На правах рукописи Ломакин Алексей Юрьевич РОЛЬ
реклама
На правах рукописи Ломакин Алексей Юрьевич РОЛЬ ДИНАМИКИ МИКРОТРУБОЧЕК И СТРУКТУРЫ ИХ СЕТИ В ОРГАНИЗАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА 03.00.03 – молекулярная биология 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в департаменте клеточной биологии Медицинской школы Университета Коннектикута (США). Научный руководитель: доктор биологических наук Надеждина Елена Сергеевна Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Родионов Владимир Иванович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Зацепина Ольга Владимировна доктор биологических наук Глушанкова Наталия Александровна Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН Защита диссертации состоится « » декабря 2009 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992 г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан « Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук » ноября 2009 г. Крашенинников И.А. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Среди трех известных в настоящий момент типов цитоскелетных структур (микрофиламенты, промежуточные филаменты, микротрубочки) особенно важное место занимает система микротрубочек. Эти цитоскелетные элементы играют ключевую роль в механизмах клеточного деления, активного транспорта органелл по цитоплазме, а также миграции клеток по субстрату. Нарушения функций микротрубочек лежат в основе многих патологических процессов, в том числе опухолевой трансформации и различных нейродегенераций (Alberts et al., 2007). В большинстве клеток животных микротрубочки располагаются в цитоплазме в виде радиальной сети с фокусом схождения в точке вблизи ядра, называемой центром их организации. Выраженность радиальной организации сети микротрубочек бывает различной. Так, для культивируемых меланофоров характерна радиально-симметричная система микротрубочек, в то время как в культивируемых эпителиальных и фибробластоподобных клетках сеть микротрубочек устроена довольно хаотично. Так или иначе, практически все микротрубочки в клетках растут из центров организации так называемыми плюс-концами к периферии, а их минус-концы остаются собранными в центре (Бураков, Надеждина, 2006). Таким образом, сеть микротрубочек анизотропна, что используется клеткой для определения разных направлений транспорта органелл в цитоплазме. Транспорт вдоль микротрубочек осуществляется при помощи моторных белков – механохимических АТФаз, принадлежащих к двум суперсемействам: динеинам и кинезинам. Связываясь одним концом молекулы с микротрубочкой, а другим – с переносимым грузом, кинезины, как правило, перемещают свой груз к плюс-концу микротрубочки, а динеины – к ее минус-концу (Holzbauer, Valle, 1994; Schroer, 1994; Vale, Fletterick, 1997). В системах с хаотичной организацией микротрубочек преобладает хаотическое движение органелл, целью которого является объединение друг с другом различных клеточных компартментов. Напротив, в ситуации с радиальной системой микротрубочек доминирует направленный транспорт к центру или к периферии клетки. Исследования последних лет показали, что многие органеллы в клетке несут на себе моторы обоих знаков, что определяет их движение по микротрубочкам как двунаправленное. Переключение активности одного из моторных белков в составе комплекса с органеллой может изменять вектор движения таких органелл; это явление лежит в основе координации различных транспортных направлений в клетке. Двунаправленный транспорт вдоль микротрубочек и участие в нем конкретных моторных белков, а также механизмы их координации наиболее четко охарактеризованы для мембранных органелл – митохондрий и меланосом – в клетках позвоночных. Однако транспорт немембранных компонентов клетки, например, рибонуклеопротеидных (мРНП) частиц, охарактеризован значительно хуже и описан, в основном, в специфических типах клеток – ооцитах и нейронах. Традиционно микротрубочкам в организации внутриклеточного транспорта отводится роль «рельсов», вдоль которых моторные белки перевозят органеллы. Тем не менее, это представление кажется односторонним, ибо микротрубочки – не застывшие арматурные элементы, а вполне динамичные образования. Большинство микротрубочек в 3 клетке на плюс-концах постоянно претерпевают чередующиеся фазы роста и укорочения, что в целом делает систему микротрубочек динамичной. Таким образом, распределение органелл в клетке в каждый данный момент, по-видимому, является статистическим результатом сочетания активных перемещений органелл по микротрубочковым путям и динамики самих этих путей. Но вклад динамики микротрубочек в общую картину внутриклеточного транспорта до настоящего времени не исследовался. Было высказано предположение о том, что динамичные микротрубочки, постоянно собираясь и разбираясь, как бы сканируют внутриклеточное пространство своими плюсконцами в поисках транспортируемых органелл (так называемая модель «поиска и захвата» (Kirschner, Mitchison, 1986)). Белки, специфически накапливающиеся на плюсконцах микротрубочек, могут временно «приклеивать» к микротрубочкам органеллы, расположенные на периферии, и тем самым способствовать началу их динеин-зависимого движения по микротрубочкам к центру клетки (Vaughan, 2004). Экспериментальные данные в пользу этой модели были получены, в основном, при наблюдении взаимодействий динамичных микротрубочек веретена деления с митотическими хромосомами (Tirnauer et al., 2002). Нарушение функций белков, локализованных на плюс-конце микротрубочки, приводило к потере контакта между микротрубочкой и кинетохором хромосомы. Это в конечном итоге служило причиной неравномерной сегрегации генетического материала в митозе (Draviam et al, 2006). Однако существование феномена «поиска и захвата» и его молекулярные механизмы в интерфазных клетках остаются практически не изученными. Все вышеизложенное обусловило актуальность настоящего исследования и определило его цель и задачи. Цель работы: диссертационное исследование ставило своей основной целью выяснение влияния микротрубочек и их динамики на внутриклеточный транспорт органелл в клетках с различной организацией микротрубочек в интерфазе – радиальной или хаотичной. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. Изучить влияние ингибирования динамики микротрубочек на внутриклеточный транспорт меланосом в культивируемых меланофорах Xenopus laevis с радиальной системой микротрубочек. 2. Провести детальные видеонаблюдения за контактами плюс-концов микротрубочек c меланосомами во время активации динеин-зависимого транспорта. 3. Установить роль белков плюс-концов микротрубочек (EB1, CLIP170, p150 Glued) в «захвате» меланосом микротрубочками. 4. Охарактеризовать транспорт цитоплазматических мРНП стрессовых гранул и проанализировать зависимость этого процесса от микротрубочек и их динамики в культивируемых клетках HeLa с хаотичной системой микротрубочек. 5. Провести детальные видеонаблюдения за совместным поведением стрессовых гранул и микротрубочек в клетках. 