С.А. Адаменко Научный руководитель: В.П. Шлапак S.A. Adamenko

С.А. Адаменко
аспирант кафедры лесного хозяйства,
Уманский национальный университет садоводства
Научный руководитель:
В.П. Шлапак
д.с.-х.н., профессор
S.A. Adamenko
postgraduate of department of forestry
Uman national university of horticulture
([email protected]; [email protected])
Supervisor:
V.P. Shlapak
Doctor of Agricultural Sciences, Professor
ПОДБОР ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ РАЗМНОЖЕНИЯ PINUS NIGRA
ARN. В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Аннотация. Исследовано размножение растений Pinus nigra в условиях
культуры in vitro. Найдено оптимальную среду для проращивания семян и культивирования эксплантов. Экспериментально подобрано оптимальное содержание
фитогормонов, необходимое для увеличения коэффициента размножения микропобегов.
Annotation. It was researched reproduction of plants Pinus nigra in vitro culture.
Founded optimal medium for germination of seeds and cultivation of explants. Experimentally selected optimal contents of phytohormones, needs to increase rate of reproduction mikroshoots.
Ключевые слова: Pinus nigra, in vitro, питательная среда, фитогормоны, коэффициент размножения.
Keywords: Pinus nigra, in vitro, culture medium, phytohormones, rate of reproduction
Введение. Микроклональное размножение является одним из перспективных методов получения посадочного материала, генетически идентичного исходному растению [1, 2]. Однако на сегодняшний день для большинства древесных пород не существует до конца разработанных методик. Особенно трудности
возникают при роботе с хвойными, что связано с большим количеством вторичных соединений в их тканях, которые подавляют деление и рост клеток, приводя
к гибели первичного эксплантов или к уменьшению регенеративной способности тканей с возрастом. Однако, использование методов культуры ткани необходимо для сохранения и быстрого размножения элитных генотипов и форм,
улучшения растений методами генной инженерии, а также для получения здорового, лишенного вирусной и бактериальной инфекции посадочного материала [3,
4].
Успешное размножение в культуре in vitro представителей рода Pinus L.
из созревших семян стало известно с 1974 года, а впоследствии начали разрабатываться рекомендации для отдельных видов [5, 6]. Тогда же было установлено,
что микропобеги лучше образуются при использовании материала из растений,
которые находятся на ювенильной стадии развития. А позже появились свидетельства об успешном размножении материала, взятого от взрослых особей [7].
Выделение нерешенных ранее частей общей проблемы, которым посвящается статья. Для культивирования древесных растений in vitro разработаны питательные среды с разным количеством макро- и микроэлементов, аминокислот, витаминов, углеводов и регуляторов роста, которые способствуют дифференциации побегов, образованию меристем или развития корневой системы
[8]. Однако в литературе найдено мало данных об успешном размножении P.
nigra [9, 10]. Задача наших исследований заключалась в подборе оптимальной
среды для размножения растительного материала и повышении частоты регенерации – доли эксплантов, образовавших адвентивные микропобеги и количества
новых микропобегов на эксплант.
Методика исследования. Для ввода в стерильные условия использовали
семена, предварительно промытые в мыльном растворе и простерилизованые 2,5
% гипохлоритом натрия в течение 10 минут. Далее семена проращивались на базовой питательной среде Мурасиге-Скуга (MS). После 14-16 суток культивирования, от пророщенных семян отделяли апикальную меристему и вместе с семядолями высаживали на следующие виды питательной среды: Мурасиге-Скуга
(MS), Ллойда-Мак-Коуна (WPM), Шенка-Хильдебранта (SH) и Гамборга (B5), с
целью изучения роста и развития эксплантов в зависимости от минеральной основы питательной среды. Культивирование происходило в комнате с кондиционированным воздухом на стеклянных стеллажах при температуре 25±1°С, относительной влажности воздуха 70-75%. Фотопериод составлял 16 часов, интенсивность искусственного освещения – 3-5 тыс. люкс. Посуда, материалы, инструменты и питательные среды готовили согласно общепринятым методикам.
Результаты исследования. Согласно данных таблицы 1, наиболее оптимальной средой для культивирования эксплантов оказалась Мурасиге-Скуга
(табл. 1).
В данном варианте наблюдался активный рост и образование новых побегов. На среде Ллойда-Мак-Коуна экспланты развивались, но боковые побеги образовывались лишь в отдельных случаях и почти не росли в отличие от материнского экспланта, который активно вытягивался в высоту. На среде ШенкаХильдебранта материнские экспланты развивались слабее, а боковые побеги не
формировались вообще. На среде Гамборга материнские экспланты также не
развивались и со временем начинали погибать.
Поскольку Мурасиге-Скуга оказалось самой оптимальной средой, дальнейшие исследования проводили на ее основе. Для этого образовавшиеся экспланты, полученные
Таблица 1. – Рост и развитие эксплантов в зависимости от минерального
состава питательной среды
Название
среды
МS
WPM
SH
Визуальная оценка состояния эксплантов
Состояние отличное, цвет зеленый, наблюдается активное образование и рост боковых
микропобегов
Состояние хорошее, цвет темно-зеленый,
наблюдается активный рост экспланта, но
боковые побеги почти не образуются
Состояние отличное, цвет зеленый, наблюдается одиночное образование боковых микро-
Количество
новых микропобегов, шт
Длина эксплантов, см
4,3±0,5
5,2±0,6
1,1±0,5
5,4±0,2
2,1±0,1
3,5±0,3
B5
побегов и слабый их рост.
