3. ИК-спектры лизина в формах:
Lys2* (I), Lys+ (2), Lys* (3) и Lys" (4)
Характерные реакции аминокислот - те реакции, в которых прини­
мают участие а-карбоксильные, а-аминогруппы, а также функциональ­
ные группы их боковых цепей. а-СООН группы всех а-аминокислот мо­
гут вступать в хорошо известные реакции с образованием амидов, слож­
ных эфиров и ацильных производных галогенов [95, 96]. Выделим реак­
ции, которые могут иметь место в процессах, способствующих меланоидинообразованию.
Если АК обработать избытком соляной кислоты в спирте, то бипо­
лярный ион превращается в катион, который вступает в реакцию этерификации, катализируемую кислотой:
Н3+N-CHR-COCT
HjN-CHR-COOH
* "С! • H j N-CHR-COOC j H j + Н20
с£
>
80
Глава 3
3.7. Отнесение колебаний для различных ионных форм валина,
характерных для системы А...В (А - донор; В - акцептор
протона; расчет колебаний по Ra...b проводился по [186,222])
Ион
УаГ
Val*
Val"
R
a .. . b ;
Л
2,97
2,80
3,20
3,38
2,80
2,78
2,63
2,56
3,01
3,12
2,97
2,75
2,54
2,80
2,59
2,54
3,13
3,07
2,82
2,80
2,77
„ см"1
эксперимент, °С
50
25
105
3433
3453
3413
3355
3363
3353
3026
3039
3080
3140
3120
3120
3507
3520
3505
3453
3413
3433
2587
2560
2533
2347
2320
2333
3080
3026
3039
3355
3353
3320
Отсутствует
3388
Отсутствует
3280
3145
3118
3125
Отсутствует
2587
2630
2598
2340
2337
2323
Отсутствует
3547
3392
3407
3406
3112
3147
3172
Отсутствует
3547
3407
3392
3366
2587
2630
2606
2353
2336
2347
V
Система
А...В
расчет
*N-H...OH2
^ -« ...о с -о н
V -Н...СГ
+N-H...C1-
но-н...он2
соо-н...он2
c o o - h ... o h 2
соо-н...он2
СОО-Н...СГ
СОО-Н...СГ
1м-н...он2
Тм-н...о=с-о*
^-н..._о-с=о
н-о-н...он2
н-о-н...о=с-о~
н-о-н...о-с=о
n - h ... o h 2
N-H...'OOC
HO-H...NH2
-
но-н...он2
но-н... о-с=о
но-н... _о-с=о
2,54
Н 0-Н ...‘0 = с-0
3418
3336
3065
3130
3523
3434
2670
2358
2910
3280
3418
3298
3182
3523
2593
2371
3506
3408
3170
3523
3390
2371
Эти эфиры чувствительны к омылению в водных растворах и кон­
денсируются друг с другом с образованием 2,5-дикетопиперазинов:
L
-2 •С2Н5ОН
/
СН —СО
N
2-H3 N-CHR-COOC2H5 ------------ - H N ^
о н
Н ,0
II I
---------- -- С1 • Н3 N-CHR-C-N-CHR-COOH
(НО)
дипептид
NH
СО “ СН
I
R
Ион
V al+
Val*
V a l'
Т,°С
Карбоксильная
группа
Вода
Аминогруппа
»с-о в
«С-0 в
«AS
»s
СООН
СООН
СОО
СОО"
105
1720
1100
-
-
50
1742
1093
—
25
1733
1107
105
50
25
—
•—
—
—
—
105
—
50
25
и
и
nh2
&AS
1ЧНз
6s
1NH3
3140
—
1573
1487
—
—
—
3120
—
1580
1500
—
—
—
—
3120
—
1586
1512
—
—
1396
1400
1412
3108
3115
3125
1608
1616
1619
1493
1507
1521
-
-
-
—
1578
1586
1593
—
—
1562
1395
—
—
—
1626
1513
—
—
1580
1400
—
—
—
1627,
1634
1526
—
— \
1584
1406
—
—
—
-
—
3113
3080
3147
3040
3172
3027
б AS
2
nh
6s
nh
2
—
1535
«он
бон
3507, 3413, 3355,
2587, 2347
3520, 3433, 3353,
2660, 2333
3505, 3453, 3320,
2533;2320
2598,2340
2587, 2327
3388, 3236, 2560,
2293
3392, 2630, 2336
1652
3407, 3366, 2606,
2347
3547, 3306, 2587,
2353
1640
1624
1613
1636
1627
1620
1652
—
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
3.8. Частоты колебаний функциональных групп в валине при различных температурах термостатирования
00
82
Глава 3
3.9. Характеристические частоты поглощения различных ионов
тирозина
Волновое число, и, см"1
Туг+ Туг*
ТугТуг23600 3560
3342
3411
3227 3227 3227
3227
3200 3206 3216
3148 3158
3146
3186
3009 3020 3018
3036
2906 2897 2897
2897
2730
-
-
-
-
2560
2700
2422
2360
2067
2587
2700
2467
2480
2067
-
-
2587
2700
2467
2480
2067
-
1547
1610
1601
1587
1547
1621
1601
1587
1547
1527
1507
1527
-
-
-
-
1443
1414
1414
1376
1336
1241
1414
1376
1337
1241
1241
1147
1094
987
894
867
734
641
574
521
494
1147
1094
979
894
867
734
641
574
521
494
1147
1094
894
867
734
641
574
494
2467
1720
1607
1601
-
1346
1241
1147
1094
997
894
867
-I
574
521
1601
1587
1547
- :
1358
-
Отнесение полос
Валентные колебания свободных ОН воды
и ОН.. ."ООС; а также и NH2 (свободной группы)
ион ароматического радикала
ион--- ООС
и H3*N или и NH2
Валентные СН в ароматическом цикле
Os метильной группы, присоед. к бензольному
кольцу
ОН в группах СООН (или Н2О...НО-фенольного
радикала)
он2...~о-с=о
ОН2...ОН-фенольного радикала
^ Н з .."ООС (или NH2..."OOC)
^ЫНз .-ООС (или NH2..."OOC)
он2...о-с=о
ис=о в недиссоциированных СООН
8as ^ Н 3 в цвиттер-ионах и катионах
С=С в ароматическом кольце
uAS СОО"
5s ^ЫНз (в катионе, цвиттер-ионе, Туг")
5 NH2 в Туг26S *NH3
ионизированный фенольный радикал
8 ОН в арильных радикалах фенолов
Us СОО"
8 ОН в фенольных радикалах
С-О в карбоксильных группах
(и 5 СН в арилах)
иas CCN
8 СН в арильном кольце
маятниковые NH3; о СН
us CCN
8 СН в ароматическом кольце
8 СОО"
8 СОО"
колебания СН в 1,4-замещенном кольце бензола
8он в фенольных радикалах; (крутильные *NH3)
рк СОО"
83
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
а-Аминогруппы АК реагируют с альдегидами с образованием
Шиффовых оснований:
R
Ш2
I
I
С—Н + Н—С—Н
H,0+RCH=N-CHR-C00H
II
I
О
СООН
Основания Шиффа являются промежуточными продуктами в неко­
торых ферментативных реакциях.
Аминокислоты вступают также в реакции, типичные для функцио­
нальных группировок, присутствующих в их R-группах. Например, для
SH-группы цистеина характерна реакция с образованием цистина:
СООН
-2Н *
2 •h 2n —c h -c h 2-s -h — ^ h 2n —c h -c h 2-s - s -c h 2—c h 2—c h -n h 2
СООН
СООН
Дисульфидные группы образуют в белках поперечные связи. Эта
реакция катализируется Fe3+.
Тирозин гидроксилируется до диоксифенилаланина (ДОФА), кото­
рый может декарбоксилироваться с образованием «ДОФА»-амина:
НО\
—
н о —0
СООН
/
е н —СН
NH2
но
ДОФА .
\
но
НО—<'
о
—СН—CH,NH,
') —СН,—CH,NH,
Тирамин
«ДОФА»-амин превращается в адреналин, при окислении которого
получается хинон (адренохинон), легко полимеризующийся с образова­
нием высокомолекулярного коричневого пигмента:
Глава 3
84
НО
НО—^
НО^
^ —СН2—СН2—n h 2
НО—^ ~ у - с н 2—c h 2—n h 2— -
но
Qv -
адреналин
| ^ | --- сн-он
J
адренохром
|
О'
СНз
Аминокислоты особым образом взаимодействуют с ионами метал­
лов. С двухвалентной медью получаются комплексы темно-синего цвета:
+
Си(ОН)2 + 2 • F^N-CHR-COO »
СОО~
|
\
RHC
у
\ /
NKb
н 2к
X CHR
/
\
\
+ 2Н20
ООС
В таких комплексах центральный атом и связанные с ним группы
расположены в одной плоскости [85, 284]. Комплексы аминокислот с ио­
нами переходных металлов могут стабилизироваться и при участии функ­
циональных групп R-радикалов (например, с цистеином и гистидином):
Н2С__
р - - ... j' ^ с н а х г
ш сн о ^Ч
h 2c x s
/
Zn
I 2
N <^
H > ^ HC0° '
N> ^ NH2
nh2
~OOCHC\ J 1CH2
*
Одной из наиболее характерных реакций а-аминогруппы является нингидриновая реакция. При нагревании 1 эквивалента аминокислоты с двумя
эквивалентами нингидрина образуется интенсивно окрашенный в синий
цвет продукт (для пролина и оксипролина - желтое окрашивание):
о о ~ с о
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
85
3.1.2. Моносахариды (альдозы)
Моносахариды по своей химической природе являются полигидр
оксиальдегидами или полигидроксикетонами, в которых карбонильная
фуппа расположена рядом с гидроксилом (первые называются апьдозами, вторые —кетозами). По числу содержащихся кислородных атомов
моносахариды подразделяются на триозы, тетрозы, пентозы, гексозы
[95, 96]. В природе среди альдоз наиболее широко распространена глю­
коза, а из кетоз - фруктоза. Моносахариды принимают участие в обра­
зовании ди-, олиго- и полисахаридов (тростниковый сахар, молочный
сахар, крахмал, целлюлоза). Количество полисахаридов превышает ко­
личество всех остальных органических веществ в природе.
Одним из источников моносахаридов являются гликозиды, пред­
ставляющие собой продукты взаимодействия сахаров с различными дру­
гими веществами (спиртами, фенолами и др.) по полуацетальному (гликозидному) гидроксилу. Такие соединения чрезвычайно распространены
в растительном мире (синие и красные красящие вещества цветов и ягод;
амигдалин, гликозиды наперстянки, антоциановые красители, относя­
щиеся к красителям флавоноидных рядов). Следующим источником мо­
носахаридов являются дубильные вещества типа таннинов, в которых
спиртовые гидроксилы этерифицированы ароматическими гидроксикарбоновыми кислотами (галловой и дигалловой) [95, 96].
Моносахариды являются нейтральными соединениями, легко рас­
творимыми в воде и трудно растворимыми в спирте. Каждый моносаха­
рид может существовать в формах а- и p-аномеров. Это объясняется
тем, что альдозы существуют не в виде альдегидов с открытой цепью, а
в виде циклических полуацетальных форм [62]:
СН2ОН-СНОН-СНОН-СНОН-СНОН-СНС
альдегидная форма
О
циклическая полуацетальная форма
Переход линейных молекул моносахаридов в циклические приво­
дит к образованию нового асимметрического атома углерода, обозна­
ченного на приведенной выше схеме звездочкой. Таутомерные превра­
щения между а- и Р-сахарами:
86
Глава 3
I---------------U ---------------1
CtLOH-CH-CHOH-CHOH-CHOH-C— H
I
OH
I
0
1
-=rCH,OH-CH-CHOH-CHOH-CHOH-C—H
I
OH
приводит к мутаротации - изменению угла вращения плоскополяризованного света.
Обычно в водном растворе в состоянии равновесия находятся не­
сколько модификаций моносахарида. Соотношение между компонента­
ми (на примере глюкозы) зависит от скорости превращений, происхо­
дящих под влиянием температуры, pH среды, примесей и других факто­
ров. Гексозы, имеющие форму пирана (пиранозы), как правило, более
устойчивы в растворах, чем сахара с кольцом фурана (фуранозы) [62].
У D-глюкозы наиболее устойчив Р-аномер (P-D-глюкопираноза).
В равновесном состоянии в водном растворе по данным метода ЯМР 13С
содержание p-пиранозы - 60,9%, а-пиранозы - 38,8%, в форме р-фуранозы - 0,14%, а-фуранозы - 0,15%, гидрата открытой линейной формы
содержится 0,0045%.
D-Фруктоза в водных средах, в отличие от глюкозы, образует
предпочтительно фуранозные аномерные формы (а- и P-D-фруктофураноза) и имеет большую склонность к раскрытию цикла, что является
причиной ее высокой реакционной способности.
Ниже на схеме приведены возможные таутомерные превращения
глюкозы в водном растворе:
87
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
Н
\ с/
,о
н—с—он
I
сн,он
СН2ОН
но—с—н
I
н—с —он
I
н—с —он
I
НО
н—с —он
ОН
Ь-пираноза
А
Оксоформа
ч
но—с—он
I
н—с —он
I
но—с—н
I
н—с—он
I
н—с—он
I
н—с —он
А
Гидратная форма
II
но-сн
но-сн
н
он
о
НО-СН
ОН
II
1 он
он
а-фураноза
с—он
I
он—с—н
I
н—с —он
ОН
Ь-фураноза
I
н—с —он
I
н—с —он
i
Енольная форма
Наибольшее внимание исследователей привлекает реакционное
поле у гликозидного центра сахаров. Многообразные события, которые
ограничены небольшим количеством атомов, определяют распад и об­
разование гликозидных связей - структурного элемента, повсеместно
88
Глава 3
распространенного в углеводсодержащих природных биополимерах и в
полисахаридных материалах [1, 19-62, 197-221].
Для О-гликозидов характерна сильная неэквивалентность двух алкоксильных заместителей при гликозидном центре (в отличие от обыч­
ных ацеталей, образующихся при конденсации двух молей спирта с кар­
бонильными соединениями и являющихся симметричными системами):
С ,Н ,„ ,С Н О + 2 ■C!H sO H ^ S ^ C „ H !„,C H (O C I Hs)2 .
Один из заместителей при О-гликозидном центре включен в цик­
лическую систему, а другой находится вне цикла и реакционно значи­
тельно активнее первого.
Превращения моносахаридов под действием кислот и оснований один из основных этапов в процессах меланоидинообразования. Первой
стадией превращений моносахаридов, катализируемой основаниями и
кислотами, является енолизация:
сн=о+н+
СН-ОН
I
Н -=
гтX
X
С—ОН ;
н-
tV
R
-он
R
НЯ СН=Ю
№ о н
СН-Оч
в
-он
нR
Ь
;н
-он
нR
Образовавшийся енол способен реагировать в нескольких направ­
лениях:
1) Отщепление молекул воды с образованием 3-дезоксигликозулозы:
С Н -Ъ -Н
Г
( с 11
-о н
с н -'о н Т н
сн=о
с!-он
IСН
+ OH
сн=о
i=o
СН,
I
R
3-дезоксигликозулозы в кислой среде в дальнейшем превращаются
в производные фурана; в щелочной среде - в метасахариновые кислоты:
89
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
НО—СН
■ I
V
СН
CHOH
НС—СН
-CHO;
I нон
СНОН
НО—С—СН
НО—С—СН,
о
Т—
ООН
&
Лактон
сахариновой
Сахарная
кислота
Оксиметилфурфурол
2)
Переход в карбонильную форму с образованием исходной альдозы, ее эпимера по С2 и кетозы:
сн=о
■он
-он
СНОН
I
СН2ОН
с—он
-он
с=о .
-ОН
R
R
R
ч
сн=о
но-он
-он
R
(реакция Лобри-де-Брюина и Альбера-ван-Экенштейна). Так, из
D-глюкозы образуется дополнительно D-манноза и D-фруктоза [62, 95].
3)
Разрыв углерод-углеродной связи и превращение в оксикарбонильные соединения с меньшим числом углеродных атомов:
;н2он
НО—Н
|СН—ОН
Чс—он
-R-CHO
______
(«СН—OH
+R-CHO
i
СН-О—н
R
ОН'
СН,он
с—он
II! 1
СН—он
х>
/
\
:н2он
:н2он
:н—он
:н=он
Ретраальдольное расщепление наблюдается преимущественно в
щелочной среде.
4)
Превращение 1,2-ендиолов в 2,3-ендиол, т. е. перемещение
двойной связи вдоль углеродной цепи (в основном в щелочной среде):
Глава 3
90
Н
Превращения могут проходить одновременно, и связаны с разры­
вом одной из связей при С3.
Дальнейшие превращения первичных веществ, возникающих при
действии кислот и оснований на восстанавливающие сахара, протекают
по-разному. Конечный результат реакции зависит от природы исполь­
зуемых кислот и оснований, их концентрации и температуры среды.
Вопрос о кислотно-катализируемом гидролизе поли- и олигосаха­
ридов, приводящем к появлению моносахаридов, изучен достаточно
подробно и детально описан в фундаментальных работах Н.К. Кочетко­
ва с сотр. [62].
1.
Наибольшее влияние на скорость кислотно-катализируемог
гидролиза в ряду изомерных сахаров оказывает размер цикла. Так, фуранозиды гидролизуются примерно на два порядка быстрее, чем пиранозиды. Например, для а-метил-О-маннозидов
СН2ОН
(при 95 °С и 0,01 М НС1) константы скорости составляют для пиранозида 0,38Т0-5 сек-1, а для фуранозида - 57,5T0-S с-1. Кроме того, энтропия
активации для пиранозидов положительна (+10) - (+20) э.е., а для фуранозидов отрицательна (-9 э.е.).
2.
Конфигурация асимметрических центров в углеводном остатке
пиранозидов (в ряду изомерных альдозидов) значительно влияет на ско­
рость кислотного гидролиза. Пиранозный цикл моносахаридов, как из­
вестно, не является плоским, наиболее выгодной является креслообраз­
ная конформация, заместители могут находиться в аксиальном (перпен­
дикулярном двум плоскостям, между которыми размещено «кресло»
цикла) и в экваториальном (в одной из этих плоскостей) положении:
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
91
Появление аксиальных заместителей в пиранозном кольце приво­
дит к увеличению скорости гидролиза (для a-D-ксило-, Р-а-арабино-,
P-D-ксило-, a-L-арабинометил-пентопиранозидов в 0,5 М HCI при 75 °С
скорость гидролиза составляет соответственно 1,0; 2,0; 2,02; 2,91). Объ­
яснение подобной зависимости связано с протонированием гликозидного атома кислорода и образованием оксониевого иона:
R
быстро
медленно
быстро
Образование гликозил-катиона приводит к более плоской структуре
пиранозного цикла, снижению в молекуле напряженности, вызванной
1,3-взаимодействием аксиальных заместителей [62]. Отсюда следует, что
любые факторы, тормозящие вращение вокруг указанных связей возле
асимметрических центров в пиранозном цикле, будут снижать наблюдае­
мую скорость гидролиза. Поэтому заторможенность вращения при введе­
нии объемных заместителей в гликозиды (как в моно-, так и в олигосаха­
риды) ведет к уменьшению скорости гидролиза гликозидных связей. Гидролиз гликозидных связей звеньев, расположенных внутри полисахарид­
ной цепи, замедлен по сравнению со звеньями концов полисахаридов.
3.
Влияние индукционного эффекта заместителей в углеводном ос­
татке (рядом с гликозидным центром) на скорость кислотного гидролиза
особенно заметно на примере 2-дезоксиальдоз и гликозидов аминосахаров.
Высокая устойчивость к гидролизу гликозидов аминосахаров связана с тем,
что в присутствии кислоты возникает положительный заряд, дестабилизи­
рующий интермедиаты, оказывающиеся в этом случае двухзарядными:
H \+ /R
-?
т»
NH3
NH}
В 2-дезоксиальдозах, напротив, отсутствует индукционный эффект
гидроксильной группы при С2, и за счет понижения электронной плот­
ности на гликозидном центре затрудняется образование оксониевого
катиона и дестабилизируются гликозил-катионы:
92
Глава 3
В зависимости от строения моносахаридного остатка скорость ки­
слотного гидролиза падает в ряду: 2-дезоксиальдоза > пентоза > гексоза > гептоза > аминосахарид > урановая кислота [62].
Под действием щелочей на глюкозу и другие монозы наблюдается
осмоление и образование ряда продуктов. Происходящие реакции зави­
сят от концентрации щелочей, температуры, времени воздействия.
1. Образование глюкозатов происходит под действием NaOH,
Са(ОН)2 на холоде. Соли слабой кислоты сильно гидролизуются, давая
щелочную реакцию.
2. Превращение одних моноз в другие под действием небольших
количеств щелочей при нагревании (например, глюкоза превращается в
фруктозу или маннозу).
3. Образование глюциновой кислоты (С^Н^Оп-НгО) при умерен­
ном действии щелочи (известь) на разбавленный раствор глюкозы (тем­
пература до 80 °С). Это более глубокое разложение - наблюдается уже
побурение раствора. Бариевая и кальциевая соли глюциновой кислоты
нерастворимы в воде.
4. При нагревании (выше 70 °С особенно) глюциновая кислота пе­
реходит в апоглюциновую (С9Н 10О5) - коричневая аморфная масса. Ее
Ва2+ и Са2+ соли растворимы в воде. Осаждается свинцовым сахаром и
свинцовым уксусом.
5. Сахарумовая кислота (С ^Н ^О ц) образует осадок при получении
из глюкозы или фруктозы глюциновой кислоты: кислота коричневого
цвета, растворима в воде и алкоголе. Из растворов ее при стоянии, вы­
деляются гуминовые вещества. Дает нерастворимые соли с Са(ОН)2,
Ва(ОН)2, со свинцовым сахаром и свинцовым уксусом.
6. Мелассиновая кислота (СбНбОз) получается при действии бари­
товой воды на глюкозу (темно-коричневая окраска соли Ва2+). Кислота
растворима в воде. Осаждается уксуснокислым свинцом.
7. Гуминовые кислоты - темно-коричневые вещества, которые полу­
чаются при гниении растений в почве. С Са(ОН)2 и В а ^ Н ^ дают нерас­
творимые в воде соли. Гумусовой кислоте (которая не растворима ни в во­
де, ни в спирте) Свен-Оден приписывает формулу СбоН52024(СООН)4. Гу­
миновые кислоты по свойствам и составу близки к мелассиновой кислоте.
8. Сахариновые кислоты и сахарин. Образуются при продолжитель­
ном воздействии избытка извести или NaOH на холоду или в течение 3-4 ч
при кипячении (в виде ее соли). При удалении извести щавелевой кисло­
той выкристаллизовывается лактон сахариновой кислоты [1,286].
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
93
9. D-L-молочная кислота получается при еще более энергичном
воздействии на глюкозу и фруктозу избытком NaOH вместе с сахарино­
вой кислотой.
Н
Н Н
ОН Н
н
Н—С—С—С—С—С—С
—
v
ОН ОН ОН Н ОН
2СН3—СНОН—СООН
молочная кислота
°
3 .1 .3 . Пектиновые вещества
В работах [1, 62, 95, 96, 286] обсуждаются свойства пектиновых
веществ. Из сухих веществ в корнеплодах (в том числе в сахарной свек­
ле) больше всего содержится пектиновых веществ. Они составляют по­
ловину веса мякоти, далеко химически не инертны по сравнению с
клетчаткой.
Находящиеся в мякоти свеклы нерастворимые в холодной воде
пектиновые вещества называются протопектином. Здесь пектиновые
вещества связаны с клетчаткой и гемицеллюлозами.
При нагревании с водой мякоть свеклы набухает и наполовину пе­
реходит в раствор. Растворимая часть называется пектиновыми вещест­
вами. Эти вещества аморфны. Сгущенный раствор их вязок и обладает
свойствами клея.
25-30% пектиновых веществ составляет полисахарид арабан (геми­
целлюлоза). При нагревании с кислотами гидролизуется и дает 1-арабинозу.
Кроме арабана содержится еще немного галактана.
70-75% пектиновых веществ составляет собственно пектин. Это
полигалактуроновая кислота, частично этерифицированная (7% по весу
групп -О-СНз). Формула d-галактуроновой кислоты:
Н—с=о
I
Н—С—ОН
I
ОН—С— Н
ОН—С—Н
I
н—с—он
СООН
альдегидная
форма
Н—С—он
I
Н—с —ОН
I
НО—с —Н
о
НО—с —н
I
н—с
СООН
кольцевая
форма
м
Глава 3
94
(этерефицировано на 60%)
Кроме того, пектин содержит 6% ацетильных групп СН3С(0)~ в
виде сложных эфиров с гидроксильными группами пектина.
Так как пектин содержит и свободные карбоксильные группы, то
он обладает свойствами кислоты, т. е. может образовывать соли. Сам
пектин растворим в воде. Известью он осаждается, т. к. пектинат каль­
ция нерастворим в воде.
Пектиновое вещество в узком смысле слова - это лишь пектин, т.е.
метиловый и уксусный эфир полигалактуроновой кислоты. Арабан и галактан - сопутствующие вещества, связанные с пектином побочными валент­
ностями в протопектине и освобождающиеся при гидролизе протопектина.
Молекулярный вес пектина свеклы 70 ООО. При нагревании с ки­
слотами (или щелочами) пектин подвергается гидролизу, и получается
полигалактуроновая кислота, лишенная оксиметильных и ацетильных
групп. Эта кислота называется пектиновой, а ее соли - пектатами.
Вращательная способность растворов пектиновой кислоты
[а]в =+285°.
При дальнейшем гидролизе пектиновая кислота дает гапактуровую
кислоту.
Гидролиз протопектина. Медленнее всего пектиновые вещества
переходят в раствор в слабокислой среде при pH = 5. В нейтральной
среде (pH = 7) скорость перехода в восемь раз больше. Далее в кислую и
щелочную сторону скорость гидролиза быстро растет (рис. 3.4-3.5).
Повышение температуры ускоряет гидролиз протопектина, осо­
бенно резко при 80 °С. С увеличением продолжительности нагревания с
водой вначале растворение растет пропорционально времени. При
большей длительности (более 90 мин при температуре 90 °С) скорость
растворения протопектина увеличивается особенно быстро (рис. 3.6).
Следует отметить, что при нагревании арабана и галактана с раз­
бавленными кислотами происходит их гидролиз с образованием 1-арабинозы, фурфурола и гидроксиметилфурфурола:
95
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
НО—СН—СН—ОН
Л дегидратация
» « r c \ ii
)Н он
-зн2о
сн—СН
I
Ш И Н д
°
пентозы
фурфурол
Фурфурол и гидроксиметилфурфурол, наличие которых в растворах
установил Прей [38, 55,61], являются, по его мнению, основными компо­
нентами при образовании окрашенных веществ во время производства.
<ь
&
со
£и
о
Q.
СО
со
о£
<ь
5
о
со
8
Я
5
Е
*
о
с
а*
0,6
0,5
0,4
0.3
0,2
0.1
0
7
8
pH (среднее)
Рис. 3.4. Гидролиз протопектина в зависимости от pH [24]
S 0,35
S’
«о
Е
0,3
<о 0,25
со
§
I
0.2
0,15
а
15 Ш
|
ч01
£
0,05
о, ------------- .--------------------------60
70
80
90
температура, °С
Рис. 3.5. Гидролиз протопектина в зависимости от температуры [24]
Глава 3
96
время, мин
Рис. 3.6. Гидролиз протопектина в зависимости от времени [24]
3 .1 .4 . Образование меланоидинов
При образовании меланоидинов не существует единой цепи хими­
ческих реакций [1-74, 97, 279, 280]. Одна из общепринятых схем, кото­
рая была впервые оглашена на 123 Конгрессе Американского химиче­
ского общества Дж. Ходжем, включает семь основных типов реакций.
Появление окрашенных продуктов в этих процессах подразделяют на
три последовательно идущие стадии [19,32].
На начальной стадии образуются бесцветные вещества (N-замещенные гликозиламины и 1-амино-1-дезокси-2-кетозы в 1,2-енольной
форме) по Куну и Вейганду. В процессе нагревания N-гликозид самопро­
извольно претерпевает внутримолекулярную перегруппировку, вначале с
образованием иммониевого иона, который отщепляет протон и превраща­
ется в 1,2-енольную структуру или кетопроизводное. Подобная перегруп­
пировка (Амадори) - один из необходимых этапов реакции меланоидинообразования. Эта реакция необратима, т. к. при гидролизе енольной формы
аминокислота выделяется в свободном виде, но сахарный компонент уже
не восстанавливается [1,19].
97
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
Начальная стадия:
сн,он
Аминокислота
NH-R-COOH
ОН
N-глиюозид
Глюкоза
HC=NH-R-COOH
|— н— с— nh 2-r-cooh
НС-ОН
О
НС— он
Иммониевый ион
Н2С—NH-R-COOH
НС— NHR-COOH
г
В
Кетопроизводное
Еиольная форма
1-амино-1 -деэокси
-2-кетозы
Промежуточная стадия:
сн,-соон
Н— CHj-NH-CHj-COOH
<
) + С6Н|20 6
| И I hoJ н и
он 1 H-J он 1
о
о
:—он
р—ОН I
:н,— 1 Н
1 -н ,---- 1
Дифруктозо глицин
он
■ —
&
о
н—С—он
нCHjOH
З-Дезоксигпюкоза
4—3196
Цис-неиасыщенный
глюкозой
Транс-ненасыщенный
глюкозон-гилрат
98
Глава 3
Эта стадия реакции неферментативного образования меланоидинов
может протекать в различных направлениях. Общими процессами при
этом являются: выделение воды, образование продуктов распада и их
последующая конденсация (полимеризация).
По схеме, которая предложена Е. Анетом [21, 44, 45], продукт пере­
группировки Амадори взаимодействует со второй молекулой моносахари­
да, в результате чего образуется дифруктозоглицин, который разлагается с
образованием разных глюкозонов. Следовательно, основными предшест­
венниками образования меланоидинов могут быть ненасыщенные озоны.
Другим предшественником коричневых пигментов в меланоидиновой реакции могут быть, по Ходжу [19, 32], редуктоны, которые обра­
зуются при гидролизе N-замещенных гликозиламинов (получающихся
на начальной стадии взаимодействия моносахаридов с аминокислота­
ми) с отщеплением двух молекул воды:
СНН
Н
СН н
О
0 0
о
— С = [ С- С] —с —с =
Редуктон
Дегидроформа
редустона
Предполагается, что редуктоны обладают структурой фурфурола (без
замкнутого фуранового кольца). К редуктонам относятся гидрохинон, пи­
рокатехин, ДОФА, ДОФА-амин, дегидроформа аскорбиновой кислоты.
Известно, что в слабощелочных средах пирокатехин и ДОФА
окисляются до свободного радикала семихинона [24, 25, 95], а затем
превращаются в устойчивый хинон, окрашенный в серо-желтый цвет:
Кроме того, хиноны образуются непосредственно из аминокислот с
ароматическим радикалом (например, из тирозина):
NH
Протокатеховая кислота
NH
5,6-Диоксиндол
Редуктоны, через образование дегидроформ (оксоформ) активно
участвуют в реакциях меланоидинообразования. К дегидроформам ре-
99
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
дуктонов могут быть отнесены вещества, подобные аллоксану, который
в слабокислой среде взаимодействует с аминопроизводными аромати­
ческих аминокислот и моносахарами, образуя окрашенные в желтый
цвет продукты, подобные рибофлавину (витамину В2) [95, 96]:
СН
СН,(СНОН),СН,ОН
.2
2-Амино-4,5-диметалрибамин
Аллоксан
Рибофлавин
Таким образом, можно полагать, что при участии в меланоидинообразовании ароматических аминокислот будут уже на промежуточных
стадиях образовываться оптически активные (окрашенные) компоненты.
Источником редуктонов являются также флавоноиды [139, 288],
уже имеющие в своем составе хиноидные фрагменты и остатки сахаров:
ОН
НО
ОН 0
Рутин
Взаимодействие флавоноидов, уже имеющих окраску, с аминокис­
лотами - один из возможных путей промежуточной стадии образования
меланоидинов. Согласно [157], при этом возможно образование поли­
мерных цепей типа:
R
Это свидетельствует об участии в меланоидинообразовании не
только редуктонов, но и азотсодержащих радикалов.
Другой вероятный путь на стадии образования промежуточных со­
единений - дегидратация 1-амино-1-дезокси-2-кетоз и превращение в
фурфурол или гидроксиметилфурфурол:
100
Глава 3
НО—СН—СН—ОН
нон2с —<^н
Ж
<!:CH-NH-R
Фуранозная форма
дизоксифруктозы
ту
НОН2С—Cv XC-CH=N-R
О
Vs\
\
\
Основание Шиффа
гидроксиметапфурфурола
SHT
tH’N-R
НОН2С—С. &—CHO
О
Гилрокси метилфурфурол
\
\
Меланоидины
1-Амино-1-дезокси-2-кетоза, получившаяся на первой стадии перефуппировки Амадори, при нафевании переходит в фуранозную форму,
которая, теряя воду, превращается в основание Шиффа фурфурола, если
исходным сахаром была пентоза, или Шиффово основание гидроксиметилфурфурола, если исходным сахаром являлась гексоза. Эти соедине­
ния могут конденсироваться до меланоидинов или, присоединяя воду,
деградировать до фурфурола (или гидроксиметилфурфурола) и свобод­
ной аминокислоты.
При окислительном взаимодействии с фурфуролом (под действием Ог)
из аминокислоты образуется альдегид, содержащий на один атом угле­
рода меньше, а также NH3 и С 0 2:
f H~ f H
Р
СН—СН
f
" S° / “< Н +° 2 ~ н ! \ 0/ J-соон
+H(fСООН
- NH! ---Фурфурол
Пирослизевая
кислота
Аминокислота
R
—IJ
:=o + c o , + n h ,
н
Альдегид
Подобное разложение (по Штрекеру) [95] аминокислот является
одной из промежуточных реакций с образованием альдегидов - одних
из активнейших меланоидинообразующих реагентов.
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
101
Реакцией, приводящей к образованию альдегидов, является также
переаминирование аминокислот с редуктонами [1,21]. При этом проте­
кает и процесс декарбоксилирования:
О
II
,
:=о + R—СН—С—R + со .
Только дикарбонильные редуктоподобные вещества способны
приводить к распаду аминокислот до альдегидов [21]. Можно полагать,
что переаминирование - одна из главных реакций, приводящая к вклю­
чению азота в окрашенный полимер [1].
Возникающие из аминокислот альдегиды вступают в реакции с
альдиминами, кетиминами, конденсируются с фурфуролом, друг с дру­
гом, с другими продуктами дегидратации сахаров, с аминокислотными
дезоксифруктозами.
Конечная стадия
На конечной стадии меланоидинообразования различают в основ­
ном два основных типа реакций: альдольная конденсация безазотистых
коричневых олигомеров и альдегид-аминная полимеризация (вклю­
чающая образование гетероциклических азотистых соединений).
Альдольная конденсация встречается только при карамелизации
очень чистых сахаров [1]. В присутствии даже следов азотсодержащих
компонентов наряду с образованием карамелей протекают процессы альдегид-аминной полимеризации. Следует отметить, что при меланоидинообразовании наблюдается сложное сочетание различных полимеризационных процессов. Образование меланоидинов в условиях сахарного, ли­
моннокислого, аминокислотного, ферментного производств, конечно,
имеет мало общего с образованием пигментов при хлебопечении или об­
жаривании кофе. Так, меланоидины, полученные из глюкозы с глицином,
содержат большое количество спиртовых гидроксильных групп; полу­
ченные в реакции глицина с фурфуролом имеют большое содержание
эфирного кислорода; меланоидины из глицина и метилглиоксапя отлича­
ются высоким содержанием енольных гидроксильных групп. Меланои­
дины в своем составе содержат много непредельных связей [49,157].
Наибольшее значение для образования меланоидинов в сахарном
производстве имеет глюкоза, фруктоза, аспарагиновая и глутаминовая
кислоты. При производстве аминокислот, ферментов, гидроксикислот
одним из компонентов их получения является меласса, в которой уже
присутствуют азотсодержащие пигменты. Поэтому в дальнейших пре­
образованиях и в образовании меланоидинов участвуют также олигоса­
хариды и пептиды [72-74, 103, 111], так как содержат свободные аминные и карбонильные группы [1, 55].
102
Глава 3
Алифатические альдегиды вступают в реакцию с альдиминами и
образуют ненасыщенный димерный альдимин R-CH-CH=C(R')CH=N-R"
и замещенный дигидропиридин [1].
В образовании меланоидинов принимают участие и производные
пиррола [49, 320] (пролин, оксипролин, триптофан), входящие в состав
белков. М. Линденмейер с соавт. [49] при взаимодействии лизина и
пролина с метиловым эфиром 2-ацетамидо-6-(2,4-дигидрокси-2,5-диметил-З-оксо-2,3-дигидропиррол-1-ил)гексановой кислоты
обнаружили окрашенные пигменты состава:
Альдегид-аминная полимеризация предполагает участие в меланоидинообразовании продуктов разложения пектинов, пептидов, пури­
новых оснований, которые не могут быть удалены в условиях сахарного
производства, накапливаясь в мелассе.
Наряду с пептидами в мелассе накапливаются пуриновые основания:
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
Ксантин
103
Гипоксантин
Фурфурол и гидроксиметилфурфурол, являющиеся продуктами
разложения пектиновых компонентов, вступают во взаимодействие с
пептидами (или пуриновыми основаниями):
н о -с -с н
II
н с —С
Q
II
С—С
>иГ
Чн
н
у
!
о
> )+ н ч
™ —СН,—С—N—СН2—С—N—СН2—СООН-
нI
нI
Диглицилглицин
-н,о но—с — сн
-
II
9
И
9
II
!—С—CH=N—СН,—С—N—СН2—С—N—СН2—СООН
0
Н
Н
Меланоидиноподобный продукт
Соединения пектино-пептидного комплекса имеют хромофоры
(усиливающие окраску веществ фрагменты) [38, 55]:
R—СН=С(ОН)—СНО
НО— (СН=СН)П—С=0
Н
В меланоидинах в качестве хромофоров могут выступать также ос­
татки пуриновых оснований, производные пиррола, хиноидные группы
[49,317,318, 327, 328].
3.2 . Строение меланоидинов
В многоатомных молекулах (которыми являются пигменты расти­
тельных сред) содержатся электроны в различных состояниях. Под дей­
ствием излучения могут происходить многочисленные переходы из ос­
новного состояния в различные возбужденные состояния. По частоте
поглощения в УФ-спектрах могут быть оценены только относительные
энергии двух уровней.
Смещение полос поглощения (под влиянием внутри- и межмолекулярных взаимодействий) происходит в результате изменения разности
104
Глава 3
между энергиями основного и возбужденного состояний, причем это
может осуществляться либо за счет изменения энергии основного со­
стояния, либо за счет изменения энергии обоих состояний. Если при
изменении энергии основного и возбужденного состояний разность ме­
жду ними не меняется, то соответствующая полоса не смещается, хотя в
меланоидинах при этом могут произойти существенные изменения в
распределении электронной плотности [169,170].
Электронные спектры выгодно отличаются от колебательных спек­
тров поглощения тем, что их интенсивность больше и поэтому они чаще
используются для количественных определений. УФ-спеюры довольно
характеристичны не только по частоте (положению в спектре), но и по
интенсивности, однако большая ширина в конденсированной фазе ухуд­
шает характеристичность и возможность структурно-группового анализа
пигментов. Поэтому для идентификации последних и определения их
состава (функциональных групп) используют колебательные спектры.
Фрагментный состав в растительных пигментах и состав функциональ­
ных групп в них (—
О—; =0; -ОН; >С=0; -СН=0; СООН; -S -; >S=; -SH;
-NH2; >NH; -N< и т . д.) является наиболее строгой и универсальной фор­
мой представления (наряду с ИКС) данных из совокупности спектров
ЯМР [93, 170, 175]. В ряде случаев представляется необходимым исполь­
зование фотометрических определений функциональных групп меланои­
динов специфическими органическими реакциями [143,163].
Предварительно меланоидины разделяли на отдельные компонен­
ты хроматографическими или электрофоретическими методами, а нако­
пленные отдельные компоненты исследовали в УФ-, ИК-свете и фото­
метрически путем окрашивания специфическими реагентами. В после­
дующих разделах рассмотрены особенности строения меланоидинов
сахарного, аминокислотных, лимоннокислого, ферментного произ­
водств, а также фульвокислот и гуминовых кислот.
3.2.1. Меланоидины сахарного производства
Разделение на отдельные компоненты исходных меланоидинов про­
водили с помощью электрофореза на бумаге «Фильтрак № II» (Германия)
в буферной смеси ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 3 : 7 с
pH = 1,8. Время деления 3 ч при напряжении 600 В. Элюция веществ из
отдельных электрофоретических зон осуществлялась бидистиллятом. Вы­
делено 13 пигментов с меланоидиновой функцией (табл. 3.10) [71,103].
Заслуживает внимания тот факт, что отдельные компоненты по­
глощают при различных длинах волн (X). Это свидетельствует о различ­
ном строении пигментов, что отличается от данных, полученных в ра­
боте [1] и вызвано отсутствием предварительного разделения. Адсорб­
ционные кривые веществ, содержащихся в 7-10 зонах, имеют максиму­
мы при 346-367 нм и при 258-276 нм (табл. 3.10, рис. 3.7).
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
105
3.10. Электрофоретическое разделение меланоидинов
Область
располо­
зоны жения
зоны
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Окраска
зоны
Анодная Бесцветная
-//-//Катодная Коричневая
Буро­
-//коричневая
-//Коричневая
-//-//-//-//Желтая
-//-
-//-
-//-
-//-
Бесцветная
-//-
-//' -//-
-//-
-II-//-
Расстояние
центра зоны Размер
от старта, зоны, мм
мм
X, нм
Цвет зоны
в УФ-свете
20
10
1
8
9
7
3
5
Голубой
230, 286
Желтый
226, 282
Коричневый
289
Голубой
264, 290
13
25
35
45
60
75
88
96
116
8
12
8
15
10
15
5
10
8
295
290
276,355
258, 346
258, 360
273, 367
263
251
265
Коричневый
Голубой
Коричневый
Желтый
Голубой
-//Фиолетовый
Желтый
Ярко-синий
Полосы поглощения в области 340-360 нм В. Прей [38,55] объяснял
наличием 2-метил-1,2-дигидро-2-кетопиранозно-1-уксусной кислоты.