6. Установить участие микротрубочек в разборке стрессовых гранул. Научная новизна и практическая значимость работы. В работе получены оригинальные, мирового уровня результаты, позволяющие выявить физиологическую роль явления динамической нестабильности микротрубочек в интерфазной клетке: 4 глобальная динамика плюс-концов микротрубочек является определяющим фактором в осуществлении синхронного динеин-зависимого транспорта мембранных органелл в клетках с радиальной системой микротрубочек. Показано, что когда плюс-концы растущих микротрубочек контактируют с меланосомами, то меланосомы, временно заякоренные в результате контакта, приступают к минус-концевому транспорту вдоль микротрубочки. Это первое наблюдение об использовании интерфазной клеткой механизма «поиска и захвата», некогда предложенного для объяснения способов взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками веретена деления в митозе. Кроме того, в настоящем исследовании впервые выявлено участие белков, специфически аккумулирующихся на плюс-концах микротрубочек (+TIPs), в осуществлении временных контактов между микротрубочкой и транспортируемой органеллой. Впервые продемонстрирована роль белка CLIP170 в осуществлении механизма «поиска и захвата» меланосом. Также, впервые показано функциональное значение EB1-зависимого привлечения CLIP170 на плюс-конец микротрубочки. Впервые показана ассоциация мРНП стрессовых гранул с клеточными микротрубочками. Впервые описан и охарактеризован внутриклеточный транспорт стрессовых гранул и его зависимость от системы микротрубочек. Показано, что динамика микротрубочек не играет существенной роли в транспорте стрессовых гранул. Впервые продемонстрировано участие микротрубочек в процессе диссоциации стрессовых гранул. Выяснение механизма взаимодействия микротрубочек с транспортируемыми грузами может оказаться полезным не только для понимания функций микротрубочек во внутриклеточном транспорте, но и для поиска фармакологических мишеней в патологически измененных клетках, с нарушенной функцией внутриклеточного транспорта. Разработанные методические подходы к наблюдению и анализу движения меланосом и стрессовых гранул могут быть использованы для изучения внутриклеточного транспорта других органелл. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в учебных лекционных и практических курсах по молекулярной биологии клетки. Апробация работы. Диссертационная работа прошла апробацию на объединенном заседании ученого совета факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ и отдела функциональной биохимии биополимеров НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ 15 октября 2009 г. Результаты работы были представлены на семинаре департамента системной биологии медицинской школы Гарвардского Университета (Бостон, США, 2009), на семинаре департамента клеточной биологии медицинской школы Университета Коннектикута (Фармингтон, США, 2009). Материалы диссертационного исследования послужили основой для докладов на следующих конференциях: - 49ая Ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (ASCB) (Сан-Диего, США, 2009); - Гордоновская научная конференция «Подвижные и сократимые системы» (НьюХэмпшир, США, 2009); - 48ая Ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (ASCB) (Сан-Франциско, США, 2008); 5 - Международный симпозиум «Биологическая подвижность: современные достижения и перспективы» (Пущино-на-Оке, Россия, 2008); - Международная конференция «Биосинтез белков, их структура и функции» (Пущино-наОке, Россия, 2007, 2008); - IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008); - Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов2008» (Москва, Россия, 2008); - XIX Зимняя молодежная научная школа-конференция «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2007); - Летняя объединенная конференция Американского общества клеточных биологов и Европейского форума по исследованию цитоскелета (ASCB/ECF) (Дижон, Франция, 2007); - 47ая Ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (ASCB) (Вашингтон, США, 2007). Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 14 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа написана и оформлена по традиционному плану. Рукопись включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 73 рисунка. Список литературы включает 237 наименований. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для достижения поставленной цели и решения задач настоящей работы использовался комплекс методов. Культивирование клеток. В работе использовали культивируемые in vitro клетки карциномы шейки матки человека HeLa и иммортализованные меланофоры из кожи Xenopus laevis. Культуры клеток HeLa выращивали в среде DMEM/F-12 (“Панэко”) с добавлением 10% бычьей эмбриональной сыворотки (“Биолот”) и 100×10 -6 г/мл гентамицина (“Sigma”). Культуры поддерживали при температуре 37 0C в атмосфере насыщенных водяных паров с 5% содержанием CO2. Культуры меланофоров выращивали в среде L-15 (“Sigma”) с добавлением 20% бычьей эмбриональной сыворотки, FBS (“HyClone”), 5×10-6 г/мл инсулина (“Sigma”) и 100×10-6 г/мл стрептомицина и 100 ЕД/мл пенициллина (“Sigma”) при температуре 27 0C. Экспериментальные воздействия на культуры клеток. Для стабилизации динамики микротрубочек клетки инкубировали в течение 5-10 минут в среде, содержащей 10 -6 M таксола (“Sigma”). Для стабилизации динамики актиновых филаментов клетки инкубировали в течение 5-10 минут в среде, содержащей 10 -6 г/мл джасплакинолида (“Sigma”). Для деполимеризации системы микротрубочек клетки инкубировали 60 минут на льду при +4 0C, а затем в среде, содержащей 10 -6 г/мл нокодазола (“Fluka”) в течение часа при +370C. Разрушения актиновых филаментов добивались при воздействии на 6 клетки латрункулина A (“Calbiochem”) в конечной концентрации 0,5×10 -6 г/мл в течение 20 минут. Для индукции образования стрессовых гранул клетки инкубировали в течение 30 минут в среде, содержащей 2×10 -3 М арсената натрия, Na2HAsO4 (“Реахим”). Биосинтез белка ингибировали при воздействии на клетки циклогексимида (“Sigma”) в концентрации 10×10-6 г/мл в течение часа. При гормональной стимуляции транспорта меланосом в меланофорах клеткам предварительно заменяли полную ростовую среду на бессывороточную, после чего добавляли мелатонин или меланоцит-стимулирующий гормон, MSH (“Sigma”) до конечной концентрации 10-8 М и инкубировали в течение 10-20 минут. Работа с плазмидной ДНК и процедура трансфекции. Полноразмерная кДНК CLIP170, а также кДНК его N-концевого (CLIP170ΔC/‘Head’, 4-309 a.о.) и С-концевого (GFP-CLIP170ΔN/‘Tail’, 1027-1320 a.о.) фрагмента были клонированы в векторе pEGFPC1 (“Clontech”). Полноразмерная кДНК EB3 человека (EB3-C–GFP) клонирована в плазмидном векторе pEGFP-N1 (“Clontech”). Вышеуказанные ДНК-конструкции были любезно предоставлены проф. А. Ахмановой (Медицинский Центр Эразмус, Роттердам, Нидерланды). кДНК миозина V с делецией моторного домена – GFP-MyoVa-ΔM – была любезно предоставлена проф. В. Гельфандом (Северо-западный Университет, Чикаго, США). Коммерчески доступная полноразмерная кДНК полиА-связывающего белка PABP1 человека (“ATCC-LGC Standards”) была ранее клонирована в нашей лаборатории к.б.н. П.А. Ивановым в плазмидных векторах pEGFP-C1 и mCherry-C1 (“Clontech”). Вектор pEGFP-tubulin был приобретен у компании “Eurogen”. Для наращивания плазмидной ДНК использовали штамм E. coli DH5α. Трансформацию бактериальных клеток осуществляли с помощью метода электропорации. Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с использованием колонок фирмы “Qiagen” в формате Miniprep или Maxiprep EndoFree. Проверку наличия искомой вставки в препарате плазмидной ДНК осуществляли путем рестриктного анализа по сайтам клонирования с последующим разделением фрагментов с помощью гель-электрофореза в агарозных блоках (Sambrook et al., 1989). Трансфекцию клеток векторными ДНК проводили липосомным методом согласно протоколу производителя с использованием реагентов Lipofectamine 2000 (“Invitrogen”), Fugen6 (“Roche”) или TRANSIT (“Mirus”). Для определения трансгена клетки анализировали спустя 16-24 часа после трансфекции. Антитела. В работе были использованы: мышиные моноклональные антитела к αтубулину, клон DM1A (“Sigma”), к промежуточной цепи динеина DIC, клон 74.1 (“Covance”), EB1 и p150 Glued (“BD Transduction Laboratories”); крысиные моноклональные антитела к α-тубулину, клон CBL270 (“Millipore”); кроличьи поликлональные антитела к CLIP170, H-300 (“Santa Cruz”), N-концу CLIP170, №2221 и к С-концу CLIP170, №2360 (любезно предоставленные проф. А. Ахмановой), к р170 субъединице фактора инициации трансляции eIF-3a (антитела были получены в лаборатории ранее) и к GFP (“Abcam”). В качестве вторых антител использовали козлиные или ослиные антитела, выработанные против иммуноглобулинов мыши, крысы или кролика и, конъюгированные с флуорофорами Alexa 488, Oregon Green, Alexa Fluor 594, Texas Red (“Molecular Probes”), 7 Cy5 (“Jackson ImmunoResearch”), или с ферментными метками – пероксидазой хрена (“Jackson ImmunoResearch”) и щелочной фосфатазой (“KPL”). Иммуноцитохимия и иммунофлуоресцентная микроскопия. Для иммунолокализации антигенов в клетках использовали следующий протокол: клетки, растущие на покровных стеклах, промывали теплым (+37 0С) 0,1 М фосфатно-солевым буфером (PBS), затем фиксировали абсолютным метанолом 10 минут при -200С, после чего проводили постфиксацию 4% раствором формальдегида (“ICN Biomedicals”) в течение 10 минут при +4 0С. Далее клетки выдерживали 5-10 минут в 0,1% растворе Triton X-100 (“Serva”) при комнатной температуре. Растворы первичных и вторичных антител готовили на 3% бычьем сывороточном альбумине (BSA) (“Serva”). Инкубацию с антителами осуществляли при комнатной температуре, в течение 30 минут. Для выявления F-актина клетки фиксировали 4% раствором формальдегида в течение 10 минут при комнатной температуре и подвергали пермеабилизации 0,1% раствором TritonX-100 в течение 10 минут. Далее клетки инкубировали с фаллоидином, конъюгированным с флуорохромом FITC (“Alexis”). Дальнейшие манипуляции проводили по общепринятой схеме. В некоторых случаях препараты клеток докрашивали DAPI (“Sigma”) для выявления хромосомной ДНК. Анализ препаратов проводили с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Axiovert 2000M (“Carl Zeiss”) (объектив 63×1.4NA PlanApo; 100×1.3NA PlanApo), оснащенного устройством для наблюдения в фазовом контрасте и 16-битной цифровой CCD камерой AxioCam HRm (“Carl Zeiss”). С помощью программного обеспечения AxioVision 3.1 (“Carl Zeiss”) изображение передавалось на компьютер и запоминалось в виде графического файла. Полученные изображения обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Adobe Photoshop Version 8.0 (“Adobe”). Для ко-локализационного анализа препараты исследовали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (система LSM 510, “Carl Zeiss”) (объектив 100×1.3NA PlanApo). Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм – для зеленого канала и He-Ne-лазер с длиной волны 543 нм – для красного канала. Применяли раздельное сканирование для сигналов из разных каналов: флуоресценция в области 500-530 нм – зеленый и 580-640 нм – красный канал. Совмещение двух сигналов проводили с помощью компьютерной программы Zeiss LSM Image Browser (“Carl Zeiss”). Микроинъекция. Для визуализации системы микротрубочек в живых клетках клетки микроинъецировали раствором тубулина, конъюгированного с флуоресцентным красителем Су3 (“Amersham Biosciences”). Препарат тубулина очищали из мозга быка и конъюгировали с красителем по ранее описанной методике (Semenova, Rodionov, 2007). Процедуру инъекции проводили с использованием микроманипулятора (“Leitz”) и микроинъекционной системы 5242 (“Eppendorf”). Концентрация Су3-тубулина в микроигле составляла 6×10 -3 г/мл. Результаты микроинъекции наблюдали 1 час спустя. Видеомикроскопия. Прижизненные наблюдения за динамическим поведением Cy3-меченых микротрубочек, GFP-EB1- и GFP-CLIP170–комет проводили с использованием мультирежимного эпифлуоресцентного микроскопа Nikon ECLIPSE TE 300 (“Nikon”) (объектив Plan x100 1.25 NA), оснащенного сенсором Andor iXon EM-CCD с эффектом электронного умножения (“Andor Technology”) под управлением программы 8 MetaMorph Version 7.0 (“Universal Imaging”). Съемку проводили c 3-секундным интервалом в течение 10 минут. Видеонаблюдения за совместным поведением микротрубочек и мРНП стрессовых гранул проводили в клетках, ко-экспрессирующих eGFP-тубулин и mCherry-PABP, c помощью мультиспектрального эпифлуоресцентного микроскопа на базе Axiovert 2000M (“Carl Zeiss”) (объектив 100×1.3NA PlanApo), оснащенного высокоскоростным контроллером для наблюдения в нескольких спектральных каналах, а также цветной цифровой CCD камерой HAMAMATSU C4880 (“Hamamatsu Photonics”) под управлением программы μManager Version 1.3-beta (открытый ресурс лаборатории Р. Вэйла, Университет Калифорнии в Сан-Франциско, США). Съемку проводили c 3-секундным интервалом в течение 5 минут. Наблюдения за динамикой GFP-PABP–содержащих мРНП стрессовых гранул в живых клетках проводили с применением инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа Axiovert 2000M (“Carl Zeiss”) (объектив 63×1.25NA Plan-NEOFLUAR), оснащенного 16-битной цифровой CCD камерой AxioCam HRm (“Carl Zeiss”) под контролем программы AxioVision 3.1 (“Carl Zeiss”). Съемку проводили c 3-секундным интервалом в течение 1 минуты. Перед началом видеонаблюдений клетки обрабатывали оксиразой (“Oxyrase Company”), позволяющей снизить эффекты фотообесцвечивания и фотоповреждения клеток. Поверх культуральной среды наносили слой минерального масла (“CVS Pharmacy”) для предотвращения ее контакта с воздухом. Для прижизненных наблюдений за движением меланосом использовали светлопольную видеомикроскопию (микроскоп Nikon ECLIPSE TE 300; объектив 20× Plan Fluar 0.50 NA (“Nikon”); цифровая видеокамера Flashbus, RS-170 (“Watec Corp”); съемка в течение 10-20 минут с 10-секундным интервалом). Для проведения трекинга единичных меланосом с высоким разрешением была использована фазово-контрастная микроскопия с видеоусилением. Биохимическое выделение препарата меланосом из клеток. Меланофоры разрушали механическим путем в присутствии ингибиторов протеаз; лизат подвергали низкоскоростному центрифугированию для получения «тяжелой» (ядра и крупные клеточные обломки) и «легкой» (цитозоль с прочими органеллами) фракции, как описано ранее (Kashina et al., 2004). Меланосомы из легкой фракции осаждали при 14000 об/мин. Полученные пробы уравнивали по оптической плотности меланина (λ = 350 нм). Вестерн-блот анализ меланосомных белков. Пробоподготовку, одномерный гель-электрофорез белков и перенос на мембрану осуществляли по общепринятой методике (Towbin et al., 1979). Иммунореактивные полосы выявляли с помощью коммерческого реагента SuperSignal West Femto maximum sensitivity substrate (“Pierce Biotechnology”). Хемилюминесцентное излучение регистрировали экспонированием на рентгеновскую пленку Kodak X-Omat K Film. Компьютерные алгоритмы анализа видеоизображений. Количественный анализ цифровых изображений сводился к установлению XY-координат движущихся объектов или среднего уровня интенсивности флуоресценции объекта интереса в пикселях. Для этих целей применяли компьютерные программы MetaMorph Version 7.0 (“Universal Imaging”) и ImageJ 1.39s (Открытый ресурс Национальных Институтов Здоровья США). 