Подлипаева Ю.И., Фульда С., Гудков А.В.

Реклама
2014
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 56, ¹ 7
ÑÒÐÅÑÑÎÂÛÅ ÁÅËÊÈ Â ÊËÅÒÊÀÕ ÊÐÀÑÍÎÉ ÂÎÄÎÐÎÑËÈ
PORPHYRA PURPUREA (RHODOPHYTA)
© Þ. È. Ïîäëèïàåâà,1 Ñ. Ôóëüäà,2 À. Â. Ãóäêîâ1
1 Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã, Ðîññèÿ,
è 2 Èíñòèòóò áèîëîãè÷åñêèõ íàóê Óíèâåðñèòåòà Ðîñòîêà, Ãåðìàíèÿ;
ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected], [email protected]
Þ. È. Ïîäëèïàåâà è äð.
Ìåòîäàìè èììóíîáëîòèíãà ñ äâóìÿ ñïîñîáàìè âèçóàëèçàöèè (îêðàñêà ùåëî÷íîé ôîñôàòàçîé è
ECL) ïîêàçàíî ïðèñóòñòâèå ñòðåññîâûõ áåëêîâ â êëåòêàõ òàëëîìîâ êðàñíîé âîäîðîñëè Porphyra purpurea èç ïðîëèâà Êàòòåãàò Áàëòèéñêîãî ìîðÿ. Ïðè îáðàáîòêå áëîòîâ àíòè-Hsp70-àíòèòåëàìè ó êîíòðîëüíûõ îðãàíèçìîâ âûÿâëÿåòñÿ ñëàáîîêðàøåííàÿ (ñëàáîñâåòÿùàÿñÿ) çîíà, ñîîòâåòñòâóþùàÿ áåëêó ñ ìîë.
ìàññîé 70 êÄà, à òàêæå çîíà, ñîîòâåòñòâóþùàÿ ïîëèïåïòèäó ñ ìîë. ìàññîé ïðèáëèçèòåëüíî 40 êÄà
(óñëîâíî «Hsp40»). Ó âîäîðîñëåé, ïîäâåðãíóòûõ òåïëîâîìó øîêó ïðè 28 °C â òå÷åíèå 1 ÷, ïîñëå ïðîâåäåíèÿ õåìèëþìèíåñöåíòíîé ðåàêöèè îòìå÷àþòñÿ «ðàñõîä» áåëêà 70 êÄà è çàìåòíàÿ èíäóêöèÿ «Hsp40»,
îñîáåííî ñèëüíî âûðàæåííàÿ ÷åðåç 24 ÷ ïîñëå òåïëîâîãî øîêà.
Ñòðåññîâûå áåëêè â êëåòêàõ êðàñíîé âîäîðîñëè Porphyra purpurea
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: Porphyra, Rhodophyta, áåëêè òåïëîâîãî øîêà, ñòðåññîâûå áåëêè, Hsp70.
Îñíîâíîå âíèìàíèå èññëåäîâàòåëåé ïðè èçó÷åíèè
áåëêîâ òåïëîâîãî øîêà ó êðàñíûõ âîäîðîñëåé òðàäèöèîííî óäåëÿåòñÿ ïîäñåìåéñòâó DnaK Hsp70 — áåëêàì áàêòåðèàëüíîãî ïðîèñõîæäåíèÿ èç õëîðîïëàñòîâ è ìèòîõîíäðèé. Èì ïîñâÿùåí öåëûé ðÿä ðàáîò, â òîì ÷èñëå ïðîèçâåäåíî ñåêâåíèðîâàíèå ãåíîâ ýòèõ áåëêîâ ó ðàçíûõ
ïðåäñòàâèòåëåé Rhodophyta (Reith, Munholland, 1991;
Renner, Waters, 2007).  òî æå âðåìÿ ñóùåñòâóåò íà óäèâëåíèå ìàëî äàííûõ îòíîñèòåëüíî öèòîïëàçìàòè÷åñêîãî
Hsp70 ó ýòèõ æå îðãàíèçìîâ. Áûë ëèøü îòìå÷åí íåêîòîðûé åãî äåôèöèò ó âîäîðîñëåé ïî ñðàâíåíèþ ñ ïîêðûòîñåìåííûìè ðàñòåíèÿìè (Renner, Waters, 2007). Íàì íå
óäàëîñü íàéòè êàêèõ-ëèáî ñâåäåíèé, óêàçûâàþùèõ íà
êîððåëÿöèþ ìåæäó ýêñïðåññèåé ãåíà è ñîäåðæàíèåì áåëêà Hsp70 â êëåòêàõ, òàê æå êàê è ðàáîò, êàñàþùèõñÿ ôóíêöèîíèðîâàíèÿ øàïåðîííîé ñèñòåìû êðàñíûõ âîäîðîñëåé,
â òîì ÷èñëå ëèòîðàëüíûõ, ðåãóëÿðíî ïîäâåðãàþùèõñÿ
ñòðåññàì ðàçëè÷íîé ïðèðîäû.