Однако наличие подобного соединения, обладающего повышенной ки­
слотностью, должно было бы привести к перемещению пигментов к ано­
ду (или меньшей скорости перемещения в катодную область). В дейст­
вительности наблюдается обратный эффект, что свидетельствует о нали­
чии в этих веществах фрагментов, содержащих группы, которые обла­
дают положительным зарядом. Такими группами могут быть гетероцик­
лы с азотом, сконденсированные с бензольными (или хиноидными)
кольцами [170, 289-291]. Кроме того, максимум в области 340-360 нм
может быть объяснен наличием фрагментов, содержащих пиррол [170].
Для проверки этого были проведены качественные реакции с альдегида­
ми (ванилином). Для пигментов, содержащихся в зонах 7 и 8, наблюда­
лось красное окрашивание [140, с. 174-175], что характерно для индольных фрагментов. Вещества, содержащиеся в зонах 9 и 10, с ванилином
давали желтую окраску, характерную для пиррольных колец [143]. По­
лосы поглощения в области 250-290 нм, по А. Анету [44, 45], вызваны
соединением типа R-CH=C(OH)-CHO и карбонильной группой С=0.
106
Глава 3
нм
Рис. 3.7. УФ-спектры отдельных компонентов в меланоидинах:
номера кривых соответствуют номерам электрофоретических зон в табл. 3.10
Кроме того, в этой области могут поглощать свет производные
имидазола и фурана [170]. Следует отметить, что качественные реакции
с солями диазония (розовое окрашивание) [143, с. 60] типа:
и с первичными нитросоединениями [143, с. 163]:’
(I
II
+
о'сно
c h 3n o 2 -
Г
!
+ н 2°
cfCH=CHN02
для контролируемых компонентов имеют место во всех электрофорети­
ческих зонах. Таким образом, эти полосы могут быть объяснены совме­
стным присутствием производных имидазола, фурана и непредельных
альдегидов.
Заслуживает внимания, что для пигмента, содержащегося в 4 и 7
зонах, при действии салицилового альдегида [143, с. 182] наблюдается
появление красной окраски, что свидетельствует о присутствии полифе-
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
107
нольных фрагментов типа резорцина или пирогаллола. Поэтому пик при
276 нм для вещества 7 зоны может объясняться наличием полифенолов.
Полосы поглощения с максимумом 225-230 нм (1 и 2 зоны) могут
быть характерны для карбоксильной и амидной групп [1, 170].
Резкое нарастание светопоглощения в коротковолновой УФ-области в спектрах исследуемых меланоидинов (рис. 3.7) свидетельствует
о возможном появлении еще одной полосы поглощения с максимумом
-190 нм, характерной для двойных связей в молекулах [1].
Данные по химическому определению функциональных групп в от­
дельных компонентах меланоидинов подтверждены результатами, полу­
ченными методом ИК-спектроскопии (рис. 3.8). Из этого рисунка видно,
что интенсивными в спектрах меланоидинов являются полосы поглоще­
ния 1634 и 1554 см-1, характерные для колебании амид I (voo) и амид II
(On-h) в пептидных группировках [170-178, 189]. Полосы поглощения
при 1160-1150 см-1 в равной мере характерны для валентных колебаний
С-ОН и С -О -С связей [172-178]. Пики в области 1030-1050 см-1 свиде­
тельствуют о наличии С -О и С -С связей в кольцевых структурах. Пики
при 1426 см характерны для валентных колебаний vs СОО", а 15701582 см*1- v„ СОО” [170, 187]. Максимумы 1520 и 1620 см”1 свидетель­
ствуют о наличии 5, и б„ аминогрупп N+H3 в цвиттер-ионах и катионах
[170, 175]. Полосы при 1313 и 1276 см” характерны для связи C-N
[172-178]. В пятой электрофоретической зоне при 956 см”1 имеют место
маятниковые колебания >ГНз [175,189]. В четвертой зоне при 2700 см”1
проявляются связи Н2О...О Н - фенольных радикалов, а при 1337 см” 8 ОН
в фенольных радикалах [175, 186]. Представляет интерес наличие пиков
в области 1706 см” (С = 0 в не диссоциированных СООН-группах) в ком­
понентах 2 и 3 электрофоретических зон. В 4 и 5 зонах присутствуют
полосы поглощения при 2204 с м '1, которые можно отнести к связям C -N
в циклических структурах типа пиррола или имидазола [170, 178]. Таким
образом, количество амино-, фенольных и карбоксильных групп для ве­
ществ отдельных зон различно.
Представляет интерес, что в области 3460-3198 см” проявляются
полосы поглощения для веществ всех электрофоретических зон, что сви­
детельствует о хорошей гидратационной способности меланоидинов.
Максимумы при 3460-3411 с м '1 характерны для свободной NH2 группы
или Н2О ... Н20 (вблизи аминогрупп или фенольных групп) [102, 179].
Пики при 3352-3320 см”1 свидетельствуют о наличии связей H2O ...H 3N+,
а 3206 см”1-с в я зе й СООН... Н20 [102,179]. Наличие метильных и мети­
леновых ф упп характеризуется полосами при 3020-2892 см~ .
Для сравнения количества групп и связей в отдельных зонах мела­
ноидинов методом базисной линии произведен расчет относительной
интенсивности их максимумов. В качестве сравнения были взяты поло­
сы колебаний метильных и метиленовых ф упп при 1368 с м '1, т. к. эти
108
Глава 3
группы стабильны в процессе меланоидинообразования. Результаты
анализа представлены в табл. 3.11.
и, см
Рис. 3.8. ИК-спектры меланоидинов в электрофоретических зонах 2, 3,
4, 5 и 7 меланоидинов сахарного производства (кривые /, 2,3,
4, 5 соответственно)
Данные табл. 3.10 и 3.11, рис. 3.9 и 3.10 показывают, что отношение
количества аминогрупп к количеству карбоксильных групп в электрофоре­
тических зонах различно. Наибольшее количество СООН-групп по отно­
шению к аминогруппам находится во второй зоне меланоидинов, наи­
меньшее - в седьмой зоне. Этим объясняется различное движение зон под
действием электрического поля: компоненты, содержащие большее число
карбоксильных групп, движутся к аноду, компоненты с меньшим количе­
ством СООН-групп - к катоду. Следует отметить, что наибольшее количе­
ство кратных связей содержат компоненты второй зоны, в которых нахо­
дится достаточное количество СООН-групп (рис. 3.9). Такой эффект объ­
ясняется тем, что карбоксильные группы сохраняются в меланоидинах,
109
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
придавая им кислотные свойства, только при наличии цепи сопряжения.
Присутствие сопряженных связей стабилизирует пигменты и сохраняет
карбоксильные группы в них [97].
3.11. Соотношение интенсивностей пиков в ИКС меланоидинов.
К„ = h /h ; где Н, И,, Н2, A* h4, hs - высоты пиков соответственно
для метильных, амино- (1620 см~'), карбоксильных групп
(1706 см~х и 1570 смГх), -С=С-связей (1600 см~1), -C -N -связей
(1313 см~х) и спиртовых групп (1150 смГ )
№ зоны
2
3
4
5
7
к.
1,31
1,38
1,35
1,36
1,32
К,
1.38
1,22
0,97
0,69
0,61
Кэ
1,46
1,20
1,27
1,25
1,28
к4
0,68
0,92
0,83
0,76
0,72
к,
0,62
1,00
0,72
0,63
0,54
Ki/K,
0,92
0,87
0,72
0,60
0,42
Рис. 3.9. Относительное содержание аминогрупп (/), карбоксильных
групп (2), кратных связей (3), связей N -C (4) и спиртовых
групп (5) в различных зонах меланоидинов
110
Глава 3
К ,/К ,
зона
Рис. 3.10. Соотношение карбоксильных и аминогрупп для различных
электрофоретических зон меланоидинов
Следует заметить, что число кратных связей изменяется противо­
положно числу спиртовых групп и C-N -связей в различных зонах мела­
ноидинов (рис. 3.9). Это свидетельствует о том, что наименьшее коли­
чество кратных связей в веществах этого класса отмечается при образо­
вании достаточного количества C-N -связей и сохранении большого
числа спиртовых групп глюкозной цепи. Это согласуется с результата­
ми, полученными Спарком [97] при исследовании роли аминокислот в
процессе меланоидинообразования.
Меланоидины сахарного производства отличаются по молекуляр­
ным массам, размерам молекул и изоэлектрическому состоянию
(табл. 3.12, рис. 3.11).
Установленные константы протолиза (pKi = 1,92-2,30) для веществ
всех гель-хроматографических зон и рК2 = 4,86 (для третьей гельхроматографической зоны, идентичной второй электрофоретической зоне)
свидетельствуют о наличии карбоксильных групп. При рКг = 8,90-10,10
протолизу подвергаются -N +H3 (или = N ^ 2) группы, рК* в четвертой и
седьмой ЭФ зонах могут соответствовать протолизу в полифенолах, а
pKR = 4,86 - протолизу в карбоксильных группах (отличающихся по
основности от СООН групп с рК[).
Константы протолиза позволили получить диаграммы равновесий
индивидуальных меланоидиноподобных компонентов в зависимости от
pH (рис. 3.11).
На основании всего вышеизложенного можно предположить суще­
ствование в меланоидинах фрагментов:
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
111
R* —HN
НООС—R?
В какой-то степени приведенная выше структура сходна с гуминовыми кислотами [93, 293]. Еще один фрагмент, идентифицированный в
ходе наших исследований, имеет следующий вид:
где R '—углеводородные радикалы, в состав которых могут входить непредель­
ные связи —С—С—, карбоксильные, амино- и спиртовые группы.
Оба предложенных фрагмента имеют статистический характер и
относятся в большей степени к гидролизуемой части меланоидинов,
куда входят:
+
R— CHj— СН— N H 3 -аминокислоты;
СОО
(С6Н|0О5)2 - остатки сахаров;
-{СООН)п - карбоксильные группы;
—(№$ )п; -(ОН)п - амино- и спиртовые группы;
- фурановые и пиррольные циклы;
J0
-ОН;
—С=С-----кратные связи
О - полифенолы и фенолы;
112
Глава 3
б
Р"
Рис. 3.11. Диаграммы равновесий в растворах меланоидинов сахаро­
рафинадного производства:
а - первая ГХ (седьмая ЭФ) зона; б - вторая ГХ ('четвертая ЭФ) зона; в - тре­
тья ГХ (вторая ЭФ) зона. М2+, М*. Л/*, АГ1, М1' - катионы, цвиттер-ионы и
анионы меланоидинов
Таким образом, структура меланоидинов имеет статистический ха­
рактер распределения отдельных фрагментов. Было бы преждевременно
и неверно представлять все структурные ячейки меланоидинов сахарно­
го производства идентичными по составу и по строению. Возможным
являются замены в составе гидролизуемых составляющих в меланоидинах, в типах замещения ароматических циклов, в их наборе и сочлене­
нии гетероциклов. Однако общие типовые признаки меланоидинов ос­
таются постоянными [1, 102].
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
113
3.12. Физико-химические свойства меланоидинов сахарного
производства [57, 67,102, 292\
3<>№Г
1 2
1 7
2 4
3 2
1
2
1
2
1
2
Мол.
мас­ Ради­
са, ус, А р! С , В НМ
кДа
(Ci6H240||N)jo
12,1
13,2 6,8 0,420 276,
355
(C16H220 8N 2) 16
6,0
7,1 3,2 0,366 264,
290
1,2
(С 17Н22О |oN)2-3
1,8 1,9 0,418 230,
286
(C 12Hl60 8N )37.38
12,0
286
п ,з
280
5,0
6,3
(Ci,Hb 0 6N)i4.|S
285
5.0
(С i6-17H22-2JO1oN) 12-13
1.0
236,
(С i6-17H25-240ИМ1™)ы
292
286
(C|4-|jH20-2|O7.gN2)32-33 13.0 14,1
286
(C2 I-22H31.32O 1|-12"^з)з 13.0 13,6
Брутто-формула
рК, рК2 рКи
Бром­
ное
число
2,08 10,10 9,12
12
2,30 9,26 8,14
8
1,92 8,90 4,86
4
14
12
Примечание: в первой графе гель-хроматографическая (ГПХ), во второй
графе - электрофоретическоя зона (ВЭФ); * электрокинетический потенциал.
3.2.2. Меланоидины в производстве лизина
Отдельные стадии получения и выделения лизина протекают при
различных pH. При микробиологическом способе его получения исход­
ным сырьем для сбраживания служит свеклосахарная меласса, ростовые
вещества, различные минеральные добавки [8-11]. Культуральная жид­
кость (КЖ) после ферментации содержит большое количество мине­
ральных компонентов и целый букет органических окрашенных соеди­
нений, которые препятствуют кристаллизации лизина. Наиболее эффек­
тивным для очистки аминокислоты с последующим ее выделением в
кристаллическом виде является применение ионитов. Решение этого во­
проса неразрывно связано с разработкой эффективных способов не толь­
ко обессоливания, но и обесцвечивания КЖ, что требует знания строения
и свойств пигментов, содержащихся в ферментационных средах.
Необходимо отметить, что окрашенные вещества при производстве
лизина уже содержатся в мелассе и образуются при ферментации и вы­
делении аминокислоты. Поэтому одним из этапов изучения пигментов
является их получение в модельных условиях. Для этого использованы
растворы лизина и сахарозы (концентрация по 5 г на 100 г раствора);
время реакции 12 ч; температура 90 °С. В качестве растворов сравнения
применяли растворы сахарозы, которые нагревали в аналогичных усло­
виях, и растворы аминокислоты.
114
Глава 3
Хроматографическое разделение окрашенных соединений проводи­
ли на бумаге «Fiitrak» № 15 (Германия). Растворителем служила смесь
н-бутиловый спирт - ледяная уксусная кислота - дистиллированная вода
в соотношении 4 : 1 : 5 . Время разделения - 22 ч. Хроматограммы после
высушивания облучали УФ-светом для обнаружения люмйнесцирующих
компонентов и проявляли растворами нингидрина и мочевины. Полу­
ченные с помощью бумажной хроматографии отдельные зоны красящих
веществ элюировали водой и изучали в УФ- и ИК-областях спектра. Об­
разцы окрашенных продуктов для получения ИК-спектров готовили в
виде таблеток с бромистым калием (1 мг вещества на 100 мг КВг).
Приведенные в табл. 3.13 результаты свидетельствуют о том, что
значительное окрашивание отдельных растворов достигается при низ­
ких значениях pH. Минимальная цветность наблюдается в нейтральной
среде. Понижение pH некоторых растворов свидетельствует об образо­
вании продуктов кислотного характера [1, 102]. Увеличение цветности
растворов при совместной реакции аминосоединения и сахарозы (по
сравнению с окраской в присутствии только дисахарида) говорит о том,
что присутствие лизина способствует усилению краскообразования ок­
рашенных соединений. Однако влияние аминокислоты при различных
значениях pH на этот процесс проявляется неодинаково.
Известно [1], что аминокислоты могут как непосредственно участ­
вовать, так и оказывать каталитическое действие на образование окра­
шенных продуктов при разложении сахарозы. В нашем случае лизин
также играет двоякую роль. Во-первых, он сам непосредственно участ­
вует в образовании меланоидиноподобных продуктов, причем наиболь­
шее количество лизина вступает в реакцию при низких значениях pH
(рис. 3.12). Это объясняется тем, что в кислых средах при температуре
90 °С (условия получения модельных растворов) происходит гидролиз
сахарозы, и она полностью разлагается на глюкозу и фруктозу. Моноса­
хариды, возникающие при инверсии сахарозы, обладают большей реак­
ционной способностью, чем сама сахароза, и активнее реагируют с ами­
нокислотами с образованием окрашенных веществ [1]. Из табл. 3.13 вид­
но, что фруктоза активнее реагирует с лизином, поскольку в растворах
после нагревания фруктозы содержится гораздо меньше, чем глюкозы.
Высокая активность пентоз в реакциях может быть объяснена тем,
что продуктом их разложения является фурфурол - один из активных
источников образования красящих веществ [1].
Еще одной причиной снижения интенсивности образования окра­
шенных веществ в щелочной среде является преимущественное проте­
кание реакции в сторону образования бесцветных продуктов (табл. 3.14)
и частичное разрушение хромофорных систем молекул красящих ве­
ществ, происходящее под влиянием гидроксильных ионов [1].
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
115
3.13. Взаимодействие лизина и сахарозы в различных условиях
№ рас­
твора
1
Концентра­
Кол-во
Кол-во сахаров,
ция компо­
лизина,
Оптиче­
содержащихся в
нентов в
всту­
pH раствора
ская
растворах после
100 мл исход­
пившего
плот­
нагревания,
ного раство­
в реак­
ность D,
г/100 мл **
ра, г*
535 нм, цию,
г/100
мл
после / = 1 0 мм
саха­ исход­
раство­ глю­ фрук­ саха­
лизин
нагре­
роза
ный
коза
тоза роза
ра
вания
4,5
(2,5)
4,5
(2,5)
4,5
(2,5)
4,5
(2,5)
4,5
(2,5)
4,5
(2,5)
4,5
(2,5)
0
5,0
0,400
2,48
2,4
0,3
0
1,1
1,1
(1,36) (1,36) (0,17)
(1,5)
2
1,45
5,0
0,150
1,57
2,3
0,68
0
1,5
(0,86) (1,27) (0,38)
(1,5)
3
5,0
3,3
0,090
0,57
2,3
0,75
0
3,1
(0,31) (1,27) (0,42)
(1,5)
4
5,0
6,9
6,7
0,018
0,65
0
0
2,0
(0,36)
(0,58)
(1,5)
5
5,0
9,8
9,7
0,045
1,65
0
0
1,5
(0,90)
(0,43)
(1,5)
0,035
6
5,0
10,1
10,1
1,23
0
0
1,3
(0,37)
(1,5)
(0,67)
7
5,0
11,7 11,8
0,035
1,23
0
0
1,3
(0,67)
(0,37)
(1,5)
—
0,148
8
5,0
—
—
М
1,1
(1,5)
5,0
—
9
0
7,0
6,3
0,002
—
—
—
(1,5)
10
5,0
10,1 5,55
0
0,001
—
—
—
—
(1,5)
И
(4,5)
0
0,001
1,1
1,1
Примечание: * в скобках дана концентрация компонентов в 10 3 моль/л; ’* в растворах 1,2,3 после нагревания обнаружены следы мальтозы
Результаты хроматографического разделения на бумаге окрашен­
ных веществ представлены в табл. 3.14. Из таблицы видно, что число
зон, окрашенных в видимой области, увеличивается с уменьшением pH,
что подтверждается и увеличением оптической плотности растворов в
кислых средах. Необходимо отметить, что в области расположения ли­
зина находятся зоны меланоидинов, которые также проявляются нингидрином. Поэтому для количественного определения лизина проводи­
ли дополнительное разделение лизина и окрашенных продуктов мето­
дом бумажной хроматографии.
116
Глава 3
pH
Рис. 3.12. Зависимость оптической плотности (У) и количества лизина,
вступившего в реакцию меланоидинообразования (2), от pH
растворов:
D —оптическая плотность; Ся—количество лизина (г/100 мл)
Окрашенные соединения зон № 2 (pH = 1,1); № 1 (pH = 1,45); № 1
(pH = 3,3); № 2 (pH = 6,7); № 2 (pH = 9,7); № 2 (pH = 10,1); № 2 (pH = 11,9)
проявляются нингидрином в виде сиренево-фиолетовых пятен.
УФ-спектры почти всех данных соединений имеют максимум при
235-300 нм и полосу поглощения 320-330 нм, что характерно для мела­
ноидинов [1, 103]. Поэтому можно предположить, что рассматриваемые
зоны содержат меланоидиноподобные вещества.
Соединение зоны с pH = 1,45 имеет максимум поглощения при
280 нм, однако это окрашенное вещество также можно отнести к меланоидинам, т. к. известно, что конфигурация УФ-спектров красящих веществ
зависит от размера их частиц и содержания функциональных фупп, обу­
словливающих поглощение света [169]. В соответствии с [6,7,169] полоса
поглощения при 280-300 нм обусловлена С =0 фуппой, сопряженной с
кратными связями. На основании этого можно предположить, что и в мо­
дельных растворах при различных значениях pH образуются меланоиди­
ны, отличающиеся по свойствам и структуре друг от друга. Полосы при
320-330 нм объясняются наличием C=N-связей в гетероциклах [102, 170].
Соединения зон №№ 3, 4, 5 (pH =1,1); №№ 2, 4, 5 (pH = 1,45) и № 4
(pH = 3,3) тоже окрашены, но нингидрином не проявляются. Окраска
этих зон гораздо слабее, чем зон, рассмофенных выше. Можно предпо-
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
117
ложить, что окрашенные соединения перечисленных зон образуются на
промежуточной стадии реакции образования меланоидинов. Полученные
УФ-спектры рассматриваемых веществ с максимумом поглощения света
275-285 нм подтверждают наше предположение [169]. Компоненты зон
№ 3 (pH = 9,7); № 3 (pH = 10,1) и № 3 (pH = 11,9) нингидрином проявля­
ются, но бесцветны в видимой области. Очевидно и этим зонам принадле­
жат бесцветные соединения, образующиеся на начальной стадии реакции
образования меланоидинов [119]. Бесцветные зоны №№ 1, 6 (pH = 1,1);
№№ 3, 6 (pH = 1,45); №№ 3, 5 (pH = 3,3); № 1 (pH = 6,7; 9,7; 10,1; 11,9)
окрашиваются мочевиной в зеленовато-синий цвет. Раствор мочевины
является реактивом на олигосахариды, кетозы и карамели сахарного про­
изводства [169] и дает характерные синие пятна на бумажных хромато­
граммах. В УФ-свете эти зоны флуоресцируют (табл. 3.14). Эти эффекты
позволяют предположить наличие в рассматриваемых зонах веществ,
напоминающих карамельсодержащие продукты.
Для установления характера функциональных групп были сняты
ИК-спектры соединений наиболее окрашенных хроматографических зон.
ИК-характеристики окрашенных компонентов, образующихся при различ­
ных значениях pH, отличаются друг от друга, как по виду спектра, так и по
интенсивности отдельных полос поглощения (рис. 3.13, 3.14). В области
3250-2900 см-1 имеются широкие полосы поглощения со сглаженными
пиками, которые соответствуют ассоциированным аминогруппам.
Полосы 1614, 1606 и 1334 см-1 характеризуют колебания NH3* групп
в цвиттер-ионах. Указанные пики, согласно литературным данным [170],
свидетельствуют об образовании внутрисолевой связи в меланоидинах,
которые принадлежат к классу высокомолекулярных аминокислот.
Заслуживает внимания малая интенсивность пика 1726 см-1, кото­
рый соответствует неионизированным карбоксильным группам. По­
следнее указывает на то, что в меланоидинах карбоксильные группы
находятся в ионизированном состоянии. Подобное явление подтвержда­
ется и сравнительно высокими значениями констант диссоциации изу­
ченных окрашенных компонентов [169], которые имеют величины в
пределах 2,0-10-3 - 4,2-10"3, и объясняется, как и в случае мономерных
аминокислот, присутствием аминогрупп [170].
Интересным фактом является наличие во всех зонах меланоидинов
пика при 1504-1455 см-1, который, как было установлено, обусловлен
наличием связи C=N [102, 170]. Указанные группы образуются только
при взаимодействии сахаров с лизином (в отличие от аминодикарбоновых аминокислот [73, 74]). Последнее свидетельствует об отличии ме­
ланоидинов производства лизина от подобных окрашенных веществ
других производств [1, 73].
Глава 3
118
3.14. Распределительная хроматография меланоидинов,
образующихся при взаимодействии лизина и сахарозы
Проявитель
pH
1,1
№ зон
Rt
Окраска
в видимой области
1
2
3
4
5
6
0,003
0,186
0,200
0,529
0,660
0,857
0,100
0,206
0,242
0,457
0,610
0,820
0,129
0,178
0,190
0,240
0,830
0,056
0,122
0,034
0,129
0,314
0,014
0,125
0,319
0,028
0,125
0,319
Бесцветная
Желто-коричневая
Желтая
Желтая
Желтая
Бесцветная
Желто-коричневая
Желтая
Бесцветная
Желтая
Желтая
Бесцветная
Желтая
Бесцветная
Бесцветная
Желтая
Бесцветная
Бесцветная
Желтая
Бесцветная
Желтая
Бесцветная
Бесцветная
Желтая
Бесцветная
Бесцветная
Желтая
Бесцветная
УФ-свет
нингидрин
+
*-
+
+ ■
+
-
-
-
+
мочевина
-
+
+
+
1
1,45
■ 2
+
+
3
+
4
.
5
• -■
+
+
6
+
+
1
3,3
. 2
+
+
3
+
4
+
+
5
+
+
1
6,7
+
+
2
+
+
9,7
1
+
+
.2
+
+
3
+
+
10,1
1
+
+
2
+
+
- '
3
+
+
1
11,9
+
+
2
+
+
3
Примечание: Знаки «+» и «-» означают положительную и отрицательную реак­
ции соответственно.
-
-
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
119
Рис. 3.13. ИК-спектры меланоидинов, образующихся
при взаимодействии лизина и сахарозы при pH = 1,1
(зона 2 в табл. 3.14) (кривая /) и pH = 3,3 (зона 1
в табл. 3.14) (кривая 2):
А - поглощение, %; v —волновое число, см~
Обращает на себя внимание различная интенсивность пиков 1040 и
985 см , которые характеризуют валентные колебания С-О групп (воз­
можно в карбоксильных группах) [1,170]. Пики 920 и 850 см-1 характери­
зуют колебания типа 2 в пиранозе и колебания типа 1 в пиранозе или
кольце фурана соответственно [1, 170]. Причем указанные пики имеют
малую интенсивность для меланоидинов, полученных при низких значе­
ниях pH. В то же время максимум 1123 см"1 для этих компонентов прояв­
ляется достаточно хорошо. Это может свидетельствовать о большом коли­
честве лактонных группировок (или гликозидных связей) в меланоидинах.
Таким образом, установлено, что при высоких значениях pH в ус­
ловиях высоких температур образование меланоидиноподобных окра­
шенных веществ происходит в меньшей степени по сравнению с низки­
ми значениями pH.
120
Глава 3
Рис. 3.14. ИК-спектры меланоидинов, образующихся
при взаимодействии лизина и сахарозы при pH = 6,7 (зона 2
в табл. 3.14) (кривая /); pH = 9,7 (зона 2 в табл. 3.14)
(кривая 2); pH =11,9 (зона 3 в табл. 3.14) (кривая J)
Пигменты, содержащиеся в производственных растворах (культу­
ральной жидкости) лизина, фракционировали с помощью бумажной
хроматографии и электрофореза. Предварительно к ферментационному
раствору добавляли при перемешивании этиловый спирт в соотношении
1 : 3 . Выпавший осадок, содержащий биомассу и коллоиды, отделяли
фильтрованием. Результаты (табл. 3.15) свидетельствуют, что вещества,
содержащиеся в КЖ, методом бумажной хроматографии (на бумаге
«Filtrak» № 15 в течение 48 ч, растворитель СН3СООН - н-бутиловый
спирт - вода в соотношении 1 : 4 : 5) разделяются на десять зон. Компо­
ненты в зонах 1, 3 и 9 не поглощают в видимой области, поэтому были
изучены только некоторые их характеристики.
121
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
НМ
Рис. 3.15. УФ-спектры веществ хроматографических зон:
1 , 3 - неокрашенные карамелеподобные вещества; 9 - неокрашенные вещества,
похожие на ПЩР; 4 - карамели; б - ПЩР; 2, 5, 7, 8, 10 - меланоидины; D оптическая плотность
122
Глава 3
3.15. Разделение пигментов, содержащихся в КЖ лизина 17 4,102\
(опытно-промышленная установка «ВНИИГенетика», Москва)
№
зон
Окраска зон
Яг
Электрический
заряд
1
Бесцветная
2
Коричневая 0,12 Положительный
3
Бесцветная
0,07 Близок к нулю
4
5
Близок к нулю
0,16
Коричневая 0,29 То же
Желтая
0,41 Положительный
6
Коричневая 0,53 Отрицательный
7
8
9
Коричневая 0,70 Положительный
Коричневая 0,73 То же
Бесцветная 0,78 Отрицательный
10 Коричневая 0,86 Положительный
Окраска проявителем
Цвет зоны
нннгидримочевиной в УФ-свете
ном
Не окраши­
вается
Розово­
фиолетовая
Не окраши­
вается
То же
Розово­
фиолетовая
Не окраши­
вается
Фиолетовая
Фиолетовая
Не окраши­
вается
Фиолетовая
Серо-синяя Голубой
Не окра­
Бесцветный
шивается
Серо-синяя Голубой
Серо-синяя Ярко-синий
Не окра­
Бесцветный
шивается
То же
Сине­
голубой
То же
Бесцветный
То же
Бесцветный
То же
Сине­
голубой
То же
Бесцветный
Данные табл. 3.15 и рис. 3.15 (вещества зон 1 и 3 имеют максиму­
мы поглощения при 230 и 285 нм) позволяют отнести компоненты зон 1
и 3 к карамелеподобным продуктам, образующимся при распаде саха­
ров, которые предшествуют пигментации, а вещество зоны 9 имеет по­
лосу поглощения при 260 нм и сходно с продуктами щелочного распада
инвертного сахара (ПЩР) [1].
Следует отметить, что в КЖ содержатся и окрашенные компоненты
(зоны 4 и б), которые относятся к карамелям и ПЩР соответственно. При
этом карамели имеют полосы поглощения при 230 и 283 нм, а ПЩР - при
265 нм (рис. 3.15). По форме указанные максимумы напоминают карамели
и ПЩР сахарного производства [1]. Согласно данным [1, 11], карамели яв­
ляются карбонильными соединениями непредельного характера, содержат
СООН-группы, а также большое число спиртовых групп. ПЩР относятся к
высокомолекулярным гидроксикислотам, которые наряду с СООН имеют
кетонные группы, сопряженные с кратными связями. Для установления
функциональных групп в окрашенных карамелях (зона 4) и ПЩР (зона б)
были проведены реакции на гликозидные связи (окисление перйодатом
натрия при 5 °С и pH = 3,5); лактоны (действие нитропруссида натрия в
присутствии NaOH [143] с последующим фотометрированием раствора при
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
123
длине волны 580 нм); альдегидные группы (действие фенилгидразона [143]
и последующее определение образующихся оснований Шиффа с фторборатом 4-нитрофенилдиазония); спиртовые группы (реакция с метаванадатом натрия и 8-оксихинолином [143]) и СООН-группы (метанольный рас­
твор нитрата кобальта с последующей экстракцией продукта реакции хло­
роформом [143] и фотометрированием при 520 нм). Проведенные опреде­
ления показали отсутствие в карамелях и ПЩР альдегидных групп. Кара­
мели содержат значительное количество лактонных группировок и спирто­
вых групп, но очень мало гликозидных связей и карбоксильных групп.
Гликозидные группировки и СООН-группы имеются в большом количест­
ве в ПЩР. Косвенным доказательством различного содержания СООНгрупп является величина pH для ПЩР и карамелей, равная 4,26 и 5,60, со­
ответственно. Следует отметить, что водный раствор карамелей после ки­
пячения имеет pH = 5,05, что косвенно свидетельствует о присутствии в
изучаемом веществе лактоновых колец, часть которых при сильном нагре­
вании в воде расщепляется с образованием СООН-групп.
ИК-спектры веществ зон 4 и 6 (рис. 3.16, кривые / и 2 соответст­
венно) имеют широкую полосу поглощения в области 3392-3224 см” ,
которая соответствует валентным колебаниям ОН-групп, соединенных
связями Н .. .ОН. Пики б, в, г, д, е, ж, з, и, к, л, м, н, о, п, р соответствуют
поглощению при 2924, 2893, 1732, 1628, 1564, 1475, 1398, 1218, 1190,
1103, 1054, 950, 931, 882, 775 с м '1. Карамелеподобные вещества содер­
жат значительно меньше карбоксильных групп (1732, 1564, 950 см-1),
чем ПЩР. Имеется также отличие карамелей и ПЩР в области поглоще­
ния гликозидных связей (1218 см-1) и С -О -С связей в лактонах (1190,
1103 см-1), а также в области колебаний пиранозных колец (931, 882 полосы типа I (а) и II (|3) соответственно) [74, 102]. Карамели и ПЩР
содержат также метальные и метиленовые группы (2924,2892, 1398 см ' ),
кратные связи (1628 см"1), спиртовые группы (1103-1053 см '1) [1,74].
Компоненты, содержащиеся в хроматографических зонах 2, 5, 7, 8
и 10, окрашиваются нингидрином в розово-фиолетовый или фиолето­
вый цвет. Под действием электрического тока эти компоненты движут­
ся к отрицательному полюсу, что говорит об их положительном заряде.
Согласно [1, 73, 74], указанные свойства характерны для пигментов,
относящихся к фуппе меланоидинов. УФ-спектры 2, 5, 6 и 10 зон ком­
понентов (рис. 3.16) имеют максимум при 275-280 нм, что также под­
тверждает правомерность отнесения их к меланоидиноподобным веще­
ствам. Указанная полоса обусловлена карбонильной группой [1], со­
пряженной с кратными связями и ОН-фенольными группами в полифенольных фрагментах (положительная реакция с салициловым альдеги­
дом [143, с. 182]).
124
Глава 3
Рис. 3.16. ИК-спектры фракций меланоидинов:
1 —карамели зоны 4; 2 - ПЩР зоны б; 3, 4, 5, 6 - меланоидины хроматографи­
ческих зон 2, 7, 8 и 10 соответственно
Меланоидины зоны 8 (рис. 3.15, кривая 8) имеют полосу поглощения
при 260 нм. Известно, что в УФ-спектрах отдельных фракций меланоиди­
нов сахарного производства, полученных при взаимодействии лизина с
сахарами [1], наблюдается такой же максимум. Смещение этой полосы по­
глощения в сторону более коротких волн по сравнению с меланоидинами
зон 2, 5, 6 и 10 может быть связано либо с более короткой цепью сопряже­
ния вещества зоны 8, либо с присутствием (наряду с С =0) групп - H O N - в
гетероциклах [170, 175]. Доказательством последнего является положи­
тельная реакция с солями диазония (розовое окрашивание) [143, с. 60], ха­
рактерная для имидазольных группировок. Вероятным может быть отнесе­
ние максимума при 260 нм к -H C = N - в основаниях Шиффа (положитель­
ная реакция с раствором фторбората 4-нитрофенилдиазония - розовое ок­
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
125
рашивание в слабокислой среде с веществом зоны 8). Кроме того, наличие
полосы 1508 см-1 (рис. 3.16, пик е) в ИКС меланоидинов зоны 8 косвенно
подтверждает наличие сопряженных -H C = N = связей [170], которые отсут­
ствуют в остальных меланоидинах. Представляет интерес наличие харак­
терного максимума при 319 см-1 для меланоидинов 8 зоны, появляющегося
при взаимодействии сахарозы с лизином [1, 74]. Можно полагать, что ме­
ланоидины этой зоны образуются при взаимодействии лизина с сахарами в
процессе биосинтеза аминокислоты. Анализ ИК-спектров (кривые 3, 4, 5, 6
рис. 3.16) меланоидинов показал, что все фракции этой группы пигментов
имеют общие полосы поглощения.
Ш ирокий максимум при 3438-3150 см-1 {o') характерен как для ва­
лентных колебаний О Н, так и для валентных колебаний аминогрупп [74,
170], участвую щ их в межмолекулярной водородной связи. Пик при
2940 см-1 ( б ') обусловлен валентными колебаниями метильных и мети­
леновых групп [170]. Полоса поглощ ения 1722 см-1 (в') вызвана колеба­
ниями С = 0 в не диссоциированных СО О Н -группах [170]. Как известно
[1, 174—178], меланоидины могут быть отнесены к классу высокомолеку­
лярны х аминокислот. При этом карбоксильные и аминогруппы могут
образовывать внутрисолевую связь, давая цвиттер-ионы. Наличие в ме­
ланоидинах производства лизина внутрисолевой связи подтверждается
появлением в ИК-спектрах пиков 1568, 1320 см” (д\ з ') - асимметрич­
ные и симметричные колебания -С О О ”, и 1624, 1222 см-1 (г\ и’) - коле­
бания N H 3+-rpynn в цвиттер-ионах [170]. Кроме указанных выше макси­
мумов, в И К-спектрах меланоидинов имеются полосы поглощения
1400 см-1 (ж - метальные группы); 1120, 1075 см-1 (к', л ' - С -О -С связи
в лактонах или гликозидные связи); 990 см~ (м' -С Н колебания в С=СНгруппах); 916, 862, 770 см-1 (н', о', п' - колебания в кольце пиранозы).
Молекулярные массы отдельных компонентов, содержащихся в мела­
ноидинах, определяли методом гельпроникающей хроматографии на Сефадексах G-50 и G-200 путем предварительного построения калибровочной
кривой. При калибровке использованы белки с известной молекулярной
массой, для которых определяли элюционный объем. Последний в значи­
тельном диапазоне является практически линейной функцией логарифма
величины молекулярной массы. Затем определяли элюционный объем изу­
чаемого меланоидина из отдельной хроматографической зоны и с помо­
щью калибровочной кривой находили молекулярную массу пигмента.
Для установления эмпирических формул был проведен элемент­
ный анализ меланоидинов. На основании данны х по молекулярным
массам и элементному составу меланоидинов были установлены ориен­
тировочны е формулы изучаемых веществ.
126
Глава 3
3.16. Свойства отдельных фракций окрашенных веществ из
лизинсодержащих растворов
№
зо­
ны
Моле­
куляр­
ная
масса
1
22500
2
20000
3
13000
Ради­
ус
Ун, моЗаряд
мл
лек.,
А
28 22,1 Положи­
тельный
30 20,2 Положи­
тельный
35
14,6 Положи­
тельный
Эмпирическая
формула
Бром
рК.(|/рКа(2) иое Pi
число
(С ю-| 1Н49О2Р-?1^ 4)40 2,58/10,47
17
9,2
(C9-mH250|7_|gN4)42 2,34/9,66
6
8,8
2,00/9,12
3
7,9
(CllH20.22O8.9N)42
М етодами гельпроникающ ей и бумажной хроматографии были
выделены шесть компонентов меланоидиноподобных веществ из лизин­
содержащих растворов. В табл. 3.16 приведены свойства трех отдель­
ных окраш енных компонентов, сопутствую щ их выделению лизина и
имеющих константы ионизации 2,0-10' 3 - 6,2-10' 3 по группам -С О О Н .
Остальные три компонента меланоидинов содержатся в незначительных
количествах и их выделение для количественного анализа затруднено.
Таким образом, цветность культуральной жидкости производства
лизина обусловлена наличием в ней меланоидинов, карамелей и про­
дуктов щ елочного распада инвертного сахара.
Окраш енные компоненты отличаются от аналогичных красящих
веществ сахарного производства.
Меланоидины, выделенные из ферментационной жидкости ПО «Ли­
зин» (Чаренцаван, Армения), с использованием бумажной и гельпрони­
кающей хроматографии на Сефадексе G-150 разделили на 9 зон. В ре­
зультате удалось сконцентрировать пигменты в трех гель-хроматографических зонах, которые оказались идентичны по молекулярной массе
меланоидинам, выделенным из КЖ опытно-промышленной установки
«ВНИИГенетика» (Москва). Однако по другим физико-химическим свой­
ствам они отличаются (рис. 3.17 и 3.18).
Из рис. 3.17 видно, что меланоидины первой зоны (кривая 1) име­
ют максимум поглощения при 252 и 315 нм в водных растворах. В эти­
ловом спирте этот же компонент имеет характеристические полосы при
245 и 304 нм. Согласно литературным данным [1, 170], максимум в об­
ласти 240-250 нм может быть обусловлен карбонильной группой С = 0 ,
сопряженной с кратными связями (переход п —* л*) или соединениями
типа R3C -C H = N R (переход п —* л*). Интересным является то, что для
остальных меланоидинов (кривая 2, кривая 3) максимума в области 3 0 0 320 нм не наблюдается. В данном случае можно говорить о значитель­
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
127
ной похожести отдельных компонентов меланоидинов, полученных в
лабораторных и производственных условиях.
Х,нм
Рис. 3.17. УФ-спектры фракций меланоидинов, выделенных методом
ГПХ на Сефадексе G-150:
/, 2, 3 —компоненты первой, второй и третьей зоны соответственно (водные
растворы); 4 - компонент первой зоны (растворитель - этиловый спирт)
На рис. 3.18 приведены ИК-спектры отдельных компонентов мела­
ноидинов, выделенных с помощью бумажной и ГПХ.
Весьма существенное значение при расшифровке ИК-спектров ме­
ланоидинов имеет корреляционный материал. При составлении корре­
ляционных данных табл. 3.17, характеризующих зависимость между
строением молекул меланоидинов и их ИК спектрами, были использо­
ваны данные из работ [1, 74, 102, 170, 172-179].
Все три компонента, содержащиеся в первых гель-хроматографических зонах, имеют общие полосы поглощения. Широкий максимум
при 3 6 3 0 -3 4 0 0 см характерен для валентных колебаний групп NH и
ОН, участвующих в межмолекулярной водородной связи. Пик в области
3352 -3 1 3 6 см"1 может быть обусловлен названными выше колебаниями,
а также валентными колебаниями NH 3+ в аминокислотах.
Полосы поглощения 2920-2850 см" характерны для валентных коле­
баниям метальных и метиленовых групп. Присутствие метальных и мети­
леновых ф упп подтверждается также в области 1450,1362 см"1 [172-179].
Глава 3
128
-f
I ) , CAf
Рис. 3.18. ИК-спектры фракций меланоидинов:
Первая цифра после номера означает зону, выделенную методом ГПХ; вто­
рая —методом БХ. А - поглощение, %; v - волновое число, см~
Полосу поглощения в области 1730-1705 см-1 можно отнести к ко­
лебаниям карбонильной группы в карбоновых или аминокислотах. М е­
ланоидины, согласно литературным данным [1, 74, 102, 286], относятся
к высокомолекулярным аминокислотам. ИК-спектры изученных нами
меланоидиноподобных веществ лизинового производства также позво­
ляю т отнести их к выш еназванному классу соединений.
При этом можно говорить о возможности существования меланои­
динов, сопутствую щ их производству лизина, в цвиттер-ионной форме.
