удк 543.97 совершенствование методов анализа воды в период

УДК 543.97
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ВОДЫ
В ПЕРИОД БИООБРАСТАНИЙ
Л. В. Боронина, Э. П. Доскина,
А. А. Сахарова, Ю. Н. Гончар, Г. Л. Гиззатова
Рассмотрены методы анализа воды в период биообрастаний.
Ключевые слова: методы для оценки качества воды, биомасса фитопланктона.
The methods of analysis of water during the biofouling.
Keywords: methods for the assessment of water quality, phytoplankton biomass.
На сегодняшний день в большинстве водоемов функция самоочищения ослаблена. В данной работе рассматривается целесообразность совершенствования методик анализа качественного и количественного состава
водной среды водорослей, включающих аппаратурное оформление, выбор
питательной среды и др.
113
Исследования направлены на разработку комплексного механизма,
реализация которого установит функцию самоочищения, позволит сбалансировать жизнедеятельность различных водорослей и избежать в дальнейшем скачков роста синезеленых в мае и августе, тем самым позволив очистным станциям по водоподготовке работать в устойчивом режиме.
Выбор жидкой питательной среды. Для выращивания водорослей
использовалась модифицированная среда Дота, где исходные концентрации одних элементов (например, сахароза, железо) варьируют от опыта
к опыту, а содержание других остается постоянным.
Для избавления от микроорганизмов, способных составить растениям конкуренцию за пищевые ресурсы, среду предварительно автоклавируют. Для полной стерилизации, в случае минеральных сред, обычно достаточно кипячения обогащенной среды в течение 30 мин. под давлением
0,5 атм. После охлаждения альгологически и бактериологически чистые
культуры микроводорослей стерильно пересевают с твердых агаризованных сред, на которых они, как правило, хранятся в альгологических коллекциях, на готовую жидкую среду.
Для учета числа клеток водорослей применяли камерный метод (камера Нажотта). Наиболее надежные результаты подсчета в камере получаются при титрах водорослей в сотни и тысячи клеток в 1 мл.
Просмотр проб водных растений (ВР) проводили на бинокулярном
микроскопе в камере Нажотта. В каждой выборке просчет делали отдельно
при большом увеличении, а после этого при более мелком увеличении для
правильного учета клеток крупных видов.
Полученные результаты по численности каждого идентифицированного рода или вида и суммарной численности фитопланктона пересчитывались на всю пробу, а затем на единицу объема исходной пробы (в данном случае на 1 мл) по следующей формуле:
ZV
А
V
К ,
ПР
(1)
где А и Z – численность клеток в 1 мл соответственно исходной и концентрированной пробы, Vк – объем концентрированной пробы,
V
ПР
V
К
V
.
слитойводы
(2)
Для определения биомассы клеток существуют различные методы,
в том числе:
 центрифугирование пробы и осаждение массы водорослей в специальных, заранее градуированных, воронках;
 прямое взвешивание на аналитических весах отфильтрованной
массы (при фиксированном объеме пробы);
 измерение индивидуальных размеров (масс) клеток и дальнейший
пересчет через численность в биомассу.
114
В работе использовался расчетный метод: под микроскопом определяют индивидуальные линейные размеры каждого вида и, принимая конфигурацию клетки за аппроксимирующую геометрическую фигуру, вычисляют ее объем, а затем и массу, имея в виду, что плотность вещества
клеток равна примерно плотности воды (1 г/см3).
Индивидуальные измерения размеров организмов (клеток, ценобиев
или колоний) производят под микроскопом с помощью окуляр-микрометра
с предварительной его калибровкой на объект-микрометре. Для установления размеров измеряют, как правило, 50 случайно встреченных особей для
массовых видов и 10 особей для редких видов. После этого вычисляют
средние арифметические значения размеров и при помощи формул объемов для аппроксимирующих фигур находят массы организмов [1].
Биомассу рассчитывают по формуле:
В  nV ,
(3)
где n – численность данного вида, V – объем клетки или ее масса.
Биомассу клеток, определенную по разнице между массой фильтра с
осажденными на нем клетками и массой чистого фильтра, через который
предварительно пропускали дистиллированную воду, пересчитывали
на одну клетку. Относительная ошибка измерения биомассы, определенная
по 10 повторениям, составила около 10 %.
В таблице 1 приведены результаты расчета биомасс изучаемых видов
водорослей описанным выше методом.
