На правах рукописи ХОХЛОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

На правах рукописи
ХОХЛОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА
ОСОБЕНОСТИ ВЛИЯНИЯ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКОГО
ФАКТОРОВ НА РЕПРОДУКТИВНУЮ СИСТЕМУ РАСТЕНИЯ
ТОМАТА LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL.
Специальность: 06.01.05 – селекция и семеноводство
сельскохозяйственных растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Краснодар – 2014
Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно-исследовательском
институте биологической защиты растений Россельхозакадемии в
лаборатории «Изучение и поддержание генетической коллекции томата» в
2008 – 2013 гг.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор,
академик РАН и РАСХН
Жученко Александр Александрович
Официальные оппоненты:
Щеглов Сергей Николаевич
доктор биологических наук, доцент
кафедры генетики, микробиологии и
биотехнологии ФГБОУ ВПО
«Кубанского государственного
университета», г. Краснодар
Зеленцов Сергей Викторович
доктор сельскохозяйственных наук,
заведующий лабораторией генетики и
иммунитета сои ГНУ ВНИИМК,
Россельхозакадемии
Ведущая организация:
ГНУ ВНИИ риса Россельхозакадемии
Защита диссертации состоится «25» сентября 2014 г. в 09.00 на
заседании диссертационного совета Д 220.038.03, созданного на базе
ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по
адресу: 350044, г. Краснодар, ул. им. Калинина, 13, (главный корпус, 1
этаж, комната 106), тел./ факс (8-861) 221-57-93.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО
«Кубанский государственный аграрный университет», по адресу 350044, г.
Краснодар, ул. им. Калинина, 13 и на сайте − http://www.kubsau.ru, с
авторефератом на сайтах: Высшей аттестационной комиссии −
http://www.vak.ed.gov.ru и ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный
аграрный университет» http://www.kubsau.ru.
Автореферат разослан
августа 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук, профессор
2
Цаценко Л.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследований.
Основные районы промышленного возделывания томата в России –
Краснодарский и Ставропольский края, Ростовская область, Нижнее
Поволжье. Большое количество промышленного возделывания этой
культуры сосредоточено в странах ближнего зарубежья Молдове, на
Украине, в Узбекистане, Азербайджане, Средней Азии (Авдеев Ю. И. и
др., 2008).
По данным ФАО (2013), в России в 2013 году произведено 2,13 млн.
тонн томатов на площади 147 тыс. га. Для производства экологичной
продукции данной культуры требуется соблюдение нескольких факторов:
технологии производства, сортового разнообразия, средовых условий и
устойчивости к эпифитотиям. На данный момент экологическим факторам
уделяется второстепенное значение, хотя задачи экологизации
производства постоянно декларируются в документах правительства. С
каждым годом увеличивается число выявленных вирусов, заражения
которыми вызывает ощутимые потери урожая и заметно ухудшает
качество сельскохозяйственной продукции. В южных районах нашей
страны поражаемость растений Tobacco mosaic virus (далее ВТМ)
повсеместно снижает урожайность плодов томата в 1,3-1,6 раза и более
(Авдеев Ю. И., 2004; Жученко А. А., 2008; 2011).
Решение проблемы видится в использовании биоразнообразия
генотипов растений томата включающие: культурные, полукультурные
сорта, дикорастущие и мутантные формы и т.д. Это позволяет расширить
спектр генетической изменчивости, даёт возможность получить
нетрадиционные формы растений томата с хозяйственно-ценными
признаками, а также наладить производство экологичной овощной
продукции овощеводства, путем создания новых устойчивых гибридов
растений томата к вирусным болезням.
Цель и задачи исследований. Цель исследований: оценка
морфологического и генетического потенциала гибридного материала
растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов
по качественным и количественным признакам.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
1.
Получить
гибриды
между
культурными
сортами,
дикорастущими видами и мутантными формами растений томата.
2.
Изучить морфологические особенности генотипов растений
томата под воздействием абиотических и биотического факторов.
3.
Провести пыльцевой анализ качества и количества пыльцевых
зерен у гибридов F1 растений томата.
3
4.
Установить характер проникновения ВТМ в растительную
клетку с помощью метода электронной микроскопии.
5.
Провести цитофотометрический анализ на количественное
содержание ДНК в ядре гибридных растений томата, пораженных ВТМ.
Научная новизна работы. В условиях Краснодарского края впервые
получены гибридные формы растений культурного томата с
дикорастущими видами (L. hirsutum var. glabratum C. H. Mull. и L.
esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh.) и мутантными формами (Mo
393; Mo 628; Mo 755). В результате внутри− и межвидовой гибридизации
получено 16 гибридных комбинаций между культурными сортами,
дикорастущими видами и мутантными формами растений томата.
Проведена морфологическая идентификация гибридного материла
по типу куста, длине междоузлия, высоте растений, типу соцветия,
проценту пораженности ВТМ, размеру и окраске цветка, форме и окраске
плода.
Впервые выявлен характер действия абиотических факторов, таких
как температура и удобрения, а также биотического фактора - поражение
ВТМ, на характеристики репродуктивной системы гибридных форм
растений томата.
Получены данные о фертильности, жизнеспособности и количестве
пыльцевых зерен у 16 гибридных комбинаций растений томата.
Впервые предпринята попытка установить характер действия ВТМ
на компоненты растительной клетки на основе данных методов
электронной микроскопии и цитофотометрии.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты
исследований являются вкладом в изучение репродуктивной системы,
гибридных комбинаций, растений томата, содержащих чужеродный
генетический материал, данных гибридных форм томата, под влиянием
действию различных доз минерального удобрения, температур и действию
ВТМ.
Изучены особенности формирования репродуктивной системы
растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов
Проведен пыльцевой анализ 16 гибридных комбинаций, выявлена
зависимость действия указанных факторов на качественные и
количественные характеристики пыльцевого зерна, что дало возможность
использовать пыльцевой тест как маркерную систему отбора генотипов,
устойчивых к действию абиотических и биотического факторов.