Об этом свидетельствует наряду с полосами поглощения 3352-3136 см-1
(указанными выш е) наличие максимумов при 1643-1646 см-1, характер­
ных для колебаний N H 3+ в аминокислотах (полоса амид И). Кроме того,
об этом же свидетельствует наличие пика при 1610-1604 см-1, харак­
терного для аминокислотной полосы амид 1 (0 =0 ), асимметричных и
антисимметричных колебаний СОО~ групп, проявляющихся в виде по­
лос при 1587-1566 см' 1 и 1339-1320 см-1 соответственно [1, 172-179].
Полоса поглощения обусловлена наличием связей C=N, сопряженных с
кратными связями [74, 170]. Это находит свое подтверждение и в
УФ -спектрах (максимум X —252 нм).
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
129
3.17. Отнесение максимумов поглощения в ИК-спектре
меланоидинов отдельных гель-хроматографических зон
Частота колебаний, см"
зона
зона
на №1-3
№1-1
№1-2 30
1
2
3
3630
3672
3686
3556
3584
3540
3542
3476
3430
3418
3398
3350
3346
3352
3136
3274
3276
2908
2920
2894
2851
2858 1 2876
1784
1769 I 1786
Характер колебаний
4
Залентные колебания групп NH или ОН, участаующих в межмолекулярных водородных связях
То же, но возможны и валентные колебания
NH3+ в цвиттер-ионах (в аминокислотах)
Валентные колебания СН, СН2, СН 3~ групп
|Валентные колебания С = 0 (амид 1) в цикличе­
ских (3-лактамах
1730
1728 | 1731 1Валентные колебания С = 0 (в кетонах, карбоно1вых кислотах, аминокислотах в виде неионизи1705
1706
гаованного карбоксила)
1689
1678 1 1691 1С=С, возможно сопряженные с С = 0 ; кроме того,
1666
1663 1 1658 1в данной области проявляются колебания МН3+
1643
1646 1 1644 1в аминокислотах или колебания 8 "N-H (амид 11)
1629
1629
1629 1Асимметричные деформационные колебания
1610
1615
1604 1МН3+ в аминокислотах (цвиттер-ионах); амино­
кислотная полоса амид 1 (С = 0)
1587
1592
1582 \ Асимметричные валентные колебания СОСГ1571 Irpynn. Возможны колебания в фуранозном
157:1
1567
1556 \кольце
155 S
1552
1508 1 Отсугсгг. \ Отсутст. (Колебания C=N связи, сопряженной с краткими
1
(связями
1452 1 1451 1 1449 1Плоское деформационное колебание СН в
1428 1 1426 1 1426 !1—С=С—Н группах
1409 1 1411 1 1410
1355 1 1346 1 1362 (Деформационные колебания метильных групп
1320 1 1313 1 1339 |Симметричные валентные колебания СОО"
\(в карбоновых или аминокислотах)
1154
1160 \Асимметричные v колебания - C - 0 - C - ; колеба1129 i И54
1129 1 1149 \ния С -О или ОН-спиртовых групп
1115 \ 1109 \ 1110
1103 \ 1080 \ 1095
1036 I
1039 1
1044 (Валентные колебания С -О групп (возможно
993 \ 1009 \ 1016 |в СООН)
5—31%
Глава 3
130
Продолжение таблицы 3.17
1
903
862
848
792
769
756
726
2
911
859
846
790
763
756
703
3
913
860
843
762
4
Колебания типа 2 в пиранозе
Колебания типа 1 в пиранозе или колебания
в кольце фурана
Пульсационные колебания пиранозных
или фуранозных колец
706
Заслуживает внимания наличие в меланоидинах № 1-1 пика 1508 см-1,
который отсутствует в ИК-спектрах других меланоидинов лизинового про­
изводства. Можно полагать, что указанная полоса обусловлена наличием
связей C=N, сопряженных с кратными связями [72, 170]. Интересным фак­
том является наличие во всех трех зонах пиков в области 1691-1658 см” ,
которые могут быть вызваны С=С связями, сопряженными с С = 0 [1, 74,
170]. Это подтверждается результатами, полученными при бромировании
компонентов всех трех изученных зон. Наибольшее число сопряженных
кратных связей содержат молекулы меланоидинов зоны № 1-1 (19 молекул
Вг2 взаимодействуют с одной молекулой пигментов); зоны № 1-2 (8 моле­
кул Вг2) и зоны № 1-3 (4 молекулы Вг2 на одну молекулу меланоидинов).
Следует отметить также значительные отличия для рассматривае­
мых спектров (по сравнению с меланоидинами сахарного производства) в
области 1806-1751 с м '1. Полосы поглощения 1786-1769 с м '1, имеющиеся
в ИК-спектрах меланоидинов лизинового производства, могут быть вы­
званы присутствием циклических Р-лактамов [170] и не наблюдаются в
меланоидиноподобных продуктах других производств.
Кроме указанных полос поглощения в ИК-спектрах наблюдаются
максимумы, характерные для колебаний С -О -С , С-О (1181-1080 и
1136-993 с м '1), а также колебаний в пиранозных и фуранозных кольцах
(913-843 см' 1 и 792-703 с м '1) [1, 170, 174]. Таким образом, исходя из
результатов спектрофотометрических исследований, меланоидины лизи­
нового производства можно характеризовать как высокомолекулярные
аминокислоты, способны е^ образованию цвиттер-ионов и имеющие в
своем составе цепи сопряжения, а также гетероциклические структуры.
Сравнение соотношения основных групп и связей, имеющихся в
отдельных компонентах меланоидинов, проводят по относительной ин­
тенсивности их максимумов в ИК-спектрах методом базисной линии.
В качестве сравнения выбирается полоса колебания метальных групп
при 1400 см~ , так как последние стабильны при меланоидинообразовании. В табл. 3.18 приведены значения К„ = И„/ И, где А и А„ - высоты
максимумов для метильных групп (1400 см-1) и пиков для отдельных
функциональных группировок.
131
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
При сопоставлении результатов табл. 3.18 видно симбатное измене­
ние относительной интенсивности пиков, соответствующих колебаниям
NH3+ и СОСГ групп, для всех пигментов. Причем соотношение KJK$ для
веществ первой, второй и третьей гель-хроматографических зон состав­
ляет близкие величины и равно 1,25; 1,31 и 1,20 соответственно.
3.18. Относительная интенсивность максимумов,
соответствующих различным функциональным группам,
для меланоидинов в гель-хроматографических зонах
Номер
зоны
К,
Кг
Ki
к4
Ks
Kf
AV
1-1
1-2
1-3
0,65
0,29
0,25
0,74
0,39
0,41
1,02
0,45
0,69
1,17
0,88
0,89
0,93
0,67
0,74
1,04
-
1,02
1,10
1,21
-
Примечание: h\, h2, й3, й4, й5,
й7 - высоты полос поглощения 1768 (С = 0 в
Р-лактамах); 1728 (С = 0 в недиссоциированных СООН): 1663 (С=С); 1629 (NH3+
в цвиттер-ионах); 1567 (СОСГ1в цвиттер-ионах); 1508 (C=N); 1154 см-1 (С -О -С )
соответственно.
Известно, что интенсивность окраски органических веществ в значи­
тельной степени зависит от длины цепи сопряжения. Результаты табл. 3.18
свидетельствуют, что количество сопряженных С=С и C=N связей (К} и
КА) в меланоидинах первой зоны значительно больше по сравнению с пиг­
ментами второй и третьей зон. Это объясняет повышенную интенсивность
поглощения в видимой части спектра меланоидинов зоны № 1-1. Следова­
тельно, соотношение общих функциональных групп в отдельных компо­
нентах меланоидинов различно.
3 .2 .3 . Меланоидины других аминокислотных
производств
В предыдущих разделах рассмотрены основные пути образования
пигментов, обладающих свойствами меланоидинов, при получении са­
хара и лизина. Кроме того, представлены данные, которые позволяют
рассматривать процесс меланоидинообразования (генезис) с общих по­
зиций для других производств. При этом основополагающими реакция­
ми в меланоидинообразовании являются процессы конденсации азотсо­
держащих веществ с альдегидами, сахарами и фенолами.
В табл. 3.19 приведены основные физико-химические характери­
стики индивидуальных компонентов меланоидинов, выделенных из
производственных растворов некоторых аминокислот. Данные исследо­
вания проведены на кафедре аналитической химии Воронежского госуниверситета за последние 25 лет и представляют интерес для других
исследователей, работающих в этой области.
Глава 3
132
3.19. Физико-химические свойства меланоидинов аминокислотных
производств
Стадия
Произ­
перера­
водство
ботки*
Лиз
Лиз
Глу
Формула
ФР
(C||H49OMN4)40
МР
(C ioH290[|N4)«
БМ ’”
(С10H25017^4)82
ГКЛ
(C.oR.AoNg)*,
М РГ
(C.oR hO.oN,,)*,
ФР
(С^НадОго^Ьб
МР
(С 12Н32О ^N2)28
(CmH390 16N3)29
(С15Н „ 01
6К 6)м
(С)| H22O9N4) |27
БМ
Три
ФР
Про
ФР
Вал
МР
Смесь
амино­
ГК
БМ
Мол.
мас­
са»
кДа
22,5
20,0
40,0
17.5
17.5
13,5
11,4
14,7
26,6
45,8
19.0
(СщЩмО16^3)43 16.0
(С 1j H j o C ^ t y ^ 27,5
(С 15Н3201$N9 ) 4 4
м
Pi
Г . в нм рК. рК, pKR
22,1
20,2
29,2
15.6
15.6
8,0
8,2
7,6
8.9
8.9
0,356
0,379
0,112
0,021
0,021
260 2,52 9,55 8,20
285 2,50 9,06 7,30
280 3,30 11.0 7,40
225
225
19,0
12,6
20,7
24,6
36,0
17,3
18,9
29,2
3,9
4,8
4,5
6,8
8,1
5,2
5,0
8,4
0,185
0,209
0,165
0,182
0,076
0,258
0,216
0.099
310
290
276
280
276
275
275
268
2,60
2,66
3,28
2,80
2,96
2,90
2,86
3,68
7,20
7,63
7,80
8,30
8,68
8,70
9,12
9,80
4,30
5,40
5,60
10,4
7,10
7,90
7,00
кислот
Примечание: ФР, МР, БМ - ферментационный, маточный растворы и биомасса
(без аминокислот) микробиологических производств; ГКЛ, МРГ - гидролизат и
маточный раствор после выделения лизина из гидролизата капролактама;
** электрокинетический потенциал £ *** для меланоидинов Лиз (ФР) имеется
max при А.= 312 нм.
Необходимо отметить, что меланоидины различных аминокислот­
ных производств отличаются по молекулярным массам, размерам моле­
кул и изоэлектрическому состоянию. Общим для них является наличие
основных (аминогрупп), кислотных (карбоксильных) и R-групп, спо­
собных к протолизу. Такими R-группами могут быть фенольные, кар­
боксильные, им ино-, 5-аминогруппы. Константы протолиза этих функ­
циональных групп позволили рассчитать диаграммы равновесий инди­
видуальных меланоидиноподобных компонентов в зависимости от кон­
центрации ионов гидроксония (рис. 3.19, рис. 3.20).
Общим свойством меланоидинов аминокислотных производств яв­
ляется их способность существовать в форме ионов различной зарядности, в том числе и в виде биполярных ионов [71-75, 102, 103, 113, 114,
150, 279, 280]. Пигменты, обладающие свойствами меланоидинов, по­
лученные при микробиологическом, гидролизном и химическом спосо-
133
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
бах выделения аминокислот, различаются по молекулярной массе, спо­
собности к светопоглощению, по изоэлектрическому состоянию. При­
чем биполярные состояния меланоидинов глутаминового и лизинового
производств различаются наиболее существенно, что свидетельствует
об участии молекул целевой аминокислоты в «строительстве» макромо­
лекулы пигмента.
/
0.8
0.6
0,4
0,2
О
pH
pH
Ис‘ 3*19. Диаграммы равновесий в растворах меланоидинов
производств лизина (о - ФР; 6 - БМ), глутаминой кислоты
(в - ФР; г - МР) и триптофана (д - ФР) производств.
Обозначения в табл.3.19
134
Глава 3
-----
а
6 8 10 12 14
pH
pH
Рис. 3.20. Диаграммы равновесий в растворах меланоидинов
производств триптофана (а - БМ), пролина (б - ФР),
валина (в - МР) и гидролизного (г - ГК). Обозначения
в табл. 3.19
3.2.4. Меланоидины производства лимонной кислоты
Производство и выделение лимонной кислоты всегда сопровожда­
ется образованием окрашенных соединений. При этом необходимо учи­
тывать специфическое влияние основного продукта, то есть лимонной
кислоты на процесс пигментообразования. Представляется целесооб­
разным рассмотреть образование пигментов на начальных стадиях
взаимодействия моносахарида и аминокислоты в присутствии лимонной
кислоты. Выбор моносахарида обусловлен тем, что по сравнению с дру­
гими сахарами он в наибольшей степени способен к образованию окра­
шенных продуктов. Использование глутаминовой кислоты вызвано
присутствием ее в исходном сырье (мелассе) при получении лимонной
кислоты, а также энергичным взаимодействием аминокислоты с саха­
рами в реакциях меланоидинообразования [1, 71-74, 102].
Для приготовления растворов использовали 15%-ную лимонную ки­
слоту, различные количества моносахарида и глутаминовой кислоты
(табл. 3.20). Смеси выдерживали 8 ч при 90 °С и разрежении 0,05 атм. За это
135
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
время растворы сгущались до 75% лимонной кислоты, т. е. в 5 раз. В качест­
ве холостых (наряду с лимонной кислотой) применяли растворы 16, не со­
держащие гидроксикислоту. При разделении образующихся окрашенных
веществ пользуются методом восходящего бумажного хроматографирова­
ния (Filtrak № 11). Растворитель - смесь н-бутилового спирта, ледяной ук­
сусной кислоты и воды в соотношении 4 : 1 : 5 . Время деления 22 ч. В каче­
стве одного из критериев, дающих надежные результаты, является опреде­
ление концентрации аминокислоты в процессе пигментообразования.
3.20. Взаимодействие фруктозы и глутаминовой кислоты
в лимоннокислых средах
a
(M
A
\
\
2
2
0
0
- .■г
3
0
A
H
5
0
А С
(0,0340)
3
0
0,5
(0,0278)**
0,2
(0,0110)
0,1
, (0,0055)
0
1
(0,0238)
0,5
(0,0340]
0,5
(0,0340)
0,1
(0,0068)
0,2
1^0136
0,5
(0,0340)
1,01
(0,0680)
4
Т
0
0
5
0,003
0,033
0
0,015
0,14
0
0,009 ]
0,05
1 1,26
Т 1,24
0
0,003 1
0***
| 1,38
0,67
0,72
1,36
0,44
0,098
(0,007)
° ’2
(0,0110)1
0,1
(0,0055)
0,5
(0,0278)
0,5
Щ 278)
0,5
(0j0278)
□ ° » 5L
10;0278)
0,040
6
#•
0
в
u
о
я
о
о#
a
Концентрация ком­
Оптическая плотпонентов в 100 мл
pH раствора
Количество
ность
1(сходного раствора, г глутаминовой
кислоты,
УФвступившее видимая область
глутами­
после
исход­
новая
фруктоза в реакцию,
область \ =282 нм
упари­
ный
г/100 мл р-ра к=535нм
кислота
(разб.
1
вания
128 раз)
0,33
7
1 1,27
1,28
8
0,28
0,22
0,27
0,29
(0,006)^
0,066
jO.004)
I 0,033
JO,002)
10,071
„(0,005)
0,153
iOjOlO)
0,356
j0;024)
1,57
0,68
136
Глава 3
Продолжение таблицы 3.20
1
13
14
15
16
2
0,3
(0,0136)
0,2
(0,0136)
0,2
(0,0136)
0,2
(0,0136)
3
0,1
(0,0055)
0,2
(0,0110)
1,0
(0,0550)
1,0
(0,0550)
4
0,070
(0,005)
0,087
(0,006)
0,090
(0,006)
0,063
(0,001)
5
0,019
6
0,15
7
1,32
8
0,36
0,031
0,35
1,32
0,34
0,148
3,14
1,32
0,31
0,040
0,55***
3,15
2,91
Примечание: толщина измеряемого слоя ^ = 1 0 мм; ** в скобках даны концен­
трации компонентов в моль/л;
максимум в УФ-области раствора 16 наблюда­
ется при \ = 272 нм (разбавление в 4 раза). Растворы 1 и 5 при снятии
УФ-спектров не разбавляли.
Концентрацию глутаминовой кислоты (ГК) определяли методом БХ
и с помощью нингидриновой реакции. Результаты свидетельствуют, что
значительное окрашивание растворов достигается, когда исходная концен­
трация фруктозы и глутаминовой кислоты не ниже 0,0278 и 0,0136 М со­
ответственно (табл. 3.20). При уменьшении содержания одного из компо­
нентов наблюдается резкое уменьшение окрашивания. Следует отметить,
что не вся аминокислота используется в реакции пигментообразования.
На рис. 3.21 показано влияние молярного соотношения ГК - фруктоза
(Сгк/ф - кривая /) и фруктоза - ГК (Сф/пс - кривая 2) на оптическую плот­
ность D модельных растворов. Для точек кривой 1 содержание фруктозы в
исходных растворах постоянно и равно 0,0278 моль/л; для точек кривой 2
содержание ГК постоянно и равно 0,0136 моль/л. Штриховой линией пока­
зано изменение D растворов от количества ГК (Срк Ю42 моль/л), вступив­
шей в реакцию. Из рис. 3.21 и табл. 3.20 следует, что на интенсивность ок­
раски влияет как концентрация, так и соотношение аминосоединения и
моносахарида в исходных растворах. С увеличением концентрации фрук­
тозы (кривая 2) наблюдается рост цветности во всем интервале концентра­
ций. С увеличением содержания глутаминовой кислоты (кривая /) вначале
цветность значительно увеличивается, а затем наблюдается стабилизация
(даже незначительное уменьшение). Аналогичная зависимость наблюдает­
ся и при рассмотрении изменения D от количества глутаминовой кислоты,
вступившей в реакцию образования пигментов (штриховая линия). Следует
заметить, что при упаривании растворов лимонной кислоты без добавок, а
также в присутствии только ГК в лимоннокислых растворах окрашивания
практически не происходит. При совместной реакции ГК и моносахарида
цветность увеличивается в 2-5 раз по сравнению с растворами, содержа­
щими только фруктозу (табл. 3.20).
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов_____________
137
Абсорбционные кривые для всех модельных растворов (за исклю ­
чением 16) имеют максимум при 282 нм (табл. 3.20) и конф игурацию
кривой раствора 10 (кривая 2, рис. 3.21). Наибольшей оптической п лот­
ностью в УФ-области из растворов с исходным содержанием ф руктозы
0,5 г/100 мл обладает раствор с концентрацией ГК 0,2 г/100 мл; наи­
меньшей - 1,0 г/100 мл (табл. 3.20). Это также подтверж дает неодно­
значное влияние ГК на возникновение окрашенных продуктов. И з р ас­
творов (с постоянным исходным содержанием ГК 0,2 г /100 мл) наи­
большей D b УФ-области обладают растворы 15 с 1,0 г /100 мл ф рукто­
зы. Отсутствие ГК приводит к меньшей окрашенности растворов при
упаривании и к изменению характера абсорбционной кривой раствора
16. Максимум поглощения находится при 272 нм. М ожно предполо­
жить, что в данном случае на образование окрашенных вещ еств и на их
природу влияет кислотность раствора.
<)
to
to
to
to
с ф )гк
Рис. 3.21. Взаимодействие фруктозы и глутаминовой кислоты
в лимоннокислых растворах:
1 - при изменении С глутаминовой кислоты; 2 —при изменении С фруктозы
Хроматографическое разделение окрашенных продуктов указы вает
на справедливость высказанных положений. Хроматограммы растворов
2, 3 и 4 (табл. 3.20), содержащих в качестве добавки только ф руктозу,
имеют одну зону (Rf = 0 ,86) с максимумом при длине волны 2 8 2 нм и
дают с мочевиной синюю окраску. Заряд вещества в этой зоне б ли зок к
нулю. Эти результаты \ \ , 63, 65, 72, 73, \ \ \ - \ \ 3 " \ позволяю т отнести
вещество к карамелеподобным продуктам.
138
Глава 3
При хроматографировании модельных растворов 6-15 (табл. 3.20)
образуется пять зон. Параллельные опыты с чистой глутаминовой кисло­
той показали, что она образует только одну зону (которую использовали
для определения аминокислоты в растворах). Вещество зоны с Rf = 0,09
(кривая 3, рис. 3.22) имеет положительный заряд и проявляется нингидрином в виде сиренево-фиолетовых пятен. Рассматриваемая полоса может
быть отнесена к меланоидинам [1, 102]. Остальные три зоны модельного
раствора (первая - с R{= 0,69; вторая - с R(= 0,77; третья - с Rf = 0,86; со­
ответственно, кривые 4, 5, 6) имеют заряд, близкий к нулю, окрашиваются
мочевиной в синий цвет, что позволяет их отнести к карамелеподобным
веществам [1, 63, 65, 111-113]. Отметим, что при хроматографировании
окрашенных продуктов из растворов 11 и 12, которые содержали значи­
тельное количество ГК, вместо одной было получено две зоны меланои­
динов (Rf0,09 и 0,15). Интенсивность же окраски мочевиной зон, харак­
терных для карамелей, растворов 11 и 12 значительно ниже по сравнению
с раствором 10 (кривая 1, рис. 3.22). Для раствора 16 (отсутствие ГК) из
окрашенных веществ проявляется лишь зона меланоидинов с Rf= 0,09,
характеризующаяся абсорбционной кривой 2 с максимумом 272 нм. Полу­
ченные результаты свидетельствуют о том, что присутствие лимонной
кислоты способствует образованию карамелеподобных веществ.
нм
Рис. 3.22. Оптическая плотность проявленных хроматографических
зон модельных растворов:
1, 2 - модельные растворы 10 и 16 соответственно. Разбавление растворов:
1 —в 128 раз; 2, 5 и 6 - в 4 раза; 3 и 4 —без разбавления
139
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
Интересным является проявление максимума поглощения у мела­
ноидинов, образующихся в присутствии ГК (кривая 5), при 270 нм - в
той же области, что пик поглощения меланоидинов, полученных в отсут­
ствие гидроксикислоты (кривая 2). Следовательно, меланоидины, полу­
ченные при выбранных условиях упаривания (pH = 1,3-3,1), отличаются
от подобных продуктов, содержащихся в сахарных растворах [1]. Можно
полагать, что в наших опытах наблюдается неполная альдегид-ам инная
поликонденсация, так как реакция образования меланоидинов представ­
ляет сложный процесс, сопровождающийся образованием промежуточ­
ных соединений.
•1
1), СМ
Рис. 3.23. ИК-спектры меланоидинов (кривая /) и карамелей:
(кривые 2, 3, 4 - четвертая, пятая и шестая кривые на рис. 3.22)
Для установления характера функциональных групп были сняты
ИК-спектры хроматографических зон меланоидинов и карамелей
(рис. 3.23). Пики а, б, в, г, д, е, ж, з, и, к, л, м соответствуют полосам
поглощения 3408, 3254, 2922, 1725, 1626, 1568, 1412,1205, 1136, 1056,
140
Глава 3
899, 878 см” . В ИК-спектре меланоидинов имеются полосы 1725 см”
(С=0 в группах -СООН) [5,7,9]; 3408-3294 см' 1 (свободные и ассоции­
рованные аминогруппы); 1136-1056 см”1 (С-О -С в лактонах) [170, 172—
178]; 878, 706 см”1 (колебания в кольце фурана) [1, 170, 173]. Известно,
что СООН и аминогруппы могут образовывать в меланоидинах внутрисолевую связь. При этом СООН-группы диссоциируют с образованием
СОО” и становится возможным резонанс между двумя С-О связями
[179]. Наличие в меланоидинах лимоннокислого производства внутрисолевой связи подтверждается проявлением в ИК-спектре пиков 1568,
1412 (асимметричные и симметричные валентные колебания -СОО”) и
1626,1267 см” (колебания NH3+ -групп в цвиттер-ионах) [174-179].
Карамелеподобные вещества содержат карбоксильные (1725 см”');
С=0-связи, сопряженные с другими двойными связями (1626 см” ); ме­
тальные группы (1397 см”1и 2922 см”1); С-О-С в лактонах (1130-1059 см’1);
фуранозные кольца (899-746 см”1) [1, 170, 173, 186]. Необходимо подчерк­
нуть, что карамели второй и третьей хроматографических зон имеют похо­
жие ИК-спектры. Для первой зоны (по сравнению со второй и третьей) ха­
рактерна очень сильная интенсивность пика СООН-группы (1725 см”1),
С-О-гликозидных связей (1205 см”1), а также менее четкие полосы в облас­
ти ассоциированных ОН-групп (3254 см”1) [102,179,186].
Таким образом, глутаминовая кислота принимает непосредствен­
ное участие в реакции меланоидинообразования, а также оказывает ка­
талитическое действие на образование карамелей.
Необходимо отметить, что возможно несколько путей образования
окрашенных продуктов в лимоннокислых производственных растворах.
Содержащиеся в небольших количествах (после ионитовых колонн)
соединения, имеющие группировки СО-СН3 или R-CH=C(OH)-CHO, а
также сами моносахариды при повышенной температуре взаимодейст­
вуют со следовыми количествами аминосоединений (амины, амиды,
аминокислоты, пептиды), которые содержались в мелассе. В этом слу­
чае будет наблюдаться образование меланоидиноподобных окрашенных
соединений. Второй путь - образование карамелей при термическом
разложении сахаров, которые присутствуют в производственных рас­
творах лимонной кислоты.
Как видно из табл. 3.21, при X = 360 нм D раствора до ионитовой
обработки равна 0,35 и после ионитовых фильтров - 0,02. Следователь­
но, иониты КУ-2 и АВ-16Г, применяемые в производстве лимонной ки­
слоты, сорбируют часть окрашенных продуктов и соединений, погло­
щающих в УФ-области спектра.
После упаривания основного и маточных растворов характер спек­
тров поглощения по сравнению с растворами до упаривания изменился.
Появился четко выраженный максимум при 280-285 нм и минимум при
255 нм. Максимум в области 280-285 нм чаще всего обусловлен карбо-
141
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
нильной группой С=0. Характер пика на кривых поглощения изучае­
мых окрашенных растворов совпадает с положением пика для меланои­
динов и карамелей. Минимум при 225 нм совпадает с минимумом кри­
вой поглощения меланоидинов, содержащих С = 0 группы. Следователь­
но, можно полагать, что в растворах после упаривания образуются ок­
рашенные компоненты, сходные с меланоидинами и карамелями. При
X = 360 нм упаренные растворы (разбавленные в 11 раз) имели оптиче­
ские плотности 0,03; 0,05 и 0,22. Оптическая плотность основного рас­
твора приблизительно в 6-7 раз ниже плотности маточных растворов.
Цветность растворов нарастает в процессе их температурной обработки.
3.21. Появление цветности в производственных растворах
лимонной кислоты (г. Белгород)
Разложенный
После ионитной
обработки
Основной
Маточный чистый
Маточный грязный
Оптическая плотность
D при 3l = 360 нм
Разбавление
Качественная
реакция
на сахара
0,35
0,02
Не разбавлен
Не разбавлен
—
о О
оU t оы
Наименование
раствора
В 11 раз
+
В 11 раз
В 11 раз
+
+
0,22
Окрашенные вещества (табл. 3.22), содержащиеся в маточных рас­
творах, электрофоретически разделяются на пять зон. Заряд компонен­
тов первой зоны близок к нулю, так как они остаются на линии старта.
Под действием мочевины вещества, содержащиеся в первой зоне, окра­
шиваются в зеленовато-синий цвет. Раствор мочевины является реакти­
вом на олигосахариды, кетозы и проявляет карамели сахарного произ­
водства в виде зеленовато-синих пятен на бумажных хроматограммах.
В УФ-свете первая зона флуоресцирует. Эти эффекты позволяют пред­
положить наличие в первой электрофоретической зоне веществ, напо­
минающих карамельсодержащие продукты. УФ-спектры показывают
(рис. 3.24), что абсорбционные кривые растворов компонентов первой
зоны имеют четко выраженные максимумы при длине воды X = 282
(группа С=0) и 227 нм (группа СООН). Положение пиков при таких X
характерно и для карамелей сахарного производства [I, 170, 173].
Следует отметить, что продукты щелочного распада и меланоидины
дают на абсорбционных кривых только по одному пику при 265 и
285 нм, соответственно [1]. Следовательно, качественная реакция с рас­
твором мочевины, заряд компонентов, близкий к нулю, характерное све­
чение в УФ-свете и характер абсорбционных кривых позволяют отнести
окрашенные вещества в первой электрофоретической зоне к карамеле-
142
Глава 3
подобным веществам. Отметим, что модельные окрашенные вещества,
образующиеся при упаривании 60%-ной лимонной кислоты в присутст­
вии глюкозы или фруктозы, имеют свойства, подобные компонентам,
содержащимся в первой зоне маточных растворов. Это позволяет гово­
рить о принадлежности названных окрашенных соединений к карамеле­
подобным веществам, а не к продуктам щелочного распада сахаров.
3.22. Некоторые свойства окрашенных веществ, содержащихся
в электрофоретических зонах
Номер
зоны
1
2
3
4
5
Область рас­
положения
зоны
Не движется
Катодная
-II-
Окраска
зоны
Желтая
Бесцветная
Желтая
-//-
41-
41-
Бесцветная
1
1
Расстояние
Размер
середины
зоны,
зоны от линии
мм
старта, мм
Голубой
22
0
Бледно-желтый
13
68
Бесцветный
9
94
415
132
418
146
НМ
Рис. 3.24. УФ-спектры окрашенных компонентов производственных
растворов Белгородского завода лимонной кислоты:
I - карамели; 2, 3, 4, 5 - меланоидины
143
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
Для установления наличия в веществе функциональных групп полу­
чены ИК-спектры (рис. 3.25, 3.26) первой электрофоретической зоны. По­
лосы при волновых числах 3060-3016 см-1 характеризуют колебания ассо­
циированных водородными связями ОН-групп [170, 173, 171]. Интенсив­
ный пик 1729 см' 1 можно отнести к колебаниям С=0-групп [2, 3, 6]. Мак­
симумы 1187-1052 см' 1 характерны в равной мере для колебаний С-О в
СООН-группах, колебаний С-ОН-групп и С-О-С-связей [170, 173]. Поло­
сы 1401, 1383, 1339, 1261 см-1 могут быть отнесены к метапьнометиленовым группам, а также к колебаниям С-О и ОН в карбоксильных
группах [170, 174]. Полученные данные говорят о наличии в карамелепо­
добных продуктах лимоннокислого производства карбонильных, спирто­
вых, метильно-метиленовых, карбоксильных, С-О-С-групп.
-1
и, см
Рис. 3.25. ИК-спектры карамелей лимоннокислого производства:
1. 2. 3. 4. 5. 6, 7, 8, 9. 10 - 3290. 3060. 1729. 1401, 1261. 1187. 1142. 1052, 898,
772 см~, соответственно
Вещества, содержащиеся во 2-5 зонах, под действием электриче­
ского тока движутся в отрицательную область (табл. 3.23), что говорит о
положительном заряде компонентов. Под действием раствора нингидрина зоны окрашиваются в сиренево-фиолетовый цвет. УФ-спектры
рассматриваемых веществ (рис. 3.24, кривые 2-5) имеют максимум при
285 нм. Все перечисленное позволяет отнести окрашенные компоненты
в зонах 2-5 к меланоидиноподобным веществам [1, 102].
В ИК-спектрах первой и второй зон меланоидинов, которые со­
держат большее количество окрашенных веществ по сравнению с ос­
тальными зонами, наблюдаются полосы 1714 и 1705 см-1 (рис. 3.26),
которые могут быть отнесены к колебаниям С=0-группы [170, 174].
Максимумы при 3306, 3102 и 1615 см" характерны для колебаний ами-
144
Глава 3
ногрупп [170, 173]. Пик 1056 см в равной мере относится как к ва­
лентным колебаниям С-ОН, так и к С-О-С-связям кольца пиранозы.
Рис. 3.26. ИК-спектры первой и второй электрофоретических зон
меланоидинов:
а, б, в, г, д, е, ж, з —3306, 1714, 1432, 1543, 1398, 1243, 1056, 898 см~соответ­
ственно
Следует заметить, что компоненты, содержащиеся к обеих зонах ме­
ланоидинов, достаточно близки по строению и имеют общие функцио­
нальные группы: амино-, карбонильные, карбоксильные, спиртовые, метильно-метиленовые (1398 см-1). Эти вещества способны существовать в
цвиттер-ионной форме (пик при 1243 см-1 присущ NH3+; при 1543 см-1 СОО-группам в амфолитах) [170, 174]. Таким образом, цветность ма­
точных растворов лимоннокислотного производства может быть обу­
словлена карамелями и меланоидиноподобными веществами.
Возможно несколько путей образования и накопления пигментов
при выделении и очистке лимонной кислоты.
Во-первых, реальным является увеличение содержания в маточни­
ках окрашенных компонентов мелассы, которая служит исходным
сырьем для получения кислоты.
Во-вторых, нарастание окраски может быть вызвано осмолением
сахаров и основного продукта, а также их взаимодействием со следами
аминосоединений, поступающих из мелассы в маточники.
Карамелеподобные вещества и меланоидины, образующиеся в ли­
моннокислых растворах, отличаются по строению от соответствующих
продуктов сахарного и лизинового производств.
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
145
3 .2 .5 . Меланоидины ферментных производств
Ферментное производство сопровождается образованием различ­
ных окрашенных соединений, которые затрудняют выделение целевого
продукта, снижают его активность, а в отдельных случаях приводят к
невозможности выделения продукта в чистом виде. Поэтому требуется
очистка ферментационных растворов от окрашенных соединений. Од­
нако в литературе отсутствуют сведения о составе и свойствах окра­
шенных веществ глюкоамилазного производства [294-301].
Известно, что производство любого фермента предусматривает на­
личие биомассы, питательной среды, продуктов метаболизма, которые в
той или иной мере участвуют в образовании пигментов. Пути их обра­
зования представляют собой весьма сложный процесс и в некоторой
степени могут напоминать окрашивание ферментационных растворов
при получении аминокислот [5-12].
Необходимо отметить, что окрашенные вещества, образующиеся
при получении и выделении сахаров, аминокислот, гидроксикислот [ 1,
21, 74], представляют собой сложную смесь компонентов, отличающих­
ся по структуре и свойствам. В случае аминокислот цветность произ­
водственных растворов обусловлена в основном наличием в них меланоидиноподобных веществ [74], которые относятся к высокомолекуляр­
ным веществам, содержат амидные связи, карбоксильные, карбониль­
ные, спиртовые, аминогруппы и способны существовать в виде бипо­
лярных ионов [1,21, 74, 102].
Механизм образования подобных пигментов обусловлен реакция­
ми между аминосодержащими соединениями и сахарами, является мно­
гостадийным (перегруппировка Амадори, дегидратация сахаров с обра­
зованием С-цепи, образование редуктонов, переаминирование, альде­
гид-амин ная полимеризация) и зависит от концентрации исходных ве­
ществ, температуры и продолжительности нагревания [1,21,97].
Изучение состава промежуточных продуктов меланоидинообразования позволяет установить механизм процесса. Однако для установле­
ния структуры и свойств окрашенных продуктов необходимо изучение
пигментов в конце технологического процесса, т. е. при выделении
фермента. В этом случае нужно подобрать условия отделения целевого
продукта от сопутствующих окрашенных веществ. Сложность в изуче­
нии пигментов заключается в том, что сам фермент может выступать
как мешающий компонент. Поэтому одним из этапов исследования
должен быть анализ целевого продукта. Для изучения свойств одного из
аминолитических ферментов - глюкоамипазы - использовали препара­
ты, выделенные из культуры плесневых грибов (Ладыжинский завод
ферментных препаратов, Украина).
Известно, что глюкоамилаза относится к гликопротеидам, содержа­
щим до 17% углеводов, среди которых преобладает D-манноза, D-глюкоза
146
Глава 3
и D-галактоза присутствуют в меньших количествах. В глюкоамилазе из
культуры Asp. niger манноза связана с гидроксильными труппами серина и
треонина гликозидными связями [294]. По сравнению с а-амилазой глю­
коамилаза более кислотоустойчива, но менее стабильна к воздействию
этилового спирта и ацетона [295]. Молекулярная масса глюкоамилазы,
выделенной из плесневых грибов, равна 97000 [300]. Методом кругового
дихроизма на основе существующих модельных методов расчета опреде­
лены параметры вторичной структуры глюкоамилазы из Asp. awamori.
Процент а-спирапьности, p-структуры и клубка составляет соответственно
16, 19 и 65% [296]. Особое значение приобретает знание свойств и струк­
туры фермента, полученного в промышленных условиях.
ГПХ фермента проводили на сефадексе G-200 с использованием ка­
либровочной кривой по белкам с известным молекулярным весом
(рис. 3.27). Из рис. 3.27 и табл. 3.23 следует, что элюционный объем VR
используемой глюкоамилазы равен 10 мл и молекулярный вес 100000 у.е. Известно [275], что в состав фермента может входить ион Са2+,
который составляет основу активного центра. Методом пламенной фото­
метрии установлено, что исследуемый препарат глюкоамилазы содержит
ионы Са2+ (11 мг-ионов/л), причем на 1 г-моль фермента приходится
0,22 г/иона кальция. Минеральный ион, по нашему мнению, может выпол­
нять в данном случае структурирующую роль [295], а не каталитическую.
Одним из эффективных методов исследования вторичной структу­
ры белков является ИК-спектроскопия. В связи с тем, что глюкоамилаза
сохраняет способность к катализу при pH = 3,0-5,5, были сняты ИКспектры фермента при pH 3,0; 4,7; 5,5. Данные представлены на рис. 3.28
и в табл. 3.24. Для ИК-спектров глюкоамилазы в изученном интервале
pH характерны полосы поглощения 3483-3430 см-1, обусловленные ва­
лентными и деформационными колебаниями свободных аминогрупп.
Ассоциированные водородными связями аминогруппы проявляются в
области 3340-3300 см-1 [170]. Можно полагать, что энергия водородных
связей для аминогрупп глюкоамилазы наибольшая при pH 4,7 и 5,5. По­
лосы поглощения 3246, 3206, 3152 см-1 относятся к группам амид I +
амид II, причем максимум поглощения при 3090 и 3040 см-1 характерен
для обертонных колебаний амид II [170, 175]. При различной кислотно­
сти среды имеет место сдвиг полос поглощения амид I + амид II, свиде­
тельствующий о конформационных превращениях фермента, обуслов­
ленных [175] вращением фрагментов полипептида относительно группы
где R\ и R2—полипептидные цепочки.
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
147
Рис. 3.27. Калибровочная кривая для определения молекулярной массы
глюкоамилазы методом гельпроникающей хроматографии:
М —молекулярная масса; KR—элюционный объем, мл
Данное предположение подтверждается наличием максимумов по­
глощения в области 1655-1620 см”1 (амид I) и 1550-1520 см-1 (амид II)
[175]. Известно, что вторичная структура ферментов представлена в
виде а-, p-спирали, сочетающихся с нерегулярными участками [295].
При нарушении спирализации белковой молекулы происходит смеще­
ние полосы поглощения амид I от 1655 см~' к 1620 см- , а максимум
поглощения амид II сдвигается от 1550 см"1 к 1520 см" . Эти эффекты
характерны для глюкоамилазы при низких значениях pH, причем при
pH 3,0 наблюдаются полосы поглощения как при 1655 см ", так и при
1626 см"1, а также при 1552 и 1532 см"' соответственно.
По-видимому, при pH 3,0 для вторичной структуры фермента рав­
новероятно наличие и а-спирали, и p-формы. При pH 4,7 и 5,5 происхо­
дит увеличение длины а-спиральных участков по сравнению с р-формой,
о чем свидетельствует увеличение максимумов поглощения 1655 см"1
(амид I) и 1550 см"1(амид II) [175].
Наблюдаемые конформационные эффекты объясняются тем, что
при низких значениях pH молекула глюкоамилазы находится в катион­
ной форме, причем группа СООН находится в недиссоциированном
состоянии (1716 см"1). При pH 4,7 и 5,5 большая часть фермента суще­
ствует в виде цвиттер-ионов [170]. При этом переход глюкоамилазы в
форму биполярного иона, исходя из полученных результатов, способст­
вует увеличению доли спиральных участков в ферменте.
Глава 3
148
Необходимо отметить, что переход отдельных фрагментов от спи­
ралевидной структуры в области низких значений pH к (3-форме должен
сопровождаться переориентацией большей части гидрофобных участ­
ков гликопротеидов на поверхность молекулы. Последнее будет сказы­
ваться на сорбционной способности фермента при поглощении ионита­
ми, имеющими массивный гидрофобный радикал.
Полученные результаты по сорбции глюкоамилазы на макропористом
анионите АН-251 (ОН-форма), содержащем 2-метил-5-винилпиридиновые
группы и дивинилбензол, подтверждают высказанное предположение. По­
глощение фермента анионообменником АН-251 при pH 3,0; 4,5; 6,0 состав­
ляет 1,95; 1,17; 1,30 мг/г смолы. Это может быть вызвано тем, что при
pH 3,0 на поверхности молекул глюкоамилазы появляется значительное
число гидрофобных участков (переход в |3-форму), увеличивается сродство
сорбата к матрице ионита и происходит полифункциональное связывание
фермента за счет гидрофобного взаимодействия.
и, см
Рис. 3.28. ИК-спектры глюкоамилазы при pH 3,0 (/); 4,7 (2); 5,5 (3):
v —волновое число, см~1; А —поглощение, %
Пигменты из ферментационных сред Ладыжинского завода фер­
ментных препаратов выделяли следующим образом. К культуральной
жидкости глюкоамилазы при перемешивании добавляли этиловый
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
149
спирт в соотношении 1 : 3 . Выпадающий осадок, содержащий биомассу
и коллоидные частицы, отделяли фильтрованием.
Красящие вещества фильтрата фракционировали с помощью бу­
мажной хроматографии и высоковольтного бумажного электрофореза.
3.23. Полосы поглощения в ИК-спектрах глюкоамилазы (pi = 6,5) при
различных значениях pH
Волновое
число,
см' 1
3483
3430
3340
3306
3246
3206
3152
3119
рН
Колебания
Свободные NH-группы
3,0
3090
-II3040
Асимметричные колебания -С Н 2—
2972
-II2910
-II2885
Симметрич. колебания СНз-группы
2864
-II2860
-II2764
С =0 в недиссоциир. -СООН
1716
-II1694
СОО" в цвиттер-ионах
1656
Амил I (С=0) кол.
