Углеводы и термогенез у пчел Apis mellifera

*
Маршаков В.Г.
Углеводы и термогенез у пчел Apis mellifera
(Carbohydrates and thermogenesis of honeybee Apis mellifera)
Содержание
1. Метаболизм углеводов
2. Механизмы термогенеза
3. Эффекторы гликолиза
4. Мощность субстратного цикла и возможные причины его появления
5. Аргининкиназа и скорость оборота ATP в мышцах
6. Литература
1. Метаболизм углеводов
Среди всех животных насекомые в полете достигают самых высоких метаболических
показателей относительно массы тела, превышающие аналогичные показатели, например
для птиц, в 50-100 раз. Летные мышцы насекомых состоят исключительно из
фибриллярной ткани и потребляют более 90% кислорода поступающего в организм в
полете. Значения дыхательного коэффициента RQ  VCO2 /VO2 наиболее близки к
единице при низкой активности ферментов участвующих в окислении жирных кислот
(Rothe, Nachtigall, 1989), что указывает на углеводы как главное окисляемое топливо,
используемое во время полета у пчел (Crabtree, Newsholme, 1972a).
Гемолимфа пчел содержит трегалозу, глюкозу и фруктозу (Woodring et al., 1994) и,
очевидно, они в первую очередь используются в полете пчелами (Gmeinbauer, Crailsheim,
1993). Содержание трегалозы в гемолимфе пчел колеблется в пределах 2-40 mg ml 1
(Bounias, Morgan, 1984; Bozic, Woodring, 1997), а глюкозы и фруктозы в пределах 2-16
mg ml 1 (Fell, 1990; Leta et al., 1996), или на особь по 0,03-0,56 и 0,03-0,22 мг
соответственно.
Высокая активность трегалазы (Lefebvre, Huber, 1970), гексокиназы и глицеролфосфат
дегидрогеназы (Crabtree, Newsholme, 1972), ферментов участвующих в гидролизе
трегалозы, фосфорилировании глюкозы, поддержании баланса NAD / NADH в процессе
аэробного гликолиза соответственно, поддерживают мнение, что окисление именно этих
сахаров обеспечивает энергию для полета (Suarez et al., 1996).
Blatt, Roces (2001) в прекрасной экспериментальной работе по определению сахаров в
гемолимфе пчел и скорости метаболизма, справедливо отмечают, что в исследованиях
других авторов по этому вопросу наблюдается огромный разброс и противоречивость
результатов. Это определяется различными экспериментальными условиями, влияющими
на поведение объекта исследований, а также неоднозначным исходным состоянием
самого объекта.
Таблица 1. Скорость выделения углекислого газа, содержание глюкозы, фруктозы и трегалозы в
гемолимфе пчел в зависимости от потребления раствора сахарозы разной концентрации и
температуры воздуха (по данным Blatt, Roces, 2001 с изменениями: в круглых скобках исходные
данные, остальные рассчитаны автором)
о
Температура воздуха, С
10
15
20
25
30
35
39
(9,58)
(8,28)
(6,97)
(5,66)
(4,36)
(3,06)
(2,01)

V CO2 (ml h 1 на особь)
(независимо от концентрации
сахара в растворе)
1
Расход глюкозы, обеспечивающий
данный уровень метаболизма
(mg min 1 на особь)
0,207
0,175
0,145
0,115
0,088
0,061
0,039
Расход глюкозы на основной метаболизм (mg на особь) за период времени:
15 минут
2,62
2,17
1,72
1,32
3,11
0,92
0,58
30 минут
6,22
5,24
4,34
3,44
2,64
1,84
1,16
60 минут
10,48
12,44
8,68
6,88
5,28
3,68
2,32
Максимальное количество сахарозы (в пересчете на глюкозу и фруктозу) проходящее через проветрикулюс
(максимальная скорость транспорта раствора равна 48 l h - Roces, Blatt, 1999) в среднюю кишку за
период времени:
15 минут (15% раствор)
0,95 mg или 5,3 mol
30 минут (30% раствор)
4,06 mg или 22,5 mol
1
14,75 mg или 81,9 mol
Содержание глюкозы (или фруктозы) после инвертации в 0,030 мл:
15% раствора сахарозы
2,38 mg или 13,2 mol
60 минут (50% раствор)
30% раствора сахарозы
50% раствора сахарозы
mol
9,2 mg или 51,1 mol
5,07 mg или 28,2
Содержание глюкозы (мг) в гемолимфе особи (объем гемолимфы пчелы массой 78 mg составляет 0,014 ml:
по Crailsheim, 1985; Wolf et al., 1996) при потреблении 0,030 мл:
15% раствора сахарозы
0,113
0,112
0,112
0,111
0,110
0,110
0,110
30% раствора сахарозы
0,17
0,15
0,14
0,12
0,10
0,09
0,07
50% раствора сахарозы
0,19
0,17
0,15
0,13
0,11
0,09
0,21
Содержание фруктозы (мг) в гемолимфе особи при потреблении 0,030 мл:
15% раствора сахарозы
0,164
0,163
0,162
0,160
0,159
0,157
0,156
30% раствора сахарозы
0,25
0,22
0,19
0,16
0,13
0,10
0,08
50% раствора сахарозы
0,22
0,19
0,16
0,13
0,10
0,08
0,24
Содержание трегалозы (мг) в гемолимфе особи при потреблении 0,030 мл:
15% раствора сахарозы
0,07
0,13
0,19
0,25
0,40
0,42
0,42
30% раствора сахарозы
0,20
0,26
0,31
0,36
0,52
0,51
0,51
50% раствора сахарозы
0,29
0,41
0,55
0,58
0,61
0,23
0,35
Суммарное содержание глюкозы, фруктозы, трегалозы (мг) в гемолимфе особи при потреблении 0,030 мл:
15% раствора сахарозы
0,35
0,41
0,47
0,52
0,68
0,68
0,69
30% раствора сахарозы
0,62
0,63
0,64
0,65
0,76
0,70
0,66
50% раствора сахарозы
0,68
0,69
0,70
0,71
0,81
0,78
0,76
*
Работа Blatt, Roces (2001) отличается четкой методикой опытов и выровненным
биологическим материалом. Используя экспериментальные результаты Blatt, Roces (2001),
рассчитано содержание основных метаболитов в гемолимфе и их изменение в организме
пчелы при понижении температуры окружающего воздуха (таблица 1), и представлено в
форме более удобной для анализа процессов метаболизма. Видна четкая обратная
зависимость между температурой и скоростью метаболизма. При сравнении скорости
транспорта раствора сахарозы через провентрикулюс и содержанием глюкозы в растворе,
можно сделать вывод, что в случае 15% раствора за 15 минут из 2,38 мг глюкозы в
гемолимфу попадет только 0,95 мг, что способно поддерживать необходимый уровень
гликолиза лишь в интервале температур от 33 до 39 оС . В случае 30% раствора за 30
минут из 5,07 мг в гемолимфу попадет 4,06 мг, но и этого количества недостаточно для
поддержания скорости гликолиза при температуре ниже 22 оС . При кормлении пчел 50%
раствором планка опускается до 18 оС . За счет каких ресурсов поддерживается
необходимый уровень метаболизма при температуре ниже 18 оС , например, при 10 оС ?