Методы, использованные в работе, могут быть востребованы для
проведения идентификационных работ по выявлению действия ВТМ на
растительную клетку.
В результате проведенных исследований созданы уникальные
гибридные комбинации межвидовых и внутривидовых форм растений
4
томата. Собран иллюстративный материал и коллекция фотообразов
пыльцевых зерен гибридных комбинаций растений томата, подвергшихся
влиянию абиотических и биотического факторов.
Материалы диссертационной работы используются в Кубанском
государственном аграрном университете при преподавании дисциплин
«Цитология» и «Генетический мониторинг» для студентов и магистров
агрономического факультета и факультета экологии.
Методология и методы исследования. В работе использованы
дикие виды, мутантные формы, культурные сорта растений томата, взятые
из генетической коллекции ГНУ ВНИИБЗР, созданной академиком
РАСХН и РАН А. А. Жученко, а также 16 гибридных комбинаций,
полученных непосредственно автором в период 2008-2011 гг. При
создании гибридных комбинаций использовалась стандартная методика
гибридизации. Пыльцевой анализ гибридных комбинаций растений томата
проводили по общепринятым методикам. Исследования с помощью
методов электронной микроскопии и цитофотометрии были проведены на
базе ВНИИСБ (г. Москва) по модифицированным методикам для данных
растительных объектов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1.
Гибридные формы, с чужеродными геномами дикорастущих
видов растений томата, характеризуются устойчивостью к ВТМ по
сравнению с другими гибридными комбинациями.
2.
Абиотические факторы, представленные различными дозами
удобрений и температур, оказывают достоверное влияние на
фертильность, жизнеспособность и количество пыльцевых зерен у всех
исследуемых генотипов растений томата.
3.
Гибридные комбинации F1 растений томата, пораженные ВТМ,
качественно различаются по гетерогенности, жизнеспособности и
количеству пыльцевых зерен.
4.
Биотический фактор, представленный вирусом табачной
мозаики, оказывает влияние на растительную клетку, меняет структуру
пыльцевого зерна, деформирует ее и вызывает изменение количества ДНК
в ядре клетки.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на:
Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и
специалистов «Молодые ученые агропромышленного комплекса
Поволжья» (г. Саратов, 2010); Международной конференции молодых
ученых и специалистов, посвященной 145-летию РГАУ – МСХА имени
К. А. Тимирязева (г. Москва, 2010); 6-ой Международной научнопрактической конференции «Биологическая защита растений как основа
экологического
земледелия
и
фитосанитарной
стабилизации
агроэкосистем» (г. Краснодар, 2010); Всероссийской научно-практической
5
конференции молодых ученых «Конкурентоспособная научная продукция
– АПК России» (г. Казань, 2011); Международной научно-практической
конференции «Современные мировые тенденции в производстве и
применение биологических и экологически малоопасных средств защиты
растений «Биологическая защита растений − основа стабилизации
агроэкосистем»
(г. Краснодар,
2012);
Международной
научнопрактической конференции «Наука и образование» и XXI веке» (г. Москва,
2013).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации
опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 2 в изданиях, рекомендованных
ВАК РФ.
Объем и структура работы. Работа изложена на 116 страницах
машинописного текста, включает 12 таблиц, 37 рисунков. Состоит из:
введения, восьми глав с описанием современного состояния проблемы на
основании проанализированных источников литературы, описанием
исходного материала и методов, используемых при решении поставленных
задач, экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов,
рекомендаций для селекционной практики. Список литературы включает
225 источника, в том числе 79 на иностранном языке.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В главе приводятся данные о влияние различных факторов на
репродуктивную систему растений томата. Представлены данные
цитогенетических исследований по выявлению влияния ВТМ на
репродуктивную систему растений томатов с помощью методов
электронной микроскопии и цитофотометрии.
2 МАТЕРИАЛ, МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ
ИССЛЕДОВАНИЙ
В работе использовали 23 различных генотипа растений
генетической коллекции томата ГНУ ВНИИБЗР: дикие виды (L. esculentum
var. racemigerum, L. hirsutum var. glabratum), мутантные формы (Мо)
растений томата: Мо 393 (с, m-2), Мо 628 (е, ful, hl, а), Мо 755 (wv, aa, d),
культурные сорта Марглоб и Гаидас в качестве контроля; 16 полученных
на их основе межвидовых и внутривидовых гибридов F1 растений томата.
Идентификацию диких видов растений томата осуществляли по
классификации А. А. Жученко и др. (1974), мутантных форм в
соответствии с каталогом Н. И. Бочарниковой (2011), зараженность
6
растения томата вирусом табачной мозаики по методике European
Handbook of Plant Diseases (1989).
Исследования проводили в период 2008 – 2013 гг. в лаборатории
«Изучение и поддержание генетической коллекции томата» и на
экспериментальной базе ГНУ ВНИИБЗР (г. Краснодар) (поле, теплица и
климакамера), а также в лаборатории клеточной биологии ГНУ ВИИСБ
(г. Москва). При выращивании растений в климакамерах (освещенность 20
кЛк; температура в дневные часы +25 ± 2о С, в ночные +18±2о С;
фотопериод – 16 часов день, 8 часов ночь; влажность почвы
поддерживалась на уровне 70-80 %) условия были оптимальными для
вегетации растений томата (Журбицкий З. И., 1968). Внесение удобрения
проводили по методике Б. А. Ягодина и др. (2007).
Гибридизацию проводили на первых трех кистях по общепринятой
методике (Веселовский И.А., 1965).
Количество пыльцы в цветке растений определяли по методике,
разработанной на кафедре РГАУ – МСХА им. К. А. Тимирязева (Иванова
С. В. и др., 1996). Для подсчета количества пыльцевых зерен использовали
камеру Горяева.
Жизнеспособность
пыльцы
определяли
на
искусственной
питательной среде (15 % раствор сахарозы, подкисленный 0,006 %
раствором борной кислоты) по общепринятой методике З. П. Паушевой
(1988). Пыльцу считали жизнеспособной, если пыльцевая трубка имела
длину равную диаметру пыльцевого зерна и более, при этом
анализировали 400-500 случайно выбранных пыльцевых зерен.