1635
-II1626
-II1620
Амид II, NH3+ в цвиттер-ионах
1552
-II1550
-II1532
(C-N) Амид III
1270
-II1265
о.с. - очень сильная; с - сильная; сл. - слабая; знак
полосы в спектре.
5,5
+
+
+
+
+
-IIАссоциированные Н-связями
NH-группы с Н20
Амид I + амид II
(С=0, CN-группы)
Н20 ...'ООС-группа
Обертонное колебание
амид II + амид 1+ амид II
Обертонное колебание амид II
4,7
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
о.с.
сл.
сл.
с.
сл.
с.
с.
с.
с.
сл.
о.с.
с.
сл.
с.
сл.
«+» означает присутствие
150
Глава 3
Хроматографическое разделение пигментов проводили на бумаге
«Фильтрак № 17; (Германия) [1, 74]. Растворителем служила смесь: пбутиловый спирт - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении 4 :1 :5.
Растворитель пропускали два раза. Продолжительность деления 48 ч.
Полученные хроматограммы проявляли 0,5%-ным раствором нингидрина в
ацетоне и раствором мочевины. Электрофоретическое разделение окра­
шенных веществ проводили на бумаге «Ленинградская средняя» при на­
пряжении 1000 В. Буферным раствором служила смесь 300 мл ледяной
уксусной кислоты и 700 мл дистиллированной воды. Продолжительность
деления 3 часа.
Окрашенные продукты, содержащиеся в отдельных непроявленных
хроматографических или электрофоретических зонах, исследовали ме­
тодом ИК-спектроскопии [74, 185, 280] и гельпроникающей хромато­
графии [174, 185]. ГПХ осуществляли на колонках, заполненных Сефадексом G-200. Молекулярную массу пигментов, содержащихся в от­
дельных хроматографических зонах, определяли путем предварительно­
го получения калибровочной кривой, построенной по белкам с извест­
ной молекулярной массой (табл. 2.3).
Результаты свидетельствуют (табл. 3.24), что окрашенные вещест­
ва, содержащиеся в фильтратах культуральной жидкости, методом бу­
мажной хроматографии разделяются на 12 зон, которые под действием
электрического тока движутся к отрицательному полюсу, что свиде­
тельствует об их положительном заряде. УФ спектры /, 3 и 5 хромато­
графических зон имеют полосы поглощения при 256-260 нм. Остальные
компоненты поглощают при 276-284 нм. Указанные полосы могут быть
обусловлены карбонильной группой С=0 , сопряженной с кратными
связями [1, 74, 285], а смещение полосы к 260 нм может быть объяснено
более короткой цепью сопряжений в окрашенных продуктах 1, 3 и 5 зон
по сравнению с пигментами других зон.
Интересна окраска хроматографических зон нингидрином, которая
варьирует от розовой до лиловой. Вещество 8 зоны окрашивается нингидриновым проявителем в светло-желтый цвет. Согласно [1, 74, 285],
все рассмотренные свойства характерны для окрашенных веществ, от­
носящихся к группе меланоидинов, причем для вещества 8 хроматогра­
фической зоны характерны пролиновые и оксипролиновые остатки, ко­
торые дают с нингидрином желтое окрашивание.
Для веществ 2, 4, 5, 9, 10 и 12 хроматографических зон был опреде­
лен электрофоретический потенциал по уравнению ГельмгольцаСмолуховского [1]. Полученные значения потенциала находятся в интер­
вале 0,026-0,051 В (см. табл. 3.24) и значительно меньше по сравнению с
аналогичными величинами (0,076-0,350 В) для пигментов аминокислот­
ных производств [102]. Это свидетельствует о малой устойчивости к коа­
гуляции пигментов глюкоамилазного производства [1]. Методом ГПХ
151
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
были определены молекулярные массы окрашенных компонентов, со­
держащихся в первой и четвертой хроматографических зонах (табл. 3.25).
3.24. Характеристики пигментов глюкоамилазного производства,
содержащихся в отдельных хроматографических зонах
№
зоны
Электрофоре­
тическая
скорость, см/с
1
-
2
0,0025
Электрокинетический
потенциал, В
Rt
0,06
бесцветный
0,026
0,11
голубой
3
-
-
4
0,0034
0,0034
0,035
0,035
- ’
—
0,15
0,19
0,23
0,28
0,33
бесцветный
голубой
голубой
бесцветный
бесцветный
0,051
0,051
0,051
0,38
0,46
0,54
0,72
0,77
голубой
голубой
голубой
бесцветный
бесцветный
5
6
7
8
9
10
11
12
-
-
0,0049
0,0049
-
0,0049
О краска
нингидрином
Цвет зоны
в УФ свете
светло­
фиолетовая
розово­
фиолетовая
фиолетовая
лиловая
фиолетовая
фиолетовая
лилово­
фиолетовая
светло-желтая
розовая
розовая
розовая
лиловая
Из табл. 3.25 следует, что методом ГПХ удается идентифицировать
два окрашенных вещества - с молекулярной массой 45000 и 19000. Бы­
ли также вычислены усредненные радиусы молекул компонентов куль­
туральной жидкости, основываясь на расчетах Огстона [162] и получен­
ных результатах (табл. 3.25). Радиусы второго и первого компонентов
равны 4,22 А и 7,27 А, соответственно.
3.25. Молекулярные массы меланоидинов, содержащихся в первой и
четвертой хроматографических зонах культуральной
жидкости (глюкоамилазное производство)
Компонент
Г лкжоамилаза
I компонент
II компонент
Молекулярная
масса, у.е.
Радиус молекулы,
100000
45000
19000
29,18
22,27
14,22
Г (А)
Элюцион­
ный объем,
Уя (мл)
10
20
30
Таким образом, анализируя результаты проведенных исследова­
ний, можно сделать вывод, что меланоидины культуральной жидкости
152
Глава 3
глюкоамилазного производства представляют собой сложную смесь
компонентов, тщательное разделение которых можно провести, только
комбинируя бумажную хроматографию, электрофорез на бумаге и
гельпроникающую хроматографию.
\),СМ-1
Рис. 3.29. ИК-спектры первой (/) и четвертой (2) хроматографических
зон меланоидинов глюкоамилазного производства
На рис. 3.29 приведены ИК-спектры меланоидинов первой и четвер­
той хроматографических зон глюкоамилазного производства. Наиболее
интенсивные максимумы в этих спектрах наблюдаются в области 1623 (d),
1585-1570 см- (е, ж), которые отвечают асимметричным деформацион­
ным колебаниям NH3+ и СОСГ-групп в цвиттер-ионах [73, 74, 102, 174,
185]. В той же области (1656 и 1532 см-1) проявляются колебания амид I
(С=0) и амид II (N-C), соответственно [178, 185]. Пики 1405, 1390 см' 1(з,
и) характерны для валентных симметричных колебаний СОСГ-групп.
Максимумы в области 1717 см' (г) соответствуют колебаниям С=0
в недиссоциированных СООН-группах [103, 104]. Это свидетельствует о
том, что в молекулах меланоидинов не все карбоксильные группы участ­
вуют в образовании цвиттер-ионов. Рассмотренные максимумы харак­
терны как для меланоидинов [1, 103], так и для полипептидов [175, 185].
Отличие рассматриваемых ИК-спектров пигментов глюкоамилаз­
ного производства от колебательных спектров пептидов наиболее ярко
проявляется в области 1123, 1078 (к, л) и 950, 846, 820 см' 1 (м, н, о).
Первые два максимума характерны для С-О-С-связей в гликозидных
остатках и лактонах [1, 174]. Последние три пика соответствуют коле­
баниям в кольце пиранозы [1, 103, 174] и отсутствуют в ИК-спектрах
полипептидов [186].
Интересно, что в спектрах окрашенных веществ, соответствующих
глюкоамилазе, наблюдаются хорошо выраженные максимумы при 3560,
3415 см' 1 (а), которые обусловлены ассоциированными водородными
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
153
связями между ОН - группами и аминогруппами [74, 103, 174]. Эта ас­
социация возможна при наличии остатков сахаров, которые придают
рассматриваемым пигментам хорошую гидрофильность. Указанные
пики не проявляются в случае пептидов [175, 185].
Следует отметить, что полосы в области 3254 (б), 2910 (в) и 1330 см-1
относятся к колебаниям аминогрупп, метальных групп и проявляются как
для пигментов глюкоамилазного производства, так и для полипептидов.
На основании ИК-спектров можно сделать вывод, что пигменты
глюкоамилазного производства действительно относятся к меланоидиноподобным веществам, содержат в своем составе сахаридные остатки
и отличаются этим от обычных пептидов.
3 .2 .6 . Гуминовые кислоты и фульвокислоты
природных вод
В основе синтеза гуминовых веществ лежит отбор структур, кото­
рые в условиях биосферы (преимущественно в корнеобитаемых слоях
почв) способны создать приемлемые экологические условия для суще­
ствования почвонаселяющих микроорганизмов и в ходе своего появле­
ния способны приобрести устойчивые свойства. Гумусовые кислоты
(ГК) являются частью гуминовых веществ и не являются строго ограни­
ченным классом соединений. Согласно исследованиям Т. Кухаренко
[304], гумусовые кислоты представляют смесь аморфных темноокрашенных органических кислот, выделяемых щелочными растворами из
воды, почв, торфа, бурых и выветрившихся каменных углей, различаю­
щихся между собой, в зависимости от происхождения исходных ве­
ществ, но объединенных общностью строения и свойств. Действитель­
но, в структуру ГК входят карбоксильные, фенольные, карбонильные,
спиртовые, енольные, лактонные, эфирные, хиноидные группировки
[78-87]. В работах [79, 81, 305] показано, что ГК можно рассматривать
как продукты поликонденсации ароматических соединений фенольного
типа с протеинами и аминокислотами. Следовательно, можно говорить
о генетическом сходстве меланоидинов и гуминовых кислот, которые,
как и меланоидины, способны существовать в биполярной форме.
В связи с этим авторы данного издания сочли возможность рассмотреть
некоторые вопросы гуминообразования и свойства ГК. Тем более, что
одной из признаваемых гипотез образования ГК является меланоидиновая, высказанная Майяром [2, 3].
Во многом эта гипотеза перекликается с концепцией деградации
биополимеров, т. е. формированием гуминовых кислот на любых этапах
трансформации белков, полисахаридов, лигнина и других веществ [306].
Первым этапом считается кислотообразование, когда в реакциях участ­
вуют органические полимеры, входящие в состав растительных остат­
ков. Прямые эксперименты показали, что при гумификации раститель-
154
Глава 3
ных остатков образуются высокомолекулярные кислоты с более высо­
кими молекулярными массами, чем ГК соответствующих почв. В по­
следующем гумификация приводит к уменьшению молекулярных масс
пигментов, что подтверждается природными наблюдениями: наиболее
гумифицированные черноземные гуминовые вещества (ГВ) имеют
меньшие молекулярные массы, чем ГВ подзолистых почв.
На втором этапе происходит непрерывная гумификация новообра­
зованных ГК. Параллельно идет медленная минерализация ГК, которая
может продолжаться в почве сотни и тысячи лет (что подтверждается
результатами определения их возраста методами радиоуглеродного ана­
лиза). Наряду с перестройкой азотсодержащих фрагментов происходит
частичная перестройка основного каркаса молекул ГК, нарастает сте­
пень бензойности и уменьшается доля алифатических цепей.
На третьем этапе ГК или полностью минерализуются, или распа­
даются на структурные фрагменты, которые вновь участвуют в гумусообразовании [93, 306].
Следует отметить, что в настоящее время нельзя провести четкой
границы между синтезом ГК и синтезом высокомолекулярных полиме­
ров в живых организмах (осуществляемым на основе генетического ко­
да). Биосинтез из метанола в природных условиях ароматических ами­
нокислот (триптофана, фенилаланина) менахинонов, участвующих в
образовании ГК, может предшествовать гумификации [302].
Классификаций гуминовых веществ существует не меньше, чем
гипотез об их синтезе. Большинство их основано не на строении состав­
ных частей молекул гуминовых веществ, а на растворимости отдельных
компонентов торфа, углей, сланцев, почв и т. д. Классификация Одена
условно разделяет гуминовые кислоты на фульвокислоты (растворимые
в воде), гиматомелановые (растворимые в спирте) и гумусовые (нерас­
творимые в спирте и в воде) [93]. Условность такого разделения оче­
видна, так как из одного и того же источника можно выделить целый
ряд промежуточных форм гуматов - от растворимых до нерастворимых
в различных растворителях [75, 93,304].
Попытки установить строение ГК позволяют говорить лишь о бо­
лее или менее удачных моделях, которые можно разделить на три груп­
пы: блок-схемы, условные структурные формулы, фрагментный состав.
Как пример блок-схем на рис. 3.30 приведена блок-схема Мистерски и
Логинова [307]. Согласно этой блок-схеме, в состав ГК входит «ядро»,
состоящее из ароматических шестичленных колец и гетероциклов. «Яд­
ро» окружено по периферии цепями углеводного, полипептидного ха­
рактера и углеродными алифатическими цепями.
Наиболее реально (по мнению большинства исследователей) свой­
ства гуминовых кислот отражают две формулы (рис. 3.31), предложен-
155
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
ные Орловым для ГК почв [83] и Комиссаровым [84]. Эти формулы,
хотя и носят статистический характер, но, тем не менее, достаточно
полно объясняют практически все известные на сегодня физические и
химические свойства гуминовых кислот [93].
периферийная часть
Н Н О
I
I
II
—N—C—C—O—
К
Н Н
I
I
О Н Н
п
О
I 1 II
—N—C—C—N—C—C—0 —
R
R
О
—с—с.
I о
—С—он
—с—он
I
I
I
«
— C — O — P — O
A !ft,
F e ft,
Si02
CaO
P f ls
минеральные
компоненты
*
-
— О — С с— Н а— O g
о
— О —
СН,
-о -с у л А
i
11 —С—О—Са—О—Р—О
I
I-
О
комплексы (сорбция)
Рис. 3.30. Блок-схема гуминовых кислот по Мистерски и Логинову [307]
Особенностью ГК является их насыщенность функциональными
группами: фенольными, спиртовыми гидроксильными, метоксильными,
карбоксильными, карбонильными, амино- и амидогруппами, хиноидными группировками. Для обеих предлагаемых формул характерна двучленность гуминовых кислот, то есть наличие негидролизуемой части
(конденсированные бензольные фрагменты, образующие сильно разви­
тую непрерывную цепь сопряженных связей с участием -С =С мостиков; кислородные и азотсодержащие гетероциклы [293]), а также
гидролизуемых компонентов типа полипептидов, аминокислотных ос­
татков, моно-и полисахаридов.
Наиболее существенное различие между рассматриваемыми фраг­
ментами ГК состоит в существовании (по Комиссарову) или в отсутствии
(по Орлову) многоядерных конденсированных систем. Следует отметить,
что формула гуминовых кислот, предложенная Орловым, в наибольшей
мере соотносится с предполагаемыми нами структурами меланоидинов.
Это свидетельствует об общих типовых признаках отдельных групп гу­
миновых кислот, содержащихся в почвах, и меланоидинов. В конденси­
рованной полиядерной модели ГК Комиссарова центральное место зани­
мают многоядерные бензоидные фрагменты. В этой формуле, однако, не
вскрыты возможные формы включения азота [93], кислородсодержащих
циклов и в должной мере не отражены алифатические фрагменты. Воз­
можно, это вызвано тем, что данная формула предложена для объяснения
156
Глава 3
специфических свойств гуминовых кислот, выделенных из окисленного
угля, где доля ароматических фрагментов действительно высока [93].
негидролизуемая часть (ядро)
гидролизуемая часть
_
R—CH2—(^H—COOH
ннг
( C ftfiJ , -(СООН)„
-(ОН), (NHJ„
-о —
—соон
Рис. 3.31. Формулы ГК по Орлову (а) [83] и по Комиссарову (б) [84]
Можно полагать, что в наибольшей степени близки к меланоиди­
нам по структуре растворимые в воде гуминовые соединения, т. е.
фульвокислоты (ФК). Большой вклад в изучение последних был внесен
исследованиями Г.В. Славинской [75, 308-311]. Ею определен элемент­
ный состав фульвокислот (табл. 3.26) различных водоемов. Причем
впервые эти данные характеризуют фульвокислоты, не содержащие ми­
неральных компонентов, т. к. для получения беззольных препаратов
были применены сильносшитые ионообменные смолы.
Методом ГПХ на сорбенте Молселект - G-50 (зернение 40-120 мкм;
высота слоя и диаметр колонки 300 мм и 10 мм соответственно) опреде­
лены молекулярные массы двух фракций ФК, равные 8900 и 6400. Сле­
дует отметить, что полученные величины подтверждают возможность
модификации первоначально образованных в почве гуминовых веществ
при переходе их в водную среду, сопровождающемся уменьшением мо­
лекулярных масс. Автор [310] установила три типа функциональных
групп в отдельных фракциях ФК, обладающих рК^) = 4,3; рКа(2) = 8,0 и
157
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
рКа(3)= 9,5. Их можно отнести к компонентам протолиза карбоксильных,
фенольных и аминогрупп соответственно [96, 102].
3.26. Элементный состав фульвокислот
Препарат ФК
№ 1 (р. Нева)
№ 2 (р. Нева)
№ 3 (р. Нева)
р. Усманка (Воронеж, обл.)
оз. Юлемисте (Таллин, Эстония)
[75, 126-129]
С,%
48,8
47,7
45,3
42,3
51,6
45-53
N, %
2,4
Н ,%
5,3
2,1
6,0
1,9
2,3-4,1
5,1
3,7
5,3
5,7-6,9
о,%
43,5
43,6
47,7
42-49
В ИК-спектрах деминерализованных ФК из различных водоемов
(рис. 3.32) подтверждается наличие указанных групп при 1720-1706 см(С=0 в недиссоциированных СООН-группах), 1650 и 1380 см"1(v СОО асимметрические и симметричные в биполярных ионах), а также 1552 см"'
(NH3+- в биполярных ионах. Необходимо отметить, что максимумы 1650—
1635 см-1 и 1552 см-1 могут также соответствовать колебаниям амид I и
амид П. Это может быть следствием образования в ФК не только биполяр­
ных ионов, но и внутренних амидов (лактамов) [170,308]:
]
+
//
-HjO и х ^ СН,
NH,—СН,—R—CH,^=:H,N—СН,—R—СН,—С
2|
Г
Joo4 ОН +Н20 HN-----С=0
В области 2730 см" проявляется полоса, характерная для ассоциатов СООН...ОН2 (или -СООН...НООС-). Таким образом, приведенные
результаты свидетельствуют о возможности существования карбок­
сильных и аминофупп в ФК в различных формах.
Фульвокислоты, благодаря наличию гидрофильных и гидрофобных
групп, различным образом взаимодействуют с водой. Наличие порогов
в области 3400 см-1 характерно для колебаний ОН-групп в молекулах
воды с ненарушенной структурой [113, 142, 283]. Ассоциаты воды с
СООН-группами дают колебания в области 3120-3180 см~ ; Н20 с фе­
нольными группами - при 3230-3260 см" ; Н20 с аминогруппами - при
3330-3300 см"' [102, 194-196, 283, 285].
В ИК-спектрах ФК присутствуют колебания метильных и метиле­
новых групп (2926, 2880 см '1); кратных -С=С- связей (1600 см-1) и
спиртовых групп (1180, 1030 см"1) [170, 174-178].
Необходимо отметить, что различная степень протонизации функ­
циональных фупп фульвокислот проявляется при изменении pH среды
(рис. 3.33). С понижением pH раствора наиболее ярко проявляется по­
лоса поглощения (при 1700 см"1) недиссоциированной карбоксильной
158
Глава 3
группы. Однако, часть СООН-групп подвергается протолизу даже при
pH = 2,0 (наличие максимумов 1640 см' 1 и 1386 см" , соответствующих
v„ и V, колебаниям СОО”-групп соответственно).
Наличие в фульвокислотах ионизированных и недиссоциированных фупп СООН говорит в пользу многоосновности последних.
Рис. 3.32. ИК спектры фульвокислот природных вод, выделенных
из воды Невы (1), Усманки (2), озера Юлемисте [75,308]
По набору максимумов поглощения можно предположить наличие
в составе ФК группировок СООН, связанных с ароматическими радика­
лами, а также СООН-групп алифатического характера. Кроме того, в
фульвокислотах имеются пептидные (амидные) связи, заряженные и
депротонированные аминогруппы, фенольные группы. Можно полагать,
что ФК являются дифильными соединениями, образующими при взаи­
модействии с водой аквакомплесы различной прочности. Для фульво­
кислот характерно наличие биполярных ионов, меняющих знак заряда в
зависимости от pH.
Растворимость гуматов наиболее высока в водных щелочных сре­
дах. Поэтому в качестве растворителя для фульво- и гуминовых кислот
авторы [93] использовали раствор NaOD в D20 в ЯМР'Н. Кроме того,
растворителями в данных исследованиях могут служить ДМСО-De и
ГМФА-018, несмотря на меньшую растворимость ФК и ГК. Быстрый
обмен протонов карбоксильных и протонных групп ОН фульвокислот с
дейтерием воды приводит к общему сигналу HDO, что не позволяет их
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
159
дифференцировать. Поэтому из спектра ЯМР'Н корректно в воде можно
оценить только соотношение атомов водорода алифатических и арома­
тических фрагментов [93, 312].
Рис. 3.33. ИК спектры невских фульвокислот в зависимости
от pH раствора:
! - 2,0; 2 - 3,5; 3 - 7,0; 4 -9 .0 [75, 308]
Регистрация спектра ЯМР'Н ГК в растворителе ДМСО-Э6 позволя­
ет провести дифференцированную оценку уже трех атомов водорода:
карбоксильных групп, фенольных и ароматических (суммарно) и алифа­
тических фрагментов [93] (рис. 3.34).
Предложена методика [312] раздельной оценки содержания прото­
нов кислых гидроксильных групп и алифатических (спиртовых) групп
ОН ГК путем последовательной регистрации спектров ЯМР'Н ГК сна­
чала в растворе ДМСО-Э6, а затем - с добавкой трифторуксусной ки­
слоты (ТФУК) в этот раствор (рис. 3.35).
Отличие ее от методики авторов [93] состоит в том, что определе­
ние содержания атомов водорода фенольных ОН-групп проводят не
непосредственно по интегральным интенсивностям их резонансных сиг­
налов, а по суммарному уменьшению интегральной интенсивности в
диапазоне спектра 11,5—6,0 м.д. после добавления в раствор ГК трифтор­
уксусной кислоты. Типичные спектры ЯМР13С ГК, выделенных из угля,
торфа, почвы и воды, приведены на рис. 3.34.
160
Глава 3
Рис. 3.34. Спектр ЯМР'Н ГК почв:
растворитель D ,0 - NaOD (а); растворитель ДМСО-Dg (б) [93]
Разбиение спектров на группы сигналов позволяет по интеграль­
ным интенсивностям провести количественную оценку содержания раз­
личных функциональных групп и структурных фрагментов молекул ФК
и ГК [312]. Наибольшее количество СООН- и COOR-групп содержится
в ФК вод; наименьшее - в ГК, выделенных из торфа и угля.
Арильные радикалы -СН наиболее интенсивно проявляются в ГК
угля и торфа. Связи Alk-O характерны для гуматов торфа, воды и поч­
вы. Наличие алкильных группировок в наибольшей степени проявляет­
ся в ФК воды и ГК почв (рис. 3.36). Связи С =0 характерны только для
ФК. К сожалению, в работах [93, 312] отсутствуют ЯМР-характеристики аминных и амидных групп. Поэтому можно полагать, что толь­
ко использование различных методов (спектральных и хроматографиче­
ских) позволяет представить наиболее полную структуру и свойства
окрашенных компонентов.
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
161
Рис. 3.35. Спектр ЯМР'Н препарата в ДМ С0-06(а), в ДМСО-Об
с добавкой CF3COOD (б) и в 0,1 М растворе NaOD в D20
(в) [312]
162
Глава 3
ХСиС, м. д.
Рис. 3.36. Типичные спектры ЯМР13С ГК различного происхождения [312]
3 .3 . Ф изиологические функции меланоидинов
Меланоидины, исходя из их строения и свойств, выполняют ряд
разнообразных функций. Одна из функций связана с проблемами сба-
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
163
лансированного, полноценного питания. Если принять гипотезу о том,
что развивающийся организм - единая система с поступающ ими извне
веществами, то с этих позиций меланоидины - не только продукт тех­
нологической переработки пищевых компонентов, но и важнейший
фактор устойчивости ж изненны х процессов.
П р отек тор н ая ф ун к ц и я . Продукты питания, содерж ащ ие мела­
ноидины, «сглаживают» токсическое действие ионов переходны х ме­
таллов. М еланоидины прочно связывают их в комплексы, препятствуя
их усвоению органами пищеварительной и кровеносной систем. Кроме
того, пигменты этого класса образую т межмолекулярные ассоциаты с
детергентами, пестицидами, аллергенами, радионуклидами, предупреж ­
дая токсическое воздействие на печень, подж елудочную железу. В оз­
действие меланоидинов в этом случае объясняется участием их в окис­
лительно-восстановительных реакциях благодаря наличию хиноидных и
полифенольных фрагментов [329]. При окислении полифенолов [95, 96,
313] вначале образую тся семихиноны, а затем хиноны:
О
О
О
Фиксируя определенны е группы токсикантов, меланоидины на
длительное время выводят их из сферы прямых контактов с живыми
тканями. С течением времени трансформация самих меланоидинов м о­
ж ет сопровождаться разрушением отдельных классов токсичных орга­
нических соединений или превращением последних в неактивные к ж и­
вым клеткам соединения.
Регуляторные функции. Эти функции охватывают широкий круг
процессов и явлений. П реж де всего, необходим о отметить положитель­
ное влияние несахаров (в том числе меланоидинов), содержащ ихся в
«ж елтом» сахаре, на работоспособность животных [3 1 4 -3 1 6 , 329].
В отличие от сахарозы («чистого» белого сахара), являющейся продук­
том современной технологии, «желтый» сахар состоит из кристаллов
сахарозы, покрытых тонким слоем патоки. В зависимости от типа пато­
ки (мелассы), покрывающей каждый кристалл сахарозы [343], различа­
ют также сахар «коричневый» и сахар «черный» [24, 286]. Биологиче­
ская активность различных видов мелассы представлена в табл. 3.27.
Трофическая (некалорийная) ценность «желтых» сахаров намного
выше белого сахара [315, 316]. Проведенные расчеты [314] показали,
что длительное (постоянное) потребление «ж елтого» сахара увеличива­
ет длительность жизни человека она 9 -3 0 лет.
Глава 3
164
3.27. Биологическая активность различных видов мелассы / 314]
Тип мелассы
Содержание, %
сахароза
несахара
Белая
71
67
Зеленая
Бурая
53
Кормовая
45
т
стимулирующая единица действия
29
33
47
55
Количество СЕД в 1 г
сахароза
несахара
50
55
77
117
172
166
164
213
Регуляторные физиологические функции меланоидинов проявля­
ются также в обмене веществ. Положительное влияние недоочищенного
сахара на углеводный и липидный обмен у крыс наблюдали И.И. Брех­
ман с сотр. [314]. В условиях автономного плавания в тропиках члены
экипажа, потреблявшие вместо сахарозы «желтый» сахар, в 2 раза
меньше болели (простудные и кожные заболевания), чем члены экипажа
контрольной группы. При этом длительное потребление недоочищенных сахаров в условиях жаркого и влажного климата улучшает у людей
адаптационные функции в сердечно-сосудистой и дыхательной систе­
мах, улучшает ряд клинических и биохимических показателей крови,
способствует сохранению высокой умственной работоспособности. Ко­
нечно, не только меланоидины (в современной их классификации) вно­
сят вклад в биологическую активность мелассы. В большой степени эта
активность определяется комплексом окрашенных компонентов при­
родного происхождения из сахарной свеклы или сахарного тростника
(фенольных гликозидов; гликозидов олеаноловой кислоты - сапонинов,
один из которых известен под названием «цуккеррюбенсапонин» и со­
держит остаток глюкуроновой кислоты; фульвокислот и др.).
Физиологическая активность меланоидинов, получаемых при выпеч­
ке хлебобулочных изделий [318, 319], сгущении молока [18], сушке и об­
жаривании кофейных зерен [156, 202, 205, 206, 208, 317] привлекает вни­
мание по двум причинам. Во-первых, меланоидины этих продуктов обра­
зуются в жестких термических условиях при минимизированном количе­
стве влаги. Это в какой-то мере напоминает процесс гумификации бурых
углей [92, 93], образование гуминовых кислот в почве [93, 94], расщепле­
ние лигнина под действием щелочей и кислорода воздуха [90-93]. Вовторых, между вышеназванными пигментами существует общая струк­
турная повторяемость, обусловленная присутствием полифенолов и их
производных [317]. Так, из 5-ферулоилокси-1,3,4-тригидрокси-1-карбоксициклогексана при термообработке кофе образуются меланоидины:
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
о
он
0 -С
ноос
165
'сн=сн / /
\
HO F * ОН
V .O H
/
гидролиз
/
он
5-фсрулоил
кислоты
-СО,
полимеризация
Меланоидины
при термообработке
кофейных зерен
4-винил-гваякол
СЛ
СЛ
с=о
с-о
Тример, содержащий орто-,
орпго-бифенильную связь
и орто-бифенилэфирную связь;
Этот тример биогенетически
родственен лигнину
Следовательно, представляется правомочным расширить круг пиг­
ментов (гуминовых, фульвокислот, лигнинов, антоциановых природных
красителей), в определенной мере способных участвовать в меланоидинообразовании и имеющих общие структурные фрагменты с меланои­
динами пищевых производств. В этом аспекте можно говорить и о фи­
зиологической функции гуминовых кислот, которые оказывают опосре­
дованное или прямое физиологическое влияние на микроорганизмы и
растения в почве и воде, выступая в роли носителей некоторых витами­
нов, аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований [293, 302,
303,312,317].
Аккумулятивная функция. Эта функция меланоидинов проявля­
ется в двух ипостасях. Во-первых, сущность этой функции заключается
в накоплении пигментами важнейших элементов питания живых орга­
низмов [321, 322, 325, 326, 330-332].
7—3196
166
Глава 3
Меланоидины - кладезь органических соединений, несущих энерге­
тические запасы, непосредственно усваиваемые микроорганизмами
[8-12,72-76, 154]. Аккумуляторная функция характерна и для гуминовых
и фульвокислот. Накопление органических веществ ими в виде межмолекулярных комплексов происходит в природных водах, донных отложени­
ях, в почвах, где ГК и ФК являются источниками энергии и питания био­
ты. Другими словами, фульво- и гуминовые кислоты создают в различ­
ных средах долгосрочные запасы углеводов и аминокислот [93].
Вторая, не менее важная аккумулятивная функция проявляется в
способности меланоидинов накапливать и сохранять длительное время
неорганические ионы (кальций, калий, магний, железо, хром и другие
элементы), необходимые микроорганизмам и высшим животным [314316, 320, 321, 331]. В форме ГК в почвах накапливается половина фос­
фора, серы и до 90% азота [79, 85, 313]. Прочное связывание неоргани­
ческих ионов обусловлено наличием в меланоидинах и ГК аминогрупп
и карбоксильных групп, способных образовывать с ионами металлов
хелатные комплексы [198, 284, 313]. Без таких длительно существую­
щих в ферментационных растворах, в природных водах и почвах ком­
плексов не могли бы существовать микрофлора и другие жизненные
формы, целостные природные биоценозы [93]. Следует заметить, что
функции меланоидинов часто дополняют друг друга, а иногда и проти­
воположны друг другу. В известной мере, аккумулятивной функции
противоречит транспортная функция пигментов.
Транспортная функция меланоидинов. Хорошо известно, что в
большинстве случаев компоненты, введенные в организм в форме ми­
неральных солей, практически не усваиваются. Только в случае образо­
вания ионами металлов, устойчивых к условиям среды, способных к
биохимической миграции комплексов, появляется возможность усвое­
ния их организмом. По всей видимости, именно органические соедине­
ния, остающиеся в мелассе (в том числе меланоидины), способны
«транспортировать» микроэлементы в органы человека.
Окрашенные вещества мелассы, в основном, имеют технологиче­
ское происхождение, т. е. они образуются в процессе переработки сы­
рья. Однако часть пигментов мелассы (в частности полифенолы) непо­
средственно поступает из свеклы и сахарного тростника [1, 49, 317-335,
337-341]. Это очень сложная смесь веществ с молекулярной массой от
400 до 10 и более. У молекул меланоидинов линейное строение, а вхо­
дящие в их состав гетероциклические пиррольные и фурановые ядра
сопряжены с боковыми цепями из остатков аминокислот и углеводов.
В «желтом» сахаре А.А. Семеновым с сотр. [337, 338] установлено
наличие примерно 200 соединений, в том числе два вещества, которые
Представления о свойствах меланоидиновых пигментов
167
ранее не определялись. Первое вещество («мациеф») представляет со­
бой природный сложный эфир фтапевой кислоты и 2Я-2-этилгексанола:
Кроме того, было выделено более полярное вещество из «желтого»
сахара и свекловичной патоки - лактон 2-метилрибоновой кислоты:
НОН
ОН ОН
Образуется оно под действием щелочей при перегруппировке глю­
козы. Из тростникового сахара-сырца [314] японские исследователи
выделили смесь фенольных гликозидов (BS-1), обладающих выражен­
ным биологическим действием [339, 340]:
Следовательно, в настоящее время изучение химического состава
мелассы далеко не закончено, и пока не удалось найти группу веществ,
которым можно было бы приписать значение главного действующего
начала (в том числе транспортной функции) в меланоидинах [341].
Транспортную функцию гуминовых и фульвокислот необходимо
рассматривать как способность их комплексов с ионами металлов к гео­
химической миграции [93]. Так, при обычных для воды и почв значени­
ях pH практически неподвижным оказывается железо, если оно нахо­
дится в виде минеральных солей. Доминирующая обычно форма - гид­
роксид железа (Ks' — 10 38) не может обусловить заметное перемещение
ионов в речных, морских, озерных, океанических водах и в почвах. Ме­
жду тем, миграция железа - установленный факт, а доминирующей ми­
грационной формой являются комплексы, в которых роль лигандов вы­
полняют анионы фульвокислот [93]. Интенсивно мигрирует в подобной
форме большинство других микроэлементов, а также значительная
часть соединений фосфора и серы.
168
Глава 3
Является доказанным, что хотя гуматы не проникают в раститель­
ную клетку, но они обладают прямым мембранотропным действием,
вызывая структурную перестройку мембран. Последнее обусловливает
изменения в цепи метаболических реакций [342]. Следовательно, транс­
портная функция гуминовых кислот отличается от миграции молекул и
ионов в живых клетках и определяется устойчивостью и растворимо­
стью комплексных соединений. На этой основе в последние годы наме­
чены пути использования гуматов металлов для создания лекарствен­
ных препаратов [303].
Глава 4. Влияние пигментов на ф изико­
химические свойства ионообменных
материалов
4.1.
Взаимодействие меланоидинов сахарного
производства с анионитом А В -17-2П
В предыдущих разделах рассмотрены вопросы меланоидинообразования, строения и свойств меланоидинов. При этом фактически учитыва­
лось влияние электрического (электрофорез), магнитного (ядерный маг­
нитный резонанс), теплового (выпаривание), светового (УФ-спектроскопия), гравитационного (гумусообразование в почвах), биологического
(ферментация) полей на процессы пигментации. Определенный интерес
представляют процессы, происходящие при взаимодействие меланоиди­
нов с сорбентами, в частности с анионитами, которые используются для
очистки целевых физиологически активных компонентов. Фактически в
данном случае можно говорить о влиянии химического поля на пигменты.
Взаимодействие красящих веществ с макропористым анионитом
АВ-17-2П (высокоосновный анионит с четвертичными аммониевыми
группами) осуществляли в динамических условиях с использованием
хроматографических колонок диаметром 0,8 см. Масса используемого
сорбента в ОН-форме, высушенного при 70 °С, равнялась 2 г, высота
слоя набухшей смолы в колонке - 30 см.
Структура анионита:
— СН— С Н г-
&
— сн— сн—
Для насыщения слоя в верхнюю часть колонки мерной пипеткой
порциями по 4 мл вносили 12 мл раствора с содержанием меланоидинов
4 мг/мл. Оптимальное время контакта каждой порции раствора с сор­
бентом, выбранное предварительно, составляло 30 мин.
Поглощенные смолой меланоидины элюировали последовательно
дистиллированной водой и 0,5 М растворами соляной кислоты или гид­
роксида натрия со скоростью 15 л/ч. Элюаты собирали отдельно в мер­
ные колбы на 100 мл и концентрацию цветных веществ в них определя­
ли на фотоколориметре ФЭК-56 НМ (pH = 7,0; длина волны 535 нм;
толщина слоя 10 мм). Разделение на отдельные компоненты исходных и
170
Глава 4
содержащихся в элюатах красителей проводили с помощью электрофо­
реза на бумаге, используя в качестве носителя бумагу «Filtrak № 11»
(Германия). Буферным раствором служила смесь ледяной уксусной ки­
слоты и воды в соотношении 3 : 7 с pH = 1,8. Время определения со­
ставляло 3 ч. при напряжении 600 В. Вещества отдельных электрофоре­
тических зон элюировались водой, а элюаты исследовались методами
УФ- и ИК-спектроскопии.
В выбранных условиях лишь часть меланоидинов поглощается
сорбентом (табл. 4.1). В то же время только в верхней части слоя обра­
зовывались четкие окрашенные зоны размером 3-4 см для ОН-формы и
2-3 см для Cl-формы. Следовательно, в процессе сорбции происходит
хроматографическое разделение меланоидинов, а отдельные компонен­
ты не поглощаются анионитом, несмотря на неиспользованную обмен­
ную емкость последнего. В работе [102] было показано, что меланоиди­
ны анионообменником могут сорбироваться по молекулярному и ионо­
обменному механизмам, а также за счет образования ковалентных свя­
зей между функциональными группами сорбата и сорбента. Представ­
ленные в табл. 4.1 результаты свидетельствуют о несколько лучшей
сорбции меланоидинов ОН-формой по сравнению с солевой формой
анионита АВ-17-2П.
4.1. Поглощение меланоидинов анионитом АВ-17-2П
ОН-анионит
С1-анионит
Содержа­
Содер­
Объем
Объем
Раствор
pH
ние пиг­
жание
pH
раствора,
раство­
раствора
ментов, раствора
пигмен­
ра, мл
мл
мг
тов, мг
7,0
12,0
Исходный
7,0
12,0
48,00
48,00
20,64
Равновесный
8,9
12,0
20,40
5,2
12,0
Элюат водный
12,0
100,0
4,0
7,45
100,0
4,40
Элюат щелочной
12,95
100,0
0,00
12,90
100,0
0,00
23,00
Элюат кислотный
0,50
100,0
14,0
0,35
100,0
раствор, вытекающий из колонки при пропускании отдельных порций исход­
ного раствора.
При элюировании водой из фазы смолы удаляется лишь часть ок­
рашенных веществ, которые, согласно [102, 103], были сорбированы за
счет молекулярного взаимодействия с ионитом. Наибольшим элюи­
рующим действием по отношению к той части меланоидинов, которая
остается в фазе сорбента после обработки водой, обладает соляная ки­
слота, вытесняющая окрашенные компоненты, поглощенные по ионо­
обменному механизму. Раствор гидроксида натрия практически не де­
сорбирует окрашенные компоненты (но, как будет показано далее, со­
держит органические вещества). Из табл. 4.1 также следует, что часть
Химизм процессов образования красящих веществ
171
меланоидинов не удаляется из фазы анионита растворами кислоты и
щелочи. На ОН-форме при элюции NaOH остается 15,6 мг, а при элюции НС1 - 1,6 мг окрашенных веществ. На Cl-форме при элюции рас­
твором соляной кислоты остается всего 0,36 мг меланоидинов.
Представляет интерес выяснение
механизма прочного закрепления ме­
ланоидинов в фазе анионита. Извест­
но, что подобный факт обусловлен
образованием ковалентных связей
между сорбатом и сорбентом или ме­
ханическим перепутыванием полиэлектролитных цепей анионита и по­
глощаемых веществ [189]. Для уста­
новления этого были сняты ИК-спектры
исходного ионообменника ( /, l') и по­
сле его контакта с меланоидинами,
часть которых, как описано выше, уда­
лялась элюированием щелочью (2, 2*)
или кислотой (3, 3). Все ИК-спектры
сняты после переведения смолы в ОНформу. Из рис. 4.1 следует, что после
элюирования гидроксида натрия с ОНи Cl-формы в смоле остается опреде­
ленное количество пигментов.
Об этом свидетельствует появле­
ние пиков в области 1718-1686 см'
(колебания С = 0 в СООН), а также хо­
максимумов
рошо
выраженных
V , см
1636
см'1
(v
С=0-амид
I)
и
1562 см'1 (6
Рис. 4.1. ИК-спектры аниони­
N
-H
-амид
II)
в
аминокислотах
[170,
та АВ-17-2П при взаимодей­
174].
Полосы
поглощения
при
1083—
ствии
с
меланоидинами.
1072,1044,1005 и 975 см'1обусловлены
Анионит в ОН-форме ( / , 2, 3)
колебаниями спиртовых и С-О -С
и Cl-форме ( 1 \ 2 ' , 3 Г
)
групп, колебаниями в пиранозных цик­
лах, а также C-N и N -H -групп в аминосоединениях (кривые 2 и 2).
Элюирование меланоидинов соляной кислотой с ОН-анионита (кри­
вая 3) также не приводит к полному удалению пигментов из фазы смолы.
Однако после обработки хлоридной формы раствором соляной кислоты в
ионообменнике остается меньшее, чем на ОН-форме, количество окра­
шенных веществ (кривая 3 ). Об этом свидетельствуют малоинтенсивные
полосы 1686, 1563 и 1072 с м ', характеризующие колебания С = 0 в СООИ-группах, ООО'- и С-О-С-группах соответственно [174-178].
172
Глава 4
Таким образом, результаты химического и спектрального анализов
показывают, что меланоидины из фазы ОН-анионита не удаляются рас­
творами гидроксида натрия и соляной кислоты. Аналогичное явление
наблюдается и для хлоридной формы при элюировании гидроксида на­
трия. При этом в ионообменнике не образуются новые ковалентные свя­
зи, а наблюдаемые в ИК-спектрах новые полосы поглощения обуслов­
лены функциональными группами меланоидинов, оставшихся в смоле
за счет механического переплетения полиэлектролитных цепей.
