УРОВЕНЬ АТР ВО ФЛОЭМНОМ ЭКСУДАТЕ СТЕБЛЯ ВЫСШЕГО

УДК 577.37: 581.18
УРОВЕНЬ АТР ВО ФЛОЭМНОМ ЭКСУДАТЕ СТЕБЛЯ
ВЫСШЕГО РАСТЕНИЯ ПОСЛЕ РАСПРОСТРАНЕНИЯ
ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ НА ОЖОГ И ОХЛАЖДЕНИЕ
В. Г. Ретивин, В. А. Опритов, Н. Н. Абрамова, С. А. Лобов
Нижегородский госуниверситет
С. Б. Федулина
Нижегородская сельскохозяйственная академия
Биофизическим люциферин-люциферазным методом исследовано содержание
АТР во флоэмном эксудате гипокотилей проростков тыквы при генерации вызванного ожогом вариабельного потенциала (ВП) и вызванного охлаждением потенциала действия (ПД) в интервале до 15 мин после распространения переднего
фронта ВП и пика ПД. Электрофизиологически показано, что импульсный компонент переднего фронта ВП по форме и скорости распространения сходен с
ПД. Обнаружено соответствие динамик изменения АТР в эксудате после ПД и
после ВП. Высказано предположение о единой природе ПД и импульсного компонента ВП. Обсуждается значение обнаруженных сдвигов содержания АТР в восстановлении ионного гомеостаза после ПД и ВП и в осуществлении ПД/ВПиндуцированного адаптивного ответа – неспецифического повышения стрессоустойчивости растения.
Для стебля высшего растения на примере хорошо исследованного электрофизиологически, особенно в последнее время, гипокотиля проростка тыквы было показано, что при распространении в нем в ответ на локальное умеренное охлаждение потенциала действия (ПД) происходит быстрое уменьшение, примерно за 1
мин, и последующее восстановление за 5–6 мин содержания АТР во флоэмном
эксудате (Опритов и др., 1976). Суммарное время этих изменений существенно
больше спайкового компонента ПД (20–30 с) и примерно соответствует длительности относительной рефрактерности для генерации ПД (Ретивин, 1988) и длительности положительного следового потенциала, иногда завершающего фазу реполяризации ПД (Ретивин и др., 1997). При ожоге или другом повреждении в
стебле тыквы распространяется так называемый вариабельный потенциал (ВП).
Он существенно отличается от ПД тем, что имеет нерегулярную форму и слабо
выраженную фазу реполяризации, т. е. весьма значительный отрицательный следовый потенциал, длящийся иногда десятки минут (Опритов, Ретивин, 1982; Ретивин, 1988).
Основная задача, поставленная в настоящей работе, заключалась в исследовании динамики изменения АТР во флоэмном эксудате гипокотиля тыквы при распространении в нем вызванного ожогом ВП и сопоставлении этого процесса с соответствующими сдвигами АТР при ПД, включая интервал времени 15 мин после
прохождения переднего фронта ВП и пика ПД, для ПД ранее не изученного. Актуальность такого исследования в том, что ВП, как считают некоторые исследователи (Stankovic, Dаvies, 1996), такая же функционально значимая форма межклеточной электрической сигнализации для растений, как и ПД, в то время как природа и
124
связь с метаболизмом ВП очень слабо изучена. С чисто биофизических позиций,
например, было бы интересно выяснить, сопровождается ли затратами метаболической энергии длительное поддержание деполяризованного состояния клеток на
заднем фронте ВП. В этом плане важен анализ уровня АТР именно через 15 мин
после генерации ВП и ПД, ибо это фаза продолжающейся следовой деполяризации при ВП и полного восстановления потенциала покоя возбужденных клеток
после ПД. Кроме того, примерно через 15 мин после ПД, как теперь стало известно (Ретивин и др., 1997; Лобов, 1998), начинает достоверно выявляться электрофизиологически адаптивный ответ клеток гипокотиля – временное повышение их
холодоустойчивости. Поэтому важно выяснить, имеют ли место в это время какие
либо изменения уровня АТР в проводящих тканях?
