прооксидантно – антиоксидантный статус хлоропластов гороха

Физико-химическая биология
Вестник
им.Веселов,
Н.И. Лобачевского,
2010, № Е.А.
2 (2),Чуманкина
с. 550–556
Л.Н.Нижегородского
Курганова , И.В.университета
Балалаева, А.П.
Е.О. Половинкина,
550
УДК 581.1
ПРООКСИДАНТНО – АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС
ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА ПРИ ДЕЙСТВИИ СТРЕССИРУЮЩИХ
АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ.
2. АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА ЗАЩИТЫ
 2010 г.
Л.Н. Курганова , И.В. Балалаева, А.П. Веселов, Е.О. Половинкина,
Е.А. Чуманкина
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
veselov@bio.unn.ru
Поступила в редакцию 02.10.2009
Проанализирована активность антиоксидантных ферментов и глутатионовый статус хлоропластов
при действии гипертермии, экзогенного Н2О2 и параквата. Показано увеличение активности антиоксидантных ферментов в условиях, исключающих синтез дополнительных ферментов. Выявлено ограничение активности глутатионредуктазы при окислительном стрессе. Высказано предположение о существовании различных путей ответа антиоксидантной системы хлоропластов на действие различных
абиотических факторов.
Ключевые слова: Pisum sativum L., хлоропласты, антиоксиданты, супероксиддисмутаза, глутатионредуктаза, глутатионтрансфераза, глутатион.
Введение
Функции антиоксидантной (АО) системы,
обеспечивающей утилизацию активных форм
кислорода (АФК) и предотвращение накопления в клетке окисленных макромолекул, приобретают особое значение при действии на растения неблагоприятных факторов. Уровень активности АО-ферментов и содержание низкомолекулярных антиоксидантов отражают общую «обороноспособность» организма и определяют границы устойчивости к экстремальным
воздействиям [1]. Адаптивная активация АОсистемы даже при неизменном уровне окислительных процессов служит маркером окислительного стресса и свидетельствует о нарушении прооксидантно-антиоксидантного гомеостаза клеток растений [2, 3].
Ответ АО-системы на действие стрессоров
различной природы обладает рядом неспецифических черт. Так, для фитостресса характерны
активация основных АО-ферментов и увеличение пула низкомолекулярных антиоксидантов
на фоне роста их окисленности [4–6]. Однако
остается невыясненным, является ли эта неспецифичность следствием адекватного ответа на
сходную картину развития окислительного
стресса, или же существуют какие-либо иные
механизмы, обусловливающие однотипную реакцию АО-системы на изменение условий
внешней среды. Кроме того, можно предполо-
жить существование специфических аспектов
влияния разнообразных стрессоров на содержание и активность антиоксидантов.
С целью выявления индивидуальных особенностей быстрого ответа АО-системы хлоропластов на действие различных по природе
абиотических факторов проанализирована динамика активности таких ферментов, как супероксиддисмутаза (СОД), глутатионредуктаза
(ГР) и глутатионтрансфераза (ГТ), а также определен глутатионовый статус пластид (GSH,
GSSG и соотношение GSSG/GSH).
Материалы и методы
Объектом исследования служила суспензия
хлоропластов, изолированных из 14-дневных
растений гороха (Pisum sativum L.) сорта Труженик. Выращивание растений и создание
стрессовых условий проводили согласно методикам, описанным в первой части настоящей
статьи [7].
Работу АО-системы хлоропластов оценивали
по активности СОД, ГР и ГТ, а также по содержанию окисленной и восстановленной форм
глутатиона. Активность СОД определяли по
реакции с нитросиним тетразолием, ГР – по использованию НАДФН для восстановления глутатиона [8], ГТ – по реакции конъюгирования
глутатиона с Cl-2,4-динитробензолом [9], содержание белка – по методу Лоури, соотноше-
551
Прооксидантно – антиоксидантный статус хлоропластов гороха... 2.
Результаты и их обсуждение
Активность
усл.
ед.белка
/ (мг *белка
СОД, СОД,
усл. ед.