Для более детального изучения механизма взаимодействия мела­
ноидинов с анионитом был исследован состав водных, щелочных и ки­
слотных элюатов электрофоретическим, а также УФ- и ИК-методами.
Из табл. 4.2 следует, что исходные меланоидины электрофотретически делятся на 13 компонентов, которые проявляются нингидрином.
По окраске в видимой и УФ областях и заряду они идентичны компо­
нентам меланоидинов в работе [71]. Различная величина пробега от­
дельных компонентов в настоящей работе и в [71] связана с неодинако­
вым рабочим напряжением (600 и 400 В соответственно).
Сравнивая электрофореграммы исходных меланоидинов и водных
элюатов (табл. 4.2), можно видеть следующее. В водных элюатах с ОНформы содержится 8 компонентов, а с хлоридной формы - 7 компонентов,
обладающих положительным зарядом. Зоны 1, 2, 6, 7 с ОН- и Cl-форм со­
ответствуют зонам 3, 4, 10, 11 исходных меланоидинов. С гидроксиль­
ной формы водой элюируются также вещества зон 8, 9, соответствую­
щие зонам 12, 13 исходных меланоидов. Интересно отметить, что в вод­
ных элюатах с хлоридной формы анионита появились три новых компо­
нента (зоны 3 ,4 и 5), а с ОН-формы - два компонента (зоны 3 и 4), кото­
рые отсутствовали в меланоидинах до контакта с ионитом.
На электрофореграммах щелочных элюатов проявляются три ве­
щества, отличающиеся от исходных компонентов окраской в видимой и
УФ-областях спектра, а также величиной пробега. При этом из фазы С1и ОН-анионита удаляются как компоненты, не имеющие заряда (зона 2),
так и вещества с положительным (зона 3) и отрицательным (зона 1) за­
рядами. На основании рассмотренных данных можно считать, что в ще­
лочных элюатах содержатся лишь компоненты, отсутствующие в ис­
ходных меланоидинах.
При электрофоретическом разделении меланоидинов, содержа­
щихся в кислотных элюатах (табл. 4.2), так же как в случае водных и
щелочных растворов, появляются новые компоненты (зоны 3 и 4), кото­
рые отсутствовали в исходных окрашенных продуктах. Вещества этих
зон имеют положительный заряд, а в видимой области - желтую окра­
ску (кроме зоны 4 с Cl-формы, которая бесцветна).
173
Химизм процессов образования красящих веществ
4.2. Электрофоретическое разделение меланоидинов
Но­
мер
юны
Зоны
элюатов*
Область
располо­
жения
зоны
1
2
3
1
2
3
4
анодная
анодная
катодная
катодная
5
6
7
8
9
10
11
12
13
катодная
катодная
катодная
катодная
катодная
катодная
катодная
катодная
катодная
О краска
зоны
Расстояние
центра
зоны от
старта, мм
Размер
зоны,
мм
Ц вет зоны в
УФ -свете
4
5
6
7
9
7
3
5
голубой
желтый
коричневый
голубой
8
12
8
15
10
15
5
10
8
коричневый
голубой
коричневый
желтый
голубой
голубой
фиолетовый
желтоватый
ярко-синий
3
6
коричневый
голубой
15/9
желтый/
голубой
синий
фиолетовый
голубой
фиолетовый
желтоватый
ярко-синий
Исходные меланоидины
20
бесцветная
10
бесцветная
1
коричневая
8
буро­
коричневая
13
коричневая'
3
4
1/1
2/2
от
3/3
коричневая
25
35
коричневая
желтая
45
желтая
60
бесцветная
75
бесцветная
88
бесцветная
96
бесцветная
116
Водные элюаты
катодная коричневая
1/1
катодная
8/7
буро­
коричневая
катодная бесцветная
20/10
от
от
10
И
12
13
4/4
от/5
6/6
7/7
8/от
9/от
катодная
катодная
катодная
катодная
катодная
катодная
от
1/1
анодная
от
212
от
3/3
линия
старта
катодная
бесцветная
42/30
бесцветная
от/35
бесцветная
73/72
бесцветная
85/85
бесцветная
94/от
бесцветная
115/от
Щелочные элюаты
голубая/
3/4
зеленая
бесцветная
0/0
бесцветная
5/6
8/4
от/3
10/7
5/8
10/от
8/от
4/5
1/1
6/8
голубой/
фиолетовый
фиолетовый/
синий
фиолетовый
174
Глава 4
Продолжение табл. 4.2.
1
4
5
6
7
Кислые элюаты
1
3
катодная коричневая
коричневый
1/1
3
4
2/2
катодная
буро­
9/9
6
голубой
коричневая
от
желтая
22/30
3/3
катодная
15/22
фиолетовый
от
4/4
катодная желтая/ бес­
42/43
24/6
фиолетовый
цветная
5/5
катодная
желтая/
9
59/61
8/6
голубой
бесцветная
10
73/от
6/от
катодная
бесцветная
11/от
голубой
11
7/7
катодная
бесцветная
87/86
5/5
фиолетовый
12
катодная
бесцветная
8/8
97/95
15/12
желтоватый
13
8/9
катодная
бесцветная
112/115
6/6
ярко-синий
в графе второй указаны электрофоретические зоны меланоидинов в элюатах.
Числитель - для ОН-формы; знаменатель —для Cl-формы анионита. Знак «от»
означает отсутствие компонента в исходных меланоидинах или в элюатах.
2
3
Необходимо отметить, что для новых компонентов водных, щелоч­
ных и кислотных элюатов с солевой и гидроксильной форм характерны
различные скорости пробега в электрическом поле и окраска как в види­
мой, так и в УФ-областях (табл. 4.2). Таким образом, можно говорить об
образовании семи новых веществ в фазе ОН-анионита и восьми новых
компонентов в фазе С 1-анионита. При этом большинство из них не по­
глощают в видимой области, а отдельные компоненты (зона 3 с ОН-фор­
мы и зона 5 с Cl-формы водных элюатов) не окрашиваются нингидрином.
Последнее свидетельствует об образовании из высокомолекулярных ами­
нокислот (меланоидинов) компонентов, не содержащих аминогрупп.
Полученные спектральные характеристики отдельных зон элюатов
и исходных меланоидинов (рис. 4.2) свидетельствуют в пользу выска­
занных ранее положений.
Следует отметить, что спектральные характеристики веществ, со­
держащихся в зонах 1, 2, 6, 7, 8, 9 водных элюатов с ОН-анионита, сов­
падают с характеристиками веществ зон 3, 4, 10, 11, 12, 13 исходных
меланоидинов (табл. 3.10, рис. 3.7). Такое ж е явление характерно для
зон 1, 2, 6, 7 водных элюатов с Cl-анионита, которые аналогичны зонам
3, 4, 10, 11 исходных меланоидов. Кривые поглощения компонентов 1,
2, 5, 6, 7, 8, 9 солянокислых элюатов с ОН-формы идентичны характе­
ристикам исходных меланоидов в зонах 3, 4, 9, 10, 11, 12, 13. Зоны 1, 2,
5, 7, 8, 9 кислотных элюатов с Cl-формы по спектральным характери­
стикам не отличаются от зон 3, 4, 9, 11, 12, 13 исходных меланоидинов.
Это подтверждают данные о стабильности рассматриваемых компонен­
тов после контакта с анионитом.
Химизм процессов образования красящих веществ
175
О собый интерес представляю т УФ спектры компонентов водных,
щелочных и кислотных элю атов с ОН- и C l-анионитов. Вещ ества в
электрофоретических зонах 3, 4, 5 водных элю атов с Cl-формы (кривые
1, 2, 3 на рис. 4.2) имею т максимумы при 290, 267 и 255 нм соответст­
венно. Компоненты 3 и 4 водных элю атов ОН-формы (кривые 4 и 5 на
рис. 4.2) с даю т максимумы в области 284 и 262 нм. При этом вещество
зоны 5 с Cl-формы (кривая 3 рис. 4.2) имеет УФ -спектр, характерный
для продуктов щелочного распада инвертного сахара [ 1]; вещество зоны
3 с ОН-формы (кривая 4 рис. 4.2) по УФ -спектру подобно продуктам
карамелизации сахарозы [1]. Вещ ества указанных зон, как упомянуто
ранее, не даю т положительной реакции с нингидрином.
Абсорбционные кривые веществ, содержащихся в щелочных элю а­
тах с Cl-анионита (зоны 1 ,2 , 3 соответствуют кривым 6, 7, 8 на рис. 4.2),
имеют максимумы при 250 и 346 нм, 281 и 258 с перегибом при 290 нм.
Компоненты зон 1, 2, 3 щелочных элюатов с ОН-анионита (кривые 9,
10, 11 на рис. 4.2) характеризуются максимумами при 260, 289 и 290 нм,
соответственно.
Для веществ зон 3 и 4 солянокислых элюатов с Cl-анионита наблю­
даются максимумы 280 и 262 плюс 338 нм (кривые 12, 13 на рис. 4.2) и
полосы поглощения 280 плюс 330 и 270 нм элюатов с ОН-анионита
(кривые 14, 15 на рис. 4.2) соответственно. Максимумы в области 3 3 0 350 нм могут принадлежать фрагментам, содержащим пиррол.
На основании электрофоретических разделений и УФ-спектров
можно говорить, что при контакте с анионитом АВ-17-2П меланоидины,
наряду с сорбцией, претерпевают ряд превращений. Последние, вопервых, могут быть связаны с распадом отдельных высокомолекуляр­
ных веществ на продукты с более низкой степенью полимеризации; вовторых, возможно взаимодействие продуктов распада между собой или
с некоторыми исходными компонентами меланоидинов с образованием
новых высокомолекулярных окрашенных и неокрашенных веществ.
Первый из названных эффектов и может служить причиной появления в
элюатах продуктов, отсутствующих в исходных меланоидинах. Вполне
вероятно, что распад отдельных компонентов исходных меланоидинов
приводит вначале к образованию аминокислотных дезоксифруктоз (что
согласуется с [55, 62, 97, 344]), неокрашенных и безазотистых окрашен­
ных соединений (в нашем случае это зоны с ОН-формы и 5 с С1-формы
водных элюатов, содержащие карамелеподобные вещества и вещества,
аналогичные продуктам распада инвертного сахара). Второй из назван­
ных эффектов может служить причиной укрупнения отдельных окра­
шенных компонентов с необратимым закреплением их в фазе сорбента.
Вероятность этого объясняется тем, что в водных, щелочных и соляно­
кислых элюатах не были обнаружены компоненты, содержащиеся в 1, 2,
5,6 и 8 электрофоретических зонах исходных меланоидинов.
176
Глава 4
Рис. 4.2. УФ спектры отдельных компонентов меланоидинов в элюатах.
Номера кривых соответствуют различным номерам
электрофоретических зон в табл. 4.2
Для более полной характеристики происходящих процессов были
сняты ИК спектры отдельных вновь образовавшихся веществ, находя­
щихся в солянокислых и щелочных элюатах, и проведено их сравнение
с окрашенными продуктами, содержащимися во 2, 3, 4, 5 и 7-й электро­
форетических зонах исходных пигментов (рис. 3.8, 4.2 и 4.3). Наиболее
интенсивными в спектрах исходных меланоидинов являются полосы
поглощения 1634 и 1554 см-1, характерные для колебаний амид I
(v С =0) и амид II (v N -H ) в аминокислотах. Полосы при 1512-1500 см-1
относятся к колебаниям пиррольного цикла, что подтверждают данные
УФ-спектроскопии. Пик 1396 см~ относится к колебаниям метильных
групп. Полосы поглощения при 1160-1150 см-1 в равной мере характер­
ны для валентных колебаний С-ОН и С -О -С связей. В ИК-спектрах
наблюдаются хорошо выраженные колебания при 1720-1706 см' 1 (С =0
в СООН-группах, а также полосы 1276 см (связи C-N).
Пики при 932-884 см-1 могут быть вызваны колебаниями NHгрупп, фуранозных колец или спиртовых групп. В работе [71] было по­
казано, что количество амино- и карбоксильных групп для веществ от­
дельных зон различно. Для компонентов исходных меланоидинов, по­
лученных нами (рис. 3.8), наблюдается подобная картина.
Химизм процессов образования красящих веществ
177
Для веществ 3-й электрофоретической зоны кислых элюатов харак­
терно их отличие от исходных компонентов (рис. 3.8). Во-первых, для них
почти не проявляются полосы поглощения 1720-1706 см-1 (С Ю в недиссоциированных СООН). Доминируют полосы 1630-1596 и 1568 см-1
(амид 1 и амид II в аминокислотах). Во-вторых, ИК спектры кислых элюа­
тов имеют менее интенсивные пики в области 1246-1258 см" (связи C-N)
по сравнению с компонентами исходных меланоидинов.
Сравнивая ИК-спектры веществ, содержащихся в электрофоретиче­
ских зонах щелочных элюатов (рис. 4.3), можно видеть следующее. Для
всех зон с ОН- и Cl-формы анионита наблюдаются общие полосы погло­
щения 1721—1708 см-1 (С = 0 в СООН-группах); 1630 и 1528 см”1 (амид I и
амид II в аминокислотах); 1585 см"1 (СОО"-группы); 1343-1273 см-1 (C -N
связи); 1038, 1008, 917 см"1 (кольца пиранозы, С-О-С-группы, С-О Н группы, а также NH -группы в аминосоединениях). Практически не прояв­
ляются полосы при 1650 см"1, характерные для сопряженных С=С связей.
Отсутствие цепи конъюгации в молекулах рассматриваемых соеди­
нений объясняет их оптическую неактивность в видимой области спек­
тра. Кроме того, для представленных ИК-спектров характерны (различ­
ные по интенсивности для отдельных компонентов) полосы поглощения
1802-1761 см"', отсутствующие в исходных меланоидинах и кислых
элюатах. Эти полосы можно отнести к колебаниям амид I - v С = 0 в
Р-лактамах. Более интенсивны эти полосы для элюатов с С1-анионита.
Кроме того, в спектрах щелочных элюатов проявляются интенсивные
максимумы 1516-1502 см"1 и 9 1 7 -8 7 6 см”', характерные для колебаний
пиррольных колец и СН в пиррольном цикле.
Следовательно, образующиеся при взаимодействии меланоидинов с
анионитом АВ-17-2П новые окрашенные и неокрашенные компоненты
значительно отличаются от исходных продуктов. При этом превращения
пигментов происходят как на солевой, так и на гидроксильной форме
анионита. Однако можно полагать, что более глубокие превращения ме­
ланоидинов наблюдаются на ОН-анионите, в фазе которого происходит
укрупнение отдельных компонентов и их необратимое поглощение. По­
этому в условиях очистки сахарных растворов, содержащих значитель­
ные количества меланоидинов, лучше использовать солевую форму.
Таким образом, впервые установлено, что взаимодействие мела­
ноидинов с ионообменником АВ-17-2П сопровождается не только их
поглощением по молекулярному и ионообменному механизмам и за счет
механического сцепления с фрагментами матрицы, но и превращением
отдельных окрашенных компонент в фазе смолы. Можно полагать, что в
данном случае проявляется каталитическое влияние ионообменника.
178
Глава 4
1800
1400
1000
600
V , см
Рис. 4.3. ИК-спектры компонентов щелочных элюатов с ОН-формы
(сплошные линии) и Cl-формы (штриховые линии) анионита
АВ-17-2П.
I, 2, 3 - первая, вторая и третья электрофоретические зоны меланоидинов
Химизм процессов образования красящих веществ
179
4 .2. Взаимодействие пигментов аминокислотного
производства с ионитами
В разделах 3.2.2 и 3.2.3 приведены свойства пигментов, которые
встречаются при получении, выделении и концентрировании аминокислот.
Следует отметить то обстоятельство, что изоэлектрические точки
меланоидинов различных аминокислотных производств различаются
между собой, что указывает на присутствие в ионах окрашенных ве­
ществ наряду с карбоксильными и аминогруппами других полярных
группировок [49, 102, 140].
Это находит свое подтверждение при анализе УФ-и ИК-спектров
отдельных компонентов меланоидинов (рис. 3.7, 3.8, 4.3,4.4, табл. 3.12),
выделенных с помощью бумажной и гельпроникающей хроматографии.
Значения констант протолиза (табл. 3.12) меланоидинов указывают
на удаленность СООН- и аминогрупп друг от друга в полимерной цепи
молекулы. Увеличение размера цвиттерлита ведет не только к простран­
ственному удалению протонодонорных и протоноакцепторных групп, к
увеличению дипольного момента, но и к заметному снижению иониза­
ции этих ф упп. Рассматриваемую закономерность легко проследить,
сравнивая снижение рК2 (аминофупп) меланоидинов различных амино­
кислотных производств (табл. 3.12) с рК2 а-аминофупп соответствую­
щих аминокислот (табл. 3.1). Как показывают приведенные данные, пиг­
менты оказываются значительно более слабыми основаниями, чем мономолекулярные аминокислоты. В этом смысле а-цвиттерлиты являются
наиболее кислыми и наиболее основными по сравнению с меланоидина­
ми. Можно полагать, что индивидуальные компоненты рассматриваемо­
го класса окрашенных веществ содержат в своем составе олигопептидные фрагменты, на которых располагаются R-радикалы с полярными
фуппами (в том числе с остатками сахаров) [49,61,318,322].
Рассмотренные особенности строения меланоидинов определенным
образом сказываются на селективности их поглощения ионообменниками.
Крупные размеры молекул и значительная молекулярная масса ме­
ланоидинов позволяют предположить, что их электростатическое взаи­
модействие с функциональными фуппами сорбентов не всегда является
тем фактором, который определяет селективность. Возвращаясь к меха­
низму поглощения биполярных ионов [102, 103, 109], можно полагать,
что в ряде случаев сорбция пигментов на ионитах в электрохимическом
отношении будет идентична сорбции аминокислот.
Особого внимания заслуживает возможность необратимого погло­
щения меланоидинов на анионитах за счет хемосорбционных процес­
сов, впервые отмеченная в работах [74, 102, 113]. Следует отметить, что
состояние резинатов меланоидинов до настоящего времени детально не
исследовалось, поэтому в данном разделе представлены результаты
сорбции пигментов на различных сорбентах.
180
Глава 4
На рис. 4.4 представлены результаты сорбции меланоидинов лизинового (C||H 490 2oN4)4o, пролинового (C|oH240|6N3)43, триптофанового
( C |j H | 9O i 6N 6)60 и глутаминового ( C | 2H 4 o 0 2oN2)26 производств на сульфокатионитах КУ-23(30/100) и Зеролит-225. Представленные данные сви­
детельствуют о незначительной сорбции пигментов гелевым катиони­
том по сравнению с его макропористым аналогом. Относительная ем­
кость смол характеризуется колоколообразными кривыми с максиму­
мами вблизи изоэлектрических точек меланоидинов (табл. 3.12). При­
чем правая ветвь кривых в области высоких pH опускается ниже, чем в
кислой области. Аналогичные зависимости наблюдали авторы [347] при
сорбции белков на сульфосмолах.
Рис. 4.4. Влияние pH раствора
на поглощение g (мг/г смолы)
меланоидинов глутаминового (/),
пролинового (2), лизинового (3),
триптофанового (4) производств
гелевым катионитом Зеролит-225
(а) и макропористым катионитом
КУ-23 (30/100) (б) в Н-форме
Можно полагать, что взаимодействие пигментов с катионообменниками является совокупностью ионного и диполь-ионного эффектов
[102, 109, 164, 166, 347]. Если это предположение верно, то сорбция
меланоидинов на анионообменниках также будет зависеть от pH рас­
твора. Действительно, для анионита АВ-17-2П (рис. 4.5) характер по­
глощения меланоидинов описывается кривой с максимумом.
Химизм процессов образования красящих веществ
181
Однако при низких значениях pH поглощение пигментов анионообменником не ниже по сравнению с высокими pH (как ожидалось), а
выше. Это указывает на то, что диполь-ионные взаимодействия между
сорбентами и пигментами в кислой среде отличаются рядом особенно­
стей. Об этом же свидетельствуют данные по сорбции пигментов лизинового и триптофанового производств неионогенным макросетчатым
сорбентом Стиросорб (рис. 4.5, б). Представляется вероятным, что мела­
ноидины, которые имеют в своем составе пептидные фрагменты, подоб­
но белкам способны иметь различную конформацию [49, 68, 95, 102].
д, м г /г
а
д, м г /г
б
Рис. 4.5. Влияние pH раствора на
поглощение g меланоидинов лизинового (/) и триптофанового (2)
производств анионитом АВ-17-2П
в ОН форме (а) и макросетчатым
неионогенным сорбентом Стиро­
сорб МХДЭхЮО (б)
При конформационных переходах [170, 173] в колебательных
спектрах наблюдается смешение полос поглощения групп амид-1 и
амид-11. Для окрашенных компонентов при pH выше 12 (рис. 4.6) на
ИК-спектрах доминирующими являются максимумы при 1651 (амид-1)
и 1556 см"1 (амид-11), характерные для а-спиральных конформационных
полипептидных участков [113, 175, 185].
Полосы при 1625 и 1526 см-1, характеризующие колебания групп
амид-1 и амид-11 в полипептидных фрагментах p-формы (почти вытяну­
тые цепочки), при pH выше 12 проявляются только в виде порогов. Одна-
182
Глава 4
ко в нейтральной области (рис. 4.6, кривая 2) интенсивность полос по­
глощения 1626 и 1526 см” повышается, что свидетельствует о появлении
в меланоидинах значительного числа участков в виде вытянутых цепей.
При низких значениях pH (рис. 4.6, кривая 3) p-форма становится
доминирующ ей, а а-спиральных участков в меланоидинах становится
меньше, что подтверждается небольшой интенсивностью максимумов
при 1651 и 1556 см-1. В области низких значений pH переход отдельных
фрагментов меланоидинов от спиральной структуры к p-форме сопро­
вождается переориентацией макромолекул и появлением большей части
гидрофобных участков на их поверхности [96].
ч'
80
60
40
---- II
20
1800
1400
1800
1400
1800
1400
v, см
Рис. 4.6. ИК-спектры меланоидинов лизинового производства (а),
образцов катионита Зеролит-225 (б) и макросетчатого
сорбента Стиросорб М Х ДЭ-100 (в), насыщенных
меланоидинами: /; 2; 3 - pH = 12,0; 6,2; 2,4 соответственно
В связи с тем, что катионит Зеролит-225 имеет массивный гидро­
фобный каркас, появление на поверхности молекул меланоидинов гид­
рофобных групп способствую т связыванию окрашенных веществ при
низких значениях pH за счет гидрофобного взаимодействия.
При этом в колебательных спектрах Н-катионита наблюдается уси­
ление полосы 1628 см-1 и появление пика при 1526 см” , характерных для
P-формы меланоидинов. Закрепившееся указанным образом окрашенные
вещества в фазе катионита при увеличении pH среды (рис. 4.6, б) прак­
тически не образует а-спиральных участков из-за возникших гидрофоб­
ных связей «сорбат - матрица сорбента». Следует отметить, что погло­
щенные необратимо меланоидины приводят к появлению у катионита
Химизм процессов образования красящ их веществ
183
слабокислотных свойств за счет накопления карбоксильных групп (мак­
симумы при 1706, 1587 и 1405 см '1, характеризующие колебания групп
>С =0 и -СОСГ соответственно).
Аналогичные превращения наблюдаются и при поглощении меланоидинов «сверхсшитым» макросетчатым полистирольным сорбентом
[107, 121], не содержащим функциональных групп. Существенным от­
личием от гелевого ионита является то, что конформационные переходы
меланоидинов под влиянием pH среды в фазе макросетчатого сорбента
(рис. 4.6, в) происходят без особых затруднений (появление пиков при
1662 и 1558 см '1при pH = 12, характерных для а-спирали). Таким обра­
зом, одним из основных факторов, приводящих к высокой селективно­
сти сорбции при низких значениях pH, являются конформационные пе­
реходы пигментов в фазе сорбентов.
Селективность сорбентов различного типа по мере их заполнения меланоидинами существенно различается (рис. 4.7). Для макросетчатого не­
ионогенного сорбента Стиросорб с увеличением X концентрационные
константы распределения растут почти монотонно, достигая самых боль­
ших значений по сравнению с ионообменными системами. В рассматри­
ваемом случае можно говорить о заметном сорбат-сорбатном взаимодейст­
вии в области больших заполнений сорбента и возможном образовании
полиассоциатов [347-350]. Константы обмена меланоидинов на сульфокатионите КУ-23 (рис. 4.7) имеют максимальное значение при степенях за­
полнения X < 0,4; а затем селективность снижается. В данном случае
можно говорить о значительном влиянии степени сетчатости ионита на
поглощение пигментов. Более крупные молекулы меланоидинов триптофанового производства начинают испытывать стерические затруднения при
меньших степенях заполнения, чем пигменты лизинового производства.
Изменение констант поглощения меланоидинов на анионитах [102,
148] характеризуется ниспадающей кривой. Можно полагать, что в дан­
ном случае определяющую роль играет стерический фактор, так как
даже при значениях X < 0 ,3 сорбция меланоидинов вызывает умень­
шение объема гранул АВ-17 на 18-20% по сравнению с исходной ОНформой анионита. Общее влагопоглощение анионообменника также
падает с 32 до 24 молей/активную группу для макропористого сорбента
и с 14 до 9 молей/активную группу для гелевой смолы. Следует отме­
тить, что сорбция меланоидинов на анионитах обусловлена энтропий­
ной составляющей [102, 148], что предполагает полифункциональные
взаимодействия пигментов с ионитом. Однако увеличение энтропии в
рассматриваемом случае не может компенсировать энтальпийный фак­
тор (рост Д/У) и ситовый эффект.
184
Глава 4
Рис. 4.7. Зависимость концентрационных констант сорбции М+-Н* от
эквивалентной доли органического противоиона в фазе
сорбентов Стиросорб МХДЭ-100 (а) и КУ-23(30/100) (б):
1; 2 - меланоидины лизинового и триптофанового
производства соответственно
Следовательно, для сорбции меланоидинов характерно их необ­
менное поглощение различными сорбентами.
Наибольший интерес представляет тот факт, что подобные процес­
сы в ряде случаев носят необратимый характер.
Выше было показано, что окрашенные компоненты содержат в своем
составе различные функциональные группы (-СООН; -NH2; —ОН; -0 -С = 0
и др.), обладают значительной молекулярной массой и способны к конформационным превращениям. При определенных условиях необменносорбированные меланоидины могут претерпевать ряд превращений [102,
103, 112, 148], приводящих к прочному закреплению пигментов в фазе сор­
бента. Например, длительная эксплуатация катионита КУ-2-8 в условиях
выделения лизина из ферментационных растворов приводит к снижению
обменной емкости по катионам целевой аминокислоты, механической
прочности и изменению окраски гранул в видимой области спектра
(табл. 4.3).
Сравнение ИК-спектров образцов катионита (рис. 4.8) показало,
что в фазе сорбента накапливаются окрашенные вещества; на спектро­
граммах появляются пики 3260, 3108, 1627 см- , характеризующие ко­
лебания аминогрупп, и максимумы 1706, 1587, 1405 см-1 (неионизированные и ионизированные СООН-группы меланоидинов). При этом в
ИК спектрах отсутствуют полосы, обусловленные образованием кова­
лентных связей между сорбентом и сорбатом, что указывает на закреп­
ление пигментов преимущественно за счет конформационных превра­
щений в ионите.
Следует отметить, что скорость превращения пигментов (их ассо­
циация и светопоглощение) несколько отстает от необратимого накоп­
ления в катионите (табл. 4.3), что свидетельствует о влиянии временно­
го фактора на глубину сорбатных превращений.
185
Химизм процессов образования красящих веществ
4.3. Изменение некоторых физико-химических характ ерист ик
сульфокатионитов КУ-2-8 после контакта с окраш енными
растворами лизинового производства.
Емкость
Время
по лизину,
контакта, ч
мг-экв/г
0
20
40
100
200
400
2,6
2,1
2,0
1,6
1,3
1,2
Осмотическая
стабильность, %
Накопление
пигментов,
мг/г ионита
100
89
80
71
70
69
0
38
51
60
64
67
Оптическая
плотность
гранул
при Х.=285 нм
0,20
0,39
0,41
0,46
0,52
0,84
Доказательством переориентации макромолекул пигментов служат
рассмотренные выше ИК-спектры образцов сульфокатионита Зеролит-225
и сорбента Стиросорб (рис. 4.7, кривая 3) при насыщении их меланоидинами.
Структурные изменения под действием окрашенных компонентов в
анионообменных смолах по сравнению с катионитами и неионогенными
сорбентами отличаются рядом особенностей. Это связано прежде всего с
меньшей термохимической устойчивостью анионитов, вызванной реак­
циями дезаминирования и дезалкилирования аминогрупп, катализиро­
ванными ионами ОН" [62,102,103,112, 113,123]. Полученные результа­
ты (табл. 4.4) указывают на то, что при воздействии растворов гидрокси­
дов происходят необратимые изменения в матрице анионита АВ-17.
Одновременное воздействие температуры и гидроксида вызывает
деградацию ОН-анионита (рис. 4.8). На ИК-спектрах таких образцов
наблюдается уменьшение интенсивности полос поглощения при 2560,
1640 и 835 см", характеризующих колебания групп ОН, связанных с
четвертичным азотом активной группы ионита. Появление на спектро­
граммах максимумов при 3430-3360; 1348 и 1146 см”1 свидетельствует
об образовании низкоосновных аминогрупп [113,140].
Известно, что регенерация анионитов в процессе выделения ами­
нокислот осуществляется в ряде случаев растворами гидроксидов [109,
141]. Такие периодически повторяющиеся операции приводят к потере
емкости сорбента по высокоосновным группам и превращению высоко­
основной смолы в полифункциональную. Появившиеся в анионите низ­
коосновные аминогруппы [102, 103, 148] при повышенных температу­
рах вступают в реакцию со слабокислотными группами меланоидинов
[102, 103, 109, 113, 123]. На это указывает появление максимума при
1579-1566 см" (рис. 4.9, а), характеризующего колебания C-N в амид­
ных группировках и -СОО" в карбоксилатных группах, а также усиле8—3196
186
Глава 4
ние пика 1230-1217 см” (С-О в аминокислотах или C -N связи) при
взаимодействии АВ-17-2П с пигментами лизинового и глутаминового
производства (кривые / и 2 соответственно).
V, СМ
V,
см
Рис. 4.8. ИК-спектры образцов Н-катионита КУ-2-8 до ( /, а) и после
400-часового контакта (2, а) с меланоидинами лизинового
производства; ОН-анионита АВ-17-2П до (1, б) и после (2, 6) 900часового контакта с 3 М раствором гидроксида натрия при 353 К
Одной из причин, приводящих к необратимому поглощению мела­
ноидинов, может быть реакция образования амидных (пептидных) свя­
зей в сорбенте [109, 113].
187
Химизм процессов образования красящих веществ
4.4. Изменение физико-химических характеристик ОН-анионита
АВ-17-8 при обработке 0,1 Мраствором NaOH
Структурные
Температура,
изменения
К
Удаление основной
373
массы воды
Окончание дегидра­
423
тации
Начало дезаминиро­
447
вания
Окончание дезами­
463
нирования
Окисление до альде­
488
гидов
Разрушение матрицы
528
Емкость,
мг-экв/г
3,9
PIS, г/мм1
Цвет гранул
1350
светло-желтый
3,7
1154
светло-желтый
3,1
738
светло-желтый
0
450
темно-желтый
0
256
коричневый
0
160
черный
Рис. 4.9. ИК-спектры образцов ОН-анионита АВ-17-2П, контактирующего
100 ч с меланоидинами лизинового (/, а) и глутаминового (2, а)
производств. 1 ,6 - исходный анионит; 2 ,6 - ОН-анионит после
450 ч контакта с 60% раствором сахарозы при 253 К
Дополнительным фактором, приводящим к модификации анионита,
являются необменные взаимодействия, в которых сорбент выступает как
катализатор реакций десмолиза полисахаридных фрагментов в меланоидинах и сахаров, сопутствующих процессу ферментации [1, 62, 102, 109].
Например, ОН-аниониты АВ-17-8 и АВ-17-2П при взаимодействии с
концентрированными растворами сахарозы при повышенной температу­
ре теряют емкость по высокоосновным группам, уменьшается их осмо­
тическая стабильность и механическая прочность, гранулы приобретают
коричневый цвет. Последнее вызвано превращением дисахарида под
действием температуры и щелочной среды в фазе анионитов (десмолиз)
Глава 4
188
в окрашенные вещества и поглощением их матрицей сорбента. В ИКспектрах таких образцов анионитов появляются полосы поглощения при
1717 см' 1 (С=0 в СООН группах), 1562 см' 1 (-СОО-), 1145-1030 см' 1
(С-О-С и ОН-фуппа), которые указывают на наличие пигментов и мо­
носахаров в фазе анионообменников (рис. 4.9, б). Следует отметить, что
образование пигментов в фазе смол при контакте сахарозы с солевой
формой высокоосновных анионитов не наблюдается.
Поглощенные необратимо меланоидины приводят к появлению у
анионита слабокислотных свойств и превращению его в амфолит. Ряд
набухания, полученный для модифицированного анионообменника
АВ-17-2П,
.Н
R
ОН
Н
Na
RC С1 < r ^/ о н < <
К
он
характерен для типичных полиамфолитов, содержащих одновременно
амино- и карбоксильные группы (рис. 4.10). Это обусловлено накопле­
нием карбоксильных групп, содержащихся в пигментах, в фазе аниони­
та. Максимумы при 1721, 1576 и 1405 см ' (рис. 4.10, а) характеризуют
колебания групп С=0 и -С О О ' в карбоксильных группировках.
HCI
НОН
NaOH
ко н
Рис. 4.10. Влияние вида противоиона на коэффициент набухания/
амфолита АНКБ-2 (/), анионита АВ-17-2П после 900-часового
контакта с раствором гидроксида натрия (2), 100-часового
контакта с меланоидинами лизинового производства (5)
Представляло интерес проследить установленные эффекты на поликонденсационных полифункциональных анионитах. Поликонденсацион-
189
Химизм процессов образования красящих веществ
ные аниониты АН-31, ЭДЭ-10П, АВ-16Г имеют амино- и спиртовые груп­
пы, при этом содержание высокоосновных аминогрупп (ЭДЭ-10П - чет­
вертичные аммониевые основания, АВ-16Г - четвертичные пиридиновые
основания) составляет 12-20% от их общего числа в сорбенте [122, 123].
Под действием раствора гидроксида натрия при повышенных тем­
пературах эти аниониты теряют емкость по высокоосновным группам.
Например, при продолжительной обработке анионита АВ-16Г раство­
рами щелочи высокоосновные пиридиновые группы за счет таутомерных реакций [95, 251]:
О
II
^ с н -с н *
R N\
хн= сн
t°с
с н ---------- ►
/
NaOH
н -с -н с * ^
R—NH
ЯН
К
_
/
сн = сн
превращаются в ненасыщенный аминоальдегид, а анионит из полифункционального - в низкоосновный [95, 113, 123, 163,351].
Превращение ненасыщенного аминоальдегида в пиридон, находя­
щийся в таутомерном равновесии с оксипиридином, вызывает образо­
вание кетогрупп >С=0:
о
О
Я
В
НО
н —-с —н е .
с —сн*.
„
--------►
R—ЙН
ЯН
-------►
R—NH
Р
Н
ч
/
ч
/
Х Н —СН
ХН=СН
I
.с —е н ^ „
R—Й\
£Н
V
х н —с н
Анализ ИК-спектров обработанных образцов анионита АВ-16Г
(рис. 4.12, а) указывает на появление в фазе смолы групп С =0 (v С =0
при 1702 см '1).
Сложные процессы протекают при взаимодействии анионита АВ-16Г
с растворами моносахаров при повышенных температурах. Например,
взаимодействие глюкозы с ОН-анионитом сопровождается необрати­
мым поглощением моносахарида с последующим окрашиванием гранул
и их разрушением [102]. В соответствии с реакцией:
R
\
R’
NH
У/Аи
V?
Х1
-н2о
/
в фазе сорбента образуются гликозиламины, наличие которых в ионите,
как и в случае мономерных веществ, характеризуется увеличением в ИКспектрах (рис. 4.11, б) интенсивности полос 1627 и 1339 см"1 (связи
190
Глава 4
C-N). Закрепившийся в анионообменнике моносахарид под влиянием
щелочной среды подвергается глубоким превращениям, в том числе ретроапьдольному распаду с образованием оксиальдегидов [62, 123]. По­
следние способны взаимодействовать с аминогруппами анионита с обра­
зованием оснований Шиффа:
У1
R -№
°4
но
+ !"'j t —R” —
► R—N = C H —R”
ГН \w
!____ ]
Обработка анионита (после контакта с глюкозой) растворами гид­
роксида натрия при 333 К сопровождается более быстрыми изменениями
свойств смолы и появлением у нее катионнообменной функции за счет
образования слабокислотных групп (v -COO" при 1535 и 1398 см"1), что
вызвано десмолизом моносахарида в фазе сорбента [24,62, 112].
3?
60
40
20
3200 2400
1800 1400 1000
V,
см
60
40
20
-------------й-----------------------3200 2400
1800 1400 1000
Рис. 4.11. ИК-спектры об­
разцов исходного ОН-анио­
нита АВ-16Г (/, а; /, б); по­
сле обработки 0,5 М раство­
ром NaOH при 333 К (2, а);
при 353 К (3, а) и после
8-часового контакта с 0,1 М
раствором глюкозы при
333 К (2, б); 3 ,6 - спектр
исходного моносахарида
Наличие в ИК-спектрах образцов анионита максимумов при 1646 и
2294 см-1 (рис. 4.11, б) характеризует колебания связи C=N. Образова­
ние оснований Шиффа подтверждается окрашиванием гранул смолы
при реакции с фторборатом 4-нитро-фенилдиазония [143, 163].
191
Химизм процессов образования красящих веществ
Ряд особенностей наблюдается при необменном взаимодействии
между анионитом АВ-16Г и меланоидинами. После обработки горячим
раствором гидроксида натрия в ионите появляются альдегидные груп­
пы, которые затем вступают в реакцию конденсации с аминогруппами
меланоидинов:
н-с+О
/ !__
не
R-NH
+
у СН
*4
ГN - R - C O O H
X
-Н20
t °с
►R - N H - C H - C H - C H
|
Н '
\:н -с н
СН—CH“ N—R—СООН
Образование связей C=N, характерных для оснований Шиффа,
проявляется в ИК-спектрах ионита (рис. 4.12) в виде полос при 2290
и 1662 см-1.
При взаимодействии смолы АВ-16Г с продуктами превращения
глюкозы и меланоидинами наблюдается ряд общих закономерностей.
В обоих случаях происходит гетерогенная реакция, приводящая к обра­
зованию оснований Шиффа в полимере. Отличие заключается лишь в
том, что при контакте сорбента с глюкозой носителем альдегидных
групп является жидкая фаза, а при контакте с меланоидинами носите­
лем групп -С Н = 0 становится твердая фаза.
а?
60
40
20
3200
2400
1800
1400
•1
V, СМ
Рис. 4.12. ИК-спектры образцов ОН-анионита АВ-16Г, контактиро­
вавшего с меланоидинами при 333 К (/); 2, 3 - образцы
анионита после регенерации 0,5 М растворами NaOH и
соляной кислоты, соответственно
192
Глава 4
Описанные выше процессы наблюдаются при использовании анио­
нита АВ-16Г для обесцвечивания ферментационных растворов лизина,
глутаминовой кислоты и триптофана. В этом случае одной из технологи­
ческих операций является регенерация ионита растворами гидроксида
натрия при температуре 323 К. Это способствует образованию в фазе
смолы ненасыщенных аминоапьдегидов и последующему взаимодейст­
вию их с меланоидинами, содержащимися в растворах аминокислот, по
описанным выше схемам. Характер ИК-спектров (рис. 4.12) образцов
анионита указывает на присутствие в фазе сорбента оснований Шиффа,
амидных связей и карбоксильных групп. Таким образом, закрепление
красящих веществ на ОН-форме анионитов может быть обусловлено как
механическим переплетением, так и образованием ковалентных связей
между сорбатом и сорбентом. Появление новых прочных связей в фазе
смол способствует увеличению жесткости матрицы. Проведенные ис­
следования по определению прочности гранул на раздавливание указы­
вают на справедливость высказанного предположения (рис. 4.13). Для
гранул анионита после 40 рабочих циклов сопротивление на раздавлива­
ние Д возросло, что объясняется дополнительным сшиванием матрицы
ионитов за счет «механического» переплетения молекулами поглощен­
ных веществ, а также образованием связей ковалентного типа между
сорбатом и сорбентом. Увеличение жесткости каркаса вызывает нарас­
тание в матрице внутренних напряжений. Поэтому быстрое набухание
или сжатие сорбентов, наблюдаемое в процессах сорбции-десорбции
аминокислот, может вызвать локальный разрыв матрицы по наиболее
перенапряженным связям. Такие разрывы сопровождаются появлением
микротрещин в зернах смол с последующим полным их разрушением.
Причем механическое измельчение гранул происходит симбатно увели­
чению жесткости матрицы ионообменников (рис. 4.13). В наименьшей
степени этот эффект характерен для макропористой смолы АВ-17*2П в
Cl-форме, для которой вероятность образования новых ковалентных свя­
зей в матрице минимальна при контакте с меланоидинами (табл. 4.5).
Следует отметить, что реакция меланоидинообразования между са­
харами и азотистыми веществами идет с выделением большого количест­
ва тепла [1, 352]. При вступлении в реакцию 14 г азота выделяется 28 кДж
[97]. Причем самые благоприятные условия реакции пигментации отме­
чаются при наличии 26-36% воды [97, 117, 286], т. е. при таком количест­
ве растворителя, какое реально может иметь место в модифицированных
ионитах [102, 140]. Поэтому в сорбентах, используемых для выделения
аминокислот и обесцвечивания ферментационных растворов, реакции
меланоидинообразования проходят со значительным экзотермическим
эффектом (рис. 4.14), особенно в щелочных средах. Это может служить
причиной повышения температуры и давления в герметически закрытых
анионообменных фильтрах в случае прерывания процесса регенерации
растворами гидроксидов.