Состояние удовлитворительное, цвет бледнозеленый, рост экспланта почти не происходит, боковые побеги не формируются.
0
2,0±0,1
после первого культивирования пересаживали на данную среду, модифицированную добавлением регуляторов роста – индолилуксусной (ИУК) и нафтилуксусной кислот (НУК) в концентрации 0,5 мг/л (согласно исследованиям, проведенных на сосне лучезарной (Pinus radiata Don) [11]) и бензиламинопурину
(БАП) в концентрации от 0,5 до 1,5 мг / л. Всего было девять вариантов опыта
(табл.2).
Таблица 2. – Варианты концентрации фитогормонов для индукции морфогенеза
Среда
МS-1
МS -2
МS-3
Фитогормоны
МS -4
МS -5
МS -6
МS -7
МS -8
МS -9
Концентрация, мг/л
БАП
0,5
0,5
0,5
1
1
1
1,5
1,5
1,5
НУК
–
0,5
–
–
0,5
–
–
0,5
–
ИУК
–
–
0,5
–
–
0,5
–
–
0,5
После 14 дней культивирования оказалось, что при определенных комбинациях фитогормонов наблюдается прямой морфогенез, в течение которого в
последствии активации меристемных тканей, начали формироваться от одного
до семи новых микропобегов, которые отличаются активным ростом (рис. 1).
Рис. 1 Коэффициент размножения эксплантов в зависимости от концентрации
фитогормонов
На среде без добавления ауксинов, при концентрации БАП 0,5 мг/л микропобеги не формировались вообще. При концентрации БАП 1 мг/л и 1,5 мг/л на
среде MS-4 и MS-7 коэффициент размножения составлял 3 и 1,4 соответственно.
В вариантах с использованием БАП в разных концентрациях и ИУК коэффициент размножения колебался от 1,2 до 3,9. Наиболее эффективным был вариант, в
котором в среду добавляли 0,5 мг/л НОК и 1 мг/л БАП. В данном случае коэффициент размножения составлял 6,6. Приведенные выше результаты экспери-
ментальных исследований микроклонального размножения P. nigra показали их
достаточную эффективность. В процессе культивирования после двух-трех пассажей наблюдается нарастание коэффициента размножения. В шестом пассаже
коэффициент размножения достигает своей максимальной величины. В дальнейшем (после шести пассажей) наблюдается уменьшение способности эксплантатов к пролиферации. Новые микропобеги, по достижении длины 2-2,5 см отделяли друг от друга и переносили на среду для ризогенеза. Экспериментальные
работы в данном направлении продолжаются.
Выводы.
1. Самой оптимальной питательной средой для размножения P. nigra в
условиях in vitro оказалась Мурасиге-Скуга.
2. На среде МS-1 развитие эксплантов не происходило вообще. На средах
з добавлением индолилуксусной кислоты способность эксплантов к пробуждению боковых почек ниже, чем в тех вариантах, где добавлялась нафтилуксусная
кислота.
3. Для получения высокого коэффициента размножения микропобегов
следует использовать следующие концентрации фитогормонов: 0,5 мг/л НУК та
1 мг/л БАП.
Список источников:
1. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р.Г. Бутенко. – М.: Изд-во "Наука",1964. – 272 с.
2. Калинин Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений /
Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. – К.: Наук. думка, 1980. – 487 с.
3. Аёшина Е.Н. Регенерация Juniperus sibirica в. in vitro / Е.Н. Аёшина, Н.А. Величко // Хвойные бореальной зоны, XXV. – 2008. – № 3-4. – С. 333-336.
4. Sommer H.E. Plantlet formation in pine tissue cultures / Sommer H.E., C.L. Brown
// Amer. J. Bot. Suppl. – 1974. – № 61. – P. 11.
5. Sommer H.E. Plantlet formation in pine tissue cultures / Sommer H.E., C.L. Brown
// Amer.J.Bot. Suppl. – 1974. – № 61. – P. 11.
6. Webb K.J. Morphogenesis in vitro of Pinus and Picea / Webb K.J., H.E. Street //
Acta Hortic. – 1977. – № 78. – P. 259-269.
7. Bonga J.M. Organogenesis in cultured Pinus sylvestris tissue / J.M. Bonga // Z.
Pflanzenphyslol. – 1980. – Vol. 96. – P. 1-6.
8. Биотехнология растений: культура клеток: пер. с англ. В.И. Негрука; с предисл. Р.Г. Бутенко. – М.: Агропромиздат, 1989. – 280 с.
9. Özkurt Z. Induction of embryogenic tissue from immature zygotic embryos in Pinus
nigra J.F.Arnold subsp. nigra var. caramanica (Loudon) Businsky / Z. Özkurt, T. Yildirim, S.
Önde, Z. Kaya // Turk. J. Bot. – 2008. – №32. – P. 179-183
10. Kolevska-Pletikapić B. Bud and shoot formation in juvenile tissue culture of Pinus
nigra / B. Kolevska-Pletikapić, S. Jelaska, J. Berljak, M. Vidaković // Silvae Genetica. –
1983. – Vol. 32/3-4. – P. 115-119.
11. Wells K.E. Development of a laboratory protocol for the micropropagation of
Monterey pines (Pinus radiata), Año Nuevo stand / K.E. Wells, 2009. – 61 р.