ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
реклама
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи АКУШСКАЯ АЛИНА СЕРГЕЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ ЖЕНЬШЕНЯ (PANAX GINSENG C.A. MEYER) 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель доктор фармацевтических наук, профессор В.А. КУРКИН Самара – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………... 9 Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЯЩЕГО (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)… 18 1.1. Ботанико-фармакогностическое настоящего и описание микроскопическая женьшеня характеристика корня…...................................................................................... 18 1.2. Ареал дикорастущего растения и его культивирование…………………………..…………..…….. 21 1.2.1. Естественные условия обитания………………..………….. 21 1.2.2. Культивирование и агротехника………………..….…..….. 22 1.3. Заготовка, сушка и хранение сырья……………..…..…….. 24 1.4. Химический состав различных органов женьшеня настоящего………………………………………………….... 26 1.5 Современное состояние стандартизации сырья и лекарственных препаратов женьшеня……………………... 1.6. Фармакологические свойства и 36 применение лекарственных средств женьшеня…………………………. 39 Выводы к главе 1……………………………………...…… 53 Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………..….. 54 2.1. Объекты исследования…………………………………….... 54 2.2. Методы исследования…………………………………..…… 55 2.2.1. Методы морфолого-анатомического исследования………. 55 2.2.1.1. Методы микроскопического исследования…………….…… 55 2.2.1.2. Гистохимический анализ растительного сырья…………… 56 2.2.2. Химические методы…………………………………………. 57 2.2.2.1. Качественные реакции……………………………..…………… 57 2.2.2.2. Кислотный гидролиз…………………………………………..… 58 2.2.2.3. Ферментативный гидролиз……………………….…………… 58 3 2.2.3. Хроматографические методы………………………………. 58 2.2.3.1. Метод колоночной хроматографии……………………...…… 59 2.2.3.2. Тонкослойная хроматография……………………………….… 59 2.2.3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография…….… 60 2.2.4. Физико-химические методы………………………..………. 60 2.2.4.1. Метод спектрофотометрии………………………………….. 2.2.4.2. 60 1 Н-ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия…………… 61 2.2.4.3. Определение рН……………………………………………………. 61 2.2.5. Методы получения лекарственных средств………..……… 61 2.2.5.1. Метод мацерации……………………………………..…………. 62 2.2.5.2. Метод модифицированной мацерации………………….…… 62 2.2.5.3. Метод прессования…………………………………….…….…… 63 2.2.6. Методы исследования фармакологической активности..… 63 2.2.6.1. Тонизирующая активность…………………………….…….… 64 2.2.6.2. Ноотропная активность………………………………………... 64 2.2.6.3. Анксиолитическое действие……………………………………. 64 2.2.7. Глава 3. Статистические методы……………………………………... 65 АНАТОМО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЯЩЕГО…………………………...… 66 3.1. Изучение строения корневищ с корнями женьшеня……… 66 3.1.1. Анатомо-морфологическое изучение корневища…………. 67 3.1.2. Изучение анатомо-морфологического строения главного корня……………………………………………………..…… 71 3.1.3. Анатомо-морфологическое изучение придаточных корней 74 3.1.4. Анатомо-морфологическое исследование порошка корневищ с корнями женьшеня…………………………….. 76 Исследование строения надземной части женьшеня…....... 76 3.2.1. Петиолярная анатомия женьшеня……….……………..… 76 3.2.2. Изучение строения листовой пластинки…………………… 80 3.2.3. Изучение строения стебля………………………………..…. 83 3.2. 4 Выводы к главе 3………………………………………...… 89 Глава 4. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЯЩЕГО……………………...……… 91 4.1. Сравнительное изучение различных органов женьшеня и препаратов на его основе………………………………….… 92 4.2. Выделение биологически активных веществ (БАВ) из корневищ с корнями и надземной части женьшеня настоящего………………………………………………….... 96 4.2.1. Выделение БАВ из корней женьшеня…………………….... 96 4.2.2. Выделение БАВ из листьев женьшеня…………………...… 98 4.3. Физико-химическая характеристика выделенных соединений………………………………………………….... 99 Выводы к главе 4………………………………….……..… 107 Глава 5. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ ЖЕНЬШЕНЯ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ЖЕНЬШЕНЯ……………………… 108 5.1. 5.1.1. Качественный анализ корневищ с корнями женьшеня….... 108 Определение подлинности сырья методом тонкослойной 108 хроматографии………………………………………………. 5.1.2. Определение подлинности сырья методом спектроскопии. 109 5.2. Количественный анализ корневищ с корнями женьшеня.... 110 5.3. Качественный анализ надземной части женьшеня…….….. 115 5.3.1. Определение сапонинов…………………………………….. 115 5.3.2. Определение флавоноидов……………………………..….... 116 5.4. Количественный анализ надземной части женьшеня…..… 117 5.4.1. Количественное определение суммы сапонинов………….. 117 5.4.2. Количественное определение суммы флавоноидов………. 119 5.5. Разработка проекта фармакопейной статьи на корневища 5 с корнями женьшеня………………………………………… 122 Выводы к главе 5……………………………………...…… 123 Глава 6. ИССЛЕДОВАНИЯ СТАНДАРТИЗАЦИИ ПРЕПАРАТОВ ПО РАЗРАБОТКЕ, НОВЫХ ЖЕНЬШЕНЯ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ И ИХ ОБОСНОВАНИЮ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ…………………………..… 124 6.1. Разработка лекарственного препарата «Женьшеня настойка»…………………………………………………….. 126 6.1.1. Способ получения настойки женьшеня……………………. 126 6.1.2. Стандартизация лекарственного препарата «Женьшеня настойка»…………………………………………………… 130 6.1.2.1. Качественный анализ…………………………………………….. 130 6.1.2.2. Количественный анализ…………………………………..……… 131 6.1.2.3. Числовые показатели и срок хранения……………………….. 133 6.2. Разработка лекарственного препарата «Женьшеня сироп». 135 6.2.1. Технология сиропа женьшеня……………………………..... 135 6.2.2. Стандартизация сиропа женьшеня…………………………. 137 6.2.2.1. Качественный анализ……………………………………………. 138 6.2.2.2. Количественный анализ…………………………………………. 139 6.2.2.3. Числовые показатели и срок хранения………………….…… 142 6.3. Разработка лекарственного препарата «Женьшеня таблетки»……………………………………………….…….. 146 6.3.1. Технология таблеток женьшеня……………………………. 146 6.3.2. Стандартизация таблеток женьшеня……………………… 148 6.3.2.1. Качественный анализ………………………………………..….. 149 6.3.2.2. Количественный анализ……………………………………..…... 150 6.3.2.3. Числовые показатели и срок хранения…………………..…… 152 6.4. Обоснование лекарственных целесообразности препаратов и разработки их новых применения в 6 медицинской практике……………………………………… 153 6.4.1. Изучение тонизирующей активности……………………... 153 6.4.2. Изучение ноотропного действия…………………………… 154 6.4.3. Изучение анксиолитической активности…………………. 155 Выводы к главе 6…………………………………………... 157 ОБЩИЕ ВЫВОДЫ………………………………………….. 158 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………... 160 ПРИЛОЖЕНИЯ……………………………………………… 176 1 – 7. Акты о внедрении…………………………………………… 8. Направительное экспертизы письмо средств в ФГБУ медицинского «Научный 177 центр применения» от 22.01.2013 г. № 1730/01-37-183. Вх. № 1021 от 28.01.2013 г. ………………………………………………........................ 184 9. Проект ФС «Женьшеня корневища с корнями»…………... 185 10. Проект ФСП «Женьшеня настойка»……………………….. 201 11. Проект ФСП «Женьшеня сироп»…………………………... 208 12. Патент на изобретение «Способ получения средства, обладающего тонизирующей активностью» №2496509….. 215 13. Патент на изобретение «Сироп женьшеня» №2514008…... 14. Удостоверение на рационализаторское 216 предложение «Способ получения настойки женьшеня» №217 от 21.09.2012 г…………………………………………………... 217 15. Удостоверение «Состав сиропа на рационализаторское женьшеня предложение настоящего» №218 от 21.09.2012 г…………………………………………………... 218 7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ДИССЕРТАЦИИ DMSO-d6 – дейтерированный диметилсульфоксид БАС – биологически активные соединения БАВ – биологически активные вещества БАД – биологически активная добавка БУВ - н-бутанол-уксусная кислота-вода ВВ – вспомогательные вещества ВР – вспомогательные работы ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ВФС – временная фармакопейная статья ГЛФ – готовая лекарственная форма ГСО – государственный стандартный образец ГФ – государственная фармакопея КТМ – кривошипная таблеточная машина КФХ – крестьянско-фермерское хозяйство МКЦ – микрокристаллическая целлюлоза НД – нормативная документация ЛП – лекарственный препарат ЛР – лекарственное растение ЛРС – лекарственное растительное сырье ЛС – лекарственное средство ЛФ – лекарственная форма ПКЛ – приподнятый крестообразный лабиринт РСО – рабочий стандартный образец ТП – технологических процесс ТСХ – тонкослойная хроматография УМО – упаковка, маркировка, описание УРАИ – условная реакция активного избегания УФ – спектр – ультрафиолетовый спектр 8 ФВК – фосфорно-вольфрамовая кислота ФС – фармакопейная статья ФСП – фармакопейная статья предприятия ЦНС – центральная нервная система ЯМР – ядерный магнитный резонанс 9 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. В соответствии со стратегией развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2020 года одним из важнейших направлений развития современной отечественной фармацевтической отрасли является расширение ассортимента эффективных и безопасных лекарственных средств (ЛС) и усиление мер по контролю качества производимых лекарственных препаратов (ЛП) (Самылина И.А. др., 2003; 2010). В рамках реализации данной стратегии также актуальными являются исследования по разработке препаратов на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) и совершенствование методов контроля качества ЛРС, субстанций и фитопрепаратов (Самылина И.А. и др., 1995; Киселева Т.Л. и др., 2008; Куркин В.А., 2002; 2007). Особой социальной значимостью в настоящее время обладает сектор фармацевтического рынка РФ, представленный ЛП группы «Общетонизирующие средства и адаптогены» (в соответствии с анатомотерапевтическо-химической классификацией ЛС). Адаптогенные фармакологические свойства ярко выражены у целого ряда растений, например, у женьшеня настоящего (Panax ginseng C.A. Meyer) (Муравьева Д.А. и др., 2002). Данный эффект растения обусловливает ведущая группа биологически активных соединений (БАС) – сапонины, являющиеся тритерпеноидами стероидного происхождения (Куркин В.А., 2007). Несмотря на многолетний опыт изучения женьшеня настоящего и его широкое применение, существуют нерешенные проблемы в области стандартизации сырья и препаратов. Так, Государственная Фармакопея (ГФ) СССР XI издания (статья 66, стр. 348) в качестве методики для определения подлинности корней женьшеня предлагает метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), однако условия хроматографирования не позволяют достичь четкого разделения веществ. В разделе «Числовые показатели» нормируются величины экстрактивных веществ, влажности и золы, которые 10 не могут трактоваться как объективные, достоверные и надежные показатели качества. Раздел «Количественное определение» в данной нормативной документации (НД) отсутствует. В соответствии с Европейской Фармакопеей стандартизацию корней женьшеня проводят путем определения суммы гинзенозидов Rb1 и Rg1 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Фармакопей США предложено определять содержание гинзенозидов Rb1 и Rg1 отдельно друг от друга, также используя метод ВЭЖХ. Однако в обоих случаях не принимается во внимание наличие сопутствующих биологически активных гинзенозидов, компонентный состав которых может варьировать до 11 (Куркин В.А., 2007). Указанные методики предусматривают наличие нескольких стандартных образцов, что значительно увеличивает стоимость анализов. Количественное определение ведущей группы БАС отсутствует и в Японской фармакопее: вместо этого в НД включено определение сухого остатка (не менее 14%). Кроме того, особого внимания заслуживает вопрос относительно сырьевой базы женьшеня настоящего. Природные ресурсы данного растения истощены, оно занесено в Международную Красную Книгу, и его сбор является правонарушением (Международный союз охраны природы, 1998). Экспортерами корней женьшеня являются, в основном, Корея и Китай. На территории РФ женьшень настоящий культивируется в Приморском крае, на Кавказе, в Калужской, Астраханской, Брянской, а также Самарской областях (крестьянско-фермерское Существуют также гипогликемическом, хозяйство научные (КФХ) данные термопротекторном, питомник о «Женьшень»). противогипоксическом, стресспротекторном и адаптогенном действии извлечений из травы женьшеня. Поэтому с точки зрения ресурсосберегающих технологий актуальным и перспективным является также изучение листьев и стеблей женьшеня, сравнение их химического состава с активными компонентами корней. 11 В этой связи актуальным является изучение химического состава, анатомо-морфологического строения корней и надземной части женьшеня, а также фармакологической активности лекарственных препаратов женьшеня, культивируемого в Самарской области. На фармацевтическом рынке РФ спектр ЛП женьшеня обширен, однако доминирующими являются ЛС зарубежного производства. Отечественные препараты представлены лишь настойкой женьшеня (Машковский М.Д., 2002). Таким образом, представляется актуальным углубленное фармакогностическое исследование корней и надземной части женьшеня, разработка отечественных импортозамещающих ЛП на основе данного растения и обоснование объективных методов стандартизации сырья и лекарственных препаратов женьшеня. Цель и задачи исследования. Цель работы: фармакогностическое исследование женьшеня настоящего и разработка объективных методов стандартизации сырья и лекарственных препаратов данного растения. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. Исследование анатомо-морфологических признаков корневищ с корнями и надземной части женьшеня настоящего. 2. Обоснование новых подходов к стандартизации сырья и ЛП женьшеня настоящего, учитывая принцип унификации методик в ряду ЛРС – субстанция – лекарственный препарат. 3. Разработка методик качественного и количественного анализа корневищ с корнями женьшеня. 4. Разработка методик качественного и количественного анализа надземной части женьшеня. 5. Оптимизация технологии ЛП «Женьшеня настойка». 6. Обоснование состава и технологии ЛП «Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки». 12 7. Фармакологическое обоснование целесообразности создания ЛП на основе корневищ с корнями женьшеня. 8. Разработка методик качественного и количественного анализа ЛП «Женьшеня настойка», «Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки». 9. Разработка проектов НД на корневища с корнями женьшеня, ЛП «Женьшеня настойка» и «Женьшеня сироп». Научная новизна. Впервые проведено анатомо-морфологическое, фитохимическое и фармакологическое исследование корней женьшеня настоящего, культивируемого в Самарской области (окр. г. Жигулевск, с. Солнечная Поляна, КФХ питомник «Женьшень»). Впервые в РФ с использованием цифровой микроскопии в сравнительном плане изучено анатомо-морфологическое и гистологическое строение отдельных частей растительного сырья – корневища, главного и придаточного корней, которые в совокупности составляют ЛРС «Женьшеня корневища с корнями». Впервые изучены анатомические и морфологические особенности потенциального ЛРС «Женьшеня трава», перспективного в качестве источника БАС и в рамках комплексного использования растения. В частности, исследовано строение черешка листа женьшеня, так как показано, что петиолярная анатомия является узкоселективным методом диагностики ЛРС (Сдобнина А.И., 2008). Разработаны методические и методологические подходы к контрою качества сырья и препаратов женьшеня настоящего, заключающиеся в оценке суммы сапонинов в пересчете на один из доминирующих компонентов – гинзенозид Rg1 с использованием методов ТСХ и спектрофотометрии. В результате фитохимического исследования из надземной части женьшеня настоящего впервые выделен и идентифицирован флавоноид – 3-О-диксилозид 3,5,7,41-тетрагидроксифлавона (кемпферол-3-О-диксилозид). 13 Научно обоснована целесообразность более полного истощения ЛРС при получении ЛП «Женьшеня настойка» (Патент РФ на изобретение № 2496509 от 27 октября 2013 г. «Способ получения средства, обладающего тонизирующей активностью»; удостоверение на рационализаторское предложение № 217 от 21 сентября 2012 г. «Способ получения настойки женьшеня»), обладающего более высокой тонизирующей активностью, чем промышленный образец. Предложен состав и способ получения ЛП «Женьшеня сироп» (Патент РФ на изобретение № 2514008 от 25 февраля 2014 г. «Сироп женьшеня»; удостоверение на рационализаторское предложение № 218 от 21 сентября 2012 г. «Состав сиропа женьшеня настоящего»). Предложен состав и способ получения ЛП «Женьшеня таблетки». Предложены методики контроля качества разработанных ЛП, основанные на определении действующих веществ (суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1), методами ТСХ и спектрофотометрии. Практическая значимость. Разработан раздел «Микроскопия» в проекте ФС на корневища с корнями женьшеня для включения в Государственную фармакопею Российской Федерации XII издания, а также раздел «Микроскопия» на потенциальное перспективное ЛРС – траву женьшеня настоящего. Предложены методики качественного и количественного анализа корневищ с корнями женьшеня и надземной части женьшеня. Определены показатели качества корней женьшеня, которые отражены в проекте ФС, принятом на рассмотрение ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» ФС «Женьшеня корневища с корнями» (вх. № 1021 от 28.01.13 г.). Разработаны состав, способ получения, определены показатели качества и методы их оценки ЛП из корневищ с корнями женьшеня «Женьшеня сироп», «Женьшеня таблетки». Оптимизирована технология ЛП «Женьшеня настойка». 14 Предложены методики качественного и количественного анализа действующих веществ в лекарственных формах (ЛФ), отвечающие принципам унификации, предъявляемые к современному фармацевтическому анализу (Самылина И.А. и др., 1994; 2006). Результаты диссертационных исследований используются в научной работе и учебном процессе на кафедрах фармацевтической технологии, фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, управления и экономики фармации, химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области», ЗАО «Самаралектравы», КФХ питомник «Женьшень» (акты о внедрении № 1-7). Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по теме: «Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения» (№ Государственной регистрации 01200900658), а также соответствует тематике Проблемной комиссии по химико-фармацевтическим наукам университета. Положения, выдвигаемые на защиту: 1. Результаты анатомо-морфологических и гистологических исследований корневищ с корнями и надземной части женьшеня настоящего. 2. Результаты фитохимического исследования различных органов женьшеня настоящего. 3. Результаты исследований по обоснованию состава и технологии ЛП «Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки». 4. Методики качественного и количественного анализа ЛРС «Женьшеня корневища с корнями», ЛП «Женьшеня настойка», «Женьшеня сироп» и 15 «Женьшеня таблетки» с использованием методов ТСХ и спектрофотометрии. 5. Способ получения средства, обладающего тонизирующей активностью (Патент РФ на изобретение № 2496509 от 27 октября 2013 г). 6. Сироп женьшеня (Патент РФ на изобретение № 2514008 от 25 февраля 2014 г.) Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на VI Всероссийской научно-практической конференции «Научные проблемы использования и охраны природных ресурсов России» (г. Самара, 2014); XVII и XVIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2012; 2013); IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (г. Волгоград, 2012); учёных и Первой научно-практической конференции молодых аспирантов (Всероссийский «Молодые институт учёные лекарственных и и фармация XXI ароматических века» растений (ВИЛАР), г. Москва, 2013); конференциях дипломированных специалистов «Аспирантские чтения «Молодые ученые – медицине» (г. Самара, 2012; 2013; 2014). Выполнение фрагментов диссертационной работы осуществлялось по линии программы «Участник Молодежного НаучноИнновационного Конкурса – 2010» («У.М.Н.И.К.»). Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 26 научных работах, из них 13 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ. Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены автором лично. Автором выполнены исследования по изучению морфологических и анатомо-гистологических особенностей строения лекарственного сырья женьшеня настоящего – корневищ с корнями, а также надземной части растения, выявлены основные диагностические признаки. Разработаны методики стандартизации корневищ с корнями женьшеня, предложены способы контроля качества травы 16 женьшеня. Предложены состав и технология получения препаратов «Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки», усовершенствована технология препарата «Женьшеня настойка». Приведены методики качественного и количественного анализа суммы сапонинов в данных препаратах с применением методов ТСХ и спектрофотометрии. Изучена стабильность препаратов «Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки», определены основные показатели качества. Автором разработан проект ФС «Женьшеня корневища с корнями». Проведены фармакологические исследования нейротропной активности усовершенствованного препарата «Женьшеня настойка» в сравнении с существующими аналогами. Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц, 61 рисунок. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатам собственных обсуждение, общих 4-х глав, посвященных экспериментальных выводов, приложения исследований и списка и их литературы, включающего 133 источников, из которых 30 – на иностранных языках. Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту. Глава 1 содержит аналитический обзор литературы по современному состоянию исследований женьшеня настоящего, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, стандартизации сырья, фармакологической активности, применения в медицинской практике. В главе 2 исследования. гистологического, представлена Приведены химического характеристика методики и объектов и методов анатомо-морфологического, физико-химического изучения 17 лекарственного растительного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, методики оценки фармакологической активности и технологии ЛП. В главах 3-6 экспериментальной части приведены результаты собственных исследований по изучению химического состава корней с корневищами и надземной части женьшеня настоящего, совершенствованию методик контроля качества ЛРС и ЛП на его основе, разработке новых препаратов, их стандартизации и обоснованию целесообразности внедрения в медицинскую практику в качестве тонизирующих ЛС. В Приложения вынесены акты внедрения, проекты ФС на женьшеня корневища с корнями, женьшеня настойку и женьшеня сироп, 2 патента РФ на изобретение и 2 рационализаторских предложения. Результаты, полученные при проведении исследований, статистически обработаны и представлены в формулах, таблицах, на рисунках, которые приведены в тексте диссертации. 18 ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЯЩЕГО (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Ботанико-фармакогностическое описание женьшеня настоящего и микроскопическая характеристика его корня Согласно ботанической классификации, женьшень настоящий – Panax ginseng C.A.Meyer относится к отделу (Magnoliophyta), классу Двудольные (Magnoliopsida), порядку Зонтикоцветные (Apiales), роду Женьшень (Panax) семейства Аралиевые (Araliacee) (Тахтаджан А.Л., 1948; Михайловская И.С., 1953 и др.). Родовое название растения Panax (является производным от слова panacea, обозначающего «лекарство от всех болезней») было дано К. Линнеем в 1753 г., когда в Европу уже дошла громкая слава о всеисцеляющем растении. Видовой эпитет Р. ginseng происходит от двух китайских слов – «jen» (человек) и «chen» (корень), что отражает сходство корня с фигурой человека [44, 64]. Это многолетнее травянистое растение высотой до 80 см, достигающее возрасте 50 лет и более [30, 34, 44, 64, 80, 84]. Стебель одиночный, округлый, зеленого или буро-красного цвета, заканчивающийся мутовкой из 2-6 листьев. Листья длинночерешковые, трех- и пятипальчатосложные; листочки по форме заостренно-эллиптические, по краю пильчатые, голые. К началу цветения (на 10-11 год жизни в природе, в культуре – на 3 год) из центра мутовки выбрасывается цветочная стрелка длиной свыше 10 (30) см, несущая простой зонтик с зеленовато-белыми пятичленными цветками с нижней двугнездной завязью. Плод представляет собой ярко-красную ценокарпную костянку с двумя плоскими семенами. Семена неправилно-округлые, шероховатые, светло-желтые. Масса 1000 свежесобранных семян составляет около 37 г, воздушно-сухих – 24 г, цветет в июле, плоды созревают в августесентябре. Растение размножается семенами (рис. 1) [26, 34, 44, 64, 80, 84]. 19 Б А В Рисунок 1 – Женьшень настоящий (Panax ginseng C.A.Meyer): А – общий вид растения, произрастающего в Самарской области; Б – свежесобранные корни; В – гербарный образец. Подземная часть представлена корневищем («шейка») с расположенными по спирали рубцами от отмерших стеблей, спящими, а также зимующей покоящейся почкой («головка») [30, 44, 64]. Главный корень по форме цилиндрический, имеет боковые корни и многочисленные более тонкие «мочки». Корневая система в длину достигает 70 см, главный корень – 30 см. У 10-50 летних растений средняя масса корней составляет приблизительно 25 г [44]. На сырье «Корни женьшеня» существует НД – ГФ CCCР XI издания (ст. 66), где в разделе «Микроскопия» описаны морфолого-анатомические признаки корня [22], однако они в полной мере не раскрывают особенностей микроскопического строения подземной части данного растения. 20 По литературным данным, на поперечном срезе под микроскопом виден узкий слой пробки светло-коричневого цвета, широкая кора, четкая линия камбия, а также древесина [22, 30, 44, 64, 83, 101]. Элементы флоэмы и ксилемы располагаются узкими радиальными тяжами, разделены широкими, многорядными сердцевинными лучами. Мелкие тонкостенные клетки флоэмы образуют прилегающие к камбию тяжи треугольной формы, над которыми залегают секреторные каналы с содержимым от светло-желтого до желтого цвета. Остальную часть коры составляет крупноклеточная рыхлая паренхима, в которой проходят 2-3 ряда секреторных каналов с каплями содержимого красно-коричневого цвета. Узкие сосуды ксилемы расположены радиально в один или два ряда; видны мелкие клетки древесной паренхимы. В центре корня залегает участок первичной ксилемы в виде звездочки [22, 30, 44, 101]. В клетках сердцевинных лучей, в паренхиме коры и древесины содержатся мелкие крахмальные зерна округлой формы, простые и 2-6сложные. В отдельных клетках иногда содержатся друзы оксалата кальция (рис. 2) [22, 30, 44, 101]. Несмотря на то, что анатомо-диагностические признаки корня женьшеня описаны, в данной НД отсутствует подробное рассмотрение морфологоанатомических признаков корневища, боковых и придаточных корней, из которых и состоит ЛРС, а также не представлены микрофотографии диагностических признаков, которые современными требованиями к НД [69]. необходимы в соответствии с 21 Рисунок 2 – Корень женьшеня. Часть поперечного среза (× 120) [30]. Обозначения: 1 – паренхима коры; 2 – камбий; 3 – сосуды древесины; 4 – секреторные вместилища; 5 – друзы оксалата кальция; 6 – проводящие элементы луба. 1.2. Ареал дикорастущего растения и его культивирование 1.2.1. Естественные условия обитания Женьшень встречается очень редко в Приморье, южный районах Хабаровского края [24, 44]. Он распространен также в Северной Корее, Китае (Маньчжурия). Биоценотически женьшень связан с кедрово- широколиственными, реже широколиственными лесами Дальнего Востока, где встречается в ассоциации с корейским кедром, орехом маньчжурским, липой амурской, маакией и другими широколиственными видами, иногда елью и пихтой на высотах 200-700 м над уровнем моря. Занимает, в основном, достаточно северные затененные увлажненной почве. макросклоны Женьшень с богатой крайне перегноем, теневынослив и тенелюбив, не выносит прямых солнечных лучей [24, 64, 103]. Запасы дикорастущего женьшеня невелики и с каждым годом уменьшаются, поэтому он занесен как в Красную книгу СССР, так и в Международную Красную книгу. Естественное восстановление запасов растения затруднительно в связи с очень медленным ростом и развитием 22 растения. Прирост корня дикорастущего женьшеня в год составляет в среднем 1 г [44, 64]. Семена после попадания в почву всходят только спустя 2-3 года. Стадии цветения и плодоношения начинаются на 8-10-ом году жизни. Для сохранения зарослей необходимо соблюдать способы и сроки его растения. Дикорастущий женьшень заготавливают в очень ограниченных количествах [44, 64, 103]. 1.2.2. Культивирование и агротехника Первой страной, наладившей массовое выращивание женьшеня, является Корея. В настоящее время в Корее различают около 15 сортов женьшеня [34, 44, 64]. В бывшем СССР культуру женьшеня осваивали во многих местах. Промышленное культивирование началось с Приморского края (совхоз «Женьшень»), а затем постепенно продвигалось на запад страны. В РФ сущемтвует научно-методический центр по культивированию женьшеня в Тебердинском государственном заповеднике, где созданы плантации женьшеня [34, 44, 64]. Опыт культивирования женьшеня показывает, что его выращивание возможно в том случае, если удается создать условия, близкие к природным по освещенности, растительному покрову, увлажненности и составу (рис. 3). Разница заключается лишь в том, что у женьшеня, произрастающего в тайге, из-за замедленного процесса обмена веществ масса корня нарастает крайне медленно, и товарного состоянии он достигает примерно к 20 годам. В условиях культивирования женьшень развивается быстрее, и нарастание массы корня форсируется с помощью агротехнических методов (в том числе оптимизации вводимых органических и минеральных удобрений); на плантациях корни женьшеня достигают товарного состояния только к 6-7 годам. Средняя масса их в этом возрасте 35-40 г, но может достигать и 70-100 г [44]. 23 Рисунок 3 – Культивирование женьшеня в Самарской области, округ г. Жигулевска, КФХ питомник «Женьшень». В промышленных масштабах женьшень культивировался в Приморском крае (совхоз «Женьшень»). Опытные плантации данного растения имеются на Северном Кавказе и в других районах страны, на Украине (Полтавская обл.). Культура женьшеня весьма трудоемка, поэтому разработана инструкция по ускоренному проращиванию семян женьшеня (Грушницкий И.В. и др., 1981 г.), в соответствии с которой рекомендуется перед севом семян проводить их теплую и холодную стратификацию [24, 26, 33]. С целью расширения сырьевой базы разработана также биотехнология культуры ткани и клеток женьшеня [34, 44]. Из каллусной ткани штамма БИО-2, полученной in vitro из корня женьшеня, производят сухую биомассу женьшеня [70, 79]. Она представляет собой округлые кусочки или кусочки неправильной формы, пористые, легкие, очень легко рассыпающиеся при растирании до состояния порошка. Цвет светло-желтого или светлокоричневого, слабый, специфический запах, солоновато-горький вкус [44]. 24 1.3. Заготовка, сушка и хранение сырья Для сохранения дикорастущего женьшеня, являющегося ценнейшим лекарственным растением, необходимо строго соблюдать сроки и способы его заготовки. Заготовку женьшеня начинают со времени созревания (покраснения) плодов, т.е. не ранее первой декады августа. Сбору подлежат исключительно плодоносящие, хорошо развитые растения, имеющие не менее 3 листьев и корень массой свыше 10 г. Корни женьшеня выкапывают с максимальной осторожностью, очищают от земли мягкой щеточкой (мыть не рекомендуется), не допуская их повреждения [44, 103]. С найденного растения собирают зрелые плоды и высаживают их в почву в месте находки или в других частях леса с подходящими условиями [24, 33, 44]. Выкопанные корни укладывают в коробки, сделанные из коры кедра, выстланные умеренно увлажненным мхом и слоем легкой лесной почвы, взятой с места заготовки женьшеня и просеянной через решето [24, 103]. Корни женьшеня сушат на солнце или в сушилках при температуре, не превышающей 50 ºС, при этомсырье раскладывают тонким слоем [33]. В Китае и Корее корни женьшеня подвергают разнообразной специальной обработке. Красный женьшень, поступающий из Кореи, получают путем воздействия горячего водяного пара в течение 30 мин и последующего высушивания при 30 ºС. В этом случае крахмал превращается в клейстер и сухие корни приобретают роговую консистенцию, становятся твердыми и тяжелыми, цвет снаружи и на изломе бурый или красный. Белый женьшень получают путем простой сушки на солнце. В Китае свежесобранный корень варят в сахарном сиропе [24, 44]. Согласно требованиям ГФ СССР XI издания, к медицинскому применению разрешены корни женьшеня корейского красные и белые [19, 22, 44]. Красный корень полупрозрачный, с роговидной консистенцией, очень тяжелый и твердый, его поверхность продольно-глубокоморщинистая, на 25 поперечном разрезе – мелкоскладчатая; тонкие корешки очень хрупкие [19, 22, 44]. «Тело» корня цилиндрическое или веретенообразное, «шейка» и «головка» обычно отсутствуют, у некоторых экземпляров на верхушке заметны следы 1-3 стеблей. Ответвлений мало, в верхней части бывают лишь 2-3 отростка и более. Корневые мочки обычно обрезаны и поступают отдельно, связанные мелкими пачками. Цвет на изломе и снаружи красновато-бурый, вкус слегка сладковатый, затем горьковатый [19, 22, 44]. Белый корень отличается от красного окраской, снаружи он беловатожелтый, на изломе белый, мучнистой консистенции [19, 22, 44]. Согласно требованиям ГОСТа 10064-62, сырые корни дикорастущего женьшеня должны быть здоровыми, плотными, с неповрежденным телом, отростками, мочками, головкой (почкой) и шейкой. В зависимости от массы и качества сырья корни женьшеня делят на 5 классов и многочисленные сорта (табл. 1) [19, 33]. В первом сорте (масса экземпляра 42 г и более) имеются сорта «экстра», к которым относятся корни массой более 120 г [19, 44] Таблица 1 – Классификация корней женьшеня в зависимости от их массы [33] Сорт Масса корня, г 1 42 и более 2 29 – 41,9 3 18-28,9 4 10-17,9 5 3-9,9 По характеру и степени поврежденности корни делят на две группы [33, 44]. К первой группе относятся: - корни с одним поломаным дополнительный отросток, - корни с естественными или искусственными повреждениями, которые составляют до 5% поверхности основного тела или дополнительных отростков (срывы кожицы, царапины и др.); 26 - корни с поврежденной головкой и шейкой, но без поломов. Ко второй группе относятся: - корни с поломкой более одного дополнительного отростка; - корни с естественными или искусственными повреждениями от 5% до 10% поверхности основного тела или дополнительных отростков; - корни без головки (почки). Влажность сдаваемого корня должна приблизительно соответствовать его влажности в условиях естественного произрастания [19, 22, 44]. Для нормальной влажности характерна плотная структура корня (на ощупь) и свежий (не вялый) по внешнему виду. Сырые корни женьшеня хранят при низких положительных температурах, не допуская их высыхания, упаковывая в деревянные ящики в количестве не более 3 кг в одном ящике. На первичных заготовительных пунктах сырые корни женьшеня хранят в легких деревянных ящиках, дно и стенки которых выстилают умеренно влажным мхом [44, 103]. 