Химизм процессов образования красящих веществ
193
е,
%
45
30
15
О
100 200
100 200
т,
час
Рис. 4.13. Изменение прочности на раздавливание А отдельных гранул ( /)
и механического измельчения £ (2) анионитов в процессе вза­
имодействия с меланоидинами лизинового производства:
а, б, в, г, д - АВ-16Г(ОН); АВ-17-8(ОН); АВ-17-2П(ОН);
АВ-17-8(С1) и А В-17-2П(С1), соответственно
4.5. Изменение физико-химических свойств анионитов после
60 циклов сорбции-десорбции меланоидинов глутаминового
производства
Ионит
Количество
ЕМ КОСТЬ, МГ'ЭКВ/Г
Обесцве­ пигментов
Механи­
чиваю­
(%), закреп­
по вы­
ческое
щая спо­ ленных в ио­
сокоос­
измель­
собность, ните, к сорби­ общая новным по ио­
чение, %
нам Na+
рованным
%
груп­
пигментам
пам
16
28
60/54*
АВ-17х2П(С1)
7
58/62
20
3,8/3,8
АВ-17х2П(ОН)
12
76/68
49
3,8/3,5
3,5/0,9
0,0/0,4
АВ-16Г(0Н)
34
80/69
82
6,7/4,9
1,4/0,3
0,0/ 1,7
49/30
36
68
0,0/0,2
4,0/3.9
4,0/1,!
3,5/3,4
АВ-17х2(С1)
АВ-17х2(ОН)
4,1/3,9
4,1/2,8
0,0/0,7
0.0/0,0
в числителе представлены данные для исходного, а в знаменателе - для моди­
фицированного анионита.
Вероятность подобного явления возрастает с увеличением времени
эксплуатации анионитов в связи с накоплением низкоосновных амино­
групп, как за счет деградации фиксированных ионов, так и за счет необ­
ратимого поглощения меланоидинов. В лабораторных опытах был смо­
делирован рассматриваемый процесс и в двух случаях были зафиксиро­
ваны взрывы ионообменных фильтров с анионитами АВ-16Г и АН-31 Г,
194
Глава 4
сопровождавшиеся выбросом смолы. Обесцвечивающие аниониты в
этом случае представляли собой теплоизоляционный слой, обладающий
низкой теплопроводностью, что привело к росту критической темпера­
туры в ионообменных колоннах.
Для предотвращения взрывов анионитовых реакторов в производ­
ственных условиях при выделении или обесцвечивании аминокислот­
ных растворов нельзя прерывать регенерацию слоя сорбента и оставлять
модифицированные аниониты в щелочных растворах.
~2
4
6
8 х, чх102
Рис. 4.14. Тепловые эффекты в фазе модифицированных меланоидинами
ОН-анионитов АВ-17-2П (/) и АВ-16Г (2) при контакте с
аминокислотами (LV) и сахарами (LC) в зависимости от
времени модификации (т) сорбентов
Следует отметить, что необратимо закрепившиеся в фазе ионитов
меланоидины оказывают влияние и на сорбционные характеристики це­
левых веществ. На рис. 4.15 представлены данные поглощения лизина
катионитом КУ-2-8, который «проработал» 400 часов с пигментами. Та­
кой сорбент по отношению к аминокислоте стал вести себя подобно полифункциональному катиониту, содержащему одновременно сульфо- и
карбоксильные группы. Проявление у модифицированного меланоиди­
нами катионообменника слабокислотных свойств наступило в результате
накопления карбоксильных групп (максимумы 1706, 1587 и 1405 см” ,
характерные колебания >С=0 и -СОО“ в карбоксильных группах).
Опыты показали, что наиболее эффективным способом регенерации
модифицированных меланоидинами ионитов является их периодическая
обработка 1,0-2,0 М растворами соляной кислоты (после 20-25 циклов
работы). Кроме того, попеременная (пульсирующая) обработка раство­
рами гидроксида и соляной кислоты также весьма эффективна для уда­
ления пигментов из анионитов. Макросетчатые неионогенные сорбенты
регенерируются на 80-85% растворами гидроксида натрия.
Химизм процессов образования красящих веществ
195
Рис. 4.15. Влияние pH равновесного раствора на сорбцию лизина ( g )
исходным катионитом КУ-2-8 (/), модифицированным
меланоидинами катионитом КУ-2-8 (2) и слабокислотным
катионитом КМТ (3) [349]
Таким образом, процессы изменения свойств ионитов («старения»)
при работе с аминокислотными растворами весьма сложны и могут быть
вызваны: 1) внутримолекулярными перегруппировками пигментов; 2) де­
струкцией связей между полимерными цепями, а также между функцио­
нальными группами матрицы; 3) каталитическими превращениями моле­
кул сорбата, которые затем закрепляются в фазе смолы; 4) специфическими
химическими реакциями между функциональными группами сорбента и
сорбируемого вещества. Эти вторичные реакции могут приводить к глубо­
ким изменениям свойств ионитов, поэтому при выборе сорбентов для вы­
деления цвиттерлитов, полного обессоливания и обесцвечивания фермен­
тационных растворов и гидролизатов необходимо учитывать возможность
их протекания и способы борьбы с быстрыми превращениями в сорбентах.
4.3. Влияние гум усовы х ве щ е ств на ф и зи ко ­
хим ические св о й ства ионообм енны х
м атериал ов
Эффективность хроматографических процессов, экологические и
экономические показатели сорбционных установок в значительной сте­
пени зависят от эксплуатационных характеристик ионообменных мате­
риалов, прежде всего от их кинетических характеристик и обменной ем­
кости. Отмечено, что с увеличением длительности эксплуатации стан­
дартных гелевых анионитов обменная емкость падает, при этом увели­
чивается количество необходимых для регенерации реагентов и воды на
отмывку от продуктов десорбции. Изменение физико-химических
свойств ионитов и мембран в литературе называют старением или отрав­
196
Глава 4
лением. Представлялось необходимым исследование изменений физико­
химических свойств ионитов в результате их взаимодействия с пигмен­
тами - гуминовыми (ГК) и фульвокислотами (ФК) природных вод.
Старение гранулированных ионообменников обнаружили впервые
в конце 50-х годов прошлого века в Голландии технологи ионообмен­
ных обессоливающих установок. Они установили, что сильноионизированные аниониты после контакта с водой, содержащей гумусовые со­
единения, теряют основность и приобретают амфотерные свойства
[354]. Позднее авторы [355] выделили 4 типа загрязнений ионообмен­
ных смол, которые могут быть ответственны за этот эффект, присутст­
вие грубодисперсных примесей (ГДП), насыщение органическими ве­
ществами, необратимые загрязнения, смешение различных ионообмен­
ных смол (катионитов и анионитов).
4.3.1. Изменение физико-химических свойств катионита
КУ-2-8 при эксплуатации в промышленных
фильтрах
Долгое время априори считалось, что отравлению органическими
веществами природных вод подвергаются только аниониты. Поэтому
вопрос старения катионитов возник гораздо позже того, как была сфор­
мулирована эта проблема в отношении анионообменников. Так, выяс­
нилось [356], что при фильтрации по схеме: АУ —> КУ-2-8 —> АВ-17-8
на активном угле (АУ) задерживается -40% примесей от исходного ко­
личества, катионит поглощает 10% и анионит — 3%. Факт адсорбции
органических веществ катионитами обнаружен по высокой окисляемости кислого регенерата [357]. Адсорбция катионитами окрашенных (гу­
мусовых) веществ отмечена также в [354, 357].
Для оценки состояния катионита после нескольких лет промыш­
ленной эксплуатации исследованы образцы из фильтров 1 ступени уста­
новки деионизации воды, содержащей 0,1 и 1,8 мг/дм ГК и ФК (р. Быстрица), а также из фильтров 1 ступени и ФСД (фильтр смешанного дейст­
вия, загрузка которого состоит из высокоионизированных ионообменных
смол - катионита КУ-2-8 и анионита АВ-17-8) в схеме обессоливания
невской воды, содержащей в среднем 1,2 и 12,5 мг/дм3 ГК и ФК.
При длительной работе катионит становится из желтого коричневым.
Установлено, что независимо от места расположения фильтра в техноло­
гической цепочке и качества сырой воды, снижение рабочей обменной
емкости (до проскока катионов С/С0 —0,03) невелико. Однако прослежи­
вается изменение соотношения внутри- и внешнедиффузионного этапов
кинетики, которое обнаруживается при сорбции ионов Са2+ (рис. 4.16).
Классическая выходная кривая при внешнедиффузионном меха­
низме кинетики, когда имеет место размытие начальной ее части (кри­
вая /), превращается в кривую (рис. 4.16, кривая 2) с явно выраженными
Химизм процессов образования красящих веществ
197
признаками значительного влияния внутридиффузионной стадии массопереноса на скорость обменного процесса: обострение начала кривой
и ее размытие при увеличении степени заполнения ионита сорбтивом.
Рис. 4.16. Выходные кривые сорбции ионов Са + катионитом КУ-2-8
товарным (/) и работавшим в ФСД (2)
Получены ИК-спектры этого образца катионита КУ-2-8 на двухлу­
чевом спектрофотометре ИКС-14 (рис. 4.17).
Рис. 4.17. ИК спектры катионита КУ-2-8 товарного ( / ) и работавшего
в ФСД в течение двух пет (2)
Имеются полосы поглощения, присущие сульфокатионитам: пло­
скостные валентные колебания связи С-Н (3050 см-') и С=С (.1600,1500,
1450 см’') бензольного кольца, а также полосы, обусловленные валент­
ными колебаниями S=0 в неионизированной (1240-1160 см-') и иони­
зированной (1045-1010 см”'') сулъфогруппе. Кроме того, на ИК-спектре
товарного образца имеются полосы поглощения, которые могут быть
отнесены к валентным колебаниям С =0 (1753 и 1708 см”') карбоксиль­
ной группы. Возрастает интенсивность полос в области 1665, 1635,
1600, 1458 см’ , что может расцениваться как увеличение содержания
Я
198
Глава 4
ароматических соединений в работавшем образце катионита и объяс­
няться внедрением в матрицу ионообменника гумусовых кислот.
Полученные результаты дают основание полагать, что выявленные
кинетические затруднения обусловлены присутствием в зерне катиони­
та ГК и ФК, оказывающих диффузионное торможение массопереноса
минеральных ионов в ионите.
Исследованы примеси, извлеченные из катионита, работавшего в
промышленном фильтре обессоливания воды. Объект - катионит КУ-2-8
после восьми лет эксплуатации в установке обессоливания артезианской
воды, содержащей 0,1 мг/дм ГК и 1,0 мг/дм3 ФК. Задача состояла в извле­
чении из работавшей смолы органических примесей и их идентификации.
Катионит обрабатывали в течение 15 и 30 сут. растворами 10% NaCl; 2%
NaOH в 10% NaCl; 5% N a^O ?; 7% НС1; 2% NaOH в 2% NR.OH, а также
водными растворами ацетона (1 : 1), диметилсульфоксида (1 : 4), этанола
(1 : 5), то есть выдерживали в тех жидких средах, в которых ГК и ФК хо­
рошо растворяются. Оказалось, что к наибольшему эффекту очистки ка­
тионита приводит его обработка солещелочной смесью.
Окрашенные органические вещества, извлеченные из катионита со­
лещелочным раствором, идентифицировали методом восходящей бумаж­
ной хроматографии в смеси бутанол-уксусная кислота - вода ( 4 : 1 : 5).
Разгонке подвергались пробы до и после гидролиза в б моль/дм3 НС1.
Проявитель - 0,5% раствор нингидрина.
Как было сказано выше, ФК и ГК имеют боковые алифатические
цепочки, в состав которых входят различные вещества, в том числе
аминокислоты.
Рис. 4.18. Кривые отмывки от НС1 образцов катионита КУ-2-8 товарного
(/) и работавшего (2,5); 2 - после обработки солещелочным
раствором; 3 - до обработки
При гидролизе сложные структуры разрушаются, и их фрагменты
можно выявить методом хроматографии. Так как присутствующие в ФК
199
Химизм процессов образования красящих веществ
аминокислоты имеют близкие значения Rf, каждой зоне соответствует
определенная группа аминокислот (табл. 4.6).
4.6. Аминокислотный состав веществ, извлеченных из работавших
в промышленных установках образцов катионита КУ-2-8
Гуминовые кислоты
Аминокислоты
Rг
Цистеин,
0,16
лизин, аргинин,
0,25
До гид­
До гид­
гистидин, аспара­ ролиза
ролиза
гин, аспарагино­
вая кислота
0,09
После
гидроли­
за
0,20
0,37
0,88
Возможно, цисте­
ин
Лизин
После
Глицин
гидроли­
за
Лейцин (слабая
полоса)
Фульвокислоты
Аминокислоты
Rt
0,37 Глицин
0,46
Аланин
0,82
Валин
0,86
Лейцин
0,28
Аргинин, гистидин
0,38
0,45
Глицин
Глутаминовая ки­
слота, аланин
Пролин
Валин
Лейцин
0,59
0,76
0,87
Из данных табл. 4.6 следует, что обработкой солещелочным рас­
твором извлекаются ГК, фрагментами которых являются в основном
аминокислоты с низкими значениями R(, в то время как элюированные
из КУ-2-8 ФК состоят из аминокислот с большими величинами R{. Ука­
занные в табл. 4.6 аминокислоты являются типичными составляющими
ФК [359]. Присутствием ГК и ФК объясняются трудности послерегенерационной отмывки смол. Поглощенные гумусовые кислоты вносят в
катионит некоторое количество карбоксильных групп. В процессе реге­
нерации последние образуют соли HCl-H2N-R-CO O H , которые при по­
даче воды гидролизуются, удлиняя процесс отмывки смолы (рис. 4.18).
Так, необработанный щелочным раствором образец катионита от­
мыть от НС 1 не удалось даже при затратах 200 объемов воды к объему
загрузки, в то время как для отмывки товарного образца достаточно
10 об/об. Катионит, обработанный солещелочным раствором, отмыт
140 объемами воды. То есть даже частичное удаление из смолы ФК и
ГК сократило объем отмывочной воды на 30%. Снижение степени за­
грязнения катионита следует также из вида ИК-спектров до и после об­
работки солещелочным раствором.
На рис. 4.19 показано, что с углублением очистки катионита от гу­
муса снижается интенсивность ряда полос поглощения или они полно­
стью исчезают.
200
Глава 4
В табл. 4.7 приведена величина относительной интенсивности по­
лос поглощения (по отношению к полосе 826 см-1). В результате обра­
ботки катионита КУ-2-8 солещелочным раствором извлечены фрагмен­
ты гумусовых кислот, содержащие алифатические и ароматические
аминокислоты, бензольные ядра с различным количеством заместите­
лей, альдегидные группировки. При этом снизилось количество метильно-метиленовых групп, входящих в алифатические боковые цепочки в
молекулах кислот. То есть солещелочной обработкой из катионита уда­
лены длинноцепочечные фрагменты ФК, которые в силу стерических
препятствий оставались на поверхности зерна ионита.
При проведении работ на ионообменной установке производитель­
ностью 40 м3/ч по обессоливанию воды р. Быстрицы обнаружен факт,
подтверждающий выявленное в [354] отравление анионитов продукта­
ми, вымываемыми из катионитового фильтра. Но это не продукты его
деструкции, как полагали авторы.
v , см -»
Рис. 4.19. ИК-спектры поглощения катионита КУ-2-8 товарного (/) и
работавшего в фильтре (2-4)\ до (2) и после ( 5 , 4) обработки
в течение 15 (3) и 30 ( 4) сут. раствором NaCl в NaOH
На протяжении рабочего периода отбирали пробы воды объемом
1 дм3 до и после фильтра с катионитом КУ-2-8, упаривали досуха. От­
метили, что сухой остаток сырой воды окрашен в желто-коричневый
цвет в меньшей степени, чем остаток воды Н-катионированной. Впо­
следствии оказалось, что интенсивность окраски осадка коррелирует с
Химизм процессов образования красящих веществ
201
концентрацией ГК и ФК в Н-катионированной воде. Результаты анализа
приведены в табл. 4.8.
Из представленных данных следует, что в процессе рабочего пе­
риода катионит «отмывается» от органических примесей, десорбиро­
ванных при кислотной промывке. Это обстоятельство - еще одно свиде­
тельство факта взаимодействия органических примесей воды не только
с анионообменными, но и с катионообменными смолами.
4.7. Относительная интенсивность полос поглощения в ИК
спектрах работавшего катионита КУ-2-8 до и после десорбции
примесей
Относительная интенсивность
полос
катионит
обработка
обработка
до обработки
30 сут.
15 сут.
отсут.
4,0
3,0
1760, v С =0 в димерах СООН
14,0
10,0
15,0
1690, v С=0 в ароматических кислотах
отсут.
отсут.
16,0
1673, v С =0 в кислотах
отсут.
5,0
4,0
1560, v „ С =0 в СОСГ
отсут.
3,5
отсут.
1533, тож е
5,0
15,0
8,0
1470, р„ в С-Н в СН2
5,0
18,5
7,0
1400, v С =0 в СОСГ
1,0
1,0
4,5
1346, v С-Н
отсут.
отсут.
1,5
1300, р, NH] в солях аминокислот
Частоты (см-1) и параметры отнесения полос поглощения
4.8. Изменение качества речной воды при ее Н-катионировании
Пропу­
щено
воды, м
80
400
1000
1600
1800
Содержание ФК,
Увеличе­
±50 мкг/дм3
ние Сфк,
до катио­
после него мкг/дм
нита
200
300
850
880
910
860
1300
1750
1040
1030
660
1000
900
160
120
Содержание ГК,
± 10 мкг/дм
до катио­
нита
70
140
60
80
50
Увели­
чение
СУк,
после него мкг/дм
270
300
190
160
75
200
160
130
80
25
Таким образом, наличие ГК и ФК в катионите явилось причиной
увеличения вклада внутридиффузионной стадии массопереноса мине­
ральных катионов к функциональным группам.
202
Глава 4
4.3.2. Изменение физико-химических свойств анионитов
при эксплуатации в фильтрах смешанного
действия
В качестве факторов, вызывающих старение анионитов, называют
планктон, синтетические детергенты, продукты распада катионитов; ио­
ны железа, попадающие в анионитовый фильтр не только с Н-катионированной водой, но и с регенерирующим раствором щелочи; крем­
ниевые кислоты; действие окислителей - свободного хлора и озона; разру­
шение ионогенных групп бактериями; необратимую сорбцию органических
веществ, вымываемых из катионообменных смол, и т. д. [354,360-362]. Од­
нако большинство исследователей считает основной причиной старения
анионитовых смол их отравление гумусовыми кислотами.
На практике с целью улучшения эксплуатационных характеристик
ионитов применяют методы, направленные на извлечение из фазы ионита
гуминовых и фульвокислот, железа, кремниевой кислоты и других приме­
сей, которые, по мнению технологов, становятся причиной падения емко­
сти ионообменников. Для восстановления первоначальных характеристик
высокоосновных смол исследователи ищут пути удаления из них органи­
ческих веществ. Однако полностью восстановить емкость не удается.
Важной задачей при обессоливании воды является удаление H Si03~ионов. При длительной эксплуатации высокоосновных анионитов типа
АВ-17-8 эффективность обескремнивания воды снижается [362]. И это
несмотря на то, что вода, поступающая в ФСД, как правило, незначитель­
но загрязнена примесями.
Исследованы свежий анионит АВ-17-8 и образцы, работавшие в
промышленном ФСД один и три года. Глубокая регенерация проведена
из расчета 100 об/об 1 моль/дм раствора NaOH, частичная - 5 об/об, что
соответствует расходу 200 кг/м3 набухшего анионита.
Оказалось, что уже в течение первого года эксплуатации анионит
АВ-17-8 утрачивает свои первоначальные кинетические характеристики
(рис. 4.20). Причем в большей степени ухудшение кинетических свойств
проявляется при сорбции кремниевой кислоты - в очень важном процес­
се, который завершает глубокое обессоливание воды, прошедшей пред­
варительную подготовку и деминерализацию на первой ступени.
Кинетические свойства анионита АВ-17-8 оценивали по времени
установления равновесия в реакциях основной формы анионита с НС1 и
H2S i0 3. В первой системе момент установления равновесия определяли
по электропроводности раствора, во второй - аналитическим определе­
нием содержания H S i0 3-HOHOB в растворе.
Необходимые для расчета кинетического коэффициента концен­
трационные константы обмена найдены из изотерм сорбции хлорид- и
силикат-ионов (рис. 4.20-4.21).
Химизм процессов образования красящих веществ
203
4.9. Физико-химические свойства анионита АВ-17-8
Расход раство­
ра NaOH на
регенерацию,
об/об
Время экс­
плуатации
100
100
100
5
5
5
0
0
0
Свежий
1 год
3 года
Свежий
1 год
3 года
Свежий
1 год
3 года
Удельный объ­
Абсолютная
ем набухшего
набухаемость,
ионита,
см3/г
см3/г
1,42
2,18
2,14
1,29
2,04
1,13
1,95
1,17
1,86
0,98
0,86
1,76
0,84
1,65
1,60
0,73
1,53
0,65
Влагоемкость,
г Н20 /г
1,40
1,38
1,27
1,12
1,09
0,95
0,80
0,75
0,68
Константы рассчитывали в пределах наиболее вероятных концен­
траций примесей по уравнению [363]:
а
ф
где К —концентрационная константа обмена; а —S/So ~ содержание насы­
щающих ионов в ионите при равновесных долях от полной обменной емкости;
Ф = С/Со ~ концентрация насыщающих ионов в растворе при равновесии в долях
от начальной концентрации. Значения К приведены в табл. 4.10.
Рис. 4.20. Кинетические кривые сорбции анионитом АВ-17-8 HSiO~3 (а)
и Cl-ионов (б) товарным ( /) , после года (2) и трех лет ( i)
эксплуатации
Как видно из данных табл. 4.10, важнейшая характеристика ионита концентрационная константа обмена ОН- ионов на С Г - и H SiO '3-ионы,
уменьшается при увеличении времени его эксплуатации.
204
Глава 4
4.10. Концентрационные константы обмена ионов на анионите
АВ-17-8
Реакция
R-OH + HCI
R-OH + NaCl
R-OH + H2S i0 3
Длительность эксплуатации образца
свежий
3 года
1 год
8,4
5,7
3,8
3,5
2,8
3,7
2,6
1,5
1,2
Значения коэффициентов массопереноса Р найдены по уравнению
[364]:
с использованием значений К, вычисленных из изотерм сорбции. С уве­
личением длительности эксплуатации товарного анионита до 1 и 3 лет
установлено снижение кинетического коэффициента р от 0,65 до 0,35 и
0,31 с-1 соответственно. Этим объясняется изменение формы выходной
кривой сорбции ионов H Si03~ работавшим анионитом (рис. 4.21, кривая 2).
Таким образом, при длительном использовании анионита АВ-17-8
для обессоливания даже малозагрязненной гумусовыми кислотами воды
происходят значительные изменения его физико-химических и техноло­
гических свойств.
Рис. 4.21. Выходные кривые сорбции кремниевой кислоты анионитом
АВ-17-8 товарным ( / ) и работавшим 3 года (2)
В вышеописанных экспериментах исследовалось влияние на анионит
потока воды при незначительном присутствии окрашенных органических
веществ. По его итогам стала ясной необходимость проведения экспери­
ментов с заведомо большим количеством органических примесей в воде.
Химизм процессов образования красящих веществ
205
4.3.3. Исследование влияния ГК и ФК на физико­
химические свойства анионита АВ-17-8
Проведено 15 циклов сорбции-десорбции гумата натрия анионитом
АВ-17-8. Его обменная емкость по НС1, NaCl и H2Si 03 представлена в
табл. 4.11, из данных которой видно, что емкость анионита по мине­
ральным ионам практически не изменилась. Однако емкость поглоще­
ния гуматов анионитом в следующих циклах сорбции, как оказалось,
заметно снизилась.
На наш взгляд, снижения обменной емкости анионита не произош­
ло потому, что большие молекулы гумата натрия в силу стерических
причин заняли поверхностные слои зерна анионита, что не явилось пре­
пятствием для диффузии минеральных ионов меньшего размера в ионит.
4.11. Обменная емкость анионита АВ-17-8 по минеральным ионам
после 15 циклов сорбции-десорбции гумата натрия
Емкость (±0,03), мг-экв/см' анионита
по НС1
по NaCl
по HjSiOj
0,54
1,14
0,79
0,54
1,18
0,84
0,54
1,18
0,80
0,74
0,56
1,16
Образец анионита
Исходный
После 5 циклов
После 10 циклов
После 15 циклов
CJfcOH, м м оль/дм 3
5
15
55
V, об/об
Рис. 4.22. Изменение концентрации NaOH в воде при отмывке анионита
АВ-17-8 товарного ( /), насыщенного гуминовыми (3) и
фульвокислотами (2)
206
Глава 4
Но при незначительном загрязнении анионита фульвокислотами
(а
= 11,7 мг/см3) значительно ухудшился процесс его отмывки от щелочи
(рис. 4.22). Расход воды увеличился в 5 раз. Такого явления не наблюда­
ется при насыщении смолы гуминовыми кислотами. Это объясняется ря­
дом причин: ГК имеют в 2-3 раза меньшее количество функциональных
групп, чем ФК; большие молекулы ГК адсорбируются в меньшей степени
в связи со стерическими затруднениями. Содержание карбоксильных
групп в ФК различно. Так, выделенные нами ФК из воды Невы, Усманки
(Воронежская обл.) и озера Юлемисте (Таллинн), которыми «отравляли»
анионит, имели емкость связывания КОН от 5,5 до 8,8 мг-экв/г [132]. За­
крепившись на матрице ионита, молекулы ФК выступают в качестве но­
сителей функциональных групп (СООН), которые превращают анионит в
амфолит. При регенерации последнего растворами NaOH удерживаемые
анионитом ФК замещают свои Н-ионы ионами натрия. Соль сильного
основания и слабой кислоты гидролизуется:
NHr-R-COONa + Н20
-
NHy-R-COOH + Na+ + ОН"
с образованием ОН-ионов. Поэтому промывная вода имеет сильноще­
лочную реакцию. Очевидно, отмывка заканчивается тогда, когда мед­
ленно идущий процесс гидролиза фульвата натрия завершится. Из дан­
ных рис. 4.22 следует, что в присутствии в анионите фульвокислот рас­
ход воды на отмывку возрастает с 20 до 100-120 об/об анионита.
Представлялось интересным оценить не только равновесные, но и
кинетические свойства анионитов, на которые воздействовали различные
внешние факторы в течение длительного времени. Необходимость объ­
ективной оценки вытекает из результатов визуального сопоставления
формы выходных кривых сорбции Н$10з-ионов работавшим и свежим
образцами анионита (рис. 4.21). Как и в случае катионита, отравленного
гумусовыми кислотами, налицо появление внутридиффузионного эле­
мента кинетики сорбции хлорид-ионов, которое мы прослеживали при
неполной регенерации анионообменника от С Г-ионов [365] или при
сорбции большого органического иона, например, триптофана [366].
По выходной кривой сорбции можно провести оценку как величи­
ны кинетического коэффициента массопереноса, так и соотношения
вкладов внутри- и внешнедиффузионного этапов процесса обмена ио­
нов. Такие данные нами были получены [367-369] при использовании
асимптотического уравнения динамики сорбции, предложенного в [370]
для случая смешанно-диффузионной кинетики ионного обмена:
W = ------— --------- - ^ 4 г ф ( 0 , т 1 , F ) ,
(1 + 0 )С О
1 2D
где W - объем раствора, очищенного до заданного проскока иона-примеси в
фильтрат; Е — полная обменная емкость колонки; Со — концентрация ионапримеси в раст воре; U —скорость потока (см1-с~'); D - коэффициент диффу-
Химизм процессов образования красящих веществ
207
зии вещества в зерне ионита; F=C/C q — концентрационное отношение (С текущая концентрация адсорбтива в фильтрате); щ —доля удаляемого компо­
нента в системе; т| = 4KJBi[l +(K—l)n<J —критерий подобия по совокупности
определяющих параметров процесса; <р - функция, определяемая системой од­
нопараметрических уравнений:
ф (0 ,Л ,/г) = 1п
Г
f
е
\+ц
/о -/)
1+ 0(1 - / )
,
0 < { < 1,
где f —степень отработанности поверхности зерен ионита для сечения колон­
ки х, где х —расстояние от входа в слой ионита; Bi —критерий, показывающий
соотношение вкладов внутренней и внешней диффузии в кинетику обмена;
0 = (К-1)п0 - критерий подобия, характеризующий крутизну приведенной изо­
термы обмена.
Функция W = f(q>), в соответствии с [370], описывает выходную
кривую сорбции в системе, включающей высокоионизированный ионит
в моноионной форме и раствор произвольной концентрации, содержа­
щий любую комбинацию равнозарядных противоионов, подлежащих
удалению. Концентрация наименее сорбируемого иона в данном случае
приравнивается к общей концентрации (Со). Если изучаемая система
однокомпонентна (no = 1), то 0 = К - 1; ц = 4/Bi; fV„cn = Е/Со, тогда эта
функция принимает вид;
и является уравнением прямой в координатах й^эксп - ср. Следовательно,
величина Е/Со - отрезок, отсекаемый на оси ординат данной прямой.
Графическое построение выходной кривой в координатах W1KCtl - <р позво­
ляет определить полную обменную емкость колонки, не проводя с этой
целью предварительных независимых экспериментов в статических или
динамических условиях: значение Е = fV0Co, где fV0= Wwc„ при ф = 0.
В уравнения функции W = Дер) через параметр г] входит искомый
диффузионный критерий Bi, который определяют путем графических по­
строений выходной кривой в координатах W,KCn- ср. Принцип определения
величины критерия Bi, соответствующего данному режиму сорбционного
процесса, заключается в нахождении его единственного значения, при
котором выполняется условие линейной зависимости
- (р. В данном
случае это перебор вариантов, когда критерий Bi задается произвольно,
сообразуясь с внешними параметрами процесса и формой выходной кри­
вой. Величина Bi определяется преобладающим механизмом кинетики.
208
Глава 4
С помощью асимптотического уравнения динамики сорбции по ме­
тодике [369, 371] рассчитаны коэффициенты внутренней диффузии
С 1-ионов, определены диффузионные критерии Bi и кинетические ко­
эффициенты Р для разных образцов анионита АВ-17-8: свежего (1) и
бывших в эксплуатации: в фильтре смешанного действия в установке
глубокого обессоливания воды после одного (2) и трех (3) лет эксплуа­
тации; из фильтра второй ступени обессоливания воды (4); из фильтра
смешанного действия в установке с электродиализным опреснением и
предварительной подготовкой воды путем сорбции органических ве­
ществ пористым сорбентом (5), а также для использованного в лабора­
торных условиях при очистке водных фульвокислот от минеральных
примесей в течение двух (6), четырех (7) и шести (8) месяцев (табл. 4.12).
4.12. Кинетические характеристики образцов анионита АВ-17-8
№
образца
U, м/ч
Bi
Р-103
1
2
3
4
14,6
14,8
15,9
15,6
1
1
1
5
1,1
1,3
1,3
1,2
№
D 107,
U, м/ч
C m V образца
6,2
6,2
6,2
1,1
5
6
7
8
15,4
15,0
15,1
15,0
Bi
Р-103
D 107,
см2-с_1
3
2
4
5
1,2
1,3
1,3
1,3
2,0
3,7
1,8
1,3
Очевидно, значительное насыщение анионита фульвокислотами
приводит к увеличению вклада внутридиффузионного фактора в кине­
тику ионного обмена в реакциях поглощения СГ-ионов из растворов
НС1, о чем свидетельствует не только возрастание критерия В i от 1 до 5,
но и уменьшение значения коэффициента диффузии хлорид-ионов с
6,210 до 1,11 (Г7 см2/с. При этом внешнедиффузионный коэффициент
Р не изменяется.
4.4. И зм енение ф изико-химических свойств
ионообменных м ембран при взаим одействии
с ф ульвокислотам и
Вода, подаваемая на электродиализ, подвергается специальной
подготовке. Ее необходимость связывают с тем, что многие вещества,
для которых мембраны непроницаемы, осаждаются в камерах аппара­
тов. При подсчете себестоимости воды оказалось, что затраты на элек­
троэнергию составляют 32,6%; химические реагенты - 2,9%; на замену
мембран и патронов в фильтрах - 26%, ежедневное обслуживание 28,7%, обслуживание по замене мембран - 9,7%. Таким образом, более
трети расходов приходится на эксплуатацию собственно мембран [372].
Так как обессоливаемая вода содержит разные группы веществ,
изменение электрохимических свойств ионообменных мембран проис-
Химизм процессов образования красящих веществ
209
ходит под действием целого комплекса факторов. В связи с этим пред­
ставляет интерес исследование влияния собственно ФК на электрохи­
мические характеристики анионообменных мембран.
В данной работе использовали электродиализный аппарат периоди­
ческого действия с чередующимися мембранами МК-40 и МА-40 с рас­
стоянием между ними 3 см. Приэле.ктродные камеры (первую и пятую)
заполняли растворами соответственно 0,1 моль/дм3 КОН и 0,05 моль/дм
KN03; вторую - 1 моль/дм3 K N 03; третью - дистиллированной водой;
четвертую - раствором ФК, который постоянно перемешивали [373].
Электродиализ раствора с содержанием 72 ммоль/дм3 NaCl и 1,5 мг/см3
ФК проводили в гальваностатическом режиме в течение 60-90 мин при
плотности тока / = 10 мА/см .
В дилюате определяли содержание ионов натрия и хлорид-ионов.
Уже через 60 мин концентрация NaCl с 72 ммоль/дм3 снижалась до 8 ,0 8,3 ммоль/дм3. Однако со временем проявилась тенденция замедления
процесса обессоливания и возрастания остаточного содержания соли в
растворе при той же продолжительности электродиализа. Например, через
14 и 24 циклов работы ячейки оно повысилось до 10,1 и 13,2 ммоль/дм3.
Для определения чисел переноса противоионов в мембране прове­
ден электродиализ чистого 0,1 моль/дм3 раствора NaCl с мембранами
исходной и бывшей в эксплуатации в течение 10 ч при / = 6,7 мА/см2
(рис. 4.23).
Представлены данные, свидетельствующие о том, что за равные
промежутки времени при одних и тех же условиях массоперенос хло­
рид-ионов через мембрану МА-40, поглотившую некоторое количество
ФК за 10 ч работы, уменьшилось. Число переноса (71) снизилось с 0,83
до 0,68. При этом электропроводность ( х ) мембраны МА-40 уменьши­
лась с 22,7-10' 3 до 5,5-10-3 Ом-1-см'1. В отсутствие других примесей из­
менение электрохимических свойств мембраны несомненно вызвано
только наличием в ней фульвокислот.
Исследования поперечного среза мембраны под микроскопом по­
казали, что ФК проникли практически на всю ее глубину, она приобрела
характерную коричнево-бурую окраску, присущую фульвокислотам.
На ИК-спектре работавшего образца появились новые полосы поглоще­
ния, отсутствующие в ИК-спектре исходной мембраны, но имеющиеся в
спектре поглощения ФК (рис. 4.24). Полосы поглощения в области
ЗОЮ, 1600,1510,1455,970-700 см"1 - соответствуют бензольным коль­
цам с разной степенью замещения; 2907,2855,1440,1370 см' 1- метильно-метиленовым группам; 3400, 1640, 1533 см"' - азотсодержащим
группам; 1200 - ОН-группам фенолов и др.
Глава 4
210
Рис. 4.23. Изменение концентрации С 1-ионов в дилюате при электро­
диализе раствора 0,1 моль/дм3 NaCl с исходной мембраной
МА-40 (/); после контакта с раствором ФК в течение 10 ч (2);
комбинированной с ультрафильтрационной мембраной
У A M -100(3)
Следует особо отметить, что ФК в растворе были в протонированном (СООН) состоянии, о чем свидетельствовала интенсивная полоса
поглощения карбоксильных групп при 1715 см-1. В мембране же они
находятся в виде карбоксилат-иона (СОСГ): появились полосы погло­
щения при 1590 и 1400 см-1. В связи с этим можно предположить, что
анионитом ЭДЭ-10П, который входит в состав мембраны М А-40, ФК
сорбированы по ионообменному механизму. Такая возможность вполне
реализуема в связи с тем, что использованные в работе фульвокислоты
характеризуются величиной рКа = 4,35, что говорит о достаточной сте­
пени ионизации последних в нейтральных растворах.
Так как анионит ЭДЭ-10П содержит не только низкоосновные, но
и высокоосновные функциональные группы, вероятно, именно они уча­
ствуют в реакции обмена:
R-OH + ФК" - — ■■ R-Ф К + ОНГ.
Для оценки возможной степени заполнения F мембраны М А-40
фульвокислотами и влияния F на значения чисел переноса получена
изотерма сорбции ФК с последующим измерением Т _ образцов мем­
браны. Величину F рассчитывали как отношение количества поглощен­
ных ФК (а) к полной обменной емкости анионита ЭДЭ-10П по мине­
ральным ионам. При расчете F исходили из того, что эквивалентная
масса ФК, найденная нами, равна 130. Дня определения величины а об­
разцы мембраны площадью 37,8 см2 помещали в растворы ФК с концен­
трацией 4 0 -3 0 0 мг/дм3 и в течение 19 сут. выдерживали при комнатной
211
Химизм процессов образования красящих веществ
температуре (20-22 °С). Величину сорбции фульвокислот (а) рассчиты­
вали по изменению концентрации ФК в растворе. Изотерма сорбции
(рис. 4.25) в координатах а - Сримеет выпуклый характер, что говорит о
селективности анионита ЭДЭ-10П в отношении ФК.
v , см
Рис. 4.24. ИК-спектры поглощения мембраны МА-40 исходной (/),
после контакта с фульвокислотами в течение трех часов (2) и
суток (5)
Ис> 4.25. Изотерма сорбции фульвокислот мембраной МА-40 (а)
и зависимость чисел переноса ионов СГ от степени ее
насыщения ФК (б)
Глава 4
212
Изотерма аппроксимируется уравнением Ленгмюра. Найдена мак­
симальная сорбция ФК: Кг~ 19,8 мг/г. Эти данные близки к данным для
зернистого анионита: при равновесной концентрации ФК 100 мг/дм3
поглощено 33,1 мг/г ФК, в то время как мембраной (с учетом содержа­
ния в ней 45% полиэтилена) в тех же условиях - 30,2 мг/г [373].
Измерена также электропроводность мембраны при разной степени
насыщения ее фульвокислотами. Видно (рис. 4.27, б), что число перено­
са F ионов СГ уменьшается линейно с увеличением сорбции фульвокислот мембраной.
Вода, подаваемая в электродиализные аппараты, может иметь раз­
ные значения pH в зависимости от технологии ее предварительной под­
готовки. Так, при pH исходной природной воды 6,5-7,5 после Н-катионирования значение pH снижается до 3-4; при Na-катионировании pH > 8.
В связи с этим определены величины а, Т и х для образцов мембраны
МА-40 после контакта с растворами ФК (С = 100±5 мг/дм3) в течение
19 сут. при pH 1-И0. Результаты этих исследований (табл. 4.13) показы­
вают, что даже наименьшая зафиксированная величина сорбции ФК со­
ставляет тем не менее ~ 25% от максимальной, рассчитанной по уравне­
нию Ленгмюра (19,8 мг/г).
Это значит, что корректировкой pH нельзя полностью устранить
явление отравления мембраны ФК при электродиализе гумуссодержа­
щих растворов. Выход по току (ri) и электропроводность мембраны из­
меняются обратно пропорционально по отношению к содержанию в ней
ФК. При увеличении сорбции ФК мембраной до ~ 10 мг/г выход по току
уменьшается всего на 7%, однако электропроводность мембраны падает
при этом более чем вдвое.
4.13. Электрохимические свойства мембраны МА-40 после
контакта с растворами фульвокислот
PH раствора
фульвокислот
а, мг/г
ЛЮ~2,
мг-экв/г
/
а*
1,1
3,5
6,2
7,3
10,4
- 7 ( раствор NaCl)
7,1
8,83
9,79
9,16
4,79
0
5,89
6,36
7,47
6,99
3,65
0
0,91
0,89
0,87
0,90
et
0,94
х -ю -3,
Ом- | см-1
9,41
6,50
4,92
9,84
22,7
Таким образом, присутствие ФК в мембране даже в небольшом коли­
честве ухудшает ее электрохимические характеристики. Уменьшение элек­
тропроводности мембраны обусловлено не столько блокировкой функцио-
Химизм процессов образования красящих веществ
213
напьных групп анионита, но, как оказалось, заменой подвижного мине­
рального противоиона малоподвижным анионом ФК. Снижение чисел пе­
реноса хлорид-ионов можно объяснить не только этой причиной, но также
падением величины х мембраны и уменьшением ее влагосодержания.
Восстановление электрохимических свойств мембран. Для
удовлетворительного функционирования аппаратов мембраны периоди­
чески промывают раствором лимонной кислоты (для снятия карбонат­
ных и сульфатных отложений), обрабатывают щавелевой кислотой с
целью удаления гидроксидов железа, а для предотвращения и снятия
биологических обрастаний эффективен гипохлорит натрия [374].
Нами сделана попытка восстановления утраченных вследствие от­
равления фульвокислотами физико-химических параметров мембраны
МА-40 химической регенерацией. Образцы площадью 4 см2 помещали на
12 сут. в растворы, применяющиеся для восстановления обменной емко­
сти зернистых анионитов или извлечения гумусовых веществ из почв и
торфов. Результаты измерения величины х представлены в табл. 4.14.
4.14. Электропроводность мембраны МА-40, насыщенной
фульвокислотами, после химической регенерации
Реагент
2% КОН
10%NaCl
3%Na4P20 7
l% Na2C03
2% КОН в 5% NaCl
1% КОН в 2% Н20 2
Х-103,
5,5
5,5
5,5
5,5
10,8
5,6
Реагент
10%NaCl в С2Н5ОН (1:1)
3,5% НС1
3,5% НС1 в 2% Н20 2
2% КОН в 5% NaCl и С2Н5ОН
2% КОН в С2Н5ОН (1:1)
Х -103,
O ivT ' cm -1
9,7
5,5
5,5
15,4
5,5
Эти данные показывают, что к заметному увеличению электропро­
водности мембраны приводит только ее обработка солещелочным рас­
твором, причем этанол углубляет десорбцию ФК. Тем не менее, исход­
ная величина х товарного образца (22,7-10-3 Ом" -см-1) не достигается,
что позволяет сделать вывод о необратимой сорбции некоторого коли­
чества фульвокислот анионообменной мембраной МА-40.
В связи с этим очевидна предпочтительность глубокого удаления
из воды гумусовых кислот, а не поиск путей восстановления утерянных
ионитами первоначальных физико-химических и электрохимических
свойств.