Èññëåäîâàíèå öèòîïëàçìàòè÷åñêèõ ñòðåññîâûõ áåëêîâ ó êðàñíûõ âîäîðîñëåé èìååò òàêæå ñóùåñòâåííîå çíà÷åíèå ñ òî÷êè çðåíèÿ ôóíäàìåíòàëüíîé áèîëîãèè. Ïðåäñòàâèòåëåé Rhodophyta ïî óðîâíþ èõ îðãàíèçàöèè òðàäèöèîííî îáúåäèíÿþò ñ äðóãèìè íèçøèìè ýóêàðèîòàìè, â
÷àñòíîñòè îäíîêëåòî÷íûìè, â åäèíîå öàðñòâî Protista
(Cavalier-Smith, 2010; Adl et al., 2012). Ïðè ýòîì óíèêàëüíûå áèîõèìè÷åñêèå õàðàêòåðèñòèêè êðàñíûõ âîäîðîñëåé,
îòñóòñòâèå æãóòèêîâûõ êëåòîê íà âñåõ ñòàäèÿõ æèçíåííîãî öèêëà, à òàêæå äàííûå ñåêâåíèðîâàíèÿ ÄÍÊ óêàçûâàþò íà èõ î÷åíü ðàííåå ïðîèñõîæäåíèå, íåçàâèñèìîå îò
ïðåäêîâûõ ôîðì ýóêàðèîò (Moreira et al., 2000).
Íàøè ðàáîòû, ïîñâÿùåííûå èçó÷åíèþ Hsp70 ó ïðåäñòàâèòåëåé ðÿäà òàêñîíîâ Protista — ëîáîçíûõ àìåá, àêàíòàìåá è èíôóçîðèé, — ïîçâîëèëè óñòàíîâèòü íåêîòîðûå
îñîáåííîñòè ôóíêöèîíèðîâàíèÿ èõ øàïåðîííûõ ñèñòåì è
Áåëêè òåïëîâîãî øîêà (heat shock proteins — Hsp) —
ñòðåññîâûå áåëêè, â íàñòîÿùåå âðåìÿ àêòèâíî èçó÷àþòñÿ
ó öåëîãî ðÿäà îðãàíèçìîâ, ñðåäè êîòîðûõ ïðåîáëàäàþò
ïðîêàðèîòû èëè âûñøèå ýóêàðèîòû (æèâîòíûå è ðàñòåíèÿ). Íàèáîëåå ïîëíî èçó÷åíû ñòðåññîâûå áåëêè ñ ìîë.
ìàññîé 70 êÄà (Hsp70), ÿâëÿþùèåñÿ âûñîêîêîíñåðâàòèâíûìè áåëêàìè ñ íèçêîé âèäîâîé ñïåöèôè÷íîñòüþ è âûðàæåííîé øàïåðîííîé àêòèâíîñòüþ. Îíè ïðèñóòñòâóþò â
êëåòêàõ ðàñòåíèé è æèâîòíûõ êàê â êîíñòèòóòèâíîé, òàê
è â èíäóöèáåëüíîé ôîðìàõ è ëîêàëèçóþòñÿ â ðàçëè÷íûõ
êëåòî÷íûõ êîìïàðòìåíòàõ — öèòîïëàçìå, ìèòîõîíäðèÿõ,
õëîðîïëàñòàõ è ýíäîïëàçìàòè÷åñêîì ðåòèêóëóìå (Lindquist, 1986; Feder, Hofmann, 1999; Ìàðãóëèñ, Ãóæîâà, 2000;
Áåðãåð, Ïîäëèïàåâà, 2013). Èìåííî öèòîïëàçìàòè÷åñêèå
Hsp70 íåñóò îñíîâíóþ øàïåðîííóþ ôóíêöèþ â êëåòêå è
îòâå÷àþò çà ðåàêöèþ íà ñòðåññ (heat shock response — Hsr).
Î ñòðåññîâûõ áåëêàõ êðàñíûõ âîäîðîñëåé (Rhodophyta) äî íàñòîÿùåãî âðåìåíè èçâåñòíî î÷åíü ìàëî. Ýòî ïðè
òîì, ÷òî íåêîòîðûå èç ýòèõ âîäîðîñëåé, â ÷àñòíîñòè ïîðôèðà (Porphyra spp.), — øèðîêî ðàñïðîñòðàíåííûå îðãàíèçìû, ÿâëÿþùèåñÿ âàæíûì ýêîëîãè÷åñêèì êîìïîíåíòîì, îïðåäåëÿþùèì êîíôèãóðàöèþ áèîòîïîâ ìíîãèõ
ìåëêèõ æèâîòíûõ, ïðîòèñòîâ è áàêòåðèé, òàê èëè èíà÷å
èñïîëüçóþùèõ òàëëîìû Porphyra â êà÷åñòâå ñðåäû îáèòàíèÿ. Êðîìå òîãî, íåêîòîðûå âèäû ïîðôèðû ñúåäîáíû è
âî ìíîãèõ ñòðàíàõ èõ òðàäèöèîííî óïîòðåáëÿþò â ïèùó.