1.4. Химический состав различных органов женьшеня настоящего Корни женьшеня настоящего содержат сапонины, относящиеся, по мнению большинства ученых, к тетрациклическим тритерпенам. Однако по мнению проф. В.А. Куркина (В.А. Куркин, 2007), сапонины женьшеня целесообразно относить к группе тритерпеноидов стероидного происхождения [44]. К доминирующим сапонинам относятся панаксозиды A, B, C, D, E, F и G на основе двух агликонов – панаксадиола и панаксатриола, содержащихся в растении в виде соответствующих предшественников – протопанаксадиола и протопанаксатриола (группа даммарана) [44]. В корне женьшеня содержится сумма сапонинов. Подробное изучение их химической природы стало возможным недавно – в последние десятилетия. В изучение сапонинов женьшеня в период 1962-1968 гг. внесли Б.Г. Еляков (Дальневосточное отделение АН СССР) и японский ученый С. 27 Шибата. Показано, что сапонины женьшеня, названные в РФ панаксозидами, а в Японии гинзенозидами, представляют собой тетрациклические тритерпеноиды, относящиеся к группе даммарана [44]. Советским ученым было выделено 7 соединений, которые обозначили латинскими буквами A, B, C, D, E, F и G [34, 44, 64, 84]. У панаксозидов А, В, С агликоном является панаксатриол, содержащий три гидроксильные группы в положениях 3, 6 и 12, а у панаксозидов D, E, F и G – панаксадиол, содержащий два гидроксила в положениях 3 и 12 [34, 44, 64, 84, 125]. Одновременно с выяснением структуры агликонов было установлено, что гликозиды женьшеня содержат в углеводородных цепях от 3 до 6 моносахаридных остатков (рамнозы, глюкозы, арабинозы и ксилозы). правктически все гликозиды имеют 2 углеводные цепи, соединенные с агликоном обычными гликозидными связями [34, 44, 64, 84]. Корни женьшеня в значительных количествах содержат белковые вещества (до 18%), крахмал (до 20%), пектиновые вещества (16-23%). В сырье обнаружены также моносахариды (глюкоза, фруктоза и др.), сахароза (4,0-9,7%), липиды, стерины, витамины С, В1, В2. В золе обнаружены калий, кальций, магний, железо, марганец (преобладает), алюминий, кремний. Соли образованы в основном серной и фосфорной кислотами, причем фосфаты составляют более 50% суммы окислов в золе [34, 44, 64, 84]. Специфический запах корней обусловлен наличием в них эфирного масла (до 80% эфирных масел – сесквитерпены) (0,05-0,25%), в частности, по имеющимся данным, фарнезолом (0,05-0,2%) и панаценом (0,05%) [34, 44, 64, 84]. В корнях женьшеня обнаружены полиацетиленовые соединения (0,020,03%) – гепта-1,9-диен-4,6-диин-3-ол (панаксинол) и гептадека-1-ен-4,6диин-3,9,10-триол (панакситриол), проявляющие антиоксидантную активность [58, 116, 124]. По данным корейских (Nguyen Huu Tung et al., 2010) и отечественных ученых в стеблевых листьях женьшеня настоящего содержатся гинзенозиды 28 R10, ST-1 и ST-2, представляющие собой модифицированные производные панаксатриола [47, 59, 74, 127]. Исследования китайских ученых (Xiu Wei Yang et al., 2000) показывают, что в стеблевых листьях женьшеня содержатся также гинзенозиды Rg4, Rg5, и Rh3 [127, 130, 131]. Из ягод женьшеня настоящего корейскими учеными (Sook Young Lee et al., 2010) выделены и идентифицированы новые гинзенозиды Rh1, Rh2 а также гинзенозид Rg4, получаемый после термической обработки сырья [104, 117]. Результаты анализа и систематизации данных литературных источников относительно химического состава женьшеня настоящего представлены в табл. 2. Таблица 2 – Химический состав женьшеня настоящего № п/п Соединение Структура Cапонины 1 20S-протопанаксадиол (3S,5R,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S) -17-[(2S)-2-гидрокси-6-метилгепт5-ен-2-ил]-4,4,8,10,14-пентаметил2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17додекагидро-1Hциклопента[a]фенантрен-3,12диол (Даммар-24-ен-3β,12β,20-триол) C30H52O3 Мм 460,73 29 2 Панаксадиол (3S,5R,6R,8R,9R,10R,12R,13R,14R,1 7S)-4,4,8,10,14-пентаметил-17[(2S)-2,6,6-триметилоксан-2-ил]2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17додекагидро-1Hциклопента[a]фенантрен-3,12диол ((20R)-20,25-Эпоксидаммарен3β,12β-диол) 3 4 C30H52O3 Мм 460,73 Гинзенозид а1 (панаксозид а1) 3-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-20-[β-Dксилопиранозил(1→4)α-Lарабинопиранозил(1→6)β-Dглюкопиранозил]-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетерагидроксидаммар24-ен C62H103 O27 Мм 1280,50 Гинзенозид а2 (панаксозид а2) 3-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-20-[β-Dксилопиранозил(1→4)α-Lарабинофуранозил(1→6)β-Dглюкопиранозил]-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетерагидроксидаммар24-ен C62H103O27 Мм 1280,50 30 5 6 7 8 Гинзенозид Rb1 (панаксозид Rb1) 3-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-20-[β-Dглюкопиранозил(1→6) β-Dглюклпиранозил]-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетерагидроксидаммар24-ен C54H92O23 Мм 1109,29 Гинзенозид Rb2 (панаксозид Rb2) 3-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-20-[α-Lарабинопиранозил(1→6)β-Dглюкопиранозил]-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетерагидроксидаммар24-ен C53H90O22 Мм 1079,30 Гинзенозид Rb3 (панаксозид Rb3) 3-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-20-[β-Dксилопиранозил(1→6)β-Dглюкопиранозил]-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетерагидроксидаммар24-ен C53H90O23 Мм 1095,27 Гинзенозид Rbс (панаксозид Rbс) 3-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-20-[α-Lарабинофуранозил(1→6)β-Dглюкопиранозил]-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетерагидроксидаммар24-ен C53H90O22 Мм 1079,29 31 9 Гинзенозид Rbd (панаксозид Rbd) 3-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-20-(β-Dглюкопиранозил)-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетерагидроксидаммар24-ен C48H82O18 Мм 974, 18 10 Гинзенозид Rg3 (панаксозид Rg3) 3-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетерагидроксидаммар24-ен C42H79O13 Мм 792,09 11 Гинзенозид Rg5 (панаксозид Rg5) 3-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетрагидроксидаммар24-ен С41Н66О12 Мм 750,98 12 13 Гинзенозид Rh2 (панаксозид Rh2) 3-(β-D-глюкопиранозил)3β,6α,12β,20S)-3,6,12,20тетрагидроксидаммар-24-ен С36Н59О8 Мм 619,87 Гинзенозид Rh3 (панаксозид Rh3) 3-(β-D-глюкопиранозил)(3β,6α,12β)-3,6,12тригидроксидаммар-20,24-диен С36Н57О7 32 14 15 16 Мм 601,85 20S-протопанаксатриол (3S,5R,6S,8R,9R,10R,12R,13R,14R,1 7S)-17-[(2R)-2-гидрокси-6метилгепт-5-ен-2-yl]-4,4,8,10,14пентаметил2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17додекагидро-1Hциклопента[a]фенантрене3,6,12,20-тетрол ((20R)-Даммар-24-ене3β,6α,12β,20-тетрол) C30H52O4 Мм 476,73 Панаксатриол (3S,5R,6R,8R,9R,10R,12R,13R,14R,1 7S)-4,4,8,10,14-пентаметил-17[(2R)-2,6,6-триметилоксан-2-ил]2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17додекагидро-1Hциклопента[a]фенантрен-3,6,12триол (20R)-20,25-Эпоксидаммарен3β,6β,12β-триол С30Н52О4 Мм 476,73 Гинзенозид Rg1 (санчинозид А, панаксозид Rg1) 6,20-Бис-(β-D-глюкопиранозил)(3β,6α,12β,20S)-3,6,12,20тетрагидроксидаммар-24-ен С42Н72О14 Мм 801,01 33 17 Гинзенозид Rg2 (панаксозид Rg2) 6-[α-L-рамнопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетрагидроксидаммар24-ен С43Н74О12 Мм 783,04 18 Гинзенозид Rg4 (панаксозид Rg4) 6-[α-L-рамнопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-(3β,6α,12β)3,6,12-тригидроксидаммар-20,24диен C42H72O11 Мм 753,01 19 Гинзенозид Rf (панаксозид Rf) 6-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетрагидроксидаммар24-ен С42Н72О14 Мм 801,03 34 20 Гинзенозид Re (панаксозид Re) 6-[α-L-рамнопиранозил (1→2)β-Dглюкопиранозил]-20-(β-Dглюкопиранозил)-(3β,6α,12β,20S)3,6,12,20-тетрагидроксидаммар24-ен С48Н73О17 Мм 922,11 21 Гинзенозид Rh1 (панаксозид Rh1) 6-(β-D-глюкопиранозил)(3β,6α,12β,20S)-3,6,12,20тетрагидроксидаммар-24-ен С36Н62О9 Мм 638,87 22 Гинзенозид ST1 6-(β-D-глюкопиранозил(3β,6α,12β,24α)-3,6,12,24тетрагидроксидаммар-20,24,25триен С36Н59О10 Мм 651,87 23 Гинзенозид ST2 6-(β-D-глюкопиранозил)(3β,6α,12β,25α)-3,6,12,25тетрагидроксидаммар-23-ен С37Н62О10 Мм 666,90 35 24 Гинзенозид R10 6-(β-D-глюкопиранозил)(3β,6α,12β)-3,6,12тригидроксидаммар-20-он С29Н48О8 Мм 522,75 25 Гинзенозид Ro 3β-28-(β-D-глюкопиранозилокси)28-оксоолеан-12-ен-3-ил-2-O-β-Dглюкопиранозил-β-Dглюкопиранозид уроновой кислоты С48Н78О18 Мм 943,15 Полиацетилены 26 27 Панаксинол (фалькаринол) Гепта-1,9-диен-4,6-диин-3-ол С17Н24О Мм 244,38 Панакситриол (фалькаринтриол) Гептадека-1-ен-4,6-диин-3,9,10триол С17Н26О3 Мм 278,40 Эфирное масло 28 Фарнезол 3,7,11-триметилдодека-2,6,10триен-1-ол C15H26O Мм 226,36 36 29 Панацен 2-[3-бромпропандиенил]-8-этил2,3,3a,8bтетрагидрофуро[3,2b][1]бензофуран C15H15BrO2 Мм 306,03 Витамины 30 31 32 Витамин С (аскорбиновая кислота) (2R)-2-[(1S)-1,2-дигидроксиэтил]4,5-дигидроксифуран-3-он С6Н8О6 Мм 176,12 Витамин В1 (тиамин) 3-[(4-амино-2-метил-5-пиримидил) метил]-5-(2-гидроксиэтил)-4метил-тиазол С12Н17N4ОS Мм 266,40 Витамин В2 (рибофлавин) 6,7-Диметил-9-(D-1-ибитил)изоаллоксазин С12Н29N4О6 Мм 376,37 1.5. Современное состояние стандартизации сырья и лекарственных препаратов женьшеня Решение проблемы химической стандартизации, согласно принципу системного подхода проф. И.А. Самылиной (1994; 1996 гг.), заключается в унификации методик анализа в ряду сырье – лекарственная субстанция – ЛП [85-87]. 37 Действующая на данный момент в РФ НД на корни женьшеня настоящего (ГФ СССР XI изд., ФС 66) в качестве методики для определения подлинности корней женьшеня предлагает метод микроскопии, качественные пробирочные реакции и метод ТСХ [22]. Метод ТСХ имеет ряд недостатков: экстракцию порошка корня женьшеня осуществляют 95% этиловым спиртом, что не позволяет максимально экстрагировать сильнополярные панаксозиды, имеющие в своей структуре до 5 остатков моносахаридов. Система растворителей хлороформ – метиловый спирт – вода (61:32:7) и марка хроматографической пластинки (Silufol) не обеспечивают четкое разделение веществ на хроматограмме [22], и, к тому же, является продукцией зарубежного производства. В разделе «Числовые показатели» нормируемыми являются величины экстрактивных веществ, влажности и золы, которые не могут трактоваться как объективные, достоверные и надежные показатели качества. Раздел «Количественное определение» в данной ФС отсутствует. Раздел «Микроскопия» включает лишь описание признаков главного корня, в то время как ЛРС женьшеня состоит, на наш взгляд, из корневища, корня, главного, бокового и придаточных корней [22]. Стандартизацию корней женьшеня по Европейской фармакопее проводят путем определения суммы гинзенозидов Rb1 и Rg1 методом ВЭЖХ [109]. Фармакопей США предложено определять содержание гинзенозидов Rb1 и Rg1 отдельно друг от друга также методом ВЭЖХ [128]. Однако в обоих случаях не принимается во внимание наличие сопутствующих биологически активных гинзенозидов, компонентный состав которых может варьировать до 11 [44]. Стандартизация субстанции «женьшеня азиатского экстракта порошок» осуществляется по гинзенозидов Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2 и показателю «не менее 3% Rd в сумме в пересчете на сухое вещество» [128]. Кроме того, данные методики предусматривают наличие нескольких стандартных образцов, что значительно увеличивает стоимость анализов. Количественное определение ведущей группы БАС отсутствует и в 38 Японской фармакопее: вместо этого в НД включено определение сухого остатка (не менее 14%) [112]. Анализ отечественных и зарубежных литературных данных показывает, что в качестве системы растворителей для ТСХ-анализа сырья и настойки используются смеси хлороформ - метанол - вода (61:32:7), нбутанол - этанол - 25% аммиак (10:4:4), хлороформ - метанол - вода (13:7:2), н-бутанол - вода - этилацетат (4:2:1), хлороформ - метанол - вода (70:30:4). В качестве проявляющего реагента используются 20% спиртовой раствор фосфорно-молибденовой кислоты, 10% раствор серной кислоты, анисовый альдегид, ванилин-фосфорный реактив [2, 12, 14, 15, 18, 22, 46, 97, 99, 100, 105, 109, 110, 128]. В практической фармации производители ЛП используют несколько видов НД на препараты женьшеня. В ВФС на настойку «Панаксел» анализ ведется по «сумме гликозидов», что нельзя считать специфичным для корней женьшеня [15]. В ФСП «Женьшеня экстракт сухой» [100] и «Женьшеня настойка» [99] предлагается количественное определение суммы панаксозидов в пересчете на панаксозид Rb1 методом спектрофотометрии после проведения реакции с фосфорно-молибденовой кислотой, однако данные об аналитической длине волны (700 и 730 соответственно) и удельном показателе поглощения (217 и 193) противоречивы [99, 101]. Отечественными методов химической учеными предпринимались стандартизации ЛРС и попытки разработки препаратов женьшеня, соответствующих требованиям объективного анализа, но они оказались не столь успешными. На наш взгляд, в данных случаях предусмотрено использование громоздкой и многостадийной технологии, которую нельзя признать целесообразной с точки зрения воспроизводимости методики [18, 46, 51, 56, 97]. Множество подходов к анализу сырья и настойки нуждаются в критическом пересмотре в плане выбора методов стандартизации. 39 Фармакологические свойства и применение лекарственных 1.6. средств женьшеня Для установления истинной ценности женьшеня потребовался труд многих исследователей исследования на профессора протяжении Брехмана ряда десятилетий. И.И. (Хабаровск) Глубокие и других отечественных ученых обосновывают применение женьшеня в качестве стимулирующего и тонизирующего средства при пониженной работоспособности, физическом и умственном переутомлении, после источающих организм заболеваний, при нарушениях функционирования сердечно-сосудистой системы, некоторых психических и нервных заболеваниях функциональной природы (психастения, неврозы, неврастения) и др. [5, 42, 44, 49]. Настойку женьшеня (1:10 на 70% этиловом спирте) и другие препараты применяют как стимулирующие ЦНС, тонизирующие, иммуностимулирующие и адаптогенные средства при переутомлении, неврастении, гипотонии [57, 94, 95, 98] (табл. 3). По данным зарубежных исследователей, в клинике и эксперименте экстракты корней, полисахариды, гинсана (стандартизированный экстракт женьшеня G115), панаксатриол и гинзенозиды обладают иммуномодулирующими и радиопротекторными свойствами [55, 115, 119], в т. ч. при химиотерапии и ВИЧ инфекции, экстракты корней и плодов, гинзенозиды Rh2 и Re обладают гипогликемическими и антидиабетическими на моделях диабета 1 и 2 типов [104, 130, 132], гинзенозиды Rg2, Rb и водный экстракт – протективными при ишемии миокарда [53, 54, 107, 126] экстракт, гинзенозиды Rc, Rg3 и Rh2 – стресспротективными [48, 121], эффективными при эректильной дисфункции. В эксперименте водный и спиртовой экстракты, гинзенозиды, протопанаксадиолы Rb1, Rb2, Re и Rd, протопанаксатриолы Re и Rg обладают нейропротективными [118] и антиоксидантными свойствами [25, 52, 58, 116], гинзенозиды Rg1 и Rb1 ноотропными [4, 41], протопанаксатриол и протопанаксадиол и гинзенозиды 40 - сосудорасширяющими и гипотензивными [53, 54, 107, 126], липофильнвя фракция и гинзенозиды – тромболитическими, сапонины – антидепрессантными [39, 80], производные панаксадиола и панаксатриола – гемопоэтическими, вещество K и гинсана – антиаллергическими [92, 93, 122], гинсана – гепатопротективными и антимутагенными [80], водный экстракт корней – цитопротективными [80], экстракты корней – гастропротективными, противорвотными [80], экстракт и полисахариды – антигиппоксическими [6, 52], экстракт корней, гинзенозиды Rb1 и Rb3 – противосудорожными, гинзенозид Rb2 – ранозаживляющими, гинзенозиды Rb1 и Rf – гиполипидемичексими [80], гинзенозид Rf – анальгезирующими, гинзенозид Rb1 – противоязвенными, полисахариды - антиадгезивными для патогенных микроорганизмов кожи и ротовой полости [80]. Гинзенозиды Rb2, Rg1 и Re стимулируют ангиогенез, экстракт корней повышает синтез коллагена в фибробластах кожи, водный экстракт цветков увеличивает синтез прогестерона [123], экстракт, гинзенозиды Rd и Rb ингибируют секрецию матричных металлопротеиназ, гинзенозид Rb1 активирует эстрогеновые рецепторы a и b [80, 123], гинзенозид Rg3 ингибирует активность циклооксигеназы-2 и фактора NFkappaB, полиацетиленовые соединения ингибируют активность холестерол ацилтрансферазы [91], (9R,10S)-эпоксигептадекан-4,6-диин-3-он эпоксигептадекан-4,6-диин-3-он – и активность 1-метокси-(9R,10S)диэтилглицерол ацетилтрансферазы [80, 91], п-кумаровая кислота – активность тирозиназы, гинзенозиды Rh1 и Rh2 – активность фосфолипазы С [63, 71]. Порошок корней подавляет развитие рака толстой кишки [76, 96, 111, 114] (существует мнение о том, что экстракты термически обработанных корней («red ginseng») могут выступать в роли неспецифических по отношению к органам хемопревентивных средств, экстракты корней подавляют развитие рака печени и кожи, аденомы легких) [34]. 3β-ацетоксипанаксадиол проявляет цитотоксическую активность в отношении клеток линии Vero [36], экстракт корней, вещество K, флоралгинзенозид Та, гинзенозиды F и F1 41 активны в отношении клеток линии HL-60 (лейкемия)], гинзенозиды Rg1, Rg3, Rh1, Rh2, Rd, Re, протопанаксадиол и протопанаксатриол – в отношении клеток линий MCF-7, MCF-7/MX и MCF-10A (рак груди), экстракт – в отношении клеток линии S180 (саркома), гинзенозиды Rg1 и Rb1 – в отношении клеток рака желудка, гинзенозид Rh2 – в отношении клеток карциномы яичников, 20(R)-гинзенозид-Rg3, 20(S)-гинзенозид-Rg3 и гинзенозид Rb2 – в отношении клеток линии В16-ВL6 (меланома), экстракт корней, 20(R),22(ξ),24(S)-даммар-25(26)-ен-3β,6α,12β,20,22,24-гексаол и панаксидол – в отношении клеток линии НерG2 (гепатокарцинома), гинзенозиды Rg3, Rg5, Rk1, Rs5 и Rs4 – в отношении клеток линии SK-Нер-1 (гепатома), 20(R)-даммаран-3β,12β,20,25-тетраол, 20(S)-протопанаксадиол и 20(S)-гинзенозид Rh2 – в отношении клеток линий Н838 (рак легких), LNCaP и РС3 (рак простаты) [1, 27, 29, 37, 50, 72, 75, 81, 90, 108, 113]. Результаты систематизации литературных данных о препаратах и БАДах женьшеня, зарегистрированных в РФ, представлены в таблице 3. Таблица 3 – Характеристика лекарственных препаратов и БАДов на основе корней женьшеня настоящего № Наименов ЛП/ Состав Фармакологически свойства, Форма п/п ание БАД активные вспомогате показания к применению выпуска, упаковка вещества льные вещества 1. Доппельге ЛП женьшеня МКЦ, Общетонизирующее, Капсулы в рц корня высокоцепо общеукрепляющее и блистерах Женьшень порошок чечный психостимулирующее действие. по 20 шт. В (180 мг в 1 глицерид, Повышает тонус сосудов, ускоряет пачке капс.) желатин, обмен аминокислот, липидов, картонной 2 железа гистамина. Улучшает или 3 оксид функциональную деятельность блистера желтый, сердечно-сосудистой и нервной железа систем. Повышает умственную и оксид физическую работоспособность и красный, адаптационную способность титана организма. Уменьшает вялость, диоксид, сонливость, чувство усталости. натрия, 42 2. Доппельге рц Женьшень Актив 3. Геримакс Женьшень 4. Геримакс Женьшень Экстра вода Астенический и неврастенический очищенная синдром; длительное психическое и физическое переутомление; стресс; период выздоровления после перенесенных заболеваний. ЛП женьшеня ароматичес Стимулирующее действие на ЦНС, Эликсир во корня кая повышение умственной и флаконах экстракт настойка; физической работоспособности, темного жидкий инвертный общеукрепляющее действие. стекла по (3243 мгв сахар; мед; Астенические состояния различной 200 или расчете на пропиленгл этиологии; повышенные 250 мл, в 100 мл), иколь; физические и умственные коробке 1 никотинам натрия нагрузки; период восстановления флакон ид, цитрата после перенесенных заболеваний. пиридокси дигидрат; на сахарный гидрохлор краситель; ид, кофеин ликерное вино; этанол 96 об.% ЛП корня кальция Стимулирующее действие на ЦНС, Таблетки в умственную и блистерах женьшеня гидрогенфо повышение физическую работоспособность. экстракт сфат, по 10 шт. В Повышенные умственные и (200 мг в 1 крахмал пачке физические нагрузки, физическое табл., что кукурузный переутомлении; картонной повышение соответств , МКЦ, физической выносливости у 1, 3, 6, 9, 12 ует 8 мг желатин, спортсменов; в комплексной или 15 гинзенози гидроксипр терапии при неврастеническом блистеров дов) опилметилц синдроме, в т.ч.: при ослаблении еллюлоза, половой функции; при вегетососудистой дистонии по магния гипотоническому типу; при стеарат, астенических состояниях в период железа выздоровления, для ускорения оксид, процесса восстановления после тяжелых макрогол перенесенных заболеваний и хирургических операций. Для повышения сопротивляемости организма к инфекциям. БАД Экстракт дикальция В качестве биологически активной Таблетки в корня фосфат, добавки к пище – дополнительного блистерах, женьшеня мальтодекстисточника витамина С, источника по 10 или (200 мг с рин, гинзенозидов и розавина. 30 в пачке содержани целлюлоза картонной ем микрокрист 43 гинзенози аллическая, дов 12,8 – карбоксиме 24,0 мг); тилцеллюло экстракт за натрия родиолы кроссвязанн розовой, ая, витамин С гидроксипр опилметилц еллюлоза, магниевые соли жирных кислот, оксиды и гидроксиды железа, воск карнаубски й 5. Геримакс БАД стандартиз МКЦ; энерджи ованный крахмал экстракт кукурузный корня ; женьшеня мальтодекст содержащ рин; ий 3,4 мг глицерин; гинзенози натрий дов (85 карбоксиме мг), тилцеллюло стандартиз за с ованный поперечным экстракт и листьев сшивками; зеленого магния чая, стеарат; витамин гидроксипр A, B1, B2, опилметилц B6, B12, C, еллюлоза; E, железа фолиевая оксид; кислота, тальк; никотинам шеллак. ид, пантотено вая Повышает сопротивляемость организма тяжелым психическим и физическим нагрузкам, улучшает память, сон, повышает общую сопротивляемость организма. Нейтрализует свободные радикалы и токсины, снижает риск возникновения онкологических заболеваний, препятствует развитию атеросклероза, оказывает противовоспалительное действие, а также способствует нормализации веса. Защищает от усталости и стресса, повышает сопротивляемость организма, улучшают работоспособность и память, способствует нормализации веса. Рекомендуется в качестве источника панаксозидов, витаминов, катехинов, макро- и микроэлементов, оказывающих общеукрепляющее и тонизирующее действие. Таблетки в ячейковой контурной упаковке 10 шт, в пачке картонной по 1, 3 или 6 упаковок. 44 кислота, Mg, Fe, Zn, Cu, Mn, Cr, Mo тонизирующее и Капсулы во 3. Гербион ЛП женьшеня лактозы Оказывает Женьшень психостимулирующее действие. корней моногидрат; флаконах Стимулирует ЦНС, уменьшает экстракт тальк; темного слабость, утомляемость, сухой крахмал стекла по 24 сонливость; повышает АД, стандартиз кукурузный физическую и умственную шт.; в пачке ованный, с ; кремния работоспособность, картонной 1 содержани диоксид адаптационную способность флакон ем суммы коллоидныйорганизма; стимулирует половую гинсенози безводный; функцию. Снижает содержание дов — 21 желатин; глюкозы и холестерина в крови, активирует деятельность мг в 350 пропилпара надпочечников. мг гидроксибе Астенические состояния различной экстракта нзоат; этиологии; длительные и/или (в 1 табл.) магния повышенные физические и психические нагрузки; период стеарат, после метилпараг выздоровления инфекционных заболеваний; для идроксибен повышения сопротивляемости зоат; организма к стрессу и бриллианто неблагоприятным воздействиям. вый черный краситель; титана диоксид; оксид железа черный; оранжевый краситель; хинолиновы й желтый 4. Женьшень ЛП экстракт – Стимулирует ЦНС. Таблетки в с Для повышения работоспособности упаковке корня витамином при повышенных физических и ячейковой женьшеня С умственных нагрузках; период контурной в 250 мг, восстановления после аскорбино пацке перенесенных заболеваний; вая астенические состояния различной картонной кислота 50 по 10 или этиологии. мг 20 шт. 5. Женьшень БАД экстракт лимонная Обладает тонизирующим и Леденцы в Доктор женьшеня кислота, общеукрепляющим действием, бумажной Тайсс 45 сахар, повышает сопротивляемость обертке 1 сироп организма к негативному шт., в мальтозы, воздействию факторов пакетике вишневый окружающей среды, способствует 50 г. ароматизатоконцентрации внимания и р, вода улучшению памяти. Оказывает освежающее и тонизирующее действие. Как общеукрепляющее и тонизирующее средство. 6. Женьшень БАД сухого лактоза, В качестве общетонизирующего, Капсулы Форте экстракта целлюлоза стимулирующего и адаптогенного Плюс корня микрокрист средства, как дополнительный женьшеня аллическая, источник гинзенозидов и витамина 50 мг, стеарат С. Показан для профилактики и в сухого магния составе комплексной терапии: при экстракта профилактике и для повышения плодов общей сопротивляемости шиповник организма к сезонным а 60 мг инфекционным заболеваниям (грипп, ОРЗ, простуды); для нормализации иммунитета; для повышения умственной и физической работоспособности и концентрации внимания; при длительных и/или повышенных физических и психических нагрузках, переутомлении, депрессии; для повышения сопротивляемости организма к стрессовым ситуациям и неблагоприятным воздействиям внешней среды (высокие и низкие температуры, различные агрессивные виды облучения, радиоактивное излучение); в период выздоровления после перенесенных инфекционных, тяжелых или длительных истощающих заболеваний; при астенических состояниях различной этиологии, неврастеническом синдроме; при потере аппетита, сахарном диабете второго типа, анемии, пониженном артериальном давлении, при 46 обильном ночном потоотделении; при комплексной терапии диабета и лейкозов; при ослаблении половой функции на почве неврастении: снижении эрекции у мужчин, а также либидо у женщин (в составе комплексной терапии). 7. Гинсана ЛП стандартиз коллоидная Стимулирует обмен веществ и Капсулы в ированны безводная энергии, клеточную активность, упаковке й экстракт двуокись улучшает усвоение кислорода ячейковой женьшеня кремния, тканями, усиливает физическую и контурной в G115 100 лактоза, умственную работоспособность и пачке мг в 1 лецитин, повышает неспецифическую картонной капс. соевый резистентность организма. по 10 или лецитин, Оказывает гипогликемическое 30 шт. восковая действие. смесь, Понижение физической и рапсовое умственной работоспособности, масло, усталость, нарушение способности этилванили к концентрации внимания, период н реконвалесценции. 8. Женьшеня ЛП корней – При действии настойки женьшеня Флаконы настойка женьшеня отмечено усиление процессов темного измельчен возбуждения в структурахстекла по 30 ных – 100 головного мозга и усиление мл, в г, спирта рефлекторной деятельности. коробке этилового Установлено, что препараты картонной 1 70% женьшеня повышают флакон достаточн работоспособность и уменьшают ое утомление при физических и количеств умственных нагрузках. о до В качестве тонизирующего и получения стимулирующего средства при 1л повышенных физических и настойки умственных нагрузках, для повышения работоспособности и сопротивляемости организма к неблагоприятным воздействиям среды, в период выздоровления после перенесенных заболеваний. При астенических состояниях, при комплексной терапии нарушений половой функции на почве неврастении. улучшению Капсулы во 9. Пролит БАД экстракты крахмал Способствует 47 супер капсулы функционального состояния флаконах листьев мочевыводящей системы и по 60 шт.; в шелковоча положительно влияет на состояние пачке шечника обмена веществ у людей, курчавого; картонной 1 страдающих мочекаменной листьев флакон болезнью. почечного В качестве средства, чая; способствующего улучшению функционального состояния корней мочевыделительной системы: при женьшеня мочекаменной болезни для настоящег выведения мелких конкрементов и о (5 мг); песка; для профилактики морского воспалительных процессов в конька; мочевыводящих путях. корневищ императы цилиндрич еской; корней солодки голой 10. Вивитал БАД экстракты крахмал; Общеукрепляющее, Таблетки в тонизирующее, стабилизирующее морского лактоза; блистере 10 фон; шт.; в конька; сахароза; эмоциональный способствующее поддержанию корня кальция коробке 2 функционального состояния женьшеня карбонат; мочеполовой системы, активизации или 4 настоящег тальк; половой функции у мужчин. блистера. о; листьев желатин; В качестве биологически активной осота кальция добавки к пище — источника короткоуш фосфат; панаксозидов и флавоноидов для кового; метиленовы мужчин и женщин всех возрастных групп. листьев й синий; почечного магния чая; стеарат; листьев титана шелковоча диоксид; шечника синий курчавого блестящий; натрия бензоат Восполняющет дефицит ниацина, Таблетки в 11. Холестери БАД Холестати н Баланс восполняет дефицит хрома, блистере 10 н, Лайф нормализует липидный и шт.; в витамин формула углеводный обмен, В3, коробке 3 гипохолестеринемическое Cr, блистера. средство. концентра При гиперхолестеринемиях (в т.ч. 48 т чеснока, экстракт женьшеня сибирског о ((10:1) 25 мг) боярышни к, петрушка, звездчатка , имбирь, экстракт виноградн ых косточек 12. Диетрин БАД Экстракт натуральн зеленого ый чая, экстракт плодов померанца горького, корень женьшеня сибирског о, экстракт семян пажитника , корень солодки гладкой, корень имбиря лекарствен ного, экстракт семян орехов Колы, экстракт семян плодов Гуараны, Cr, Va наследственно обусловленных), нарушениях жирового и углеводного обмена, ожирении I– III степени, сахарном диабете типа 2 (инсулинонезависимом). Для профилактики желчнокаменной болезни (с преимущественным образованием холестериновых камней), атеросклероза, болезней сердца, рака простаты. Способствует подавлению чувства Таблетки в голода. Стимулирует сжигание упаковке 10 жира и лишних калорий. шт. Для снижения веса. 49 13. Память Форте 14. Эктиви 15. Репен БАД Lглутамин, листья готу-кола, холина битартрат, экстракт готу-кола, L-тирозин, Lметионин, экстракт гинкго билоба, РНК, ДНК, женьшень корейский, женьшень американс кий БАД Женьшень , зеленый кофе, маточное молочко, цветочная пыльца, витамин C, Е, А БАД кава-кава, белокудре нник черный, женьшень, железа глюконат, цинка глюконат, дрожжи с селеном Способствует нормализации Капсулы в периферического (капиллярного) блистере 10 кровообращения, в т.ч. мозгового. шт.; в коробке 3 блистера. Восполняет дефицит биологически Капсулы во активных веществ, витамина a, c, e, флаконах общетонизирующее. Повышает по 60 шт. физическую выносливость и или в активность, способствует быстрому восстановлению блистере 10 физических сил, нормализует шт.; в коробке 1 функцию иммунной системы. Для восполнения абсолютного или блистер. относительного недостатка витаминов и минеральных веществ, повышения общего тонуса организма, в качестве общеукрепляющего и тонизирующего средства. Устраняет чувство тревоги, Капсулы во оказывает успокаивающее, флаконах расслабляющее действие при по 60 шт. стрессовых ситуациях, бессоннице, или в повышает устойчивость к нервным блистере 10 перегрузкам. Для восполнения дефицита шт.; в витаминов и минеральных веществ, коробке 3 при тревожных состояниях и блистера. стрессе. 50 16. Болюсы Хуато 17. Мемория 18. Витамакс софора Улучшает кровоснабжение иПилюли в японская, функциональное состояниебанках по женьшень, головного мозга, что способствует80 г (в дудник восстановлению микроциркуляции комплект китайский, и улучшением метаболизма тканей любисток мозга. При лечении последствийвходит сычуаньск ишемического инсульта —дозирующа ий, восстановление зрения, речи,я ложка); в коричник подвижности, памяти, внимания. коробке 1 камфарны Для профилактики инсультов;комплект. й, дереза нормализации мозгового китайская, кровообращения; лечения офиопогон вегетососудистой дистонии и японский, дисциркуляторной энцефалопатии; горечавка при умственном переутомлении; крупнолис при травмах головы; при спазмах тная, сосудов. эводия лекарствен ная, мед, дудник даурский, активиров анный уголь Лечение нарушений памяти и Капли для ЛП зверобой вода продырявл очищенная; концентрации внимания; приема енный комплексное лечение внутрь спирт гинкго церебрального атеросклероза и этиловый гомеопатич двулопаст сопровождающих его головной еские во ной боли и головокружении. флаконахболиголов капельница пятнистый женьшень х темного арника стекла по горная 20, 50, 100 мл; в пачке картонной 1 флакон. Повышает неспецифическую В блистере ЛП маточное молочко, резистентность организма, 5 или 15 экстракт оказывает регенерирующее и капсул; в женьшеня, стимулирующее действие пачке пыльца (женьшень). Источник природных растений, белков, аминокислот углеводов,, картонной 1 масло из липидов, жирных кислот, блистер. проростко обеспечивает пластический и в энергетический обмен, пшеницы, стимулирует метаболические фосфатид процессы (маточное молочко, биоы сои, и микроэлементы, витамины, ЛП 51 19. ЭнергоТоник сафлорово е масло, Lаргинин, L-лизин, оротовая кислота, диметилам иноэтанол битартрат, витамин А, D3, Е, С, B1, B2, B6, B12, фолиевая кислота, кальция пантотена т, никотинам ид, параамино бензойная кислота, биотин, Fe, Ca, P, K, Cu, Mn, Mg. I, Se, F БАД хрома полиникот инат, орех кола, экстракт листьев овса, ягоды лимонника , корень сибирског о женьшеня, экстракт корня имбиря, женьшень корейский, зеленый чай минералы). Профилактика дефицита минеральных веществ и гиповитаминоза у взрослых, в т.ч. при стрессе, в период реконвалесценции после тяжелых заболеваний, соблюдении строгой диеты, операций, лучевой терапии; понижение способности к концентрации внимания, работоспособности (физической, умственной), состояние усталости; для повышения физических возможностей, в частности у спортсменов. Нормализует обмен веществ,Капсулы в улучшает пищеварение, обладаетблистере 10 тонизирующим, адаптогенным ишт.; в антиоксидантным действием, коробке 3 повышает жизненную энергию, выносливость, работоспособностьблистера. и иммунитет. Применяется как общетонизирующая, общеукрепляющая и адаптогенная БАД при: переутомление, снижение физической работоспособности, астенический синдром; повышенные умственные и физические нагрузки; работа в ночное время суток или вождение автомобиля на большие расстояния; артериальная гипотония; состояния после перенесенных заболеваний и оперативного лечения; при ограничительных диетах и в качестве дополнения к комплексной программе коррекции веса; профилактика простудных и 52 вирусных заболеваний; в качестве средства повышения общей сопротивляемости организма при хронических заболеваниях внутренних органов; как дополнительное средство при нарушениях половой функции у мужчин и женщин. 