Метаболизм углеводов можно представить в виде подвижного баланса между
необходимыми затратами, скоростью поступления метаболитов из кишечника и их
запасами в гемолимфе, в мышцах и жировом теле. Самый короткий и быстрый путь –
использование гликогена мышечной ткани, но его запасы весьма ограничены. Другой путь
2
– это использование глюкозы поступающей в гемолимфу из пищевого субстрата и далее в
саркоплазму мышечных клеток. Третий путь – использование трегалозы. Неизвестно, как
трегалоза попадает в саркоплазму (Becker et al., 1996), неизвестно где происходит ее
гидролиз до глюкозы, поскольку по одним данным фермент трегалаза на 92-95%
локализован с наружной стороны внутренней мембраны митохондрий и частично с
наружной стороны внешней мембраны в мышцах асинхронного типа с редуцированным
эндоплазматическим ретикулюмом (Brandt, Huber, 1979a), по другим имеет и свободную
форму в гемолимфе (Lee et al., 2001). Прямое разрушение мембран митохондрий не
приводило к активации трегалазы у пчел (Brandt et al., 1979). И, наконец, еще один путь использование гликогена и триацилглицеролов жирового тела.
Метаболизм углеводов в жировом теле может осуществляться по нескольким
направлениям, и выбор какого-нибудь одного из них зависит от ежечасно и даже
ежеминутно меняющихся «спроса и предложения» в подвижном балансе затрат:
1) глюкоза > глюкозо-6-фосфат > UDP-глюкоза > гликоген;
2) гликоген > глюкозо-1-фосфат > глюкозо-6-фосфат > UDP-глюкоза > трегалоза;
3) гликоген > глюкозо-1-фосфат > глюкозо-6-фосфат > глюкоза;
4) фруктоза > фруктозо-6-фосфат > глюкозо-6-фосфат > UDP-глюкоза > трегалоза;
5) фруктоза > фруктозо-1-фосфат > диоксиацетонфосфат + глицеральдегид >
> глицерол-3-фосфат > триацилглицеролы;
6) фруктоза > фруктозо-6-фосфат > глюкозо-6-фосфат > пируват > ацетил-СоА >
> малонил-СоА > триацилглицеролы.
Триацилглицеролы, в свою очередь, используются в метаболизме мышечных клеток при
недостатке углеводного топлива (Candy et al., 1997) по схеме: Триацилглицерол (жировое
тело) > жирная кислота + диацилглицерол (переходит в гемолимфу и далее в летные
мышцы) > жирные кислоты (окисляются в мышечных клетках до углекислого газа и воды)
+ глицерол (переходит через гемолимфу обратно в жировое тело и участвует в синтезе
триацилглицеролов).
Рассмотрим ситуацию при скармливании пчелам 50% раствора сахарозы и внешней
температуре, при которой проводился опыт, равной 10 оС (табл. 1). На обеспечение
необходимого уровня метаболизма по выделению углекислого газа требуется 12,44 мг
углеводов в расчете на глюкозу. Поступило в гемолимфу за период опыта 9,2 мг глюкозы
при повышении ее содержания в гемолимфе на 0,12 мг и снижении содержания трегалозы
на 0,38 мг, то есть дефицит составил 2,98 мг (12,44+0,12-9,2-0,38). Но остаток фруктозы
может обеспечить синтез 8,68 мг трегалозы, что с учетом поступившей глюкозы
превышает расход почти в 1,5 раза. Тем не менее, содержание трегалозы в гемолимфе
снизилось почти на 60%. Однако в абсолютном значении снижение содержания трегалозы
в гемолимфе составляет всего 3% (0,38/12,44) расхода метаболитов и связано, скорее
всего, с восполнением мышечного гликогена, используемого в метаболизме в первую
очередь. Это можно объяснить также тем, что синтез трегалозы из фруктозы в жировом
теле более длительный процесс. К тому же часть фруктозы используется в синтезе
глицерола. То есть действует система, регулирующая направления синтетических
процессов в жировом теле в зависимости от потребностей метаболизма (Beenakkers et al.,
1984).
Теперь рассмотрим ситуацию, возникшую при скармливании пчелам 15% раствора
сахарозы и внешней температуре, при которой проводился опыт, равной 10 оС (табл. 1).
На обеспечение необходимого уровня метаболизма по выделению углекислого газа
требуется 3,11 мг углеводов в расчете на глюкозу. Поступило в гемолимфу, исходя из
максимальной скорости транспорта раствора через провентрикулюс, за период опыта 0,95
мг глюкозы из 2,38 мг содержавшихся в растворе. Еще столько же может дать фруктоза за
счет синтеза трегалозы, но все вместе не обеспечивает необходимого расхода глюкозы,
несмотря на падение содержания трегалозы в гемолимфе почти на 85%. Недостающее
количество глюкозы в энергетическом плане может восполнить окисление жирных
3
кислот. Следовательно, в основном обмене у пчел при недостатке углеводов
подключаются жирные кислоты и дыхательный коэффициент в этом случае ниже
единицы. Но поскольку в указанных опытах дыхательный коэффициент a priori был
принят равным единице, определение потребления кислорода не проводилось.