/ (мг
мин) ⋅ мин)
Основным ферментом, инициирующим цепной процесс ПОЛ, является СОД [11]. Локализация СОД в мембранном матриксе в непосредственной близости от фотосистемы I, основного
продуцента АФК, обусловливает ведущее участие этого фермента в утилизации и предотвращении выхода супероксида из липидной фазы в водную. Кроме того, в строме хлоропластов присутствует водорастворимый пул СОД,
дополняющий защитные функции мембранной
фракции [12].
Несмотря на ключевую роль СОД, при гипертермии изменение его активности не отмечено (рис. 1).
Можно предположить, что в условиях нагревания хлоропласты способны в течение определенного времени поддерживать баланс между
скоростью термонезависимых физических и
термочувствительных химических реакций фотосинтеза. Однако при сдерживании реакций
образования АФК электрон-транспортной цепью происходит существенное ускорение свободно-радикальных процессов в мембранах [7].
Результатом функционирования СОД становится переход заряженной молекулы О2.– в пероксид водорода.
Детоксикация и утилизация окисленных
производных жирных кислот и других макромолекул связана с работой аскорбат-глутатионтокоферольной системы [12]. Утилизация образующегося Н2О2 в хлоропластах производится
ферментом ГР, осуществляющим НАДФНзависимое восстановление окисленного димерного глутатиона [13]. Повышение температуры
до 42ºС приводило к временной активации ГР,
максимально – через 30 мин после начала воздействия (рис. 1).
Другим глутатион-зависимым ферментом, катализирующим детоксикацию продуктов ПОЛ, в
первую очередь 4-гидрокси-ноненалей, а также
глутатионпероксидазную реакцию с гидроперекисными производными жирных кислот, являет-
9
0,6
8
0,5
7
0,4
6
0,3
5
0,2
4
0,1
3
2
0
0
0
10
5 10 15
20
30
40
30
Время,
время,мин
мин
СОД
50
60
60
ГР
Рис. 1. Активность СОД и ГР в хлоропластах при гипертермии
ГР, мкмоль НАДФН / (мг белка * мин)
Активность ГР,
мкмоль НАДФН / (мг белка ⋅ мин)
ние восстановленной и окисленной форм глутатиона – титрометрически по методу Вудворда –
Фрея [9].
Использовали НАДФН, НАДН фирмы
«Reanal» (Венгрия), нитросиний тетразолий
фирмы «Merck» (Германия), феназинметасульфат фирмы «ICN Biomedicals» (США), окисленный и восстановленный глутатион фирмы
«Sigma» (США). Остальные реактивы отечественного производства марок «х. ч.» и «ч. д. а.».
На графиках представлены средние арифметические трех-шести независимых опытов, проведенных в трехкратной биологической повторности, и их стандартные ошибки. Одна биологическая повторность представляла собой суспензию хлоропластов, полученную из объединенной навески листьев 20 растений. Значимость различий оценивали по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений с контролем (уровень значимости p < 0.05) [10].
552
Л.Н. Курганова , И.В. Балалаева, А.П. Веселов, Е.О. Половинкина, Е.А. Чуманкина
ся ГТ [14]. В наших опытах нагревание суспензии хлоропластов до 42°С приводило к скачку
активности ГТ уже через 5 мин прогревания (до
120% от исходного уровня), а в дальнейшем при
всех экспозициях (10–60 мин) её активность не
отличалась от контроля (рис. 2).
Помещение суспензии хлоропластов в условия гипертермии становилось причиной постепенного окисления пластидного пула глутатиона на фоне неизменного общего содержания
данного антиоксиданта, выраженного в GSHэквивалентах (таблица).
Соотношение GSSG/GSH, отражающее общий redox-статус пластид, увеличивалось от
0.17 до 0.32 через 60 мин прогревания. Относительно медленный, линейный рост показателя
GSSG/GSH свидетельствовал о развитии при
высокотемпературной обработке окислительного стресса. При этом максимальное соотношение GSSG/GSH совпадало по времени с угнетением активности ГР, отвечающей за обратное
восстановление глутатиона и его рециклирование.