53 ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 1 1. В корнях женьшеня настоящего ведущей группой БАС следует считать сапонины, обусловливающие адаптогенные и тонизирующие свойства лекарственных препаратов на его основе. 2. На основе систематизированных литературных данных можно сделать вывод о том, что контроль качества корней и препаратов женьшеня в РФ и за рубежом не отвечает современным требованиям объективной стандартизации. В связи с этим существует необходимость разработки и обоснования методик анализа сырья и препаратов женьшеня. 3. Анализ ассортимента препаратов на основе корней женьшеня настоящего, представленных на современном фармацевтическом рынке РФ, показывает, что доминирующими являются препараты зарубежного производства, как правило, дорогостоящие и в связи с этим доступные не всем категориям населения. 4. Является необходимой разработка новых отечественных импортозамещающих фитопрепаратов на основе корней женьшеня настоящего. 54 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объекты исследования Объектом исследования служили корневища с корнями и надземная часть женьшеня настоящего (Panax ginseng C.A.Meyer), собранные в 2009 2014 гг. на территории Самарской области в колхозно-фермерском хозяйстве «Женьшень» (округ г. Жигулевска). В естественных условиях произрастания растение заготавливали в Северной Корее в период с 2006 по 2008 гг. Для разработки ЛП «Женьшеня настойка», «Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки» использовали образцы корневищ с корнями, заготовленные в Самарской области в период с 2011 по 2013 гг. Временем сбора корневищ с корнями женьшеня являлся период их полного созревания (начиная с первой декады августа до начала октября), индикатором при этом являлось покраснение плодов [24, 44, 64]. Выкопанные корни укладывали в коробки, выстланные увлажненным мхом и слоем легкой лесной почвы, взятой с места заготовки женьшеня. Корни измельчали на корнерезке до размеров частиц не менее 7 мм и сушили в сушильном шкафу при температуре 55-60 оС в течение 4 часов. При более низких температурах сушки возможны процессы ферментативного гидролиза гликозидов, что объясняет выбор именно данного температурного режима. Для сравнения химического состава использовали также дикорастущие корни женьшеня (место произрастания – Корея). Исследованию подвергались листья и стебли женьшеня настоящего, собранные в период плодоношения (август). Изучены лекарственные средства, субстанции из корней женьшеня, а также лекарственные препараты сравнения, в том числе: водно-спиртовые извлечения из воздушно-сухих корневищ с корнями женьшеня различной концентрации; 55 образцы настойки корневищ с корнями женьшеня, полученные по стандартной разработанной технологии; образцы опытных серий сиропа с настойкой женьшеня; образцы опытных серий таблеток с экстрактом женьшеня. Исследованы образцы препаратов женьшеня (настоек и эликсира) различных производителей: «Женьшеня настойка» ОАО «Тверская фармацевтическая фабрика» (г. Тверь), серия 121109; «Женьшеня настойка» ООО «Камелия НПП» (г. Москва), серия 081009; «Женьшеня настойка» ООО «Тульская фармацевтическая фабрика» (г. Тула), серия 051209; «Женьшеня настойка» ЗАО «Вифитех» (Московская обл, п. Оболенск), серия 040910; «Женьшеня настойка» ОАО «Ивановская фармацевтическая фабрика» (г. Иваново), серия 14.11.10; «Гинсана» (эликсир) Pharmaton SA (Швейцария), серия 12515497FG; Индивидуальные вещества, выделенные из корней и листьев женьшеня; Государственный стандартный образец (ГСО) рутин. 2.2. Методы исследования 2.2.1. Методы морфолого-анатомического исследования 2.2.1.1. Методы микроскопического исследования Микроскопический анализ проводили на образцах корней женьшеня, использованных для изучения химического состава. Для приготовления срезов сухие корни, помещали в холодную воду и выдерживали 24 часа, затем помещали в смесь 96% этилового спирта и глицерина (1:1) на 3 суток. Из размоченных корней делали поперечные срезы и готовили микропрепараты в растворе глицерина (ГФ XI, вып. 1, стр. стр. 282) [21]. В качестве просветляющей жидкости использовали глицерин. 56 Исследования срезов корней, листьев и стеблей растения осуществляли с помощью микроскопов «Motic DM-111» (Корея), «Motic DM-1802А» (Корея) и «Motic DM-39»с увеличениями × 8, × 16, × 20, × 40, × 100, × 400, × 1000 [10, 21, 30]. 2.2.1.2. Гистохимический анализ растительного сырья Для определения диагностических признаков в тканях корней растения использовали слудеющие реакции [10, 21, 30]: 1) с раствором сернокислого анилина: лигнифицированные оболочки окрашиваются в желтый цвет. Приготовление раствора сернокислого анилина: 0,2 г сернокислого анилина растворяют в смеси, состоящей из 0,4 мл уксусной кислоты и 19,4 мл 50% этилового спирта. 2) с раствором Люголя: крахмал окрашивается в синий или сине- фиолетовый цвет; белок – в желтый цвет. Приготовление раствора Люголя: 2,0 г калия растворяют при нагревании в 5 мл воды очищенной, добавляют в этот раствор 1,0 г кристаллического йода. Доводят водой объем раствора до 300 мл. 3) с суданом III: опробковевшие оболочки (суберин) окрашиваются в красный цвет. Приготовление раствора судана III: 0,01 г красителя растворяют в 5 мл этилового спирта, после чего к раствору прибавляют 5 мл глицерина. 4) с 33% водным раствором гидроксида калия: опробковевшие оболочки (суберин) окрашиваются в красный цвет. Приготовление 33% раствора гидроксида калия: 3,3 г гидроксида калия растворяют в 10 мл воды. 5) с 10% водным раствором гидроксида калия: происходит осветление микропрепарата, гистологические структуры становятся лучше различимы. Приготовление 33% раствора гидроксида калия: 1,0 г гидроксида калия растворяют в 10 мл воды. 57 2.2.2. Химические методы 2.2.2.1. Качественные реакции При исследовании химического состава различных органов женьшеня использованы качественные реакции: 1) Реакция Лафона (на тритерпеновые сапонины): Вв пробирке на 1 мл извлечения осторожно наслаивают 1 мл серной кислоты концентрированной, 1 мл 95% этанола и несколько капель 10% раствора железа сульфата (II). При нагревании тритерпеновые сапонины дают зеленое окрашивание [44]. 2) Реакция Санье К 1-2 мл извлечения в пробирке прибавляют 1 мл 5% спиртового раствора ванилина и 3-4 капли серной кислоты концентрированной. В присутствии тритерпеновых сапонинов появляется красное окрашивание. При разбавлении водой образуются хлопья синего цвета [44]. 3) Реакция с концентрированной серной кислотой К 1-2 мл в пробирке осторожно прибавляют 1 мл 70% серной кислоты. При нагревании в присутствии тритерпеновых сапонинов появляется краснобурое окрашивание [44]. 4) Реакция осаждения спиртом (на крахмал) 1 г сырья экстрагировали водой при нагревании на водяной бане, затем к аликвоте прибавляют 3 объема 95% спирта. Выпадает белый аморфный осадок полисахаридов [44]. 5) Цианидиновая реакция (проба Shinoda) К 1-2 мл концентрированную спиртового извлечения хлористоводородную по каплям кислоту, прибавляли затем порошок металлического цинка. При наличии флавоноидов развивается красное, оранжевое или малиновое окрашивание [9, 44]. 6) Цианидиновая реакция по Брианту Раствор, полученный при проведении цианидиновой реакции, разбавляли водой и прибавляли 2-3 мл октилового или бутилового спирта. 58 При наличии агликонов флавоноидов малиновая окраска переходит в верхнюю органическую фазу, а при присутствии гликозилов флавоноидов остается в водной фазе[9, 44]. 7) Реакция с алюминием хлоридом К 2-3 мл водно-спиртового извлечения из сырья прибавляют по каплям 1-2% спиртовой раствор алюминия хлорида. При наличии флавоноидов раствор приобретает желто-зеленую окраску и имеет желто-зеленую флуоресценцию при длине волны 366 нм (батохроманый сдвиг) [9, 44]. 2.2.2.2. Кислотный гидролиз 10 мг вещества нагревают с 3 мл 2% раствора хлористоводородной кислоты на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Полноту гидролизу проверяют методом ТСХ. Из охлажденной смеси отфильтровывают кристаллы агликона через взвешенный стеклянный фильтр, а в случае некристаллического агликона его извлекают хлороформом из кислотного гидролизата. Водный раствор упаривают в вакууме, затем используют для идентификации углеводов методом бумажной хроматографии (БХ) по сравнению со стандартами [20, 21, 44]. 2.2.2.3. Ферментативный гидролиз 5 мг гликозида термостатируют при в течение 24-48 часов при температуре 38 ºС с 1 мг β-глюкозидазы («Serva»). Из гидролизата агликон выпадает в осадок, его отделяют и анализируют методом ТСХ, массспектрометрии и другими методами, а в водном растворе методом БХ идентифицируют углевод [44]. 2.2.3. Хроматографические методы Для выделения и очистки индивидуальных соединений и суммы сапонинов в исследованиях использованы следующие хроматографические методы: 59 2.2.3.1. Метод колоночной хроматографии С использованием метода колоночной хроматографиии изучали химический состав водно-спиртовых извлечения из корней женьшеня. Использованы следующие сорбенты: 1) Сефадекс LH-20 (Швеция); 2) Полиамид марки «Wolem», Германия; 3) Силикагель марки L 40/100 мкм и L 100/250 мкм (Чехия). В процессе эксперимента проводили элюирование хлороформом (ТУ 2631-019-00277757-03, “Волга-реактив”), смесью хлороформ - этанол в различных соотношениях и на заключительном этапе водой очищенной. Эффективное разделение и очистка веществ достигалась путем чередования сорбентов и смесей растворителей [16, 31, 44, 45, 68]. Кроме того, метод колоночной хроматографии с использованием сорбента полиамида применялся при разработке методик количественного определения суммы сапонинов в корнях, настойке, сиропе женьшеня, а также таблеток с экстрактом женьшеня. 2.2.3.2. Тонкослойная хроматография Для тонкослойно-хроматографического анализа извлечений из корней женьшеня, субстанций, выделенных соединений и лекарственных препаратов использовали пластинки «Silufol UV 254» (ТУ 9185-005-53347293-06, Чехия) и «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» (ТУ 26-11-17-89, зернение 5-17 мкм, тип сорбента – силикагель СТХ-1А, Россия). Опробованы следующие системы растворителей: 1) хлороформ - метанол - вода, 26:14:3; 2) хлороформ - метанол - вода, 13:7:2 [112, 128]; 3) хлороформ - метанол - вода, 61:32:7 [22]; 4) хлороформ - метанол - вода, 70:30:4 [110]; 5) хлороформ - этанол - вода, 26:16:3; 6) н-бутанол - этанол - 25% аммиак, 10:4:4; 7) н-бутанол - вода - этилацетат, 4:2:1, 60 8) н-бутанол - уксусная кислота 98% - вода, 4:1:2 [44, 64, 17, 45]. Хроматографические пластинки предварительно выдерживали 1 ч в сушильном шкафу при температуре 100-105 оС. Хроматографическую камеру насыщали парами растворителей в течение 24 ч. Анализ проводили при комнатной температуре; время окончания хроматографирования фиксировали по фронту прохождения растворителя, который составлял около 9 см (в случае пластинок «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ») или 13 см (в случае пластинок «Silufol UV 254»). Обнаружение пятен проводили при комнатном освещении, УФоблучении (254 и 366 нм) до и после обработки хроматограммы 20% спиртовым раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) (H7P[ (W2O7)6] x nH20) и нагревания ее на плитке 3 мин при 100-105 оС; а также после обработки щелочным раствором диазобензолсульфокислоты (ДСК) и 3% спиртовым раствором алюминия хлорида [17, 45, 102, 129]. 2.2.3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ-анализ (ВЭЖХ) проводили на жидкостном хроматографе Biotronic; хроматографическая колонка Phenomenex Luna C18(2) (250 мм х 4,6 мм, 5 мкм), элюент А – ацетонитрил; элюент В - 0,01 М КН2РО4, подкисленный Н3РО4 до рН 3,00±0,01, расход подвижной фазы - 0,6 мл/мин, объем инжектируемой пробы 20 мкл. Режим элюирования – градиентный, двухступенчатый: элюент А 15% 19 мин; подъем до 40% за 1 мин, 30 мин 40% А. Детектируемые длины волн выбирали на основании данных спектрофотометрического анализа [16, 21]. 2.2.4. Физико-химические методы 2.2.4.1. Метод спектрофотометрии Исследовании методов спектрофотометрии проводили для качественной и количественной оценки содержания суммы сапонинов в корневищах с корнями женьшеня, субстанциях и лекарственных препаратах на его основе, а также для оценки содержания флавоноидов в надземной части растения. Для этих целей проводили прямое спектрофотометрическое определение на 61 спектрофотометре «Specord 40» (Analytik Jena) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Растворами сравнения служили вода очищенная и спирт этиловый различной концентрации (40%, 70% и 95%). Для идентификации выделенных веществ использовали также метод спектрометрии в сочтании с данными масс- и ЯМР- спектров [21]. 2.2.4.2. 1Н-ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия Физико-химические и спектральные свойства выделенных веществ изучали следующим образом: 1Н-ЯМР-спектры регистрировали на приборе «Bruker AM 300 (300 мГц); масс-спектры электронного удара регистрировали на приборе «Kratos MS-30» при энергии ионизирующих электронов 70 эВ и варьировании температуры ионного источника от 100 до 250 ºС. Температуру плавления выделенных веществ определяли на блоке Кофлера. 2.2.4.3. Определение рН рН-метрию полученных лекарственных препаратов (сиропов) проводили на приборе АНИОН 4100 – Инфраспак-Аналит. 2.2.5. Методы получения лекарственных средств Изготовление лекарственных препаратов проводили в соответствии с классическими правилами фармацевтической технологии. Готовые лекарственные формы (ГЛФ) контролировали согласно требования общих фармакопейных статей (ОФС): «Настойки» – ГФ XI, вып. 2, стр. 148-149; «Сиропы» - ГФ XI, вып. 2, стр. 150-151; «Таблетки» – ГФ XI, вып. 2, стр.154-160 [22]. Концентрацию спирта определяли по температуре кипения в соответствии с ГФ РФ ХII издания, ОФС 42-0039-07, стр. 49-52. Определение тяжелых металлов проводили в соответствии с требованиями ГФ ХI, вып. 1, стр. 171-172 [11]. Определение сухого остатка проводили по фармакопейной методике ГФ ХI, вып. 1, стр. 285-286 [11]. Испытания на микробиологическую чистоту 62 проводили согласно ГФ РФ XII издания, ОФС 42-0067-07, стр. 160-193 193 [22] и Изменениям № 3 к ГФ XI [22]. Срок годности лекарственных препаратов определяли в естественных условиях хранения, в прохладном, защищенном от света месте. 2.2.5.1. Метод мацерации Метод является традиционным для получения настоек в лабораторных условиях. В мацерационный бак помещали необходимое количество воздушно-сухих измельченных корней женьшеня и заливали пятикратным по отношению к массе сырья объемом экстрагента. Сырье настаивали в течение 7 суток при комнатной температуре, периодически перемешивая. По истечении времени сырье отжимали и измеряли объем полученного извлечения. Недостающий до соотношения 1:10 объем настойки восполняли путем промывания сырья экстрагентом и повторного его отжима [61, 78]. 2.2.5.2. Метод модифицированной мацерации Данный метод разработан на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии СамГМУ и заключается в сочетании методов дробной мацерации (в случае настоек – с делением сырья на равные части) и термической экстракции, где экстрагент делится на три равные части. Описанный способ апробирован раннее на нескольких видах сырья, содержащего фенилпропаноиды и их производные, что нашло отражение в соответствующих патентах РФ на изобретение (№2102999, №2134584, №2133620 и др.). Технологическое исследование по разработке таблеток с экстрактом женьшеня проведено на кафедре фармацевтической технологии ГБОУ ВПО СамГМУ под руководством зав. кафедрой, д. фарм. н. профессора С.В. Первушкина и к. фарм. н., старшего преподавателя Н.Н. Желонкина. Таблетки с экстрактом женьшеня получали прессованием через стадию сухого гранулирования и размола увлажненной и высушенной массы с использованием гранулятора и таблеточного пресса. В качестве 63 вспомогательных веществ использовали лактозу, микрокристаллическую целлюлозу и кальция стеарат. 2.2.5.3. Метод прессования Таблетки с экстрактом женьшеня получали прессованием массы, полученной методом сухого гранулирования и размола увлажненной и высушенной смеси. Подготовка таблетируемой смеси включала следующие стадии: смешивание сухих вспомогательных веществ, перемешивание порошка с лекарственной субстанцией – жидким экстрактом женьшеня, который являлся одновременно гранулирующей жидкостью, гранулирования путем протирания влажной массы через сито, сушка гранулята. 2.2.6. Методы исследования фармакологической активности Фармакологическое исследование выполнено на базе кафедры фармакологии имени заслуженного деятеля науки РФ профессора А.А. Лебедева ГБОУ ВПО СамГМУ под руководством зав. кафедрой, д. мед. н. профессора А.В. Дубищева и к. мед. н., доцента Д.В. Корчагиной. Оценку нейротропной активности проводили с использованием модели тиопенталового сна (гипногенная активность), методики выработки условной реакции активного избегания (УРАИ) (ноотропная активность) и теста («приподнятый крестообразный лабиринт») (ПКЛ) (анксиолитическая активность) [82]. Исследования проводили на белых беспородных крысах обоего пола массой 170-250 г, которые содержались в условиях вивария на обычном рационе. В каждом опыте были использованы по 10 животных. Введение фитопрепаратов проводили внутрижелудочно через зонд, предварительно разбавив изотоническим раствором натрия хлорида, в дозе 100 мк/кг. Для каждой дозы препаратов были взяты контрольные группы животных, получавших растворитель в эквивалентных количествах. 64 2.2.6.1. Тонизирующая активность Тонизирующую активность изучали на модели тиопенталового сна [82]. Продолжительность снотворного эффекта оценивали с момента наступления бокового положения до момента пробуждения, показателем которого считался выход животного из бокового положения. Эффект препаратов изучали при их однократном введении за 30 минут до введения анализатора. 2.2.6.2. Ноотропная активность Ноотропную активность определяли путем выработки УРАИ [82]. Препараты вводили 1 раз в сутки на протяжении 4-х дней – за день до выработки УРАИ и в последующие дни эксперимента. Выработку УРАИ вызывали в камере с электрифицированным решетчатым полом, помещая животных на расположенную в центре безопасную площадку. Сразу после третьего спуска в течении 3-х раз с интервалами 30 мин фиксировали время от момента включения тока до возвращения на животных на безопасную площадку, подвергая их постоянному электроболевому воздействию (50 Гц, 35 В, 3 с). При воспроизведении УРАИ через 24 ч и 48 ч проводили оценку запоминания негативного воздействия тока по количеству обученных животны, остающихся на площадке более 1 мин, а также по времени повторного поиска безопасной площадки при электроболевом раздражении [82]. 2.2.6.3. Анксиолитическое действие Методика теста ПКЛ основана на способности животных под действием препаратов преодолевать естественный страх перед падением с высоты и открытыми площадками [82]. Контрольные интактные животные предпочитают значительную часть времени проводить в закрытых рукавах. Анксиолитическое действие препарата оценивается по увеличению числа заходов в открытые рукава и времени нахождения в них, без учета увеличения общего числа заходов в оба рукава. Анализируемые препараты вводили 1 раз в сутки на протяжении 3-х дней: за 2 дня до опыта и в день эксперимента [82]. 65 2.2.7. Статистические методы Статистическую обработку экспериментальных данных исследований (Р=95%) проводили с помощью программ StatSoft Statistica 6.0, Microsoft Excel; вычисление граничных значений доверительного интервала среднего результата и определение ошибки единичного определения проводили по ГФ XI, вып. 1, стр. 199 [21]. Отсутствие систематической ошибки предложенных методик подтверждали опытами с добавлением РСО и гинзенозида Rg1. 66 ГЛАВА 3. АНАТОМО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЯЩЕГО 3.1. Изучение строения корневищ с корнями женьшеня Согласно ОСТ 91500.05.001.00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения», Приложение 2 «Перечень разделов фармакопейных статей и фармакопейных статей на лекарственные средства конкретных предприятий – производителей лекарственных средств», раздел X «Лекарственное растительное сырье и сборы (фасованная продукция: брикеты, пакеты, фильтр-пакеты, резано-прессованное и др.)», пункт 3.2. «Микроскопия, иллюстрированная микрофотографией или рисунком», микрофотографии диагностических признаков являются обязательным компонентов НД на ЛРС [69]. Морфологический анализ, проведенный до микроскопического исследования, показал, что изучаемое сырье соответствует описанию в НД (рис. 3). Рисунок 3 – Общий вид корня женьшеня настоящего. Обозначения: 1 – корневище; 2 – главный корень; 3 – боковые корни; 4 – придаточные корни. 67 3.1.1. Анатомо-морфологическое изучение корневища При анатомическом исследовании установлено, что корневище женьшеня на поперечном срезе имеет округлую форму. Корневище состоит из тканей центрального цилиндра и первичной коры, с поверхности которой находится перидерма (пробка) (рис. 4). Рисунок 4 – Поперечный срез корневища женьшеня (× 40; окраска – раствор Люголя 3% и раствор сернокислого анилина 5%). Обозначения: 1 – пробка; 2 – феллоген; 3 – феллодерма; 4 – паренхима первичной коры; 5 – флоэма (луб); 6 – зона залегания камбия; 7 – сердцевинные лучи паренхимы; 8 – ксилема (сосуды древесины); 9 – перициклическая зона; 10 – вместилища схизогенного происхождения; 11 – идиобласты с друзами в основной паренхиме коры. На поперечном срезе корневища диаметром 1,0 см установлено, что пробка залегает по всей окружности корневища и состоит из 6-7 рядов светло-бурых мертвых утолщенных равномерно и слабо лигнифицированных тонкостенных клеток (рис. 4, 5). При микроскопировании с поверхности видно, что клетки пробки плотно прилегают друг к другу и имеют 4-6 угольную слегка сглаженную форму (рис. 6). 68 Рисунок 5 – Поперечный срез Рисунок 6 – Пробка корневища корневища женьшеня: фрагмент (400). женьшеня: вид сверху (100). Обозначения: 1 – клетки пробки; 2 – феллоген; 3 – клетки феллодермы. Под феллогеном, формирующим пробку и состоящим из одного слоя уплощенных живых клеток, заметна феллодерма, состоящая из нескольких (3-4-х) слоев живых, паренхимных округлых клеток (рис. 5). Основная паренхима первичной коры неоднородна: от периферии к центру корня клетки её располагаются всё более рыхло. Клетки основной паренхимы со слегка утолщенными оболочками, крупные, округлый или овальный, заполнены крахмалом. Крахмальные зерна мелкие, простые, округлые (раствор Люголя 3%) (рис. 7). В толще паренхимы коры расположены вместилища схизогенного происхождения (рис. 7), вытянутые на продольном срезе (рис. 8) и содержащие капельки лимонно-желтого или красно-коричневого секрета [22, 30]. В некоторых клетках коровой паренхимы содержатся друзы оксалата кальция большого размера (рис. 9). Перициклическая зона центрального цилиндра так же, как и первичная кора, представлена основной тканью, где есть многочисленные идиобласты с друзами. 69 Рисунок 7 – Поперечный срез корневища женьшеня: фрагмент (× 400). Обозначения: 1 – клетки паренхимы коры, заполненные крахмальными зернами; 2 – полость вместилища; 3 – клетки, образующие стенки вместилища. Рисунок 8 – Продольный срез корневища Рисунок 9 – Поперечный срез корневища женьшеня: фрагмент (× 400). женьшеня: фрагмент (× 400). Обозначения: 1 – секреторный канал; Обозначение: 1 – друзы оксалата кальция. 2 – капля секрета. Определено, что проводящая система корневища непучкового типа: камбий залегает сплошным кольцом параллельно поверхности корневища. Проводящие ткани разделены широкими сердцевинными лучами основной паренхимы и упорядоченно чередуются с ними (рис. 10). Клетки основной паренхимы заполнены крахмальными зернами. На поперечном срезе видно, что сосуды древесины залегают группами, лигнифицированы (раствор сернокислого анилина 5%) (рис. 11). На продольном срезе различимы два типа сосудов – густо-спиральные и лестнично-пористые (рис. 12). 70 Флоэма состоит из относительно мелких, тонкостенных клеток. Сердцевина корневища выполнена основной тканью из тонкостенных округлых клеток, содержащих крахмал и друзы оксалата кальция. Рисунок 10 – Поперечный срез корневища женьшеня: фрагмент (× 100; окраска – 5% раствор сернокислого анилина). Обозначения: 1 – сердцевинные лучи; 2 – сосуды древесины; 3 – зона залегания камбия; 4 – флоэма. Рисунок 11 – Поперечный срез корневища Рисунок 12 – Продольный срез женьшеня: фрагмент (× 400; окраска – раствор корневища женьшеня: фрагмент (× 400). сернокислого анилина 5%). Обозначение: 1 – сосуды древесины. Обозначение: 1 – проводящие элементы древесины с одревесневшими стенками. 71 3.1.2. Изучение анатомо-морфологического строения главного корня Анализ поперечного среза главного корня показал, что на поперечном срезе хорошо различимы два блока, соизмеримые по размеру – древесина и вторичная кора (рис. 13 и 14). Рисунок 13 – Поперечный срез главного Рисунок 14 – Поперечный срез главного корня женьшеня (× 40): микропрепарат корня женьшеня (× 40; окраска – 3% осветлен 10% раствором натрия гидроксида. раствор Люголя). Обозначения: 1 – пробка; 2 – вместилище Обозначения: 1 – пробка; 2 – вместилище; схизогенного характера; 3 – клетки 3 – клетки паренхима, содержащая паренхимы, содержащие друзы оксалата крахмал; 4 – камбий. кальция; 4 – сердцевинный луч; выстилающие клетки канала; 5 – вторичная кора; 6 – камбиальная зона; 7 – паренхима, содержащая пигмент. В центре корня есть нечетко диагностируемые остатки первичной ксилемы в виде двух лучей. К периферии от первичной ксилемы отходят крупноклеточные первичные радиальные лучи паренхимной ткани. Между ними, по обе стороны от первичной ксилемы, находится вторичная ксилема, пересеченная многочисленными вторичными радиальными лучами основной паренхимы (рис. 15А и 15В). Флоэма и ксилема разделены камбиальной зоной, которая проходит примерно через середину радиуса корня и иногда не просматривается (рис. 16Г). 72 Основная масса ксилемы состоит из тонкостенных паренхимных клеток, содержащих крахмальные зерна. Сосуды четкими радиальными прерывистыми лучами отходят от центра и видны как вкрапления в толщу крахмалоносной паренхимы. Сосуды имеют утолщенные одревесневшие стенки (реакция с раствором сернокислого анилина) и расположены поодиночке или собраны по три-шесть в группы (рис. 15Б). В паренхиме древесины изредка встречаются клетки, содержащие желтые пигменты (рис. 16В). Рисунок 15 – Поперечный срез главного корня женьшеня (А-В –5% раствор сернокислого анилина; Г – раствор 3% Люголя): А – лучи ксилемы (× 40); Б – сосуды ксилемы (× 400); В – ксилема (× 100); Г – фрагмент паренхимы сердцевинных лучей (× 400). Обозначения: 1 – клетки вторичной ксилемы; 2 – друзы оксалата кальция; 3 – первичная ксилема; 4 – первичный луч; 5 – вторичный луч; 6 – крахмальные зерна. Флоэма состоит главным образом из мелкоклеточных элементов. Паренхима луба неоднородна: в ней находятся хорошо заметные схизогенные вместилища, содержащие капельки секрета от светло-желтого до красно-коричневого цвета (рис. 16Б). Паренхима луба также богата 73 крахмалом (рис. 14). Крахмальные зерна мелкие, округлые, простые. В отдельных клетках паренхимы содержатся друзы оксалата кальция (рис. 15Г). Проводящие элементы флоэмы не диагностируются. Наружная часть вторичной коры граничит с зоной из нескольких (4-6) рядов крупных тангентально вытянутых паренхимных клеток феллодермы, возникших вследствие деления клеток феллогена. Клетки феллодермы со слегка утолщенными оболочками, округлые или овальные. Корень покрыт перидермой. Клетки пробки живые (отчетливо просматриваются ядра), светло бурые тонкостенные и лигнифицированные (раствор сернокислого анилина), а не опробковевшие (отсутствие реакции с раствором судана III и 33% раствором натрия гидроксида) (рис. 16А). Микроскопия поперечных срезов боковых корней показала, что их анатомическое строение принципиально не отличается от анатомии главного корня и практически его повторяет. 74 Рисунок 16 – Поперечный срез главного корня женьшеня (× 400): А – клетки пробки ( окраска – 5% раствор сернокислого анилина); Б – секреторный канал (10% раствор натрия гидроксида); В – фрагмент паренхимы древесины; Г – зона залегания камбия. Обозначения: 1 – клетки пробки с частично одревесневшими клетками; 3 – ядра живых клеток пробки; 2 – феллоген; 4 – феллодерма; 5 – выстилающие клетки канала; 6 – полость канала; 7 – крахмальные зерна; 8 – паренхима, содержащая пигмент; 9 – камбий. 3.1.3. Анатомо-морфологическое изучение придаточных корней В ходе настоящего исследования проведен анализ поперечного и продольного срезов придаточных корней женьшеня. Установлено, что на поперечном срезе в центре органа заметен луч сосудов первичной ксилемы – остаток диархного проводящего пучка при первичном строении. Два сектора вторичной ксилемы разделены радиальными лучами основной паренхимы (рис. 17А, 17В; рис. 18). Клетки паренхимы округлые или овальные, частично или полностью заполнены крахмальными зернами, как и клетки вторичной коры (рис. 17Г). Пробка слагается из 5-7 слоев прямоугольных, тонкостенных клеток. Клетки слабо лигнифицированы, как и клетки пробки главного корня (окраска с раствором сернокислого анилина) (рис. 17Б). 75 Рисунок 17 – Поперечный срез придаточного корня женьшеня (окраска – 3% раствор Люголя и 5% раствор сернокислого анилина): А – общий вид (× 100); Б – клетки пробки (× 400); В – сосуды ксилемы (× 400); Г – клетки паренхимы коры, заполненные крахмалом (× 400). Обозначения: 1 – клетки пробки; 2 – крахмальные зерна; 3 – полость вместилища; 4 – паренхима первичной коры; 5 – вторичная кора; 6 – сосуды вторичной ксилемы; 7 – сердцевинный луч; 8 – сосуды первичной ксилемы. Рисунок 18 – Продольный срез придаточного корня женьшеня: фрагмент (× 100; окраска – 3% раствор Люголя и 5% раствор сернокислого анилина). Обозначения: 1 – пробка; 2 – клетки паренхимы, заполненные крахмалом; 3 – сосуды древесины. 76 3.1.4. Анатомо-морфологическое исследование порошка корневищ с корнями женьшеня При рассмотрении микропрепаратов порошка под микроскопом видны обрывки эпидермиса, пробки, древесины, паренхимы [67] (рис. 19). Б А В Д Г Рисунок 19 – Фрагменты порошка сырья женьшеня (×100) (А-В – микропрепарат осветлен раствором натрия гидроксида 10%; Г - 5% раствор сернокислого анилина; Д – раствор 70% серной кислоты): А – клетки паренхимы сердцевинного луча; Б – проводящие элементы с содержимым; В – сосуды древесины; Г – клетки пробки; Д – клетки паренхимы. 3.2. Исследование строения надземной части женьшеня Для более полной идентификации и характеристики надземной части женьшеня, а также для однозначного установления ее подлинности необходимы данные анатомии и гистологии анализируемых вегетативных органов. В фитомассе травы женьшеня преобладают стебли и листья, поэтому нами изучены морфолого-анатомическое строение именно этих органов. 3.2.1. Изучение петиолярной анатомии женьшеня Перспективным методом диагностики и подтверждения подлинности растительных объектов является петиолярная анатомия – строение черешка 77 листа. По мнению специалистов, анатомическое строение основных органов растения – корня, стебля и листьев – относительно постоянны и типичны для двудольных растений, однако строение черешка листа (пятиолярная анатомия) отличается большим разнообразием диагностических признаков, а также видовой специфичностью, позволяющей проводить узкоселективный анализ [40, 43, 77, 88]. Поперечное сечение черешка листа женьшеня вписывается в овал. Контуры поперечного сечения черешка неровные, неравномерно округлые, городчатые. С адаксиальной (обращенной к стеблю) стороны имеется Vобразный вырез с округлым выступом в середине. Края выреза представлены остатками нисбегающего основания листовой пластины. Они, как правило, отвернуты к нижней стороне листа (рис. 20). Рисунок 20 – Поперечный срез черешка листа женьшеня (× 40). Обозначения: 1 – фрагмент листовой пластинки; 2 – клетка верхнего эпидермиса; 3 – выступ адаксиальной части; 4 – проводящие пучки; 5 – ксилема; 6 – флоэма; 7 – паренхима сердцевины; 8 – абаксиальная сторона черешка. Эпидермальные клетки черешка листа на основной части поперечного сечения неправильной, иногда смятой формы и имеют заметно утолщенные клеточные стенки. Исходно стенки эпидермальных клеток не окрашены. Кутикула диагностируется с поверхности по розово-коричневому окрашиванию при обработке раствором Судана III. Под эпидермисом расположена колленхима уголково-пластинчатого типа, насчитывающая до 78 3-х слоев клеток. Форма клеток колленхимы неправильная, иногда смятая (рис. 21Б). А Б Рисунок 21 – Поперечный срез черешка листа женьшеня (× 400): А – без окраски; Б – окраска раствором Судана III. Обозначения: 1 – кутикула; 2 – клетка эпидермиса; 3 – уголково-пластинчатая колленхима; 4 – клетки мезофилла; 5 – межклетник; 6 – друзы оксалата кальция. При рассмотрении поверхности листа эпидермальные клетки вытянутые, равновеликие, в длину достигают до 200 мкм, в ширину – до 25 мкм (рис. 22). По поверхности черешка изредка встречаются устьичные аппараты, окруженные четырьмя–пятью околоустьичными клетками, отличающимися от клеток основной эпидермы меньшими размерами (аномоцитный тип) (рис. 22Б). А Б Рисунок 22 – Черешок листа женьшеня, вид с поверхности (× 400): А – эпидермис (без окраски); Б – паренхима под эпидермисом (без окраски); В – эпидермис (окраска раствором Судана III). Обозначения: 1 – клетка эпидермы; 2 – устьице; 3 – содержимое протопласта клеток паренхимы; 4 – кутикула. 