9 Статистический анализ данных. Результаты трех независимых экспериментов суммировали и статистически обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Excel for Windows (“Microsoft”). Данные представляли как среднее ± стандартное отклонение (M ± SD), а в некоторых случаях – как среднее ± стандартная ошибка среднего (M ± SEM). Статистически достоверные отличия сравниваемых независимых выборок, имевших нормальное распределение, определяли при помощи непарного двухвыборочного t-теста Стьюдента в автоматической программе P-value Сalculator (http://www.graphpad.com/quickcalcs/ttest1.cfm). Критический уровень значимости принимали равным 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Перемещения меланосом по цитоскелетным трекам в меланофорах Xenopus laevis как идеальная модель для изучения механизмов транспорта мембранных органелл. Меланофоры содержат в цитоплазме пигмент меланин, который сконцентрирован в особых мембранных везикулах – меланосомах. Вместе с другими разновидностями пигментных клеток, меланофоры участвуют в быстром изменении цвета кожных покровов у рыб, амфибий и рептилий. Под действием гормона эпифиза мелатонина происходит синхронный транспорт меланосом от периферии к центру клетки (агрегация меланосом). Явление обратное агрегации – дисперсия – стимулируется гипофизарным гормоном меланотропином/меланоцит-стимулирующим гормоном (MSH). Система микротрубочек в меланофорах имеет классическую радиальную архитектуру: в центре клетки находятся минус-концы микротрубочек, собранные на центросоме, а на периферию обращены их плюс-концы. Агрегация происходит благодаря быстрому транспорту меланосом вдоль микротрубочек в направлении их минус-концов. В качестве мотора агрегирующие меланосомы используют цитоплазматический динеин. Дисперсия включает в себя кинезин-2–зависимое перемещение меланосом в направлении плюсконцов микротрубочек и переход меланосом на актиновые филаменты, где транспорт осуществляется актин-зависимым мотором миозином V (Rodionov, Borisy, 1999). При стимуляции агрегации меланосомы должны перейти с актина назад на микротрубочки и затем начать движение от плюс-конца к минус-концу микротрубочек. Стабилизация динамики микротрубочек приводит к нарушению процесса агрегации меланосом в меланофорах Xenopus laevis. До последнего времени вопрос о том, каким образом меланосомы сменяют актиновые треки на микротрубочковые, оставался открытым. Во-первых, можно предположить, что миозиновый мотор подвозит органеллу к близлежащей микротрубочке. Однако меланосомы и большинство микротрубочек, особенно на периферии клеток, оказываются разнесенными друг от друга на значительные расстояния. В такой ситуации вероятность доставки органеллы миозином к микротрубочковому треку невелика. С другой стороны, как недавно было показано (Semenova et al., 2008), собственная динамика актиновых филаментов важна для осуществления некоторых видов внутриклеточного транспорта. Полимеризуясь, актин способен прокладывать треки для движения карго. Можно представить ситуацию, при которой актиновый филамент подрастает к микротрубочке, а затем миозин V подвозит органеллу к этой микротрубочке. И, наконец, третья возможность состоит в использовании клеткой собственной динамики микротрубочек и их способности к 10 «поиску и захвату». Прижизненные наблюдения за динамикой микротрубочек в меланофорах Xenopus показали, что микротрубочки в ламелле меланофора способны дорастать до мембраны и, демонстрируя типичные признаки динамической нестабильности, постоянно «сканировать» периферические зоны клетки. Подобное «сканирование» могло бы позволить микротрубочкам «собрать» меланосомы с актиновой сети на периферии клетки. Для того чтобы выяснить, какой из трех механизмов работает при агрегации меланосом, мы подавили зависимый от миозина V транспорт меланосом путем экспрессии в клетках доминантно-негативного мутанта миозина V c делецией моторного домена (GFP-MyoVa-ΔM), а с применением фармакологических ингибиторов (джасплакинолид, таксол) затормозили динамику актиновых филаментов и микротрубочек. Оценка эффекта от указанных воздействий на перераспределение меланосом с периферии к центру клетки, выявила, что ни динамика актина, ни миозин-зависимый транспорт не вносят какого-либо вклада в агрегацию меланосом. Следовательно, необходимо было исследовать влияние динамики микротрубочек. Мы подобрали условия обработки таксолом (10-6 М, 5 мин), при которых таксол подавлял динамическую нестабильность микротрубочек, но практически не влиял на структуру сети микротрубочек и ее плотность. Видеонаблюдения за направленным транспортом меланосом в контрольных клетках и в клетках, обработанных таксолом, выявили существенные различия в кинетике транспорта меланосом при агрегации (Рис. 1). Рис. 1. Таксол специфически подавляет процесс агрегации меланосом. Положение меланосом было оценено с помощью компьютерной программы MetaMorph путем измерения плотности черного пигмента в пределах площади клетки во времени. Данные представлены в виде M ± SD. Подсчет фракций агрегированных, частично агрегированных и диспергированных клеток, показал, что предобработка таксолом приводит к значительному увеличению в популяции меланофоров доли частично агрегированных и диспергированных клеток в ответ на сигнал к агрегации. При этом нам не удалось установить каких-либо существенных отличий в транспорте меланосом в ответ на сигнал к дисперсии (Рис. 2). Это наблюдение говорит о специфичном влиянии таксола на протекание именно минусконцевого транспорта меланосом. 11 Рис. 2. Предобработка клеток таксолом при запуске процесса агрегации меланосом приводит к значительному увеличению фракции клеток с диспергированными или частично агрегированными меланосомами. Данные представлены в виде M ± SD. Динамичные плюс-концы микротрубочек осуществляют «поиск и захват» меланосом во время агрегации. Каким образом динамичные микротрубочки могут вовлекаться в регуляцию минус-концевого транспорта меланосом? Для поиска ответа на этот вопрос мы решили провести прижизненные наблюдения за совместным поведением индивидуальных микротрубочек и меланосом в меланофорах, микроинъецированных раствором Су3-меченого тубулина. Предпринятые видеонаблюдения за меланофорами во время агрегации позволили зарегистрировать контакты плюс-концов микротрубочек с меланосомами на периферии клетки. Микротрубочка подрастала к неподвижной меланосоме, контактировала с ней своим плюс-концом, в результате такого контакта органелла оказывалась связанной с микротрубочкой и приступала к перемещению в направлении ее минус-конца (Рис. 3). Рис. 3. Динамичные плюс-концы микротрубочек осуществляют «поиск и захват» меланосом во время агрегации. Флажком показано положение меланосомы, стрелкой – положение плюс-конца микротрубочки. Время указано в секундах. Масштабная линейка, 2 мкм. В клетках, где динамика микротрубочек была подавлена с помощью таксола, мы никогда не встречали подобного рода взаимодействий. Таким образом, динамичные микротрубочки используют механизм «поиска и захвата» для того, чтобы «собрать» на периферии клетки меланосомы, подлежащие