Лекция 3. Генетика митохондрий
advertisement
ГЕНЕТИКА МИТОХОНДРИЙ Лекция 3 раздел ГЕНЕТИКА КЛЕТОЧНЫХ ОРГАНЕЛЛ дисциплина СТРУКТУРНАЯ ГЕНОМИКА Словарик Плазмогены – гены, локализованные в цитоплазме, способные к авторепродукции и передаче наследственной информации Ортологичные гены – гомологичные гены филогенетически родственных организмов, разошедшихся в процессе видообразования Катенаны – соединения, молекулы которых состоят из двух или более циклов, продетых один Генетика клеточных органелл. Лекция 3. Генетика митохондрий ИСТОРИЯ ВОПРОСА История изучения геномов клеточных органелл 1963 г. Маргит и Сильвен Насс открыли мт ДНК (методы микроскопия) Hans Tuppy 1964 г. Эллен Харлсбруннер, Ханс Туппи, Годфрид Шоц открыли мт ДНК (методы биохимические) Gottfried Schatz Особенности геномов клеточных органелл Гены органелл находятся в полиплоидном состоянии Гены органелл не объединяются в зиготе в равных соотношениях Гены органелл случайно распределяются при митотическом делении клетки Гены органелл не подчиняются законам Менделя, которые описывают распределение аутосомных генов в потомстве Генетика клеточных органелл. Лекция 3. Генетика митохондрий МИТОХОНДРИИ Клеточные органеллы – митохондрии Митохондрии – клеточные органеллы, присутствующие в клетках эукариотических организмов, осуществляющие реакции клеточного дыхания с выделением энергии, которая запасается в виде аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) Общие сведения Митохондрии произошли от α-протеобактерий Часть белков эндосимбионта до сих пор функционирует в митохондриях Большая часть предковых генов перенесена в ядерный геном В геноме митохондрий человека осталось закодировано 13 белков Часть белков эндосимбионта потеряна в ходе эволюции Потеря белков митохондрией в основном происходила на ранних этапах эволюции Некоторые утраченные белки заменены неортологичными В митохондриальный протеом в ходе эволюции добавились новые белки В связи с возникновением новых функций у митохондрий по сравнению с бактериальным предком В ходе эволюции происходило увеличение числа субъединиц в больших мультиферментных митохондриальных комплексах Часть белков эндосимбионта до сих пор роаботает в митохондриях (ферменты окислительного фосфорилирования, компоненты рибосом) Часть белков потеряна в ходе эволюции Добавились новые белки (белки системы митохондриального импорта) Генетика клеточных органелл. Лекция 3. Генетика митохондрий НАСЛЕДОВАНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК мт ДНК Митохондрия содержит от 1 до 8 молекул мтДНК (1000-8000 копий на клетку) единого гаплотипа Наследование мтДНК по материнской линии Генетика клеточных органелл. Лекция 3. Генетика митохондрий СТРУКТУРА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК Свойства мтДНК Компактность. Гены rРНК чередуются с генами tРНК. Межгенные участки представлены короткими, в несколько нуклеотидов, вставками. Исключение - петля смещения, или D-петля, протяженностью 1,1 т.п.н. Это не кодирующая структура, обеспечивает ассоциацию мтДНК на мембране органеллы и содержит сайты, необходимые для инициации и регуляции процессов репликации и транскрипции мтДНК. Свойства мтДНК Нестабильность митохондриальный геном нестабилен – скорость эволюции (мутирования) мтДНК превышает таковую для ядерной ДНК в 10-20 раз мтДНК ПОДВЕРЖЕНА МУТАЦИЯМ Гомоплазмия – ни в одной молекуле мтДНК нет мутаций или во всех молекулах мтДНК присутствует мутация Гетероплазмия – мутация присутствует в некоторых молекулах мтДНК Гетероплазмия мтДНК реплицируется независимо от репликации в ядре, поэтому мутации в мтДНК при гетероплазмии накапливаются при делении клетки с гетероплазмией возникает мозаичное распределение ДНК с мутацией Сегрегация генов клеточных органелл Сегрегация – разделение по какому-либо признаку Гомоплазмия. Эффект при гомоплазмии все потомки больной женщины будут больными, т.