79 Клетки эпидермиса остатков листовой пластинки округлой формы с утолщенными оболочками (рис. 23). А Б Рисунок 23 – Поперечный срез черешка листа женьшеня. Край листовой пластинки (× 400): А – окраска раствором сернокислого анилина; Б – без окраски. Обозначения: 1 – фрагменты протопласта; 2 – кутикула; 3 – эпидермис; 4 – мезофилл листа; 5 – уголково-пластинчатая колленхима. Черешок листа голый, опушения не имеет. Он выполнен основной паренхимой, ее клетки на поперечном сечении имеют округлую изодиаметрическую форму (рис. 21). Размер клеток мезофилла варьирует от 40 до 100 мкм в диаметре. Наиболее крупные клетки составляют паренхиму сердцевины, мелкие расположены по периферии. Округлые крупные клетки паренхимы расположены хаотично, при смыкании образуют крупные межклетники треугольной формы. В паренхиме встречаются друзы оксалата кальция (рис. 21А). В паренхиме черешка расположены закрытые коллатеральные проводящие пучки. Количество пучков варьирует от степени развития листа и места поперечного сечения. В среднем в черешке обнаружено 7 пучков размером от 0,1 мм до 0,45 мм в диаметре (рис. 20). Пучки расположены по периметру. Самый крупный пучок – центральная жилка – расположен ближе к абаксиальной стороне. Строение пучков без особенностей. Сосуды ксилемы окрашиваются растворами сернокислого анилина и Судана III в 80 желтый и розовый цвет соответственно (рис. 23). Склеренхима в пучках не выражена. Со стороны флоэмы расположены вместилища с секретом изначально желтого цвета, который переходит в розовый под действием раствора Судана III (рис. 24А). А Б Рисунок 24 – Проводящий пучок черешка листа женьшеня (× 400): А – окраска раствором Судана III; Б – окраска раствором сернокислого анилина. Обозначения: 1 – основная паренхима; 2 – клетки флоэмы; 3 – сосуды ксилемы; 4 – вместилище с секретом. Строение черешка по всей его длине принципиально не отличается. Мезофилл остатков листовой пластинки также представлен клетками округлой формы. Паренхима рыхлая, с большим количеством межклетников. В клетки мезофилла диагностируются фрагменты протопласта. Края листовых пластин армированы колленхимой уголково-пластинчатого типа в один слой клеток (рис. 23). 3.2.2. Изучение строения листовой пластинки Листовая пластинка листочка сложного листа женьшеня дорзовентрального типа. При рассмотрении на поперечном сечении видно, что мезофилл слабо дифференцирован и представлен округлыми (20-30 мкм в диаметре), тонкостенными клетками с аморфным протопластом светлозеленого цвета (рис. 25В). В мезофилле изредка встречаются мелкие друзы округлой формы (15 мкм в диаметре). 81 Диагностической особенностью листовых пластинок листочков является выраженная паренхиматизация проводящих тканей, собранных в закрытые коллатеральные пучки (рис. 25А, 25Б). Поперечное сечение жилок каждого листочка характерной формы: абаксиальная сторона листовой пластинки значительно увеличена, и, как правило, округлой формы; адаксиальная сторона сильно выступает над поверхностью пластинки вдоль срединной жилки (рис. 25). Во вторичных жилках проводящие пучки слабо армированы. Необходимо отметить, что строение центральной жилки весьма схоже со строением черешка листа. Рисунок 25 – Листовая пластинка листочка женьшеня (поперечный срез): А – в основании листовой пластики (×10); Б – на верхушке листовой пластинки (×10); В – фрагмент листовой пластинки (×400). Обозначения: 1 – листовая пластинка; 2 – хлорофиллоносная паренхима; 3 – проводящие пучки; 4 – выступ в адаксиальной части; 5 – вместилище; 6 – абаксиальная сторона листовой пластинки, 7 – флоэма; 8 – ксилема; 9 – клетки эпидермы. На поперечном сечении листовой пластинки листочков как верхний, так и нижний эпидермис сложен из клеток овальной формы. С поверхности эпидермис покрыт однородным слоем тонкой кутикулы (рис. 25В). Эпидермальные клетки широкопросветные (20-30 мкм в диаметре) с целлюлозными клеточными стенками без выраженных поровых каналов. 82 При рассмотрении листовой пластинки с поверхности форма клеток верхнего и нижнего эпидермиса различается. Клетки нижнего эпидермиса волнообразно и сильноизвилистые, с продолговато-морщинистой кутикулой, достигающие в длину 100 мкм (рис. 26). Устьичные аппараты аномоцитного типа и расположены только с абаксиальной стороны (рис. 26). Замыкающие клетки устьичных аппаратов ладьевидные по форме, с заметным протопластом зеленого цвета [83]. Рисунок 26 – Эпидермис листочка женьшеня: А, Б – нижний эпидермис; В, Г – верхний эпидермис (А, В: ×100; Б, Г: ×400). Обозначения: 1 – друзы оксалата кальция; 2 – устьица; 3 – клетки нижнего эпидермиса с извилистыми стенками; 4 – клетки хлоренхимы под слоем эпидермиса; 5 - жилка листа; 6 – клетки верхнего эпидермиса; 7 – морщинистая кутикула. Стенки клеток верхнего эпидермиса слабоволнистые, в длину не более 100 мкм (рис. 26). Кутикула верхней эпидермы лучисто-морщинистая (рис. 26Г) [83]. Клетки эпидермиса над жилкой прозрачные, прозенхимные, клеточные стенки более толстые, с простыми порами. При рассмотрении эпидермиса с поверхности в мезофилле заметны друзы. 83 На V-образных выступах пильчатого края листочка имеются крупные трихомы, похожие на эмергенцы (рис. 27), по форме узкоконусовидные (длина от 300 до 450 мкм), в основании расширяющиеся, к верхушке зауженные. Верхушка эмергенца иногда обламывающаяся, представлена вытянутыми толстостенными клетками с бурым протопластом (рис. 27Б). Рисунок 27 – Край листочка листа женьшеня (А: ×5; Б: ×400). Обозначения: 1 – V-образные выступы пильчатого края листочка; 2 – эмергенец. 3.2.3. Изучение строения стебля Стебель женьшеня на поперечном срезе округлый, слаборебристый, пучкового типа строения. При рассмотрении на поперечном сечении эпидермис стебля сложен из мелких округлых клеток диаметром до 20 мкм. Клеточные стенки эпидермиса заметно утолщены, изначально имеют слабо-желтую окраску, которая усиливается при обработке раствором сернокислого анилина. Поверхность эпидермиса кутинизирована, что подтверждается реакцией с раствором Судана III, окрашивающим ее в розово-коричневый цвет (рис. 28В). 84 Рисунок 28 – Поперечный срез стебля женьшеня (×100): А – не окрашен; Б – окраска раствором сернокислого анилина; В – окраска раствором Судана III; Г – окраска раствором Люголя. Обозначения: 1 – колленхима; 2 – паренхима первичной коры; 3 – склеренхима; 4 –гантелевидный проводящий пучок; 5 – коллатеральный проводящий пучок; 6 – основная ткань сердцевины; 7 – полость середцевины стебля; 8 – смятые клетки сердцевины; 9 – друзы оксалата кальция; 10 – клетки эпидермы с кутикулой. Уголково-пластинчатая колленхима, расположенная под эпидермой, как правило, двух- или трехслойная. Полости клеток изодиаметрические, угловатые. Клеточные стенки целлюлозные, значительно утолщенные, без выраженных поровых каналов (рис. 29). Паренхима первичной коры мелкоклеточная (клетки до 35 мкм в диаметре), тонкостенная, с большим количеством межклетников. В толще паренхимы изредка встречаются локальные вместилища выделений, вероятно, лизигенного происхождения, с диаметром полостей около 30 мкм (рис. 29А). 85 Рисунок 29 – Ткани периферической части стебля женьшеня, поперечный срез (×400): А – без окраски; Б – окраска раствором сернокислого анилина; В – окраска раствором Судана III. Обозначения: 1 – ксилема; 2 – флоэма; 3 – склеренхима; 4 – паренхима первичной коры; 5 – эпидермис; 6 – лизигенное вместилище; 7 – уголково-пластинчатая колленхима; 8 – кутикулярный слой эпидермиса. Проводящие ткани стебля представлены проводящими пучками, расположенными по кругу центрального цилиндра. Все пучки значительно армированы со стороны флоэмы мощным слоем склеренхимных волокон перециклического происхождения. Кольцо склеренхимы волнообразное, непрерывное, в своем контуре повторяет контур поперечного сечения стебля (рис. 28). Клетки склеренхимы образуют над каждым пучком полукруг, сливаясь при этом в сплошное склеренхимное кольцо (рис. 28). Пучки двух видов. Одни типичные, открытые коллатеральные. Такие пучки локализованы, как правило, в ребрах (выступах) стебля. Они нередко с крупными полостями, разрывами рексигенного происхождения, как правило, в тканях ксилемы (рис. 28, 30). Флоэмная часть пучков выражена слабо и представлена мелкими (до 15 мкм в диаметре) тонкостенными клетками. Ксилема, напротив, выражена значительно. Сосудистые элементы на 86 поперечном сечении разноразмерные (в диаметре от 8 до 30 мкм), расположены радиально. Клеточные стенки ксилемы лигнифицированы, исходно они темно-бурого цвета, при обработке раствором Судана III окрашиваются в розовый цвет (рис. 30Г, 30Е). На продольных срезах диагностируются спиральные и сетчатые сосуды (рис. 31В). Другие пучки узкие, по форме гантелевидные, расположены глубже, между ребрами стебля, чередуясь с обычными пучками (рис. 28, 30). Топографически эти пучки расположены ближе к сердцевине. Гантелевидная форма, с нашей точки зрения, обусловлена особой структурой пучка, которая может быть диагностичной для данного растения. Ксилема расположена в центре пучка, суженная в середине, она как бы зеркально отражается в своих очертаниях по составу и форме в радиальном направлении. Пучок внешне формально напоминает биколлатеральный (рис. 28, 30). Флоэма расположена снаружи и в глубине, ближе к сердцевине, двумя участками. Ткани ксилемы утолщены и лигнифицированы, что гистохимические реакции (рис. 28, 30). подтверждает внешний вид и 87 Рисунок 30 – Проводящий пучок стебля женьшеня, поперечный срез (×400): А, Б – без окраски; В, Г – окраска раствором сернокислого анилина; Д, Е – окраска раствором Судана III; А, Б, Д – гантелевидные проводящие пучки; Б, В, Е – коллатеральные проводящие пучки с разрывом. Обозначения: 1 – склеренхима; 2 – флоэма; 3 – сосуды ксилемы; 4 – основная ткань сердцевины; 5 – поры, вид сверху; 6 – разрыв в проводящем пучке. Основная ткань, или выполняющая паренхима сердцевины состоит из тонкостенных округлых клеток (от 10 до 70 мкм в диаметре), более мелких между проводящими пучками и постепенно увеличивающимися к центру стебля, где находится полость (рис. 28). Клетки паренхимы расположены рыхло, при смыкании образуют крупные межклетники. На большом увеличении (х400) в клеточных стенках отчетливо видны поровые каналы 88 (рис. 30). Стенки клеток лигнифицированы, что подтверждается лимонножелтым окрашиванием при воздействии раствором сернокислого анилина (рис. 28Б, 30В, 30Г). Раствором Судана III ткани окрашиваются в розовый цвет, что говорит о липофильной природе веществ, содержащихся в клеточных стенках (рис. 28В, 30Д, 30Е). На продольных срезах клетки паренхимы вытянутые (в длину от 80 до 300 мкм), равновеликие, иногда со скошенными стенками (рис. 31А, 31Б). Рисунок 31 – Продольный срез стебля женьшеня (А, Б: ×100; В: ×400): А, В – без окраски; Б – окраска раствором сернокислого анилина. Обозначения: 1 – полость сердцевины; 2 – клетки паренхимы сердцевины; 3 – проводящие элементы ксилемы; 4 – рексигенный разрыв пучка; 5 – склеренхимные волокна; 6 – ткани ксилемы; 7 – колленхима; 8 – спиральные сосуды; 9 – сетчатые сосуды. Сердцевина стеблей небольшого диаметра (2-2,5 мм) выполнена смятыми тонкостенными клетками паренхимы (рис. 28В), в толще клеток которых встречаются друзы оксалата кальция. Паренхима сердцевины в стеблях большого диаметра (4-5 мм) часто разрывается с образованием полости (рис 28А, 28Б, 28В). 89 ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 3 1. Методом микроскопии использованием цифрового микроскопа в сравнительном плане изучено анатомическое строение отдельных частей растительного сырья – корневища, главного и придаточных корней, которые в совокупности составляют лекарственное растительное сырье «Женьшеня корневища с корнями», что позволяет рекомендовать данное название взамен наименованию «Женьшеня корни» (ГФ СССР XI издания, ФС 66). 2. Определено, что диагностическое значение могут иметь следующие признаки сырья: морфология неизмельченного сырья, особенности анатомического строения подземных органов и характер сложения их тканей, гистологические составляющие корней и корневищ: вместилища выделений, место их локализации, толщина пробкового слоя, а также форма и утолщение пробковых клеток, гистологический рисунок коры и ксилемы. 3. Выявленные диагностические признаки и иллюстрации микропрепаратов положены в основу раздела «Микроскопия» проекта ФС «Женьшеня корневища с корнями», который рекомендован для включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания (взамен ФС 66 ГФ XI издания). 4. Впервые изучено строение листа и стебля женьшеня. Выявлен комплекс диагностических признаков листьев: дорзовентральный тип листовых пластинок листочков; характерная форма поперечных сечений их жилок; выраженная паренхиматизация проводящих тканей центральной и боковых жилок; аномоцитный тип устьичных аппаратов, ладьевидная форма замыкающих клеток устьиц; наличие крупных трихом по типу эмергенцев на V-образных выступах краев листочков; особенности кутикулярного слоя верхнего и нижнего эпидермиса. Определены диагностические признаки стебля: пучковый тип; редко встречающиеся 90 лизигенные вместилища в паренхиме первичной коры; два типа пучков: открытые коллатеральные с крупной полостью рексигенного происхождения и гантелевидные пучки; наличие по периметру стебля мощного склеренхимного кольца волнообразной формы, образующего полукруг над каждым пучком. 5. Впервые изучены особенности строения черешка листа женьшеня. Полученные данные представляют большой теоретический интерес, при этом комплекс диагностических признаков в дальнейшем может быть включен раздел «Микроскопия» проекта фармакопейной статьи на траву женьшеня. 91 ГЛАВА 4. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЯЩЕГО В РФ отсутствует НД на корни женьшеня, предусматривающая количественное определение ведущей группы БАС. Поэтому целью работы являлось получение РСО и разработка на его основе методик качественного и количественного определения суммы сапонинов для включения в проект ФС. Известно, что при сборе корней, а также при подготовке молодых растений к зимовке остается значительная фитомасса вегетирующей надземной части, извлечения из которой, по данным некоторых ученых, обладает противогипоксическим, актопротекторным, термопротекторным, стресспротекторным и адаптогенным действием [11, 28, 46, 59]. Поэтому надземная часть женьшеня также интересна в качестве источника БАС, в том числе с точки зрения ресурсосберегающих технологий. В предварительных исследованиях качественного состава показано, что существенный вклад в электронный спектр поглощения из травы женьшеня вносят флавоноиды, что также подтверждается качественными реакциями на данную группу веществ. Для предварительной оценки химического состава корней и надземной части женьшеня настоящего проведены цветные качественные реакции. В результате реакций с серной кислотой и сульфатом железа (II) (реакция Лафона), ФВК, серной кислотой и ванилином (реакция Санье) [44] показано, что в корнях, листьях и, в меньшей степени, в стеблях присутствуют сапонины. При проведении реакции комплексообразования извлечений из надземной части женьшеня с раствором алюминия хлорида наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы, что свидетельствует о достаточно высоком содержании флавоноидов. Аналогичная реакция с извлечением из корней не показала видимого эффекта. 92 Для более подробного изучения химического состава женьшеня настоящего использовались такие методы анализа, как ТСХ и спектрометрия, описанные в главе 2. 4.1. Сравнительное изучение различных органов женьшеня и препаратов на его основе Методом ТСХ проведен фитохимический анализ извлечений из корней, листьев и стеблей женьшеня, полученных на 40% и 70% этиловом спирте. Выбор растворителей обусловлен тем обстоятельством, что 70% этиловый спирт является универсальным растворителем для веществ различных классов (флавоноидов, сапонинов и др.) как в форме гликозидов, так и в форме агликонов [44]. Однако согласно литературным данным [44] в корнях и траве женьшеня содержится значительное количество гинзенозидов с большим количеством сахарных остатков (например, гинзенозид а1 – 5 остатков сахаров) [34, 44, 64], что делает молекулу вещества очень полярной. Поэтому выбор 40% этилового спирта в качестве экстрагента также является оправданным. При использовании различных систем растворителей, указанных в главе 2, п. 2.2.3.2., выявлено, что диагностируемые вещества (сапонины) наиболее четко разделяются в системе растворителей хлороформ - метанол - вода в соотношении 26:14:3 (рис. 32). При этом относительно более интенсивно окрашенными являются пятна веществ в извлечениях на 70% этиловом спирте. 93 А Б Рисунок 32 – Схема ТСХ в системе хлороформ - метанол - вода (26:14:3): А - проявление 20% спиртовым раствором ФВК; Б – проявление 3% спиртовым раствором AlCl3. Обозначения: 1 – извлечение из корней женьшеня (70% этанол); 2 – извлечение из корней женьшеня (40% этанол); 3 – извлечение из надземной части женьшеня (70% этанол); 4 – извлечение из надземной части женьшеня (40% этанол). В результате спектрофотометрического анализа получены кривые поглощения в УФ и видимой области спектра извлечений из корней и надземной части женьшеня (рис. 33 и 34). Максимум поглощения водноспиртового извлечения из корней женьшеня находится при длине волны 2682 нм, извлечения из травы – при длине волны 273±2 нм и 320±3, что свидетельствует о различной химическом составе. Кривая поглощения раствора извлечения из травы обусловлена, в большей степени, флавоноидами, спектр извлечения из корней – веществами терпеноидной природы. 94 [A] 2,5 2,25 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 0 200 250 300 350 400 450 500 [nm] Рисунок 33 – Спектр поглощения водно-спиртового извлечения из корней женьшеня. Рисунок 34 – Спектр поглощения водно-спиртового извлечения из надземной части женьшеня. С учетом зарубежного опыта использования ВЭЖХ для целей стандартизации корней женьшеня, нами в сравнительном плане изучены возможности данного метода для идентификации и количественного определения БАС. Учитывая сложность компонентного состава корней женьшеня (сапонины в форме агликонов и гликозидов, продукты гидролиза и т.д.) использование метода ВЭЖХ для качественного и количественного определения ведущей группы БАС является проблематичным. Поэтому на данном этапе в плане подготовки ФС для включения в ГФ РФ XII издания мы считаем нецелесообразным. 95 Хроматографический профиль извлечения из корней женьшеня при 210 нм представлен на рисунке рис. 35. Время удерживания пика 9 (32,8 мин) совпадает с временем удерживания гинзенозида Rg1. Рисунок 35 – Хроматографический профиль водно-спиртового извлечения из корней женьшеня при 210 нм. Однако для целей стандартизации травы женьшеня, особенно с точки зрения определения подлинности и содержания флавоноидов, мы считаем целесообразным использование метода ВЭЖХ. ВЭЖХ-хроматограмма извлечения из листьев женьшеня представлена на рис. 36. Время удерживания пика 1, принадлежащего доминирующему флавоноиду, составляет 35,4 мин. Рисунок 36 – Хроматографический профиль водно-спиртового извлечения из надземной части женьшеня при 360 нм. 96 4.2. Выделение биологически корневищ с корнями активных и надземной веществ части (БАВ) из женьшеня настоящего С целью получения РСО сапонина и дальнейшего использования его в методиках качественного и количественного определения суммы БАС, а также для углубленного изучения флавоноидного состава травы женьшеня проведено выделение индивидуальеых БАВ из корней и травы женьшеня. 4.2.1. Выделение БАВ из корней женьшеня 150,0 г высушенных измельченных корней трижды экстрагировали 70% этиловым спиртом: первые две экстракции проводили при комнатной температуре в течение 24 ч, третий этап – при нагревании на водяной бане в течение 30 мин. Водно-спиртовые извлечения объединяли, упаривали сначала под вакуумом, за затем на водяной бане до минимального объема. Полученный концентрат смешивали с 50,0 г силикагеля L 40/100 мкм и высушивали. Сухой порошок (экстракт корня женьшеня + силикагель) наносили на слой силикагеля, сформированного в хлороформе (высота колонки 20 см, диаметр – 5,5 см), и элюировали последовательно хлороформом, смесью спирта и хлороформа в различных соотношениях (3:97, 5:95, 7:93, 10:90, 15:85, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40), спиртом этиловым и водой очищенной. Отсутствие примесей в получаемых фракциях веществ контролировали методом ТСХ в системах растворителей хлороформ – метанол – вода (26:14:3) и н-бутанол – уксусная кислота 98% – вода (4:1:2). Детектирование веществ проводили опрыскиванием хроматограммы 20% спиртовым раствором ФВК с последующим нагреванием на плитке при температуре 100-105°С в течение 3 минут. Фракции, обогащенные веществом 1 (№ 70-78, элюент – спиртохлороформная смесь, 50:50), растворяли в минимальном количестве воды очищенной, переносили по очереди на хроматографическую колонку (сорбент – полиамид, высота сорбента составляет 2,0 см, диаметр – 3,0 см). 97 Вещество 1 элюирования очищали водой, Кристаллизацию и рехроматографией водным спиртом путем (20%, перекристаллизацию последовательного 40%) веществ и спиртом. проводили при использовании метанола и хлороформа в соотношении ~1:4. Контроль за очисткой осуществлялся с помощью ТСХ-анализа. Схема выделения гинзенозида Rg1 представлена на рис. 37. Высушенные измельченные корни женьшеня (150 г) Экстракция 70% EtOH Экстракт корней женьшеня Жидкостная адсорбционная колоночная хроматография Колонка №1 (сорбент: силикагель; элюенты: хлороформ, смеси спиртхлороформ в различных соотношениях, спирт) Фракции веществ № 70-72 Колонка №2 (сорбент: полиамид; элюенты: вода, спирт) Кристаллизация (фракции 40% EtOH) Технический гинзенозид Rg1 Перекристаллизация (метанол, хлороформ) РСО Rg1 Рисунок 37 – Схема выделения гинзенозида Rg1 из корней женьшеня. 98 4.2.2. Выделение БАВ из листьев женьшеня 20,0 г высушенных листьев трижды экстрагировали 70% этиловым спиртом: первые две экстракции проводили при комнатной температуре в течение 24 ч, третий этап – при нагревании на водяной бане в течение 30 мин. Водно-спиртовые извлечения объединяли, упаривали сначала под вакуумом, за затем на водяной бане до минимального объема. Полученный концентрат смешивали с 7,0 г силикагеля L 40/100 мкм и высушивали. Сухой порошок (экстракт листьев женьшеня + полиамид) наносили на слой силикагеля L 40/100 мкм, сформированный в стеклянном фильтре (диаметр – 8 см, высота слоя сорбента – 4 см) и элюировали последовательно хлороформом, смесью спирта и хлороформа в различных соотношениях (10:90, 15:85, 20:80, 30:70, 40:60) и спиртом этиловым. Отсутствие примесей в получаемых фракциях веществ контролировали методом ТСХ в системах растворителей хлороформ – метанол – вода (26:14:3) и н-бутанол – уксусная кислота 98% – вода (4:1:2). Детектирование веществ проводили опрыскиванием хроматограммы 3% раствором алюминия хлорида. Фракции, обогащенные веществом 2, объединяли и смешивали с минимальным количеством полиамида до получения сухого порошка. Смесь переносили на хроматографическую колонку (сорбент – полиамид, высота сорбента – 2,0 см, диаметр – 3,0 см). Вещество I очищали рехроматографией путем последовательного элюирования водой, водным спиртом (20%, 40%, 70%) и спиртом. Кристаллизация и перекристаллизация веществ осуществлялись с помощью метанола и ацетона в соотношении ~1:4. Контроль за очисткой осуществлялся с помощью ТСХ-анализа. Кислотный гидролиз соединения 2 осуществляли 2 % HCl при 100 ºС в течение 30 мин. Осадок, полученный после охлаждения реакционной смеси, промывали водой очищенной и перекристаллизовывали из водного спирта. В результате из гликозида 2 получен агликон – соединение 3. 99 4.3. Физико-химическая характеристика выделенных соединений Для установления строения выделенных веществ получены 1Н-ЯМР(рис. 38 и 39) и масс-спектры, проведены анализы методом бумажной хроматографии путем сравнения со стандартными моносахаридами. В итоге вещество 1 идентифицировано как 3-[β-D-глюкопиранозил(1→2)β-D- глюкопиранозил]-20-[β-D-глюкопиранозил(1→6)β-D-глюкопиранозил](3β,6α,12β,20S)-3,6,12,20-тетрагидроксидаммар-24-ен (гинзенозид Rg1), вещество 2 – как 3-О-β-D-диксилозид 3,5,7,4’ – тетрагидроксифлавона (кемпферол-3-О-диксилозид), вещество 3 – 3,5,7,4’ - тетрагидроксифлавон (кемпферол) (табл. 4). Рисунок 38 – 1Н-ЯМР-спектр гинзенозида Rg1 (1) в DMSO-d6. 100 Рисунок 39 – 1Н-ЯМР-спектр 3-О-β-D-диксилозида 3,5,7,4’-тетрагидроксифлавона (2) в DMSO-d6. Таблица 4 – Физико-химические константы и спектральные характеристики соединений, выделенных из корней и травы женьшеня настоящего № в-ва 1 2 Название 3-[β-Dглюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-20-[β-Dглюкопиранозил(1→6)β-Dглюкопиранозил](3β,6α,12β,20S)-3,6,12,20тетрагидроксидаммар-24-ен (гинзенозид Rg1) С42Н72О14 3-О-диксилозид 3,5,7,41 тетрагидроксифлавона (кемпферол-3-О-диксилозид) С25Н26О16 3 3,5,7,41 тетрагидроксифлавон (кемпферол) С15Н10О6 Химическая формула Физико-химические характеристики Белое порошкообразное вещество Т. пл. 200-203 °С; Светло-желтое кристаллическое вещество состава С25Н22О16 Т. пл. 175-178 oС (водный спирт). max EtOH 269, 350 нм. Светло-желтое кристаллическое вещество состава С15Н10О6 Т. пл. 283-285 oС (водный спирт). max EtOH 267, 360 нм. 101 1. Гинзенозид Rg1: масс-спектр (m/z): (70 eV, 200 оС, m/z, %): 476 (М+ агликона); 1Н-ЯМР-спектр (300 МГц, DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 5.05 (1H, уш. т., J = 6 Гц, H-24), 4.82 (2Н, м, Н-23), 4.43 (1H, д, J= 7 Гц, H-111 глюкозы при С-20), 4.24 (1H, д, J= 7 Гц, H-11 глюкозы при С-6), 4.10 (1H, дт, J =3 и 10 Гц, H-6), 3.55 (1H, м, H-12), 3,60 (2Н, м, Н-22), 3.33 (1H, дд, м, H-3), 3.27 (1Н, м, Н-5), 2,8-3,8 (12Н, м, 12Н глюкозы), 2.17 (1H, м, H17), 1.72 (1H, т, J = 10 Гц, H-13), 1,3-1,5 (10Н, м, 2Н-1, 2Н-2, 2Н-Н-11, 2Н15, 2Н-16), 1.61 (3H, с, СH3-27), 1.55 (3H, с, СH3-26), 1.24 (6H, с, СH3-21 и СH3-28), 1.00 (3H, с, СH3-18), 0.88 (3H, с, СH3-29), 0.82 (6H, с, СH3-19 и СH3-30) (рис. 6). 2. Кемпферол-3-О-диксилозид: масс-спектр (70 eV, 200 оС, m/z, %): 286 (М+ агликона, 100 %), 153 (17), 121 (7). max EtOH 269, 350 нм; + NaOAc 274, 368 нм; + NaOAc + H3BO3 272, 355 нм; +А1С13 и +А1С13 + HCl 275, 305, 395 нм. 1Н-ЯМР-спектр (300 МГц, DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 12,68 (с, 1Н, 5-ОН), 8,07 (д, 9 Гц, 2Н, Н-21,61), 6,87 (д, 9 Гц, 2Н, Н-31,51), 6,42 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,18 (д, 2,5 Гц, Н-6), 5,66 (д, 7 Гц, Н-111 ксилозы), 4,55 (д, 7 Гц, Н-1111 ксилозы), 3.1-5.5 (м, 10Н двух молекул ксилозы) (рис. 7). 3. Кемпферол: max EtOH 267, 360 нм; + NaOAc 274, 368 нм; + NaOAc + H3BO3 272, 355 нм; +А1С13 и +А1С13 + HCl 275, 305, 395 нм. 1Н-ЯМРспектр (300 МГц, DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 12,51 (с, 1Н, 5-ОН), 8,06 (д, 9 Гц, 2Н, Н-21,61), 6,89 (д, 9 Гц, 2Н, Н-31,51), 6,50 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,21 (д, 2,5 Гц, Н-6). Спектр раствора гинзенозида Rg1 в этиловом представлен на рисунке 40. 102 1,8 D 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 200 250 300 350 нм 400 Рисунок 40 – Спектр поглощения спиртового раствора гинзенозида Rg1. Для установления гинзенозида Rg1 величины проводили удельного показателя спектроскопический поглощения анализ комплекса, полученного при взаимодействии вещества с серной кислотой 70%. Реакцию проводили по следующей методике: точную навеску вещества (в диапазоне 0,0008 - 0,0018 г) растворяли в 1 мл 96% этилового спирта, прибавляли 5 мл серной кислоты 70%, нагревали на водяной бане в течение 10 минут, охлаждали и измеряли оптическую плотность полученного окрашенного раствора в диапазоне волн 300-700 нм. Максимумы поглощения полученного комплекса имеют максимумы при 320 нм (УФ область спектра), 390 нм и 526 нм (видимая область спектра) (рис. 41). D 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 нм Рисунок 41 – Спектр комплекса гинзенозида Rg1 с 70% серной кислотой. 103 Результаты расчетов удельного показателя поглощения и график линейной зависимости представлены в таблице 5 и на рисунке 42, соответственно. Таблица 5 – Результаты расчета удельного показателя поглощения гинзенозида Rg1 Масса порошка гинзенозида Rg1, взятая для приготовления раствора 0,0008 Концентрация гинзенозида Rg1, % 0,021 А Метрологические характеристики 0,506 24,13 n=10 0,0010 0,023 0,565 24,56 X =26,04 0,0011 0,025 0,624 24,98 P=95% 0,0012 0,027 0,687 25,45 f=9 0,0013 0,029 0,781 25,89 t(P, f)=2,26 0,0014 0,031 0,809 26,11 S=1,29 0,0015 0,033 0,874 26,47 Sx=0,43 0,0016 0,035 0,950 27,14 E=0,92 0,0017 0,037 1,021 27,60 ∆ X =1,03 0,0018 0,039 1,093 28,02 y = 32,4x + 0,018 R = 0,998 D 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,020 0,025 0,030 0,035 0,040 % Рисунок 42 – График линейной зависимости оптической плотности от концентрации спиртового раствора гинзенозида Rg1. 104 Максимум поглощения при 526 нм обусловлен, на наш взгляд, именно сапониновой структурой выделенного вещества, и, следовательно, данную длину волны можно рассматривать в качестве аналитической при разработке методики количественного определения суммы сапонинов в корнях женьшеня в пересчете на гинзенозид Rg1. Такое предположение подтверждается тем, что спектр окрашенного комплекса, полученного при взаимодействии извлечения из корня женьшеня с серной кислотой, имеет аналогичный максимум при 526 нм (рис. 43). D 1,4 1 1,2 2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 350 400 450 500 550 600 650 700 нм Рисунок 43 – Спектр поглощения окрашенного комплекса нативного извлечения из корня женьшеня (1) и окрашенного комплекса гинзенозида Rg1 (2). Кемпферол-3-О-диксилозид в гликозидной хроматографической системе н-бутанол - уксусная кислота 98% - вода (4:1:2) имеет хроматографическую подвижность с Rf ~ 0,5 и проявляется в виде ярко-желтого пятна 3% раствором алюминия хлорида и в виде оранжевого пятна – раствором диазобензолсульфокислоты в насыщенном растворе натрия карбоната. УФспектр выделенного вещества имеет максимумы поглощения при 271±2 нм и 355±2 нм (рис. 44). Спектры комплексов вещества с алюминия хлоридом м натрия ацетатом, а также дифференциальный спектр представлены на рисунках 45 и 46. 105 1,4 [A] 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 230 250 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 [nm] 470 Рисунок 44 – Спектры поглощения раствора кемпферола-3-О-диксилозида. Обозначения: 1 – исходный раствор; 2 – исходный раствор после добавления алюминия хлорида; 3 – дифференциальный спектр исходного раствора на фоне комплекса с алюминия хлоридом. [A] 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 1 230 250 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 [nm] Рисунок 45 – Спектры поглощения раствора кемпферола-3-О-диксилозида. Обозначения: 1 – исходный раствор; 2 – исходный раствор после добавления ацетата натрия. 106 [A] 1,6 1,4 1,2 1 2 1 3 0,8 0,6 0,4 0,2 Рисунок046 – Спектры поглощения извлечения из надземной части женьшеня. 230 260 290 320 350 380 410 Обозначения: 1 – исходный раствор (разведение 1:50); 2 – исходный раствор после добавления комплексообразователя алюминия хлорида; 3 – раствор кемпферола-3-Одиксилозида. Таким образом, гинзенозид Rg1, 3-О-β-D-диксилозид 3,5,7,4’– тетрагидроксифлавона и кемпферол впервые выделены из женьшеня, произрастающего в Самарской области, при этом кемпферол-3-О-диксилозид является новым природным соединением растения, ранее в литературе не описанным. 440 107 ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 4 1. Из корней женьшеня настоящего выделено индивидуальное соединение, идентифицированное с помощью УФ-, 1Н-ЯМР-спектроскопии и массспектрометрии как гинзенозид Rg1. 2. По своим гинзенозид физико-химическим Rg1 является и спектральным перспективным характеристикам веществом в плане использования в качестве РСО в методиках контроля качества сырья и препаратов женьшеня. 3. Из листьев женьшеня выделены два индивидуальных вещества, которые идентифицированы методами УФ-, 1 Н-ЯМР-спектроскопии, спектрометрии, ТСХ–анализа и результатов различных масс- химических превращений (ферментативный и кислотный гидролиз) как кемпферол3-О-диксилозид и его агликон – кемпферол. 4. Кемпферол-3-О-диксилозид (3-О-β-D-диксилозид 3,5,7,4’- тетрагидроксифлавона) представляет собой новое природное соединение растения и является доминирующим флавоноидом травы женьшеня настоящего. Для него впервые получены данные 1Н-ЯМР–спектра и спектральные характеристики. 108 ГЛАВА 5. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ ЖЕНЬШЕНЯ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ЖЕНЬШЕНЯ Качественный анализ корневищ с корнями женьшеня 5.1. 5.1.1. Определение подлинности сырья методом тонкослойной хроматографии При разработке методики определения подлинности корней женьшеня методом ТСХ апробированы несколько систем растворителей, которые используются в различных Фармакопеях мира (табл. 6). Оптимальное разделение веществ достигается в системе хлороформ - метанол - вода (26:14:3) на пластинках марки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» (рис. 47). Допустимо также использование системы н-бутанол - уксусная кислота 98% вода (4:1:2). Таблица 6 – Системы растворителей, опробованные при разработке методики качественного анализа корней женьшеня (ТСХ) № Система растворителей Литературный источник 1. Хлороформ - метанол - вода, 70:30:4 Deutsches Arzneibuch [110] 2. Хлороформ - метанол -вода, 61:32:7 ГФ СССР XI издания [22] 3. Хлороформ - метанол -вода, 13:7:2 4. Хлороформ - метанол -вода, 26:14:3 Универсальные гликозидные 5. Хлороформ - спирт этиловый -вода, 26:16:3 системы растворителей [17, 6. н-бутанол - уксусная кислота 98% - вода, 4:1:2 44, 45, 64] U.S. Pharmacopeia [128], Japan Pharmacopeia [112] Целевые вещества не имеют флюоресценции при длинах волн 256 нм и 366 нм (УФ-область спектра), поэтому хроматограмму необходимо проявлять реактивом. Предложена обработка хроматограммы 20% спиртовым 109 раствором ФВК с последующим нагреванием на плитке при температуре 100105 ºС в течение 5 минут. На наш взгляд, в методике целесообразно использовать спиртовой раствор РСО гинзенозида Rg1 с величиной Rf около 0,3 (одно из доминирующих пятен). При этом на хроматограмме должны обнаруживаться не менее 6 пурпурно-красных пятен, принадлежащих гинзенозидам, с Rf от 0,10 до 0,50 (рис. 47). Рисунок 47 – Схема ТСХ водно-спиртового извлечения из корней женьшеня (система растворителей: хлороформ - метанол –вода (26:14:3), пластинка «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», реактив – 20% спиртовой раствор ФВК). Обозначения: 1 – извлечение из корней женьшеня на 70% этиловом спирте; 2 – спиртовой раствор РСО гинзенозида Rg1. 