Таблица 1
-10
Изменчивость размеров клеток водорослей (см ·10 ) в ходе эксперимента
(в таблице приведена 90 %-е доверительные интервалы)
Вид
Хлорелла
Синезеленые
водоросли
Аппроксимирующая
фигура
шар радиуса R
цилиндр с
радиусом
R основания и высотой h
Начальные
размеры
R
h
44±3,7
11,7±
0,6
Начальный
объем
3,7±0,6
37±7
1,5±0,2
Новые
размеры
R
h
37,8±
3,2
16,9±
0,9
90±
7,2
Объем к 25-м суткам
поликультура
4,4
0,15
Вт/м2 Вт/м2
2,3±
4,0±
0,4
0,6
0,8±
0,8±
0,1
0,1
монокультура
2,3±
0,4
0,8±
0,1
Контроль за состоянием водородного показателя (рН) осуществляется в течение всего опыта по стандартной методике (рН-метр).
Для дополнительного контроля за соотношением между числом живых и мертвых клеток использовалась стандартная методика с применением люминесцентного микроскопа.
115
В опытах с моно- и поликультурами важную роль играют лимитирующие субстратные факторы, т. е. те виды ресурсов, исчерпание которых
из среды приводит к прекращению деления клеток. Что касается фактора
энергетического, которым является свет, то остановка роста возникает при
достижении культурой определенной оптической плотности, пропорциональной численности клеток.
Для изучения лимитирования в работе использовали метод пересевов, который достаточно прост и эффективен.
Водоросли выращивали в режиме накопительного культивирования
в монокультуре при разных начальных концентрациях. Затем культуру водоросли пересевали стерильно на нормальную питательную среду и выращивали в течение 24 суток до плотностей 103–104 кл/мл в люминостате при
постоянной температуре и освещенности.
Перед постановкой эксперимента в начале опыта клетки отмывают
стерильной питательной средой без добавок загрязнителей и выдерживают
двое суток для истощения запасов этих элементов в клетках.
Начальные дозы добавок загрязнителей выбирали такими, чтобы
за сравнительно короткое время культуры достигли стационарной фазы
роста.
Среди большого числа различных методик определения концентраций биогенных элементов в работе применен метод тонкослойной хроматографии и иономер.
Экспериментальный посев поликультуры производили стерильно
с учетом объемов клеток и плотностей исходных культур в среду Бенеке
с содержанием загрязнителей 100 мг/л. Начальный объем – около 0,5 мл,
при каждом взятии проб на гидрохимию, микроскопирование и первичную
продукцию (углеродная методика с изотопом С14) отбиралось около 0,1 мл
суспензии.
Размеры и численность клеток определялись под микроскопом МБИ-11
с помощью винтового объект – микрометра и камеры Горяева.
Методы для оценки качества воды. Для оценки качества воды
применены контактные оптические методы, рекомендованные учеными
Института биофизики СО РАН А. Д. Апонасенко, В. Н. Лопатиным,
В. С. Филимоновым, Л. А. Щур [2].
При определении оптических и флуоресцентных характеристик проб
воды использовался спектрофотометр ДСФГ-2 и лабораторный флуориметр ЛФл-И.
Определение концентрации хлореллы (ХЛ) и сине-зеленых водорослей (СЗВ) методами дифференциальной спектрофотометрии основано на
регистрации разностных спектров поглощения проб воды, в одной из которых устранены клетки водорослей (фильтрованием или центрифугированием) или обесцвечен хлорофилл. Метод является модернизированным вариантом способа, предложенного для определения содержания ХЛ и СЗВ,
116
используется спектральная область 670–750 нм. Это объясняется тем, что
из всех пигментов, содержащихся в клетках водорослей, в ней, в основном,
поглощает хлорофилл а. На практике, пользуясь «базисным» методом при
определении концентрации хлорофилла а (Схл), обычно используют выражение:
С  (D
D
) / K  l  D
/ K l ,
(4)
хл
680
750
уд
680
уд
где D 680 и D750 – оптические плотности взвеси микроводорослей соответственно в области максимума красной полосы поглощения хлорофилла а и в
области, где хлорофилл и другие пигменты практически не поглощают
свет. Значения D750 используют для уменьшения влияния светорассеяния;
К уд – удельный показатель поглощения при λ = 680 нм, l – толщина слоя
взвеси.
Благодаря высокой чувствительности дифференциальных спектрофотометров (в частности, чувствительность спектрофотометра ДСФГ в красной области составляет 5·10-5 единиц оптической плотности) и возможности использования кювет длиной до 50 см представляется возможным определение концентраций хлорофилла при значениях См > 0.015 мг/м3.
Однако это возможно только при идеальной компенсации поглощения и рассеяния света водой и взвешенными частицами. Основными источниками погрешностей являются нескомпенсированность температуры
воды в кюветах и средних оптических путей лучей, распространяющихся
в этих кюветах. При одинаковой температуре воды в кюветах и использовании в качестве сравнения воды, профильтрованной через фильтр с диаметром пор около 1 мкм, можно измерять концентрации хлорофилла
от 0,1 мг/м3 и выше в зависимости от прозрачности вод [3].