Методика
Для опытов использовали проростки тыквы (Cucurbita pepo L.) 12–18-дневного
возраста. Растения выращивали в гидропонной культуре на керамзите с 1/2 среды
Хоглэнда-Арнона под люминесцентными лампами при освещенности 6000 лк,
световом периоде 12 ч и температуре 19–21оС. АТР определяли люциферинлюциферазным (Л-Л) методом на установках, собранных на основе сцинтилляционных радиометров ДРГЗ-03 или РКС-08П. Блоки детектирования приборов были
переоборудованы так, что позволяли регистрировать вспышки свечения Л-Л системы непосредственно при вливании в нее пробы, содержащей АТР. Как и в ранее
проведенном исследовании (Опритов и др., 1976), в работе использовали Л-Л экстракт, приготовленный из 20 лиофильно высушенных светоносных органов светляков Luciola mingrelica L., растертых в 3 мл трис-ацетатного буфера (рН 7.65–
7.8) на холоду (4оС) с 25 мг кристаллического сернокислого магния. Гомогенат
центрифугировали 10 мин при 15000 об/мин и полученный супернатант выдерживали не менее суток в морозильнике (–8оС) для «выгорания» эндогенных фондов
АТР. При определении АТР в реакционную кювету наливали 0.7 мл бидистиллированной воды, 0.2 мл Л-Л экстракта и помещали ее в блок детектирования. Затем
при помощи специально разработанной пневматической подачи в кювету впрыскивали 0.1 мл исследуемой пробы. Световую реакцию регистрировали по максимуму отклонения стрелки прибора ДРГЗ-03 или по средней скорости счета прибора РКС-08П в имп/с за 10 с экспозиции от момента введения пробы в Л-Л систему.
По стандартным растворам АТР строили калибровочный график и рассчитывали
концентрацию АТР в пробах флоэмного эксудата.
Эксудат собирали с поперечного среза, сделанного острой бритвой в середине
гипокотиля. Со среза сначала удаляли фильтровальной бумагой клеточный сок из
перерезанных паренхимных клеток, а затем предварительно взвешенной полоской
беззольного фильтра собирали выделяющийся из ситовидных трубок флоэмный
эксудат в течение 10–15 с. Повторным взвешиванием определяли сырую массу
собранной пробы эксудата и разводили ее трис-буфером примерно в 100 раз. При
расчете концентрации АТР в эксудате учитывали точное разведение эксудата в
пробе. Конечный результат выражали в виде разности концентраций АТР в покое,
т. е. без раздражения, и при возбуждении, т. е. после распространения ВП или ПД,
возникающих, соответственно, в ответ на ожог или охлаждение. Ранее, чтобы определить содержание АТР в состоянии покоя, мы предварительно «наркотизировали» растения парами эфира 20 мин, что предотвращало неконтролируемое возможное возбуждение при перерезании гипокотиля, производимом для сбора эксу125
дата. Эфирный контроль применялся в исследованиях на локомоторных растениях
(Mimosa pudica) и другими авторами (Toriama,1962). В данной работе мы не использовали эфирный наркоз для контроля уровня АТР в опытах без раздражения,
полагая, во-первых, что однотипная процедура отбора эксудата вносит примерно
равный вклад в изменение уровня АТР по сравнению с покоем во всех биологических повторностях эксперимента. Во-вторых, мы предположили, что этот вклад
может быть весьма несуществененым, ибо основная часть эксудата выделяется в
первые 10 с после процедуры перерезания, способной вызвать местное или распространяющееся электрическое возбуждение, а уровень АТР максимально изменяется значительно позже – через 1 мин после ПД. Следовательно, возбуждение
при перерезании не успеет заметно изменить (снизить) уровень АТР в эксудате.
Действительно, уровень АТР во флоэмном эксудате проростков тыквы в покое с
эфирным контролем составлял 0.178±0.016 мМ (n = 21) (Опритов и др., 1976). В
настоящем иследовании уровень АТР в «покое» без эфирного контроля не отличался достоверно от ранее установленного – 0.185±0.013 мМ (n = 19).