5.1.2. Определение подлинности сырья методом спектроскопии Водно-спиртовые извлечения из корней женьшеня имеют коротковолновый максимум поглощения при 268 нм, который может служить аналитическим для определения подлинности корней (рис. 48). Кроме того, аналитическими являются максимумы кривой поглощения (3202 нм, 3902 нм и 5202 нм) после проведения комплексообразования с 70% серной кислотой (см. п. 5.2. и рис. 49). реакции 110 [A] 2,5 2,25 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 0 200 250 300 350 400 450 500 [nm] Рисунок 48 –-Спектр извлечения из корней женьшеня Количественный анализ корневищ с корнями женьшеня 5.2. Спектр спиртового раствора гинзенозида Rg1 (рис. 40 – глава 4) не имеет выраженного максимума, при этом плато при 230 нм не совпадает с максимумом на кривой поглощения спиртового извлечения из корней. Поэтому нами предложено проведение цветной реакции извлечения и раствора РСО гинзенозида Rg1 с дальнейшим получением электронного спектра. В ходе эксперимента использовались различные реактивы для получения окрашенных комплексов сапонинов, а именно: реактив Санье (концентрированная серная кислота + насыщенный спиртовой раствор ванилина); концентрированная серная кислота; разведенная серная кислота в различных концентрациях (50% 60%, 70%, 80%, 90%). На наш взгляд, реакция Санье, предложенная Л.И. Глебко и др. [18] (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток, 2004 г.) неприменима при реализации методики количественного анализа по следующим причинам: сапонины женьшеня реагируют с раствором ванилина в серной кислоте при нагревании с образованием интенсивно-окрашенного пурпурного раствора, однако окрашенный комплекс выраженного максимума поглощения; нестабилен и не имеет 111 очевидна необходимость проведения контрольного опыта, однако раствор сравнения, полученный в тех же условиях с использованием 95% этилового спирта взамен извлечения из корней женьшеня, имеет аналогичные значения оптических плотностей. Кроме того, интенсивность и оттенок окраски раствора сравнения варьирует в зависимости от температуры его нагревания; концентрированная серная кислота приводит к обугливанию органической составляющей извлечения из корней женьшеня, поэтому оправдан выбор кислоты меньшей концентрации. Показано, что применение разведенной серной кислоты в концентрации 70% приводит к образованию стабильного, окрашенного в розовый цвет комплекса. Данный раствор имеет максимумы поглощения при длине волны 3202 нм, 3902 нм (пл.) и 5262 нм, при этом последний максимум обусловлен сапонинами и совпадает с максимумом поглощения гинзенозида Rg1 после проведения реакции с 70% серной кислотой (рис. 49). Для исключения вклада сопутствующих веществ предложено проводить очистку водно-спиртового извлечения на сорбенте полиамиде. [A] 1,6 1,4 1 1,2 1 2 0,8 0,6 0,4 0,2 0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 [nm] Рисунок 49 – Спектры комплекса водно-спиртового извлечения из корня женьшеня, очищенного на полиамиде, с 70% серной кислотой (1) и комплекса гинзенозида Rg1 с 70% серной кислотой (2). Для определения оптимальных условий экстракции сапонинов из корней женьшеня изучено влияние таких параметров, как концентрация экстрагента, время экстракции и время проведения реакции с 70% серной кислотой. 112 Результаты определения представлены в табл. 7 и на рис. 50. Оптимальными являются следующие величины показателей: концентрация этилового спирта – 70%, время экстракции – 90 минут, время проведения реакции с 70% серной кислотой – 10 минут. Таблица 7 – Влияние различных факторов на полноту извлечения суммы сапонинов из корней женьшеня Экстрагент Время экстракции, мин Время проведения реакции с 70% серной кислотой, мин 30% этиловый спирт 90 10 Содержание суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 и абсолютно сухое сырье, % 3,86 0,06 40% этиловый спирт 90 10 3,63 0,06 50% этиловый спирт 90 10 4,13 0,05 60% этиловый спирт 90 10 4,92 0,07 70% этиловый спирт 90 10 6,10 0,07 80% этиловый спирт 90 10 5,20 0,07 95% этиловый спирт 90 10 2,49 0,018 70% этиловый спирт 15 10 4,50 0,06 70% этиловый спирт 30 10 4,84 0,05 70% этиловый спирт 45 10 5,00 0,08 70% этиловый спирт 60 10 5,34 0,07 70% этиловый спирт 90 10 6,25 0,10 70% этиловый спирт 120 10 6,04 0,08 70% этиловый спирт 90 5 5,30 0,10 70% этиловый спирт 90 10 6,24 0,08 70% этиловый спирт 90 15 6,21 0,09 70% этиловый спирт 90 20 6,20 0,09 70% этиловый спирт 90 25 6,19 0,10 70% этиловый спирт 90 30 6,12 0,08 113 % 7,00 % 6,50 6,00 6,00 5,00 5,50 4,00 5,00 3,00 4,50 4,00 2,00 20 30 40 50 60 70 80 90 0 100 15 30 45 60 75 90 105 А Б % 6,50 6,00 5,50 5,00 0 5 10 120 t, мин Концентрация спирта, % 15 20 25 30 t, мин В Рисунок 50 – Динамика полноты извлечения суммы сапонинов из корней женьшеня в пересчете на гинзенозид Rg1 в зависимости от различных факторов: А – от концентрации этилового спирта; Б – от времени экстракции; В – от времени проведения реакции комплексообразования с 70% серной кислотой. Методика количественного определения суммы сапонинов в корнях женьшеня. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 70% спирта этилового. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до 0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр («красная полоса»). Испытуемый 114 раствор А готовят следующим образом: 5 мл полученного извлечения упаривают на водяной бане досуха в фарфоровой чашке. После охлаждения сухой остаток растворяют в 5-6 мл воды, количественно переносят на слой полиамида высотой 1-1,5 см, сформированный на стеклянном фильтре, и элюируют 10-15 мл воды. Водный элюат отбрасывают. Затем элюируют 95% спиртом в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл испытуемого раствора А вносят в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора 70% серной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут. После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 526 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% этиловый спирт. Примечание. Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО) гинзенозида Rg1. Около 0,03 г (точная навеска) гинзенозида Rg1 помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 5 мл 70% серной кислоты и нагревают в течение 10 мин на кипящей водяной бане (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм. Раствором сравнения служит 95% этиловый спирт. Примечание: приготовление раствора 70% серной кислоты. К 45 мл воды осторожно, при перемешивании, добавляют 60 мл серной кислоты концентрированной (ГФ XII, стр. 368). Содержание суммы сапонинов (Х) в пересчете на гинзенозид Rg1 и абсолютно сухое сырье в процентах вычисляют по формуле: Х = D m0 30 10 6 1 100 100 , D0 m 5 1 25 6 100 W (1) 115 где D – оптическая плотность испытуемого раствора; D0 – оптическая плотность РСО гинзенозида Rg1; m – масса сырья, г; m0 – масса РСО гинзенозида Rg1, г; W – потеря в массе при высушивании сырья в процентах. При отсутствии стандартного образца гинзенозида Rg1 целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 25: Х = D 30 10 6 100 , m 5 1 25 100 W (2) где D – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса сырья, г; 25 1% – удельный показатель поглощения ( E1см ) продукта взаимодействия гинзенозида Rg1 с раствором серной кислоты при 526 нм; W – потеря в массе при высушивании сырья в процентах. Результаты статистической обработки проведенных опытов по приведенной методике свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы сапонинов в корнях женьшеня с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,61 % (табл. 8). Таблица 8 – Метрологические характеристики методики количественного определения суммы сапонинов в корнях женьшеня f X S P, % t (P, f) ∆X E, % 10 5,91 0,1222 95 2,23 ±0,272 ±4,61 5.3. Качественный анализ надземной части женьшеня Ранее показано, что надземная часть женьшеня также интересна в качестве источника БАС. Поэтому нами разработаны методики качественного и количественного определения суммы сапонинов в траве женьшеня, а также суммы флавоноидов, которые вносят существенный вклад в электронный спектр поглощения. 5.3.1. Определение сапонинов Параметры и методика проведения ТСХ-анализа для определения подлинности травы женьшеня повторяет методику, обоснованную в п. 5.1.1.: система растворителей хлороформ - метанол - вода (26:14:3), пластинки 116 марки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», реактив для проявления – 20% спиртовой раствор ФВК, раствор сравнения – спиртовой раствор гинзенозида Rg1 (рис. 51). Рисунок 51 – Схема ТСХ водно-спиртового извлечения из травы женьшеня (система растворителей: хлороформ - метанол – вода (26:14:3), пластинка «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», реактив – 20% спиртовой раствор ФВК). Обозначения: 1 – извлечение из травы женьшеня на 70% этиловом спирте; 2 – спиртовой раствор РСО гинзенозида Rg1 5.3.1. Определение флавоноидов Для детектирования флавоноидов в траве женьшеня предложен метод ТСХ, при этом в качестве раствора сравнения целесообразно использовать раствор ГСО рутина, величина Rf которого совпадает со значением Rf кемпферол-3-О-диксилозида, выделенного из листьев женьшеня (глава 4). Подобраны оптимальные условия хроматографирования: система растворителей хлороформ - метанол - вода (26:14:3), пластинки марки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», реактив для проявления – 3% спиртовой раствор алюминия хлорида, раствор сравнения – спиртовой раствор ГСО рутина (рис. 52). 117 Рисунок 52 – Схема ТСХ водно-спиртового извлечения из травы женьшеня (система растворителей: хлороформ - метанол – вода (26:14:3), пластинка «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», реактив – 3% раствор AlCl3). Обозначения: 1 – извлечение из травы женьшеня на 70% этиловом спирте; 2 – спиртовой раствор рутина. 5.4. Количественный анализ надземной части женьшеня 5.4.1. Количественное определение суммы сапонинов За основу методики анализа суммы сапонинов в траве женьшеня взята разработанная методика определения суммы сапонинов в корнях женьшеня (п. 5.2.). Электронный спектр поглощения водно-спиртового извлечения из травы после аналогичной пробоподготовки (упаривание, растворение в спирте, фильтрование через слой полиамида, добавление реактива – серной кислоты 70%) также имеет максимум поглощения при длине волны 526 нм. Указанный максимум совпадает с таковым на кривой поглощения РСО гинзенозида Rg1. Однако наличие хлорофилла и других липофильных веществ, реагирующих с серной кислотой, приводит к завышению результатов при количественном сопутствующих определении веществ сапонинов. введена стадия Поэтому очистки для удаления водно-спиртового извлечения хлороформом. Методика количественного определения суммы сапонинов в траве женьшеня. Около 1 г (точная навеска) воздушно-сухого сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, 118 прибавляют 30 мл 70% спирта этилового. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр («красная полоса»). Содержимое колбы тщательно перемешивают (раствор А). 15 мл раствора А дважды экстрагируют порциями хлороформа по 10 мл. Получают раствор очищенного извлечения (раствор Б). 10 мл раствора Б упаривают на водяной бане досуха в фарфоровой чашке. После охлаждения сухой остаток растворяют в 5-6 мл воды очищенной, количественно переносят на слой полиамида высотой 1-1,5 см, сформированный на стеклянном фильтре, и элюируют 10-15 мл воды. Водный элюат отбрасывают. Затем элюируют 95% спиртом в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки и перемешивают (раствор В). 1 мл раствора Б вносят в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора 70% серной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут (раствор Г). Оптическую плотность раствора Г измеряют после охлаждения на спектрофотометре при длине волны 526 нм; толщина слоя кюветы – 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% спирт. Содержание суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле: Х = , где D – оптическая плотность испытуемого раствора (3) (раствор Г); D0 – оптическая плотность РСО гинзенозида Rg1; m – масса сырья, г; m0 – масса РСО гинзенозида Rg1, W - потеря в массе при высушивании сырья, %. 119 При отсутствии стандартного образца гинзенозида Rg1 используют теоретическое значение удельного показателя поглощения – 25: Х = = , (4) где D – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса сырья, г; 25 – удельный показатель поглощения ( ) продукта взаимодействия гинзенозида Rg1 с раствором серной кислоты при 526 нм; W – потеря в массе при высушивании сырья, %. Результаты статистической обработки проведенных анализов по данной методике свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы сапонинов в надземной женьшеня с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,48 % (табл. 9). Таблица 9 – Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы сапонинов в надземной части женьшеня n f X S S2 P, % t (P,f) ΔX E, % 7 6 3,10 0,0510 0,0026 95 2,45 ±0,125 ±4,48 5.4.2. Количественное определение суммы флавоноидов Кривая поглощения водно-спиртового извлечения из травы женьшеня имеет максимумы в области 273±2 нм и 320±3 нм, обусловленные, на наш взгляд, в значительной мере флавоноидами. При образовании комплекса с алюминием хлоридом наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы с образованием плато при длине волны 412 нм (аналитическая длина волны рутина) (рис. 53), что свидетельствует о наличии флавоноидов. Смещение кривой в данной области позволяет использовать ГСО рутина для оценки количественного содержания суммы флавоноидов. Разработана методика определения суммы флавоноидов в листья и стеблях женьшеня, а также суммарно в траве женьшеня в пересчете на ГСО рутин методом дифференциальной спектрофотометрии при 412 нм (рис. 53). 120 Рисунок 53 –-Спектры поглощения водно-спиртового извлечения из надземной части женьшеня (раствор А) (1) и комплекса извлечения с раствором алюминия хлорида (раствор Б) (2). Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве женьшеня. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр («красная полоса»). Испытуемый раствор А готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят раствор до метки 95% этиловым спиртом (испытуемый раствор А). В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный при тех же условиях, но без добавления алюминия хлорида (раствор сравнения А). 121 Параллельно измеряют оптическую плотность раствора ГСО рутина. Раствор ГСО готовят по следующей методике: около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и доводят 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят 95% спиртом до метки (испытуемый раствор Б рутина). В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл раствора А рутина, помещенного в мерную колбу на 25 мл, и доведенный 95% спиртом до метки (раствор сравнения Б рутина). Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 30 мин после приготовления всех растворов. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в % (Х) вычисляют по формуле: , (5) где D – оптическая плотность испытуемого раствора; D0 – оптическая плотность ГСО рутина; m – масса сырья, г; m0 – масса ГСО рутина, г; W – потеря в массе при высушивании сырья, %. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы флавоноидов в надземной женьшеня с доверительной вероятностью 95% составляет ±3,21 % (табл. 10). Таблица 10 – Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в надземной части женьшеня n f X S S2 P, % t (P,f) ΔX E, % 7 6 0,90 0,0118 0,00014 95 2,45 ±0,029 ±3,21 122 Результаты определения содержания суммы сапонинов и флавоноидов по разработанным методикам в надземной части, стеблях и листьях женьшеня представлено в таблице 11. Таблица 11 – Содержание сапонинов и флавоноидов в частях растения, % Сапонины (в пересчете на Флавоноиды (в пересчете Сырье РСО гинзенозида Rg1) на ГСО рутина) Корни 6,11±0,272 –– Листья 4,30±0,078 1,20±0,053 Стебли 1,30±0,066 0,50±0,022 Надземная часть (трава) 3,10±0,125 0,90±0,029 Группа БАС 5.5. Разработка проекта фармакопейной статьи на корневища с корнями женьшеня Разработанные методики качественного и количественного определения суммы сапонинов в корнях женьшеня включены в проект ФС на «Корневища с корнями женьшеня», принятой на рассмотрение ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения». 123 ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 5 1. Показана целесообразность проведения стандартизации корней женьшеня по ведущей группе БАС – сапонинам, в частности, по одному из доминирующих сапонинов – гинзенозиду Rg1. 2. Разработаны методики качественного анализа корней женьшеня методом ТСХ по сравнению с РСО гинзенозида Rg1; методом спектроскопии после проведения цветной реакции по характерным максимумам кривой поглощения при 3202 нм, 3902 нм и 5262 нм с использованием РСО гинзенозида Rg1. 3. Разработаны методики качественного анализа сапонинов и флавоноидов в надземной части женьшеня методом ТСХ с использованием РСО гинзенозида Rg1 и ГСО рутина, соответственно. 4. Разработана методика количественного определения суммы сапонинов в корнях женьшеня методом прямой спектрометрии после проведения цветной реакции использованием реактива 70% серной кислоты при аналитической длине волны 526 нм. Ошибка единичного определения суммы сапонинов в корнях женьшеня с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,61 %. 5. Разработана методика количественного определения суммы сапонинов в траве женьшеня методом прямой спектрометрии после очистки извлечения хлороформом и проведения цветной реакции с 70% серной кислоты при аналитической длине волны 526 нм; ошибка единичного определения суммы сапонинов в надземной женьшеня с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,48 %. 6. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием стандарта ГСО рутина при 412 нм; ошибка единичного определения суммы флавоноидов в надземной вероятностью 95% составляет ±3,21 %. женьшеня с доверительной 124 7. На основании полученных данных оформлен проект ФС «Женьшеня корневища с корнями», принятый на рассмотрение ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» с целью включения в Государственную Фармакопею РФ XII издания (приложение 8 и 9). 125 ГЛАВА 6. ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ, СТАНДАРТИЗАЦИИ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ЖЕНЬШЕНЯ И ОБОСНОВАНИЮ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ Корни женьшеня настоящего используются в качестве лекарственного растительного сырья общетонизирующего для получения действия, препаратов обладающих также адаптогенного, сопутствующим гипогликемическим, иммуномодулирующим свойствами [44, 57, 72, 92]. Сухой экстракт корня женьшеня часто является компонентом поливитаминных препаратов [57, 98]. В Самарской, Брянской областях, Приморском крае ведется обширное промышленное культивирование растения, однако среди товаров аптечного ассортимента отечественный препаратом женьшеня является только настойка корней [23, 57]. Поэтому актуальным представляется расширение ассортимента отечественных адаптогенных и тонизирующих ЛС растительного происхождения, принимая во внимание в настоящее время особую актуальность импортозамещения. Создание препаратов тесно связано с разработкой методик объективной стандартизации, унифицированных в ряду сырье – субстанция – препарат [3, 7, 32, 35, 85-87]. ЛП на основе корней женьшеня, представленные на фармацевтическом рынке РФ, не отвечают в полной мере требованиям современной фармакоэкономики. Кроме того, они имеют такие недостатки, как неоптимальная технология, низкое содержание ведущей группы БАС и др. ВС точки зрения технологии, аналитики и фармакологии особенно важным является наличие в готовой ЛФ суммы гинзенозидов в пересчете на один из доминирующих компонентов – гинзенозид Rg1. Данная группа БАС является ключевой для обсуждаемых ЛП в плане анализа. В главе 5 показана целесообразность провдения стандартизации сырья по содержанию ведущей группы БАС – сапонинам, в частности, по 126 содержанию гинзенозида Rg1 (проект ФСП «Женьшеня корневища с корнями»). Данный подход к контролю качества является актуальным также и для определения подлинности ЛП сырья женьшеня настоящего. Для приведения к единообразию методов анализа сырья и разработанных ЛП в качестве основы взяты методики анализа, описанные при разработке стандартизации корневищ с корнями женьшеня с использованием гинзенозида Rg1 (глава 5). 6.1. Разработка лекарственного препарата «Женьшеня настойка» В настоящее время в РФ существует способ получения настойки женьшеня, который осуществляется путем измельчения сырья и последующей экстракции измельченного сырья 70% этиловым спиртом в соотношении 1:10 (глава 2) [78]. Недостатком данного способа является низкий выход целевых веществ, невысокое содержание действующих веществ в готовом продукте, а также значительный расход этилового спирта. Исследования в плане совершенствования способа получения настойки в соотношении 1:5 позволяют оптимизировать затраты экстрагента для получения настойки, осуществлять более полное истощение сырья при экстракции, повысить содержание сапонинов в готовом продукте и увеличить его фармакологическую активность. 6.1.1. Способ получения настойки женьшеня Первый день. В три экстрактора емкостью 1 л помещают 150 г измельченных корней женьшеня настоящего по 50 г в каждый экстрактор. В 1-ый экстрактор заливают 450 мл 40% этилового спирта, т.е. 9 объемов по отношению к сырью, и оставляют для настаивания в течение 12 часов. Параллельно во 2-ой и 3-ий экстрактор заливают по 100 мл 40% этилового спирта, т.е. 2 объема по отношению к сырью, и оставляют для замачивания. Через 12 ч извлечение из 1-го экстрактора – около 7 объемов по отношению к сырью, т.е. 350 мл, сливают в сборник 1, переносят его во 2-ой экстрактор и оставляют для настаивания в течение 12 ч. В 1-ый экстрактор заливают свежий экстрагент – 300 мл 40% этилового спирта или 6 объемов 127 по отношению к массе сырья, и оставляют для настаивания на 12 ч. По истечении 12 ч извлечение из 2-го экстрактора – около 6 объемов по отношению к массе сырья, т.е. 300 мл, сливают в сборник 2, переносят его в 3-ий экстрактор и настаивание проводят в течение 12 часов. Второй день. По истечении 12 ч извлечение из 3-го экстрактора – 250 мл или 5 объемов по отношению к сырью, что составляет или 1/3 готового продукта – сливают в сборник 3 и переносят в емкость, в которую собирают готовый продукт. По истечении 12 ч извлечение из 1-го экстрактора, т. е. 250 мл, сливают в сборник 1, переносят во 2-ой экстрактор и оставляют для настаивания в течение 12 ч. По истечении указанного времени извлечение из 2-го экстрактора, т.е. 250 мл, сливают в сборник 2, переносят в 3-ий экстрактор и настаивают в течение 8 ч. В 1-ый экстрактор заливают свежий экстрагент – 250 мл 40% этилового спирта, и затем осуществляют термическую экстракцию при температуре 90 оС в течение 30 мин. Данное извлечение – около 250 мл – сливают в сборник 1 и переносят во 2-ой экстрактор. Затем во 2-ом экстракторе экстракцию при температуре 90 осуществляют термическую о С в течение 30 мин и полученное извлечение в количестве 250 мл сливают в сборник 2. Третий день. Из 3-го экстрактора сливают около 250 мл извлечения, что составляет 1/3 готового продукта, в сборник 3 и переливают в емкость с готовым продуктом. Извлечение из сборника 2 переносят в 3-ий экстрактор и осуществляют термическую экстракцию при температуре 90 о С в течение 30 мин. Полученное извлечение – 250 мл или 1/3 готового продукта – сливают в сборник 3 и переносят в емкость с готовым продуктом. Сливы с готовым продуктом перемешивают и отстаивают в течение двух суток при температуре не выше 8 оС. Затем настойку женьшеня фильтруют и получают 750 мл готового продукта, что соответствует соотношению "сырье – экстрагент" 1:5. Технологическая схема производства настойки представлена на рис. 54. 128 Содержание разработанной суммы сапонинов, определенное с использованием методики, представлено в табл. 12 и 13: максимальное содержание БАС наблюдается в препарате на 70% этаноле (1,17%) в соотношении 1:5, выход целевых веществ при этом составляет 96,0% от теоретического содержания в ЛРС. Сравнение традиционного и разработанного способов получения настойки женьшеня представлено в табл. 12. Таблица 12 – Содержание суммы сапонинов в настойке женьшеня (%, г) и выход целевых веществ (%) в зависимости от используемого экстрагента и соотношения № при мера 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Исходное сырье (масса, г) Корни женьшеня настоящего (150 г) Корни женьшеня настоящего (150 г) Корни женьшеня настоящего (150 г) Корни женьшеня настоящего (150 г) Корни женьшеня настоящего (150 г) Корни женьшеня настоящего (150 г) Корни женьшеня настоящего (150 г) Корни женьшеня настоящего (150 г) Содержание суммы сапонинов в сырье % г 6,10 9,15 Наименование препарата (объем) Настойка на 70 % спирте (1500 мл) прототип Настойка на 40 % спирте (750 мл) 6,10 9,15 6,10 9,15 Настойка на 50 % спирте (750 мл) 6,10 9,15 Настойка на 60 % спирте (750 мл) 6,10 9,15 6,10 Содержание суммы сапонинов в препарате % г 0,45 6,75 0,97 Выход суммы сапонинов, % 73,8 7,25 79,2 7,81 85,4 1,13 8,48 92,7 Настойка на 70 % спирте (750 мл) 1,17 8,78 96,0 9,15 Настойка на 80 % спирте (750 мл) 1,12 8,41 91,9 6,10 9,15 Настойка на 70 % спирте (900 мл) 0,98 8,78 96,0 6,10 9,15 Настойка на 70 % спирте (600 мл) 1,20 7,20 78,7 1,04 129 1-ый день 2-ой день 300 250 3-ий день 450 1 1 1 1t 50 50 350 250 50 250 2 2 50 50 2 2t 300 250 50 250 3 3 3 50 50 50 3t 250 250 750 Рисунок 54 – Технологическая схема получения настойки женьшеня. 250 130 Таблица 13 – Сравнение традиционного и нового способа получения настойки женьшеня № п/п Параметры способа Заявляемый способ Этиловый спирт (40 % – 80 %) 1. Экстрагент Этиловый спирт (70 %) 2. Выход действующих веществ, % 96,0 % 73,8 % 3. Содержание сапонинов в настойке женьшеня, % 1,17 % (пример 4) 0,45 % 4. Фармакологические свойства Таким образом, Прототип использование этилового Преимущества заявляемого способа Шире диапазон концентрации спирта Более высокий выход сапонинов (в 1,3 раза) Более высокое содержание сапонинов в целевом продукте (в 2,6 раза) Более высокая тонизирующая активность спирта в диапазоне концентраций 40-80% для получения настойки 1:5 при нагревании на третьем этапе экстракции позволяет увеличить содержание сапонинов в готовом продукте в 2,6 раз, и увеличить выход ведущей группы БАС в 1,3 раза. 6.1.2. Стандартизация лекарственного препарата «Женьшеня настойка» При разработке методик качественного и количественного анализа суммы сапонинов в настойке женьшеня за основу взято определение суммы сапонинов в корнях женьшеня (глава 5). 6.1.2.1. Качественный анализ Методика качественного анализа сапонинов в настойке женьшеня 1. На линию старта пластинки «Сорбфил – ПТСХ-АФ-А-УФ» микропипеткой 0,02 мл настойки и 0,05 мл раствора А РСО гинзенозида Rg1 в виде пятен диаметром 5 мм. Пластинку с нанесенной пробой помещают в вертикальную камеру, которую предварительно насыщают не менее 24 ч смесью растворителей: хлороформ - метанол - вода (26:14:3), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей проходит около 9 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин. Хроматограмму опрыскивают раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и нагревают на плитке 3 мин 131 при 100-105 оС. На хроматограмме обнаруживается не менее 6 пурпурнокрасных пятен с Rf от 0,1 до 0,45; при этом доминирующим является пятно на уровне пятна РСО гинзенозида Rg1 с величиной Rf около 0,4. Допускается наличие других пятен. Примечание 1: подготовка пластинок. Пластинки “Сорбфил ПТСХ-АФА-УФ” (ТУ 26-11-17-89) разрезают поперек линий накатки соответственно на 2 части 10 5 см и перед использованием активируют в сушильном шкафу при 110 ОС в течение 1 ч. Примечание 2: приготовление раствора А РСО гинзенозида Rg1 – см. Примечание 1 в "Методике количественного определения сапонинов в настойке женьшеня". 2. Спектр раствора Б (см. п. 6.1.2.2.) имеет максимум поглощения при длине волны 320±2 нм, 390±2 нм и 526±2 нм (сапонины). Раствором сравнения является спирт этиловый 96%. 6.1.2.2. Количественный анализ Методика количественного определения суммы сапонинов в настойке женьшеня. Испытуемый раствор А готовят следующим образом: 1 мл настойки упаривают на водяной бане досуха в фарфоровой чашке. После охлаждения сухой остаток растворяют в 2-3 мл воды, количественно переносят на слой полиамида высотой 1-1,5 см, сформированный на стеклянном фильтре, и элюируют 10-15 мл воды. Водный элюат отбрасывают. Затем элюируют 95% спиртом в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл испытуемого раствора А вносят в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора 70% серной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% этиловый спирт. 132 Примечание 1: приготовление раствора РСО гинзенозида Rg1. Около 0,03 г (точная навеска) гинзенозида Rg1 помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 5 мл 70% серной кислоты и нагревают в течение 10 мин на кипящей водяной бане (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм. Раствором сравнения служит 95% этиловый спирт. Примечание 2: приготовление раствора 70% серной кислоты. К 45 мл воды осторожно, при перемешивании, добавляют 60 мл серной кислоты концентрированной (ГФ XII, стр. 368). Содержание суммы сапонинов (Х) в пересчете на гинзенозид Rg1 в процентах вычисляют по формуле: Х = D m0 10 6 1 100 , D0 1 1 25 6 (6) где D – оптическая плотность испытуемого раствора; D0 – оптическая плотность РСО гинзенозида Rg1; m0 – масса РСО гинзенозида Rg1. При отсутствии стандартного образца гинзенозида Rg1 целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 25: Х = D 10 6 , 1 1 25 (7) где D – оптическая плотность испытуемого раствора; 25 – удельный 1% показатель поглощения ( E1см ) продукта взаимодействия гинзенозида Rg1 с раствором серной кислоты при 526 нм. По разработанной методике определено содержание действующих веществ в некоторых препаратах (табл. 14). суммы 133 Таблица 14 – Количественное определение суммы сапонинов в препаратах женьшеня № п/п Название лекарственного препарата Производитель 1. 2. 3. 4. Настойка женьшеня Настойка женьшеня Настойка женьшеня Гинсана (эликсир) ООО "Камелия НПП", РФ ОАО "Тверская фармфабрика", РФ ОАО "Ивановская фармфабрика", РФ Фарматон С.А., Швейцария Содержание суммы сапонинов в пересчете на гинзенозида Rg1, % 0,50 ± 0,04 0,61± 0,03 0,57± 0,03 0,42± 0,04 6.1.2.3. Числовые показатели и срок хранения Содержание спирта Как видно из табл. 12, рекомендуемый экстрагент для получения настойки женьшеня – этиловый спирт 70%. В ходе исследования показано, что при хранении препарата концентрация спирта может снижаться до 65%. Это является нижним пределом концентрации спирта. Определение производили в соответствии с ГФ РФ XII издания, часть 1, стр. 49 [20]. Испытания на микробиологическую чистоту проводились в соответствии с ГФ РФ XII издания, часть 1, с. 160, на питательных средах, соответствующих ГОСТ и ТУ. Установлено, что в 1 мл ЛП содержится менее 104 аэробных бактерий, менее 102 грибов, при отсутствии бактерий Escherichia coli, Salmonella и. Staphylococcus aureus. Тяжелые металлы Не более 0,001% в ЛП. Определение проводили в соответствии с требованиями ГФ РФ XII издания, часть 1, с. 121. Срок годности Исследование 4 серий образцов ЛП «Женьшеня настойка» в процессе хранения показало, препарат стабилен в течение трех лет (табл. 15). Показатели качества, приведенные в проекте ФС, предложенным пределам в течение исследуемого срока. Исследования в данном направлении продолжаются. соответствуют 134 Таблица 15 – Результаты анализа 4 серий ЛП «Женьшеня настойка» в процессе хранения № серии Дата анализа 011011 10.2011 051011 04.2012 10.2012 04.2013 10.2013 04.2014 10.2014 10.2011 111011 04.2012 10.2012 04.2013 10.2013 04.2014 10.2014 10.2011 151011 04.2012 10.2012 04.2013 10.2013 04.2014 10.2014 10.2011 04.2012 10.2012 04.2013 10.2013 04.2014 10.2014 Описание Прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом и горько-пряным вкусом — // — — // — — // — — // — — // — — // — Прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом и горьким пряным вкусом — // — — // — — // — — // — — // — — // — Прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом и горьким пряным вкусом — // — — // — — // — — // — — // — — // — Прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом и горьким пряным вкусом — // — — // — — // — — // — — // — — // — Показатели качества Подлинность Содержан ие суммы сапонинов не менее 0,4%, % 1,17 max = 320 ± 2 нм, 390 ± 2 нм, 526 ± 2 нм; Rf 0,1 – 0,5 Содерж ание спирта не менее 65%, % 70,0 Микробиологич. Содержание чистота тяжелых металлов не более 0,001%, % 0,0001 соответ. категории 3Б Соответствие требованиям проекта ФС соответ. — // — — // — — // — — // — — // — — // — max = 320 ± 2 нм, 390 ± 2 нм, 526 ± 2 нм; Rf 0,1 – 0,5 1,16 1,18 1,15 1,14 1,10 1,03 1,15 69,0 69,0 68,0 67,0 67,0 66,0 69,0 0,0004 0,0003 0,0002 0,0003 0,0003 0,0004 0,0004 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. — // — — // — — // — — // — — // — — // — max = 320 ± 2 нм, 390 ± 2 нм, 526 ± 2 нм; Rf 0,1 – 0,5 1,15 1,14 1,14 1,14 1,13 1,07 1,14 69,0 68,0 68,0 68,0 67,0 67,0 70,0 0,0004 0,0003 0,0002 0,0002 0,0002 0,0003 0,0004 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. — // — — // — — // — — // — — // — — // — max = 320 ± 2 нм, 390 ± 2 нм, 526 ± 2 нм; Rf 0,1 – 0,5 1,12 1,12 1,13 1,12 1,10 1,04 1,17 70,0 68,0 67,0 67,0 66,0 66,0 69,0 0,0003 0,0004 0,0004 0,0003 0,0003 0,0004 0,0004 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. — // — — // — — // — — // — — // — — // — 1,16 1,16 1,15 1,15 1,10 1,10 68,0 67,0 68,0 66,0 66,0 66,0 0,0004 0,0004 0,0002 0,0003 0,0003 0,0003 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. соответ. 135 6.2. Разработка лекарственного препарата «Женьшеня сироп» Несмотря на многообразие зарегистрированных лекарственных средств и БАДов, на фармацевтическом рынке РФ отсутствует такая ЛФ, как сироп. Кроме того, отсутствует ЛФ женьшеня для детей и пациентов, страдающих сахарным диабетом. По данным ВОЗ, количество людей, страдающих сахарным диабетом, в РФ составляет около 3 млн человек, т.е. до 2,12% населения. Поэтому улучшение качества жизни больных диабетом является важным направлением развития медицины и фармацевтической отрасли [62, 132]. Нами проведено обоснование состава, технологии и стандартизации ЛС для лечения и профилактики астенических состояний, комплексной сахароснижающей терапии и применения в педиатрической практике – сиропа женьшеня. 