Способ определения содержания растворенных органических веществ (РОВ) основан на том, что многие органические вещества, растворенные в природных водах, поглощают свет в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Известно [4], что показатель поглощения света растворенным органическим веществом в морской воде аппроксимируется
выражением:
к ( )  К exp(   ),
(5)
где λ – длина волны падающего света; К – коэффициент пропорциональности; μ – некоторый коэффициент, который варьирует для различных акваторий и глубин и определяется из выражения:
  ln к (1 )  ln к (2 ) /(2  1 ).
(6)
Из закона Бэра удельный показатель поглощения для кюветы единичной длины:
к уд ( )  к (  ) / С  К exp(   ) / C  K 1 exp(   ),
(7)
к ( )  К1С exp(  ),
где С – концентрация вещества (или ХПК).
117
(8)
Подбор параметров аппроксимирующей экспоненциальной функции
для выражения (8) проводился так, чтобы минимизировать относительные
и абсолютные погрешности. Окончательное выражение для содержания
РОВ (с учетом приближенного кислородного эквивалента природных
РОВ) выражено формулой:
С  0,013к ( ) exp( ).
(9)
Энтропийное значение относительной приведенной погрешности
при определении содержания РОВ по этому методу равно 13,5 %. Диапазон значений содержания РОВ составляет от 2 до 100 мг/л, при этом значения показателя μ варьируют от 0,0106 до 0,0187 [5].
Расчет площади поверхности фитопланктона. Характеристика ряда явлений, в частности изотерма сорбции, невозможна без знания величины площади единицы объема биомассы.
В работе используется стандартная методика подсчета численности
фитопланктона и определение его размеров с последующим расчетом
площади поверхности организмов. Наиболее удобной методикой является
распределение определенной массы фитопланктона на специальной пластинке и обработка ее стеклянной палочкой, по аналогии со способом приготовления слоя силикагеля для тонкослойной хроматографии.
Для минеральной взвеси использовался оптический метод определения площади поверхности абиогенной взвеси. Метод основан на оригинальном способе определения среднего размера взвешенных частиц полидисперсных суспензий по интегральной индикатрисе светорассеяния f (θ),
которая для абсолютного большинства монодисперсных взвесей гидрозольных частиц зависит только от произведения дифракционного параметра частиц р на значение угла с раствором [6]. Следовательно, если известна
доля потока энергии f (θ) / f (0), рассеянной в конусе с углом раствора θ,
то по графику зависимости f (рθ), взятому из работы [6], можно найти произведение рθ. Угол θ при выбранной доле потока f (θ) / f (0) находится по
измеренной интегральной индикатрисе, а из известного произведения рθ
находится р и далее диаметр частиц d. Наиболее точно диаметр определяется для f (q) / f (0) = 0,5, при этом рθ = 1,8 [6] и дифракционный параметр р (относительный размер) равен
= 1,8/ .
(10)
Так как:
=
/ ,
(11)
где n – показатель преломления среды, в которой взвешены частицы; λ –
длина волны излучения в вакууме, то из (10) и (11) определится диаметр
частиц d:
= 0,57 /( ).
(12)
Поскольку форма зависимости f(pθ) не зависит от p в пределах
от р = 3 до р = ∞, то данный расчет справедлив и для полидисперсной взвеси с любым распределением частиц по размерам (единственное ограниче118
ние на минимальный размер частиц во взвеси р > 3). В этом случае определяется средний эффективный диаметр частиц.
В большинстве случаев по интегральной индикатрисе представляется возможным раздельно оценить средние размеры фитопланктона и минеральных частиц (совместно с мелкой фракцией органического детрита).
При определении размеров фитопланктона используется малоугловая интегральная индикатриса светорассеяния от 30' до 10°, а размеров минеральной взвеси – от 10 до 150°.
Общее содержание взвешенного вещества М в воде определяется
по светорассеянию на длине волны λ = 550 нм, при этом М рассчитывается
по регрессионному уравнению, полученному нами на основании исследования разнотипных внутренних водоемов:
= 1,46 (550) + 0,52,
(13)
-1
где σ(550) – показатель рассеяния света, м .
В биологическом анализе для определения степени загрязнения воды
применяют систему сапробности вод, когда степень загрязнения органическими веществами и продуктами их распада оценивают по индикаторным
организмам водорослей. Количественная оценка индекса сапробности
по Пантле и Буку требует определения видового состава водорослей, выявления из них видов-индикаторов.