Blatt, Roces (2001) сделали вывод, что снижение уровня трегалозы в гемолимфе
свидетельствует о недостаточной скорости синтеза трегалозы из глюкозы в жировом теле
для обеспечения метаболизма выше 4,5 ml CO2 в час на особь. Из этого следует, что в
метаболизме используется только глюкоза, полученная из трегалозы, синтезированной в
свою очередь из глюкозы в жировом теле. То есть используется энергетически затратный
путь метаболизма. Так ли это? При том, что роль фруктозы никак не комментируется.
Рассмотрим ситуацию, возникшую при скармливании пчелам 50% раствора сахарозы и
внешней температуре, при которой проводился опыт, равной 20 оС (табл. 1). На
обеспечение необходимого уровня метаболизма по выделению углекислого газа требуется
8,68 мг углеводов в расчете на глюкозу. Поступило в гемолимфу, исходя из максимальной
скорости транспорта раствора через провентрикулюс, за период опыта все 9,2 мг глюкозы
содержавшейся в растворе, что полностью обеспечивает необходимый уровень
метаболизма. Наблюдаемое снижение содержания трегалозы в гемолимфе не связано с
обеспечением уровня метаболизма выше 4,5 ml CO2 в час на особь. По-видимому, имеют
место два противоположно направленных процесса протекающих с разной скоростью.
Один связан с восполнением запасов мышечного гликогена с использованием трегалозы
гемолимфы, другой связан с синтезом трегалозы и триацилглицеролов в жировом теле из
фруктозы.
При более интенсивных нагрузках, например в полете, расход метаболитов возрастает,
но схема не меняется. Так, уровень трегалозы в груди у пчел существенно не менялся
первые 2-4 минуты полета, а содержание глюкозы резко понижалось уже первые 15
секунд полета (Brandt, Huber, 1979). У пчел вылетающих из улья с достаточным запасом
меда в зобике, снижение содержания трегалозы и глюкозы в гемолимфе наблюдалось
лишь через 15-60 минут работы. Но при отсутствии меда в зобике содержание глюкозы и
трегалозы снижалось на 50% за 30 мин. При поступлении углеводов в зобик уровень
трегалозы и глюкозы в гемолимфе восстанавливался в течение 10 минут (Woodring et al.,
1993), по другим данным - 2-5 минут (Crailsheim, 1985).
Следует обратить внимание на низкую активность гликоген фосфорилазы в летных
мышцах пчел, что свидетельствует против значительного использования гликогена как
окисляемого топлива. В то же время у мух активность фосфорилазы в грудных мышцах в
12-15 раз выше, чем у пчел, ос и шмелей (Crabtree, Newsholme, 1972). Это возможно при
значительных запасах гликогена в груди. Действительно, у мухи Phormia regina Meigen
(Calliphoridae), значительную долю углеводного питания которой составляет нектар
цветов, содержание гликогена в грудном отделе в 6 раз выше, чем трегалозы. При этом во
время полета содержание гликогена за 10 минут снижается в 6 раз, а трегалозы в 1,5 раза
(Clegg, Evans, 1961; Sacktor, Wormser-Shavit, 1966). Это указывает на другой путь
метаболизма углеводов в жировом теле.
2. Механизмы термогенеза
Давно известно, что многие насекомые способны регулировать температуру своего
тела, в первую очередь груди ( Tth ), в ответ на изменения температуры среды ( Ta ). Такая
терморегуляция требует наличия особого механизма термогенеза.
Две группы больших летных мышц непрямого действия, DV и DL (dorso-ventral, dorsolongitudinal), используются пчелами, шмелями и осами в разных поведенческих
ситуациях, включающих собственно полет, термогенез, звуковые сигналы без видимых
движений, жужжание с колебанием сложенных крыльев, общее кратковременное
4
дрожание, биение крыльями с высокой частотой во время вентиляции гнезда (Himmer,
1927, 1932; Esch et al., 1975; Esch, 1976; Heinrich, 1980).
Летные мышцы при температуре грудного отдела ниже, чем требуется для полета,
находятся в состоянии тетануса сопровождаемого дрожью, появлением звукового сигнала
с последующим дрожанием крыльев (Esch, Goller, 1991). Для поддержания состояния
тетануса требуется большой непрерывный гидролиз молекул АТР с высвобождением
большого количества энергии, часть которой рассеивается и повышает температуру
мышц. Длительное состояние тетануса невозможно, быстро наступает частичное
снижение тетануса сопровождающееся появлением дрожи в мышцах и последующим
расслаблением. В опытах с одновременной регистрацией терморегуляции при Ta  26 0C
(увеличение выработки энергии определялось калориметрически) и звуковых сигналов у
шмелей Bombus lapidarius выявлена строгая последовательность между терморегуляцией
и звуковыми сигналами. Во всех случаях появление терморегуляции фиксировалось по
меньшей мере за 5 минут до появления звуковых сигналов. Процесс терморегуляции имел
четко выраженный циклический характер. Амплитуда и частота терморегуляции
понижались в течение некоторого периода, затем цикл повторялся. В начале каждого
цикла жужжания и дрожания крыльев (wing buzzing) терморегуляция достигала
максимального значения (Schultze-Motel, Lamprecht, 1994).
Это хорошо подтверждается ослаблением тетануса, фиксируемого изменением отношения
частоты возбуждения DL/DV в отношении перехода от состояния дрожи (shivering) к
жужжанию (buzzing) и собственно полету (flight) (табл. 2).
Таблица 2. Частоты возбуждения летных мышц и состояние объекта (по: Esch, Goller, 1991)
Состояние объекта
Дрожание (shivering)
Жужжание-гудение (buzzing)
Полет (flight)
Соотношение частот возбуждения DL/DV
Пчелы
Шмели
1,34±0,25
1,38±0,34
1,08±0,12
0,86±0,13
0,70±0,08
Состояние тетануса можно сравнить со статической разминкой (разогревом) мышц.