Ïîýòîìó âíèìàíèå èññëåäîâàòåëåé ñîñðåäîòî÷åíî íà
ïðî÷òåíèè ãåíîìîâ ýòèõ âîäîðîñëåé (Nakamura et al.,
2013), íà ïîâûøåíèè èõ óðîæàéíîñòè ïóòåì ñîçäàíèÿ áîëåå óñòîé÷èâûõ è æèçíåñïîñîáíûõ «ãèáðèäîâ», òîëåðàíòíûõ ê ðàçëè÷íûì ñòðåññàì (Blouin, 2011), à òàêæå íà
àíàëèçå âåùåñòâ, îáóñëîâëèâàþùèõ âûñîêóþ óñòîé÷èâîñòü íåêîòîðûõ âèäîâ ïîðôèðû ê ñòðåññàì (Jia et al.,
2013).
536
Ñòðåññîâûå áåëêè â êëåòêàõ êðàñíîé âîäîðîñëè Porphyra purpurea
ïðåäïîëîæèòü, ÷òî íèçøèå ýóêàðèîòû ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé êàê áû ïîëèãîí, íà êîòîðîì ïðîèñõîäèëî ôîðìèðîâàíèå è ñòàíîâëåíèå ìåõàíèçìîâ àäàïòàöèè è çàùèòíûõ ñèñòåì ýóêàðèîòè÷åñêîé êëåòêè (Podlipaeva, 2001; Ïîäëèïàåâà è äð., 2008; Ñìóðîâ è äð., 2010; Goodkov et al., 2010).
 ýòîì êîíòåêñòå èçó÷åíèå öèòîïëàçìàòè÷åñêîãî Hsp70 ó
ïðåäñòàâèòåëåé Rhodophyta î÷åíü âàæíî êàê ñ òî÷êè çðåíèÿ ðàñøèðåíèÿ ñïåêòðà èçó÷àåìûõ ìàêðîòàêñîíîâ íèçøèõ ýóêàðèîò, äàëåêî îòñòîÿùèõ äðóã îò äðóãà â ôèëîãåíåòè÷åñêîì îòíîøåíèè, òàê è ñ òî÷êè çðåíèÿ âûÿâëåíèÿ
âîçìîæíîé ñïåöèôèêè ôóíêöèîíèðîâàíèÿ øàïåðîííûõ
ñèñòåì ó ýâîëþöèîííî äðåâíèõ, ðàíî äèâåðãèðîâàâøèõ
ãðóïï Protista.
Çàäà÷à íàñòîÿùåé ðàáîòû ñîñòîÿëà â òîì, ÷òîáû ìåòîäîì èììóíîáëîòèíãà ñ äâóìÿ ðàçëè÷íûìè ñïîñîáàìè
âèçóàëèçàöèè (îêðàñêà ùåëî÷íîé ôîñôàòàçîé è ECL) âûÿâèòü áåëêè òåïëîâîãî øîêà â èíòàêòíûõ êëåòêàõ òàëëîìîâ Porphyra purpurea è âîäîðîñëåé, ïîäâåðãíóòûõ
ñòðåññîâîìó âîçäåéñòâèþ (òåïëîâîé øîê).
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
 ðàáîòå èñïîëüçîâàëè ñâåæèå òàëëîìû âîäîðîñëåé
Porphyra purpurea, ñîáðàííûå â ðàéîíå ïðîëèâà Êàòòåãàò
Áàëòèéñêîãî ìîðÿ ïðè òåìïåðàòóðå 10 °C è ñîëåíîñòè 28 ‰.
Äëÿ ïîëó÷åíèÿ áåëêîâîãî ýêñòðàêòà íåáîëüøèå êóñî÷êè òàëëîìîâ (ïðèìåðíî 5%5 ìì) ïîìåùàëè â ïðîáèðêó, íàïîëíåííóþ ñòåêëÿííûìè øàðèêàìè, è äîáàâëÿëè
150 ìêë ýêñòðàãèðóþùåãî áóôåðà (ñì.: Podlipaeva, 2001).
Ïðîáèðêó âñòðÿõèâàëè â øåéêåðå äâàæäû ïî 10 ñ, ïîñëå
÷åãî ïîëó÷åííûé ãîìîãåíàò öåíòðèôóãèðîâàëè 20 ìèí
ïðè 10 000 îá/ìèí è 4 °C. Ñóïåðíàòàíò ïåðåíîñèëè â ýïïåíäîðôû è ãîòîâèëè ïðîáû äëÿ ïðîâåäåíèÿ áåëêîâîãî
ýëåêòðîôîðåçà ïî ñòàíäàðòíîé ìåòîäèêå (Laemmli, 1970),
ïðåäâàðèòåëüíî îïðåäåëèâ êîíöåíòðàöèþ áåëêà â àëèêâîòå êàæäîé ïðîáû ìåòîäîì Áðýäôîðä (Bradford, 1976).