Электрофизиологическая регистрация ВП и ПД осуществлялась на многоканальной электрофизиологической установке, обеспечивающей возможность аналоговой и цифровой записи электрических реакций растений на персональном
компьютере (Ретивин и др., 1997). Отведение реакций проводилось экстраклеточно с помощью одного или двух измерительных электродов, контактирующих с поверхностью стебля на растоянии от зоны раздражения, и электрода сравнения в
омывающем корни растворе (рис. 1в). ВП вызывали ожогом пламенем свечи
верхнего края одного из семядольных листьев проростка в течение 25 с. ПД вызывали кратковременным охлаждением участка гипокотиля холодной водой, как
описано ранее (Опритов и др., 1976). Через 15 мин после регистрации пика ПД и
через 1, 3, 6 и 15 мин после регистрации переднего фронта ВП электродом, расположенным в середине гипокотиля, непосредственно в зоне контакта этого электрода гипокотиль разрезали, отбирали пробы флоэмного эксудата и определяли в
них уровень АТР, как описано выше.
Результаты и их обсуждение
Представленные на рисунках компьютерные осциллограммы ПД, вызванного
охлаждением (рис. 1а), и ВП, вызванного ожогом (рис. 1б), распространяющихся
по гипокотилю проростка тыквы, показывают, что распространяющийся ПД имеет
типичную для экстраклеточного отведения относительно небольшую амплитуду
фазы деполяризации (около 30 мВ), компактную импульсную форму за счет резко
выраженной фазы реполяризации и достаточно высокую скорость распространения (1.25 см/с); ВП в верхней части гипокотиля, т. е. ближе к месту ожога имеет
резкий передний фронт деполяризации, существенно большей амплитуды, чем ПД
(80 мВ), но такой же примерно крутизны и распространяющийся примерно с такой же скоростью. ВП имеет замедленную реполяризацию (иногда ее может достаточно долго не быть) и на ее фоне серию нерегулярных импульсных колебаний
потенциала, наподобие ритмических местных ПД, но несколько более длительных. Причины их возникновения не ясны. Ниже по гипокотилю передний фронт
ВП несколько трансформируется и приобретает импульсную составляющую,
близкую по амплитуде и форме к ПД, а амплитуда и крутизна дальнейшей деполяризации по мере распространения по гипокотилю становится все меньше. Так как
скорость распространения переднего фронта ВП и ПД в приведенной на рис. 1 за126
писи электрофизиологического эксперимента одинакова, а эксперимент был проведен на одном и том же растении (интервал между вызыванием ПД и ВП одни
сутки), то можно предположить, что распространяющаяся в гипокотиле тыквы
электрическая реакция на ожог, т. е. вариабельный потенциал, имеет комплексный
характер и его передний фронт включает импульсный компонент, аналогичный
или, по крайней мере, близкий по своей природе к потенциалу действия. Такие же
представления о характере и природе переднего фронта ВП высказывались некоторыми электрофизиологами растений и ранее (Pickard, 1973; Цаплев, Зацепина,
1980; Roblin, 1985).
Рис. 1. Компьютерные осциллограммы ПД (а), возникшего на охлаждение,
ВП (б), возникшего на ожог, зарегистрированные с интервалом 24 ч в гипокотиле
проростка тыквы в соответствии с представленной схемой (в)
Обозначения. Охл – охлаждение участка гипокотиля водой 5–7 оС 25 с; ожог –
ожог семядоли пламенем 25 с; ∆U1,0, ∆U2,0 – разность потенциалов между электродами Е1 и Е0 и между Е2 и Е0, соответственно. T, c – время регистрации. Скорость распространения ПД: Vа = ∆la / ∆ta = 10 см / 8 с ≈ 1,2 см/с. Скорость распространения ВП: Vб = ∆lб / ∆tб = 6 см / 5 с ≈ 1,2 см/с.