к. мтДНК попадает в зиготу из яйцеклетки, а мтДНК спермия в основном деградирует в цитоплазме ооцита 90% случаев наследственной оптической нейропатии Лебера Гетероплазмия. Эффект при гетероплазмии уровень содержания мутантной ДНК в разных органах и даже в клетках одного органа различен дисфункция возникает при превышении определенного порога содержания мутантной мтДНК. этот порог различен при разных заболеваниях При гетероплазмии женщина может передать потомству разный уровень мутантной мтДНК, а может вообще не передать мутацию 10% случаев нейропатий Лебера: вероятность передачи заболевания потомству неизвестна мтДНК. Форма мтДНК – кольцевая дц молекула, присутствует в органелле в виде ковалентно замкнутой суперспирализованной формы, ассоциированой с внутренней мембраной митохондрии, формирует ДНК-белковые комплексы – нуклеоиды Компактизация мт ДНК. Tfam (mitochondrial transcription factor A) участвует в пространственной организации нуклеоида Компактизация мт ДНК. Нуклеоид. нуклеоид содержит 1-10 копий мтДНК и белки, участвующие в репликации и транскрипции ДНК Формы мтДНК оpen circle supercoiled circle Основные формы у многоклеточных животных оpen circle head-to-tail circular dimer сat - катенаны 10% у мыши, более 30% у мыши состоят не более чем из 4 молекул ДНК. у человека встречаются катенаны из 8 молекул ДНК supercoiled circle мтДНК в сердечной мышце. мтДНК в сердечной мышце взрослого человека организована в многомерную сеть, содержащий множество линейных геномов, в которой постоянно происходит репликация и рекомбинация Строение дц мтДНК оц ДНК • в мтДНК выделяют H (heavy) тяжелую и L (light) легкую цепи • цепи комплементарны, но различаются по удельной плотности, т.к. содержат разное количество «тяжелых» пуриновых (G) и «легких» пиримидиновых (C) нуклеотидов • в мтДНК присутствует оцДНК оцДНК гибридизуется с материнской L-цепью в районе NCR (noncoding region), формируя трехцепочечную структуру – D-петлю (displacement loop – петля смещения). D-loop регион образован репликацией, инициированной в ОН и терминированной в TAS Регуляторные участки в мтДНК TAS CSB Регуляторные участки в D-петле. NCR единственный некодирующий участок NCR в мт ДНК расположен между генами tRNA Pro и tRNA Phe D-loop LSP Phe Ori H Ori b CSB Pro TAS HSP1 Основные элементы NCR Ori b Ori b 1. ориджин репликации OH и дополнительные ориджины (ori b) 2. участки регуляции репликации CSB (conserved sequence blocks) 3. участок терминации репликации TAS (termination-associated sequence). Белок MTERF может связываться с TAS 4. промоторы для обеих цепей LSP и HSP Структура мтДНК Зона гипервариабельности D-петля содержит консервативные и вариабельные участки Гипервариабельные сегменты наиболее изменчив гипервариабельный сегмент I расположенный между позициями 16024 п.н. и 16400 п.н. Генетика клеточных органелл. Лекция 3. Генетика митохондрий РЕПЛИКАЦИЯ ДНК Особенности процесса репликации мтДНК АССИНХРОННОСТЬ процесса – тяжелая и легкая цепь реплицируются последовательно (сначала образуется дочерняя H, а затем дочерняя L-цепь) НЕПРЕРЫВНОСТЬ процесса (синтез обеих цепей идет непрерывно) Репликация мтДНК. Факторы DNA pol γ mt SSB – single strand DNA binding protein mt DNA helicase TWINKLE Topoisomerases RNase H1 Функции основных факторов репликации Название Функции ДНК полимераза γ вставляет нуклеотиды в новую цепь ДНК Хеликаза TWINKLE расплетает дцДНК Белок SSB связывается с оцДНК Топоизомеразы класса Тopo I и Topo II вносят в ДНК разрыв, снимают супернапряжение RNase Н удаляют РНК праймеры ДНК полимераза γ (POLG) Каталитическая субъединица – 40 кДа (ген POLG) 3’→5’ экзонуклеазная активность 5’→3’ дезоксирибофосфат лиазная активность активность обратной транскриптазы 5’→3’ полимеразная активность Пальцы (оранжевый), ладонь (зеленый) и большой палец (синий) Результат мутаций в гене POLG Хроническая прогрессирующая офтальмоплегия синдром, характеризующийся постепенной атрофией и параличом глазодвигательных