Таким образом, факт ухудшения физико-химических характери­
стик катионитов и анионитов установлен не только при исследовании
работавших смол, но и моделировался с использованием выделенных из
214
Глава 4
природных вод гуминовых и фульвокислот. Установлено, что при не­
значительном присутствии ГК и ФК в ионитах их обменная емкость не
изменяется, однако возрастает расход воды на послерегенерационную
отмывку как катионита, так и анионита.
При наличии в анионите фульвокислот уменьшается коэффициент
внутренней диффузии минеральных ионов и возрастает вклад внутридиффузионной стадии массопереноса, что является причиной ухудше­
ния кинетических свойств ионообменника, и как следствие - снижения
его рабочей обменной емкости.
Показано, что не простая блокировка функциональных групп
анионита фульвокислотами, а замена минеральных анионов на мало­
подвижные анионы ФК снижает электрохимические характеристики
мембраны - электропроводность и числа переноса, что уменьшает вы­
ход по току.
Заключение
Меланоидины - продукты химических превращений растительного
сырья (аминокислот, белков, углеводов, полифенолов) в процессах техно­
логической переработки и биогенеза. В первом случае имеет место ин­
тенсивное воздействие температурного фактора, pH среды. Во втором
случае образование пигментов происходит под воздействием различных
природных факторов. Рассматривая химическое строение меланоидинов,
следует обратиться к данным о химическом составе главных сахаропро­
изводящих растений: сахарной свеклы и сахарного тростника.
К сожалению, химический состав этих растений, выращиваемых миллио­
нами тонн, в настоящее время изучен не полностью. Это не исключение,
так как пищевые и лекарственные растения в большинстве случаев рас­
сматривают с точки зрения целевого (основного) пищевого компонента.
Сахарный тростник и сахарную свеклу ценят, прежде всего, за саха­
розу, в последнее время привлекают пектиновые вещества, а на все дру­
гие вещества обращают меньше внимания. И это при том, что в сахарной
свекле найдено около шестидесяти физиологически активных веществ, не
намного меньше их и в сахарном тростнике. В обоих растениях (Содер­
жится большой набор аминокислот: тирозин, фенилаланин, ДОФА, гис­
тидин, бетаин, глутамин, лейцин, изолейцин, лизин и др. (от 5 до 10% от
массы свеклы). Особо следует отметить присутствие в сахаросодержащих
растениях пуриновых оснований, аденина, гуанина, гипоксантина. В са­
харной свекле содержатся сапонины (в их состав входят гликозиды олеоноловой кислоты, а также остаток глюкуроновой кислоты), которые пред­
ставляют серьезную экологическую опасность для биоты водоемов, но в
то же время обладают (подобно женьшеню и другим аралиевым) тонизи­
рующим, адаптогенным действием. Заслуживает внимания присутствие в
сахарной свекле и тростнике инозитгексафосфорной (фитиновой) кисло­
ты, магниево-кальциевые соли которой (под названием «фитины») ис­
пользуют в качестве медицинского препарата с широким спектром ле­
чебного и профилактического действия. Большое место в составе неса­
харной части свеклы занимают адипиновая, гликолевая, глутаровая, ли­
монная, щавелевая, яблочная, янтарная, гидрокофейная, оксикаприловая
кислоты. В сахарном тростнике и свекле присутствуют в достаточном
количестве витамин С и витамины группы В. Таким образом, химический
состав сахаропродуцирующих растений свидетельствует об отсутствии
сильнодействующих и ядовитых веществ, которые могли бы представ­
лять опасность для человеческого организма.
Выделение сахарозы из свеклы и тростника сопровождается обра­
зованием патоки (мелассы), в состав которой входят аминокислоты, аденозин, пурины, пиримидины, ацетилпиррол. Сложный состав патоки,
216
обусловленный наличием природных физиологически активных ве­
ществ, содержащихся в исходном сырье и образующихся в процессе
технологической обработки, позволяет разделить мелассу (в зависимости
от содержания ФАВ) на «белую» (29% несахаров); «зеленую» (33%);
«бурую» (47%) и «кормовую» (56% несахаров).
Цветность мелассы определяется несколькими группами веществ,
между которыми иногда трудно провести четкие границы: 1) карамели и
продукты щелочного распада инвертного сахара; 2) меланины и фе­
нольные соединения с ионами железа; 3) меланоидины.
Продукты щелочного распада инвертного сахара - это продукты
разложения сахарозы под действием оснований и высоких температур.
Близкие к ним по многим свойствам карамели также образуются из са­
харозы, но в отсутствие щелочей. Обе эти группы пигментов не содер­
жат аминогрупп.
Меланины - полимеры с высокой молекулярной массой, состоящие
из отдельных звеньев типа хинонов и аминокислотных фрагментов. Ме­
ланины и другие полифенолы в процессе выделения сахарозы из свеклы
образуют сильно окрашенные комплексы с ионами железа.
Меланоидины - азотосодержащие соединения, образующиеся при
поликонденсации углеводов с пептидами и аминокислотами (в том числе
ароматическими). Этот химический процесс, называемый реакцией Майяра, приводит к образованию окрашенных полимеров, содержащих кисло­
родные и азотные гетероциклы (главным образом фуран и пиррол). У мо­
лекул полимерных меланоидинов сахарного производства линейное
строение. Входящие в их состав фурановые и пиррольные гетероциклы
снабжены боковыми фрагментами из остатков аминокислот и углеводов.
Это позволяет меланоидинам существовать в виде катионов, биполярных
ионов и анионов в зависимости от pH среды. Меланоидины - сложная
смесь веществ с молекулярной массой от 700 до 50000 и более.
Меласса свеклосахарного и тростникового производств служит од­
ним из исходных компонентов при получении аминокислот, гидроксикислот, нуклеиновых кислот, дрожжей. Различные технологические и
биохимические режимы синтеза этих ФАВ сопровождаются образова­
нием новых групп пигментов, относящихся к меланоидинам, и модифи­
кацией исходных меланоидинов мелассы. Появляются в пигментах
в достаточных количествах негидролизируемые компоненты, близкие
по структуре к фульвокислотам, а также полифенольные фрагменты,
напоминающие меланины. Таким образом, между меланоидинами, ме­
ланинами, фульвокислотами весьма трудно провести четкие границы.
Последнее явление характерно также при рассмотрении процессов
гумификации растительного сырья в почвах и в процессах хлебопече­
ния, копчения, жарения пищевых продуктов. И это несмотря на то, что
исходные органические компоненты при гумификации в природе и при
Заключение
217
меланоидинообразовании в процессе технологической переработки бел ­
ков, углеводов, жиров не всегда идентичны.
По своему молекулярному строению гуминовые кислоты почв (а так­
же торфа, сапропеля, бурых углей, горючих сланцев, асфальтов) напоми­
нают пигменты, относящиеся к меланоидинам, образующимся при жаре­
нии мяса, копчении рыбы и мяса, в хлебопечении, при термообработке чая
и зерен кофе, в процессах, испытывающих дефицит влаги. Это свидетель­
ствует об общем генезисе при гумификации растений и при меланоидино­
образовании в различных технологических процессах. Следует также под­
черкнуть общность функций (регуляторной, протекторной, транспортной,
аккумулятивной, физиологической) для гуминовых кислот и меланоидинов
пищевых, микробиологических и фармацевтических производств.
Прямые эксперименты подтвердили, что в процессах выделения,
очистки пищевых продуктов и при гумификации растительных остатков
в природе имеют место процессы модификации пигментов. При этом
возможен не только синтез полимеров с большей молекулярной массой,
но и образование окрашенных веществ с меньшими молекулярными
массами. В технологических процессах идут аналогичные процессы при
взаимодействии меланоидинов с обесцвечивающими ионообменниками.
Список сокращений и обозначений
АК - аминокислота
БХ - хроматография на бумаге
ВЭФ - высоковольтный электрофорез на бумаге
ГПХ - гельпроникающая хроматография
ГК - гуминовые кислоты
ДОФА - 3,4-дигидроксифенил-Ь-апанин
ДМ СО - диметилсульфоксид
ИК - инфракрасный
ИОХ - ионообменная хроматография
ПЩ Р - продукты щелочного распада инвертного сахара
ТСХ - тонкослойная хроматография
УФ - ультрафиолетовый
ФК - фульвокислоты
ЯМ Р - ядерный магнитный резонанс
а - мольная доля индивидуальных компонентов
в равновесных условиях
А - относительная оптическая плотность в ИК-спектрах, %
D - коэффициент распределения
D - оптическая плотность в УФ-спектрах
D - коэффициент диффузии вещества в зерне ионита
g - величина поглощения сорбата массой сорбента, мг/г
Е - емкость ионообменной смолы по сорбируемому иону, мг-экв/г
X —длина волны, нм
Rf - коэффициент относительного удерживания в ТСХ
Т - коэффициент пропускания в ИК-спектрах, %
VR- объем удерживания (элюционный объем), мкп
W - объем раствора, очищенного до заданного проскока иона в
фильтрат
Литература
1. Сапронов А.Р., Колчева Р.А. Красящие вещества и их влияние на
качество сахара. - М.: Пищевая пром-ть, 1975.
2. Maillard M.L.G. Action des acids amines sur les sucres, formation des
melanoidines par voie methodique // Academie Compte rendu des
Scienst. - 1912.- V . 154. - 1912. - V. 155.
3. Maillard M.L.G. Formation de matieres humigues par action de polipeptides sur sucres // C. R. Acad. Sci. - 1913. - V. 156.
4. Maillard M.L.G. Synthese des matieres mimiques par action des acides
amines sur les sucres reducteurs // Annales de Chemie. - 1916. - V. 5.
5. Швядас B.K., Галаев И.Ю. Ферментативное превращение рацема­
тов в энантиомеры аминокислот // Успехи химии. - 1983. - Т. 52. № 12.
6. Толстогузов В.Б. Искусственные продукты питания. Новый путь
получения пищи и его перспективы. Научные основы производст­
ва. - М.: Наука, 1978.
7. Тюряев И.Я., Помиленко Р.И. Состояние и перспективы промыш­
ленного производства аминокислот химическими методами // Раз­
работка промышленных процессов получения аминокислот хими­
ческими методами. - Л., 1979.
8. Апсите А.Ф., Межиня Г.Р., Осе В.П. Продуценты L-лизина из рода
Brevibacterium // Атлас морфологических исследований. - Рига:
Зинатне, 1978.
9. Дебабов В.Г. Новые подходы к селекции высокопродуктивных
штаммов - продуцентов аминокислот // Микробиологический и эн­
зиматический синтез аминокислот. - Пущино, 1980.
10. Рубан Е.Л., Вербина Н.Н., Бутенко С.А. Биосинтез аминокислот
микроорганизмами. - М.: Наука, 1968.
11. Сафонова Э.М., Беликов В.М. Успехи в области синтеза и произ­
водства L-аминокислот // Успехи химии. - 1974. - Т. 43. - № 9.
12. Goldnik A., Gajewska М. Wyodrebnianie L-aminokwasow z hydrolizatu
bialka z odpadow skor bydlecych // Acta pol. Pharm. - 1983. - V. 40. № 3.
13. Davankov V.A., Zolotarev Yu.A., Kurdanov A.A. Ligand-exchange
chromatography of racemates. XI. Complete resolution of some chelat­
ing racemic compounds and nature of sorption enantioselectivity //
Liquid Chromatogr. - 1979. - V. 2. - № 8.
14. Стручалина Т.И., Абдразакова H.B., Куткина О.П. и др. Примене­
ние ионообменных смол при переработке вторичных отходов свек­
лосахарного производства // Теория и практика сорбционных про­
цессов. —Воронеж: ВГУ, 1986. - № 18.
220
15. Попова В.А., Гордиенко С.В., Островский Д.И. Влияние pH на эф­
фективность очистки автолизата дрожжей на ионообменных смо­
лах // Теория и практика сорбционных процессов. - Воронеж: ВГУ,
1985. -№ 17.
16. Зубкова Е.И., Муромцева Г.В., Тонконог Л.Г., Корниенко А.В. Из­
менение состава белкового гидролизата при обработке макропорис­
тым катионитом // Изв. вузов. Пищевая технология. - 1978. —№ 1.
17. Гребешова Р.Н. Ферментные препараты, выпускаемые микробиоло­
гической промышленностью, и их применение. - М., 1977.
18. Паулина Я.Б., Марх А.Т. Продукты меланоидинообразования в
сгущенном молоке с сахаром // Изв. вузов. Пищевая технология. —
1979. -№ 1.
19. Hodge J.E. The amadori rearrangement // Advances in Carbohydrate
Chemistry. - 1955.-№ 10.
20. Забродский А.Г., Витковская B.A. Кинетика сахаро-аминной реак­
ции // Тр. Киевского филиала Всесоюзн. НИИ спиртовой пром-сти. 1958.-№ 4.
21. Пономарева А.М. Реакция меланоидинообразования и ее роль в
процессе приготовления хлеба // Прикл. биохимия и микробиоло­
гия. - 1965.-Т . 1. —№ 5.
22. Машковцев М.Ф. Влияние количества воды на течение реакции
между аминокислотами и редуцирующими сахарами // Биохимия. 1951.-Т . 16.- № 6.
23. Смирнов В.А., Гейспиц К.А. Об образовании меланоидинов // Био­
химия. - 1956. - Т. 21. - № 6.
24. Технология сахара / Под ред. П.М. Силина. - М.: Пищепромиздат,
1958.
25. Кретович B.JL, Токарева P.P. Взаимодействие аминокислот и сахаров
при повышенных температурах // Биохимия. - 1948. - Т. 13. -№ 6.
26. Сотская В.П., Смирнов В.А. Значение образования оксиметилфурфурола и меланоидинов в разложении сахарозы // Изв. ВУЗов. Пи­
щевая технология. - 1961. - № 3.
27. Petershofer G. Formation de colarants // Cucrerie Beige. - 1969. - № 9.
28. Gruszecka H. Spektrofotometry w laboratorium cukrowniczym // Gazeta Cukrovamicza. - 1967. -№ 6.
29. Gottschalk A. Interaction between simple sugars and aminoacids // Na­
ture. - 1950. - V. 165. - № 4200.
30. Gottschalk A., Partridge S.M. The interaction between simple sugars
and aminoacids // The Biochemical Journal. - 1950. - V. 46. - № 2.
31. Valter V. Vlastnosti barviv vznikajicich pri vyrobe cukru // Listy cukrovamicre. - 1966. -№ 1.
32. Hodge J.E. Chemistry of browning reactions in model systems // Agri­
cultural and Food Chemistry. - 1953. - V. 1. - № 15.
Литература
221
33. Me Weeny D.J., Burton H.S. Some possible glucose/glycine browning
intermediates and their reactions with sulphited // J. of the Science of
food and agriculture. - 1963. - V. 14. - № 5.
34. Griffith Т., Jonson J.A. Relation of the browning reaction to storage
stability of sugar cookies // Cereal Chemistry. - 1957. - V. 34. - № 3.
35. Euler H.V., Hasselquist H. Reductone Sammlung chemischer und chemisch technischer Vortrage. - Stuttgart: F. Funke, 1950.
36. Euler H.V., Brunius E. Uber Reactionen zwischen Zuckerarten und
Aminen // Chemische Berichte. - 1926. - V. 59.
37. Stadtman F.H., Chichester C.O., McKinney G. Carbon Dioxide produc­
tion in the browning reaction // American Chemical Society. - 1952. V. 74. - № 12.
38. Prey V., Hammer E., Braunsteiner W. Farbstoffe und Farbstoffbildung in
der Zuckerfabrikation // Zeitschrift fur die Zuckerindustrie. - 1965. - № 7.
39. Carruthers B.A., Dutton J.V., Oldfield J.F.T. Chromogenic reducing sub­
stances in molasses // The International Sugar Journal. - 1963. - V. 65. № 779.
40. Heyns K., Paulsen H. Veranderungen der Nahrung durche industrielle
und haushaltsmaszige Verarbeitung. - Darmstadt: Dr. D. Steinkorf Verlag, 1960.
41. Luers H., Traitteur H. Der neuerste Stand der Melanoidinforschung //
Schweazer Brauerei-Rundshau. —1954. - V. 65. - № 3.
42. Haugaard C., Tumerman L., Silvestri H. A study of the reaction of al­
doses and amino acids // Amer. Chem. Soc. —1951. - V. 73. —№ 10.
43. Weugand F., Simon H., Klebe J. Uber den Reaktiones Mechanismus der
OsazonbiIdung in der Zuckerreiche // Chemische Berichte. — 1958. V. 9 1.-№ 8 .
44. Anet E.F.L.J. Degradation of carbohydrates. I. Isolation of 3deoxyhexosones // Australian Journal of Chemistry. - 1960. - V. 13. - № 3.
45. Anet E.F.L.J. Degradation of carbohydrates/II/ The action of acid and alkaly on 3-deoxyhexosones // Australian Journal of Chemistry. - 1961. V. 14. - № 2.
46. Danehy J., Pigman W.W. Reactions between sugars and nitrogenous
compounds // Advances in Food Research. - 1951. - V. 3.
47. Enders C. Neuere Arbeiten uber Melanoidine // Wochenschrift filr
Brauerei. - 1943. - V. 60.
48. Enders C., Sigurdsson S. Zur Existenz und Bedeutung der ZuckerTriosegleichgewichte // Biochemische Zeitschrift. - 1944. - V. 316.
49. Lindenmeier М., Faist V., Hormann T. Structural and Functional Charac­
terization of Pronyl-Lysine, a Novel Protein Modification in Bread Crust
Melanoidins Showing in Vitro Antioxidative and Phase I/II Enzyme
Modulating Activity // Agricultural and Food Chemistry. - 2002. - V. 50.
222
50. Schiweck F. Physikalische und chem ische Eigenschaften einer aus den
Regenerationsablaufen einer Entfarbungsanlage fur Klare isolierten
FarbstofFsaure // Zucker. - 1963. - V. 16. - № 20.
51. Binkley W.W. Hydrogenolysis o f the Dialysed Browning Products o f
final cane molasses // Intem at. Sugar Journal. - 1957. - V. 59. - № 699.
52. Binkley W.W. The Action o f Bromine on the Dialysed Browning Prod­
ucts // Intem at. Sugar Journal. - 1958. - V. 60. - № 7 1 1 .
53. Barnes H.M., Kaufman C.W. Industrial Aspects o f Browning Reaction //
Industrial and Engin. Chemistry. - 1947. - V. 39. - № 9.
54. Beyer H. Lehrbuch der organischen Chemie. - Hirzel-Leipzig, 1961.
55. Prey V., Andres H. Nebenreaktionen der Saftreinigung // Zietschrift fur
die Zuckerindustrie. - 1971. - № 6.
56. Reinefeld E., M ussawi-Barab M.H. Uber M elassefarbstoffe // Zucker. 1 9 6 3 .-№ 12.
57. Jamane Т., Suzuki K., Takanuzawa J. The effects o f m olecular sizes o f
colorants in the cane raw sugars and refinery liqnors on their behaviour
in the sugar refining processes // Paper presented at the 13* Congress o f
the Com mission International Technique de Sucrerie; Falsterbo. - 1960.
58. Jam ane Т., Suzuki K. Uber die Farbsoffe im Dicksaft einer Rubenzuckerfabrik // Zeitschrift fur die Zuckerindustrie. - 1963. - № 11.
59. Jamane Т., Suzuki K. The colored substance in thieck juice o f a beet
sugar factory // Proceedings o f the Research Society o f Japan Sugar Re­
fineries Technologists. - 1963. - № 13.
60. Stanek V. Uber die stickstoffhaltigen Farbstoffe der M elasse // Zeit­
schrift fur die Zuckerindustrie in Bohmen. - 1916-1917. - V. 41.
61. Prey V. Vznik barbiv a farbiva v cukrovarnickom priem ysle a ich odstranovanie // Listu cukrovam icke. - 1970. - № 12.
62. Кочетков H.K., Бочков А.Ф., Дмитриев Б.А. и др! Химия углеводов. М.: Химия, 1967.
63. Чикин Г.А., Синегубова Л.И. О заряде красящих веществ сахарно­
го производства // Сахарная пром-ть. - 1970. - № 6.
64. Харин С.Е., Колчева Р.А., Сапронов А.Р. Кинетика разложения не­
которых аминокислот в зависимости от pH // Спиртовая и фер­
ментная пром-сть. - 1970. - № 2.
65. Тоболина Н.М., Чикин Г.А., М ирошникова З.П. Анализ красящих
веществ методом бумажной хроматографии // Сахарная пром-сть. 1 9 7 1 .-№ 4.
66. Харин С.Е., Колчева Р.А., Сапронов А.Р. Полидисперсный анализ
меланоидинов // Изв. вузов. Пищевая технология. - 1971. - № 3.
67. Бугаенко И.Ф., Булгакова И.П., Павлов И.И. Разделение красящих
веществ при помощи гельфильтрации // Сахарная пром-сть. - 1968. № 7. '
Литература
223
68. Бугаенко И.Ф., Мухамед М. Роль пептидов в реакции меланоиди­
нообразования в сахарном производстве // Изв. вузов. Пищевая
технология. —1971. —№ 5.
69. Волгунов Г.П., Похно М.Т. Влияние влажности субстрата на образо­
вание меланоидиновых веществ // Биохимия, - 1950. - Т. 15. - № 1.
70. Думанский А.В., Харин С.Е. Влияние коллоидов на процессы саха­
роварения. - Киев: Наукова Думка, 1950. - 68 с.
71. Селеменев В.Ф., Чикин Г.А., Вейссенберг Н.В. и др. Некоторые
особенности строения меланоидинов и продуктов щелочного рас­
пада инвертного сахара // Сахарная пром-сть. - 1972. - № 2.
72. Селеменев В.Ф., Шамрицкая И.П., Jlenc К., Орос Г.Ю. Взаимодей­
ствие фруктозы и глутаминовой кислоты в лимоннокислых средах //
Изв. вузов. Пищевая технология. - 1979. - № 2.
73. Селеменев В.Ф., Шамрицкая И.П., Лепс К. Окрашенные продукты
лимоннокислого производства // Изв. вузов. Пищевая технология. 1977.-№ 5.
74. Селеменев В.Ф., Неповинных В.Н., Орос Г.Ю., Шолин А.Ф. Свой­
ства окрашенных веществ, сопутствующих производству лизина //
Изв. вузов. Пищевая технология. - 1981. - № 6.
75. Славинская Г.В., Селеменев В.Ф. Фульвокислоты природных вод. Воронеж: ВГУ, 2001.
76. Скопинцев Б. А. Органическое вещество в природных водах (водный
гумус) // Тр. океаногр. ин-та. - Л.: Гидрметеоиздат, 1950. - Т. 17.
77. Селеменев В.Ф., Шамрицкая И.П., Завьялова ТА . и др. Исследова­
ние красящих веществ сахарного производства методом инфра­
красной спектроскопии // Теория и практика сорбционных процес­
сов. —Воронеж: ВГУ, 1971. - Вып. 6.
78. Стивенсон Ф.Дж., Батлер Дж.Х.А. Химия гуминовых кислот и родст­
венных им пигментов // Органическая геохимия. - М.: Недра, 1974.
79. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв. - М.: МГУ, 1974.
80. Варшал Г.М., Инукирвели Л.Н., Сироткина И.С. и др. Об ассоциа­
ции фульвокислот в водных растворах //Геохимия. - 1975. - № 10.
81. Пономарева В.В., Плотникова Т.А. Гумус и почвообразование. Л.: Наука, 1980.
82. Румянцева З.А. Фульвокислоты выветрившегося бурого угля // Изв.
АН Таджик. ССР. Отдел, физ.-мат., химии и геологии. - 1983. - № 1.
83. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: МГУ, 1990.
84. Комиссаров И.Д., Логинов Л.Ф. Молекулярная структура и реак­
ционная способность гуминовых кислот // Гуминовые вещества в
биосфере. - 1993. - № 4.
224
85. Брукс Дж., Смит Дж. Диагенез и катагенез растительных липидов
при образовании углей, нефти, газа. - М.: Недра, 1971.
86. Барле Р., Пьер Ж.Л. Пособие для изучающих органическую химию. М.: Мир, 1971.
87. Смирнова Л.С., Абдуазимов Х.А. Диоксанлигнин из проростков
семян хлопчатника сорта 108-Ф.1 // Химия природн. соединений. 1979.-№ 1.
88. Рудаков О.Б., Селеменев В.Ф. Физико-химические системы сорбатсорбент-элюент в жидкостной хроматографии. - Воронеж: ВГУ, 2003.
89. Рудаков О.Б., Востров И.А., Федоров С.В. и др. Спутник хромато­
графиста. Методы жидкостной хроматографии. - Воронеж: Водолей,
2004.
90. Резников В.М., Михасева М.Ф. О филогении лигнина // Химия дре­
весины. - 1982. - № 6.
91. Каницкая Л.В., Рохин А.В., Кушнарев Д.Ф., Калабин Г.А. Химиче­
ская структура макромолекулы диоксанлигнина пшеницы: иссле­
дование методом спектроскопии ЯМР на ядрах Н и С // Высокомолек. соед. - 1998. - Сер. А. - Т. 40. - № 5.
92. Crawford R.L. Lignin biodegradation and transformation. New York:
John Willey, 1981.
93. Калабин Г.А., Каницкая Л.В., Кушнарев Д.Ф. Количественная
спектроскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов
его переработки. —М.: Химия, 2000.
94. Skjemstad J.O., Frost R.L., Barron P.F. Structural units in humic acids
from South-eastern Queensland soiks as determined by carbon -13NMP //
Austr. J. Soil Res. - 1983. - V . 21.
95. Каррер П. Курс органической химии. - Л.: ГосНТИ хим. литерат.,
1962.
96. Ленинджер А. Биохимия. - М.: Мир, 1974.
97. Spark B.A.A. Role of amino acids in non-enzymic browning // Sci. Fd
Agric. - 1969. - V. 20. - № 5.
98. Ковалева T.A., Селеменев В.Ф., Плохих A.M. и др. Изучение неко­
торых свойств глюкоамилазы сорбционными и спектральными ме­
тодами // Теория и практика сорбционных процессов. - Воронеж:
ВГУ, 1985.
99. Рогов Н.А., Антипова Л.В., Дунченко Н.И., Жеребцов Н.А. Химия
пищи. Книга 1. Белки: структура, функции, роль в питании. - М.:
Колос, 2000.
100. А.С. 1163639, МКИ А; С12 11/00.
101. Ahari D., Genotelle J. La coloration en sucrerie // Industries Alimentaires et Agricoles. - 1961. - V. 78. - № 7-8.
Литература
225
102. Селеменев В.Ф. Обменные процессы и межмолекулярные взаимо­
действия в системе ионит-вода-аминокислота: Дисс. ... докт. хим.
наук. - Воронеж: ВГУ, 1993.
103. Селеменев В.Ф. Взаимодействие меланоидинов с обесцвечиваю­
щим анионитом АВ-17-2П // Теория и практика сорбционных про­
цессов. - Воронеж: ВГУ, 1983.
104. Сапронов А.Р., Потапова Н.М., Воронкова И.Н. Роль аминокислот
и сахаров в реакциях образования красящих веществ // Сахарная
пром-сть. - 1969. - № 8.
105. Stewart J.W., Stahman М.А. Polyaminoacids, polypeptides and pro­
teins. - Madison, 1962.
106. Davankov V.A., Rogozhin S.V., Tsyrupa M.P. Influence of Polymeric
Matrix Structure on performance of Ion-exchange Resins // Ion Ex­
change and Solvent Extraction. - 1977. - V. 7.
107. Цюрупа М.П., Даванков В.А., Кривоносова Л.Г., Селеменев В.Ф., Чикин Г.А. // Приклад, биохимия и микробиология. - 1985. - Т. 21. - № 1.
108. А.С. 1690338 СССР, МКИ А1 С07С227/40; 229/00.
109. Чикин Г.А. Сорбция цветных веществ сахарного производства
анионообменными смолами: Дисс. ... канд. хим. наук. - Воронеж,
1969.
110. Шолин А.Ф., Селеменев В.Ф., Тер-Саркисян Э.М. и др. Исследова­
ние работы крупногабаритного ионообменного фильтра в процессе
выделения кристаллического лизина из ЮК // Теория и практика
сорбционных процессов. —Воронеж: ВГУ, 1981. - № 14.
111. Селеменев В.Ф., Шамрицкая И.П., Богатырев К.С. и др. Красящие
вещества в производстве лимонной кислоты и осветление лимон­
нокислых растворов // Научно-техн. информация. Кондитерская
пром-сть. - М.: ЦНИИТЭИПИЩЕПРОМ, 1977. - № 2.
112. Селеменев В.Ф., Чикин Г.А., Корчкова Н.В. Сорбция карамелей
анионитом АВ-17-2П // Сахарная пром-сть. - 1979. - № 2.
113. Углянская В.А., Чикин Г.А., Селеменев В.Ф., Завьялова Т.А. Ин­
фракрасная спектроскопия ионообменных материалов. - Воронеж:
ВГУ, 1989.
114. Селеменев В.Ф., Чикин Г.А., Загородний А.А. и др. Анализ пиг­
ментов глюкоамилазного производства // Ферментная и спиртовая
пром-сть. —1987. - № 4.
115. Гребенюк В.Д., Стрижак Н.П., Славинская Г.В. Реверсивный элек­
тродиализ растворов, содержащих гумусовые кислоты // Химия и
технология воды. - 1987. - Т. 9. - № 6.
116. Franzke G., Grunert К.С., Ullrich Е. Zur Adsorption und Desmolyse
von Sacchariden durch basische Ionenaustauschharze // Nahrung. 1966.- V . 1 0 .- № 7.
226
117. Бобровник Jl.Д., Волошенко Г.П., Сапронов А.Р., Мирошниченко
С.С. Активность пептидов в реакции образования красящих ве­
ществ сахарного произвоства и ингибирование ее // Изв. ВУЗов.
Пищевая технология. - 1973. - № 3.
118. Obenaus R., Neumann H.-J. Entsalzung von Huminsauren an Sephadex
G-25 // Naturwissenschaften. —1965. - V. 52. - № 1.
119. Бугаенко И.Ф., Славгородская И.П. Свойства красящих веществ
сахарного производства и методы их удаления. - М.: ЦНИИТЭИПИЩЕПРОМ.- 1972.
120. Тагер А.А., Цилипоткина М.В. Пористая структура полимеров и
механизм сорбции // Успехи химии. - 1978. - Т. 47. - № 1.
121. Цюрупа М.П. Сверхсшитый полистирол - новый тип полимерных се­
ток. Автореф. дисс.... докт. хим. наук. - М.: ИНЭОС АНСССР, 1985.
122. Казанцев Е.И., Пахолков B.C., Кокошко З.Ю., Чупахин О.Н. Ионооб­
менные материалы, их синтез и свойства. - Свердловск. - УПИ. 1969.
123. Чикин Г.А., Шамрицкая И.П., Селеменев В.Ф. Ионообменные тех­
нологические процессы в пищевой промышленности // Прикладная
хроматография. - М.: Наука. - 1984.
124. Buhler B.D.R., Thomas R.C., Christensen В.Е., Wang C.H. Epimerization and Fragmentation of Glucose by Quaternary Ammonium Base Type
Anion Exchange Resins // Amer. Chem. Soc. - 1955. - V. 77. - № 2.
125. A critical evaluation of aquatic humic substances // Hum. Subst. and
Role Environ. Rept Dahlem Workshop.-Berlin, March 29 - Apr. 3. Chrichester e.a. -1988.
126. Фотиев А.В. К изучению гумуса грунтовых вод // Почвоведение. 1966.-№ 11.
127. Фотиев А.В. К изучению гумуса болотных вод // Почвоведение. —
1964. -№ 12.
128. Симаков В.Н., Левашкевич Г.А. Влияние способов очистки гуми­
новых кислот на их химические свойства // Вестник Ленинград, ун­
т а , - 1 9 7 1 .-№ 15.
129. Варшал Г.М., Велюханова Т.К., Сироткина И.С. и др. Фракциони­
рование, количественное определение и изучение некоторых основ­
ных компонентов растворенных органических веществ природных
вод // Гидрохимические материалы. - 1973. - Т. 59.
130. Стадник А.С., Дедков Ю.М . Вымораживание как метод концентрирова­
ния примесей в водах // Химия и технология воды. - 1981. - Т. 7. - № 7.
131. Славинская Г.В., Зеленева Л.А. Причины «старения» анионита АВ17 при обессоливании воды // Теория и практика сорбционных
процессов. - Воронеж. - 1980. - Вып. 13.
132. Slavinskaya G.V., Selemenev V.F. Acid-base function of colloid fulvic
acid of natural waters //International Conference of Colloid Chemistry
Литература
227
and Physical-Chemical Mechanics dedicated to the centennial of the
birthday of P. A. Rehbinder. - 4-8 October 1998. - M.
133. Кузнецова H.C., Славинская Г.В., Маркина М.И. Исследование сорб­
ции фульвокислот природных вод синтетическими сорбентами // Тео­
рия и практика сорбционных процессов. - Воронеж. - ВГУ. - № 19.
134. Селеменев В.Ф., Славинская Г.В., Хохлов В.Ю., Чикин Г.А. Прак­
тикум по ионному обмену. —Воронеж: ВГУ, 1999.
135. Obenaus R. Huminsauren naturlicher Gewasser. 2 Mitt.Quantitativ Bestimmung der Huminsauren // Schweiz Z.Hydrol. - 1964. - Bd. 26. - № 1.
136. Oberlander H.E., Stadier J., Roht K. Entsalzung von Fulvosaurelosungen durch Gelfitation // Z. AnalyL Chem. - 1968. - Bd. 234. - № 2.
137. Цвет M.C. О новой категории адсорбционных явлений и о приме­
нении их к биохимическому анализу // Тр. Варшавского Общества
Естествоиспытателей, отд. Биология. - 1903. - Т. 14.
138. Хайс И.М., Мацек К. Хроматография на бумаге. - М.: ИЛ, 1962.
139. Рудаков О.Б., Хайрутдинова А.Д., Один А.П., Болотов В.М. Фрак­
ционный состав антоциановых красителей из растительных экс­
трактов и контроль над ним методом ВЭЖХ // Вестник Воронежск.
Ун-та. Серия: Химия, биология, фармация. - 2004.
140. Селеменев В.Ф. Безреагентные ионообменные методы выделения
физиологически активных веществ // Ведущие научно-педагогические коллективы. - Воронеж: ВГУ, 2003.
141. Селеменев В.Ф., Чикин Г.А., Негробов О.П. Физико-химические,
технологические и социальные аспекты выделения физиологиче­
ски активных веществ сорбционными методами из отходов раз­
личных производств // Вестник Воронежск. ун-та: Серия 2. Естест­
вен. науки. - Воронеж. - 1998.
142. Рудаков О.Б. Растворитель как средство управления процессом в
жидкостной хроматографии. - Воронеж: ВГУ, 2003.
143. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения ор­
ганических соединений. - М.: Химия, 1975.
144. Гейс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. - Т.1. - М., 1999. Т. 2. - М., 1999.
145. Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Тюрина Н.В. Тонкослойная хромато­
графия. Теоретические основы и практическое применение. - Са­
ратов: СГУ, 2002.
146. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А. и др. Аналитиче­
ская хроматография. - М.: Химия, 1993.
147. Киселев А.В., Пашкус Д.П., Яшин Я.И. Молекулярные основы ад­
сорбционной хроматографии. - М.: Химия, 1986.
148. Селеменев В.Ф., Котова Д.Л., Орос Г.Ю., Загородний А.А. Хрома­
тография низкого давления физиологически активных веществ //
100 лет хроматографии. - М.: Наука, 2003.
228
149. Беленький В.Г., Гурковская Е.А., Коган Ю .Д., Красиков В.Д. Тон­
кослойная хроматография в России // 100 лет хроматографии. - М.:
Наука, 2003.
150. Selem enev V.F., Chikin G.A., Khokhlov V.Yu. Interionic and intermolecular interactions in ion-exchange and sorption system s involving
physiologically active substances // Ion-exchange. - M arsel Dekker. New York. - 2000. - № 1.
151. Дегтярев E.B., Тяглов Б.В., Красиков В.Д. и др. Применение тонкос­
лойной хроматографии в анализе биологически активных веществ //
100 лет хроматографии. - М.: Наука, 2003.
152. Комплект оборудования для тонкослойной хроматографии //СанктПетербург. НПЦ «Ленхром». - СПб., 2001.
153. М атериалы и оборудование для тонкослойной хроматографии //
Каталог ЗАО «Сорбполимер», ООО «М ашиностроитель». - Крас­
нодар, 2001.
154. Li X., Ricke S.С. Influence o f soluble lysine M aillard reaction products
on Escherichia coli amino acid lysine auxotroph growthbased assay //
Food Science. - 2002. - V. 67. - № 6.
155. Obretenov C., Demyttenaere J., Tehrani K.A., et al. Flavor release in the
presence o f melanoidins prepared from L-(+)-ascorbic acid and amino
acids // Agriculture Food Chemistry. - 2002. - V. 50. - № 15.
156. Borrelli R.C., Viscontu A., Mennella C., et al. Chemical charaqcterization and antioxidant properties o f coffee melanoidins // Agric. Food
Chem. - 2002. - V. 50. - № 22.
157. Martins S.J.F.S., Van Boekel M.A.H.S. M elanoidins extinction coeffi­
cient on the glucose/glycine Maillard reaction // Food Chemistry. 2 0 0 3 .- V . 8 3 . - № 1.
158. Patil P.U., Kapadnis B.H., Dhamankar V.S. Decolorisation o f synthetic
melanoidin and biogas effluent by immobilised fungal isolate o f Asper­
gillus niger UM2 // Intemat. sugar Journal. - 2003. - № 105.
159. Yaylayan V.A. Recent advances in the chem istry o f Strecker degrada­
tion and Amadori rearrangement: Implications to aroma and color for­
mation // Food Sci. And Technol. Research. - 2003. - № 9.
160. Machiels D., Istasse L. Maillard reaction: importance and applications in
food chemistry // Annal. Medecine Veterinaire. - 2002. - V. 146. - № 6.
161. Mundt S., Welzicha B.L. A kinetic models for the glucose-fructose-glycine
browning reaction // Agric. Food Chem. - 2003. - V. 51. - № 15.
162. Детерман Г. Гель-хроматография. - М.: Мир, 1970.
163. Методы органической химии. Серия монографий под ред. Вайсбергера А. Т. II. Кн. 2. Установление структуры органических соедине­
ний физическими и химическими методами. —М.: Химия, 1967.
Литература
229
164. Либинсон Г.С. Физико-химические свойства карбоксильных ка­
тионитов. - М.: Наука, 1969.
165. Альберт А., Сержент Е. Константы ионизации кислот и оснований. М.: JL: Химия, 1964.
166. Либинсон Г.С. Сорбция органических соединений ионитами. - М.:
Медицина, 1979.
167. Золотов Ю.А., Дорохова Е.Н., Шпигун О.А., Большова Т.А. и др.
Основы аналитической химии. - М.: Высшая школа, 1999.
168. Крешков А.П., Быкова Л.Н., Казарян Н.А. Кислотно-основное тит­
рование в неводных средах. - М.: Химия, 1967.
169. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ
в органической химии. - Л.: Химия, 1975.
170. Казицына Л.А., Куплетская Н.Б. Применение УФ-, ИК- и ЯМРспектроскопии в органической химии. - М.: Высшая школа, 1971.
171. Гаммет Л. Основы физической органической химии. - М.: Мир,
1972.
172. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. Физико-химические свойства,
методики, библиография. - М.: Мир, 1976.
173. Беллами Л. Инфракрасные спектры сложных молекул. - М.: ИЛ,
1963.
174. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических со­
единений. - М.: Мир, 1965.
175. Дехант И., Данц Р., Киммер В. и др. Инфракрасная спектроскопия
полимеров. - М.: Химия, 1976.
176. Збинден В. Инфракрасная структура высокополимеров - М.: Мир,
1966.
177. Кросс А. Введение в практическую инфракрасную спектроскопию. М.: ИЛ, 1961.
178. Беллами Л. Новые данные по ИК спектрам сложных молекул. - М.:
ИЛ, 1971.
179. Цундель Г. Гидратация и межмолекулярное взаимодействие. - М.:
Мир, 1972.
180. Либрович Н.Б., Сакун В.П., Соколов Н.Д. Сильные водородные свя­
зи в водных растворах кислот и оснований // Водородная связь. —
М.: Наука, 1981.
181. Бутырская Е.В., Шапошник В.А. Потенциал валентных колебаний
гидратированного иона Ме+ -Н2О (Ме+ = Li+, Na+, К+) // Оптика и
спектроскопия. —1989. —Т.67. —№ 4.
182. Кучеров А.П. Вычисление величин, характеризующих перекры­
вающиеся линии в спектрах // Журн. прикл. спектроскопии. - 1984. Т. 41. —№ I
230
183. Кучеров А.П., Кравец Б.К., Сердюк J1.A. и др.Универсальная про­
грамма обработки спектров УПОС // Гос. ФАП, № 50850000513 от
17.06.1985.
184. Кучеров А.П., Кочубей С.М. Метод разложения сложного контура
на элементарные составляющие с использованием предварительно­
го анализа его структуры // Журн. прикладной спектроскопии. 1983.- Т . 3 8 .-№ 1.
185. Чиргадзе Ю.Н. Инфракрасные спектры и структура полипептидов
и белков. - М.: Наука, 1965.
186. Пиментел Дж., Мак-Клеллан О. Водородная связь. - М.: Мир, 1964.
187. Buontempo U., Careri G., Fazella P. Hydration Water of Globular Proteins:
The infrared Band Near 3300 sm'1// Вiopolimers. - 1972. - V. 11. - № 2.
188. Schroetter S., Boufeard D., Schrader B. Spectroscopic study of C-H...0
interactions in some organic molecular crystals // Spectroscopic letters. 1985.-V . 18.-№ 2.
189. Zagorodni A.A., Kotova D.L., Selemenev V.F. Infrared spectroscopy of
ion exchange resins: chemical deterioration of the resins // Reactive and
Functional Polymers. - 2002. - V. 53.
190. Карпов С.И. Кинетика многокомпонентной сорбции минеральных
ионов и ароматических аминокислот ионитами. Автореф. дисс. ...
канд. хим. наук. - Воронеж: ВГУ, 2002.
191. Сидорова Д.Р. Исследование гидратации аминокислот методом ИКС.
Автореф. дисс.... канд. хим. наук. - Казань: КазГУ, 1973.
192. Котова Д.Л., Селеменев В.Ф., Елисеева Т.В., Селеменева Н.В.