Состояние тетануса легко определяется по изменению положения заднеспинки (scutellum) в
период дрожания (shivering) грудного отдела. Повышение температуры груди никогда не
наблюдалось в отсутствие мышечных сокращений. Это наблюдение очень важно,
поскольку в ряде работ обосновывается предположение о наличии термогенеза не
связанного с дрожанием груди вследствие тетануса (NST - nonshivering thermogenesis)
(Greive, Surholt, 1990; Surholt et al., 1990). Таким образом, термогенез основан на энергии
работы крыловых мышц непрямого действия. Если в процессе сокращения мышц крылья
не соединены жестко со скутумом аксиллярным аппаратом, термогенез сопровождается в
разной степени заметным дрожанием груди и слабыми звуками. Если аксиллярный
аппарат входит в зацепление с крыловыми пластинками, можно наблюдать дрожание
крыльев и выраженное гудение. Кроме того предполагается, что в процессе термогенеза в
предполетный период на летные мышцы передается потенциал действия без заметного
движения крыльев (Surholt et al., 1990) при минимальной деформации груди (Esch, Goller,
1991).
Термогенез можно подразделить на управляемый заданной функцией
терморегуляции и не управляемый. В первом случае имеет место поддержание
температуры груди на определенном уровне для обеспечения полета, необходимой
температуры в расплодной зоне, обеспечение температурного градиента в зимующем
клубе. В этом случае процесс термогенеза носит прерывистый характер с обратной связью
с уровнем терморегуляции. Во втором случае термогенез не связан с функцией
терморегуляции и является следствием требуемой мощности мышечной работы при
полете с разной нагрузкой.
5
Термогенез осуществляется в основном за счет метаболизма в мышечных клетках, за
счет окислительного фосфорилирования в митохондриях и расщепления АТР в фибриллах
актиномиозин АТР-фосфатазой (Askew et al., 2010). Механизм терморегуляции у пчел,
шмелей и ос активно обсуждается с начала 70-х годов. Одна из теорий предполагает
терморегуляцию как результат ферментативных реакций субстратного цикла (‘futile
cycle’) в мышечных клетках (в норме необратимая третья реакция гликолиза фруктозо-6фосфат > фруктозо-1,6-бифосфат становится обратимой и гликолиз в той или иной
степени блокируется). Newsholme et al. (1972) обнаружили высокую и практически
равную активность фосфофруктокиназы (PFK) и фруктозо-бифосфатазы (FbPase) в летных
мышцах шмелей. Они предположили, что необычно высокая активность FbPase приводит
к быстрому гидролизу фруктозо-1,6-бифосфата, полученного действием PFK, что опять
обеспечивает PFK субстратом. В результате на каждый единичный цикл гидролизуется
молекула АТР. Если этот механизм функционирует с высокой скоростью, то такой
субстратный цикл будет сопровождаться выделением большого количества энергии без
совершения механической работы, то есть осуществляется термогенез. Удивление
исследователей вызвал факт отсутствия субстратного цикла у пчел. Цикл деактивируется
с началом полета, поскольку активность FbPase ингибируется ионами Ca 2 
выбрасываемыми в цитоплазму мышечных клеток при деполяризации мембран нервным
импульсом и возникновении потенциала сокращения мышечного волокна (Clark et al.,
1973; Storey, 1978; Grieve, Surholt, 1990). Относительно ингибирования фруктозобифосфатазы свободными ионами кальция, факта обычно не подвергаемого сомнению,
необходимо сделать два замечания. Согласно Матвееву В.В. (2006) « В клетке
аккумулируются только те вещества, для которых в ней имеется достаточное количество
центров связывания. Чем больше таких центров и чем выше их сродство
(избирательность) к данному веществу (иону), тем больше разница между внутри- и
внеклеточной концентрациями данного соединения (иона)». То есть ионы кальция
эндоплазматического ретикулюма мышечной клетки моментально связываются
соответствующими центрами тропонина в миофибриллах и в свободном состоянии в
процессе сокращения мышечной клетки отсутствуют. Это хорошо согласуется с
появившимися данными о том, что свободные ионы кальция в клетке могут ингибировать
гликолиз и потребление кислорода (Jung et al., 2000) и не являются управляющим
элементом гликолиза при выработке энергии (Ørtenblad et al., 2009).
Если FbPase/ PFK субстратный цикл является общим механизмом термогенеза, можно
предполагать такую активность ферментов не только у европейских видов шмелей. Для
решения этого вопроса было проведено исследование 8 видов северо-американских видов
шмелей (Staples et al., 2004), включая голарктические B. terrestris и B. affinis. Результаты
имели смешанный характер. Только у двух видов была зарегистрирована активность
FbPase на уровне 50% активности PFK.
Тем не менее, эта элегантная теория использования субстратного цикла в процессе
термогенеза была подвергнута резкой критике с нескольких позиций. Ряд исследователей
считают, что величина термогенеза, полученная как на основе оценки субстратного цикла
in vivo (Clark et al., 1973), так и на основе скорости цикла в зависимости от максимальной
активности PFK и FbPase, явно недостаточна для терморегуляции грудного отдела
(Kammer, Heinrich, 1978; Newsholme, Crabtree, 1976). Staples et al. (2004), анализируя
собственные данные только для одного вида шмелей, пришли к выводу, что FbPase/ PFK
цикл дает менее 7% энергии необходимой для поддержания оптимальной температуры
груди у шмелей в холодную погоду (Heinrich, 1972).
3. Эффекторы гликолиза
Поскольку гликолиз является основным метаболитическим путем обеспечения энергией
летных мышц, то регулирование этого процесса возможно посредством эффекторов
фосфофруктокиназы (PFK), ключевого фермента гликолиза. Среди других эффекторов
6
PFK у пчел в условиях физиологической концентрации АТР, АМР, фосфата и фруктозо-6фосфата, наличие глюкозо-1,6-бифосфата или фруктозо-1,6-бифосфата угнетало
активность фермента. В летных мышцах пчел, в отличие от мышц других животных, не
обнаружено влияния АМР на активность фермента и в процессе полета колебания
концетрации АМР вероятно очень незначительны, поскольку в летных мышцах у пчел в
состоянии покоя концентрация АМР очень высока (Beis, Newsholme, 1975) и активность
аденилат-киназы в летных мышцах пчел в полете низка в сравнении с другими мышцами
и с уровнем оборота АТР.