транспорту к центру. Белки плюс-концов микротрубочек (+TIPs) и их роль в осуществлении механизма «поиска и захвата» меланосом во время агрегации. Итак, динамичные микротрубочки «собирают» своими плюс-концами меланосомы, что является необходимым условием для инициации минус-концевого транспорта последних. Каковы же молекулярные механизмы взаимодействия плюс-концов микротрубочек с 12 меланосомами? Наиболее вероятными кандидатами на роль «связки» между плюс-концом микротрубочки и меланосомой являются белки, специфически аккумулирующиеся на плюс-концах микротрубочек (+TIPs). Наиболее важными представителями этой группы являются белки EB1/3, CLIP170, Glued p150 , которые объединены общим свойством формировать димеры и взаимодействовать друг с другом и тубулином микротрубочек по принципу «голова– хвост». Эти взаимодействия приводят к формированию так называемого плюс-концевого комплекса на конце растущей микротрубочки. EB1/3 ассоциируется с тубулином на плюсконце растущей микротрубочки. Связываясь своим N-концевым доменом с хвостом EB1, CLIP170 экспонирует С-концевой домен, за который цепляется голова p150Glued (Komarova et al., 2002; Lansbergen et al., 2004; Komarova et al., 2005). Указанные особенности белков плюс-концевого комплекса позволили применить доминантно-негативный подход для оценки роли этих белков в обнаруженном нами явлении «поиска и захвата» меланосом плюс-концами микротрубочек. Для этих целей мы специфически вытесняли с плюс-конца микротрубочек эндогенные +TIPs, экспрессируя в клетках соответствующие конструкции, и наблюдали за тем, как отсутствие того или иного белка скажется на способности меланофоров агрегировать меланосомы в ответ на гормональный стимул. В частности, мы экспрессировали в клетках рекомбинантные белки с С-концом «закрытым» GFP или фрагменты белков, не способные к димеризации (детально схема эксперимента рассматривается в диссертации). В ходе указанных экспериментов нам удалось выяснить, что удаление CLIP170 и p150 Glued, но не одного лишь p150Glued, с плюс-концов микротрубочек специфически ингибирует процесс агрегации в меланофорах (Таблица 1). +TIPs регулируют в клетках множество важнейших процессов, и, в первую очередь, динамику микротрубочек, а также работу динеин-динактинового комплекса. Нарушение локализации и функций +TIPs могло сказаться на транспорте меланосом именно за счет изменения параметров динамической нестабильности микротрубочек или активности динеина, т.е. скорости минус-концевого транспорта. Мы измерили параметры динамики микротрубочек и скорость двунаправленного транспорта единичных меланосом в клетках, экспрессирующих доминантно-негативные конструкции, использованные в нашей работе. Оказалось, что при экспрессии доминантно-негативных конструкций эти параметры действительно несколько изменяются (данные приведены в диссертации). Таблица 1. Влияние смещения +TIPs c плюс-концов микротрубочек на способность меланофоров агрегировать меланосомы в ответ на гормональный стимул. Экспрессия доминантнонегативной конструкции EB3-C–GFP GFP-CLIP170ΔN GFP-CLIP170ΔC Локализация эндогенных белков на плюсконцах микротрубочек EB1 CLIP170 p150Glued Способность агрегировать меланосомы ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ + ¯ + + + 13 Для оценки вклада изменений в динамике микротрубочек и двунаправленного транспорта единичных органелл в агрегацию меланосом была разработана стохастическая компьютерная модель транспорта меланосом вдоль микротрубочек, учитывающая вероятность «встречи» микротрубочки и меланосомы и скорость перемещения меланосомы. Согласно компьютерному моделированию, изменения в динамике микротрубочек и двунаправленного транспорта единичных органелл, выявленные в клетках, экспрессирующих доминантно-негативные конструкции, не вносят существенного вклада в процесс агрегации меланосом. Это позволяет рассматривать принципиальный результат экспериментов по вытеснению +TIPs с плюс-концов микротрубочек, при экспрессии доминантно-негативных конструкций, как специфичный. Также, применяя биохимические методы анализа, мы показали, что цитоплазматический динеин, ассоциированный с меланосомами, не покидает своего карго на фоне экспрессии доминантно-негативных конструкций (данные приведены в диссертации). Наши наблюдения свидетельствовали о возможной роли белка CLIP170 в осуществлении временных контактов между плюс-концом микротрубочки и поверхностью меланосомы во время агрегации, поэтому на следующем этапе мы перешли к визуализации непосредственного взаимодействия CLIP170 c меланосомами в живых клетках. Для этих целей мы проэкспрессировали полноразмерный CLIP170 дикого типа, слитый с GFP, и индуцировали процесс агрегации в меланофорах. GFP-CLIP170 в клетках связывается с плюс-концами микротрубочек и формирует кометы, разлетающиеся от центросомы к периферии. GFP-CLIP170–кометы часто сталкиваются с меланосомами, и мы показали, что в ~80% случаев такие столкновения приводят к инициации центростремительного транспорта меланосом (Рис. 4). Чтобы показать специфичность такого взаимодействия, мы проэкспрессировали другой +TIP – EB3-C–GFP, который подобно GFP-CLIP170 формирует кометы, однако контакты EB3-C–GFP-комет с меланосомами приводили к инициации транспорта последних лишь в 7,8% случаев. Скорее всего, это происходит из-за того, что полноразмерный EB3, слитый с GFP на Сконце, действует как доминантно-негативный фактор в отношении CLIP170, вытесняя его с плюс-конца микротрубочки. Рис. 4. Контакт меланосомы с плюс-концом микротрубочки, покрытым GFP-CLIP170, приводит к инициации минус-концевого транспорта. Белой сплошной линией очерчено положение меланосомы в пространстве и во времени. Черной сплошной линией очерчено положение GFPCLIP170-кометы, сталкивающейся с меланосомой. Кимограф был построен в программе ImageJ при вырезании области интереса из кадров видеофильма длиной 60 секунд. Временной интервал между кадрами составил 3 секунды. Обратившись к математическому моделированию, мы выяснили, что лишь одного снижения количества контактов, приводящих к инициации минус-концевого транспорта, 14 достаточно для ингибирования агрегации, сравнимого по эффективности с действием таксола. Чтобы заингибировать CLIP170 другим методом, мы применили микроинъекцию в клетки антитела против CLIP170. Введение в клетки антитела против CLIP170 специфически блокировало агрегацию меланосом, не влияя на их дисперсию. Микроинъекция же неспецифических антител не оказывала влияния на транспорт меланосом (Рис. 5). Клетки, инъецированные антителом против CLIP170, демонстрировали фенотип, схожий с таковым при доминантно-негативном ингибировании CLIP170, или при воздействии на клетки таксола, что еще раз доказывает роль белка CLIP170 в «захвате» меланосом посредством плюс-концов микротрубочек и критичность этого взаимодействия для инициации динеин-зависимого транспорта. Рис. 5. Микроинъекция антитела против CLIP170 приводит к резкому увеличению фракции клеток с диспергированными или частично агрегированными меланосомами при индукции процесса агрегации. Цвета столбиков соответствуют обозначенным на рис. 2. Данные представлены в виде M ± SD. Одним из важнейших предсказаний нашей модели является принципиальная способность CLIP170 взаимодействовать не только с плюс-концами микротрубочек, но и с поверхностью меланосом. Для проверки данной гипотезы мы биохимически