Äëÿ ïðîâåäåíèÿ òåïëîâîãî øîêà òàëëîìû ïîðôèðû,
íàõîäèâøèåñÿ â êþâåòå ñ ìîðñêîé âîäîé (28 ‰), ïîìåùàëè íà 1 ÷ â òåðìîñòàò ïðè 28 °C. Ãîìîãåíàòû è ïðîáû äëÿ
ýëåêòðîôîðåçà ïðèãîòîâëÿëè íåìåäëåííî ïîñëå ïðîâåäåíèÿ òåïëîâîãî øîêà, ÷åðåç 4 è 24 ÷ ïîñëå øîêà, ÷òîáû
îïðåäåëèòü äèíàìèêó ðàçâèòèÿ Hsr â êëåòêàõ âîäîðîñëè.
SDS-ýëåêòðîôîðåç â 10%-íîì ÏÀÀÃ ïðîâîäèëè â
óñòðîéñòâå äëÿ ýëåêòðîôîðåçà Mini-PROREAN 3 BIORAD. Ãåëè ïîñëå ýëåêòðîôîðåçà îêðàøèâàëè Êóìàññè.
Ýòîò æå ïðèáîð âïîñëåäñòâèè èñïîëüçîâàëè äëÿ ïðîâåäåíèÿ ýëåêòðîáëîòèíãà.
Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ìîëåêóëÿðíîé ìàññû âûÿâëÿåìûõ
ïîëèïåïòèäîâ èñïîëüçîâàëè ìàðêåðû ColourBurst electrophoresis marker (m. w. 8000—220 000 Da; Sigma-Aldrich,
ÑØÀ). Ìåìáðàíû îáðàáàòûâàëè àíòèòåëàìè, âûðàáîòàííûìè ïðîòèâ Hsp70 (SPA-822, Enzo Life Sciences,
ÑØÀ—Øâåéöàðèÿ), çàòåì âòîðè÷íûìè àíòèòåëàìè,
êîíúþãèðîâàííûìè ëèáî ñî ùåëî÷íîé ôîñôàòàçîé (Sigma Chemical Company, ÑØÀ) äëÿ ïîëó÷åíèÿ öâåòíîé
ôåðìåíòàòèâíîé ðåàêöèè (AP), ëèáî àíòèòåëàìè, êîíúþãèðîâàííûìè ñ ïåðîêñèäàçîé õðåíà (Sigma Chemical
Company, ÑØÀ) äëÿ äàëüíåéøåãî âûÿâëåíèÿ èììîáèëèçîâàííûõ íà ìåìáðàíå è ïîìå÷åííûõ áåëêîâûõ çîí
(ECL).  ïîñëåäíåì ñëó÷àå ìåìáðàíû îáðàáàòûâàëè ëþìèíåñöèðóþùèì ðàñòâîðîì (9 ìêÌ ð-êóìàðîâîé êèñëîòû â ÄÌÑÎ, 17.5 ìêÌ ëþìèíîëà â 0.1 Ì Òðèñ-ÍÑl-áóôåðå, ðÍ 8.5, è 90 ìêÌ ïåðåêèñè âîäîðîäà) â òå÷åíèå
1—5 ìèí. Ïëåíêó (Fudji) ýêñïîíèðîâàëè 1—5 ìèí, çàòåì
537
ñêàíèðîâàëè. Èíòåíñèâíîñòü ñâå÷åíèÿ çîí íà ïëåíêå èçìåðÿëè â îòí. åä. ïðè ïîìîùè äåíñèòîìåòðà BIO-RAD
GS-800 (Ãåðìàíèÿ).
 êà÷åñòâå êîíòðîëÿ ïðèñóòñòâèÿ Hsp70 íà áëîòàõ è
ïëåíêàõ èñïîëüçîâàëè ïðîáó, ïðèãîòîâëåííóþ èç êëåòîê
æàáðû áåëîìîðñêîé ìèäèè Mytilus edulis, ñîäåðæàùèõ
Hsp70 êàê êîíñòèòóòèâíî, òàê è â ñòðåññîâûõ óñëîâèÿõ
(Ïîäëèïàåâà, Áåðãåð, 2012).