Два фактора способны снизить ингибирующий эффект глюкозо-1,6-бифосфата и
фруктозо-1,6-бифосфата на фермент PFK в летных мышцах пчелы – это субстраты
фруктозо-6-фосфат и особенно фруктозо-2,6-бифосфат. Концентрация фруктозо-2,6бифосфата в летных мышцах пчелы в состоянии покоя лишь 4,4±0,73 nmol/грамм мышц.
Это подтверждает, что в летных мышцах пчелы в состоянии покоя, низкая активность
PFK обусловлена концентрацией глюкозо-1,6-бифосфата и фруктозо-1,6-бифосфата, но
при инициации подготовки к полету этот эффект исчезает при увеличении концентрации
как фруктозо-6-фосфата, так и фруктозо-2,6-бифосфата. У тараканов в летных мышцах
концентрация фруктозо-2,6-бифосфата на начало полета в два раза выше, чем в состоянии
покоя. Остается неизвестным, как осуществляется контроль за концентрацией фруктозо2,6-бифосфата в летных мышцах пчел, но вслед за увеличением концентрации фруктозо-6фосфата происходит увеличение активности не только 6-фруктозо-1-киназы
катализирующей превращение фруктозо-6-фосфата в фруктозо-1,6-бифосфат, но и 6фруктозо-2-киназы, катализирующей превращение фруктозо-6-фосфата в фруктозо-2,6бифосфат.
Низкая концентрация фруктозо-6-фосфата в летных мышцах пчел в состоянии покоя
(Beis, Newsholme, 1975) может скачком увеличиваться при подготовке к полету,
следовательно, уровень фосфорилирования глюкозы в мышцах находится под контролем
субстратного цикла между глюкозой и глюкозо-6-фосфатом (Surholt, Newsholme, 1981).
Можно высказать предположение, что иной механизм контроля PFK у пчел в сравнении
другими насекомыми (саранчевые, тараканы, бабочки) связан с их образом жизни.
В последние годы выяснено, что активность PFK в разных тканях регулируется
фруктозо-2,6-бифосфатом, возможно, наиболее важным активатором ферментов у
млекопитающих. Фруктозо-2,6-бифосфат играет важную роль в регуляции уровня
гликолиза и/или глюконеогенеза в печени, активирует PFK, но ингибирует FbPase,
осуществляя прямой контроль над направлением метаболизма глюкозы (Wegener et al.,
1986).
Определение гликолитических интермедиатов в летных мышцах шмелей при низких и
нормальных температурах, выявило статистически достоверное увеличение
концентрации AMP , фруктозо-2,6-бифосфата, глюкозо-6-фосфата и уменьшение
концентрации ATP в полете при 250 C или в состоянии покоя при 50 C (табл. 3).
Таблица 3. Содержание метаболитов ( M / грамм мышечной массы) в летных мышцах
шмелей (1 – Leite et al., 1988; 2 – Newsholme et al., 1972)
Состояние
шмелей
F2,6P2
AMP
2,77±0,25
0,16±0,04
0,07±0,01
3,02±0,35
0,05±0,01
0,06±0,01
0
7,13±0,58
0,39±0,09
0,16±0,03
2,56±0,33
0,05±0,01
0,06±0,01
В покое , 5 C
7,26±0,86
0,37±0,05
0,15±0,04
2,30±0,27
0,06±0,01
0,08±0,01
0,11±0,03
2,69±0,18
0,16±0,02
0,06±0,01
0,22±0,09
2,10±0,28
0,16±0,01
0,03±0,01
0
1)
В покое , 25 C
1)
В полете , 25 C
1)
В покое
2)
В полете
2)
0
G6P
ATP
F1,6P2
F6P
*
7
Шмелей Bombus atratus (Leite et al., 1988) отлавливали в поле на цветах в районе СантПауло (Бразилия) и содержали в темноте при 250 C и 50 C в течение 5 минут, после чего
мгновенно замораживали в жидком азоте. Другую группу принуждали к полету в течение
2 минут, а затем также замораживали. Шмелей Bombus hortorum (Newsholme et al., 1972)
отлавливали в районе Оксфорда (Англия) и содержали в темной комнате до начала опыта
в течение нескольких часов (температура не указана). Несмотря на то, что указанные виды
шмелей обитают в разных температурных и климатических зонах, изменения
концентрации основных метаболитов в покое и в полете очень схожи (табл. 3).
Leite et al. (1988) установили, что активность PFK ингибируется высокими
концентрациями АТР и усиливается с возрастанием концентрации АМР. В то же время
увеличение концентрации фруктозо-2,6-бифосфата до 7,2 M понижало активность
FbPase в 2,5 раза при максимальном усилении активности PFK. При таких условиях
появление FbPase/ PFK субстратного цикла выглядит проблематично. Особенно, если
учесть, что по данным Newsholme et al. (1972) у всех шмелей отмечена активность
альдолазы (реакция 4 гликолиза; расщепление фруктозо-1,6-бифосфата на
дигидроацетонфосфат и глицеральдегид-3-фосфат) на уровне активности PFK, что должно
приводить к конкуренции за субстрат с FbPase. К тому же и активность
митохондриальной глицерол-3-фосфат дегидрогеназы (глицерол-фосфатный челночный
механизм) соответствовала нормальному гликолизу. Все это указывает на наличие
некоторого неучтенного фактора приводящего к скачку активности FbPase.
4. Мощность субстратного цикла и возможные причины его появления
Вопрос о недостаточной мощности субстратного цикла для эффективной терморегуляции
невозможно конструктивно обсуждать без определения целевой функции, то есть
граничных условий относительно которых оценивается мощность процесса. Данные,
относящиеся к термогенезу у насекомых, в том числе у пчел и шмелей, представлены в
многочисленных работах с использованием разных единиц измерения. С целью
облегчения проведения сравнительного анализа, все оценки исследуемых факторов
отнесены к одной сравнительной единице – к массе грудных (летных) мышц в граммах в
минуту ( g 1  min 1 ) , как это принято в биохимических исследованиях. При переводе
объемов использованного при дыхании кислорода в количество вещества в молях,
учитывалось, что объем моля кислорода при стандартных физических условиях
(00 С , 2730 K ) равен 22,4 литра с коэффициентом увеличения 0,082 на градус. При оценке
термогенеза на основе расхода кислорода при синтезе АТР в митохондриях и его
последующего гидролиза в процессе мышечных сокращений, учитывалось, что на
собственно механическую работу (mechanochemical coefficient) расходуется не более 30%
энергии высвобождаемой при гидролизе (Askew et al., 2010; на один моль глюкозы
расходуется 6 молей кислорода и синтезируется 36 молей АТР; энергия гидролиза АТР
принята равной 42 кДж/моль).