выделили и очистили препарат меланосом из меланофоров в диспергированном и агрегированном состоянии. Чистоту препарата оценивали иммуноблотингом с антителами против растворимого цитозольного белка GAPDH. Рис. 6. CLIP170 соочищается с белками меланосом. Белки тотального экстракта (E) меланофоров, а также меланосом, выделенных из меланофоров в агрегированном (A) и диспергированном (D) состоянии были разделены с помощью электрофореза в 7,5% 15 полиакриламидном геле. Белковые полосы в дальнейшем были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и выявлены с помощью иммуноферментного мечения антителами на CLIP170 или глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH) как маркер растворимых цитозольных белков. Слева указан молекулярный вес полипептидов. С использованием антител против CLIP170 мы показали присутствие данного белка в составе белков меланосомной фракции (Рис. 6), что доказывает возможность взаимодействия CLIP170 с меланосомами во время процесса агрегации и позволяет предложить модель взаимодействия плюс-концов микротрубочек с меланосомами (Рис. 7). Рис. 7. Модель взаимодействия CLIP170 на плюс-конце микротрубочки с меланосомой. CLIP170, заякоренный за счет EB1 на плюс-конце микротрубочки, взаимодействует с гипотетическим адаптером (CLIP-170 binding factor) на поверхности меланосомы (Pigment granule). В результате подобного взаимодействия происходит сближение микротрубочки и меланосомы, что приводит к активации динеинового мотора (Dynein), «сидящего» на меланосоме, и началу минус-концевого транспорта по микротрубочке. Стрессовые гранулы в клетках млекопитающих как модельные объекты для изучения активного транспорта немембранных компонентов – мРНК-белковых комплексов. Одним из наиболее ранних и специфичных ответов клетки на неблагоприятные воздействия (тепловой шок, окислительный стресс, УФ облучение и некоторые другие) является падение общего уровня белкового синтеза за счет ареста трансляции мРНК. При этом в цитоплазме эукариотических клеток возникают плотные образования, называемые стрессовыми гранулами (Kedersha et al., 1999). Стрессовые гранулы представляют собой гигантские рибонуклеопротеидные (РНП) комплексы, состоящие из малых рибосомных субчастиц, некоторых факторов инициации трансляции, мРНК и мРНК-связывающих белков. мРНК в составе стрессовых гранул инертна и не участвует в трансляции, т.к., перемещаясь в стрессовые гранулы, мРНК одевается целой «шубой» различных стабилизирующих белков, что уменьшает ее деградацию. При снятии стрессового воздействия на клетку гранулы разбираются, и инициаторные комплексы вновь вовлекаются в процесс трансляции (Kedersha et al., 2002). Стрессовые гранулы – образования временные. Они возникают через 15-20 минут после начала стрессового воздействия на клетку и исчезают в течение 1,5-3 часов после его снятия (Kedersha, Andersen 2002). Эти наблюдения породили интерес к изучению динамики стрессовых гранул в клетке. Использование флуоресцентно-слитых форм белков, идентифицированных в составе стрессовых гранул, позволяет проводить прижизненные 16 наблюдения за их поведением в культивируемых клетках. Оказалось, что стрессовые гранулы являются динамичными образованиями цитоплазмы: они постоянно обмениваются с ней своими компонентами; курсируют по клетке, двигаясь в различных направлениях, и нередко сливаются друг с другом (Kedersha et al., 2005; Ohn et al., 2008). Было показано, что образование стрессовых гранул сильно зависит от целостности микротрубочек в клетках. При разрушении микротрубочек нокодазолом стрессовые гранулы не формируются в ответ на окислительный стресс, однако при отмывке нокодазола на фоне окислительного стресса восстановление системы микротрубочек сопровождается образованием стрессовых гранул (Ivanov et al., 2003). Следует отметить, что визуализация внутриклеточного движения компонентов трансляционного аппарата как индивидуальных молекул (мРНК, мРНК-связывающих белков и трансляционных факторов) практически трудно выполнима. В этой связи стрессовые гранулы, размер которых в среднем составляет 1-2 мкм, являются очень удобным объектом для наблюдений. Внутриклеточный транспорт стрессовых гранул и зависимость этого процесса от динамики микротрубочек. Предпринятые нами видеонаблюдения за живыми клетками HeLa, экспрессирующими маркерный белок стрессовых гранул – PABP, слитый с GFP, показали, что стрессовые гранулы – довольно динамичные цитоплазматические образования, способные перемещаться по клетке. За времена порядка десятков секунд одна и та же стрессовая гранула способна совершить направленное перемещение вдоль условной линии и вновь вернуться на изначальную позицию; в некоторых случаях скорости и дистанции таких перемещений были значительными (до 1 мкм/c); некоторые стрессовые гранулы совершали движения с неупорядоченной траекторией; другие же и вовсе хаотично колебались относительно некоего условного положения равновесия без совершения эффективного перемещения. При разрушении системы микротрубочек, но не актиновых филаментов, происходит резкое снижение скорости движения стрессовых гранул в клетке. Средняя скорость движения гранул в клетках после разборки микротрубочек составила 0,04 мкм/с против 0,13 мкм/c в контроле. Лишь 1,5% гранул (против 10% в контроле) в клетках с деполимеризованными микротрубочками движутся со скоростью, превышающей пороговое значение 0,2 мкм/c (критерий, используемый при характеристике активного транспорта различных компонентов в клетке; Minin et al., 2006). В этих условиях начинают превалировать хаотические низкоамплитудные колебания гранул без совершения эффективного перемещения, либо всякое движение затормаживается. В отличие от транспорта меланосом, перемещение стрессовых гранул как к центру клетки, так и на ее периферию, не зависит от динамичности плюс-концов микротрубочек; обработка клеток таксолом существенно не влияет ни на расположение гранул в цитоплазме, ни на скорость их транспорта. Совокупное движение стрессовых гранул можно охарактеризовать как хаотическое перемещение по цитоплазме: они заметно не смещаются ни к центру, ни к периферии клетки. Для точной характеристики движения стрессовых гранул мы применили строгий математический анализ изменения среднеквадратичного смещения (MSD) гранул по времени, позволяющий разложить движение частицы на составляющие компоненты (диффузионную компоненту и активный транспорт, зависимый от моторных белков) и оценить вклад каждой компоненты. Результаты предпринятого анализа показали, что в 17 клетках лишь небольшая фракция стрессовых гранул (~10%) демонстрирует активное движение, остальное движение описывается как простая или затрудненная диффузия. Усредненное движение стрессовых гранул в клетках в целом можно описать как затрудненную диффузию (Рис. 8). Следует отметить, что везикулярные частицы сходного размера, двигающиеся по микротрубочкам в клетках CHO-K1, демонстрируют аналогичный характер движения (Heinzer et al., 2008). Разрушение системы микротрубочек приводит к полному нивелированию фракции стрессовых гранул, движущихся путем активного транспорта. Среднее значение коэффициента диффузии D для гранул, двигающихся в цитоплазме контрольных клеток, оказалось в ~3 раза больше, чем для гранул в клетках с разрушенными микротрубочками (1,9x10–3 мкм2/с против 6x10 -4 мкм2/с соответственно). Определенная нами средняя скорость перемещений