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Íà ðèñ. 1 ïðåäñòàâëåí ñïåêòð îáùåãî áåëêà òàëëîìà
Porphyra purpurea ïîñëå ýëåêòðîôîðåçà â 10%-íîì
ÏÀÀÃ. Îáðàùàåò íà ñåáÿ âíèìàíèå îòñóòñòâèå â ãåëå
ïîñëå ýëåêòðîôîðåçà âèäèìûõ îêðàøåííûõ áåëêîâûõ çîí
ñ ìîë. ìàññîé 70 êÄà è âûøå. Ïî-âèäèìîìó, èõ êîëè÷åñòâî â êëåòêàõ òàëëîìà ïîðôèðû òàê íåâåëèêî, ÷òî äàííûé
ìåòîä îêàçûâàåòñÿ íåäîñòàòî÷íî ÷óâñòâèòåëüíûì äëÿ èõ
âûÿâëåíèÿ ïðè âûáðàííîé íàãðóçêå íà ñòàðòîâûé ãåëü.
Ìàæîðíûå çîíû ðàñïîëàãàþòñÿ â ðàéîíå 58—60 êÄà.
Êðîìå òîãî, îò÷åòëèâî âûÿâëÿåòñÿ áåëîê ñ ìîë. ìàññîé
35—40 êÄà, êîëè÷åñòâî êîòîðîãî â êëåòêàõ òàëëîìà ïîðôèðû ÿâíî âîçðàñòàåò ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëåì ïî ïðîøåñòâèè 24 ÷ ïîñëå òåïëîâîãî øîêà (ðèñ. 1; ñð. äîðîæêè 3 è 6).
Ìåòîäîì èììóíîáëîòèíãà ñ îêðàñêîé AP (ðèñ. 2, à) è
ECL (ðèñ. 2, á) â êëåòêàõ èíòàêòíûõ (êîíòðîëüíûõ) òàëëîìîâ P. purpurea âûÿâëåíî ïðèñóòñòâèå áåëêà ñ ìîë. ìàññîé 70 êÄà (ðèñ. 2, á, äîðîæêà 2), à òàêæå íàëè÷èå áåëêà ñ
ìîë. ìàññîé 35—40 êÄà, íàçûâàåìîãî çäåñü óñëîâíî
Hsp40 (ðèñ. 2, à, äîðîæêà 3; 2, á, äîðîæêè 2—4). Ïî äàííûì äåíñèòîìåòðèè (ñì. òàáëèöó), ñîäåðæàíèå Hsp70,
êîíñòèòóòèâíî ïðèñóòñòâóþùåãî â êëåòêàõ ïîðôèðû, ñîñòàâëÿåò 926.7 îòí. åä., ÷òî áîëåå ÷åì â 2 ðàçà ïðåâûøàåò
ñîäåðæàíèå êîíñòèòóòèâíîãî «Hsp40» — 445.3 îòí. åä.
Ïîñëå òåïëîâîãî øîêà, êîòîðîìó áûëè ïîäâåðãíóòû
âîäîðîñëè (íàãðåâ äî 28 °C â òå÷åíèå 1 ÷), íàáëþäàåòñÿ
çàìåòíàÿ èíäóêöèÿ «Hsp40» (ðèñ. 2, à, äîðîæêà 3); îñîáåííî çíà÷èòåëüíî óðîâåíü äàííîãî áåëêà ïîâûøàåòñÿ
÷åðåç 24 ÷ ïîñëå òåïëîâîãî øîêà (ðèñ. 2, á, äîðîæêà 4).
Ðèñ. 1. Ñïåêòð îáùèõ áåëêîâ êëåòîê òàëëîìà ïîðôèðû Porphyra purpurea è æàáðû ìèäèè Mytilus edulis â íîðìàëüíûõ óñëîâèÿõ è ÷åðåç ðàçíûå ïðîìåæóòêè âðåìåíè ïîñëå òåïëîâîãî
øîêà.
Äîðîæêè: 1 — ìàðêåðû ìîëåêóëÿðíûõ ìàññ; 2 — æàáðû ìèäèè, êîíòðîëü; 3 — ïîðôèðà, êîíòðîëü; 4—6 — ïîðôèðà ñðàçó ïîñëå, ÷åðåç 4 è 24 ÷
ïîñëå òåïëîâîãî øîêà ñîîòâåòñòâåííî (10 % ÏÀÀÃ, îêðàñêà Êóìàññè, íà
ñòàðòå êàæäîé äîðîæêè ãåëÿ 10 ìêã áåëêà).
Þ. È. Ïîäëèïàåâà è äð.
538
Ñîäåðæàíèå áåëêîâ òåïëîâîãî øîêà â êëåòêàõ òàëëîìà Porphyra purpurea
â êîíòðîëå è ïîñëå òåïëîâîãî øîêà ïðè ðàçíûõ óñëîâèÿõ ïðîâåäåíèÿ ECL
Áåëîê
Hsp70, êîíòðîëü
Hsp40, êîíòðîëü
Hsp40, 4 ÷ ïîñëå øîêà
Hsp40, 24 ÷ ïîñëå øîêà
Óðîâåíü áåëêà (îòí. åä.) ïðè ðàçíîì âðåìåíè ýêñïîçèöèè
è îáðàáîòêè ìåìáðàíû, ìèí
1+1
5+5
5+1
926.7
445.3
656.9
5503.5
—
697.4
1045.8
6576.2
—
670.9
972.0
9905.5
Ï ð è ì å ÷ à í è å. Ïî äàííûì äåíñèòîìåòðèè õåìèëþìèíåñöåíòíîé ðåàêöèè.