При расчете удельной мощности термогенеза ( Pm ) использовалась удельная теплоемкость
(specific heat) мягких тканей (3,35 J  g 1  0С 1 ) и удельная теплопроводность грудного
отдела (thoracic conductance) с учетом потерь на охлаждение (3,47 J  g 1  0С 1  min 1 ) (по:
Harrison J.M., 1987 – с изменениями).
Таблица 4. Активность ферментов, расход кислорода и мощность термогенеза у пчел.
Состояние
объекта
Активность
ферментов
( mol  g 1  min 1 )
Расход
(потребление)
кислорода
Удельная
мощность
термогенеза
(ml  g 1  min 1 )
( J  g 1  min 1 )
Ta 0C
T 0C
8
1) Летающие
пчелы
(free flying)
2) Пчелы на
расплоде
(on brood area)
Пчелы вне
расплода
(off brood area)
3) Активные
пчелы
(walking)
HK
42,3
PFK
(39,6)
(68,4)
4) Пассивные
пчелы
5) Полет на
привязи
(tethered bee)
( Pm )
(6,15)
254
44,8
22
+12,9
338
59,7
(15)
+17,2
32,8
8,45
(0,89)
4,93
197
34,7
(15)
+10,0
43,2
25,8
9,2
(6,13)
(3,78)
(1,40)
259
155
55
45,7
27,3
9,7
(15)
(25)
(40)
+13,2
+7,9
+2,8
29,5
15,2
4,5
(4,18)
(2,23)
(0,68)
177
91
27
31,2
16,1
4,8
(15)
(25)
(40)
+9,0
+4,6
+1,4
3,0
120
21,2
(22?)
+6,0
11,3
9,4
465
379
(82,1)
(66,9)
(24)
(30)
+23,6
+19,3
56,3
Пассивные пчелы
(sitting)
( mol  g 1  min 1 )
mol
ml
(29,0)
(20,0)
77,5
63,2
*
Ссылки в таблице: 1) Suarez et al., 1996; оценка расхода кислорода проводилась у пчел в полете при 22 С ,
0
оценка активности ферментов in vitro - при 37 С ; масса тела – 78,25 мг, масса груди – 28,58 мг, масса
мышц груди принята равной 75% массы груди (Heinrich, 1980); 2) Harrison, 1987; в опыте использовалась
0
рамка с расплодом и около 1000 пчел, помещенных в термостат при 15 С ; 3) Stabentheiner et al., 2003; для
оценки потребления кислорода пчел помещали в сосуд Варбурга (Warburg vessel) с фиксированной
температурой, визуально подразделив их на две группы: пчелы с высокой активностью и пчелы с низкой
активностью, подразделение достаточно условно; 4) Newsholme et al., 1972; шмелей отлавливали на цветах
и содержали в темной комнате 1-2 часа до использования; 5) Nachtigall et al., 1989. Значения в круглых
0
скобках взяты из цитируемого источника, остальные рассчитаны на их основе автором статьи.
Анализ данных таблиц 4 и 5 свидетельствует о способности пчел к активному
термогенезу. Величина термогенеза зависит не только от внешней температуры, но и от
наличия расплода, скученности (агрегированности) пчел или от их локомоторной
активности. При наличии высокой локомоторной активности термогенез одиночных пчел
может превосходить таковой у агрегированных, но неактивных пчел, при той же внешней
температуре. Это хорошо видно при сравнении удельного термогенеза в табл. 4 и 5
относительно Ta =15 о С . В таблице 5 для свободно передвигающихся пчел термогенез
равен 48,1 Дж, что хорошо согласуется с интервалом значений термогенеза на фоне
разной активности пчел в 31,2-59,7 Дж, рассчитанным по другим источникам (табл. 4).
Таблица 5. Мощность термогенеза пчел относительно внешней температуры (рассчитано по
результатам опытов Blatt, Roces, 2001 с изменениями: в круглых скобках исходные данные,
остальные рассчитаны автором)
о
Температура воздуха, С
( Ta )
10
15
20
25
30
35
39
(9,58)
(8,28)
(6,97)
(5,66)
(4,36)
(3,06)
(2,01)
321,5
272,9
226,2
179,4
136,4
94,4
60,3
53,6
45,5
37,7
29,9
22,7
15,7
10,1

V CO2 (ml h 1 на особь)
(независимо от концентрации
сахара в растворе)

V O2 (mol  g 1  min 1 )
Расход глюкозы,
9
обеспечивающий данный
уровень метаболизма
( mol  g 1  min 1 )
Удельная мощность
термогенеза
( J  g 1  min 1 )
T 0C
56,7
+16,4
48,1
+13,9
39,9
+11,5
31,6
+9,1
24,1
+6,9
16,6
+4,8
10,6
+3,0
Следовательно, термогенез зависит не только и не столько от разности температур
грудного отдела и внешней среды, но в значительной степени от поведенческой модели
(функциональной нагрузки). Это, в свою очередь, позволяет соотнести целевую функцию
поддержания необходимого температурного поля у зимующих пчел с расходом глюкозы и
кислорода, и рассчитать все остальные теплофизические параметры для определения
условий минимизации энергетических и биологических затрат.
В работе Harrison J.M. (1987) при расчете удельной мощности термогенеза использовались
не крайние значения изотерм, а изотерма груди пчел и значение изотермы воздуха на
расстоянии один сантиметр от груди, что повлияло на оценку. Необходимо брать крайние
устойчивые значения изотерм, так как мощность процесса характеризуется величиной
градиента температуры. Именно поэтому получена заниженная 0,89 (ml  g 1  min 1 )
оценка расхода кислорода. Это тем более важно иметь в виду при расчете термогенеза
зимующих пчел на основе их температурных полей в улье.
