Отчет ассистента кафедры цитологии и гистологии А. В

«Утверждаю»
___________________
Председатель Учёного Совета
И.А. Горлинский
Отчет
ассистента кафедры цитологии и гистологии А. В. Красиковой за первый год работы
по Программе поддержки молодых кандидатов
Санкт-Петербургского Государственного Университета
Тема: «Исследование центромерных районов хромосом и ассоциированных с ними структур
в ядрах растущих ооцитов птиц и амфибий»
Научный руководитель: Гагинская Елена Романовна
Научно-исследовательская работа
Научно-исследовательская работа выполнялась в лаборатории структуры и функции
хромосом биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета
в соответствии с утверждённым планом. За отчетный период получены следующие результаты.
1. Изучена структура центромерных районов хромосом и определено их значение для
пространственной организации хроматина в ядрах растущих ооцитов птиц и амфибий. Построена
модель доменной организации центромерных районов хромосом на стадии ламповых щеток.
Основные домены центромеры (домен контакта, содержащий прицентромерный гетерохроматин,
центральный, содержащий центромерный гетерохроматин, и кинетохорный) идентифицированы в
структуре ламповых щеток, особенности их молекулярного состава, морфологии и
функционирования охарактеризованы. В центральном домене центромер в ламповых щетках
птиц, наряду с белками комплекса когезин, обнаружен кинетохорный белок Mis12
(консервативный белок, важный для сборки кинетохоров). Вместе с тем, такой конститутивный
центромерный белок, как гистон CENP-A, не детектируется в хроматине ламповых щеток
методами иммуноцитохимии, а эндогенный белок CENP-C в ламповых щетках обнаруживает не
характерную для белков кинетохоров локализацию и распределяется по всей длине хромосом. Как
при этом происходит контроль сборки кинетохорных структур остается неизвестным. В ядрах
диплотенных ооцитов у двух представителей класса Амфибии (тритона Карелина и озерной
лягушки) в центромерных районах хромосом присутствуют гомологичные белковым телам птиц
структуры, которые не содержат хроматина. Мы полагаем, что белковые тела, формирующиеся в
центромерных районах хромосом на стадии ламповых щеток, необходимы для монополярной
ориентации сестринских кинетохоров в ходе первого мейотического деления.
2. Для секвенированной части генома домашней курицы разработан алгоритм
компьютерного анализа последовательностей, формирующих центромерные районы хромосом,
который может быть адаптирован и для других видов позвоночных животных. Предложенный
подход позволил выявить в геноме курицы как ранее известные сателлитные последовательности,
так и новые повторы. В частности, на хромосоме 24 был обнаружен GC-богатый тандемный
повтор с повторяющейся единицей длиной 28 п.н., который мы назвали PO28. ПЦР-анализ
геномной ДНК курицы с использованием праймеров, специфичных к последовательности РО28,
подтвердил наличие этого повтора в геноме курицы и его тандемную организацию.
3. Проведен анализ транскрипции сателлитной ДНК на ламповых щетках курицы и
перепела на примере сателлитов с длиной повторяющейся единицы 41 пн. Ранее мы показали, что
некоторые из этих повторов могут считываться с обеих нитей ДНК, причем разные нити
считываются в разных петлях (Krasikova et al., 2006; Deryusheva et al., 2007). Компьютерный
анализ доступных в базах данных генома курицы клонов, содержащих сателлитные повторы CNM
и PO41, позволил сделать ряд существенных обобщений относительно механизмов регуляции
транскрипции сателлитных ДНК. Впервые предложен механизм инициации транскрипции
сателлитов с помощью РНК-полимеразы II с промоторов LTR-ретротранспозонов, расположенных
в массивах некодирующей ДНК.
Рассматривая вопрос о механизмах транскрипции сателлитной ДНК в ооцитах, следует
отметить, что процессинг вновь синтезируемых транскриптов происходит ко-транскрипционно
(Neugebauer, Roth, 1997). Ранее было обнаружено, что в отличие от транскриптов,
синтезирующихся на подавляющем большинстве латеральных петель ламповых щеток, РНК,
считанная с повторов длинной 41 пн, не подвергается сплайсингу с участием мяРНП. Вместе с
тем, РНП-матрикс боковых петель, содержащий С-богатые транскрипты повторов CNM и РО41,
обогащен белком К гетерогенных ядерных РНП (Deryusheva et al., 2007). Характерные свойства
РНП-матрикса петель, транскрибирующих сателлитную ДНК 41 пн (отсутствие сплайсинговых
мяРНП в матриксе и содержание некоторых типов белков процессинга РНК), напоминают
свойства ядерных «стресс-телец» и «омега-спеклов» (Jolly, Lakhotia, 2006). Имея ввиду, что
формирующийся ко-транскрипционно РНП-матрикс латеральных петель ламповых щеток может
соответствовать внутриядерным доменам, обогащенным определенными классами гяРНП, мы
провели иммунофлуоресцентное исследование белков гяРНП K, L и C1/C2, а также фактора
сплайсинга SC35 и белков мяРНП в интактных ядрах растущих ооцитов птиц с помощью
конфокального микроскопа. Методика фиксации и иммуноокрашивания микрохирургически
изолированных из растущих ооцитов птиц зародышевых пузырьков, полностью сохраняющая их
морфологию, предложена нами впервые. В результате, накопление определенных белков гяРНП
обнаружено только на тех латеральных петлях, где происходит синтез и ко-транскрипционный
процессинг РНК сателлитных повторов.