В исследованиях на различных водоемах получено линейное регрессионное уравнение связи среднего объема клеток V с индексом сапробности Is:
= 2,38 − 0,00041 .
(14)
Коэффициент корреляции при этом составил 0,67 при общем количестве обработанных проб, равном 254. Исследования проводились на различных внутренних водоемах, но для всех них были характерны только
α-олигосапробные и β-мезосапробные зоны сапробности вод. Поэтому
и уравнение (14) можно применять только для таких вод. Небольшая модификация уравнения (14) позволила скомпенсировать некоторую нелинейность указанной связи. Это уменьшило ошибки при определении сапробности в β"-мезосапробных водах и соответственно повысило коэффициент корреляции до 0,71. Модифицированное уравнение имеет вид:
= 2,70 − 0,0005 − 0,15 log .
(15)
В работе проводились флуориметрические измерения для определения характеристик водной системы, касающихся наличия в ней водорослей.
Как известно, интенсивность флуоресценции водорослей в общем
случае пропорциональна их концентрации:
I  k п k уд С хл  kC хл .
(16)
Здесь коэффициент kп определяется интенсивностью возбуждающего
излучения, толщиной образца и геометрией измерения, т. е. зависит от типа конкретно применяемого прибора, а kуд есть удельный выход флуоресценции, определяемый квантовой эффективностью φ флуоресценции
и спектром возбуждающего излучения. Поскольку φ зависит от таксоно119
мического положения водорослей, то прямое использование выражения
Схл  I / k при измерении содержания хлореллы может привести к большим
погрешностям. Необходимо периодически контролировать величину k
по независимому измерению Схл для разных сезонов и водоемов либо использовать усложненный вариант [7], при котором к тому же можно определять и состав фитопланктона по трем основным отделам водорослей.
Для оценки численности биомассы фитопланктона использовали
экспресс-метод с помощью флуориметра ЛФл-И непосредственно в полевых условиях, предложенный П. В. Пожиленковой [8]. В качестве флуоресцентного красителя использовался флуорескамин. Интенсивность свечения биомассы бактерий определялась разностью между интенсивностями флуоресценции образца и фильтрата, пропущенного через полиядерные
фильтры с диаметром пор 0,17 мкм.
Таким образом, усовершенствование методик позволило в дальнейшем применить их при проведении эксперимента в условиях с водными
средами Нижнего Поволжья.
Список литературы
1. Левич, А. П. Теоретическая и экспериментальная экология планктонных водорослей. Управление структурой и функциями сообществ : учеб. пособие / А. П. Левич,
В. Н. Максимов, Н. Г. Булгаков. – М. : Изд-во НИЛ, 1997. – 184 с., ил.
2. Апонасенко, А. Д. Некоторые возможности контактных оптических методов
для исследования водных экосистем / А. Д. Апонасенко, В. Н. Лопатин, В. С. Филимонов, Л. А. Щур // Известия РАН. Физика атмосферы и океана. – 1998. – Т. 34, № 5. –
С. 721–726.
3. Сидько, Ф. Я. Спектрофотометрический метод определения концентрации хлорофилла фитопланктона / Ф. Я. Сидько, А. Д. Апонасенко, В. А. Васильев // Гидробиологический журнал. – 1989. – Т. 25, вып. 5. – С. 66–71.
4. Шифрин, К. С. Введение в оптику океана / К. С. Шифрин. – Л. : Гидрометеоиздат, 1983. – 278 с.
5. Патент РФ. № 2087901 Оптический способ определения химического потребления кислорода в природных водах / А. Д. Апонасенко, В. С. Филимонов, В. Н. Лопатин, Л. А. Щур // Бюлл. изобр. – 1994. – № 34. – С. 106.
6. Сидько, Ф. Я. Поляризационные характеристики взвесей биологических частиц
/ Ф. Я. Сидько, В. Н. Лопатин, Л. Е. Парамонов. – Новосибирск : Наука, 1990. – 119 с.
7. Гольд, В. М. Опыт использования флуоресценции для дифференциальной оценки
содержания хлорофилла а у планктонных водорослей / В. М. Гольд, Н. А. Гаевский,
И. Ю. Шатров и др. // Гидробиологический журнал. – 1986. – Т. 22, № 3. – С. 80–85.
8. Пожиленкова, П. В. Адсорбция растворенного органического вещества на минеральной взвеси в водоемах разного типа / П. В. Пожиленкова, А. Д. Апонасенко, В. С. Филимонов // Исследовано в России : электронный журнал. – 2002. – № 139. – С. 1568–
1576. – Режим доступа: http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2002/139.pdf. – Заглавие с экрана. – Яз. рус.
120