На рис. 2 (кривая «ВП») представлены результаты изменения содержания АТР
во флоэмном эксудате после прохождения ВП по гипокотилю. Из рисунка видно,
что достоверное снижение содержания АТР по отношению к контролю регистрируется через 1 мин после прохождения переднего фронта ВП. Через 3 мин после
этого достоверные различия сохраняются на том же уровне. Через 6 мин концентрация АТР увеличивается и различия с контролем приобретают недостоверный
127
характер. Через 15 мин АТР в эксудате становится заметно больше, чем в покое,
хотя уровень значимости различий в этом случае переходный с тенденцией к недостаточности (Р≤0.1). Следовательно, распространение ВП по гипокотилю вызывает изменение содержания АТР в ситовидных трубках флоэмы, которое носит
временный обратимый характер.
Рис. 2. Изменение концентрации АТР во флоэмном эксудате гипокотилей
проростков после проведения ВП – электрической реакции на ожог и
ПД – электрической реакции на охлаждение
Обозначения. ∆ [АТР], мкМ – разность концентраций АТР в покое, т. е. без раздражения, и при возбуждении, т. е. после распространения ПД или ВП. t, мин –
время отбора проб эксудата после регистрации пика ПД и переднего фронта ВП.
На рис. 2 (кривая ПД) представлена также экспериментальная кривая изменения содержания АТР во флоэмном эксудате в интервале до 6 мин после прохождения пика ПД, полученная ранее (Опритов и др., 1976) и дополненная результатом настоящих исследований, указывающим на достоверное превышение уровня
АТР над его уровнем в покое через 15 мин после ПД.
Очевидно, что изменения АТР при ПД и ВП весьма сходны по своей динамике.
В обоих случаях концентрация АТР уменьшается достаточно быстро и примерно
на одну и ту же величину около 50 мкМ. Обнаруженное соответствие очевидно
свидетельствует об общей природе установленных метаболических сдвигов. Ранее
мы предположили (Опритов и др., 1976; Ретивин, 1988), что энергия пула АТР из
русла дальнего флоэмного транспорта расходуется сразу после ПД на процессы
активного мембранного ионного транспорта, т. е. на восстановление нарушенного
генерацией ПД ионного гомеостаза как в самих ситовидных трубках, так и в прилегающих к ним возбудимых паренхимных клетках.
128
Интересно в связи с этим провести следующее количественное сравнение.
Максимальная убыль АТР, экспериментально обнаруживаемая после генерации
ПД в ситовидных трубках, в объемном выражении ≅ 50 мкмоль⋅дм-3⋅импульс-1 =
5⋅10-20 моль⋅мкм-3⋅импульс-1. Теоретический расход АТР на идущую в сотни (102)
раз быстрее реполяризацию мышечных волокон, имеющих размеры сопоставимые
с ситовидными трубками, ≅4.2⋅10-22 моль.мкм-3⋅импульс-1 (Ершов, Мушкамбаров,
1990). Совпадение, возможно, случайно, так как через поверхностные мембраны
при генерации ПД в клетках растения потенциалопределяющих ионов переносится по градиенту электрохимического потенциала 10-8 моль⋅см-2⋅импульс-1, а в мышечных волокнах, как и в нервах, –10-12 моль⋅см2⋅импульс-1. Ионов в растительных
клетках при их возбуждении переносится, таким образом, в 104 раз больше, чем в
возбудимых животных клетках. В одиночном цикле возбуждения в мышцах,
включая даже акт сокращения, убыли АТР реально не происходит из-за кратковременности процесса переноса ионов и наличия высокоэффективной системы
экстренного ресинтеза АТР за счет креатинфосфата. У растений активный перенос
ионов после генерации ПД идет в тысячи раз дольше, системы ресинтеза, можно
полагать, не столь эффективны и дефицит АТР поэтому реально выявляется в течение значительного (несколько мин) времени. При этом суммарный расход энергии на восстановление исходного ионного гомеостаза после возбуждения, безусловно, должен быть существенно больше экспериментально обнаруживаемой максимальной убыли АТР в ситовидных трубках и, соответственно, на много больше
теоретического расхода АТР в мышечных волокнах при электрическом возбуждении. Однако, поскольку длительность ПД в растительных клетках в 104 раз больше, чем длительность ПД у животных, то интенсивность ионных потоков в этих
различных возбудимых образованиях, как уже отмечалось нами ранее, примерно
одинакова – 10-9 моль⋅см-2⋅с-1 (Ретивин, 1988). Отсюда можно предположить, что
одинаковые для растений и животных по интенсивности процессы пассивного переноса ионов при возбуждении могут быть сопряжены и с примерно одинаковыми
по интенсивности активными потоками, восстанавливающими ионный гомеостаз.