Для препаровальных работ в опыте использовали стереоскопический
микроскоп (бинокуляр) Olympus SZ61.
Цитологический анализ проводили на световом микроскопе Olympus
BX×41. Готовые препараты анализировали при увеличении объективов
10×0,25, 40×0,65.
Электронная микроскопия проводилась по методике Polowick et al.
(1992). Готовые препараты рассматривались на электронном микроскопе
марки Hitachi H − 500, при разрешении около 0,5 нм. (увеличении × 2500).
Документацию изображения проводили с помощью цифровой камеры
Kodak 489, обработку изоброжения проводили с помощью программы
Photo Shop 6.0.1 Update.
Цитофотометрия проводилась по методике Л. С. Агроскин и
др.(1976). Препараты были просмотрены на цитофотометре Opton, в
режиме: I=5мА, изображения были сфотографированы на цифровую
камеру Kodak 489, полученные образы обработаны с помощью программы
Adobe Photoshop CS (8.0).
Оценку достоверности различий между средними значениями
7
признаков образцов проводили с помощью рангового теста
(Тюрин В. В. 2010).
Для классификации наблюдений применяли кластерный анализ
(Олдендерфер М. С., и др., 1989).
3 ХАРАКТЕРИСТИКА МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА У ГИБРИДОВ
F1 РАСТЕНИЙ ТОМАТА ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ АБИОТИЧЕСКИХ
И БИОТИЧЕСКОГО ФАКТОРОВ
3.1 Морфологическая изменчивость гибридов F1 растений
томата под воздействием абиотических и биотического
факторов
У внутривидовых гибридов F1 растений томата проявление
фенотипических признаков: тип куста, длина междоузлия, высота
растений, тип соцветия, процент пораженности ВТМ, размер и окраска
цветка, форма и окраска плода, шло по материнскому компоненту,
представленному культурными сортами Marglob и Гаидас.
У межвидовых гибридов F1 наследование этих же признаков, шло по
отцовскому компоненту, в качестве которого использовались
дикорастущие виды. Процент поражения вирусом табачной мозаики у
межвидовых гибридов F1: Мо 393 × L. esculentum var. racemigerum; Мо 393
× L. hirsutum var. glabratum; Мо 628 × L. esculentum var. racemigerum; Мо
628 × L. hirsutum var. glabratum; Мо 755 × L. esculentum var. racemigerum;
Мо 755 × L. hirsutum var. glabratum; Marglob × L. hirsutum var. glabratum;
Marglob × L. esculentum var. racemigerum; Гаидас × L. hirsutum var.
glabratum; Гаидас × L. esculentum var. racemigerum составляет 40−45 %, в
отличие от остальных генотипов, процент поражения у которых был равен
50 % и более.
Из 16 гибридных комбинаций, полученных в ходе работы, только у
четырех гибридов F1 растений томата отмечено образование плодов, где в
качестве отцовской формы использовались дикорастущие виды.
3.2 Фертильность и жизнеспособность мужского гаметофита у
гибридов
F1
растений
томата
под
воздействием
абиотических и биотического факторов
Наибольшее достоверное влияние на фертильность пыльцевых зерен
у всех исследуемых генотипов оказали температура и совокупность
факторов – температуры и удобрение. Доля дисперсии соответственно
составила 61,3 и 27,3 %.
В работе установлено, что жизнеспособность пыльцевых зерен
зараженных растений томата при оптимальных условиях роста и развития
на искусственной питательной среде in vitro составляла 12-33 %. Оценка
8
эффектов различия генотипов, температур и фонов удобрений проведена с
помощью трехфакторного дисперсионного анализа.
В ходе дисперсионного анализа установлены статистически
достоверные
эффекты
изучаемых
факторов.
Для
показателя
жизнеспособности пыльцевых зерен преимущество имели температура −
40,2 % и удобрения − 19,5 %.
Вклад различий совместного влияния температур и фонов
минерального питания также был велик и составил 28,5 %. Влияние
генотипа оказалось незначительным, как по отдельному признаку (0,9 %),
так и по совместному (1,6 %; 0,3 %; 0,8 %).
3.3 Количество пыльцевых зерен у гибридов F1 растений томата
под воздействием абиотических и биотического факторов
Проведенные исследования показали статистически достоверные
различия для всех изучаемых факторов. Наибольшее влияние на признак
количество пыльцевых зерен оказывают различия между генотипами −
11,6 %. На взаимодействие факторов температуры и минерального
удобрения приходится − 16,7 %, а генотипа и температуры − 10,9 % от
общей изменчивости. Для данного показателя наиболее существенным
оказался эффект остаточной изменчивости, который составил 43 %. Таким
образом, при исследовании пыльцеобразующей способности у гибридов F1
растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов
установлено статистически достоверное влияние генотипа на количество
пыльцевых зерен − 11,6 %.
3.4 Классификация генотипов, подвергнутых влиянию разных
температур
Температура является важнейшим фактором, влияющим на
анализируемые признаки. Вклад различия температур для признака
фертильность составил 61,3 %, для признака жизнеспособность – 40,2 %, а
признака количество пыльцевых зерен − 5,7 %. Однако, для последнего
признака выявлен значительный эффект взаимодействия генотиптемпература – 10,9 %.
Характер температурных различий раскрывают результаты
множественного сравнения средних значений признаков, выполненные по
принципу рангового теста (таблица 1-3).
Полученные данные подтверждают, что наибольшее среднее
значение фертильности пыльцевых зерен у зараженных растений томата
ВТМ было в оптимальных условиях выращивания при +25 °С, и составило
− 48,3 %, при этом самые низкие показатели фертильности выявлены при
критической температуре +12 °С и они не превышали 1 %.
При температуре выращивания +30 °С, среднее значение показателя
составило − 31,8 %.
9
Таблица 1 – Результаты множественного рангового теста различия
среднего значения фертильности пыльцевых зерен растений томата,
пораженных ВТМ в условиях разных температур, ГНУ ВНИИБЗР, 2008 –
2013 гг.