Ñîäåðæàíèå Hsp70 â êëåòêàõ òàëëîìà ïîðôèðû ïîñëå
òåïëîâîãî øîêà, íàïðîòèâ, íàñòîëüêî ïàäàåò, ÷òî íå âèçóàëèçèðóåòñÿ íà ïëåíêå è íå óëàâëèâàåòñÿ íà äåíñèòîãðàììàõ. Ïî ðåçóëüòàòàì òðåõ èçìåðåíèé (ñì. òàáëèöó) ñîîòíîøåíèå ñðåäíåãî êîëè÷åñòâà «Hsp40» â êîíòðîëå ê êîëè÷åñòâó «Hsp40», ðåãèñòðèðóåìîìó ÷åðåç 4 è 24 ÷ ïîñëå
òåïëîâîãî øîêà, ñîñòàâëÿåò 1 : 1.44 : 11.93.
Òàêèì îáðàçîì, ðåçóëüòàòû íàøèõ èññëåäîâàíèé ïîêàçàëè, ÷òî øàïåðîííàÿ ñèñòåìà P. purpurea õàðàêòåðèçóåòñÿ îòíîñèòåëüíî íèçêèì óðîâíåì ñîäåðæàíèÿ êîíñòèòóòèâíîãî Hsp70 â êëåòêàõ è äîâîëüíî ìåäëåííûì (24 ÷)
ðàçâèòèåì ðåàêöèè íà ñòðåññ (Hsr), ïðè÷åì îñíîâíûì
ó÷àñòíèêîì ýòîãî îòâåòà îêàçûâàåòñÿ áåëîê ñ ìîë. ìàññîé
35—40 êÄà.
Ê íàñòîÿùåìó âðåìåíè â ðÿäå ðàáîò ïîêàçàíî, ÷òî
áåëêè ñ ìîë. ìàññàìè 35, 38 è 40 êÄà êîíñòèòóòèâíî ïðèñóòñòâóþò è íàðÿäó ñ Hsp70 ïðèíèìàþò ó÷àñòèå â Hsr â
êëåòêàõ íåêîòîðûõ ïðîêàðèîòè÷åñêèõ è âûñøèõ ýóêàðèî-
òè÷åñêèõ îðãàíèçìîâ, â ÷àñòíîñòè ìîðñêèõ ìîëëþñêîâ
Mytilus edulis (Ïîäëèïàåâà, Áåðãåð, 2012), òðåõ âèäîâ ðîäà
Tegula (Tomanek, Somero, 2002) è òåðìîôèëüíîé áàêòåðèè Rhodothermus obamensis (Takai et al., 1998). Èçâåñòíî
òàêæå, ÷òî Hsp40 êîíñòèòóòèâíî ïðèñóòñòâóåò â ñîñòàâå
ìóëüòèøàïåðîííîãî êîìïëåêñà (âìåñòå ñ Hsp70 è Hsp90),
àññîöèèðîâàííîãî ñ ôàêòîðîì òåïëîâîãî øîêà HSF-1.
Ïðè ñòðåññîâîì âîçäåéñòâèè, êîãäà íà÷èíàþò ïîÿâëÿòüñÿ
äåíàòóðèðîâàííûå áåëêè, ýòîò êîìïëåêñ äèññîöèèðóåò íà
òðè ìîëåêóëÿðíûõ øàïåðîíà (Hsp40, Hsp70 è Hsp90) è
ÍSF-1(Marimoto, Santoro, 1998; Hochachka, Somero, 2002).
Îäíàêî êàêèå-ëèáî ñâåäåíèÿ î ïðèñóòñòâèè èíäóöèáåëüíîé ôîðìû áåëêà òåïëîâîãî øîêà ñ ìîë. ìàññîé îêîëî
40 êÄà â êëåòêàõ ïðåäñòàâèòåëåé òîãî èëè èíîãî ìàêðîòàêñîíà Protista íàì íåèçâåñòíû.
Ïîëó÷åííûå â íàñòîÿùåé ðàáîòå äàííûå óêàçûâàþò
íà èìåþùóþñÿ ó êðàñíûõ âîäîðîñëåé õîðîøî âûðàæåííóþ ñïåöèôèêó ôóíêöèîíèðîâàíèÿ øàïåðîííîé ñèñòåìû, ÷òî, áåçóñëîâíî, òðåáóåò äàëüíåéøåãî òùàòåëüíîãî
èçó÷åíèÿ.