Полученные данные вполне согласуются с
предположением о ведущей роли аскорбатглутатион-токоферольной системы в поддержании функциональной активности хлоропластов
при гипертермии
Для выяснения влияния Н2О2 на функционирование антиоксидантной системы хлоропластов гороха при воздействии стрессирующих
факторов, суспензию пластид обрабатывали
экзогенным пероксидом водорода. В настоящее
время пероксид водорода рассматривается не
28
мкмоль конъюгата / (мг белка * мин)
Активность ГТ,
мкмоль конъюгата/ (мг белка ⋅ мин)
26
24
22
20
18
16
14
12
10
0
10
20
30
40
время,мин
мин
Время,
50
60
Рис. 2. Активность ГТ в хлоропластах при гипертермии
Таблица
Суммарное содержание глутатиона в хлоропластах и соотношение
его окисленной и восстановленной форм при действии различных неблагоприятных факторов
Время,
мин
GSSG/GSH
мкмоль/мг
белка
GSSG/GSH
мкмоль/мг
белка
GSSG/GSH
500 мкМ PQ
мкмоль/мг
белка
100 мкМ PQ
GSSG/GSH
10 мМ Н2О2
мкмоль/мг
белка
Гипертермия, 42°С
0
5
10
15
30
60
15.8 ± 0.2
15.5 ± 0.3
15.3 ± 0.6
15.1 ± 0.3
15.5 ± 0.6
16.1 ± 0.3
0.17
0.17
0.19
0.21
0.23
0.32*
19.3 ± 0.6
18.6 ± 0.4
18.3 ± 0.6
17.7 ± 0.2
17.3 ± 0.4
17.8 ± 0.4
0.09
0.31*
0.15
0.14
0.17
0.23*
17.6 ± 0.4
16.6 ± 0.5
17.9 ± 0.4
17.2 ± 0.3
18.8 ± 0.4
19.9 ± 0.5*
0.15
0.31*
0.45*
0.34*
0.47*
0.50*
18.8 ± 0.6
20.9 ± 0.5*
22.5 ± 0.3*
30.3 ± 0.2*
27.0 ± 0.6*
29.6 ± 0.9*
0.17
0.56*
0.59*
0.79*
0.61*
0.79*
Примечание: * – отличие статистически значимо по отношению к началу экспозиции (0 мин).
553
Прооксидантно – антиоксидантный статус хлоропластов гороха... 2.
14
0,6
12
0,5
10
0,4
8
0,3
6
0,2
4
2
0,1
0
0
0 0
5 1010 1520
3030 40
время,мин
мин
Время,
СОД
50
мкмоль НАДФН / (мг белка ⋅ мин)
Как показано на рис. 3, введение в суспензию хлоропластов Н2О2 в расчетной концентрации 10 мМ приводило к увеличению активности
СОД до 150–160% через 10–15 мин и до 175% –
к 60 минутам экспозиции, т.е. синтеза дополнительных количеств данного фермента не требовалось.
Усиление работы фермента при действии
микромолярных концентраций Н2О2 описывается, в частности, в работе E.A. Kosenko с сотр.
[18] для эритроцитарной СОД животных и противопоставляется быстрой деструкции фермента миллимолярными концентрациями. Выявленное в условиях нашей модельной системы
ГР, мкмоль
НАДФН / (мгГР,
белка * мин)
Активность
АктивностьСОД,
СОД,
(мг белка
усл.усл.
ед. /ед.
(мг /белка
* мин) ⋅ мин)
только как окислительный стимул в модельных
исследованиях, но и как индуктор системной
приобретенной устойчивости растений и запрограммированной гибели клеток, сигнальный
мессенджер, регулятор транскрипции генов и
развития защитных реакций [15, 16]. В работе
T. Gechev с сотр. [17] показана его способность
к индукции повышенной устойчивости растений табака к окислительному стрессу посредством увеличения активности и (или) количества
антиоксидантных ферментов. Однако ответ
изолированных хлоропластов на обработку экзогенным Н2О2 существенно отличался от
реакции целого организма.
6060
ГР
Рис. 3. Активность СОД и ГР в хлоропластах при обработке экзогенным 10 мМ Н2О2
мкмоль конъюгата / (мг белка * мин)
Активность ГТ,
мкмоль конъюгата/ (мг белка ⋅ мин)
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
0
10
20
30
40
50
60
время,
Время, мин
мин
Рис. 4. Активность ГТ в хлоропластах при обработке экзогенным 10 мМ Н2О2
554
Л.Н. Курганова , И.В. Балалаева, А.П. Веселов, Е.О. Половинкина, Е.А. Чуманкина
быстрое снижение концентрации Н2О2 в суспензии до микромолярных значений может играть
ключевую роль в поддержании структуры и активности СОД [8], возможно за счёт взаимодействия Н2О2 с активным центром фермента.