В некоторых случаях при оценке метаболизма использовалось термохимическое значение
сгорания глюкозы в кислороде (Krogh, Zeuthen, 1941; Feller, Nachtigal, 1989), что приводит
к существенным неточностям, поскольку энергия биохимического окисления глюкозы и
гидролиза АТР в мышцах весьма далека от термохимической. Rothe, Nachtigal (1989)
предприняли попытку экспериментально градуировать уровни метаболизма у пчел в
состоянии покоя, при локомоции и в полете при разной температуре окружающего
воздуха. Результаты имели столь огромный разброс, что какой-либо убедительной
интерпретации такому состоянию дать не удалось. Результаты нисколько не напоминали
данные полученные в опытах Stabentheiner et al. (2003), где пчелы также разбиты на
группы по степени их активности. Тем не менее, авторы (Rothe, Nachtigal, 1989)
справедливо указывают на определенные сложности в физиологическом плане при
попытке дать определение состоянию покоя (resting) только по визуальным признакам. К
этому можно добавить, что на разброс результатов внутри больших температурных
интервалов, могла повлиять большая разнокачественность пчел, а именно возраст,
состояние пищевых запасов и, что представляется не менее важным, их текущая функция
в семье и время ее выполнения на момент отлова.
Полет пчел на привязи можно сравнить с нагруженным полетом. Их метаболизм почти в
два раза превышает метаболизм у греющих пчел на расплоде относительно нижней
границы температур. Тезис о том, что термогенез является функцией работы, хорошо
подтверждается в опытах по потреблению кислорода у механически обездвиженных пчел
при наличии лишь дыхательных движений брюшка (Allen, 1959). Метаболизм находился
на уровне чисто пойкилотермных животных, активный термогенез отсутствовал во всем
диапазоне температур от 12 до 47 0 С . Весьма показательны данные по термогенезу у пчел
на расплоде (Harrison, 1987). График распределения температур внутри выборки из 145
пчел характерен для негативного распределения признака (negative binominal distribution),
что свидетельствует о том, что только около 10-15% пчел заняты активным термогенезом,
а остальные в пассиве.
10
Таблица 6. Активность ферментов, расход кислорода и мощность термогенеза у шмелей.
Активность
ферментов
( mol  g 1  min 1 )
Объект
HK
B. rufocinctus 1)
B. vagans 1)
B. bimaculatus 1)
B. impatiens 1)
B. perplectus 1)
B. affinis 1)
B. terrestris 1)
B. terrestris 2)
B. terrestris 3)
B. affinis 4)
1. Flying
2. Flying
1. Non-flying
2. Non-flying
3. Non-flying
B. terrestris 5)
B. agrorum 5)
B. pratorum 5)
B. hortorum 5)
B. lapidarius 5)
B. ruderarius 5)
B. lucorum 5)
B. terrestris 6)
PFK
FbPase
(107)
(160)
(123)
(132)
(109)
(66,7)
(99,0)
(57,5)
(18,7)
(6,7)
(3,0)
(28,6)
(4,7)
(54,9)
9,2
22,4
(14,7)
(20,4)
(1,12)
(5,8)
(86)
(109)
(105)
(89)
(61)
(95)
(92)
(42,6)
(0,48)
(10,4)
(45,3)
(41,0)
(33,5)
(50,7)
(27,5)
(60,3)
(42,3)
(55,0)
(41,5)
(34,7)
(67,8)
(18,1)
(78,3)
(71,6)
(84,0)
Расход
(потребление)
кислорода
(ml  g 1  min 1 )
Удельная
мощность
термогенеза
( J  g 1  min 1 )
( Pm ) на основе:
T 0C
mol
FbPase
О2
6,75
19,3
15,9
17,6
11,0
8,5
6,02
(1,35)
(3,60)
297
848
698
774
482
372
265
55,2
147
2,4
0,8
0,3
0,1
1,2
0,2
2,3
52,4
149,6
123,1
136,5
85,0
65,6
46,7
9,7
26,0
(4)
(4)
(4)
(4)
(4)
(4)
(4)
(25)
?
+15,8
+43,3
+35,5
+39,3
+24,8
+19,0
+14,1
+2,8
+7,5
1,97
2,74
88,2
122,4
3,8
?
?
0,02
0,24
1,8
15,6
21,6
0,67
?
?
(21)
(5)
(21)
(5)
(27)
+4,5
+6,2
+0,2
?
+0,52
?
?
?
56,4
?
?
?
1,7
1,4
2,9
0,8
2,5
1,8
2,3
(26)
+0,49
+0,40
+0,84
+3,1
+0,72
+0,52
+0,66
+18,6
ml
?
?
?
?
?
?
9,9
(64,8)
или
(46,3)
(37,0)
(24,1)
(11,1)
Терморегуляция
в пределах
одного цикла
Ta 0C
+13,3
+10,7
+7,0
+3,2
*
Ссылки в таблице: 1) Staples et al., 2004; шмели отлавливались в период с мая по сентябрь без регистрации
Ta , после отлова содержались ночь при температуре 4 0 C ; оценка активности ферментов in vitro - при
37 0 С ; масса груди на 75% представлена массой летных мышц (Nachtigall et al., 1995); 2) Wolf et al., 1996;
масса тела в среднем 250 мг, масса мышц груди принята равной 32,4 % массы тела (Surholt et al., 1991),
Ta = 250 С , полет кратковременный, прерывающийся; 3) Ellington et al., 1990; уровень потребления
кислорода соответствовал готовности к полету; 4) Clark et al., 1973; шмелей отлавливали на цветах и
содержали в темноте при Ta  27 C ; 5) Newsholme et al., 1972; шмелей отлавливали на цветах и
0
содержали в темной комнате 1-2 часа до использования;
6) Schultze-Motel, Lamprecht, 1994; шмелей брали из наблюдательного гнезда (observation nest box) и
помещали в калориметр. Значения в круглых скобках взяты из цитируемого источника, остальные
рассчитаны на их основе автором статьи.
Анализ данных таблицы 6 позволяет сделать несколько определенных выводов.