Среднее значение,
Температура
Ранговый тест
%
+12°С
1,0
*
+30°С
31,8
*
+25°С
48,3
*
Примечание: Здесь и в других подобных таблицах расположение знака «*»
на разных вертикалях указывает на достоверность различия средних
значений
Наибольшее среднее значение жизнеспособности пыльцевых зерен
растений томата наблюдалось при +25 °С и составило 3,6 % и достоверно
отличалось от других средних значений 0,8 % и 2,4 % при +12 °С и +30 °С
соответственно.
Таблица 2 – Результаты множественного рангового теста различия
среднего значения жизнеспособности пыльцевых зерен растений томата,
пораженных ВТМ в условиях разных температур, ГНУ ВНИИБЗР, 2008 –
2013 гг.
Среднее значение,
Температура
Ранговый тест
%
+12°С
0,8
*
+30°С
2,4
*
+25°С
3,6
*
Наибольшее количество пыльцевых зерен в цветке растений томата
выявлено при температуре +25°С и составило 5,7 тыс. шт., это значение
достоверно отличается от значений при +12 °С и +30 °С.
Таблица 3 – Результаты множественного рангового теста различия
среднего значения количества пыльцевых зерен растений томата,
пораженных ВТМ в условиях разных температур, ГНУ ВНИИБЗР, 2008 –
2013 гг.
Среднее значение,
Температура
Ранговый тест
тыс. шт.
+12°С
5,1
*
+30°С
5,5
*
+25°С
5,7
*
10
Для выбора лучших генотипов, выращенных в условиях 25°C и 30°С,
проведена их классификация методом кластерного анализа (рисунок 1).
При разрезании кластерного дендрита по уровню сходства в 30 усл.
ед. генотипы разделяются на три кластера. В первый из них входит 5
генотипов: Гаидас × Мо 755, Marglob × Мо 628, Marglob × L. esculentum
var. racemigerum, Marglob × L. hirsutum. var. glabratum, Гаидас × Мо 393.
Во второй – 7 генотипов: Мо 755 × L. hirsutum var. glabratum, Мо 393 ×
L. esculentum var. racemigerum, Гаидас × Мо 628, Marglob × Мо 393, Мо
628 × L. hirsutum var. glabratum, Marglob × Мо 755, Гаидас. В третий
кластер вошло 6 генотипов: Гаидас × L. hirsutum var. glabratum, Мо 755 ×
L. esculentum var. racemigerum, Мо 628 × L. esculentum var. racemigerum,
Гаидас × L. esculentum var. racemigerum, Мо 393 × L. hirsutum var.
glabratum, Marglob.
10
слияния усл. ед.
Коэффициент
Linkage Distance
8
6
4
2
0
14 11 16 15 10
8
3
12
9
6
13
2
17
7
5
18
4
1
Рисунок 1 − Кластеризация генотипов, выращенных при температуре 25°C:
1) Marglob;
2) Гаидас;
3) Мо 393 × L. esculentum var. racemigerum;
4) Мо 393 × L. hirsutum var. glabratum; 5) Мо 628 × L. esculentum var.
racemigerum; 6) Мо 628 × L. hirsutum var. glabratum; 7) Мо 755 × L.
esculentum var. racemigerum; 8) Мо 755 × L. hirsutum var. glabratum; 9)
Marglob × Мо 393; 10) Гаидас × Мо 393; 11) Marglob × Мо 628; 12)
11
Гаидас × Мо 628; 13) Marglob × Мо 755; 14) Гаидас × Мо 755; 15)
Marglob × L. hirsutum. var. glabratum; 16) Marglob × L. esculentum var.
racemigerum; 17) Гаидас × L. hirsutum var. glabratum; 18) Гаидас × L.
esculentum var. racemigerum.
Проверка кластерного решения была выполнена нами с помощью
однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора
выступала кластерная принадлежность генотипов (таблица 4).
Согласно полученным данным, положительные результаты
дисперсионного анализа полностью подтверждают различия между
кластерами по всем признакам. Доля соответствующей дисперсии
варьирует от 47,7% до 77,9%.
Таблица 4 – Результаты однофакторного дисперсионного анализа
признаков с фактором кластер генотипов, выращенных при температуре
25°C, ГНУ ВНИИБЗР, 2008 – 2013 гг.
Доля в
Изменчивость
общей
2
df
mS
F
Fst
d
дисперсии,
%
Фертильность пыльцевых зерен, %
между
кластерами
остаточная
между
кластерами
остаточная
2
63,03
77,9
15
17,88
−
−
17,88
Жизнеспособность пыльцевых зерен, %
22,1
2
396,08
1,57
22,4
6,5
3,68
3,68
0,22
47,7
15
0,24
−
−
0,24
Количество пыльцевых зерен, тыс. шт.
52,3
между
2
1,64
9,2
3,68
0,24
57,6
кластерами
остаточная
15
0,18
−
−
0,18
42,4
Примечание: df – степень свободы; mS – средний квадрат; F – критерий
Фишера; Fst – критерий Фишера (табличный); d2 – дисперсия
Завершением дисперсионного анализа был ранговый тест, который
позволил выявить лучший кластер между средними значениями каждого
из изучаемых признаков (таблицы 5 − 7).
Генотипы, относящиеся к первому кластеру: Гаидас × Мо 755,
12
Таблица 5 – Ранговый тест средних значений фертильности пыльцевых
зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в условиях 25°C в
разных кластерах
Кластер
Среднее значение %
Ранговый тест
1
37,91
***
2
50,65
***
3
54,26
***
Marglob × Мо 628, Marglob × L. esculentum var. racemigerum, Marglob
× L. hirsutum. var. glabratum, Гаидас × Мо 393, характеризуются низкой
фертильностью, но имеют высокие показатели жизнеспособности и
количества пыльцевых зерен.