6.2.1. Технология сиропа женьшеня В качестве основы для получения сиропа нами использованы различные корригенты – сахароза, фруктоза и сорбит – в концентрации 60-64%. Фруктоза и сорбит имеют ряд преимуществ: сироп на их основе может применяться при лечении и профилактике астенических состояний у диабетических больных, при комплексной терапии сахарного диабета. Сорбит используют в качестве основы во многих сиропах и, как правило, указывают как неактивный ингредиент. Однако известно, что сорбит может обладать желчегонным и слабительным действием, поэтому его суточное потребление следует ограничивать до 10 г [89]. По нашим расчетам, масса сорбита в суточной дозе сиропа составляет 5,58 г. Это снимает вышеуказанное ограничение по применению сиропа, связанное с возможным побочным действием. Сироп на основе сахарозы может применяться здоровым взрослым населением, а также детьми. Для обоснования концентрации настойки, используемой в качестве лекарственной субстанции для получения сиропа, и лечебной разовой дозы, 136 учтено, что рекомендуемая лечебная доза настойки – 20 капель 2 раза в день. Проведенные расчеты показали, что необходимое количество гинзенозидов содержится в 1 чайной ложке сиропа с 10% настойки. Как показано ранее (п. 6.1.1.), оптимальным экстрагентом для получения настойки женьшеня является этиловый спирт в диапазоне концентраций 4080%. Для того, чтобы при замене растворителя избежать выпадения в осадок действующих веществ, содержащихся в настойке, необходимо вводить в сироп настойку с минимальным содержанием этилового спирта. Поэтому в качестве экстрагента при получении настойки целесообразно использовать 40% этанол. Таким образом, состав сиропа является следующим: настойки женьшеня на 40% спирте (в соотношении 1:5) 10,0 сорбита или фруктозы 55,8 воды очищенной 34,2 За основу получения сиропа с настойкой женьшеня взята классическая схема производства сиропов, содержащих спиртовые извлечения из ЛРС, термолабильные БАВ (сироп солодки, алтея, пертуссин) [78]. Технологическая схема получения сиропа женьшеня включает следующие стадии: получение настойки (экстрагирование лекарственного растительного сырья, очистка извлечения и стандартизация), приготовление вкусового сиропа (варка, фильтрование, стандартизация), смешивание промежуточных продуктов, стандартизация готового продукта (рис. 55). 137 ВР-1. Санитарная подготовка производства ВР-2.1. Измельчение и отвешивание ЛРС ВР-2. Подготовка сырья и материалов ВР-2.2. Получение рассчитанного объема экстрагента ВР-2.3. Дозировани е ВВ (корригента, воды) ТП-1.1. Эстрагирование ЛРС ТП-1. Получение настойки женьшеня ТП-1.2. Очистка извлечения ТП-1.3. Стандартизация настойки ТП-2.1. Варка вкусового сиропа ТП-2.2. Фильтрование ТП-2. Приготовление сиропа ТП-2.3. Стандартизация ТП-2.4. Введение настойки в сироп УМО-1. Фасовка, упаковка, маркировка ТП-2.5. Стандартизация сиропа женьшеня Рисунок 55 – Технологическая схема получения сиропа женьшеня 6.2.2. Стандартизация сиропа женьшеня В соответствии с требованиями OCТ 91500.05.001. «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» для стандартизации сиропов проводится оценка органолептических, физико-химических и микробиологических показателей качества (ГФ СССР XI изд., вып. 2, стр. 150) [22]. За основу методик качественного и количественного анализа суммы сапонинов в сиропе женьшеня нами взят подход, описанный в главе 5 для 138 корней и в п. 6.1.2. для настойки женьшеня. Методики адаптированы с учетом наличия в сиропе дополнительных компонентов. 6.2.2.1. Качественный анализ На рис. 56 представлено схематичное изображение хроматограммы, свидетельствующей об идентичности состава исходного сырья – корней культивируемого женьшеня, лекарственной субстанции – настойки и ацетонового извлечения из сиропа. В качестве одного из доминирующих гинзенозидов анализируемые образцы содержат гинзенозид Rg1. Методика качественного анализа сапонинов в сиропе женьшеня. 1. На линию старта пластинки «Сорбфил – ПТСХ-АФ-А-УФ» микропипеткой 0,02 мл упаренного ацетонового извлечения из сиропа и 0,05 мл раствора А РСО гинзенозида Rg1 в виде пятен диаметром 5 мм. Пластинку с нанесенной пробой помещают в вертикальную камеру, которую предварительно насыщают не менее 24 ч смесью растворителей: хлороформ метанол - вода (26:14:3), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей проходит около 9 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин. Хроматограмму опрыскивают раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и нагревают на плитке в течение 3 мин при 100-105 оС. На хроматограмме обнаруживается не менее 6 пурпурно-красных пятен с Rf от 0,10 до 0,50; при этом доминирующим является пятно на уровне пятна РСО гинзенозида Rg1 с величиной Rf около 0,3. Допускается наличие других пятен. Примечание 1: подготовка пластинок. Пластинки “Сорбфил ПТСХАФ-А-УФ” (ТУ 26-11-17-89) разрезают поперек линий накатки соответственно на 2 части 10 5 см и перед использованием активируют в сушильном шкафу при 110 ОС в течение 1 ч. Примечание 2: приготовление раствора А РСО гинзенозида Rg1 – см. Примечание 1 в "Методике количественного определения сапонинов в сиропе женьшеня". 139 2. Спектр раствора Б (см. п. 6.2.2.2.) имеет максимум поглощения при длине волны 320±2 нм, 390±2 нм и 526±2 нм (сапонины). Раствором сравнения является спирт этиловый 96%. Рисунок 56 – Хроматографический профиль извлечений и препаратов корней женьшеня (ТСХ-анализ). Обозначения: 1 – извлечение из корней женьшеня; 2 – настойка женьшеня; 3 – ацетоновое извлечение из сиропа; 4 – рабочий стандартный образец (РСО) гинзенозида Rg1. 6.2.2.2. Количественный анализ Изучение электронных спектров настойки женьшеня, очищенной суммы сапонинов (рис. 57), одного из доминирующих гинзенозидов корней женьшеня (рис. 58) показало, что комплекс сапонинов с серной кислотой 70%-ной имеет три максимума поглощения, при этом длинноволновый максимум 526 нм является общим как для гинзенозида Rg1, так и для суммы ведущей группы БАВ. Экстракция сиропа ацетоном позволяет извлекать весь комплекс БАВ женьшеня, а его очистка на сорбенте полиамиде приводит к получению нативной суммы гинзенозидов, спектр поглощения которой имеет «плато» при 526 нм после взаимодействия с 70%-ным раствором серной кислоты (рис. 58). 140 Рисунок 57 – Спектры поглощения Рисунок 58 – Спектры поглощения настойки женьшеня на 40% этиловом комплексов гинзенозида Rg1 с серной спирте (1:5) (1) и суммы сапонинов, кислотой 70% (1) и упаренного очищенного полученной путем очистки настойки на ацетонового извлечения из сиропа с серной полиамиде и взаимодействия с серной кислотой 70% (2). кислотой 70% (2). Методика количественного определения суммы сапонинов в сиропе женьшеня. Испытуемый раствор А готовят следующим образом: 10,0 г сиропа (точная навеска) экстрагируют тремя порциями ацетоном по 7-10 мл. Полученное ацетоновое извлечение упаривают на водяной бане досуха в фарфоровой чашке. После охлаждения сухой остаток растворяют в 2-3 мл воды, количественно переносят на слой полиамида высотой 1-1,5 см, сформированный на стеклянном фильтре, и элюируют 10-15 мл воды. Водный элюат отбрасывают. Затем элюируют 95% спиртом в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл испытуемого раствора А вносят в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора 70% серной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% этиловый спирт. Примечание 1: приготовление раствора РСО гинзенозида Rg1. Около 0,03 г (точная навеска) гинзенозида Rg1 помещают в мерную колбу на 25 мл 141 и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 5 мл 70% серной кислоты и нагревают в течение 10 мин на кипящей водяной бане (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм. Раствором сравнения служит 95% этиловый спирт. Примечание 2: приготовление раствора 70% серной кислоты. К 45 мл воды осторожно, при перемешивании, добавляют 60 мл серной кислоты концентрированной (ГФ XII, стр. 368) [20]. Содержание суммы сапонинов (Х) в пересчете на гинзенозид Rg1 в процентах вычисляют по формуле: Х = D m0 10 6 1 100 , D0 m 1 25 6 (8) где D – оптическая плотность испытуемого раствора; D0 – оптическая плотность РСО гинзенозида Rg1; m – масса навески сиропа, г; m0 – масса РСО гинзенозида Rg1, г. При отсутствии стандартного образца гинзенозида Rg1 целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 25: Х = D 10 6 , m 1 25 (9) где D – оптическая плотность испытуемого раствора; 25 – удельный 1% показатель поглощения ( E1см ) продукта взаимодействия гинзенозида Rg1 с раствором серной кислоты при 526 нм. Содержание суммы сапонинов в 1 г сиропе женьшеня (пересчете на гинзенозид Rg1) варьирует от 0,47±0,023 мг до 0,51±0,023 мг. При статистической обработке результатов проведенных опытов показано, что ошибка единичного определения суммы сапонинов в сиропе женьшеня с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,82%. Метрологические характеристики метода количественного определения сапонинов в сиропе женьшеня представлены в табл. 16. 142 Таблица 16 – Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы сапонинов в сиропе женьшеня n f X S P, % t (P,f) ΔX E, % 11 10 0,049 0,0011 95 2,23 ±0,0024 ±4,82% 6.2.2.3. Числовые показатели и срок хранения В соответствии с требованиями OCТ 91500.05.001. «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» для стандартизации сиропа проведена оценка органолептических свойств и определены плотность, показатель преломления, значения рН, концентрация спирта, содержание действующих веществ, микробиологическая чистота (табл. 17). Плотность Определение производили в соответствии с ГФ РФ XII издания, часть 1, стр. 38. При хранении значения данного показателя составили 1,25; 1,23 и 1,27 для сахарного, сорбитного и фруктозного сиропов женьшеня, соответственно. Показатель преломления Определение производили в соответствии с ГФ РФ XII издания, часть 1, стр. 52. При хранении значения данного показателя составили 1,4500; 1,4400 и 1,4800 для сиропов женьшеня на сахарозе, сорбите и фруктозе, соответственно. рН Определение производили в соответствии с ГФ РФ XII издания, часть 1, стр. 85. Значения рН в процессе хранения составили 5,31; 5,53 и 5,25 для сиропов женьшеня на сахарозе, сорбите и фруктозе, соответственно. Содержание спирта Данные, полученные в процессе хранения сиропа, позволяют рекомендовать содержание спирта не менее 3,0% и не более 4%. Определение производили в соответствии с ГФ РФ XII издания, часть 1, стр. 49. 143 Микробиологическую чистоту определяли согласно ГФ РФ XII издания, часть 1, стр. 160. При проведения испытания сиропов выявлено, что в 1 мл ЛП содержится менее 500 аэробных бактерий и менее 50 грибов. Испытания не выявили наличия бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Таблица 17 – Показатели качества сиропа женьшеня Показатели качества Описание Плотность (г/см3) Показатель преломления рН Содержание спирта, % Содержание суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1, % Микробиологическая чистота Сироп на сахарозе Прозрачная густоватая жидкость светложелтого цвета со слабым специфическим запахом и сладким вкусом 1,25 1,4500 5,31 Значения Сироп на сорбите Сироп на фруктозе Прозрачная Прозрачная густоватая жидкость густоватая светло-желтого жидкость светлоцвета со слабым желтого цвета со специфическим слабым запахом и сладким, специфическим слегка холодящим запахом и сладким вкусом вкусом 1,23 1,27 1,4400 1,4800 5,53 5,25 3,7 0,049 Аэробных бактерий менее 500 в 1 г; грибов менее 50 в 1 мл; отсутствие бактерий семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus Срок годности Исследование 12 серий образцов ЛП «Женьшеня сироп» при хранении в течение 1,5 лет в естественных условиях показало, что показатели качества сиропов на сорбите, сахарозе и фруктозе практически не изменились (табл. 18-20). Это позволяет сделать вывод о том, что препараты стабильны без добавления консервантов и стабилизаторов, что особенно важно при использовании в педиатрической практике. Исследования в данном направлении продолжаются. 144 Таблица 18 – Результаты анализа 4 серий ЛП «Женьшеня сироп» на сахарозе в процессе хранения № Дата серии анализа 011112 11.2012 05.2013 11.2013 05.2014 021112 11.2012 05.2013 11.2013 05.2014 031112 11.2012 05.2013 11.2013 05.2014 041112 11.2012 05.2013 11.2013 05.2014 Показатели качества Содержание Содержание Плотность, Показатель суммы спирта не менее г/см3 преломления сапонинов не 3% и не более менее 0,4%, % 4%, % Прозрачная 0,51 3,8 1,26 1,4513 max = 320 ±2 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким вкусом — // — 0,51 3,7 1,27 1,4505 — // — — // — 0,50 3,7 1,25 1,4502 — // — — // — 0,49 3,6 1,25 1,4497 — // — Прозрачная max = 320 ± 2 0,50 3,8 1,25 1,4507 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким вкусом — // — 0,49 3,8 1,26 1,4511 — // — — // — 0,48 3,7 1,25 1,4492 — // — — // — 0,48 3,7 1,25 1,4500 — // — Прозрачная max = 320 ± 2 0,51 3,7 1,26 1,4489 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким вкусом — // — 0,51 3,6 1,24 1,4495 — // — — // — 0,50 3,6 1,25 1,4502 — // — — // — 0,49 3,5 1,25 1,4590 — // — Прозрачная max = 320 ± 2 0,49 3,7 1,26 1,4506 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким вкусом — // — 0,49 3,7 1,26 1,4498 — // — — // — 0,48 3,7 1,24 1,4500 — // — — // — 0,49 3,6 1,25 1,4503 — // — Описание Подлинность рН Микробиологич. чистота Соответствие требованиям проекта ФС 5,30 соответ. категории 3Б соответ. 5,31 5,29 5,31 5,28 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ. соответ. 5,28 5,30 5,29 5,32 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ соответ. 5,31 5,31 5,32 5,30 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ соответ. 5,30 5,31 5,30 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ Таблица 19 – Результаты анализа 4 серий ЛП «Женьшеня сироп» на сорбите в процессе хранения № Дата серии анализа Описание Подлинность Прозрачная max = 320 ±2 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким, слегка холодящим вкусом 05.2013 — // — — // — 051112 11.2012 Показатели качества Содержание Содержание Плотность, Показатель суммы спирта не менее г/см3 преломления сапонинов не 3% и не более менее 0,4%, % 4%, % 0,52 3,7 1,25 1,4412 0,50 3,7 1,26 1,4405 рН Микробиологич. чистота Соответствие требованиям проекта ФС 5,52 соответ. категории 3Б соответ. 5,54 соответ. категории 3Б соответ. 145 11.2013 05.2014 061112 11.2012 05.2013 11.2013 05.2014 071112 11.2012 05.2013 11.2013 05.2014 081112 11.2012 05.2013 11.2013 05.2014 — // — — // — — // — — // — Прозрачная max = 320 ± 2 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким, слегка холодящим вкусом — // — — // — — // — — // — — // — — // — Прозрачная max = 320 ± 2 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким, слегка холодящим вкусом — // — — // — — // — — // — — // — — // — Прозрачная max = 320 ± 2 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким, слегка холодящим вкусом — // — — // — — // — — // — — // — — // — 0,50 0,51 0,50 3,7 3,6 3,8 1,25 1,25 1,26 1,4408 1,4410 5,5296 5,53 5,52 5,54 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ соответ. 0,48 0,49 0,49 0,48 3,8 3,7 3,7 3,8 1,26 1,24 1,25 1,26 5,5308 5,5303 5,5298 5,5293 5,54 5,54 5,54 5,53 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ соответ. 0,48 0,49 0,48 0,49 3,7 3,7 3,6 3,7 1,27 1,25 1,25 1,26 5,5310 5,5312 5,5300 5,5313 5,52 5,52 5,53 5,51 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ соответ. 0,48 0,48 0,50 3,6 3,6 3,5 1,24 1,25 1,25 5,5310 5,5303 5,5209 5,53 5,51 5,51 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ Таблица 20 – Результаты анализа 4 серий ЛП «Женьшеня сироп» на фруктозе в процессе хранения № Дата серии анализа 091112 11.2012 05.2013 11.2013 05.2014 101112 11.2012 05.2013 11.2013 05.2014 111112 11.2012 Показатели качества Содержание Содержание Плотность, Показатель суммы спирта не менее г/см3 преломления сапонинов не 3% и не более менее 0,4%, % 4%, % Прозрачная 0,50 3,7 1,27 1,4811 max = 320 ±2 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким вкусом — // — 0,51 3,8 1,27 1,4845 — // — — // — 0,50 3,8 1,26 1,4805 — // — — // — 0,49 3,6 1,26 1,4798 — // — Прозрачная max = 320 ± 2 0,50 3,8 1,27 1,4832 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким вкусом — // — 0,49 3,8 1,26 1,4794 — // — — // — 0,48 3,7 1,27 1,4814 — // — — // — 0,48 3,7 1,25 1,4804 — // — Прозрачная max = 320 ± 2 0,51 3,9 1,28 1,4811 Описание Подлинность рН Микробиологич. чистота Соответствие требованиям проекта ФС 5,25 соответ. категории 3Б соответ. 5,25 5,26 5,25 5,24 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ соответ. 5,24 5,23 5,23 5,25 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ соответ. 146 05.2013 11.2013 05.2014 121112 11.2012 05.2013 11.2013 05.2014 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким вкусом — // — — // — — // — — // — — // — — // — Прозрачная max = 320 ± 2 густоватая нм, жидкость 390 ± 2 нм, 526 светло-желтого ± 2 нм; цвета со слабым Rf 0,1 – 0,5 специфическим запахом и сладким вкусом — // — — // — — // — — // — — // — — // — 0,51 0,50 0,49 0,49 0,49 0,48 0,49 3,9 3,7 3,8 3,7 3,6 3,6 3,6 1,27 1,27 1,27 1,26 1,4786 1,4770 1,4779 1,4815 5,24 4,24 5,25 5,26 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ соответ. 1,27 1,26 1,27 1,4823 1,4821 1,4807 5,25 5,24 5,25 соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. категории 3Б соответ. соответ. соответ 6.3. Разработка лекарственного препарата «Женьшеня таблетки» Проведено обоснование состава, технологии и стандартизации лекарственного препарата «Женьшеня таблетки». Таблетки просты и удобны в применении, позволяют лекарственным веществам длительно воздействовать на организм в связи с постепенным высвобождением [78]. 6.3.1. Технология таблеток женьшеня В качестве основы для получения таблеток женьшеня использованы такие вспомогательные вещества (ВВ), как лактоза и МКЦ в соотношении 2:3. Лекарственным ингредиентом являлся экстракт женьшеня жидкий, полученный методом перколяции на 70% этиловом спирте в соотношении 1:1. Рекомендуемая дозировка настойки женьшеня 1:10 составляет 20 капель 2 раза в день. Содержание суммы сапонинов в жидком экстракте 1:1 составляет 40 мг/мл (что соответствует 4%), поэтому количество экстракта, вводимого в 1 таблетку, составляет приблизительно 5 капель. При этом сохраняется кратность приема – по 1 таблетке 2 раза в день (табл. 21). 147 Таблица 21 – Состав ЛП «Женьшеня таблетки» (в расчете на одну таблетку) № 1. 2. 3. 4. Компонент Лактоза МКЦ Женьшеня экстракт жидкий (70% этанол, 1:1) Стеарат кальция Количество 0,0950 г 0,1430 г 5 капель (по стандартному каплемеру), что соответствует сухому остатку массой 0,0095 г 0,0025 г За основу получения таблеток взята классическая схема производства таблеток [8, 61, 78]. Технологическая схема получения таблеток женьшеня включает следующие стадии: получение экстракта; взвешивание, измельчение и просеивание ВВ; добавление к смеси ВВ рассчитанного количества экстракта, сушка полученной таблеточной смеси, измельчения, опудривание стеаратом кальция (1% от смеси) и прессование на КТМ (рис. 59). 148 ВР-1. Санитарная подготовка производства ВР-2.1. Измельчение и отвешивание ЛРС ВР-2.2. Получение рассчитанного объема экстрагента ВР-2. Подготовка сырья и материалов ВР-2.3. Дозирование ВВ (лактоза, МКЦ, стеарат кальция) ВР-2.4. Измельчение ВВ ВР-2.5. Просеивание ВВ ТП-1.1. Экстрагирование ЛРС ТП-1. Получение жидкого экстракта женьшеня ТП-1.2. Очистка извлечения ТП-1.3. Стандартизация экстракта ТП-2.1. Смешивание лактозы с МКЦ и с жидким экстрактом ТП-2. Получение таблеток ТП-2.2. Подсушивание таблеточной массы ТП-2.3. Опудривание таблеточной массы стеаратом кальция ТП-2.4. Прессование таблеток УМО-1. Фасовка, упаковка, маркировка ТП-2.5. Стандартизация таблеток Рисунок 59 – Технологическая схема получения таблеток женьшеня 6.3.2. Стандартизация таблеток женьшеня Для стандартизации таблеток проведена оценка качественного и количественного содержания действующих веществ и физико-химических показателей качества. 149 По аналогии с разработанными методиками определения суммы сапонинов в корнях женьшеня и настойке женьшеня (глава 5), апробированы и метрологически аттестованы методики качественного и количественного определения суммы сапонинов в таблетках женьшеня. Данные методики адаптированы путем введения пробоподготовки в связи с наличием ВВ. 6.3.2.1. Качественный анализ 1. На линию старта пластинки «Сорбфил – ПТСХ-АФ-А-УФ» микропипеткой 0,02 мл объединенный водный упаренного экстракта из таблеток (см. «Методика количественного определения суммы сапонинов в таблетках женьшеня») и 0,05 мл раствора А РСО гинзенозида Rg1 в виде пятен диаметром 5 мм. После нанесения пробы пластинку помещают в вертикальную камеру, предварительно насыщенную в течение не менее 24 ч смесью растворителей: хлороформ - метанол - вода (26:14:3). Затем хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей проходит около 9 см, пластинку вынимают из камеры и сушат на воздухе 5 мин. Хроматограмму опрыскивают раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и нагревают на плитке в течение 3 мин при 100-105 оС. На хроматограмме обнаруживается не менее 6 пурпурно-красных пятен с Rf от 0,10 до 0,50; при этом доминирующим является пятно на уровне пятна РСО гинзенозида Rg1 с величиной Rf около 0,3. Допускается наличие других пятен. Примечание 1: подготовка пластинок. Пластинки “Сорбфил ПТСХАФ-А-УФ” (ТУ 26-11-17-89) разрезают поперек линий накатки соответственно на 2 части 10 5 см и перед использованием активируют в сушильном шкафу при 110 ОС в течение 1 ч. Примечание 2: приготовление раствора А РСО гинзенозида Rg1 – см. Примечание 1 в "Методике количественного определения сапонинов в таблетках женьшеня". 150 2. Спектр раствора Б (см. п. 6.3.2.2.) имеет максимум поглощения при длине волны 320±2 нм, 390±2 нм и 526±2 нм (сапонины). Раствором сравнения является спирт этиловый 96%. 6.3.2.2. Количественный анализ Методика количественного определения суммы сапонинов в таблетках женьшеня. 10 таблеток растирают до получения однородного порошка. Около 0,75 г порошка таблеток (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 30 мл, прибавляют 7-8 мл воды очищенной. Колбу закрывают пробкой и полученную взвесь интенсивно встряхивают в течение 2-3 мин. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость сливают в выпарительную чашку. Процедуру повторяют трижды. Объединенный водный экстракт упаривают на водяной бане в выпарительной чашке до 5-6 мл. Испытуемый раствор А готовят следующим образом: полученный раствор количественно переносят на слой полиамида высотой 1-1,5 см, сформированный на стеклянном фильтре, и элюируют 10-15 мл воды. Водный элюат отбрасывают. Затем элюируют 95% спиртом в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл испытуемого раствора А вносят в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора 70% серной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 526 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% этиловый спирт (рис. 60, 61). Примечание. Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО) гинзенозида Rg1. Около 0,03 г (точная навеска) гинзенозида Rg1 помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 5 мл 70% серной кислоты и нагревают в течение 10 мин на кипящей водяной бане (раствор Б). После охлаждения измеряют 151 оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм. Раствором сравнения служит 95% этиловый спирт. Примечание: приготовление раствора 70% серной кислоты. К 45 мл воды осторожно, при перемешивании, добавляют 60 мл серной кислоты концентрированной (ГФ XII, стр. 368). Содержание суммы сапонинов (Х) в пересчете на гинзенозид в граммах на 1 таблетку вычисляют по формуле: Х = D m0 10 6 1 mcр D0 m 1 25 6 , (10) где D – оптическая плотность испытуемого раствора; D0 – оптическая плотность РСО гинзенозида Rg1; m – масса навески, взятая на анализ г; m0 – масса РСО гинзенозида Rg1, г; mср – средняя масса таблеток, г. При отсутствии стандартного образца гинзенозида Rg1 целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 25: Х = D 10 6 mср m 1 25 100 , (11) где D – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса навески, 1% взятая на анализ, г; 25 – удельный показатель поглощения ( E1см ) продукта взаимодействия гинзенозида Rg1 с раствором серной кислоты при 526 нм; mср – средняя масса таблеток, г. Рисунок 60 –-Спектр жидкого экстракта женьшеня на 70% этиловом спирте (1:1) (1) и комплекса очищенного на полиамиде экстракта (сумма сапонинов) с 70% серной кислотой (2). Рисунок 61 – Спектр раствора Б, полученного при пробоподготовке таблеток (1) и комплекса гинзенозида Rg1 с серной кислотой 70% (2). 152 Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы сапонинов в таблетках женьшеня с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,51 % (табл. 22). Таблица 22 – Метрологические характеристики методики количественного определения суммы сапонинов в таблетках женьшеня f 10 X 3,32 S 0,1143 P, % 95% t (P, f) 2,23 ∆X ±0,255 E, % 4,51 6.3.2.3. Числовые показатели и срок хранения Качество полученной серии таблеток соответствовало стандартным фармакопейным показателям (табл. 23) [21]. Таблица 23 – Показатели качества ЛП «Женьшеня таблетки» № Показатель качества 1. Внешний вид 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Распадаемость Растворение Средняя масса Содержание суммы сапонинов Точность дозирования Однородность дозирования Прочность на истирание Значение Таблетки белого или белого с желтоватым оттенком цвета, плоскоцилиндрические, с риской, со слабым специфическим запахом Время распадаемости менее 15 мин. 85,3±0,9 % 0,25±0,01 г 3,32±0,15 мг 3,37±0,16 мг 3,29±0,15 мг 98,6±1,1 % Выбор дозировки 3,3 мг/таб. отличается от существующих на фармацевтическом рынке таблеток с экстрактом женьшеня: так, например, таблетки, покрытые пленочной оболочкой «Геримакс женьшень» содержат 200 мг экстракта корня женьшеня, что соответствует содержанию гинзенозидов 8 мг [23, 95]; рекомендуемая суточная доза 1 таб./день. Разработка таблеток с дозировкой 3,3 мг/таб. обусловлена возможностью их применения как детьми школьного возраста от 12 до 18 лет, так и в гериатрической практике с учетом пониженного обмена веществ. Исследование стабильности таблеток при хранении продолжается. 153 6.4. Обоснование целесообразности разработки новых лекарственных препаратов и их применения в медицинской практике В соответствии с методическими рекомендациями (Хабриев Р.У., 2005) необходимо подтверждать заявляемую фармакологическую активность новых ЛП перед прохождением процедуры регистрации путем проведения доклинических исследований. Исследования нейротропных свойств проводили на кафедре фармакологии им. з. д. н. А.А. Лебедева Самарского государственного медицинского университета на белых беспородных крысах обоего пола [82] (раздел 2.2.5). Проводили исследования разработанных настоек женьшеня на 40% и 70% этаноле в соотношении 1:5. Препаратами сравнения являлись настойка женьшеня (ОАО "Тверская фармфабрика") и препарата Гинсана (Pharmaton S.A., Швейцария). 6.4.1. Изучение гипногенной активности Гипногенную активность изучали на модели тиопенталового сна. Полученные результаты свидетельствуют о выраженном антигипногенном действии фитопрепаратов на основе корней женьшеня. На фоне действия настойки женьшеня на 40%-ном этаноле по сравнению с интактным контролем продолжительность тиопенталового сна сокращалась в 4,3 раза, при действии промышленного образца настойки и препарата Гинсана – в 4,0 и 3,2 раза соответственно (табл. 24). 154 Таблица 24 – Содержание основных БАВ в исследуемых фитопрепаратах и их влияние на продолжительность тиопенталового сна у животных № п/п Название препарата Производитель / разработчик Содержание суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 (%) – Контроль – Настойка женьшеня ОАО "Тверская 0,61±0,06 (70% этанол, 1:10) фармфабрика", РФ 3. Pharmaton S.A., Гинсана, эликсир 0,42±0,08 Швейцария 4. Настойка женьшеня ГБОУ ВПО СамГМУ 0,97±0,08 (40% этанол, 1:5) Минздрава России 5. Настойка женьшеня ГБОУ ВПО СамГМУ 1,17±0,09 (70% этанол, 1:5) Минздрава России *P ≤ 0,01 по критерию Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса 1. 2. Продолжительн ость сна (мин), M±m 112,8±4,9 27,6±3,8* 35,0±1,6* 26,1±3,4* – 6.4.2. Изучение ноотропного действия Ноотропную активность определяли путем выработки УРАИ. У исследуемых фитопрепаратов обнаружена ноотропная активность (табл. 25). Установлено, что через 24 после выработки рефлекса количество условных реакций избегания в опытной группе животных, которым вводили настойку женьшеня на 40%-ом этаноле, в 2 раза превышало число зарегистрированных условных рефлексов в контрольной группе. В опытных группах, в которых животным вводили настойку женьшеня промышленного производства и препарат Гинсана, число условных рефлексов возрастало в 2,2 и 2,4 раза соответственно. После 48 ч значения в опытных группах превышали контроль в 1,8; 1,9 и 1,7 раз, соответственно. При этом следует отметить, что через 48 ч на фоне препарата Гинсана количество обученных животных не изменилось. 155 Таблица 25 – Влияние фитопрепаратов на сохранность УРАИ № п/п 1. 2. Название препарата Контроль Настойка женьшеня (ОАО «Тверская фармфабрика») Гинсана Настойка женьшеня (40% этанол, 1:5) 3. 4. Количество условных реакций избегания, % Через 24 часа Через 48 часов 25,2±0,8 35,3±1,1 55,7±0,9 66,6±1,2 59,8±1,0 60,7±0,7 50,4±0,9 61,8±0,8 6.4.3. Изучение анксиолитической активности Анксиолитическую активность определяли по методике теста ПКЛ. У животных, получавших промышленный образец настойки женьшеня, время поиска безопасной площадки при воздействии тока не отличалось достоверно от показателей контрольной группы (табл. 26). Выявлено, что при повторном воздействии электрического тока время нахождения безопасной площадки под влиянием настойки женьшеня на 40%ном этаноле и препарата Гинсана сокращается соответственно в 4,2 раза и 2,2 раза. Таблица 26 – Влияние препаратов женьшеня на время поиска безопасной площадки при электроболевом воздействии (Мe [min-max]) Название препарата Время поиска безопасной площадки при обучении, с 51,1 [3,6-223,5] Контроль Настойка женьшеня (ОАО «Тверская 45,7 [3,7-184,8] фармфабрика») Гинсана 24,1 [7,8-153,0] Настойка женьшеня 29,8 [3,5-108,6] (40% этанол, 1:5) **P≤0,05 по критерию Крускала-Уоллиса Время повторного поиска безопасной площадки, с 12,6[1,3-101,0] 37,0 [5,3-123,0]** 5,6 [2,7-14,8]** 3 [1,2-7,4]** На фоне введения промышленного образца настойки женьшеня частота посещений открытых рукавов приподнятого крестообразного лабиринта увеличивалась в 4 раза, время нахождения крыс в них повышалось в 3,5 раза 156 по сравнению с контролем (таблица 27). Под действием настойки женьшеня на 40%-ном этаноле и препарата Гинсана число заходов в открытые рукава ПКЛ также увеличивалось в 3,5 раза и 3 раза, соответственно. Время пребывания в открытых рукавах повышалось по сравнению с контрольной группой в 5,2 раза в случае оригинального образца и 4,7 раза в случае Гинсаны, что свидетельствует о выраженном анксиолитическом действии изучаемых препаратов. Таблица 27 – Влияние препаратов на поведение животных в тесте ПКЛ (Мe [min-max]) Пребывание на центральной площадке, с 14,95 [0,00-98,70] Число заходов в открытые рукава 1,0 [0,0-3,0] Общее число заходов в рукава 2,5 [0,0-10,0] 235,00 [183,40257,00] 5,90 [0,00-32,00] 4, 00 [2,00-5,00]* 5,70 [3,00-9,00] 214,0 [150,0-290,0] 14,25 [0,00-40,00] 3, 0 [0,0-5,0] ** 5,5 [1,0-9,0] 8,45 [5,00-32,00] 3, 5 [2,0-7,0] ** 5,5 [3,0-9,0] Название препарата Пребывание в открытых рукавах, с Пребывание в закрытых рукавах, с Контроль 12,5 [0,0-37,5] 248,0 [170,0-297,0] Настойка женьшеня (ОАО «Тверская фармфабрика») 43,75 [22,90116,70]* Гинсана 59,2 [0,0-119,2]** Настойка 65,0 216,5 женьшеня [7,0-153,0]** [127,0-262,00] (40% этанол, 1:5) *P≤0,05, **P≤0,01 по критерию Манна-Уитни Таким образом, препараты женьшеня оказывают комплексное тонизирующее, ноотропное и анксиолитическое действие, что является основой для разработки фитопрепаратов на основе данного растения. При этом анксиолитическое действие впервые выявлено для препаратов корней женьшеня. Результаты исследования создают предлагают основу для разработки новых импортозамещающих ЛП на основе корней женьшеня, обоснованных с точки зрения состава, технологии производства и контроля качества. 157 ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 6 1. С помощью проведенных аналитических, технологических и фармакологических исследований показана целесообразность разработки и внедрения новых отечественных импортозамещающих лекарственных препаратов из корневищ с корнями женьшеня. 2. Разработан новый способ получения настойки женьшеня с использованием 40-80% этилового спирта в соотношении 1:5 – 1:9 при нагревании. Получен патент на изобретение №2496509. 3. Разработаны и апробированы методики качественного и количественного анализа настойки. Показано, что показатели качества остаются стабильными в течение трех лет, что позволяет рекомендовать срок годности – три года. 4. Предложен оригинальный состав сиропа женьшеня для лечения и профилактики астенических состояний у диабетических больных, при комплексной терапии сахарного диабета, применения здоровыми взрослыми и детьми. Получен патент на изобретение № 2514008. 5. Разработанные методики качественного и количественного определения суммы сапонинов метрологически аттестованы, обоснованы числовые показатели и срок хранения – 1,5 года. 6. Разработана технология получения таблеток с жидким экстрактом женьшеня, полученным в соотношении 1:1 на 70% этаноле, предложены методы их стандартизации. 7. На основании полученных данных разработаны проект ФСП «Женьшеня настойка», проект ФСП «Женьшеня сироп». 158 ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. В результате анатомо-морфологических исследований изучено корневище, главный и придаточный корень женьшеня, которые в совокупности составляют лекарственное сырье «Женьшеня корни». На основании полученных данных взамен ранее используемому названию ЛРС «Женьшеня корни» предложено новое наименование – «Женьшеня корневища с корнями», которое более полно отражает состав используемого сырья. 2. Впервые изучено анатомическое строение и характер сложения тканей листа, черешка листа и стебля женьшеня, представляющих собой перспективное ЛРС «Женьшеня трава». 3. В результате изучения химического состава женьшеня, культивируемого в Самарской области, с использованием химических, хроматографических и спектральных методов из корней женьшеня выделен гинзенозид Rg1, а из листьев женьшеня – кемпферол и кемпферол-3-О-диксилозид тетрагидроксифлавона), 3,5,7,41- (3-О-диксилозид представляющий собой новое природное соединение. 4. Показана целесообразность контроля качества корней и препаратов женьшеня по сумме сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1, а травы женьшеня – по содержанию суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 и по сумме флавоноидов в пересчете на рутин. 