PABP-содержащих стрессовых гранул (~0,13 мкм/c) в клетках HeLa хорошо совпадает с уже охарактеризованными средними скоростями микротрубочки-зависимого транспорта различных мРНП-частиц. Например, в нейронах мРНП-частицы, содержащие белок CPEB, перемещаются со средней скоростью 0,06-0,13 мкм/c (Huang et al., 2003); в кардиоцитах мРНП-частицы, содежащие белки ZBP1 и Staufen, транспортируются по микротрубочкам со скоростью 0,08-0,15 мкм/с (Scholz et al., 2008); IMP-1–содержащие РНП в фибробластах передвигаются по цитоплазме со скоростью 0,12 мкм/c (Rackham, Brown, 2004). Рис. 8. Анализ транспорта стрессовых гранул. А – типы движений, которые демонстрируют стрессовые гранулы в цитоплазме клеток HeLa. Показаны треки индивидуальных гранул. Классификация типов движения произведена на основе расчета MSD для гранул. d.m. (directed motion) – направленное перемещение, активный транспорт; s.d. (simple diffusion) – простая диффузия; o.d. (obstructed diffusion) – затрудненная диффузия; с.d. (confined diffusion) – ограниченная диффузия. Б – график изменения по времени коэффициента диффузии для стрессовых гранул, показанных на А. Обозначения те же. В – график изменения по времени среднего значения коэффициента диффузии стрессовых гранул в различных условиях эксперимента. 1 – контроль, 2 – латранкулин А, 3 – таксол, 4 – нокодазол. Наблюдение прямого взаимодействия стрессовых гранул с микротрубочками в живых клетках. Охарактеризовав разнотипные движения гранул и, проследив зависимость их быстрых и на большие дистанции перемещений от целостности микротрубочек, мы перешли к изучению взаимодействия стрессовых гранул с микротрубочками в живых клетках. Для этих целей нами были получены клетки, транзиентно экспрессирующие eGFP-тубулин и mCherry-PABP. Видеонаблюдения с помощью двухканальной флуоресцентной микроскопии за совместным поведением 18 стрессовых гранул и микротрубочек показали, что подвижные гранулы ассоциированы с микротрубочками. Будучи связанными с микротрубочками, гранулы демонстрируют разнообразные типы движений: направленные сальтаторные движения (скачки на значительные расстояния за небольшой промежуток времени), двунаправленные перемещения и низкоамплитудные колебания относительно некоторого положения равновесия (Рис. 9). Учитывая, что в клетках HeLa микротрубочки образуют густую сеть, движение большинства стрессовых гранул можно описать как низкоамплитудные перемещения в трехмерных ячейках, которые образуются в густой сети хаотично расположенных микротрубочек. Двигаясь в пределах таких ячеек, стрессовые гранулы могут совершать прыжки в соседние микродомены. Рис. 9. Двунаправленный транспорт стрессовых гранул вдоль клеточных микротрубочек. Клетки были трансфецированы двумя плазмидами – еGFP-тубулин (для визуализации микротрубочек) и mCherry-PABP (для визуализации стрессовых гранул). С помощью двухканальной флуоресцентной микроскопии был получен видеофильм. Приведена последовательность фрагментов, вырезанных из кадров видеофильма длиной 30 секунд. Временной интервал между кадрами фильма составил 3 секунды. Кадры видеофильма были обработаны в программе «ImageJ-деконволюция» для получения более четкого изображения и различения индивидуальных микротрубочек. Изучая ассоциацию стрессовых гранул с микротрубочками на препаратах фиксированных клеток, нам удалось выявить, что стрессовые гранулы по своей морфологии напоминают плод ежевики. Отдельные «субъединицы» стрессовых гранул размером ~0,1-0,5 мкм удавалось также обнаружить колокализованными с микротрубочками. Это свидетельствует о том, что, по-видимому, стрессовые гранулы формируются за счет транспорта по микротрубочкам отдельных мРНП комплексов, которые, налипая друг на друга, и формируют более крупные конгломераты – стрессовые гранулы. Косвенным доказательством этой гипотезы служит наше наблюдение о том, что нередко мелкие стрессовые гранулы «сливаются» друг с другом с образованием одной, более крупной гранулы (Рис. 10). Рис. 10. Морфология и динамика стрессовых гранул. А – морфология стрессовых гранул по данным иммунофлуоресцентной микроскопии. Клетки были фиксированы ледяным метанолом с последующей постфиксацией 4% параформальдегидом и иммуноцитохимически окрашены на один из маркерных белков стрессовых гранул – eIF3a. Показаны две стрессовые гранулы, состоящие из множества мелких «субъединиц». Масштабная линейка – 1 мкм. Б – объединение двух стрессовых гранул в одну гранулу в цитоплазме живых клеток. Показан участок цитоплазмы 19 клетки, экспрессирующей один из маркеров стрессовых гранул – GFP-PABP. Время указано в секундах. Масштабная линейка, 2 мкм. Участие микротрубочек в разборке стрессовых гранул. Ранее было показано, что при деполимеризации клеточных микротрубочек стрессовые гранулы не формируются в ответ на окислительный стресс, однако восстановление целостности сети микротрубочек на фоне окислительного стресса сопровождается образованием стрессовых гранул de novo (Ivanov et al., 2003). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что интактная система микротрубочек необходима для формирования стрессовых гранул из составляющих компонентов. В то же время, хорошо известно, что стрессовые гранулы – образования временные. Они возникают через 15-20 минут после начала стрессового воздействия на клетку и исчезают, путем диссоциации на составляющие, в течение 1,5-3 часов после его снятия (Kedersha, Andersen 2002). Поэтому, характеризуя роль микротрубочек в транспорте стрессовых гранул и их компонентов, для нас представляла самостоятельный интерес задача выяснения участия системы микротрубочек в процессе разборки стрессовых гранул. При планировании экспериментов в этом направлении, мы взяли на вооружение факт разборки стрессовых гранул при воздействии на стрессированные клетки ингибитором трансляции, циклогексимидом (Kedersha et al., 2005). Мы разрушали систему микротрубочек в клетках, предварительно обработанных арсенатом для индукции стрессовых гранул. Обработка клеток со стрессовыми гранулами циклогексимидом вызывала их исчезновение в клетках с интактной системой микротрубочек. Однако в клетках, где микротрубочки были разрушены, разборка стрессовых гранул под действием циклогексимида была подавлена. Нами также была проверена вовлеченнность микрофиламентов в разборку стрессовых гранул под действием циклогексимида. Для этого стрессированные арсенатом клетки обрабатывали латрункулином А, вызывающим деполимеризацию актиновых филаментов. Далее такие клетки инкубировали в среде с циклогексимидом, фиксировали и окрашивали антителами к eIF3a. Оказалось, что исчезновение стрессовых гранул в таких клетках происходит так же, как и в контроле (Рис. 11). Рис. 11. Деполимеризация микротрубочек, но не актиновых филаментов подавляет разборку стрессовых гранул в ответ на циклогексимид. Ars – арсенат; Noc – нокодазол; LatA – латрункулин А; Chx – циклогексимид. Данные представлены в виде M ± SEM. 20 Таким образом, разрушение микротрубочек, но не микрофиламентов влияет на разборку стрессовых гранул под действием циклогексимида на фоне стресса. То есть микротрубочки необходимы не только для формирования стрессовых гранул, как было показано ранее, но и для их разборки. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Обобщая результаты исследования, важно подчеркнуть, что в данной работе нами впервые описан зависимый от микротрубочек транспорт немембранных органелл, стрессовых гранул, в клетках млекопитающих, а также охарактеризованы новые детали хорошо известного транспорта мембранных органелл, меланосом, в меланофорах Xenopus laevis. Полученные данные позволяют заключить, что различия в структуре и плотности сети микротрубочек сказываются на организации внутриклеточного транспорта органелл. Так, в меланофорах Xenopus с хорошо выраженной радиальной организацией микротрубочек происходит быстрый, направленный и синхронный транспорт органелл. В клетках HeLa c хаотичной системой микротрубочек наблюдается асинхронное перемещение органелл, носящее хаотический характер. Плотность сети микротрубочек в меланофорах много меньше, чем в клетках HeLa, поэтому в меланофорах существует механизм, способный привести транспортируемые органеллы в контакт с микротрубочками. Данный механизм основан на явлении динамической нестабильности микротрубочек. Микротрубочки в меланофоре выступают не просто в качестве рельсов, вдоль которых моторные белки перевозят меланосомы, микротрубочки, благодаря своей динамичности, сами активно вовлекаются в процесс транспорта, играя роль «ловцов» меланосом, подлежащих транспортировке. В ответ на стимул к мгновенному изменению положения пигмента клетка мобилизует все возможные механизмы для прохождения этого процесса с максимальной эффективностью. Скорее всего, подобный механизм был приобретен в процессе эволюции и закреплен естественным отбором, ибо быстрое изменение цвета кожных покровов играет ключевую роль в социальном поведении животных, а также приобретении ими покровительственной окраски в природных условиях. В густой сети микротрубочек органелле не сложно найти свой транспортный трек, поэтому ингибирование динамики микротрубочек в клетках HeLa существенно не влияет на транспорт стрессовых гранул. По-видимому, как для транспорта самих стрессовых гранул, так и для их формирования из «субъединиц» или диссоциации на составляющие компоненты, важно наличие целостного трека, вдоль которого молекулярные моторы могут транспортировать компоненты стрессовых гранул и сами гранулы. ВЫВОДЫ 1. Глобальная динамика плюс-концов микротрубочек необходима для быстрой и синхронной агрегации мембранных органелл, меланосом, в меланофорах Xenopus. Динамичные плюс-концы микротрубочек взаимодействуют с меланосомами, подлежащими минус-концевому транспорту, по механизму «поиска и захвата». 2. Белок СLIP170, аккумулирующийся на концах растущих микротрубочек, принимает участие в формировании временных контактов между плюс-концом микротрубочки и 21 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. меланосомой. Указанные взаимодействия необходимы для инициации динеинзависимого транспорта меланосом. Белок динактинового комплекса p150 Glued, также ассоциированный с плюс-концами микротрубочек, не участвует в «захвате» меланосом микротрубочками. Немембранные органеллы, стрессовые гранулы, перемещаются в клетках по микротрубочкам. Транспорт стрессовых гранул характеризуется как асинхронное перемещение, носящее хаотический характер. Динамика микротрубочек не вносит вклада в результирующее движение стрессовых гранул. Микротрубочки необходимы не только для формирования стрессовых гранул, как было показано ранее, но и для их разборки. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Lomakin A.J., Semenova I., Zaliapin I., Kraikivski P., Nadezhdina E., Slepchenko B., Akhmanova A., and Rodionov V. CLIP-170-dependent capture of membrane organelles by microtubules initiates minus-end directed transport // Dev. Cell. - 2009. - Vol. 17. - P. 323333. Lomakin A., Semenova I., Nadezhdina E., Akhmanova A., Rodionov V.I. Search-andcapture of membrane organelles by dynamic microtubules is required for initiation of dyneindependent transport // Mol. Biol. Cell. - 2007. - Suppl. Vol. 18. - P. 192a. Ivanov P.A., Lomakin A.J., Nadezhdina E.S. RNP Stress Granule Dynamics Depends on Microtubules and Microtubule Motors // Mol. Biol. Cell. - 2007. - Suppl. Vol. 18. - P. 198a. Nadezhdina E.S., Ivanov P.A., Lomakin A.J. Microtubules in stress granule dynamics // American Society for Cell Biology & European Cytoskeleton Forum Summer Meeting “Dynamic Interplay between Cytoskeletal and Membrane Systems”. Materials of the Conference. - Dijon, France, 2007. - P. 35. Надеждина Е.С., Иванов П.А., Ломакин А.Ю. Микротрубочки в динамике стрессовых гранул // Международная конференция «Биосинтез белков, их структура и функции». Сборник тезисов. - Пущино: Институт белка РАН, 2007. - С. 134. Ломакин А.Ю., Иванов П.А., Надеждина Е.С. Участие тубулинового цитоскелета в трансляционной регуляции экспрессии генома в условиях клеточного стресса // XIX Зимняя молодежная научная школа-конференция «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Сборник тезисов. - М.: Институт биоорганической химии РАН, 2007. - С. 36. Lomakin A., Semenova I., Nadezhdina E., Akhmanova A., Rodionov V. Regulation of the CLIP-170-dependent interaction of membrane organelles with the plus ends of cytoplasmic microtubules essential for initiation of the minus-end directed transport // Mol. Biol. Cell. 2008. - Suppl. Vol. 19. - P. 298b. Lomakin A., Semenova I., Nadezhdina E., Akhmanova A., Rodionov V.I. Cytoplasmic linker protein 170 is essential for ‘search-and-capture’ of membrane organelles by dynamic microtubules // IVth Meeting of the Russian society for biochemistry and molecular biology. Abstract book. - Novosibirsk: SB RAS, 2008. - P. 152. Lomakin A., Semenova I., Nadezhdina E., Akhmanova A., Rodionov V.I. Cytoplasmic linker protein 170 (CLIP-170) is essential for initiation of dynein-driven transport of melanosomes 22 // Materials of international symposium “Biological motility: achievements and perspectives”. - Pushchino: Foton-Vek, 2008. - Vol. 2. - P. 235. 10. Lomakin A., Chudinova E., Ivanov P., Nadezhdina E. Role for microtubules and microtubule associated motor proteins in the dynamics of ribonucleoprotein stress granules // Materials of international symposium “Biological motility: achievements and perspectives”. - Pushchino: Foton-Vek, 2008. - Vol. 2. - P. 234. 11. Ломакин А.Ю., Надеждина Е.С., Ахманова А.С., Родионов В.И. Идентификация белков микротрубочек, необходимых для их взаимодействия с меланосомами // Международная конференция «Биосинтез белков, их структура и функции». Сборник материалов конференции. - Пущино: Институт Белка РАН, 2008. - С. 165. 12. Ломакин А.Ю., Семенова И.А., Надеждина Е.С., Ахманова А.С., Родионов В.И. «Поиск и захват»: молекулярные основы динамического взаимодействия микротрубочек с мембранными органеллами // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». Секция «Биология». Тезисы докладов. - М.: МАКС Пресс, 2008. - С 237. 13. Kraikivski P., Lomakin A., Semenova I., Nadezhdina E., Akhmanova A., Rodionov V. Regulation of microtubule dynamics enhances capture of pigment granules by growing microtubule ends during pigment aggregation in melanophores // Mol. Biol. Cell. - 2009. Suppl. Vol. 20. - P. 203a. 14. Lomakin A., Kraikivski P., Semenova I., Nadezhdina E., Akhmanova A., and Rodionov V. Changes in microtubule dynamics enhance the CLIP-170-dependent binding of pigment granules to microtubules during pigment aggregation in melanophores // Materials of Gordon Research Conference “Motile & Contractile Systems”. - New London, USA, 2009. - P. 51. 23