Ïðèíîñèì ãëóáîêóþ áëàãîäàðíîñòü ä. á. í. È. À. Ãàìàëåé çà öåííûå çàìå÷àíèÿ ïðè ïîäãîòîâêå ðóêîïèñè ê
ïå÷àòè.
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå ïðîåêòà RUS-09/038 (IB/BMBF, Ãåðìàíèÿ).
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Ðèñ. 2. Áåëêè òåïëîâîãî øîêà ìèäèè è ïîðôèðû â íîðìàëüíûõ
óñëîâèÿõ è ïîñëå òåïëîâîãî øîêà.
Ìåòîä èììóíîáëîòèíãà, îêðàñêà ùåëî÷íîé ôîñôàòàçîé (à) è
ECL (á).
a — äîðîæêè: 1 — ìàðêåðû ìîëåêóëÿðíûõ ìàññ; 2 — Hsp70 â êëåòêàõ
æàáðû Mytilus edulis, êîíòðîëü; 3 — «Hsp40» â êëåòêàõ ïîðôèðû ÷åðåç
24 ÷ ïîñëå ïðîâåäåíèÿ òåïëîâîãî øîêà ïðè 28 °C â òå÷åíèå 1 ÷. á — äîðîæêè: 1 — Hsp70 â êëåòêàõ æàáðû M. edulis, êîíòðîëü; 2 — Hsp70 è
«Hsp40» â êëåòêàõ ïîðôèðû, êîíòðîëü; 3, 4 — «Hsp40» â êëåòêàõ ïîðôèðû ÷åðåç 4 è 24 ÷ ïîñëå òåïëîâîãî øîêà ñîîòâåòñòâåííî.
Áåðãåð Â. ß., Ïîäëèïàåâà Þ. È. 2013. Ñòðåññîðíûå áåëêè
è ñîëåíîñòü âíåøíåé ñðåäû. Òð. Çîîë. èí-òà ÐÀÍ. Ïðèëîæåíèå 3. (Ïÿòüäåñÿò ëåò êîíöåïöèè êðèòè÷åñêîé ñîëåíîñòè.)
ÑÏá.: Èçä-âî ÇÈÍ ÐÀÍ. 22—32. (Berger V. Ja., Podlipaeva Yu. I. 2013. Stress proteins and environmental salinity.
Proc. Zool. Inst. RAS. Suppl. 3. SPb.: Publ. Zool. Inst. RAS.
22—32.)
Ìàðãóëèñ Á. À., Ãóæîâà È. Â. 2000. Áåëêè ñòðåññà â ýóêàðèîòè÷åñêîé êëåòêå. Öèòîëîãèÿ. 42 (4) : 323—342. (Margulis B. A., Guzhova I. V. 2000. Stress proteins in eukaryotic cells.
Tsitologiya. 42 (4) : 323—342.)
Ïîäëèïàåâà Þ. È., Áåðãåð Â. ß. 2012. Èçìåíåíèÿ ñîäåðæàíèÿ áåëêîâ òåïëîâîãî øîêà ñåìåéñòâà 70 êÄà â êëåòêàõ æàáåðíîãî ýïèòåëèÿ ìîëëþñêîâ Mytilus edulis L. â çàâèñèìîñòè îò ñîëåíîñòè ñðåäû. Öèòîëîãèÿ. 54 (7) : 580—584. (Podlipaeva Yu.I.,
Berger V. Ja., 2012. The effect of environmental salinity on the level of heat shock proteins in gill epithelium of Mytilus edilis L. mussel. Cell Tissue Biol. 6 (5) : 498—502.)
Ïîäëèïàåâà Þ. È., Ñìóðîâ À. Î, Ãóäêîâ À. Â. 2008. Èçìåíåíèå óðîâíÿ ñîäåðæàíèÿ áåëêà òåïëîâîãî øîêà ñåìåéñòâà
70 êÄà ó èíôóçîðèè Tetrahymena pyriformis â ïðîöåññå àäàïòàöèè ê èçìåíåíèþ ñîëåíîñòè ñðåäû. Öèòîëîãèÿ. 50 (7) : 619—
Ñòðåññîâûå áåëêè â êëåòêàõ êðàñíîé âîäîðîñëè Porphyra purpurea
622. (Podlipaeva Yu.I., Smurov A. O., Goodkov A. V. 2008. Expression of heat-shock protein 70 kDa in Tetrahymena pyriformis during cell adaptation to salinity changes in the medium. Cell Tissue
Biol. 2 (4) : 373—375.)
Ñìóðîâ À. Î., Ïîäëèïàåâà Þ. È., Ñêàðëàòî Ñ. Î., Ãóäêîâ À. Â. 2010. Ñâÿçü ìåæäó ñòåïåíüþ ñîëåóñòîé÷èâîñòè èíôóçîðèé è êîíñòèòóòèâíûì óðîâíåì ñîäåðæàíèÿ Hsp70 â êëåòêàõ. Öèòîëîãèÿ. 52 (12) : 1041—1044. (Smurov A. O., Podlipaeva Yu. I., Skarlato S. O., Goodkov A. V. 2010. Correlations between
salinity-persistence of ciliate species and their constitutive heat
shock protein of 70 kDa contents. Tsitologiya. 52 (12) : 1041—
1044.)