Судьба транскриптов сателлитных повторов, синтезируемых в ходе оогенеза, в настоящее
время все еще не ясна. Однко, полученные результаты позволяют предложить новое объяснение
биологического значения феномена хромосом типа ламповых щеток, основанное на анализе
механизмов
регуляции
транскрипции
высокоповторяющихся
некодирующих
последовательностей ДНК. Согласно выдвигаемой гипотезе, синтезируемые на стадии ламповых
щеток транскрипты сателлитных повторов запасаются в ооците в виде длинных двунитевых
молекул, которые на ранних стадиях эмбриогенеза, в отсутствие собственной синтетической
активности хромосом, служат источником малых интерферирующих РНК (siRNA), в частности
необходимых для формирования прицентромерного гетерохроматина и когезии сестринских
центромер.
4. Исследовали архитектуру эукариотического ядра и динамику специализированных
внутриядерных структур в женских половых клетках. Метод конфокальной лазерной
сканирующей микроскопии впервые применен для исследования архитектуры ядра в растущих
ооцитах. Показано, что, в отличие от ооцитов амфибий, в ядрах ооцитов домашней курицы,
японского перепела и зяблика отсутствуют экстрахромосомные домены, обогащенные РНК.
Проведено компьютерное моделирование трехмерной организации хроматина и внутриядерных
доменов, участвующих в регуляции транскрипции и созревания РНК. Обнаружено, что в
растущих ооцитах домашней курицы и японского перепела не сохраняется характерное для
соматических клеток радиальное распределение хромосом относительно центра ядра:
обогащенные генами микрохромосомы не имеют преимущественной локализации во внутренней
части ядра. Полученные данные открывают перспективы для дальнейших исследований в этой
области с использованием методов микроинъекций и прижизненного наблюдения флуоресцентномеченных молекул.
Участие в других проектах:
1) соисполнитель гранта РФФИ 05-04-48252-а «Особенности структурной организации и
функционирования генома на стадии ламповых щеток в ооцитах птиц» (2005-2007 гг);
2) соисполнитель гранта РФФИ 08-04-01328-а «Ядро растущего ооцита: динамика
внутриядерных структур и закономерности функционирования генома» (2008-2010 гг);
3) соисполнитель гранта РФФИ 08-04-00493-а «Сравнительная цитогенетика птиц: анализ
кариотипов представителей отряда Galliformes с использованием высокоразрешающего
генетического картирования на гигантских хромосомах - ламповых щетках» (2008-2010 гг).
Публикации за отчетный период
По результатам исследования опубликовано 11 печатных работ, в том числе статья в
журнале Chromosoma (Springer):
1) Deryusheva S., Krasikova A., Kulikova T., Gaginskaya E. Tandem 41 bp repeats in chicken and
Japanese quail genomes: FISH mapping and transcription analysis on lampbrush chromosomes //
Chromosoma 2007. V. 116: 519-530.
2) Derjusheva S.E., Krasikova A.V., Kulikova T.V., Gaginskaya E.R. Transcription of satellite DNA in
oocytes at the lampbrush stage: Immunofluorescent and cytogenetic analysis // Цитология 2007.
Т.49, №9. С. 810.
3) Красикова А.В., Дерюшева С.Е., Гагинская Е.Р. Анализ последовательностей ДНК в
центромерных районах хромосом птиц методами in silico // Цитология 2007. Т.49, №9. С. 760761.
4) Красикова А.В., Дерюшева С.Е., Сайфитдинова А.Ф., Гагинская Е.Р. Центромерные районы
хромосом и пространственная организация генома в растущих ооцитах // Цитология 2007.
Т.49, №9. С. 761-762.
5) Куликова Т.В., Злотина А.М., Красикова А.В., Дерюшева С.Е., Гагинская Е.Р. Структуры,
содержащие поли(А)+ РНК в ядрах ооцитов на стадии ламповых щеток // Цитология 2007.
Т.49, №9. С. 765-766.