5. Разработаны методики качественного анализа корней женьшеня на содержание сапонинов методами ТСХ и спектроскопии с использованием РСО гинзенозида Rg1, а также методики качественного анализа травы женьшеня на содержание сапонинов и флавоноидов методом ТСХ. 6. Разработаны методики количественного анализа суммы сапонинов в корнях женьшеня и в траве в пересчете на РСО гинзенозид Rg1 методом прямой спектрофотометрии, а также методика количественного 159 определения суммы флавоноидов в траве женьшеня методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на ГСО рутин. 7. Определены показатели качества сырья «Женьшеня корневища с корнями»: в качестве нижнего предела содержания суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 предложено значение «не менее 2,0%»; препарата «Женьшеня настойка» («не менее 0,4%»); препарата «Женьшеня сироп» («не менее 0,04%»). 8. Экспериментально доказана тонизирующая, ноотропная и анксиолитическая активность водно-спиртовых извлечений из корней женьшеня, культивируемого в Самарской области, при этом анксиолитическое действие выявлено впервые. 9. На основе исследований химических, обоснована технологических и целесообразность фармакологических использования в медицинской практике новых тонизирующих лекарственных препаратов «Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки». 10. Разработан проект ФС «Женьшеня корневища с корнями», который направлен в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» с целью включения в Государственную Фармакопею РФ XII издания, а также проекты ФСП на лекарственные препараты «Женьшеня настойка» и «Женьшеня сироп». 160 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Аведисова, А. Терапия астенических состояний / А. Аведисова // Фармацевтический вестник. – 2000. – №5. – С. 87-89. 2. Антан, И.С. Разработка метода количественного спектрофотометрического определения основных действующих веществ в препаратах селективного штамма женьшеня / И.С. Антан, Л.И. Слепян, С.А. Минина, А.Н. Шиков //Хим.-фарм. журн. – 1995. – Т. 29, № 6. – С. 57-61. 3. Арзамасцев, А.П. Основные аспекты совершенствования фармакопейного анализа / А.П. Арзамасцев, В.Л. Багирова, Н.П. Садчикова // Хим.-фарм. журн. – 2000. – Т. 34, № 5. – С. 47-48. 4. Арушанян, Э.Б. Препараты корня женьшеня и других растительных адаптогенов как ноотропные средства / Э.Б. Арушанян// Экспер. и клин. фармакология. – 2008. – № 6. – С. 58-66. 5. Барнаулов, О.Д. Фитотерапия в неврологии: монография / О.Д. Барнаулов, М. Л. Поспелова. – СПб.: Н-Л, 2009. – 320 с. 6. Буданцев, А.Л. Лекарственные растения-антигипоксанты / А.Л.Буданцев, Е.Е. Лесиовская, Л.В. Пастушенков, Е.И. Саканян // Fito Ремедиум. – 2001. – №1. – С. 34-46. 7. Багирова, В.Л. О стандартизации лекарственных средств на современном этапе / В.Л. Багирова, Е.Л. Ковалева, Н.П. Садчикова // Хим.-фарм. журнал. – 2000. – Т. 34, № 5. – С. 47-48. 8. Барташевич, O.A. Таблетки из порошка корня женьшеня / O.A. Барташевич // Мед. пром. СССР. – 1962. – № 3. – С. 38-40. 9. Беликов, В.В. Реакции комплексообразования в анализе флавоноидов / B.В. Беликов, Т.В. Точкова // Фенольные соединения физиологические свойства. – Алма-Ата, 1973. – С. 168-172. и их 161 10. Березовская, Т.П. Методы микроскопического анализа ботанических объектов / Т.П. Березовская, Н.В. Дощинская, Е.А. Серых. – Томск, 1978. – 113 с. 11. Бржихнач, Б.К фармакогностической характеристике листьев Panax ginseng C.A. Meyer / Б. Бржихнач, В.К. Шаповалов, Н.И. Севрюк // Раст. ресурсы. – 1982. – Т. 18, вып. 3. – С. 357-363. 12. Васильева, О.Н. Фармакогностическое изучение надземных органов и корней женьшеня, культивируемого на разных плантациях России и СНГ: автореф. дисс. … канд. фарм. наук: 15.00.02 / Васильева Ольга Николаевна. – Пятигорск, 2000. – 24 с. 13. Вергейчик, Е.Н. Возможность использования шрота корня женьшеня / Е.Н. Вергейчик, Е.В. Компанцева, Д.А. Муравьева, Ю.Г. Пшуков, О.И. Попова, Т.О. Арчинова, Л.А. Лукашова, А.И. Бодрова, Г.С. Гутенева, Ю.А. Огурцов, М.В. Линников, Н.В. Головко // Фармация. – 1998. – №6. – С. 15-17. 14. ВФС 42-1891-89. Биомасса женьшеня сухая / Фармакопейный государственный комитет. – Введ. 21.04.1989. – М., 1989. – 7 с. 15. ВФС 42-3044-98. Настойка «Панаксел» / Фармакопейный государственный комитет. – Введ. 13.10.1998. – М., 1998. – 10 с. 16. Геккелер, К. Аналитические и препаративные лабораторные методы / К. Геккелер, Х. Экштайн. – М.: Химия, 1994. – 409 с. 17. Георгиевский, В.П. Применение хроматографии в тонком слое для идентификации и количественного определения биологически активных веществ растительного происхождения / В.П. Георгиевский – М.: Наука, 1978. – 68 с. 18. Глебко, Л.И. Стандартизация качества женьшеня корней и настойки по содержанию суммы гинзенозидов / Л.И. Глебко, Н.П. Красовская, Т.В. Покушалова, Г.Я. Ильченко, Т.А. Будина // Хим.-фарм. журнал. – 2004. – Т. 38, №4. – С. 20-23. 162 19. ГОСТ 23938-79. Корень женьшеня культивируемый свежий. Технические условия. – М.: Межгос. совет по стандартизации, метрологии и сертификации, 1979. – 2 с. 20. Государственная фармакопея Российской Федерации XII издания. – М.: Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008. – Ч.1. – 704 с. 21. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа / МЗ СССР. – 11 изд. – М.: Медицина, 1987. – Вып. 1. – 336 с. 22. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. – 11 изд. – М.: Медицина, 1990. – Вып. 2. – 398 с. 23. Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. – Электрон. дан., 2014. – Режим доступа: http://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx. 24. Гранадский, Н.С. Выращивание женьшеня в комнатных и огородных условиях / Н.С. Гранадский – Чебоксары, 1983. – 32 с. 25. Громовая, В.Ф. Антиоксидантные свойства лекарственных растений / В.Ф. Громовая, Г.С. Шаповал, И.Е. Миронюк, Н.В. Нестюк // Хим.фарм. журнал. – 2008. – Т. 42, № 1. – С. 26-29. 26. Грушвицкий, И.В. Приемы ускоренного проращивания семян женьшеня / И.В. Грушвицкий, З.И. Гутникова, П.П. Воробьева // Тез. докл. совещ. по вопросам изучения и освоения растительных ресурсов СССР, 1968. – С. 81-88. 27. Гуревич, К.Г. Женьшень: побочные эффекты и лекарственные взаимодействия / К.Г. Гуревич // Фарматека. – 2005. – № 2. – С. 58-61. 28. Демченко, Д.В. Разработка технологии жидкого экстракта на основе листьев черники и женьшеня / Д.В. Демченко, Ю.Д. Папок, А.Б. Легостаева // Хим.-фарм. журнал. – 2008. – Т. 42, № 3. – С. 20-24. 163 29. Добряков, Ю.И. Результаты фармакологических исследований природного лекарственного сырья Дальневосточного региона / Ю.И. Добряков // Вестник ДВО РАН. – 2004. – № 3. – С. 87-92. 30. Долгова, А.А. Морфолого-анатомическое исследование лекарственного растительного сырья: практикум по фармакогнозии / А.А. Долгова, Е.Я. Ладыгина. – М.: Медицина, 1977. – 255 с. 31. Жидкостная колоночная хроматография / Под ред. З. Дейла, К. Мацека, Я. Янака (пер. с англ.). – М.: Мир, 1978. – 428 с. 32. Запесочная, Г.Г. Методические основы химической стандартизации растительного сырья и фитопрепаратов / Г.Г. Запесочная // Современное состояние и перспективы научных исследований в области фармации: тез. докл. науч.- практ. конф., посвящ. 25-летию фарм. фак-та СамГМУ (Самара, 11-12 сент. 1996 г.). – Самара, 1996. – С. 127. 33. Игнатьев, А.Г. Корень жизни. Вопросы биологии, разведения и использования женьшеня / А.Г. Игнатьев, Г.В. Гуков. – Владивосток: Изд. ДВГУ, 1994. – 55 с. 34. Киселева, Т.Л. Отечественные фармакопейные растения и сырье: учебное пособие / Т.Л. Киселева, Ю.А. Смирнова, А.А. Карпеев. – М., 2009. – 108 с. 35. Киселева, Т.Л., Лекарственные растения в мировой медицинской практике: государственное регулирование номенклатуры и качества: монография / Т.Л. Киселева, Ю.А. Смирнова. – М.: Проф. ассоц. натуротерапевтов, 2009. – 295 с. 36. Коновалов, Д.А. Цитотоксические свойства полиацетиленовых соединений растений. I / Д.А. Коновалов // Раст. Ресурсы. – 2014. – Т. 50, вып. 1. – С. 153-171. 37. Кривошеева, Е.М. Спектр фармакологической активности растительных адаптогенов / Е.М. Кривошеева, Е.В. Фефелова, С.Т. Кохан // Фундаментальные исследования. – 2011. - № 6. – С. 85-88. 164 38. Кудимов, Ю.Н. Совершенствование процесса получения полисахаридного комплекса женьшеня / Ю.Н. Кудимов, В.Т. Казуб, Д.А. Муравьева, О.Н. Васильева, К.В. Мартиросян // Фармация. – 2002. – № 6. – С. 24-26. 39. Куркин, В.А. Анксиолитическая активность некоторых фитопрепаратов и фенилпропаноидов / В.А. Куркин, А.В. Дубищев, В.Н. Ежков, И.Н. Титова // Раст. ресурсы. – 2007. – Т. 43, вып. 3. – С. 130-139. 40. Куркин, В.А. Новые подходы к диагностике лекарственного растительного сырья эхинацеи пурпурной / В.А. Куркин, Е.И. Вельмяйкина, Л.В. Тарасенко, В.М. Рыжов // Традиционная медицина. – 2012. – № 1. – С. 42-46. 41. Куркин, В.А. Ноотропная активность некоторых фитопрепаратов и фенилпропаноидов / В.А. Куркин, А.В. Дубищев, В.Н. Ежков // Раст. ресурсы. – 2007. – Т. 43, вып. 2. – С. 76-88. 42. Куркин, В.А. Основы фитотерапии: учебное пособие для студентов фармацевтических вузов / В.А. Куркин. – Самара: ООО «Офорт», ГБОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2009. – 963 с. 43. Куркин, В.А. Сравнительное анатомо-морфологическое исследование некоторых вегетативных органов эвкалипта прутовидного и эвкалипта серого / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, Л.В. Тарасенко, В.М. Рыжов, Н.Р. Шагалиева, А.В. Азнагулова, Л.В. Марлынова // Медицинский альманах. – 2013. – № 5 (28). – С. 191-196. 44. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармац. вузов. – Изд. 2-ое, перераб. и доп. / В.А. Куркин. – Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ», 2007. – 1239 с. 45. Куркин, В.А. Физико-химические методы исследования природных биологически активных соединений. Ч. 1. Хроматографические методы: Учебное пособие / В.А. Куркин, В.Б. Браславский, Е.В. Авдеева, М.Ф. Сенцов, Л.Д. Климова, И.Ф. Шаталаев. – Самара: СамГМУ. – 1997. – 38 с. 165 46. Легостева, А.Б. Фитохимическое изучение листьев женьшеня, получение и анализ препаратов, содержащих панаксозиды: автореф. дисс. … канд. фарм. наук / Легостева Анастасия Борисовна. – Ленинград, 1989. – 26 с. 47. Легостева, А.Б. Возрастная и сезонная динамика содержания панаксозидов в листьях культивируемого Panax ginseng C. A. May / А.Б. Легостева, И.В. Грушвицкий, С.А. Минина // Раст. ресурсы. – 1986. – № 4. – С. 523-526. 48. Лесиовская, Е.Е. Об индивидуальных особенностях стресспротективных свойств некоторых адаптогенных препаратов / Е.Е. Лесиовская // Химия и технология лекарственных веществ: материалы Всероссийской научн. конф. – СПб.: СПХФИ. – 1994. – 458 с. 49. Лесиовская, Е.Е. Фармакотерапия с основами фитотерапии: учебное пособие 2-е изд. / Е.Е. Лесиовская, Л.В. Пастушенков. – М., 2003. – 592 с. 50. Листровой, М. Астения – усталость по жизни / М. Листровой // Здоровье Украины. – 2005. – №114. – С. 5-7. 51. Лукашина, Т.В. Разработка и стандартизация комплексного фитопрепарата для лечения синдрома хронической усталости: автореф. дис. … канд. фармац. Наук: 15.00.02 / Лукашина Татьяна Викторовна. – Москва, 2009. – 23 с. 52. Макарова, М.Н. Характеристика антирадикальной активности экстрактов из растительного сырья и содержание в них дубильных веществ и флавоноидов / М.Н. Макарова, В.Г. Макаров, Н.М. Станкевич, С.Б. Ермаков, И.А. Яшакина // Раст. ресурсы. – 2005. – Т. 4, вып. 2. – С. 106-115. 53. Маслов, Л.Н. Инотропные, кардиопротекторные и антиаритмические эффекты препаратов женьшеня / Л.Н. Маслов, Ю.Н. Конковская // Экспер. и клин. фармакология. – 2009. – Т. 72, № 4. – С. 52-60. 166 54. Маслов, Л.Н. Сосудистые эффекты препаратов женьшеня / Л.Н. Маслов, Ю.Б. Лишманов // Экспер. и клин. фармакология. – 2008. – Т. 71, № 5. – С. 58-68. 55. Матюхин, В.А. Лечебное действие женьшеня при хронической лучевой болезни белых крыс / В.А. Матюхин, Г.М. Маянский // Матер. к изучению женьшеня и других лекарственных растений Дальнего Востока. – Владивосток, 1963. – Вып. 5. – С. 137-141. 56. Маханьков, В.В. Сравнительное исследование качественного состава и количественного содержания тритерпеновых гликозидов, продуцируемых дикорастущим и плантационным женьшенем Panax ginseng C. А. Meyer и клеточной культурой на его основе: автореф. дисс. … канд. хим. наук: 02.00.10 / Маханьков Вячеслав Валентинович. – Владивосток, 2001. – 25 с. 57. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: в 2-х т. / М.Д. Машковский. – 14-е изд. перераб. и доп. – М.: Новая волна, 2002. – 2 т. 58. Милютина, Н.П. Антирадикальная активность экстрактов женьшеня / Н.П. Милютина, А. Ананян, В.П. Тувик, Р.М. Кесслер // 4-я конф.: биоантиоксидант. Тез. Докл. – М., 1993. – С. 19. 59. Минина, С.А. Способ приготовления и фармакологические свойства настойки из листьев женьшеня / С.А. Минина, А.Б. Легостева, Н.Б. Сыровежко, Е.Е. Лесиовская, Н.Ю. Фролова, М.А. Буракова, Н.Е. Тушина // Хим.-фарм. журнал. – 2000. – Т. 38, № 9. – C. 31-33. 60. Минина, С.А. Оптимизация процесса экстрагирования корня женьшеня / С.А. Минина, В.А. Вайнштейн, Л.В. Шигарова // Хим.-фарм. журнал. – 1998. – Т. 36, №7. – С. 42-45. 61. Минина, С.А. Химия и технология фитопрепаратов: учебное пособие. – 2-е изд., перераб. и доп. / С.А. Минина, И.Е. Каухова.– М.: Издательская группа «ГЕОТАР-Медиа», 2009. – 560 с. 167 62. Министерство промышленности и торговли Российской Федерации: стратегия развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2020 года. – Москва, 2009 г. 63. Молчанов, Г.И. Использование лекарственных препаратов женьшеня, лимонника и элеутерококка для создания лечебно-профилактических пищевых продуктов / Г.И. Молчанов, К.С. Лукьянчиков, В.В. Кочанов // материалы науч.-практ. конф., посвящ. 50-летию фарм. фак-та: тез. докл. – Томск, 1991. – Ч. 1. – С. 167-168. 64. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия: учеб. / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2002. – 656 с. 65. НД 42-10675-00. Настойка женьшеня / Фармакопейный государственный комитет. – Введ. 19.01.2000. – М., 2000. – 5 с. 66. НД 42-7339-02. Гинсана капсулы 100 мг / Фармакопейный государственный комитет. – Введ. 10.01.2000. – М., 2000. – 17 с. 67. Новосёлов, Г.И. Определение подлинности порошка корней женьшеня методом микроскопии / Г.И. Новосёлов, А.С. Хомик, В.В. Вандышев // Фундаментальные исследования. – 2006. – № 5. – С. 66-67. 68. Орлов, В.И. Жидкостная хроматография: теоретические основы / В.И. Орлов, А.А. Аратсков. – Дзержинск, 1997. – 82 с. 69. ОСТ 91500.05.001-00 “Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения”. 70. Пат. 2052925 Российская Федерация, A 01 H 4/00, C 12 N 5/00 Штамм клеток растительной ткани женьшеня – продуцент гинзенозидов / Константинова Н.А. [и др.] (РФ). – 93051195/13; заявл. 05.11.1993; опубл. 27.01.1996, Бюл. № 43. – 10 с. 71. Пат. 2057463 Российская Федерация, A 23 L 1/08. Биологически активная пищевая добавка «Женьшень стимул» / Скоблик Т.И. [и др.] (РФ). – 93046485/13; заявл. 17.09.1993; опубл. 10.04.1996, Бюл. № 21. – 13 с. 168 72. Пат. 2125458 Российская Федерация, A 61 K 35/78. Способ получения комплекса, обладающего адаптогенным, гипогликемическим, антигипоксическим и противовоспалительным действием / Минина С.А. [и др.] (РФ). – 97104723/14; заявл. 02.04.1997; опубл. 27.01.1999, Бюл. № 45. – 12 с. 73. Пат. 2153884 Российская Федерация, A 61 K 9/20. Твердое лекарственное средство / Минина С.А. [и др.] (РФ). – 98105570/14 ; заявл. 30.03.1998; опубл. 10.08.2000, Бюл. № 32. – 14 с. 74. Пат. 2157231 Российская Федерация, A 61 K 35/78, A 61 K 31/715, A 61 P 1/16 Способ получения водорастворимых полисахаридов, обладающих гепатопротекторной активностью, из листьев женьшеня / Казуб В.Т. [и др.] (РФ). – 99113967/14; заявл. 25.06.1999; опубл. 10.10.2000, Бюл. № 41 – 11 с. 75. Петренко, Е.Р. Сравнительное фармакологическое изучение адаптогенных свойств препаратов женьшеня: автореф. дисс. … канд. биол. наук: 14.00.25 / Петренко Елена Руслановна. – СПб., 1998. – 27 с. 76. Попов, А.М. Противоопухолевая и антиметастатическая активность моноглюкозидов женьшеня: современные представления / А.М. Попов // Биофармацевтический журнал. – 2011. – Т. 3, № 5. – С. 3-8. 77. Попова, И.А. Анатомо-гистологическое исследование листочков сложного листа Hedysarum grandiflorum Pall. / И.А. Попова, Т.И. Плаксина, В.М. Рыжов, Л.В. Тарасенко // Вестник Самарского государственного университета. – 2011. - №8 (89). – С. 196-201. 78. Промышленная технология лекарств: Учебник для вузов: в 2-х т., Том 2 / В.И. Чуешов, М.Ю. Чернов, Л.М. Хохлова. – Х.: МТК-Книга; Издательство НФАУ, 2002. – 716 с. 79. Пчелкин, В.П. Видовой состав лецитинов клеток женьшеня в культуре / В.П. Пчелкин, М.А. Шаталова, В.Д. Цыдендамбаев, А.М. Носов, А.Г. Верещагин // Хим.-фарм. журнал. – 2004. – Т. 38, № 2. – С. 34-36. 80. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их 169 компонентный состав и биологическая активность. Т. 3. Семейства Fabaceae – Apiaceae / Отв. ред. А.Л. Буданцев. – СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2010. – 601 с. 81. Рукавишникова, С.А. Фитоадаптогены и их влияние на лабораторные показатели крови, характеризующие радиорезистентность организма / С.А. Рукавишникова, Н.Н. Зыбина, Е.И. Саканян // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы VIII Международного съезда ФИТОФАРМ: Тез.докл. – Миккели, 2004. – С.166-168. 82. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. – 832 с. 83. Самылина, И.А. Фармакогнозия. Атлас: учебное пособие: в 2-х томах / И.А. Самылина, О.Г. Аносова. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. – Т. 2. – 192 с. 84. Самылина, И.А. Женьшень (Panax ginseng C.A. Mey) / И.А. Самылина, А.А. Сорокина, Н.В. Пятигорская // Фарматека. – 2010. - № 16. – С. 9395. 85. Самылина, И.А. Основные направления исследований лекарственных растений на современном этапе / И.А. Самылина, И.С. Грицаенко, Н.К. Горчакова // Современные аспекты изучения лекарственных растений: науч. тр. – М., 1995. – Т. XXXIV. – С. 3–6. 86. Самылина, И.А. Проблемы стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных средств / И.А. Самылина // Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты: материалы 1-го Междунар. науч. конгр.: тез. докл. – М.: Ин-т традицион. методов лечения МЗ РФ и др., 1994. – С. 203. 170 87. Самылина, И.А. Пути использования лекарственного растительного сырья и его стандартизация / И.А. Самылина, И.А. Баландина // Фармация. – 2004. – № 2. – С. 39-41. 88. Сдобнина, А.И. Диагностические признаки лекарственных растений в петиолярной анатомии. Биоразнообразие: проблемы и перспективы сохранения: Материалы Международной научной конференции, посвященной 135-летию со дня рождения И. И. Спрыгина. – П.: Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского, 2008. – 420 с. 89. Синева, Т.Д. Фармация на современном этапе – проблемы и достижения: Научные труды / Т.Д. Синева, Н.И. Котова, Н.Ю. Фролова. – М., 2000. – Т. XXXIX. – С. 289-293. 90. Синяков, О.Ф. Стимуляторы жизни / О.Ф. Синяков. – М.: Молодая гвардия, 1990. – 190 с. 91. Слепнев, А.А. Экспериментальная сравнительная оценка гериопротекторных свойств маточного молочка, женьшеня и их комбинации: автореф. дисс. … канд. биол. Наук: 03.00.04 / Слепнев Александр Александрович. – Рязань, 2003. – 21 с. 92. Смолина, Т.П. Иммуностимулирующее действие полисахаридов, выделенных из корня и культуры клеток женьшеня / Т.П. Смолина, Н.В. Крылова // Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. – Томск, 1989. – С. 159. 93. Смолина, Т.П. Интерферониндуцирующее действие полисахаридсодержащих биополимеров из корня и культуры клеток женьшеня / Т.П. Смолина, Т.Г. Орлова, О.Н. Щегловитова, Н.Н. Беседнова // Антибиотики и химиотерапия. – 1998. – № 43. – С. 21-23. 94. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. – М.: АстраФармСервис, 2011. – 1728 с. 171 95. Справочник РЛС: лекарственные средства и препараты. Инструкция, применение, описание [Электронный ресурс]. – Электрон. дан., 2010. – Режим доступа: http://www.rlsnet.ru. 96. Сюткина, Н.И. Возможности применения препаратов, полученных из растения семейства аралиевые (настойка женьшеня, сапарал), а так же препаратов китайского лимонника и родиолы розовой в онкологии / Н.И. Сюткина, В.И. Купин // Клинические исследования. – 1993. – № 10. – С. 26-33. 97. Уварова, Н.И. количественное Химическая определение характеристика, и сравнительное биологическая активность тритерпеновых гликозидов из дикого и плантационного женьшеня Panax ginseng C.A. Meyer, произрастающих в Приморском крае / Н.И. Уварова, В.В. Маханьков, Г.В Малиновская, Н.Ф. Самошина, Л.Н. Атопкина, Г.Н. Лихацкая, Н.Ю. Ким, М.М. Анисимов, Г.Б. Еляков // Хим.-фарм. журнал. – 2000. – Т. 32, № 3. – С. 19-23. 98. Федеральный Реестр Биологически активных добавок (БАДы) [Электронный ресурс]. – Электрон. дан., 2014. – Режим доступа: http://www.ros-med.info/bad/. 99. ФС 42-1886-82. Настойка женьшеня / Фармакопейный государственный комитет. – Введ. 02.08.1982. – М., 1982. – 5 с. 100. ФСП 42-0171640605. Женьшеня экстракт сухой / Фармакопейный государственный комитет. – Введ. 28.07.2006. – М., 2006. – 8 с. 101. Хржановский, В.Г. Практикум по курсу общей ботаники: Учеб. пособие / В.Г. Хржановский, С.Ф. Пономаренко. – М.: Высш. школа, 1979. – 422 с. 102. Хроматография в тонких слоях / Под ред. Э. Шталя. – М.: Мир, 1965. – 508 c. 103. Шнытко, М.В. Инновационные разработки в области выращивания женьшеня в условиях Среднего Поволжья / М.В. Шнытко, Л.А. Клейн // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции 172 «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты». – Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2011. – С. 154. 104. Attele, A.S. Antidiabetic effects of Panax ginseng berry extract and the identification of an effective component / A. S. Attele, Y. P. Zhou, J. T. Xie, J. A. Wu, L. Zhang, L. Dey, W. Pugh, P. A. Rue, K. S. Polonsky, C. S. Yuan // Diabetes. – 2002. – Vol. 51, No. 6. – P. 1851-1858. 105. British Pharmacopoeia. – Appendix III, 2001. – Vol. 11. 106. Cai, Z. Applications of Mass Spectrometry in the analysis of Ginsenosides and Ginseng Extracts / Z. Cai, V. Gao // Analytical sciences. – 2001. – No. 17. – P. 463-465. 107. Chang, S.J. Vasorelaxing effect by protopanaxatriol and protopanaxadiol of Panax ginseng in the pig coronary artery / S.J. Chang, J.S. Suh, B.H. Jeon, K.Y. Nam, H.K. Park // Korean J. Ginseng Sci. – 1994. – Vol. 18. – P. 95101. 108. Chang, Y.S. Ginseng and health / Y.S. Chang // The Challenges of the 21st century: Proceedings of the International Ginseng Conference. – Vancouver British Columbia, Canada: Edited by W.G. Baliley, C. Whitehead, J.T.A. Proctor and J.T. Kyle. – 1995. – P. 23. 109. European Pharmocopoeia. – 6-th Ed. – Rockville: United States Pharmocopoeial Convention, Inc., 2008. – P. 1658-1659. 110. German Homoeopathic Pharmacopoeia. 5th Supplement 1991 to the first edition 1978. –Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart, 1993. – P. 303 -306. 111. Helms., S. Cancer prevention and therapeutics: Panax ginseng / S. Helms // Alterrnative medicine review. – 2004. – No. 3. – P. 259-274. 112. Japanese Pharmocopoeia. – JP XIV. – 2001. – P. 927-930. 113. Kieffer, D. Panax ginseng / D. Kieffer, T. Pantuso // Complementary and alternative medicine. – 2003. – No. 8. – P. 1539-1542. 114. Kikuchi, Y. Inhibition of human ovarian cancer cell proliferation in vivo by ginsenoside Rh-2 and adjuvant effects to cisplatin in vitro / Y. Kikuchi, H. 173 Sasa, T. Kita, J. Hirata, T. Tode, I. Nagata // Anti-cancer Drugs., 1991. – Vol. 2. – P. 63-67. 115. Kim, H.J. Radioprotective effects of an acidic polysaccharide of Panax ginseng on bone marrow cells / H.J. Kim, M.N. Kim, Y.Y. Byon, J.W. Park, Y. Jee, H G. Joo // J. Vet. Sci.. – 2007. – Vol. 8, No. 1. – P. 39-44. 116. Koh, H.Y. Photooxidant of polyacetylene compounds from Panax ginseng C.A. Meyer / H.Y. Koh, S.K. Chang, S. Ch. Shim // Bulletin of Korean Chemical Society. – 1986. – No. 3 – P. 179-182. 117. Lee, S.Y. Chemical constituents and biological activities of the berry of Panax ginseng / S.Y. Lee, Y.K. Kim, N. Park., Ch. S. Kim, Ch.Y. Lee, S.U. Park // Journal of medical plants research. – 2010. – No. 4. – P. 349-353. 118. Leung, K.W. Angiomodulatory and neurological effects of ginsenosides / K.W. Leung, K.K. Yung, N.K. Mak, P.Y. Yue, H.B. Luo, Y.K. Cheng, T.P. Fan, H.W. Yeung, T.B. Ng, R.N. Wong // Curr. Med. Chem. – 2007. – Vol. 14, No. 12. – P. 1371-1380. 119. Li, X. Study on antiradiation effect of panaxatriol / X. Li, Z. Lin, Y. Huang, Q. Deng, H. Xu // Zhong Yao Cai. – 2002. – Vol. 25, No. 11. – P. 805-808. 120. Morinaga, O. Chromatographic resolution of glucosidic compounds, ginsenosides on polyethersulphone membrane, and its application to the quantitative immunoassay for ginseng saponins / O. Morinaga, N. Fukuda, H. Tanaka, Y. Shoyama // Glycobiology. – 2005. – No. 15. – P. 1061-1066. 121. Radad, K. Ginsenosides Rb1 and Rg1 effects on mesencephalic dopaminergic cells stressed with glutamate / K. Radad, G. Gille, R. Moldzio, H. Satio, W. D. Rausch // Brain Res. – 2004. – Vol. 1021, No. 1. – P. 41-53. 122. Scaglione, F. Immunomodulatory effects of two extracts of Panax ginseng C.A. Meyer / F. Scaglione, F. Ferrara, S. Dungnani, M. Falchi, G. Santoro, F. Fraschini // Drugs Exp. Clin. Res. – 1990. – Vol. 16. – P. 537-542. 123. Seely, D. Safety and efficacy of Panax ginseng during pregnancy and lactation / D. Seely, J-J. Dugoua, D. Perri, E. Mills, G. Koren // Can. Clin. Pharmacol. – 2008. – No. 15. – P. 87-95. 174 124. Shim, S.Ch. Polyacetylene compounds from Panax ginseng C.A. Meyer / S.Ch. Shim, H.Y. Koh // Bulletin of Korean Chemical Society. – 1983. – No. 4. – P. 183-188. 125. Sung, K.K. Change of Ginsenoside composition of various American Ginseng roots / K.K. Sung, O.S. Cho, H.M. Bae, U.D. Sohn, B.O. Im, S.H. Chung, B.Y. Lee // J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. – 2009. – No. 52 (2). – P. 198201. 126. Surh, Y.-J. Molecular mechanism underlying anti-tumor promoting activities of heat-processed Panax ginseng C.A. Meyer / Y.-J. Surh, H.-K. Na, J.-Y. Lee, Y. S. Keum // J. Korean Med. Sci. – 2001. – No. 16. – P. 38-41. 127. Tung, H.T. New Dammarane saponins from the steamed Ginseng leaves / H.T. Tung // Bull. Korean Chem.Soc. – 2010. – No. 7. – P. 2094-2096. 128. U.S. Pharmacopeia. The official Compendia of Standards. – The USP 30 NF 25. – Official May 1, 2007. 129. Wagner, H. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas / H. Wagner, S. Blads // Berlin-Heidelberg-New York: Springer Verlang, 1996. – 348 p. 130. Xie, J. T. Antihyperglycemic effects of total ginsenosides from leaves and stem of Panax ginseng / J. T. Xie, J.T. Xie, C.Z. Wang, A.B. Wang, J. Wu, D. Basila, C.S. Yuan // Acta Pharmacol Sin. – 2005. – Vol. 26, No. 9. – P. 11041110. 131. Yang, X.W. Ginsenoside-Rg6, a novel triterpenoid saponin from the stemleaves of Panax ginseng C.A. Mey / X.W. Yang, L.Y. Li, J.M. Tian, Z.W. Zhang, J.M. Ye, W.F. Gu // Chinese Chemical Letters Vol. – 2000. – No. 10. – P. 909-912. 132. Yokozawa, T. Studies on the mechanism of the hypoglycemic activity of the ginsenoside Rb2 in streptozotocin-diabetic rats / T. Yokozawa, T. Kobayashi, H. Oura, Y. Kawashima // Chem. Pharm. Bull. – 1985. – Vol. 33. – P. 869872. 175 133. Zongwei, C. Applications of Mass Spectrometry in the analysis of Ginsenosides and Ginseng Extracts / C. Zongwei, G. Vince // Analytical sciences. – 2001. – No. 17 – P. 463-465 176 ПРИЛОЖЕНИЯ 1 – 7. Акты о внедрении; 8. Направительное письмо в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» от 22.01.2013 г. № 1730/01-37-183. Вх. № 1021 от 28.01.2013 г.; 9. Проект ФС «Женьшеня корневища с корнями»; 10. Проект ФСП «Женьшеня настойка»; 11. Проект ФСП «Женьшеня сироп»; 12. Патент на изобретение «Способ получения средства, обладающего тонизирующей активностью» №2496509; 13. Патент на изобретение «Сироп женьшеня» №2514008; 14. Удостоверение на рационализаторское предложение «Способ получения настойки женьшеня» №217 от 21.09.2012 г.; 15. Удостоверение на рационализаторское предложение «Состав сиропа женьшеня настоящего» №218 от 21.09.2012 г. 177 Приложение 1 178 Приложение 2 179 Приложение 3 180 Приложение 4 181 Приложение 5 182 Приложение 6 183 Приложение 7 184 Приложение 8 185 Приложение 9 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ Директор Центра фармакопеи и международного сотрудничества ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», доктор фармацевтических наук, профессор ________ Е.И. САКАНЯН «___» 20___ г. . СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Производитель: КФХ питомник «Женьшень» (с. Солнечная поляна, Самарская область) Заявитель: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Разработчик: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Женьшеня корневища с корнями ФС 42-…………… Panacis ginseng rhizomata cum radicibus взамен ст. 66, ГФ СССР XI издания Срок введения установлен c “__” ________________г. до “__” _______________г. Настоящая фармакопейная статья распространяется на собранные в конце августа – начале сентября и высушенные корневища с корнями дикорастущего и культивируемого женьшеня настоящего – Panax ginseng C.A.Meyer. (семейство араливые – Araliacee); цельные, измельченные и порошок. ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ ПЕРЕПЕЧАТКА ВОСПРЕЩЕНА 186 Спецификация лекарственного растительного сырья «Женьшеня корневища с корнями» Производитель: КФХ питомник «Женьшень» Показатель Методы Нормы 3 Ц е л ь н о е с ы р ь е. Соответствует разделу «Внешние признаки». И з м е л ь ч е н н о е с ы р ь е. Соответствует разделу «Внешние признаки». П о р о ш о к. Соответствует разделу «Внешние признаки». Соответствие анатомическим признакам 4 Просмотр невооружённым глазом и под лупой с увеличением (×10) качества 2 Внешние признаки Микроскопия Качественные реакции Количественное определение: Содержание суммы сапонинов в пересчете на Просмотр под микроскопом с увеличением (не менее ×40) 1. ТСХ-анализ; 1. ТСХ: наличие не менее 6 пурпурно-красных пятен с Rf от 0,10 до 0,50, в том числе пятно с Rf, соответствующим РСО гинзенозида Rg1 (около 0,4) после опрыскивания 20% спиртовым раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты; 2. Качественные реакции: При нанесении на порошок 2. Качественные реакции; корневищ с корнями женьшеня капли концентрированной серной кислоты через 1-2 мин появляется кирпичнокрасное окрашивание, переходящее в краснофиолетовое (гинзенозиды). 3. Спектр раствора В (см. раздел "Количественное определение") имеет максимумы поглощения 320 2 нм, 390 2 нм и 526 2 3. Спектроскопия в УФ и видимой нм (сапонины). области спектра. max = 320 2 нм, 390 2 нм и 526 нм 2 нм (сапонины); УФ-спектроскопия Не менее 2,0% 187 гинзенозид Rg1 Потеря в массе при высушивании Золы общей Золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной Корней и корневищ, потемневших и побуревших с поверхности Органической примеси Минеральной примеси Размер частиц измельченного сырья: 1. Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм 2. Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3,1 мм. Размер частиц порошка: 1. Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм 2. Частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,25 мм. ГФ XI, вып. 1, стр. 285 Не более 13 % ГФ XI, вып. 2, стр. 24 Не более 5,0 % Не более 2,0% ГФ XI, вып. 1, стр. 275 Не более 10,0 % ГФ XI, вып. 1, стр. 275 Не более 0,5% ГФ XI, вып. 1, стр. 275 Не более 1,0% ГФ СССР XI, вып. 2, стр. 17 (для измельченного сырья) не более 10 % не более 10 % не более 10 % не более 10 % Микробиологическая чистота Срок годности В соответствии с XII ГФ РФ, часть 1, Визуально ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота». 2 года 6 месяцев Внешние признаки. Ц е л ь н о е с ы р ь е. Корни с корневищами длиной до 25 см, толщиной 0,7-2,5 см, с 2-5 крупными разветвлениями, реже без них. Корни стержневые, продольно-, реже спиральноморщинистые, хрупкие, излом ровный. «Тело» корня утолщенное, почти цилиндрическое, сверху с ясно выраженными кольцевыми утолщениями. В верхней части 188 корня имеется суженное поперечно-морщинистое корневище – «шейка». Корневище короткое с несколькими рубцами от опавших стеблей, наверху образуют «головку», представляющую собой расширенный остаток стебля и верхушечную почку (иногда 2-3). От «шейки» иногда отходят один или несколько придаточных корней. «Шейка» и «головка» могут отсутствовать. Цвет корней и корневищ с поверхности и на разрезе желтовато-белый, на свежем изломе белый. Запах специфический. Вкус сладкий, жгучий, затем горьковатый. И з м е л ь ч е н н о е с ы р ь е. Кусочки корней и корневищ различной формы, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Цвет с поверхности и на изломе желтовато-белый. Запах специфический. Вкус сладкий, жгучий, затем горьковатый. П о р о ш о к. Смесь измельченных частиц корней и корневищ разнообразной формы желтовато-белого цвета. Запах специфический. Вкус сладкий, жгучий, затем горьковатый. Микроскопия. Ц е л ь н о е с ы р ь е. Корневище на поперечном срезе округлой формы. Слагается из тканей центрального цилиндра и первичной коры, с поверхности находится перидерма (рис. 1). 189 Рисунок 1 – Поперечный срез корневища женьшеня (× 40; окраска – раствор Люголя 3% и раствор сернокислого анилина 5%) Обозначения: 1 – пробка; 2 – феллоген; 3 – феллодерма; 4 – паренхима первичной коры; 5 – флоэма; 6 – зона залегания камбия; 7 – сердцевинные лучи паренхимы; 8 – ксилема; 9 – перициклическая зона; 10 – вместилища схизогенного происхождения; 11 – идиобласты с друзами.