мышц Реплисома митохондрий. Основные и вспомогательные факторы Модели репликации мт ДНК А. Strand displacement model – однонаправленный ассиметричный синтез с Ori Н, затем синтез второй цепи с Ori L Б. Strand-coupled model – двунаправленный синтез с образованием θ-структуры В. RITOLS (ribonucleotide incorporation throughout the lagging strand) – отстающая цепь синтезируется в виде РНК, которая затем заменяется на ДНК. А В Б Strand displacement model Этапы: 1. формируется D-петля 2. синтезируется дочерняя Н-цепь 3. синтезируется дочерняя L-цепь 1 2 3 Инициация репликации PMID:17408359 РНК-полимераза POLRMТ синтезирует РНК-праймеры для ДНК-полимеразы γ POLRMT связывается с LSP, чтобы синтезировать полноразмерный транскрипт. Он разрезается или терминируется с образованием РНКпраймера длиной 25-75 нуклеотидов на ori L POLRMT синтезирует праймер Репликация мтДНК млекопитающих 1 этап – образование D-петли D-петля состоит из дц и оц (отодвинутой части Нцепи) участков. дц участок формируется частью L-цепи и комплементарным ей синтезированным фрагментом ДНК длиной 450-650 нуклеотидов, имеющим на 5'-конце затравку, которая соответствует точке начала синтеза Н-цепи (ori H) Репликация мтДНК млекопитающих 2 этап – синтез Н-цепи Синтезируются короткие РНК-транскрипты, которые служат праймерами для начала репликации Н-цепи Репликация мтДНК млекопитающих 3 этап – синтез L-цепи Синтез L-цепи начинается, когда Н-цепь доходит до точки ori L, т.к. область инициации репликации L-цепи доступна для ДНК-полимераз лишь в одноцепочечном состоянии. Дочерние цепи мтДНК синтезируются непрерывно и асинхронно. Генетика клеточных органелл. Лекция 3. Генетика митохондрий ТРАНСКРИПЦИЯ РНК Общие сведения в мтДНК записаны мт-белки и большинство мтРНК (за исключением нескольких sРНК и части tРНК, которые транспортируются в митохондрию из цитоплазмы) Особенности транскрипции мтДНК Транскрипция ДНК в митохондриях тесно связана с репликацией Синтез цепи начинается всегда в одном и том же месте, над oriH rРНК вырезаются из длинного и короткого транскриптов Н-цепи tРНК и mРНК образуются в результате процессинга из транскриптов обеих цепей ДНК Митохондриальный геном человека содержит 37 генов: PMID: 22137970 На L-цепи – 8 tРНК + 1 mРНК На Н-цепи – 2 rРНК + 14 tРНК +12 mРНК. гены мтДНК у животных не содержат интронов Участники транскрипции мтДНК Минимальный необходимый аппарат транскрипции: мт РНК-полимераза факторы инициации: mtTFA (Tfam), Tfb1m и/или Tfb2m факторы терминации: mTERF Факторы Характеристика мт РНК-полимераза, POLRmt у млекопитающих белок (120 кДа) гомологичный РНКполимеразам дрожжей Tfam у млекопитающих белок (24 кДа) специфически связывает мтДНК, изгибает и расплетает ее метилтрансферазы Tfb1m и Tfb2m взаимодействуют с С-концевым доменом Tfam, необходимы для узнавания мтРНК-полимеразой промотора mTERF белок (34 кДа) специфически связывается с POLRmt и переносит ее с сайта терминации на сайт инициации транскрипции мтДНК РНК-полимераза POLRMT PMID: 22551784 Способна осуществлять транскрипцию только в присутствии Tfam и одного из транскрипционных факторов: Tfbm1 или Tfbm2 Tfam – транскрипционный фактор, стимулирующий активность POLRMT на двух промоторах: LSP и HSP1, связывается с ДНК upstream от промотора. Его уровень направленно регулирует транскрипцию комплексами Tfbm1/POLRMT и Tfbm2/POLRMT in vitro. Транскрипция мтДНК PMID: 22137970 Три транскрипта: 1) с HSP1 – в D-loop 2) с HSP2 – upstream 5’-конца 12 S rRNA (слабый промотор) 3) с LSP – в D-loop Транскрипция мтДНК млекопитающих В области D-петли расположены два промотора: HSP инициирует транскрипцию основной кодирующей Н-цепи LSP - комплементарной легкой Lцепи На LSP инициируется синтез коротких РНК-транскриптов, которые служат праймерами для начала репликации Н-цепи Транскрипция мтДНК млекопитающих Каждая из цепей мтДНК транскрибируется с образованием одной молекулы РНК, начинающейся в районе