6) Krasikova A., Deryusheva S., Kulikova T., Gaginskaya E. Centromere regions of chromosomes in the
lampbrush phase // Chromosome Research 2007. V. 15, Suppl. 2. P. 63.
7) Krasikova A., Derjusheva S., Gaginskaya E. Centromere regions and spatial chromosome
organization in growing oocytes // Proceedings of the 20th Wilhelm Bernhard Workshop on the Cell
Nucleus, 27-31 August 2007, St. Andrews, Fife, Scotland. Session 1, DNA/Chromatin.
8) Deryusheva S., Krasikova A., Kulikova T., Gaginskaya E. Chromatin-associated domains containing
satellite RNA and hnRNP proteins in growing avian oocytes // Proceedings of the 20th Wilhelm
Bernhard Workshop on the Cell Nucleus, 27-31 August 2007, St. Andrews, Fife, Scotland.
9) Kulikova T., Deryusheva S., Zlotina A., Krasikova A., Gaginskaya E. Telomere-associated structures
on avian lampbrush chromosomes are enriched with poly(A)+RNA // Abstract Book of the
EMBO/FEBS Conference on Nuclear Structure and Dynamics, 1-5 September 2007, Montpellier,
France. P-072.
10) Красикова А.В. Архитектура ядра в растущих ооцитах птиц // Молодые ученые –
промышленности Северо-Западного региона: Материалы конференций Политехнического
симпозиума 2007 года. СПбГПУ, 2007. С. 178.
11) Василевская Е.В., Красикова А.В. Локализация и исследование транскрипции генов гистонов
на хромосомах типа ламповых щеток домашней курицы (Gallus gallus domesticus) // Молодые
ученые – промышленности Северо-Западного региона: Материалы конференций
Политехнического симпозиума 2007 года. СПбГПУ, 2007. С. 129-130.
Приняты к печати три работы:
12) Zlotina A., Daks A., Galkina S., Deryusheva S., Krasikova A., Crooijmans R., Groenen M.,
Gaginskaya E. High-resolution comparative FISH mapping on chicken and Japanese quail lampbrush
chromosomes // Chromosome Res. Suppl. 2008 (в печати).
13) Krasikova A., Vasilevskaya E., Maslova A., Yurgenis A., Radaev A., Gaginskaya E. Nuclear
architecture in growing avian oocytes: three-dimensional genome organization and functional
compartmentalization // Chromosome Res. Suppl. 2008 (в печати).
14) Krasikova A., Gaginskaya E. A novel integrative approach for the investigation of highly repetitive
sequences // Proceedings of the 6th International conference on BGRS, June 2008, Novosibirsk,
Russia (в печати).
Участие в работе международных конгрессов и симпозиумов
Материалы исследования были представлены на международной Конференции,
посвященной юбилею Института цитологии РАН совместно со Съездом Российского общества
клеточной биологии (Санкт-Петербург, Россия), на 16-ой Международной конференции по
хромосомам (Амстердам, Нидерланды), на 20-м симпозиуме им. В.Бернара (Сэнт-Эндрюс,
Шотландия), а также на Политехническом симпозиуме для молодых ученых Северо-Западного
региона (Санкт-Петербург, Россия).
Педагогическая работа
Педагогическая нагрузка выполнена в полном объёме. В октябре 2007 г. проведены
практические занятия для студентов 1 курса магистратуры биолого-почвенного факультета
СПбГУ в ЦКП «Хромас» при лаборатории структуры и функции хромосом по курсу «Практикум
по структурному и молекулярному анализу биологических систем» (60 часов).
В декабре 2007 г. прочитана лекция на тему «Функции некодирующей РНК» в рамках
курса лекций «Организация интерфазного ядра» для студентов 1 курса магистратуры кафедры
цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета СПбГУ (2 часа).
В течение 2007-2008 г.г. осуществляла научное руководство:
1) студентом бакалавриата кафедры цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета
СПбГУ Василевской Еленой Владимировной (тема выпускной квалификационной работы –
«Исследование внутриядерных структур, содержащих факторы процессинга пре-мРНК, в
растущих ооцитах птиц отряда Galliformes»),
2) студентом 1 курса магистратуры кафедры цитологии и гистологии биолого-почвенного
факультета СПбГУ Ходюченко Татьяной Александровной (тема исследования –
«Функциональная компартментализация ядра в растущем ооците: сравнительное исследование
телец Кахала у птиц и амфибий»),
3) стажером кафедры цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета СПбГУ Масловой
Антониной Владимировной (цель стажировки – выполнение исследования на тему
«Гигантские ядра из растущих ооцитов японского перепела как модель для анализа
трехмерной организации генома»).
Отчёт заслушан и утверждён на заседании кафедры цитологии и гистологии биологопочвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета. Протокол N 7 от
«15» мая 2008 г.