Активность ГР при обработке Н2О2 (в отличие от гипертермического воздействия) оставалась на исходном уровне в течение первого получаса, но снижалась до 70% от контроля по
прошествии 60 мин эксперимента (рис. 3). Быстрые, но несущественные изменения в работе
ГТ (рис. 4) также свидетельствовали о незначительном вкладе данного фермента в развитие
адаптивной реакции.
Общий пул глутатиона не претерпевал существенных изменений, хотя и наблюдалась тенденция к его снижению (таблица). Динамика
отношения окисленной и восстановленной
форм глутатиона характеризовалась быстрым
обратимым окислением GSH и восстановлением прежнего соотношения через 5–10 мин после
обработки вследствие сильного окислительного
Активность СОД, усл. ед. / (мг белка ⋅ мин)
10
9
усл. ед. / (мг белка * мин)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
Время,
мин
время, мин
100 мкМ PQ
50
60
500 мкМ PQ
Активность ГР,
мкмоль НАДФН / (мг белка ⋅ мин)
Активность ГТ,
мкмоль НАДФН / (мг белка ⋅ мин)
Рис. 5. Активность СОД в хлоропластах при обработке паракватом (PQ)
Время, мин
а
Время, мин
б
Рис. 6. Активность ГР (а) и ГТ (б) в хлоропластах при обработке паракватом (PQ)
Прооксидантно – антиоксидантный статус хлоропластов гороха... 2.
воздействия на redox-систему пластид одномоментно введенного Н2О2.
В настоящее время не существует единого
мнения о влиянии параквата на работу АОсистемы, что, по-видимому, является следствием сложной дозовой зависимости и специфики
ответной реакции различных объектов исследования [19, 20]. В наших экспериментах введение
в суспензию хлоропластов 100 мкМ PQ приводило к незначительному снижению активности
СОД – до 80% от исходного уровня к 60 мин
экспозиции (рис. 5).
Однако при увеличении концентрации исследуемого гербицида до 500 мкМ ингибирование фермента сменялось его активацией (до
120–150% от контрольного уровня) к 30–60 мин
обработки (рис. 5).
Как и при действии Н2О2, при введении 100
мкМ PQ активность ГР уменьшалась через 15
мин экспозиции; увеличение концентрации PQ
до 500 мкМ приводило к стабилизации фермента, и его активность сохранялась на исходном
уровне в течение всего эксперимента (рис. 6а).
В отличие от предыдущих стрессоров, 100
мкМ PQ не вызывал изменения активности ГТ.
В то же время обработка 500 мкМ PQ приводила к значительной активации фермента через 30
минут воздействия (до 200%) (рис. 6б).
Такая реакция фермента, по-видимому, отражает существенные окислительные изменения в хлоропластах и является адаптивной в
условиях роста содержания модифицированных
макромолекул и токсичных продуктов распада.
Последующее снижение активности фермента
связано с особенностями изолированных органелл.
Максимальное соотношение GSSG/GSH, отмеченное при обработке 500 мкМ PQ, сопровождалось увеличением общего пула глутатиона,
что могло иметь компенсаторное значение для
работы глутатион-зависимых систем на фоне
резкого снижения содержания в пластидах восстановленной формы этого соединения. В изолированных пластидах исключается возможность перераспределения глутатиона между
компартментами клетки и его транспорта извне
(таблица), при этом хлоропласты обладают всеми изоформами ферментов, необходимыми для
синтеза глутатиона [21], что, вероятно, и определят возможность его накопления.
Таким образом, АО-система обладает значительной лабильностью и чувствительностью к
изменениям окружающей среды, что необходимо для защиты пластид на первых этапах стрессовой реакции, еще до изменения экспрессии
соответствующих генов и синтеза защитных
555
белков. Необходимо отметить зависимость раннего адаптивного ответа АО-системы от характера и интенсивности воздействующего на растение стрессора: активация СОД зарегистрирована при введении экзогенного Н2О2 и в меньшей степени – высокой концентрации PQ; нагревание приводило к усилению работы ГРсистемы; наибольший ответ ГТ, а также индукция синтеза глутатиона в хлоропластах отмечены при обработке 500 мкМ PQ. Подобная специфичность призвана обеспечивать оптимальный защитный эффект путем минимальных затрат на обеспечение устойчивости.