ori H. Кроме длинных молекул РНК, комплементарных Н- и L-цепям, формируются и более короткие участки Н-цепи, которые начинаются в той же точке и заканчиваются на 3'-конце гена 16S rРНК Транскрипция мтДНК млекопитающих Коротких транскриптов в 10 раз больше, чем длинных. В результате процессинга из них образуются 12S rРНК и 16S rРНК, участвующие в формировании митохондриальных рибосом, а также фенилаланиновая и валиновая tРНК. Транскрипция мтДНК млекопитающих из длинных транскриптов вырезаются остальные tРНК и образуются транслируемые mРНК, 3’-концы которых полиаденилируются, а 5'концы не кэпируются. Сплайсинг не происходит, т.к. митохондриальные гены млекопитающих не содержит интронов. Терминация транскрипции PMID: 22137970 Терминация транскрипции осуществляется mTERF1 •транскрипт Н1 терминируется внутри tRNA Leu •транскрипт L – вероятно, также терминируется внутри tRNA Leu •транскрипт Н2 - точное место терминации неизвестно 60 А-С. mTERF связывается вдоль большой бороздки ДНК это приводит к изгибу ДНК на 25о D-E. Затем концы ДНК вновь принимают В-форму, а центральная часть молекулы расплетается. F. три нуклеотида (А на L-цепи и С и Т на Н-цепи) «выворачиваются» из дцДНК и стабилизируются в таком состоянии аминокислотами R162, F234, Y288 (аргинин, фенилаланин, тирозин). PMID: 20550934 три нуклеотида (А на L-цепи и С и Т на Н-цепи) «выворачиваются» из дцДНК и стабилизируются в таком состоянии аминокислотами R162, F234, Y288 Генетика клеточных органелл. Лекция 3. Генетика митохондрий ПРОЦЕССИНГ МТДНК Процессинг митохондриальных РНК в результате транскрипции мтДНК образуются полицистронные прекурсоры (предшественники) Процессинг включает • разрезание полицистронных прекурсоров • полиаденилирование mРНК • модификацию нуклеотидов Процессинг мт tРНК процессинг 5’-конца – РНКаза Р процессинг 3’-конца – РНКаза Z (ELAC2) на 3’-конец tРНК добавляется триплет ССА – АТР(СТР)-tРНК трансфераза модифицируются нуклеотиды – метилаза Процессинг мт rРНК нарезание полицистронного транскрипта деметилирование Процессинг мт mРНК Полиаденилирование (mtРАР (poly (A)-polymerase) мт-mРНК имеют 3’-poly (A) длиной около 45 нуклеотидов Полиаденилирование мт mРНК. Значение В митохондриях функции poly (A) различны у разных организмов: дрожжи – нет poly (A), есть АU-богатый участок, необходимый для стабилизации простейшие – короткий poly (A) стабилизирует транскрипт во время редактирования, затем poly (A) удлиняется для трансляции Генетика клеточных органелл. Лекция 3. Генетика митохондрий ТРАНСЛЯЦИЯ МТ БЕЛКОВ Рибосомы ТЭМ – трансмиссионный электронный микроскоп мт рибосомы – 55S у животных 39S – 16rРНК 28S – 12rРНК) Рибосомы матрикса митохондрий отличаются от рибосом ЭПС на рибосомах митохондрий образуется около 5% от всех мт-белков. основная часть белков митохондрий, кодируется ядерным геномом, синтезируется на рибосомах ЭПС и транспортируется по ее каналам к месту сборки Особенности генома митохондрий ОТКЛОНЕНИЯ ОТ УНИВЕРСАЛЬНОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА мт АУА кодирует метионин вместо изолейцина мт АГА и АГГ являются стоп-кодонами вместо аргинина мт УГА кодирует триптофан вместо стоп-кодона Митохондриальный генетический код Универсальный генетический код Особенности генома митохондрий ОДНА МОЛЕКУЛА TРНК УЗНАЕТ СРАЗУ ЧЕТЫРЕ КОДОНА 22 мт tРНК достаточно для узнавания 64 кодонов, тогда как для обычных рибосом их должно быть не менее 32, а у некоторых организмах найдено до 61. Особенности генома митохондрий РЕДАКТИРОВАНИЕ РНК включает замену Ц на У в строго определенных местах либо, наоборот, происходит замена У на Ц процесс осуществляется специфическими ферментами, исправлению подвергаются различные участки РНК, преимущественно участки, кодирующие аминокислоты Особенности генома митохондрий ПЕРЕКРЫВАНИЕ ГЕНОВ Например, в митохондриальном геноме курицы ген тирозиновой tРНК перекрывается одним нуклеотидом с геном цистеиновой tРНК