Эти активные процессы также идут с примерно равными затратами метаболической энергии на единицу объема клетки в единицу времени. Этим, по всей вероятности, и можно объяснить совпадение регистрируемого экспериментально «дефицита» АТР в ситовидных трубках растений после ПД, с запаздыванием компенсируемого процессами ресинтеза, и расчетного общего расхода АТР в мышечных
волокнах на реполяризацию сарколеммы Na+, K+-АТР-азой после возбуждения
(без раходов на сокращение).
Что касается близости величин убыли АТР после ПД и ВП, то это, по нашему
мнению, свидетельствует о том, что энергетических расходов требует, в основном,
аналогичная ПД импульсная составляющая переднего фронта ВП. Поддержание
длительного деполяризованного состояния, включая генерацию нерегулярных
ритмических импульсов на этом деполяризованном уровне, в таких затратах не
нуждается или они значительно меньше, чем расходы АТР на восстановление
ионного гомеостаза после прохождения ПД. Это мнение подтверждают и наблюдаемые динамики восстановления концентрации АТР во флоэмном эксудате после
ПД и ВП. Относительно медленная (минуты) скорость процесса (креатинфосфат
обеспечивает ресинтез АТР в мышце за тысячные доли секунды) позволяет предположить, что он связан, по-видимому, с обычными гликолитическими и окислительными процессами, протекающими в клетках и в условиях покоя, но активи129
рующимися после ПД или ВП по известному принципу акцепторного или дыхательного контроля, т. е. пропорционально возрастающей концентрации АDP, являющегося акцептором фосфата. В варианте «после ВП» процесс восстановления
АТР хотя и менее выражен, однако также имеет место в сопоставимом с вариантом «после ПД» интервале времени, несмотря на сохраняющееся деполяризованное состояние клеток гипокотиля.
Можно рассмотреть, по крайней мере, два возможных механизма длительной
деполяризации после ВП, не требующих затрат метаболической энергии. Первый
– переход плазматических мембран клеток в состояние стрессовой проводимости,
как это показано, например, на тонопласте харовых водорослей (Плакс, Юрин,
1991). Второй – угнетение электрогенного Н+-насоса плазматических мембран на
время следовой деполяризации ВП. Однако последнее предположение входит в
некоторое противоречие с данными (Опритов и др., 1988) об активации электрогенного Н+-насоса на фазе реполяризации ПД, если полагать, что импульсная
компонента переднего фронта ВП аналогична ПД и процесс реполяризации при
этом лишь «замаскирован» следовой деполяризацией, имеющей иную природу
(химическую или гидравлическую), связанную с повреждением.