Таблица 6 – Ранговый тест средних значений жизнеспособности
пыльцевых зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в
условиях 25°C в разных кластерах
Кластер
Среднее значение %
Ранговый тест
2
3,12
***
3
3,92
***
1
4,03
***
Таблица 7 – Ранговый тест средних значений количества пыльцевых зерен
растений томата пораженных ВТМ, выращенных в условиях 25°C в разных
кластерах
Кластер
Среднее значение %
Ранговый тест
2
5,05
***
1
5,33
***
3
6,04
***
Генотипы второго кластера: Мо 755 × L. hirsutum var. glabratum, Мо
393 × L. esculentum var. racemigerum, Гаидас × Мо 628, Marglob × Мо 393,
Мо 628 × L. hirsutum var. glabratum, Marglob × Мо 755, Гаидас, имели
низкие показатели жизнеспособности и количества пыльцевых зерен, но
характеризовалась высокими значениями фертильности пыльцевых зерен
гибридов F1 растений томата.
В число лучших входят генотипы кластера 3 − Marglob, Мо 393 × L.
hirsutum var. glabratum, Мо 628 × L. esculentum var. racemigerum, Мо 755 ×
L. esculentum var. racemigerum, Гаидас × L. hirsutum var. glabratum, Гаидас
× L. esculentum var. racemigerum, характеризующихся высокими
показателями фертильности, жизнеспособности и количества пыльцевых
зерен.
13
Аналогичным образом был выполнен поиск лучших генотипов,
зараженных ВТМ, выращенных в условиях 30°С (риунок 2).
При разрезании кластерного дендрита по уровню сходства в 6 усл.
ед. также выделяется три кластера генотипов. В первый из них входит 6
генотипов: Marglob × Мо 755, Мо 628 × L. esculentum var. racemigerum,
Гаидас × Мо 628, Мо 628 × L. hirsutum var. glabratum, Мо 393 × L. hirsutum
var. glabratum, Мо 393 × L. esculentum var. racemigerum. Во второй только 3
генотипа: Marglob × Мо 393, Гаидас, Гаидас × Мо 393. В третий кластер
вошли остальные 9 генотипов: Marglob × L. esculentum var. racemigerum,
Мо 755 × L.hirsutum var. glabratum, Гаидас × L. hirsutum var. glabratum, Мо
755 × L. esculentum var. racemigerum, Marglob × L .hirsutum. var. glabratum,
Гаидас × Мо 755, Гаидас × L. esculentum var. racemigerum, Marglob × Мо
628, Marglob.
12
Linkage Distance
Коэффициент слияния усл. ед.
10
8
6
4
2
0
13
5
12
6
4
3
9
10
2
16
8
17
7
15
14
18
11
1
Рисунок 2 − Кластеризация генотипов, выращенных при температуре 30
ºС: 1) Marglob; 2) Гаидас; 3) Мо 393 × L. esculentum var. racemigerum; 4)
Мо 393 × L. hirsutum var. glabratum; 5) Мо 628 × L. esculentum var.
racemigerum; 6) Мо 628× L. hirsutum var. glabratum; 7) Мо 755 × L
esculentum var. racemigerum; 8) Мо 755 × L. hirsutum var. glabratum; 9)
Marglob × Мо 393; 10) Гаидас × Мо 393; 11) Marglob × Мо 628; 12) Гаидас
× Мо 628; 13) Marglob × Мо 755; 14) Гаидас × Мо 755; 15) Marglob × L.
14
hirsutum. var. glabratum; 16) Marglob × L. esculentum var. racemigerum; 17)
Гаидас × L. hirsutum var. glabratum; 18) Гаидас × L. esculentum var.
racemigerum.
В нашей работе установлены статистически значимые различия
между кластерами по признакам: фертильности, жизнеспособности и
количеству пыльцевых зерен. Результаты представлены в таблице 8.
Согласно полученным данным, результаты однофакторного
дисперсионного анализа подтверждают различия между кластерами по
всем признакам.
Доля влияния генотипов на признак фертильности пыльцевых зерен
в условиях +30 °C составила 51,2 %, на жизнеспособность 61,2 %,
количество пыльцевых зерен 80,9 %.
Таблица 8 − Результаты однофакторного дисперсионного анализа
признаков с фактором кластер генотипов, выращенных при температуре
+30°C
Доля в
Изменчивость
общей
df
mS
F
Fst
d2
дисперсии,
%
Фертильность пыльцевых зерен, %
между
2
84,21
7,30
3,68
12,11
51,2
кластерами
остаточная
15
11,54
−
−
11,54
48,8
Жизнеспособность пыльцевых зерен, %
между
2
0,07
10,44
3,68
0,01
61,2
кластерами
остаточная
15
0,01
−
−
0,01
38,8
Количество пыльцевых зерен, тыс. шт.
между
2
1,94
26,44
3,68
0,31
80,9
кластерами
остаточная
15
0,07
−
−
0,07
19,1
Итогом дисперсионного анализа был проведен ранговый тест,
который позволил выявить различий между средними значениями каждого
из изучаемых признаков (таблицы 9 − 11).
Таблица 9 – Ранговый тест средних значений фертильности пыльцевых
зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в условиях 30°C в
разных кластерах
15
Кластер
2
1
3
Среднее значение %
25,71
31,08
34,25
Ранговый тест
***
***
***
В результате анализа исследуемые образцы разделились на три
кластера. В первый кластер вошли генотипы: Marglob × Мо 755, Мо 628 ×
L. esculentum var. racemigerum, Гаидас × Мо 628, Мо 628 × L. hirsutum var.
glabratum, Мо 393 × L. hirsutum var. glabratum, Мо 393 × L. esculentum var.
racemigerum с высокими показателями жизнеспособности и количества
пыльцевых зерен 6,33 тыс. шт.
Во второй кластер вошли генотипы: Гаидас, Marglob × Мо 393,
Гаидас × Мо 393 характеризующиеся низкими показателями фертильности
и жизнеспособности и количеством пыльцевых зерен, 25,71 % и 2,18 %
соответственно.