Компенсационная зависимость в кинетике дегидратации анионита
АВ-17//Журн. физ. химии. - 1989. -Т . 63. -№ 8.
193. Полянский Н.Г., Горбунов Г.В., Полянская Н.Л. Методы исследо­
вания ионитов. - М.: Химия, 1976.
194. Карякин А.В., Кривенцова Г.А. Состояние воды в органических и
неорганических соединениях. - М.: Наука, 1973.
195. Иогансен А.В. Инфракрасная спектроскопия и спектральное опре­
деление энергии водородной связи // Водородная связь. - М.: Нау­
ка, 1981.
196. Юхневич Г.В. Инфракрасная спектроскопия воды. - М.: Наука, 1973.
197. Obretenov Т., Kuntscheva М., Ivanova S. Model Studies on processes of
melanoidine formation in meat // Nahrung-Food. - 1983. - V. 27(10).
198. Kwak E.J., Lee Y.S., Murata M. et al. Effect of reaction pH on the photode­
gradation of model melanoidins // Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie-Food science and Technology. - 2004. - V. 37(2).
199. Morales F.J., limenes-Peres S. Peroxyl radical scavenging activity of
melanoidins in aqueous systems // European food Research and Tech­
nology. - 2004. - V. 218(6).
Литература
231
200. Iokic A., Wang М.С., Lin С. et al. Integration of the polyphenol and Maillard reactions into a unified abiotic pathway for humification in nature: the
role of delta-Mn02 // Organic geochemistry. - 2004. - V. 35(6).
201. Hoffmann Т., Schieberle P. Influence of melanoidins of the aroma staling of
coffee beverage // Asc symposium series. - 2004. - V. 871.
202. Daglia М., Racchi М., Papetti A. et al. In vitro and ex vivo antihydroxyl
radical activity of green and roasted coffee // Agric. Food Chem. 2004.-V . 52(6).
203. Yanagimoto K., Ochi H., Lee K.G. et ak. Antioxidative activities of
fractions obtained from brewed coffee // Agric. Food Chem. - 2004. V. 52(3).
204. Taylor I. L.S., Demyttenaere I. C. R., Tehrani K. A. et al. Genotoxicity
of melanoidin fractions derived from a standard glucose/glycine model //
Agric. Food Chem. —2004. - V. 52(2).
205. Andriot I., Le Quere I.L., Guichard E. Interactions between coffee me­
lanoidins and flavour compounds: impact of freeze-drymg (method and
time) and roasting degree of coffee on melanoidins retention capacity //
Food Chemistry. - 2004. - V. 85(2).
206. Kumazawa K., Masuda H. Effect of pH on the thermal stalility of potene roasty oborants, 3-mercapto-3-methylbutyl esters, in coffee drink //
Agric. Food Chem. —2003. —V. 51(27).
207. Adams A., Tehrani K.A., Kersiene M. et al. Characterization of model
melanoidins by the thermal degradation profile // Agric. Food Chem. —
2003--V . 51(15).
208. Hofmann Т., Schieberle P. Chemical interaction between odor-active thiols
and melanoidins involved in the aroma staling of coffee beverages //
Acric. Food Chem. - 2002. - V. 50(2).
209. Jokic A., Frenkel A.I., Huang R.M. Effect of light on bimessite catalysis
of the Maillard reaction and implication in humification // Canadian
Journal of soil science. - 2001. - V. 81. - № 3.
210. Jokic A., Frenkel A.I., Vairavamurthy M.A. et al. Bimessite catalysis of
the Maillard reaction: Its significance in natural humification // Geo­
physical Research Letters. - 2001. - V. 28. - № 20.
211. Hofmann Т., Schieberle P. Influence of melanoidins on the aroma stal­
ing of coffee beverage // Abstracts of Papers Americ. Chem. Society. 2001.-97-AGED Part 1.
212. Hofmann Т., Czemy М., Calligaric S. et al. Model studies on the influence
of coffee melanoidins on flavor volatiles of coffee beverages // Agric.
Food Chem. - 2001. - V. 49. - № 5.
213. Serban A., Nissenbaum A. Light induced production of hydrogen from
water by catalysis with ruthenium melanoidins // Intemat. J. Hydrogen
Energy. - 2000. - V. 25. - № 8.
232
214. Arfaioli P., Pantani O.L., Bosetto M. et al. Influence of clay minerals and
exchangeable cations on the formation of humic-like substances (mela­
noidins) from D-glucose and L-tyrosine // Clay Minerals. — 1999. V. 23.-№ 3 .
215. Ide N., Lau B.H.S., Ryu K. et al. Antioxidant effects of fructosyl argin­
ine, a Maillard reaction product in aged garlic extract // Nutritional Biochem. - 1999. - V. 10. - № 6.
216. Rogacheva S.М., Kuntcheva M.I., Panchev I.N. et al. Meianoidin for­
mation in L-ascorbic acid alpha-amino acids interaction. A comparative
study // Nahrung-Food. - 1999. - V. 43. - № 2.
217. Hofmann T. 4-alkylidene-2-imino-5-[4-alkylidene-5-oxo-l,3-imidazol-2inyl] azamethylidene-1,3-imidazolidine. A novel colored substructure in
melanoidins formed by Maillard reaction of bound arginine with glyoxal
and furan-2-carboxaldehyde // Agric. Food Chem. -1998. - V. 46. -№ 10.
218. Kuntcheva R.L., Obretenov T.D. Isolation and characterization of mela­
noidins from beer // Zeitschrift fllr Lebensmittel-Untersuchung und Forschung. - 1996. - V. 202(3).
219. Lusk L.N., Goldstein H., Ryder D. Independent Role of Beer proteins,
melanoidins and polysaccharides in foam formation // Amer. Soc.
Brewing Chem. - 1995. - V. 53. - № 3.
220. Bosetto М., Arfaioli P., Ristory G.G. et al. Influence of some homoionic
clays on the formation of melanoidinic compounds from Glucose and
Tryptophan // Fresenius Environmental Bulletin. - 1994. —V. 3. - № 6.
221. Kuntcheva R.L., Panchev I.N., Obretenov T.D. Influence of reaction
conditions on the formation of nondialyzable melanoidines from DFructose and Glycine // Food Processing and Preservation. — 1994. V. 18.-№ h
222. Гурская Г.В. Структура аминокислот. - М.: Наука, 1966.
223. Бектуров Е.А., Хамзамулина Р.Э., Бакауова З.Х. и др. Молекуляр­
ные комплексы полимеров. - Алма-Ата: Наука, 1988.
224. Селеменев В.Ф., Строителева Н.В., Загородний А.А. и др. Сорбция ти­
розина катионитом КУ-2-8 // Изв. вузов. Пищевая техн. - 1983. -№ 5.
225. Владимиров Ю.А., Ли Чинь Го. Спектры люминесценции белков и
ароматических аминокислот при различных pH // Биофизика. 1962.- Т . 7. - № 3.
226. Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. - М.:
Наука, 1965.
227. Чебаевский А.И., Смирнова Н.А. Исследование водных растворов
некоторых аминокислот изопиестическим методом // Химия и тер­
модинамика растворов. - Л.: ЛГУ, 1968. -№ 2.
Литература
233
228. Spink C.H.,Wadso I. Thermochemistry of solution of biochemical model
compounds. 4. The partial molar heat capacities of some amino acids in
aqueous solution // Chem. Thermodynamice. - 1975. - № 7.
229. Spink C.H., Auker M. Entropies of Transfer of Amino Acids from Water
to Acueous Ethanol Solutions // Phys. Chem. - 1970. - V. 74. - № 8.
230. Franks F., Reid D.S. Thermodynamic Properties // Water A. Compre­
hensive treatise. - New York: Plenum Press, 1973. - V. 2. - № 5.
231. Гусев Ю.А. Диэлектрическая релаксация в растворах некоторых
аминокислот. Автореф. дисс. ... канд. физ.-мат. наук. - Казань:
КазГУ, 1975.
232. Гусев Ю.А., Седых Н.В., Зуев Ю.Ф., Гусев А.А. Исследование ме­
ханизмов гидратации аминокислот и их влияние на диэлектриче­
ские свойства воды // Физико-химическая механика и лиофильность
дисперсных систем. - Киев: Наукова Думка, 1974. - № 6.
233. Гусев Ю.А., Седых Н.В., Фельдман Ю.Д., Гусев А.А. Диэлектрическая
релаксация аминокислот в водных растворах // Там же.
234. Hamabaha A., Chang S., Hippel Р.Н. Model studies on the Effects of Neu­
tral Salts on the Conformational Stability of Biological Macromolecules.
III. Solubility of Fatty Acid Amino in Ionic Solutions // Biochem. - 1973. V. 12,- №7.
235. Виман Дж. Диэлектрическая постоянная растворов диполярных
ионов // Успехи химии. - 1937. - № 6.
236. Chakravorty S.K., Lahiri S.C. Studies on the Dissociation Constants of
Amino Acids in Mixed Solvent // Indian Chem. Soc. - 1987. - V. 54. - № 7.
237. Kresheck G.C., Schneider H., Scherada H.A. The effect of D20 on the
Thermal Stability of Proteins. Thermodynamic Parameters for the
Transfer of Model Compounds from H20 to D20 // Phys. Chem. —
1965.- V . 6 9 .-№ 9 .
238. Kresheck G.C., Klotz I.M. The Thermodynamics of Transfer of Amides
from an Apolar to an Aqueous Solution // Biochem. - 1969. - V. 8. - № 1.
239. Maity B.S.K., Lahiri S.C. On the Correlation of the Reaction-Solvent Pa­
rameters and V // Z. Phys. Chemic. —1980. —V. 261. - № 3.
240. Schrier B.E., Robinson R.A. A Study of Free Energy Relationships in
Some Amino Acid Sodium Chloride-Water Systems // Biol. Chem. 1971.- V . 4 6 .-№ 9 .
241. Schrier B.E., Robinson R.A. Free Energy Relationships in Aqueous
Amino Acid and Peptide Solutions Containing Sodium Chloride // Solu­
tion Chem. - 1974. - V. 3. - № 7.
242. Kozak J.J., Knigth W.S., Kauzmann W. Solute-Solute interactions in
Aqueous Solution // Chem. Phys. - 1968. - V. 48. - № 2.
243. Franks F. Solute interaction in Dilute Aqueous Solutions. 3. Volume
changes Associated with the Hydrophobic Interaction // Chem. Soc.
Faraday Trans. - 1977. - V. 73.
234
244. Мищенко К.П., Полторацкий Г.М. Вопросы термодинамики и
строения водных и неводных растворов электролитов. - JI.: Наука,
1976.
245. Крестов Г.А. Термодинамика ионных процессов в растворах. - JI.:
Химия, 1973.
246. Niasi M.S.K., Moll in J. Dissociation of constants of some amino asid
and pyridinecarboxylic acids in ethanol - H20 mixtures // Bull. Chem.
Soc. Jap. - 1987. - V. 60. - № 7.
247. Franks F., Redley M.D., Reid D.S. Solute interaction in Dulite Aqueous
Solution. 1. Microcalorimetric Study of the Hydrophobic Interaction //
Chem. Soc. Faraday Trans. - 1976. - V. 72.
248. Cabani S., Conti G., Glannesal D., Lepori L. Thermodynamic Study of
Aqueous Dilute Solutions of Organic Compounds. 3. Morpholines and Piperasines // Chem. Soc. Faraday Trans. - 1975. -V . 71.
249. Cabani S., Conti G., Matteoli E. Thermodynamic Properyies of Organic
Compounds in Aqueous Solutions . II. Apparent Molal Heat Capacities of
Piperidines. Morpholines and Piperazines // Solution Chem. - 1976. - V.
5 ,-№ 2 .
250. Cabani S., Conti G., Matteoli E., Tani A. Apparent Molar Heat Capacities
of Organic Compounds in Aqueous Solution. 3. L-amino acid and related
compounds // Chem. Soc. Faraday Trans. - 1977. - V. 73.
251. Nosaki Y., Tanford C. The Solubilitu of Amino Acids and Two Glycine
Peptides in Aqueous Ethanol and Dioxsane Solution // Biol. Chem. 1971.- V . 2 4 6 ,-№ 7 .
252. Алтунина JI.K., Безруков О.Ф., Смирнова H.A. и др. Самодиффузия
в водных растворах аминокислот, пептидов, белков // Структура и
роль воды в живом организме. - Л.: ЛГУ, 1968.
253. Whitney P.L., Tanford С. Solubility of amino acids in aqueous Urea So­
lutions and its implications for the Denaturation of Proteins by Urea //
Biol. Chem. - 1962. - V. 237. - № 5.
254. Mason L.S., Offutt W.F., Robinson A.L. The Heats of Dilution of Aque­
ous Solutions of Four Amino Acids at 25° // Amer. Chem. Soc. —1949. V. 71. - № 4.
255. Bernstein H.I. The average XH stretching frequency as a measure of XH
bond properties // Spectrochem. Acta. - 1962. - V. 18.
256. Bull H.B., Breese K. Protein Hydration. 1.Binding Sites // Arch. Biochem. and Biophys. - 1968. - V. 128.
257. Зяблов A.H., Елисеева T.B., Селеменев В.Ф. Кажущиеся молярные
объемы и реологические свойства аминокислот в водных растворах //
Журн. физич. химии.-2 0 0 3 .- Т . 71. —№ 12.
258. Новикова И.В., Данковцев А.В., Востриков С.В., Рудаков О.Б.,
Дроздова Н.В. Микроколоночная ВЭЖХ водно-спиртовых экс­
Литература
235
трактов древесины дуба II Сорбцион. и хроматогр. процессы. 2003.- Т . 3. - № 5.
259. Зяблов А.Н., Елисеева Т.В., Селеменев В.Ф., Крисилова Е.В. Метод
сканирующей зондовой микроскопии в исследовании структуры
физиологически активных веществ // Сорбцион. и хроматогр. про­
цессы. - 2003. - Т. 3. - № 3.
260. Мартыненко С.В., Стекольников К.Е., Котов В.В., Селеменев В.Ф.
ИК-спектроскопическое и потенциометрическое исследование со­
става и строения гуминовых кислот // Сорбцион. и хроматогр. про­
цессы. - 2003. - Т. 3. —№ 2.
261. Зяблов А.Н., Елисеева Т.В., Селеменев В.Ф., Самойлова Н.Н. Гид­
ратация нейтральных аминокислот в разных ионных формах //
Журн. физич. химии. - 2001. - Т. 75. - № 3.
262. Крысанова Т.А., Котова Д.Л., Селеменев В.Ф., Давыдова Е.Г. Осо­
бенности гидратации аскорбиновой кислоты // Журн. физич. хи­
мии. - 2004. - Т. 7 8 .- № 6.
263. Орос Г.Ю., Мокшина Н.Я., Селеменев В.Ф. Применение методов
хроматографии и спектроскопии для идентификации пигментов
белковых гидролизатов II Сорбцион. и хроматогр. процессы. 2003. - Т. 3. - № 5.
264. Хохлов В.Ю., Селеменев В.Ф., Хохлова О.Н., Загородний А.А.
Ионные равновесия в растворах аминокислот при различных тем­
пературах // Вестн. ВГУ. Сер. «Химия. Биология, фармация». 2003.-№ 1.
265. Котова Д.Л., Селеменев В.Ф., Бейлина Д.С., Афиногенов Ю.П., Кры­
санова Т.А. Исследование гидратационных характеристик фенила­
ланина и тирозина методом термического анализа // Конденсиров.
среды и межфазные границы. - 2002. - Т. 4. - № 4.
266. Селеменев В.Ф., Карпов С.И., Матвеева М.В., Потянихин А.С. Оп­
ределение ионных форм ароматических аминокислот, осажденных
на кремниевой пластине методом ИКФТ-спектроскопии II Сорбци­
он. и хроматогр. процессы. - 2002. - Т. 2. - № 2.
267. Зяблов А.Н., Елисеева Т.В., Селеменев В.Ф. Структурный анализ
лизина и (3-аланина, сорбированных на графите, методом зондовой
микроскопии // Сб. «Проблемы аналитической химии (III Черкесовские чтения)». - Саратов: Слово, 2002.
268. Мокшина Н.Я., Селеменев В.Ф., Орос Г.Ю. Расчет коэффициентов
активности аминокислот в средах с переменной диэлектрической
проницаемостью // Изв. вузов. Химия и хим. технология. - 2001. Т. 4 4 .-№ 5 .
269. Зяблов А.Н., Долгих Д.С., Елисеева Т.В., Селеменев В.Ф., Битюцкая Л.А., Суровцев И.С. Сканирующая туннельная микроскопия в
236
270.
271.
272.
273.
274.
275.
276.
277.
278.
279.
280.
исследовании структуры молекулы лизина // Журн. структ. химии. 2001. - Т . 42. - № 3 .
Зяблов А.Н., Елисеева Т.В., Селеменев В.Ф., Битюцкая Л. А. Визуа­
лизация молекулы (3-аланина, сорбированного на поверхности
графита // Вестн. ВГУ. Сер. химия, биология. - 2000. - № 6.
Котова Д.Л., Яценко О.Б., Бейлина Д.С., Селеменев В.Ф., Ермолова
О.В. Распределение компонентов при кристаллизации и плавлении
льда в водных растворах аминокислот // Конденсир. среды и межфазные границы. - 2001. - Т. 3. - № 1.
Селеменев В.Ф., Мокшина Н.Я., Орос Г.Ю., Мануковская А.Н. Оп­
ределение тепловых эффектов и параметров растворимости при
экстракции аминокислот методом термического анализа // Вестн.
Тамб. ГУ. Естеств. и технич. науки. - 2000. - Т. 5. - № 5.
Сливкин А.И., Сафонова Е.Ф., Селеменев В.Ф. Исследование кине­
тики реакции конденсации глюкозы с гидразином изоникотиновой
кислоты // Труды VIII Регион, конф. «Проблемы химии и хим. тех­
нологии». - Воронеж, 2000.
Котова Д.Л., Рожнова О.И., Селеменев В.Ф., Перегудов Ю.С. Тер­
мохимические характеристики растворения цистеина в воде //
Журн. физич. химии. - 2000. - Т. 74. - № 12.
Казначеев А.В., Хохлова О.Н., Селеменев В.Ф., Хохлов В.Ю.,
Мокшина Н.Я. Спектрофотометрическое определение ароматиче­
ских и гетероциклических аминокислот в их смесях // Журн. аналит. химии. - 2000. - Т. 55. - № 4.
Рожнова О.И., Котова Д.Л., Селеменев В.Ф., Крысанова Т.А. Спек­
трофотометрическое определение цистеина в водном растворе //
Журн. аналит. химии. - 1999. - Т. 54. - № 12.
Котова Д.Л., Ермолова О.В., Селеменев В.Ф., Яценко О.Б., Рожнова
О.И. Распределение компонентов при кристаллизации и плавлении
льда в водных растворах аминокислот // Труды VI Регион, конф.
«Проблемы химии и хим. технологии». - Воронеж. - 1998. - Т. 1.
Селеменев В.Ф., Ковалева Т.А., Зяблов А.Н., Чикин Г.А., Казначе­
ев А.В., Железной С.А. Меланоидиноподобные вещества в микро­
биологических средах, содержащих лизин // Тр. биологич. Центра
ВГУ «Веневитиново» «Состояние и проблемы экосистем Среднего
Подонья». - 1998. - Вып. 10.
Ковалева Т.А., Селеменев В.Ф. Безотходная технология и разделе­
ние пигментов глюкоамилазного производства // Тр. Междунар.
конф. «Геоэкологические проблемы устойчивого развития город­
ской среды». - Воронеж: ВГУ, 1996.
Ковалева Т.А., Селеменев В.Ф., Башарина О.В. Хроматографическое
разделение пигментов глюкоамилазного производства и безотходная
Литература
281.
282.
283.
284.
285.
286.
287.
288.
289.
290.
291.
292.
293.
294.
295.
296.
237
технология // Тр. биологич. Центра ВГУ «Веневитиново» «Состоя­
ние и проблемы экосистем Среднего Подонья». - 1994. - Вып. 5.
Мокшина Н.Я., Селеменев В.Ф., Матвеева М.В., Крестникова Ю.В.
Экстракция тирозина и фенилаланина гидрофильными растворите­
лями // Журн. аналит. химии. - 1994. - Т. 49. - № 11.
Селеменев В.Ф., Хохлов В.Ю., Коренман Н.Я., Ловчиновская Е.В.
Спектрофотометрическое определение фенилаланина и тирозина //
Журн. аналит. химии. - 1994. - Т. 49. —№ 4.
Селеменев В.Ф., Загородний А.А., Углянская В.А., Завьялова Т.А.,
Чикин Г.А. Гидратация и явление пересыщения аминокислот в ионообменниках // Журн. физич. химии. - 1992. —Т. 66. - № 6.
Умланд Ф., Янсен А., Тириг Д., Вюнш Г. Комплексные соединения
в аналитической химии. - М.: Мир, 1975.
Селеменев В.Ф., Хохлов В.Ю., Бобрешова О.В. и др. Физико­
химические основы сорбционных и мембранных методов выделе­
ния и разделения аминокислот. - М.: Стелайт, 2002.
Силин П.М. Технология сахара. - М.: Пищевая пром-сть, 1967.
Шамханов Ч.Ю. Получение и применение кератиновых продуктов
на основе биомодификации сырья мясной промышленности: тео­
рия и практика: Дисс. ... доктора техн. наук. - Воронеж: ВГТА,
2004.
Машковский М.Д. Лекарственные средства. Ч. II. - М.: Медицина,
1993.
Мальцев А.А. Молекулярная спектроскопия. - М.: МГУ, 1980.
Исакова Н.А., Фихтенгольц B.C., Красикова В.М. Методы исследо­
вания состава эластомеров. - Л.: Химия, 1974.
Фихтенгольц B.C., Золотарева Р.В., Львов Ю.А. Атлас ультрафио­
летовых спектров поглощения веществ, применяющихся в произ­
водстве синтетических каучуков. - Л.: Химия, 1969.
Schneider F., Schliephake D., Paleos I. Uber Farbstoffadsorption und Entfarbungsharzen // «International sugar Journal». - 1968. - V. 70. —№ 831.
Драгунов C.C. Гуминовые кислоты и их структура // Тр. Почвен.
ин-та им. Докучаева. - 1951. - Вып. 38.
Котова Г.А., Котов В.Б., Сорокина А.С. Глюкоамилаза микроорга­
низмов. - М., 1976.
Калунянц К.А., Голгер Г.И. Микробные ферментные препараты. М., 1979.
Илларионова Н.Г., Сергеев В.Р., Фирсов Л.М. Исследование вто­
ричной и третичной структуры глюкоамилазы Asp. amamori и ее
фермент-субстратного комплекса методами кругового дихроизма и
дифференциальной спектроскопии // Тезисы докл. IV Всесоюзной
конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков, 1981.
238
297. Полторак О.М., Чухрай Е.С. Физико-химические основы фермен­
тативного катализа. - М.: Высшая школа, 1971.
298. Торшин И.Ю., Полторак О.М., Чухрай Е.С. Расчет позиции атомов
водорода и геометрические критерии существования водородной
связи в белках // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Химия. - 1996. Т. 3 7 .-№ 4 .
299. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. - М.: Мир, 1983.
300. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты (в 3 томах). - М.: Мир, 1982.
301. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии фермента­
тивного катализа. - М.: Высшая школа, 1977.
302. Максимова Н.Б., Лысак В.А., Дображинецкая Е.В. и др. Биосинтез
биологически активных соединений ароматической природы мик­
роорганизмами // Выбраныя науковыя працы Беларускага Дзяржаунага Университэта. - Минск: БДУ, 2001. - Т. 7.
303. Костюк В.А., Потапович В.И., Владыковская Е.М. и др. Биофлавоноиды и их металлокомплексы: биологическая активность и пер­
спективы использования для создания лекарственных препаратов //
Выбраныя науковыя працы Беларускага Дзяржаунага Университэ­
та. - Минск: БДУ, 2001. - Т. 7.
304. Кухаренко Т.А. О молекулярной структуре гуминовых кислот //
Гуминовые вещества в биосфере. - 1993. - № 4.
305. Кононова М.М. Органическое вещество почвы. Его природа, свой­
ства и методы изучения. - М.: Изд-во АН СССР, 1963.
306. Александрова Л.Н. Органическое вещество почвы и процессы его
трансформации.-Л.: Химия, 1980.
307. Мистерский В., Логинов В. Исследование некоторых физико­
химических свойств гуминовых кислот // Почвоведение. - 1959. - № 2.
308. Славинская Г.В., Мирошникова З.П., Зенина Т.А. Изучение строе­
ния водных фульвокислот методом ИК спектроскопии // Теория и
практика сорбционных процессов. - Воронеж. - 1982. - Вып. 15.
309. Кузнецова Н.С., Славинская Г.В., Маркина М.И. Исследование
сорбции фульвокислот природных вод синтетическими сорбентами //
Там же. - Воронеж. - 1987. - Вып. 19.
310. Славинская Г.В. Физико-химические свойства фульвокислот при­
родных вод // Тез. докл. Всесоюз. конф. по коллоидн. химии при­
родных дисперсных систем. - Канев. - 1987.
311. Славинская Г.В. Физико-химическое обоснование и реализация
процессов удаления гумусовых кислот из водных растворов методом
препаративной хроматографии //Автореф.... докт. дисс. —М., 2003.
312. Ковалевский Д.В. Исследование структуры гумусовых кислот ме­
тодами спектроскопии ЯМР 'Н и 13С. // Дис. ... канд. хим. наук. М., 1998.
Литература
239
313. Екатеринина JI.H., Кухаренко Т.А. Исследование производных гу­
миновых кислот (К вопросу о механизме реакции с двухлористым
оловом) // Почвоведение. - 1971. - № 3.
314. Брехман И.И., Нестеренко И.Ф. Природные комплексы биологически
активных веществ. Сахар и здоровье человека// Л.: Наука, 1988.
315. Брехман И.И., Мочалова Д.П. Проблема сахара - варианты реше­
ния // Химия и жизнь. - 1983. - № 3.
316. Брехман И.И., Жарский В.Н. Желтый сахар // Пищевая промыш­
ленность. Сер 11. Сахар, пром-сть.: Научно-техн. реф. сб. ЦНИИТЭИПИЩЕПРОМ. - 1980. - Вып. 11;
317. Dorfiier R., Ferge Т., Kettrup A., Zimmermann R., Yeretzian Ch. RealTime Monitoring of 4-Vinylguaiacol, guaiacol, and phenol during cof­
fee roasting by Resonant Laser Ionization Time-of-Flight Mass Spec­
trometry// Agric. Food Chem. -2003. - V . 51.
318. Borrelli R.C., Mennella C., Barba F., Russo M. et al. Characterization of
coloured compounds obtained by enzymatic extraction of bakery prod­
ucts // Food and Chem. Toxicology. - 2003. - V. 41.
319. DelFAquila C., Ames I.М., Gibson G.R., Wynne A.G. Fermentation
of heated gluten systems by gut microflora // Tur Food Res.Technol. V. 217.
320. Kwak E.I., Young S. Lee, Murata М., Homma S. Effect of pH control
on the intermediates and melanoidins of nonenzymatic browning reac­
tion // Lebensm. - Wiss.u.-Nechnol. —2005. —V. 38.
321. Kwak E.I., Lim S.I. The effect of sugar amino acid, metal ion, and NaCl on
model Maillard reaction under pH control // Amino Acids. - 2004. - V. 27.
322. Glosl S., Wagner K.-H., Draxler A. et al. Genotoxicity and mutagenicity
of melanoidins isolated from a roasted glucose-glycine model in human
lymphocyte cultures, intestinal Caco-2 cells and the Salmonella typhimurium strains ТА 98 and ТА 102 applying the AMES test // Food and
Chem. Toxicology. - 2004. - V. 42.
323. Morales F.J., Femandez-Fraguas G., Jimenez-Perez S. Iron-binding abil­
ity of melanoidins from food and model systems // Food Chemistry. 2004. - V. 90.
324. Galligaris S., Manzocco L., Anese М., Nicoli M.C. Effect of heattreatment of the antioxidant and pro-oxidant activity of milk // Intemat.
Dairy Journal. —2004. - V. 14.
325. Sirianuntapiboon S., Zohsalam P., Ohmomo S. Decolorization of mo­
lasses wastewater dy Citeromyces sp. WR-43-6 // Process Biochem. 2004.1V . 39.
326. Raghukumar Ch., Mohandass C., Kamat S., Shailaja M.S. Simultaneous
detoxification and decolorization of molasses spent wach by the immo­
bilized white-rot fungus Flavodon flavus isolated from a marine habitat //
Enzyme and Microbial Technology. - 2004. - V. 35.
240
327. Inoue S., Noguchi М., Hanaoka Т., Minowa T. Organic Compounds Formed
by Thermochemical Degradation of Glucose-Glycine Melanoidins Using
Hot Compressed Water // Chem. Engin. Japan. - 2004. - V. 37. -№ 7.
328. Coca М., Garcia Т., Gonzalez G. et al. Study of coloured components
formed in sugar beet processing // Food. Chem. - 2004. - V. 86.
329. Valls-Belles V., Torres M.C., Muniz P., Boix L., Gonzales-Sanhose
M.L. The protective effects of melanoidins in adriamycin-induced oxida­
tive stress in isolated rat hepatocytes // Sci. Food. Agric. - 2004. - V. 84.
330. Sirianuntapiboon S., Phothilangka P., Ohmomo S. Decolorization of
molasses wastewater by a strain No. BP 103 of acetogenic bacteria //
Bioresource Technology. - 2004. - V. 92.
331. Shayegan J., Pazouki М., Afschari A. Continuous decolorisation of an­
aerobically digested distillery wastewater // Process Biochem. - 2005. V. 40.
332. Kumar P., Chandra R. Detoxification of Distillery Effluent through Ba­
cillus thuringiensis (MTCC4714) Enhanced Phytoremediation Potentioal of Spirodela polyrrhiza (L.) Schliden // Bull. Environ. Contam.
Toxicol.-2004.-V . 73.
333. Guimaraes C., Porto P., Oliveira R., Mota M. Continuous decolourisation of a sugar refinery wastewater in a modified rotating bioligycal
contactor with phanerochaete chrysosporium immobilized on polyure­
thane foam disks // Process Biochem. - 2005. - V. 40.
334. Mundt S., Wedzicha B.L. Comparative Study of the Composition of
Melanoidins from Glucose and Maltose // Agric. Food Chem. - 2004. V. 52.
335. Brun-Merimee S., Billaud G., Louarme L., Nicolas J. Effect of glu­
tathione and Maillard reaction products prepared from glucose or fruc­
tose with glutathione on polyphenoloxidase from apple.-ll. Kinetic
study and mechanism of inhibition // Food Chemistry. - 2004. - V. 84.
336. Schroeder H.A. The role of trace elements in cardiovascular diseas //
Med. Clin. N. Amer. - 1974. - V. 58. - № 2.
337. Остроухова JI.A., Черных E.A., Семенов A.A. О химическом соста­
ве желтого сахара // О биологической активности различных видов
сахара и промежуточных продуктов сахарного производства. —
Владивосток. - 1981.
338. Черных Е.А., Семенов А.А. Химический состав желтого сахара. I.
Выделение бис-(2К(-)-2-этилгексил)фтолата // Химия природных
соединений. - 1980. - № 2.
339. Kimura G., Okuda Н., Arichi S. Effects of non-sugar fraction in black
sugar on lipid and carbohydrate metabolism. Pt:l // Planta med. - 1984. № 6.
340. Kimura G., Okuda H., Shoji N. et al. Effects of non-sugar fraction in
black sugar on lipid and carbohydrate metabolism. Pt:2: New com­
Литература
241
pounds inhibiting elevating of plasma insulin // Planta med. - 1984. № 6.
341. Yudkin J. Pure, white and deadly: The problem of sugar. London, 1974.
342. Овчинникова T.B., Кудряшов А.П., Мажуль B.M. и др. О мембран­
ной активности гидрогумата - гуминового препарата из торфа //
Биологическ. науки. - 1991. - № 10.
343. Зубченко А.В., Олейникова А .Я. Влияние крахмальной патоки на
параметры роста кристаллов сахарозы // Изв. ВУЗов. Пищевая тех­
нология. - 1975. - № 1.
344. Carpenter B.F.G., Roberts E.J. Colorant Formation Under Refining
Conditions // The Sugar Journal. —1976. - V. 39. - № 1.
345. Брежнева T.A., Атаманова C.A., Сливкин А.И. и др. Особенности
выделения сапонинов из корнеплодов растений Beta vulgaris L II
Вестн. ВГУ. Сер.: Химия, биология, фармация. - 2004. - № 1.
346. Славинская Г.В., Топтунова Т.Е., Хромых А.Н. и др. Адсорбция
озонированных фульвокислот невской воды аминокислотами //
Сорцион. и хроматограф, процессы. - 2003. - Т. 3. - № 6.
347. Островский Д.И., Дмитриенко Л.В., Самсонов Г.В. Взаимодействие
инсулина с полиэлектролитами макропористой структуры // Изв.
АН СССР. Сер. хим. - 1973. - № 5.
348. Самсонов Г.В., Тростянская Е.Б., Елькин Г.Э. Ионный обмен.
Сорбция органических веществ. -J I.: Наука, 1969.
349. Шатаева Л.К., Кузнецова Н.Н., Елькин Г.Э. Карбоксильные катио­
ниты в биологии. - JL: Наука. - 1979.
350. Самсонов Г.В., Меленевский А.Т. Сорбционные и хроматографи­
ческие методы физико-химической биотехнологии. - JL, 1986.
351. Тулупов П.Е. Стойкость ионообменных материалов. - М.: Химия, 1984.
352. Valter V., Ciz К. Odbarvovaci Ionexy. V. Pixsobeni n6kterych factorii pri
statickem hodnoceni ionexu // Listy curovarickS. - 1959. - V. 75. - № 1.
353. Соколов М.И., Болдырев С.Ю., Шестаков A.C., Рудаков О.Б. Гельпроникающая хроматография смесей олиго-, ди- и моносахаридов //
Известия вузов. Пищевая технология. - 1999. - Вып. 5-6.
354. lanssen С. Vollentsalzung und organische Substancen // Mitt. Verein.
Grosskesselbesitzer. - 1959. - Bd. 60.
355. Saint-L6on R. Pollution des echangeurs d'ions, restauration de leurs
p ro p erties // Terres et eaus. - 1969. - V 22. - № 60.
356. Грановская Г.Л., Мазо A.A., Спирина А.Ф. и др. Применение акти­
вированных углей и ионитов для очистки природных вод от органи­
ческих веществ в процессе обессоливания // Тр. лаборатории ионо­
обменных процессов и сорбции. - Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та.,
1966. - Вып. 1.
242
357. Wiktorowski S., LegedZ E. Wykorzystame przemysliwych in staiacju
jonitowego odsalama do Padama organicznuch skladnicow wody //
Gosp. Wod. - 1980. - V 40. - № 8-9.
358. Kruithof J.C. Removal of organic contaminants from drinking water //
Aqua. - 1985.-№. 2.
359. Орлов Д.С. Химия почв. - М.: Изд-во МГУ, 1985.
360. Dickels К. Die Beseitigung von Huminsaure, Eisen und Ol aus
Ionenaustauschem // Energie (BRD). - 1961. - Bd. 13. - № 9.
361. Мазо А.А., Славинская Г.В., Кузнецова H.C. и др. О требованиях к
чистоте реагентов для ионообменного обессоливания воды на
предприятиях электронной техники // Электронная техника. Сер. 7,
Технология и организация производства, оборудование. - М.:
ЦНИИ «Электроника». - 1977. - № 6.
362. Прохоров. Ф.Г., Прохорова А.М. Опыт применения анионитов на
обессоливающих установках электростанций // Теплоэнергетика. 1963.-№ 3 .
363. Рустамов С.Б. Динамика ионообменной сорбции разновалентных
ионов при стационарном режиме // Теория ионного обмена и хро­
матографии. - М.: Наука, 1968.
364. Marchevska W. Moszynski Jan.Wyniki badari zdolnosci wymiennej
anionit ow metoda Martinoli // Przem. Chem. - 1970. - V. 49. - № 2.
365. Славинская Г.В. Применение асимптотического уравнения динами­
ки сорбции для расчета поглощения хлорид-ионов высокоосновным
анионитом при неполной регенерации // Журн. физ. химии. - 1993. —
Т. 67. - № 10.
366. Славинская Г.В., Селеменев В.Ф., Кондрина О.Ю. Прогнозирова­
ние выходной кривой сорбции триптофана при изменении концен­
трационно-гидродинамических условий процесса // Проблемы хи­
мии и химической технологии: Тез. докл. конф. - Воронеж, 1998.
367. Славинская Г.В. Расчет сорбции хлорид-ионов анионитом АВ-17-8
по асимптотическому уравнению динамики сорбции // Журн. физ.
химии. - 1992. - Т. 66. - № 3.
368. Славинская Г.В. Расчет технологических характеристик ОНанионирования воды на анионите АВ-17-8 по асимптотическому
уравнению динамики сорбции // Химия и технология воды. - 1993. Т. 15.-№ 6.
369. Славинская Г.В. Методика расчета выходных кривых ионообмена
по асимптотическому уравнению динамики сорбции // Химия и
технология воды. - 1993. - Т. 15. - № 4.
370. Кузьминых В.А., Чикин Г.А. Основы расчета процессов очистки
растворенных минеральных веществ от многокомпонентных при­
месей сильнодиссоциирующими ионитами // Теория и практика
Литература
371.
372.
373.
374.
243
сорбционных процессов. Межвуз. сб. науч. тр. - Воронеж: И зд-во
Воронеж, ун-та, 1983.-Вып. 16.
Славинская Г.В. Влияние гумусовых кислот на физико-химические
свойства катионита КУ-2х8 // Прикладная химия. - 2004. - Т. 77. Вып. 2.
Sheldon D. Strauss. Electrodialysis reversal enhances membrane dem ­
ineralization // Power. - 1985. - V 129. - № 1.
Славинская Г.В., Шапошник В.А., Пилкина О.И. Изменение элек­
трохимических свойств анионообменной мембраны М А-40 в вод­
ных растворах фульвокислот// Химия и технология воды. - 1989. Т. 11.—№ 9.
Bunnik Н.М. Ultrapure water in the microelectronics industry // Efflu­
ent and Water Treat. J. - 1986. - V 26. - № 1.
Содержание
Введение............................................................................................................ 3
Глава 1. Химизм процессов образования красящих
веществ в ходе свеклосахарного производства.....................6
Глава 2. Методы выделения, концентрирования и
фракционирования пигментов из природного
сырья....................................... ................................................. 17
2.1. Подготовка пигментов к анализу....................................... .......... 17
2.2. Хроматографические методы разделения и анализа
пигментов......................... ................ .............................................22
2.2.1. Разделение методом распределительной
хроматографией...................................................................... 22
2.2.2. Разделение методом тонкослойной
хроматографиии...................................................................... 25
2.2.3. Метод электрофоретического разделения............................. 26
2.2.4. Гельпроникающая хроматография......................................... 27
2.3. Определение физико-химических свойств пигментов.................30
2.3.1. Химический анализ................................................................ 30
2.3.2. Параметры, определяемые для пигментов методами
планарной хроматографии......................................................32
2.3.3. Определение заряда, пути пробега, скорости
перемещения, изоэлектрической точки и
электрокинетического потенциала меланоидиновых
пигментов................................................................................35
2.3.4. Определение молекулярной массы и радиуса
молекул пигментов методом гельпроникающей
хромато графии........................................................................ 38
2.3.5. Анализ пигментов спектрофотометрическим
методом в видимой и ультрафиолетовой областях
спектра.....................................................................................41
2.3.6. Определение функциональных групп и связей
в пигментах методом инфракрасной спектроскопии............45
Глава 3. Представления об образовании, строении и
свойствах меланоидиновых пигментов............................... 57
3.1. Генезис........................................................................................... 57
3.1.1. Растворы аминокислот........................................................... 59
3.1.2. Моносахариды (альдозы)....................................................... 85
3.1.3. Пектиновые вещества............................................................. 93
3.1.4. Образование меланоидинов....................................................96
Введение
245
3.2. Строение меланоидинов....................... ........................................... ЮЗ
3.2.1. Меланоидины сахарного производства.................................. 104
3.2.2. Меланоидины в производстве лизина.................................... 113
3.2.3. Меланоидины других аминокислотных производств..........131
3.2.4. Меланоидины производства лимонной кислоты.................. 134
3.2.5. Меланоидины ферментных производств............................... 145
3.2.6. Гуминовые кислоты и фульвокислоты природных вод..........153
3.3. Физиологические функции меланоидинов.................................... 162
Глава 4. Влияние пигментов на физико-химические
свойства ионообменных материалов...................................169
4.1. Взаимодействие меланоидинов сахарного производства
с анионитом АВ-17-2П..................................................................... 169
4.2. Взаимодействие пигментов аминокислотного
производства с ионитами...... ...........................................................179
4.3. Влияние гумусовых веществ на физико-химические
свойства ионообменных материалов..............................................195
4.3.1. Изменение физико-химических свойств катионита
КУ-2-8 при эксплуатации в промышленных
фильтрах....................................................................................... 196
4.3.2. Изменение физико-химических свойств анионитов
при эксплуатации в фильтрах смешанного действия...........202
4.3.3. Исследование влияния ГК и ФК на физико­
химические свойства анионита АВ-17-8................................ 205
4.4. Изменение физико-химических свойств ионообменных
мембран при взаимодействии с фульвокислотами..................... 208
Заключение................................................................................................215
Список терминов......................................................................................218
Л итература................................................................................................219
Научное издание
Селеменев Владимир Федорович
Рудаков Олег Борисович
Славинская Галина Владимировна
Дроздова Н аталья Владимировна
Пигменты пищевых производств
(м е л а н о и д и н ы )
Главный редактор О. В. Саламаха
Заместитель редактора Г. И. Елагин
Художественный редактор Н. И. Смирнова
Технический редактор О. Д. Хилиль
Художник А. В. Маслова
Подписано в печать 18.04.08. Формат 60x90 1/16.
Бумага офсет№ 1. Гарнитура «Таймс». Уел. печ.л 15,5. Уч-изд. л. 13,2.
Тираж 1ОООэкз. Заказ № 3 196.
Издательство «ДеЛи принт».
123181, г. Москва, а/я 42, тел. (495) 265-7145; www.deli.ru
Отпечатано в ООО ПФ «Полиграфист»
160001, г. Вологда, ул. Челюскинцев, 3.