В заключение – о феномене «овершута АТР», т. е. об увеличении концентрации АТР во флоэмном эксудате выше исходного уровня покоя через 15 мин после
прохождения ПД или переднего фронта ВП. Ранее мы показали, что в интервале
времени 12–60 мин после ПД временно повышается холодоустойчивость клеток
гипокотиля. Было установлено также, что этот адаптивный ответ сопряжен с активацией электрогенного насоса (Н+-АТР-азы) поверхностных мембран клеток гипокотиля (Ретивин и др., 1997). Повышение устойчивости, очевидно, имеет неспецифический характер, т. к. под влиянием ПД повышается и холодо- и теплоустойчивость (Ретивин и др., 1999). Можно полагать, что процессы «ПД (или, возможно, импульсный компонент ВП) → активация Н+-насоса → неспецифическое повышение устойчивости клеток стебля» и «ПД (импульсный компонент ВП) → повышение уровня АТР во флоэме стебля» взаимосвязаны. При этом увеличение
энергетического потенциала (уровня АТР) в русле дальнего флоэмного транспорта
может быть значимо не только для обеспечения деятельности активированной
мебранной Н+-АТР-азы, опосредующей ПД/ВП-индуцированное повышение устойчивости клеток, но и в свете «биоэнергетической концепции устойчивости растений» (Климов, 1997) непосредственно влиять на стрессоустойчивость растения.
Финансирование иследований частично проводилось по гранту Российского
фонда фундаментальных исследований № 97-04-48549.
ЛИТЕРАТУРА
Ершов Ю. А., Мушкамбаров Н. Н. Кинетика и термодинамика биохимических и физиологических процессов. М., 1990.
Климов С. В. Биоэнергетическая концепция устойчивости растений к низким температурам // Успехи совр. биол. 1997. Т. 117, вып. 2. С. 153-160.
Лобов С. А. Адаптация процессов биоэлектрогенеза тканей проростка тыквы Cucurbita
pepo при периодическом холодовом воздействии // Регуляция и управление в биосистемах:
Сб. работ молодых ученых биол. ф-та ННГУ. Н. Новгород, 1998.
Опритов В. А., Абрамова Н. Н., Ретивин В. Г., Павлова О. М. АТФ в соке ситовидных трубок Cucurbita pepo при распространении одиночной волны возбуждения // Пере-
130
движение веществ у растений в связи с метаболизмом и биофизическими процессами: Сб.
науч. трудов / Горьковский ун-т. Вып. 7. Горький, 1976. С. 17-26.
Опритов В. А., Пятыгин С. С., Ретивин В. Г. Участие электрогенного насоса возбудимой мембраны в формировании потенциала действия у высших растений // ДАН СССР.
1988. Т. 300, № 2. С. 466-468.
Опритов В. А., Ретивин В. Г. О механизме распространяющегося возбуждения у
высших растений // Физиология растений. 1982. Т. 29, вып. 5. С. 915-923.
Плакс А. В., Юрин В. М. Два состояния интактного тонопласта клеток Nitellopsis
obtusa // Биоэлектрогенез и транспортные процессы у растений: Межвуз. сб. Н. Новгород,
1991. С.47-51.
Ретивин В. Г. Ионный механизм генерации потенциала действия в проводящих тканях
стебля высшего растения: Автореф. дис. … канд. биол. н. М, 1988.
Ретивин В. Г., Опритов В. А, Лобов С. А., Тараканов С. А., Худяков В. А. Модификация устойчивости фотосинтезирующих клеток к нагреванию и охлаждению после раздражения корней раствором КС1 // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 5. С. 790-798.
Ретивин В. Г., Опритов В. А., Федулина С. Б. Предадаптация тканей стебля Сucurbita
pepo к повреждающему действию низких температур, индуцированная потенциалом действия // Физиология растений. 1997. Т. 44, № 4. С. 499-510.
Цаплев Ю. Б., Зацепина Г. Н. Электрическая природа распространения вариабельного
потенциала у традесканции // Биофизика. 1980. Т. 35, вып.4. С. 708-712.
Pickard B. G. Action potentials in higher plants // Botanical Rev. 1973. V. 39, № 2. P. 172201.
Roblin G. Analysis of the variation potentials induced by wounding in plants // Plant and Cell
Physiol. 1985. V. 26, № 3. P. 455-461.
Stankovic B., Davies E. Both action potentials and variation potentials induce proteinase
inhibitor gene expression in tomato // FEBS Lett. 1996. V. 390, № 3. P. 275-279.
Toriama H. Observation and experimental studies of sensitive plants // Cytologia. 1962.
V. 27, № 4. P. 431-442.
131