Таблица 10 – Ранговый тест средних значений жизнеспособности
пыльцевых зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в
условиях 30°C в разных кластерах
Кластер
Среднее значение %
Ранговый тест
2
2,18
***
3
2,40
***
1
2,44
***
Таблица 11 – Ранговый тест средних значений количества пыльцевых
зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в условиях 30°C в
разных кластерах
Кластер
Среднее значение %
Ранговый тест
2
5,24
***
3
5,39
***
1
6,33
***
В третий кластер вошли генотипы: Marglob, Marglob × L. esculentum
var. racemigerum, Мо 755 × L.hirsutum var. glabratum, Гаидас × L. hirsutum
var. glabratum, Мо 755 × L. esculentum var. racemigerum, Marglob × L
.hirsutum. var. glabratum, Гаидас × Мо 755, Гаидас × L. esculentum var.
racemigerum, Marglob × Мо 628 характеризующиеся высокими
показателями
фертильности
пыльцевых
зерен − 34,25 %,
жизнеспособности − 2,44 % пыльцевых зерен растений томата.
Таким образом, можно сделать заключение, что в число лучших
генотипов вошли представители первого и третьего кластеров. Именно они
16
имели максимальные статистически достоверно отличающиеся значения
по признакам фертильность и жизнеспособность пыльцевых зерен
растений томата от генотипов второго кластера. По количеству пыльцевых
зерен растений томата был выделен один культурный сорт томата Marglob
и 8 гибридов F1: Мо 755 × L. esculentum var. racemigerum, Мо 755 × L.
hirsutum var. glabratum, Marglob × Мо 628, Гаидас × Мо 755, Marglob × L.
hirsutum. var. glabratum, Marglob × L. esculentum var. racemigerum, Гаидас ×
L. hirsutum var. glabratum, Гаидас × L. esculentum var. racemigerum,
вошедшие в третий кластер. В результате анализа можно сделать
заключение, что один культурный сорт и 2 генотипа: Гаидас, Marglob ×
Мо 393, Гаидас × Мо 393, вошедшие во второй кластер не являются
перспективными для дальнейшей селекционной работы.
Несовпадение результатов отбора генотипов при выращивании в
разных температурных условиях, является следствием выявленного в
трехфакторном
дисперсионном
анализе
достоверного
эффекта
взаимодействия генотипа и температуры. Это означает, что разные
генотипы по-разному реагируют на воздействие температур +25 °C и
+30 °С.
Определены статистически достоверные эффекты генотипа,
температуры и минерального питания на качественные и количественные
показатели пыльцы.
4 ВЛИЯНИЕ ВТМ НА ПЫЛЬЦЕВОЕ ЗЕРНО ГИБРИДОВ F1
РАСТЕНИЙ ТОМАТА
4.1 Влияние вируса табачной мозаики на пыльцевые зерна
растения томата
Влияние вируса табачной мозаики на пыльцевые зерна гибридов F1
растений томата пораженных ВТМ определяли с помощью электронной
микроскопии. Пыльцевое зерно гибрида F1 Мо 393 × L. hirsutum var.
glabratum пораженное ВТМ характеризовалось маленькими вакуолями,
хотя они похожи на нормальные, но большинство из них были сжаты.
Эндоплазматический ретикулум был разрежен. Митохондрии имели форму
от сферической до яйцевидной, пузырьки в многочисленных местах,
мембрана пыльцевого зерна деформирована (рисунок 3а).
Пыльцевое зерно у незараженного растения томата было правильной
формы, содержало небольшое ядрышко, вакуоли, которые были
расположены по периферии пыльцевого зерна (рисунок 3б).
Пыльцевое зерно, пораженное ВТМ, гибрида F1 Гаидас × L. hirsutum
var. glabratum имело ядро с неправильными очертаниями и ядрышко
17
Рисунок 3 – Гибрид F1 Мо 393 × L. hirsutum var. glabratum: а) пораженное
пыльцевое зерно: 1 – мелкие вакуоли, митохондрии сферической и
яйцевидной формы, 3 – разреженный ретикулум, 4 – деформированная
мембрана пыльцевого зерна; б) нормальное пыльцевое зерно.
сферической
формы.
Эндоплазматический
ретикулум
не
просматривался (рисунок 4а).
У незараженной формы ВТМ растений томата пыльцевое зерно
содержало эндоплазматический ретикулум, который представляет собой
систему плоских дисковидных замкнутых цистерн, располагающихся одна
над другой в виде стопки. В цитоплазме содержатся хорошо развитые
митохондрии. Ядро заключено в матрикс (рисунок 4).
Рисунок 4 – Гибрид F1 Гаидас × L. hirsutum var. glabratum: а) пораженное
пыльцевое зерно, стрелкой указано ядрышко неправильной формы, с
нечеткими очертаниями; б) нормальное пыльцевое зерно, стрелкой указано
ядрышко с четкими контурами.
18
Рисунок 5 – Гибрид F1 Marglob × L. esculentum var. racemigerum:
а) пораженное пыльцевое зерно, стрелками указаны липоиды зерна
неправильной формы; б) нормальное пыльцевое зерно: 1 – генеративное
ядро, 2 – вегетативное ядро.
В пораженном пыльцевом зерне гибрида F1 Marglob × L. esculentum
var. racemigerum, большинство органелл были повреждены, имели
неправильную форму. Стрелкой на рисунке 5а отмечены липоиды зерна
неправильной формы.
В непораженном пыльцевом ядре гибрида F1 растения томата
хорошо выражены генеративное и вегетативные ядра, хорошо развиты
митохондрии, большое количество вакуолей (рисунок 5б).
В пораженном пыльцевом зерне гибрида F1 Мо 755 × L. hirsutum var.
glabratum мембрана была повреждена и пронизана многочисленными
порами, плазменная мембрана отходила от стенок пыльцевого зерна,
наличие вакуолей, эндоплазматический ретикулум был разрежен,
митохондрии от сферической до яйцевидной формы, пузырьки в
многочисленных местах, (рисунок 6а).
Пыльцевое зерно у незараженной ВТМ формы растений томата было
правильной формы, содержащее генеративное и вегетативное ядра,
вакуоли, которые были распределены по всей цитоплазме, хорошо развиты
митохондрии (рисунок 6б).
Таким образом, выполненный цитологический анализ пыльцевых
зерен с помощью электронной микроскопия позволила показать
разнокачественность пыльцы по основным органоидам, которая является
причиной гетерогенности пыльцы у гибридных форм томата.