Adl S. M., Simpson A. G. B., Lane Ch.E., Lukes J., Bass D.,
Bowser S. S. et al. 2012. The revised classification of eukaryotes. J.
Eukaryot. Microbiol. 59 : 429—493.
Blouin N. A., Brodie J. A., Grossman A. C., Xu Pu, Brawley S. H. 2011. Porphyra: a marine crop shaped by stress. Trends
Plant Sci. 16 : 29—37.
Bradford M. M. 1976. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle
of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 : 248—254.
Cavalier-Smith T. 2010. Kingdoms Protozoa and Chromista
and the eozoan root of the eukaryotic tree. Biol. Lett. 6 : 342—345.
Feder M. E., Hofmann G. E. 1999. Heat shock proteins, molecular chaperones and the stress response: evolutionary and ecological physiology. Ann. Rev. Physiol. 61 : 243—282.
Goodkov A. V., Smurov A. O., Podlipaeva Yu. I. 2010. Free-living protists as a model for studying heat shock proteins in the cell.
In: Handbook of molecular chaperones: roles, structures and mechanisms. New York: Nova Sci. Publ., Inc. 293—312.
Hochachka P. V., Somero G. N. 2002. Biochemical adaptation.
Mechanism and process in physiological evolution. Oxford: Univ.
Press. 466 p.
Jia Z., Niu J., Huan L., Wu X., Wang G., Hou Z. 2013. Cyclophilin participates in responding to stress situations in Por-
539
phyra haitanensis (Bangiales, Rhodophyta). J. Phycol. 49 :
194—201.
Laemmli U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during
the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 :
681—685.
Lindquist S. 1986. The heat-shock response. Annu. Rev. Biochem. 55 : 1151—1191.
Marimoto R. I., Santoro M. G. 1998. Stress-inducible responses and heat shock proteins: new pharmacologic targets for cytoprotection. Nature Biotech. 16 : 833—838.
Moreira D., Le Guyader H., Phillippe H. 2000. The origin of
red algae and the evolution of chloroplasts. Nature. 405 : 69—72.
Nakamura Y., Sasaki N., Kobayashi M., Ojima N., Yasuike M.
et al. 2013. The first symbiont-free genome sequence of marine red
alga, Susabi-nori (Pyropia yezoensis). PLoS ONE. 8 : e57122. doi :
10.1371/journal.pone.0057122.
Podlipaeva Y. I. 2001. Heat shock protein of 70 kDa in Amoeba proteus. Protistology. 2 : 123—129.
Reith M., Munholland J. 1991. An hsp70 homolog is encoded
on the plastid genome of the red alga, Porphyra umbilicalis. FEBS
Lett. 294 : 116—120.
Renner T., Waters E. 2007. Comparative genomic analysis of
the Hsp70s from five diverse photosynthetic eukaryotes. Cell
Stress Chaperones. 12 : 172—185.
Takai K., Nunoura T., Sako Y., Uchida A. 1998. Acquired thermotolerance and temperature-induced protein accumulation in the
extremely thermophilic bacterium Rhodothermus obamensi. J. Bacteriol. 180 : 2770—2774.
Tomanek L., Somero G. N. 2002. Interspecific- and acclimation-induced variation in levels of heat-shock proteins 70 (hsp70)
and 90 (hsp90) and heat-shock transcription factor-1 (HSF1) in
congeric marine snails (genus Tegula): implications for regulation
of hsp gene expression. J. Exp. Biol. 205 : 677—685.
Ïîñòóïèëà 21 III 2014
STRESS PROTEINS IN THE CELLS OF PORPHYRA PURPUREA (RHODOPHYTA) THALLUS
Yu. I. Podlipaeva,1,* S. Fulda,2 A. V. Goodkov1
1
Institute of Cytology RAS, St. Petersburg, Russia, and 2 University of Rostock, Institute of Biosciences, Germany;
* e-mail: [email protected]
Heat shock proteins have been revealed for the first time by the methods of Western blotting using alkaline
phosphatase and ECL in the cells of Porphyra purpurea from Kattegat area of the Baltic Sea in normal and experimental stress conditions. It was demonstrated with application of monoclonal anti-Hsp70 antibodies that a
slight band about 70 kDa is present constitutively at the film; additionally the polypeptide of about 40 kDa
(«Hsp40») has been detected. After heat shock at 28 °C during 1 hr significant «expenditure» of Hsp70 was observed, as well as the pronounced induction of «Hsp40»; the induction was expressed especially strongly in
24 hr after the stress application.
K e y w o r d s: stress proteins, heat shock proteins, Porphyra, Rhodophyta.
Скачать