Southern Blot
advertisement
Гибридизация нуклеиновых кислот Гибридизация нуклеиновых кислот Tm – температура плавления Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот • Хорошо охарактеризованная ДНК или олигонуклеотидные фрагменты (зонды) используются для поиска близких последовательностей в тестовых образцах • Основаны на специфичности спаривания нуклеотидов • Используется однонитевая ДНК • Одна из цепей метится (радиоизотопы, химически модифицированные группы), другая крепится на фазу • Стабильность гетеродуплексов зависит от степени комплементарности, а также от длины комплементарного участка, температуры и ионного состава раствора Формирование гетеродуплексов при гибридизации Температура плавления дуплексов Неспаренность (mismatch) при гибридизации нуклеиновых кислот > 100 нуклеотидов ~ 20 нуклеотидов Мечение и фиксация на твердой фазе Мечение ДНК при помощи никтрансляции (nick translation) Мечение с использованием случайных праймеров Меченье РНК зондов в процессе транскрипции Типы меток • Радиоактивные • Флуоресцентные • Метки с непрямой детекцией Радиоактивные метки Авторадиография Флуоресцентные метки Флуоресцентная микроскопия Метки с непрямой детекцией Метки с непрямой детекцией: биотин, дигоксигенин Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот • Southern blot, northern blot, western blot, southwestern blot, eastern blot • Microarray • FISH, TISH Southern Blot • Разрезание ДНК • Электрофорез ДНК • Перенос ДНК на мембранный фильтр • Гибридизация • Визуализация Перенос на мембрану • ДНК в геле денатурируется под воздействием щелочи • Пассивный перенос (за счет диффузии) ДНК из геля на мембрану (нитроцеллюлоза или нейлон) • Мембрана отделяется от геля и гибридизуется с зондами Зонд • Олигонуклеотид с известной последовательностью ДНК • Последовательность комплементарна искомому гену (или другому фрагменту хромосомы) • Однонитевая ДНК • Помечен радиоактивным фосфором или флуоресцентной группой Гибридизация • Температура и солевой состав контролируются для оптимальной гибридизации • Зонд с целевой последовательностью образуют двунитевую молекулу ДНК • Несвязавшиеся зонды отмываются Визуализация радиоактивной метки • Мембрана контактирует с рентгеновской пленкой • Авторадиограмма на соответствует положению радиоактивного зонда на мембране DNA from normal individual digested with Eco R1 and electrophoresed through agarose DNA from mutant individual digested with Eco R1 and electrophoresed through agarose Example II RFLP deletion mutation Example III Amplification Типы блоттинга Southern blot • ДНК • Гибридизация с ДНК Northern blot • РНК • Гибридизация с ДНК Western blot • Белки • Гибридизация с антителами Southwestern blot • Белки, связанные с ДНК • Гибридизация с ДНК Eastern blot • Посттрансляционные модификации белков • Гибридизация с антителами Northern blot Поиск мРНК в разных тканях Dot-blot Анализ мутации серповидноклеточной анемии ДНК стрипы Зонды – на твердой фазе Образцы ДНК – помечены 28 ДНК стрипы 29 ДНК стрипы 30 ДНК стрипы 31 DNA-microarray • Технология микрочипов позволяет проводить огромное количество гибридизаций одновременно • Зонды зафиксированы на твердой фазе, образцы ДНК мечены флуорофорами Гибридизация на микрочипе 1. Получение одноцепочечных меченных молекул ДНК исследуемого образца (PCR, RT-PCR) 2. Гибридизация 3. Отмывка несвязавшейся ДНК 4. Считывание флюоресценции Микрочипы (microarrays) Микрочипы (microarrays) Affymetrix GeneChip Микрочип на 40000 проб Применение микрочипов • • • • • • • Анализ экспрессии Сравнительная гибридизация геномов Идентификация организма Анализ полиморфизмов Иммунопреципитация хроматина на чипе Анализ альтернативного сплайсинга Анализ перестроек Экспрессионный профиль Сравнение экспрессии Сравнительная гибридизация геномов Иммунопреципитация хроматина на чипе - для поиска участков связывания белков с ДНК Способы формирования микроструктуры чипа - Гидрогелевые чипы - Прямая иммобилизация на твердой фазе - Твердофазный синтез на субстрате Гидрогелевые чипы Прямая иммобилизация на твердой фазе • Ковалентное связывание зонда с твердой поверхностью (стекло) • Нанесение зондов на твердую фазу при помощи роботизированных систем печати Принципы печати микрочипов Твердофазный синтез на субстрате FISH — fluorescence in situ hybridization Флуоресцентная гибридизация in situ in situ (лат.) – на месте Зонды метят флуорофорами или метками с непрямой детекцией Образец ДНК денатурируют в фиксированных препаратах клеток Этапы FISH Подготовка зондов Подготовка препарата •(фиксация хромосом) Гибридизация •Денатурация •Гибридизация •Отмывка после гибридизации Анализ результатов Зонды для FISH (размер до нескольких сотен килобаз) • • • • Центромерные зонды Суб-теломерные специфичные зонды Хромосомные красители Зонды, детектирующие уникальные последовательности хромосомных транслокаций • Зонды, детектирующие делеции • Зонды, детектирующие ген Зонды для FISH Хромосомные зонды Субтеломерные и центромерные зонды Транслокации Филадельфийская хромосома Кино • http://www.youtube.com/watch?v=zvl3uCfwsrw Диагностика хромосомных патологий • Анеуплоидия • Микроделеционные синдромы • Хромосомные перестройки Онкодиагностика • • • • • • • • • Рак мочевого пузыря Рак молочной железы Глиомы Рак легких Саркома Рак предстательной железы Лейкимии Миеломы Лимфомы TISH tissue in situ hybridization Для локализации нуклеиновых кислот (как правило, мРНК) на срезах тканей Спасибо за внимание