Отклонениями в строении пыльцевых зерен, пораженных вирусом
19
Рисунок 6 – Гибрид F1 Мо 755 × L. hirsutum var. glabratum: а) пораженное
пыльцевое зерно: 1 – разряженный ретикулум, митохондрии от
сферической до яйцевидной формы; б) нормальное пыльцевое зерно: 1вегетативное ядро, 2 - генеративное ядро, 3 - хорошо развитые
митохондрии.
Отклонениями в строении пыльцевых зерен, пораженных вирусом
ВТМ у гибридных комбинаций растений томата являлись: деформация
клеточной мембраны, изменение структуры органелл (митохондрий,
вакуоли, эндоплазматический ретикулум, а также ядрышек). Выявленные
повреждения структуры митохондрий при анализе дают объяснения
снижения жизнеспособности пыльцевых зерен, а именно - не происходит
рост пыльцевых трубок, что обуславливает снижение репродуктивного
потенциала, пораженных вирусом гибридных комбинаций растений
томата.
4.2 Влияние абиотических и биотического факторов на
количество ДНК в пыльцевом зерне растения томата
В нашей работе количество ДНК определяли методом быстрого
оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в
ней процессов.
Методика определения количества ДНК в клетке заключается в
выявлении рассеяния света лазерного луча, при прохождении через него в
струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить
представление о размерах и структуре клетки (Агроскин Л. С. и др., 1976).
Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции
химических соединений, входящих в состав клеточной стенки
(аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением
цитометрии (Хачатуров Ε. Н. 1980).
20
Методом цитофотометрии исследовалось генеративное ядро 2-х
клеточной пыльцы гибридов F1 Гаидас × L. hirsutum var. glabratum и
Marglob × L. esculentum var. racemigerum, подвергнутых воздействию ВТМ.
Полученные данные показали увеличение содержания ДНК в
генеративном ядре зрелой пыльцы у этих гибридов, что свидетельствует о
нестабильности генома гибридных комбинаций растений томата.
Объяснение этому процессу может быть связано с тем фактом, что при
создании гибридной формы в ядре сочетаются хромосомы обоих
родителей, относящихся к разным генотипам, которые при прохождении
процесса мейоза неравномерно расходятся к полюсам в стадии анафазы I.
При прохождении мейоза у отдаленных гибридов возможны генетические
изменения структуры хромосом, вызванные хромосомными мутациями
(Pound G. S., 1955; Yarwood C. E., 1963).
Известно, что пыльце гибридов F1 растений томата свойственна
гетерогенность, наличие стерильной и фертильной пыльцы, различие по
размерам пыльцевых зерен. Вместе с тем, ядра стерильной пыльцы
гибридов содержат меньшее количество ДНК, чем ядра фертильной
пыльцы. В то же время размер пыльцевых зерен коррелирует с уровнем
плоидности. Возможно, сочетание этих особенностей и приводит к
различию по содержанию ДНК.
Количественные данные свидетельствуют о том, что в опыте c
гибридом F1 Гаидас × L. hirsutum var. glabratum, зараженного ВТМ,
содержится большее количество ДНК, чем в контроле. В опыте с гибридом
F1 Marglob × L. esculentum var. racemigerum, наоборот количество ДНК
меньше, чем в контроле.
Если посмотреть распределение ДНК, то можно отметить, что во
всех вариантах количество ДНК варьирует от 1С до 1,5 и 2С. Причем,
количество ДНК зараженных растений гибридов F1 Гаидас × L. hirsutum
var. glabratum уменьшается до 1С ДНК и возрастает до 1,5С ДНК. В то же
время количество ДНК F1 Marglob × L. esculentum var. racemigerum
увеличивается 1С и 1,5 ДНК и снижается 2С ДНК. Это можно объяснить
более стабильным геномом гибрида F1 Гаидас × L. hirsutum var. glabratum
по сравнению F1 Marglob × L. esculentum var. racemigerum.
Существует несколько предположений о действии вируса ВТМ на
клеточные структуры. По мнению ряда авторов C. E. Yarwood (1960),
Warren R. L. (2007), репликация ВТМ происходит только в цитоплазме.
Однако, данные Бужоряну В. В. (1986), полученные при цитологических и
цитохимических исследованиях, позволяют предполагать, что первичным
местом репликации РНК этого вируса является, ядро. У гибридных
комбинаций растений томата пораженных ВТМ, количество ядерной ДНК
колеблется от 1С до 1,5 и 2С, что позволяет считать нахождение ВТМ в
цитоплазме клетки, при этом частично разрушает оболочку ядра.
21
ВЫВОДЫ
1.
У межвидовых гибридов F1 растений томата проявление
фенотипических признаков, таких как: тип куста, длина междоузлия,
высота растений, тип соцветия, процент пораженности ВТМ, базовые
характеристики цветка и плода проявляются в соответствии с генотипом
отцовской формы, в качестве которого выступают дикорастущие виды
томатов.
2.
Полученные межвидовые Гибриды F1: Мо 393 × L. hirsutum var.
glabratum, Мо 628 × L. hirsutum var. glabratum, Мо 755 × L. hirsutum var.
glabratum, Marglob × L. hirsutum var. glabratum, Гаидас × L. esculentum var.
racemigerum характеризовались устойчивостью к вирусу табачной
мозаики, процент поражения составлял от 40 до 45 %.
3.
Достоверно показано при изучении влияния абиотических
факторов на репродуктивную систему гибридных комбинаций растений
томата, что наибольшее влияние на фертильность пыльцевых зерен у всех
исследуемых генотипов оказали температура и совокупность факторов –
температуры и удобрения. Доля дисперсии соответственно составила
61,3 % и 27,3 %.
4.