в основной паренхиме коры. Пробка залегает по всей окружности корневища и состоит из 6-7 рядов светло-бурых мертвых утолщенных равномерно и слабо лигнифицированных тонкостенных клеток. При микроскопировании с поверхности видно, что клетки пробки плотно прилегают друг к другу и имеют 4-6 угольную слегка сглаженную форму Основная паренхима первичной коры неоднородна: от периферии к центру корня клетки её располагаются всё более рыхло. Клетки основной паренхимы крупные, со слегка утолщенными оболочками, округлой или овальной формы, заполнены крахмалом. Крахмальные зерна мелкие, простые, по форме округлые (раствор Люголя 3%). В толще коровой паренхимы встречаются вместилища схизогенного происхождения, вытянутые на продольном срезе и содержащие капельки 190 секрета от лимонно-желтого до красно-коричневого цвета. В отдельных клетках коровой паренхимы содержатся крупные друзы оксалата кальция. Проводящая система корневища непучкового типа: камбий залегает сплошным кольцом параллельно поверхности корневища. Проводящие ткани разделены широкими сердцевинными лучами основной паренхимы и упорядоченно чередуются с ними. Клетки основной паренхимы заполнены крахмальными зернами. Сосуды древесины залегают группами, лигнифицированы (раствор сернокислого анилина 5%). На продольном срезе различимы два типа сосудов – густо-спиральные и относительно мелких, лестнично-пористые. Флоэма состоит из тонкостенных клеток. Сердцевина корневища выполнена основной тканью из тонкостенных округлых клеток, содержащих крахмал и друзы оксалата кальция. На поперечном срезе главного корня хорошо различимы два блока, соизмеримые по размеру – древесина и вторичная кора (рис. 2). Флоэма и ксилема разделены камбиальной зоной, которая проходит примерно через середину радиуса корня и иногда не просматривается. В центре корня есть нечетко диагностируемые остатки первичной ксилемы в виде двух лучей. К периферии от первичной ксилемы отходят крупноклеточные первичные радиальные лучи паренхимной ткани. Между ними, по обе стороны от первичной ксилемы, находится вторичная ксилема, пересеченная многочисленными вторичными радиальными лучами основной паренхимы. Основная масса ксилемы состоит из тонкостенных паренхимных клеток, содержащих крахмальные зерна. Сосуды четкими радиальными прерывистыми лучами отходят от центра и видны как вкрапления в толщу крахмалоносной паренхимы. Сосуды имеют утолщенные одревесневшие стенки (реакция с раствором сернокислого анилина) и расположены поодиночке или собраны по три-шесть в группы. В паренхиме древесины изредка встречаются клетки, содержащие желтые пигменты (рис. 2). 191 5 Рисунок 2 – Поперечный срез главного корня женьшеня (× 40; микропрепарат осветлен раствором натрия гидроксида 10%) Обозначения: 1 – пробка; 2 – вместилище схизогенного характера; 3 – клетки паренхимы, содержащие друзы оксалата кальция; 4 – сердцевинный луч; выстилающие клетки канала; 5 – вторичная кора; 6 – камбиальная зона; 7 – паренхима, содержащая пигмент. Флоэма состоит главным образом из мелкоклеточных элементов. Паренхима луба неоднородна: в ней находятся хорошо заметные схизогенные вместилища, содержащие капельки секрета от светло-желтого до красно-коричневого цвета. Крахмальные зерна мелкие, округлые, простые. В отдельных клетках паренхимы содержатся друзы оксалата кальция. Наружная часть вторичной коры граничит с зоной из нескольких (46) рядов крупных тангентально вытянутых паренхимных клеток феллодермы, возникших вследствие деления клеток феллогена. Клетки феллодермы со слегка утолщенными оболочками, округлые или овальные. Корень покрыт перидермой. Клетки пробки живые (отчетливо просматриваются ядра), светло бурые тонкостенные и лигнифицированные (раствор сернокислого анилина), а не опробковевшие (отсутствие реакции с раствором судана III и 33% раствором натрия гидроксида). На поперечном срезе придаточного корня (рис. 3) в центре органа заметен луч сосудов первичной ксилемы – остаток диархного проводящего 192 пучка при первичном строении. Два сектора вторичной ксилемы разделены радиальными лучами основной паренхимы. Клетки паренхимы округлые или овальные, частично или полностью заполнены крахмальными зернами, как и клетки вторичной коры. Пробка слагается из 5-7 слоев прямоугольных, тонкостенных клеток. Клетки слабо лигнифицированы, как и клетки пробки главного корня (окраска с раствором сернокислого анилина). Рисунок 3 – Поперечный срез придаточного корня женьшеня (окраска – раствор Люголя 3% и раствор сернокислого анилина 5%): А – общий вид (× 100); Б – клетки пробки (× 400); В – сосуды ксилемы (× 400); Г – клетки паренхимы коры, заполненные крахмалом (× 400) Обозначения: 1 – клетки пробки; 2 – крахмальные зерна; 3 – полость вместилища; 4 – паренхима первичной коры; 5 – вторичная кора; 6 – сосуды вторичной ксилемы; 7 – сердцевинный луч; 8 – сосуды первичной ксилемы. И з м е л ь ч е н н о е с ы р ь е. При рассмотрении под микроскопом видны фрагменты поперечных и продольных срезов корневища, главного и придаточных корней. Элементы корневища (рис. 4) представлены клетками пробки, феллодермы, феллогена (А); паренхимой коры с крахмальными зернами, полостями вместилищ и выстилающими клетками (Б); секреторными каналами с каплями секрета (В); друзами оксалата кальция (Г); проводящими элементами древесины (Д) и сосудами (Е). 193 А 1 – клетки пробки; 2 – феллоген; 3 – клетки феллодермы. Б 1 – клетки паренхимы коры, заполненные крахмальными зернами; 2 – полость вместилища; 3 – клетки, образующие стенки вместилища. Г 1 – друзы оксалата кальция. В 1 – секреторный канал; 2 – капля секрета. Д Е Окраска – раствор 1 – сосуды древесины. сернокислого анилина 5%): 1 – проводящие элементы древесины с одревесневшими стенками. Рисунок 4 – Фрагменты поперечного и продольных срезов корневища (× 400). Элементы главного корня (рис. 5, 6) представлены лучами и сосудами ксилемы, заполняющими клетками паренхимы сердцевинных лучей с крахмальными зернами, полостями канала и выстилающими клетками, клетками паренхимы с пигментами, клетками камбия. 194 Рисунок 5 – Фрагменты поперечного среза главного корня женьшеня (А-В – 5% раствор сернокислого анилина; Г – раствор 3% Люголя): А – лучи ксилемы (× 40); Б – сосуды ксилемы (× 400); В – ксилема (× 100); Г – фрагмент паренхимы сердцевинных лучей (× 400). Обозначения: 1 – клетки вторичной ксилемы; 2 – друзы оксалата кальция; 3 – первичная ксилема; 4 – первичный луч; 5 – вторичный луч; 6 – крахмальные зерна. Рисунок 6 – Фрагменты поперечного среза главного корня женьшеня (× 400): А – клетки пробки ( окраска – 5% раствор сернокислого анилина); Б – секреторный канал (10% раствор натрия гидроксида); В – фрагмент паренхимы древесины; Г – зона залегания камбия. Обозначения: 1 – клетки пробки с частично одревесневшими клетками; 3 – ядра живых клеток пробки; 2 – феллоген; 4 – феллодерма; 5 – выстилающие клетки канала; 6 – полость канала; 7 – крахмальные зерна; 8 – паренхима, содержащая пигмент; 9 – камбий. Элементы придаточного корня (рис. 3) представлены клетками пробки, паренхимой с крахмальными зернами, вместилищами, вторичной корой, сосудами, сердцевинными лучами. первичной и 195 П о р о ш о к. При рассмотрении микропрепаратов порошка под микроскопом видны обрывки эпидермиса, пробки, древесины, паренхимы (рис. 7). А В Б Д Г Рисунок 7 – Фрагменты порошка (× 100) (А-В – микропрепарат осветлен раствором натрия гидроксида 10%; Г - 5% раствор сернокислого анилина; Д – раствор 70% серной кислоты): А – клетки паренхимы сердцевинного луча; Б – проводящие элементы с содержимым; В – сосуды древесины; Г – клетки пробки; Д – клетки паренхимы. Качественные реакции. 1. На линию старта пластинки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» микропипеткой 0,02 мл раствора А (извлечения из сырья) и 0,05 мл раствора А рабочего стандартного образца (РСО) гинзенозида Rg1 в виде пятен диаметром 5 мм (см. раздел "Количественное определение"). Пластинку с нанесенной пробой помещают в вертикальную камеру, которую предварительно насыщают не менее 24 ч смесью растворителей: хлороформ метиловый спирт - вода (26:14:3), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей проходит около 9 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин. Хроматограмму опрыскивают 196 раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и нагревают на плитке 3 мин при 100-105 оС. На хроматограмме должно обнаруживаться не менее 6 пурпурно-красных пятен с Rf от 0,10 до 0,50; при этом доминирующим является пятно на уровне пятна РСО гинзенозида Rg1 с величиной Rf около 0,3. Допускается наличие других пятен. Примечания: 1. Подготовка пластинок. Пластинки “Сорбфил ПТСХ-АФ-АУФ” (ТУ 26-11-17-89) разрезают поперек линий накатки соответственно на 2 части 10 5 см и перед использованием активируют в сушильном шкафу при 110 ОС в течение 1 ч. 2. Приготовление раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты. 20 г фосфорно-вольфрамовой кислоты (ГФ XII, стр. 404) растворяют в 100 мл спирта 95 % при легком нагревании на водяной бане. Проверка 3. пригодности хроматографической Хроматографическая система считается пригодной, если системы. выполняются следующие условия: на хроматограмме извлечения из корневищ с корнями женьшеня Rf основных пятен (гинзенозиды) раствора должно быть от 0,10 до 0,50. 2. При нанесении на порошок корневищ с корнями женьшеня капли концентрированной серной кислоты через 1-2 мин появляется кирпичнокрасное окрашивание, переходящее в красно-фиолетовое (гинзенозиды). 3. Спектр раствора В (см. раздел "Количественное определение") имеет максимум поглощения при длине волны 320 2 нм, 390 2 нм и 526 2 нм (сапонины). Раствором сравнения является спирт этиловый 96 %. 4. Вкус водного извлечения из цельного, измельченного сырья и порошка – пряно-горьковатый. Числовые показатели. Цельное сырье. Суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 и абсолютно сухое сырье не менее 2,0%; потери в массе при высушивании не более 13%; золы общей не более 5,0%; золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной не более 2,0%; корней и корневищ, 197 потемневших и побуревших с поверхности не более 10,0%; органических примесей не более 0,5%; минеральной примеси не более 1,0%. Измельченное сырье. Суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 и абсолютно сухое сырье не менее 2,0%; потери в массе при высушивании не более 13%; золы общей не более 5,0%; золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной не более 2,0%; корней и корневищ, потемневших и побуревших с поверхности не более 10,0%; органических примесей не более 0,5%; минеральной примеси не более 1,0%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм не более 10%; частиц, проходящих сквози сито с отверстиями диаметром 3,1 мм не более 10%. Порошок. Суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 и абсолютно сухое сырье не менее 2,0%; потери в массе при высушивании не более 13%; золы общей не более 5,0%; золы, нерастворимой в 10 % растворе кислоты хлористоводородной не более 2,0%; корней и корневищ, потемневших и побуревших с поверхности не более 10,0%; органических примесей не более 0,5%; минеральной примеси не более 1,0%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм не более 10%; частиц, проходящих сквози сито с отверстиями диаметром 0,25 мм не более 10%. Микробиологическая чистота. Категория 3 Б. В 1 г или 1 мл должно быть не более 104 аэробных бактерий, не более 102 грибов, не более 102 энтеробактерий и других грамотрицательных бактерий; отсутствие Escherichia coli, Salmonella и Staphylococcus aureus (ГФ XII ГФ РФ, часть 1, ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота»). Степень зараженности амбарными вредителями. В соответствии с ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб». Количественное определение. Около 1 г (точная навеска) воздушносухого сырья, измельченного до размера частиц проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 198 100 мл, прибавляют 30 мл 70% спирта этилового. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до 0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр («красная полоса»). Содержимое колбы тщательно перемешивают (раствор А). 5 мл раствора А упаривают на водяной бане досуха в фарфоровой чашке. После охлаждения сухой остаток растворяют в 5-6 мл воды очищенной, количественно переносят на слой полиамида высотой 1-1,5 см, сформированный на стеклянном фильтре, и элюируют 10-15 мл воды. Водный элюат отбрасывают. Затем элюируют 95% спиртом в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки и перемешивают (раствор Б). 1 мл раствора Б вносят в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора 70% серной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут (раствор В). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора В на спектрофотометре при длине волны 526 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% спирт. Содержание суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле: Х = D m0 30 10 6 1100 100 , где D0 m 5 1 25 6 100 W D – оптическая плотность испытуемого раствора (раствор В); D0 – оптическая плотность РСО гинзенозида Rg1; m – масса сырья, г; m0 – масса РСО гинзенозида Rg1, W - потеря в массе при высушивании сырья, %. При отсутствии стандартного образца гинзенозида Rg1 используют теоретическое значение удельного показателя поглощения – 25: 199 Х = D 30 10 6 100 D 14,4 100 = , где m 5 1 25 100 W m 100 W D – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса сырья, г; 1% 25 – удельный показатель поглощения ( E1см ) продукта взаимодействия гинзенозида Rg1 с раствором серной кислоты при 526 нм; W – потеря в массе при высушивании сырья, %. Примечания. 1. Приготовление раствора серной кислоты К 45 мл воды осторожно, при перемешивании, добавляют 60 мл серной кислоты концентрированной (ГФ XII, стр. 368). 2. Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО) гинзенозида Rg1. Около 0,03 г (точная навеска) гинзенозида Rg1 помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора 95% этиловым спиртом до метки, перемешивают (раствор А). Срок хранения 1 мес. 1 мл раствора А помещают в мерную колбу объемом 25 мл, прибавляют 5 мл 70% серной кислоты, нагревают в течение 10 мин. на кипящей водяной бане (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм. Раствором сравнения служит 95% этиловый спирт Раствор используют свежеприготовленным. Тяжелые металлы. В соответствии с XII ГФ РФ, часть 1, ОФС 42-005907 «Тяжелые металлы». Упаковка. В соответствии с ГОСТ 6077-80 и ГОСТ 17768-90 в тканевые мешки по ГОСТ 30090-93 не более 40 кг нетто. Транспортная тара в соответствии с ГОСТ 17768-90. Маркировка. В соответствии с ГОСТ 17768-90 и ГОСТ 6077-80 со следующим дополнением: указывают массу при потери в массе при высушивании 12 %, условия хранения, регистрационный номер, штрих-код, соответствие продукции требованиям ВДУ ГН 2.6.005-93 по содержанию радионуклидов. Маркировка транспортной тары в соответствии с ГОСТ 14192-77. 200 Транспортирование. В соответствии с ГОСТ 17768-90 и ГОСТ 6077-80. Хранение. В соответствии с ГОСТ 6077-80 и ГФ XI, вып. 1, с. 296. Срок годности. 2 года 6 месяцев. Фармакологическая группа. Общетонизирующее, адаптогенное средство. Назначение. Сырье для получения настойки корней женьшеня, других моно- и комплексных препаратов женьшеня. Примечание. Реактивы и методики определения числовых показателей, приведенные в настоящей фармакопейной статье, описаны в соответствующих разделах Государственной фармакопеи СССР ХI издания, вып. 1, 2; XII Государственной фармакопеи РФ, часть 1. Ректор ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, Академик РАМН, Лауреат Государственной премии РФ и дважды лауреат премии Правительства РФ заслуженный деятель науки РФ, профессор Г.П. Котельников «___» ______________ 2014 г. Зав. кафедрой фармакогнозиис ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, профессор В.А. Куркин «___» ______________ 2014 г. Аспирант кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России А.С. Акушская «___» _____________ 2014 г. 201 Приложение 10 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ Директор Центра фармакопеи и международного сотрудничества ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», доктор фармацевтических наук, профессор Е.И. САКАНЯН «___» 20___ г. . СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ ПРЕДПРИЯТИЯ Заявитель: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Разработчик: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Женьшеня настойка ФС 42Ginseng tinctura Взамен ФС 42-1886-82 Срок введения установлен c “__” ________________г. до “__” _______________г. Настоящая фармакопейная статья распространяется на настойку корней женьшеня, в состав которой входят корни женьшеня настоящего – Panax ginseng C.A.Meyer. (семейство Араливые – Araliacee) и спирт этиловый 70%. ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ ПЕРЕПЕЧАТКА ВОСПРЕЩЕНА 202 Спецификация лекарственного растительного средства «Женьшеня настойка» № Показатель п/п качества 1. Описание 2. Качественные реакции 3. Количественное определение (спектрофотометри я) Тяжелые металлы Спирт 4. 5. 6. 7. Сухой остаток Микробиологическ ая чистота 8. Номинальный объем Упаковка 9. Методы Нормы Визуальная оценка на Прозрачная жидкость соответствие требованиям ГФ желтого цвета со XI, вып. 2, стр. 148-149. специфическим запахом, горьковатого вкуса. 1. Тонкослойная 1. Не менее 6 пурпурнохроматография (ТСХкрасных пятен с Rf от анализ); система 0,10 до 0,50, в том числе растворителей: хлороформпятно с Rf около 0,4 (РСО метиловый спирт-вода гинзенозида Rg1) после (26:14:3); опрыскивания 20% 2. Спектроскопия в УФ и спиртовым раствором видимой области спектра. фосфорно-вольфрамовой кислоты; 2. Спектр раствора В (см. раздел "Количественное определение") имеет максимумы поглощения 320 2 нм, 390 2 нм и 526 2 нм (сапонины). Числовые показатели Спектроскопия в УФ и Содержание суммы видимой области спектра. сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 не менее 0,5%. ГФ XI, вып. 2, стр. 149. Не более 0,001% XII ГФ РФ, часть 1, ОФС 42- Не менее 65% 0039-07 «Определение спирта этилового в жидких фармацевтических препаратах», стр. 49. ГФ XI, вып. 2, стр. 149. Не менее 1,5 % XII ГФ РФ, часть 1, ОФС 42- Категория 3Б 0067-07 «Микробиологическая чистота», стр. 160. ОСТ 64-492-85 25 мл (±5%). По 25 мл во флаконы ФВ-30-20-ОС-1 и ФВ-50-20-ОС-1 по ОСТ 64-2-71-80, укупоренные полиэтиленовыми пробками типа 3.1-20 или 3.2-20 и навинчиваемыми пластмассовыми крышками типа 1.1-20 по ОСТ 64-2-81 или по 25 мл во флаконы-капельницы по ТУ 64-2-208-79, укупоренные 203 пробками-капельницами и крышками навинчиваемыми по ТУ 64-2-64-2-81. Каждый флакон вместе с инструкцией по применению упаковывают в коробку из картона коробочного типа хром-эрзац или марки А по ГОСТ 7933-89. На флаконы и коробки наклеивают этикетки из бумаги этикеточной по ГОСТ 7625-86 или бумаги писчей по ГОСТ 18510-87. Групповая и транспортная упаковка в соответствии с ГОСТ 17768-90 и РД 9301-0015-05749470-97. Маркировка упаковочного листа в соответствии с ГОСТ 10. Маркировка 17768-90. Маркировка транспортной тары в соответствии с ГОСТ 14192-96. 11. Транспортирование В соответствии с ГОСТ 17768-90 Радиационный контроль. В соответствии с ВДУ ГН 12. Содержание радионуклидов 2.6.005-93. В прохладном, защищенном 13. Условия хранения от света месте. В недоступном для детей месте. 3 года 14. Срок годности Общетонизирующее 15. Фармакологическая группа средство растительного происхождения. Состав. Для приготовления 1000 мл настойки необходимо: Женьшеня корневищ с корнями (ФС 66, ГФ XI, с. 348) – 200 г; Спирта этилового 70% (ФС 42-3071-00) – достаточное количество до получения 1 л настойки. Описание. Прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом, горьковатого вкуса. Качественные реакции. 1. На линию старта пластинки «Сорбфил микропипеткой 0,02 мл настойки и 0,05 мл – ПТСХ-АФ-А-УФ» раствора А рабочего стандартного образца (РСО) гинзенозида Rg1 в виде пятен диаметром 5 мм. Пластинку с нанесенной пробой помещают в вертикальную камеру, которую предварительно насыщают не менее 24 ч смесью растворителей: хлороформ метанол - вода (26:14:3), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей проходит около 9 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин. Хроматограмму опрыскивают 204 раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и нагревают на плитке 3 мин при 100-105 оС. На хроматограмме обнаруживается не менее 6 пурпурнокрасных пятен с Rf от 0,1 до 0,45; при этом доминирующим является пятно на уровне пятна РСО гинзенозида Rg1 с величиной Rf около 0,3. Допускается наличие других пятен. Примечания: 1. Подготовка пластинок. Пластинки “Сорбфил ПТСХ-АФ-АУФ” (ТУ 26-11-17-89) разрезают поперек линий накатки соответственно на 2 части 10 5 см и перед использованием активируют в сушильном шкафу при 110 ОС в течение 1 ч. 2. Приготовление раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты. 20 г фосфорно-вольфрамовой кислоты (ГФ XII, стр. 404) растворяют в 100 мл спирта 95 % при легком нагревании на водяной бане. 3. Проверка пригодности хроматографической Хроматографическая система считается пригодной, если системы. выполняются следующие условия: на хроматограмме извлечения из корневищ с корнями женьшеня Rf основных пятен (гинзенозиды) раствора должно быть от 0,10 до 0,50. 4. Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО) гинзенозида Rg1. Около 0,03 г (точная навеска) гинзенозида Rg1 помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора 95% этиловым спиртом до метки, перемешивают (раствор А). Срок хранения 1 мес. 1 мл раствора А помещают в мерную колбу объемом 25 мл, прибавляют 5 мл 70% серной кислоты, нагревают в течение 10 мин. на кипящей водяной бане (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм. Раствором сравнения служит 95% этиловый спирт Раствор используют свежеприготовленным. 2. Спектр раствора Б (см. раздел "Количественное определение") имеет максимум поглощения при длине волны 320 2 нм, 390 2 нм и 526 2 нм (сапонины). Раствором сравнения является спирт этиловый 96 %. 205 Количественное определение. 1 мл настойки упаривают на водяной бане досуха в фарфоровой чашке. После охлаждения сухой остаток растворяют в 2-3 мл воды, количественно переносят на слой полиамида высотой 1-1,5 см, сформированный на стеклянном фильтре, и элюируют 10-15 мл воды. Водный элюат отбрасывают. Затем элюируют 95% спиртом в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл испытуемого раствора А вносят в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора 70% серной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 526 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% этиловый спирт. Содержание суммы сапонинов (Х) в пересчете на гинзенозид Rg1 в процентах вычисляют по формуле: Х = D m0 10 6 1100 , D0 11 25 6 где D – оптическая плотность испытуемого раствора; D0 – оптическая плотность РСО гинзенозида Rg1; m0 – масса РСО гинзенозида Rg1. При отсутствии стандартного образца гинзенозида Rg1 целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 25: Х = D 10 6 , 1 1 25 где D – оптическая плотность испытуемого раствора; 25 – удельный 1% показатель поглощения ( E1см ) продукта взаимодействия гинзенозида Rg1 с раствором серной кислоты при 526 нм. Примечание: 1. Приготовление раствора 70% серной кислоты. К 45 мл воды осторожно, при перемешивании, добавляют 60 мл серной кислоты концентрированной (ГФ XII, стр. 368). Тяжелые металлы. Не более 0,001% (По ГФ XI, вып. 2, стр. 149). 206 Спирт. Не менее 65% (XII ГФ РФ, часть 1, ОФС 42-0039-07 «Определение спирта этилового в жидких фармацевтических препаратах», стр. 49). Сухой остаток. Не менее 1,5% (ГФ XI, вып. 2, с. 149). Микробиологическая чистота. Категория 3 Б. В 1 г или 1 мл должно быть не более 104 аэробных бактерий, не более 102 грибов, не более 102 энтеробактерий и других грамотрицательных бактерий; отсутствие Escherichia coli, Salmonella и Staphylococcus aureus (ГФ XII ГФ РФ, часть 1, ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота», стр. 160). Номинальный объем. Определение проводят согласно ОСТ 64-492-85 из 10 флаконов. Допустимые нормы отклонения для 1 флакона 25 мл (±5%); для 10 флаконов ± 0,9%. Упаковка. По 25 мл во флаконы ФВ-30-20-ОС-1 и ФВ-50-20-ОС-1 по ОСТ 64-2-71-80, укупоренные полиэтиленовыми пробками типа 3.1-20 или 3.2-20 и навинчиваемыми пластмассовыми крышками типа 1.1-20 по ОСТ 64-2-81 или по 25 мл во флаконы-капельницы по ТУ 64-2-208-79, укупоренные пробками-капельницами и крышками навинчиваемыми по ТУ 64-2-64-2-81. Каждый флакон вместе с инструкцией по применению упаковывают в коробку из картона коробочного типа хром-эрзац или марки А по ГОСТ 7933-89. На флаконы и коробки наклеивают этикетки из бумаги этикеточной по ГОСТ 7625-86 или бумаги писчей по ГОСТ 18510-87. Групповая и транспортная упаковка в соответствии с ГОСТ 17768-90 и РД 9301-0015-05749470-97. Маркировка. Маркировка упаковочного листа в соответствии с ГОСТ 17768-90. Маркировка транспортной тары в соответствии с ГОСТ 14192-96. Транспортирование. В соответствии с ГОСТ 17768-90. Содержание радионуклидов. В соответствии с ВДУ ГН 2.6.005-93. Условия хранения. В прохладном, защищенном от света месте. В недоступном для детей месте. 207 Срок годности. 3 года Фармакологическая группа. Общетонизирующее средство растительного происхождения. Ректор ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, Академик РАН, Лауреат Государственной премии РФ и дважды лауреат премии Правительства РФ, заслуженный деятель науки РФ, профессор Зав. кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, профессор Аспирант кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России Г.П. Котельников «___» ______________ 2014 г. В.А. Куркин «___» ______________ 2014 г. А.С. Акушская «___» _____________ 2014 г. 208 Приложение 11 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ Директор Центра фармакопеи и международного сотрудничества ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», доктор фармацевтических наук, профессор ________ Е.И. САКАНЯН «___» 20___ г. . СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ ПРЕДПРИЯТИЯ Производитель: КФХ питомник «Женьшень» (с. Солнечная поляна, Самарская область) Заявитель: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Разработчик: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Женьшеня сироп Ginseng sirupus ФС 42-…………… Срок введения установлен c “__” ________________г. до “__” _______________г. Настоящая фармакопейная статья распространяется на сироп корней женьшеня, в состав которого входят корни женьшеня настоящего – Panax ginseng C.A.Meyer. (семейство Араливые – Araliacee), сахароза или фруктоза или сорбит, и спирт этиловый 40%. ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ ПЕРЕПЕЧАТКА ВОСПРЕЩЕНА 209 Спецификация лекарственного растительного средства «Женьшеня сироп» № п/п 1. Показатель качества 4. 5. Количественное определение (спектрофотометр ия) Тяжелые металлы Спирт 6. Микробиологичес кая чистота 7. Номинальный объем Упаковка 8. Нормы Визуальная оценка на Прозрачная густоватая соответствие требованиям ГФ жидкость светло-желтого XI, вып. 2, стр. 150-151 цвета со слабым специфическим запахом и сладким (слегка холодящим – у сиропа на сорбите) вкусом 1. Тонкослойная 1. Не менее 6 пурпурнохроматография (ТСХкрасных пятен с Rf от 0,10 анализ); система до 0,50, в том числе пятно растворителей: хлороформс Rf около 0,4 (РСО метиловый спирт-вода гинзенозида Rg1) после (26:14:3); опрыскивания 20% 2. Спектроскопия в УФ и спиртовым раствором видимой области спектра. фосфорно-вольфрамовой кислоты; 2. Спектр раствора Б (см. раздел "Количественное определение") имеет максимумы поглощения 320 2 нм, 390 2 нм и 526 2 нм (сапонины). 2. 3. Методы Спектроскопия в УФ видимой области спектра. и Содержание суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1 не менее 0,04%. ГФ XI, вып. 2, стр. 149. XII ГФ РФ, часть 1, ОФС 420039-07 «Определение спирта этилового в жидких фармацевтических препаратах», стр. 49. XII ГФ РФ, часть 1, ОФС 420067-07 «Микробиологическая чистота», стр. 160. ОСТ 64-492-85 По 100,0 г во флаконы ФВ100-20-ОС-1 по ОСТ 64-2-7180, укупоренные полиэтиленовыми пробками типа 3.1-20 или 3.2-20 и навинчиваемыми пластмассовыми крышками типа 1.1-20 по ОСТ 64-2-81. Каждый флакон вместе с Не более 0,001% Не менее 4% и не более 5% Категория 3Б 100,0 г (±2%). 210 9. 10. 11. 12. 13. 14. инструкцией по применению упаковывают в коробку из картона коробочного типа хром-эрзац или марки А по ГОСТ 7933-89. На флаконы и коробки наклеивают этикетки из бумаги этикеточной по ГОСТ 7625-86 или бумаги писчей по ГОСТ 18510-87. Групповая и транспортная упаковка в соответствии с ГОСТ 17769-90. Маркировка Маркировка упаковочного листа в соответствии с ГОСТ 17768-90. Маркировка транспортной тары в соответствии с ГОСТ 14192-96. Транспортировани В соответствии с ГОСТ 17768е 90 Содержание В соответствии с ВДУ ГН Радиационный контроль радионуклидов 2.6.005-93 Условия хранения В прохладном, защищенном от света месте Срок годности 2 года Фармакотерапевти Тонизирующее средство ческая группа Состав. Для приготовления 1000 г сиропа необходимо: Настойка женьшеня (проект ФС-42…) – 100 мл Сиропа сахарного (ГФ X, «Сиропы», стр. 215), сорбитного или фруктозного – достаточное количество до получения 1000 г сиропа Описание. Прозрачная густоватая жидкость светло-желтого цвета со слабым специфическим запахом и сладким (слегка холодящим – у сиропа на сорбите) вкусом. Должна соответствовать требованиям ГФ XI, вып. 2, с. 150. Качественные реакции. 1. На линию старта пластинки «Сорбфил – ПТСХ-АФ-А-УФ» микропипеткой 0,02 мл упаренного ацетонового извлечения из сиропа и 0,05 мл раствора А РСО гинзенозида Rg1 в виде пятен диаметром 5 мм. Пластинку с нанесенной пробой помещают в вертикальную камеру, которую 211 предварительно насыщают не менее 24 ч смесью растворителей: хлороформ метанол - вода (26:14:3), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей проходит около 9 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин. Хроматограмму опрыскивают раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и нагревают на плитке в течение 3 мин при 100-105 оС. На хроматограмме обнаруживается не менее 6 пурпурно-красных пятен с Rf от 0,10 до 0,50; при этом доминирующим является пятно на уровне пятна РСО гинзенозида Rg1 с величиной Rf около 0,3. Допускается наличие других пятен. Примечания: 1. Подготовка пластинок. Пластинки “Сорбфил ПТСХ-АФ-АУФ” (ТУ 26-11-17-89) разрезают поперек линий накатки соответственно на 2 части 10 5 см и перед использованием активируют в сушильном шкафу при 110 ОС в течение 1 ч. 2. Приготовление раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты. 20 г фосфорновольфрамовой кислоты (ГФ XII, стр. 404) растворяют в 100 мл спирта 95 % при легком нагревании на водяной бане. 3. Проверка пригодности хроматографической Хроматографическая система считается пригодной, если системы. выполняются следующие условия: на хроматограмме извлечения из корневищ с корнями женьшеня Rf основных пятен (гинзенозиды) раствора должно быть от 0,10 до 0,50. 4. Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО) гинзенозида Rg1. Около 0,03 г (точная навеска) гинзенозида Rg1 помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора 95% этиловым спиртом до метки, перемешивают (раствор А). Срок хранения 1 мес. 1 мл раствора А помещают в мерную колбу объемом 25 мл, прибавляют 5 мл 70% серной кислоты, нагревают в течение 10 мин. на кипящей водяной бане (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм. 212 Раствором сравнения служит 95% этиловый спирт Раствор используют свежеприготовленным. Спектр раствора Б (см. раздел "Количественное определение") 2. имеет максимум поглощения при длине волны 320 2 нм, 390 2 нм и 526 2 нм (сапонины). Раствором сравнения является спирт этиловый 96 %. Количественное определение. 10,0 г сиропа (точная навеска) экстрагируют тремя порциями ацетоном по 7-10 мл. Полученное ацетоновое извлечение упаривают на водяной бане досуха в фарфоровой чашке. После охлаждения сухой остаток растворяют в 2-3 мл воды, количественно переносят на слой полиамида высотой 1-1,5 см, сформированный на стеклянном фильтре, и элюируют 10-15 мл воды. Водный элюат отбрасывают. Затем элюируют 95% спиртом в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл испытуемого раствора А вносят в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора 70% серной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин (раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 526 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% этиловый спирт. Содержание суммы сапонинов (Х) в пересчете на гинзенозид Rg1 в процентах вычисляют по формуле: Х = D m0 10 6 1 100 , D0 m 1 25 6 где D – оптическая плотность испытуемого раствора; D0 – оптическая плотность РСО гинзенозида Rg1; m – масса навески сиропа, г; m0 – масса РСО гинзенозида Rg1, г. При отсутствии стандартного образца гинзенозида Rg1 используют теоретическое значение удельного показателя поглощения – 25: Х = D 10 6 , m 1 25 213 где D – оптическая плотность испытуемого раствора; 25 – удельный 1% показатель поглощения ( E1см ) продукта взаимодействия гинзенозида Rg1 с раствором серной кислоты при 526 нм. Примечание: 1. Приготовление раствора 70% серной кислоты. К 45 мл воды осторожно, при перемешивании, добавляют 60 мл серной кислоты концентрированной (ГФ XII, стр. 368). Тяжелые металлы. Не более 0,001% (По ГФ XI, вып. 2, стр. 149). Спирт. Не менее 4% и не более 5% (XII ГФ РФ, часть 1, ОФС 42-0039-07 «Определение спирта этилового в жидких фармацевтических препаратах», стр. 49). Микробиологическая чистота. Категория 3 Б. В 1 г или 1 мл должно быть не более 104 аэробных бактерий, не более 102 грибов, не более 102 энтеробактерий и других грамотрицательных бактерий; отсутствие Escherichia coli, Salmonella и Staphylococcus aureus (ГФ XII ГФ РФ, часть 1, ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота», стр. 160). Номинальный объем. Определение проводят согласно ОСТ 64-492-85 из 10 флаконов. Допустимые нормы отклонения для 1 флакона 100,0 мл (±2%); для 10 флаконов ±0,9%. Упаковка. По 100 мл во флаконы ФВ-30-20-ОС-1 и ФВ-50-20-ОС-1 по ОСТ 64-2-71-80, укупоренные полиэтиленовыми пробками типа 3.1-20 или 3.2-20 и навинчиваемыми пластмассовыми крышками типа 1.1-20 по ОСТ 642-81. Каждый флакон вместе с инструкцией по применению упаковывают в коробку из картона коробочного типа хром-эрзац или марки А по ГОСТ 7933-89. На флаконы и коробки наклеивают этикетки из бумаги этикеточной по ГОСТ 7625-86 или бумаги писчей по ГОСТ 18510-87. Групповая и транспортная упаковка в соответствии с ГОСТ 17768-90 и РД 9301-0015-05749470-97. Маркировка. Маркировка упаковочного листа в соответствии с ГОСТ 17768-90. Маркировка транспортной тары в соответствии с ГОСТ 14192-96. 214 Транспортирование. В соответствии с ГОСТ 17768-90. Содержание радионуклидов. В соответствии с ВДУ ГН 2.6.005-93. Условия хранения. В прохладном, защищенном от света месте. В недоступном для детей месте. Срок годности. 1,5 года. Фармакологическая группа. растительного происхождения. Общетонизирующее Ректор ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, Академик РАН, Лауреат Государственной премии РФ и дважды лауреат премии Правительства РФ, заслуженный деятель науки РФ, профессор Зав. кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, профессор Аспирант кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России средство Г.П. Котельников «___» ______________ 2014 г. В.А. Куркин «___» ______________ 2014 г. А.С. Акушская «___» _____________ 2014 г. 215 Приложение 12 216 Приложение 13 217 Приложение 14 218 Приложение 15