Список литературы
1. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. // Усп. совр.
биол. 1993. Т. 113. Вып. 4. С. 442–455.
2. Калашников Ю.Е., Балахнина Т.И., Бенничелли Р.П., Степневский В., Степневская С.Н. // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 2. С. 268–275.
3. Mittler R. // Tr. Plant Sci. 2002. V. 7. № 9.
P. 405–410.
4. Filek M., Baczek R., Niewiadomska E.,
Pilipowicz M., Kościelniak J. // Acta Biochem. Polonica.
1997. V. 44. № 2. P. 315–322.
5. Hernandez J.A., Almansa M.S. // Physiol. Plant.
2002. V. 115. P. 251–257.
6. Fu J., Huang B. // Environ. Exp. Bot. 2001.
V. 45. P. 105–114.
7. Курганова Л.Н., Балалаева И.В., Веселов А.П.
и др. // Вестник Нижегородского ун-та им.
Н.И. Лобачевского. 2010. № 2 (2). С. 544–549.
8. Курганова Л.Н., Веселов А.П., Синицына
Ю.В., Еликова Е.А. // Физиология растений. 1999.
Т. 46. № 2. С. 218–222.
9. Habig W.H., Pabst M.V., Jacobi W.B. // J. Biol.
Chem. 1974. V. 249. P. 7130–7135.
10. Гланц С. Медико-биологическая статистика.
М.: Практика, 1998. 459 с.
11. Scandalios J.G. // Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses / Еd. J.G. Scandalios. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1997. P. 527–568.
12. Чернов Н.Н. Глутатионредуктаза. Белки и
пептиды. В 2 т. М.: Наука, 1995. Т. 1. С. 78–83.
13. Van Breusegem F., Vranova E., Dat J., Inze D. //
Plant Sci. 2001. V. 161. P. 405–414.
14. Iturbe-Ormaetxe I., Escuredo P.R., ArreseIgor C., Becana M. // Plant Physiol. 1998. V. 116.
P. 173–181.
15. Alscher R.G., Donahue J.L., Cramer C.L. //
Physiol. Plant. 1997. V. 100. P. 224–233.
16. Foyer C.H., Lopez-Delgado H., Dat J.F.,
Scott I.M. // Physiol. Plant. 1997. V. 100. P. 241–254.
17. Gechev T., Gadjev I., Van Breusegem F. et al. //
CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 2002. V. 59. P. 708–714.
18. Kosenko E.A., Kaminsky Y.G., Stavrovskaya I.G. et
al. // FEBS Letters. 1997. V. 410. P. 309–312.
19. Donahue J.L., Okpodu C.M., Cramer C.L., Grabau E.A., Alscher R.G. // Plant Physiol. 1997. V. 113.
Р. 249–257.
556
Л.Н. Курганова , И.В. Балалаева, А.П. Веселов, Е.О. Половинкина, Е.А. Чуманкина
20. Вартанян Л.С. Супероксиддисмутаза. Белки и
пептиды. В 2 т. М.: Наука, 1995. Т. 1. С. 89–95.
21. Noctor G., Arisi A.-C.M., Jouanin L., Kunert K.J.
et al. // J. Exp. Bot. 1998. V. 49. № 321. P. 623–647.
PROOXIDANT-ANTIOXIDANT STATE OF PEA CHLOROPLASTS UNDER THE INFLUENCE
OF ENVIROMENTAL ABIOTIC STRESSORS. 2. ANTIOXIDANT DEFENCE SYSTEM
L.N. Kurganova , I.V. Balalaeva, A.P. Veselov, E.A. Polovinkina, E.A. Chumankina
The analysis of antioxidant enzymes and glutation rate in chloroplasts under the influence of high temperature,
exogenous hydrogen peroxide and the herbicide Paraquat have been performed. Antioxidant activity was shown to
be increased in excluding enzyme biosynthesis conditions. Decreasing glutationreductase activity was determined. It
has been suggested that there are many different ways in which the chloroplasts′ antioxidant system may respond to
different abiotic factors.
Keywords: Pisum sativum L., chloroplasts, reactive oxygen species, lipid peroxidation.