Установлено, что вклад различий генотипов исследуемых
комбинаций по признаку жизнеспособность пыльцевых зерен крайне мал и
не превышал одного процента. Для этого показателя превалировала роль
средовых факторов – температурного режим и дозы удобрений. Так, вклад
различия температур составил – 40,2 %, а удобрений − 19,5 %. Вклад
различий совместного влияния температур и фонов минерального питания
также был велик и составил 28,5 %. Влияние генотипа оказалось
незначительным, как по отдельному признаку (0,9 %), так и по
совместному (1,6 %; 0,3 %; 0,8 %).
5.
Установлено статистически достоверное влияние генотипа на
количество пыльцевых зерен (11,6 %). На взаимодействие факторов
температуры и минерального удобрения приходится 16,7 %, а генотипа и
температуры – 10,9 % от общей изменчивости.
6.
В результате статистической обработки материала выявлено,
что оптимальной температурой для процесса микроспорогенеза у
гибридных комбинаций является температура 25°С, так как при этом
отмечаются достоверно высокие качественные (фертильность пыльцы
48,5 %, жизнеспособность 3,6 %) и количественные показатели пыльцы
(количество пыльцевых зерен 5,7 тыс. шт.).
7.
Доказана с помощью метода электронной микроскопии
разнокачественность и гетерогенность пыльцы у гибридных форм
растений томата.
22
8.
Выявлено, что к общим отклонениям в строении пыльцевых
зерен, зараженных ВТМ у гибридных комбинаций растений томата
относились: деформация клеточной мембраны, изменение структуры
органелл (митохондрий, вакуоли, эндоплазматического ретикулума, а
также ядрышек).
9.
Показано, что распределение ДНК в ядре пораженных
растений ВТМ варьирует, во всех вариантах в количестве от 1С до 1,5 и
2С. По показателю количества ДНК, выявлено, что ВТМ в ядре клеток
гибридных комбинаций растений томата не обнаруживается, по всей
видимости, он доходит до ядра клетки у растений томата, но внутрь не
проникает.
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ
1. Межвидовые гибриды F1: Мо 393 × L. hirsutum var. glabratum,
Мо 628 × L. hirsutum var. glabratum, Мо 755 × L. hirsutum var. glabratum,
Marglob× L. hirsutum var. glabratum, Гаидас × L. esculentum var.
racemigerum могут быть рекомендованы для дальнейшей селекционной
практики так как, они отличались устойчивостью к вирусу табачной
мозаики.
2. Гибридные комбинации, содержащие геномы диких видов
растений томатов: Мо 755 × L. esculentum var. racemigerum, Мо 755 ×
L. hirsutum var. glabratum, Marglob × Мо 628, Гаидас × Мо 755, Marglob ×
L. hirsutum. var. glabratum, Marglob × L. esculentum var. racemigerum,
Гаидас × L. hirsutum var. glabratum, Гаидас × L. esculentum var. racemigerum
могут быть использованы в дальнейшей селекционной работе как
перспективные формы по показателям фертильности и количеству
пыльцевых зерен в пыльнике при оптимальных и повышенных условиях
выращивания (+25 °C и +30 °C), что актуально для климатических условий
Краснодарского края.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Публикации в изданиях, рекомендуемых ВАК
Хохлова, А. А. Морфологическая оценка и репродуктивный
потенциал при воздействии вируса ВТМ на F1 гибриды растений
томата, полученные при отдаленной гибридизации / А. А. Хохлова //
Политематический сетевой электронный научный журнал
Кубанского государственного аграрного университета (Научный
журнал КубГАУ) [Электронный ресурс]. – Краснодар: КубГАУ,
2011. – №06(070). С. 503 – 512. – Режим доступа:
http://ej.kubagro.ru/2011/06/pdf/34.pdf
23
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Хохлова, А. А. Анализ количественных признаков гибридов F1
томатов под влиянием абиотических и биотических стрессоров / А.
А. Хохлова // Труды Кубанского государственного аграрного
университета. – Краснодар, 2012. – №5 (38). – С. 83–86.
Публикации в других изданиях
Хохлова, А. А, Создание исходного материала для изучения
мейотической рекомбинации у томатов, подвергшихся влиянию
вирусной инфекции / А. А. Хохлова, Н. А. Щербаков // «Молодые
ученые агропромышленному комплексу Поволжья». Всероссийская
научно-практическая конференция молодых учёных и специалистов.
Материалы докладов, сообщений. – ГНУ НИИСХ Юго-Востока. –
Саратов, 2010. – С. 135–137.
Хохлова, А. А. Оценка влияния биотического стресса на качество
пыльцы у растений томата / А. А. Хохлова // «Международная
конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 145летию РГАУ – МСХА имени К. А. Тимирязева». Сборник статей в 2х томах. − РГАУ – МСХА имени К. А. Тимирязева.−Москва, 2010. –
С. 143–147.
Юнусов, З. Р., Влияние гибридизации трансгенной и мутантной
форм томата на качество плодов / З. Р. Юнусов, А. А. Хохлова //
«Биологическая защита растений как основа экологического
земледелия и фитосанитарной стабилизации агроэкосистем». 6-я
Международная научно-практическая конференция. Материалы
докладов, сообщений. – ГНУ ВНИИ биологической защиты
растений. – Краснодар, 2010. – С. 676–680.
Хохлова, А. А. Устойчивость гибридов F1 томата к ВТМ/
А. А. Хохлова // «Конкурентоспособная научная продукция − АПК
России».
Материалы
Всероссийской
научно-практической
конференции молодых ученых. − Казань, 2011. − C 253–255.
Хохлова, А. А. Использование дикого вида томата L. hirsutum var.
glabratum в отдаленной гибридизации / А. А. Хохлова,
Н. А. Щербаков // «Современные мировые тенденции в производстве
и применение биологических и экологически малоопасных средств
защиты растений» 7-я Международная научно-практическая
конференция. Материалы докладов, сообщений. – ГНУ ВНИИ
биологической защиты растений. – Краснодар, 2012. – С. 378–380.
Хохлова, А. А. Изучение влияние ВТМ на пыльцевое зерно гибридов
томатов с помощью методов современной микроскопии /
А. А. Хохлова // «Наука и образование в XXI веке» Сборник
научных трудов по материалам Международной научнопрактической конференции. − Москва, 2013. − С.155–157.
24