Во-первых, высокая активность фруктозо-бифосфатазы (FbPase) в субстратном цикле
блокирует гликолиз и резко снижает возможности термогенеза у насекомых. Во-вторых,
энергетическая эффективность термогенеза на основе субстратного цикла в 25 раз ниже,
чем в свободном гликолизе. Во всех (Newsholme et al., 1972; Clark et al., 1973) или в части
11
(Staples et al., 2004) результатов с высоким уровнем активности FbPase, положительная
терморегуляция оказалась невозможна. В-третьих, терморегуляция имеет циклический
характер с сокращением периодов и снижением амплитуды мощности термогенеза в
течение цикла (Schultze-Motel, Lamprecht, 1994), периоды темогенеза разобщены краткими
периодами покоя без заметной мышечной активности или ее отсутствием.
Помимо рассмотренных выше доводов разных авторов о невозможности существования
субстратного цикла как такового в сокращающихся мышцах, рассмотрим возможные
причины его появления. У всех насекомых существует нижний порог температуры тела,
при котором мышечная активность прекращается, так называемая холодовая кома (chillcoma). При понижении температуры тела с 25 до 150 С , амплитуда потенциала
возбуждения в мышцах всех исследованных видов насекомых уменьшается в два раза, а
продолжительность увеличивается в два раза (Esch, 1988; Goller, Esch, 1990). Нижний
порог, при котором потенциал возбуждения не фиксируется, достаточно специфичен для
определенных групп насекомых. У шмелей он равен 7  80 С , у ос веспид 6  7 0 С , у
рабочих особей медоносной пчелы 11  120 С . Холодовая кома влияет и на способ,
которым осуществляется газообмен. У пчел при температуре тела ниже 120 С газообмен
протекает непрерывно (continuous) за счет общей диффузии, при 120 С и выше газообмен
переходит к прерывистому (discontinuous) дыхательному циклу, но лишь по достижении
температуры более 150 С процесс дыхания сопряжен с активным сокращением брюшка и
возможностью термогенеза (Lighton, Lovegrove, 1990). Это является причиной
стабильного и низкого уровня метаболизма у пчел в интервале температур 7  150 С .
Дыхательный коэффициент в указанном интервале температур RQ=0.864, что указывает
на метаболизм смешанного типа, основанный не исключительно на углеводах, как это
происходит в период активного термогенеза (Rothe, Nachtigall, 1989), но с использованием
в окислительных процессах до 45% жирных кислот.
Если теперь обратить внимание на условия подготовки живого материала в работах,
где обнаружен субстратный цикл, то с учетом сказанного, можно попытаться обосновать
причины его появления. В опытах Staples et al. (2004) шмели после отлова содержались по
меньшей мере 12 часов при температуре 4 0 C . В опытах Clark et al. (1973) шмели после
отлова содержались в темноте при 27 0 C некоторое время, затем проводилась
иммобилизация при  200 C в течение 4,5 минут, после чего в грудные мышцы
проводилась инъекция меченной глюкозы.
В первом случае шмели оказываются в состоянии холодовой комы максимум через час,
а во втором случае – в шоком режиме. При почти полном прекращении сокращений
летной мускулатуры, ионы кальция до этого связанные тропонином, освобождаются, но
ионный насос не работает (Lighton, Lovegrove, 1990; Sinclair et al., 2004; Koštál et al., 2004;
McMullen et al., 2010), что приводит к угнетению дыхания и гликолиза (Jung et al., 2000),
смене типа метаболизма и возрастанию активности фруктозо-бифосфатазы (Bosca et al.,
1985). Таким образом, появление цикла PFK/FbPasa является, по-видимому, ответом на
холодовой шок, а не процессом термогенеза в норме. Этому может способствовать
критический недостаток свободных углеводов, переход на окисление жирных кислот с
блокированием гликолиза.
5. Аргинин киназа и скорость оборота АТР в мышцах
Мышцы, способные работать с высокой частотой продолжительное время, обладают
высокой способностью к аэробному синтезу АТР и, следовательно, высокой плотностью
митохондрий. В летных мышцах пчел плотность митохондрий в объеме клетки достигает
43% (Suarez, 1996), а миофибриллы занимают до 54% (Suarez et al., 2000). Синхронные
мышцы, работающие с высокой частотой, требуют большой скорости изменения
концентрации ионов Са 2  саркоплазматическим ретикулюмом (SR). Многие насекомые,
особенно перепончатокрылые и двукрылые, обладают асинхронным типом мышц,
12
характеризующимся очень слабым развитием SR, поэтому высокая частота сокращений
ассоциируется с плотностью митохондрий, а не с плотностью SR (Josephson et al., 2000) и
за ресинтез АТР после гидролиза клеточной АТРазой отвечает окислительное
фосфорилирование в митохондриях.
Миофибриллы, митохондрии и SR в мышечных клетках столь плотно упакованы, что
вполне уместно задать риторический вопрос: «где здесь цитозол?» (Suarez, 2003).
Поскольку скорость оборота АТР зависит от дистанции между митохондриальной АТР
синтазой и активной АТРазой актомиозина, здесь мы сталкиваемся с одним исключением
из обобщения о том, что градиент внутриклеточных метаболитов несущественен для
метаболизма. Для процесса мышечной работы необходима высокая скорость
диффузионного потока ADP из миофибрилл, где актомиозин АТРаза катализирует
гидролиз АТР в ADP и фосфат, в митохондрии, где АТР ресинтезируется. Концентрация
свободного ADP в цитоплазме мышечных клеток столь низка вследствие очень высокой
скорости оборота АТР (Jacobus, 1985) и вследствие этого внутриклеточный градиент ADP
недостаточен для обеспечения требуемого потока от миофибрилл в митохондрии.
Установлено, что в скелетных и сердечных мышцах позвоночных приблизительно
половина фермента креатин киназы (CK) находится в саркоплазме, а вторая половина в
особой изоформе граничит с митохондриями и миофибриллами.
Проблема ограничения окислительного фосфорилирования в митохондриях скоростью
диффузии ADP решается посредством диффузии креатина (Cr) из миофибрилл в
митохондрии, где под воздействием СК креатин фосфорилируется, получая фосфатную
группу от АТР и диффундирует обратно в миофибриллы в форме креатин фосфата (CrP).
В миофибриллах АТР гидролизуется АТРазой актомиозина и полученная ADP
рефосфорилируется, используя CrP в реакции, катализируемой миофибриллярной CK.
Сущность этого цикла, названного челночным (Meyer et al., 1984; Dzeja, Terzic, 2003),
состоит в том, что транспортные функции креатина и CrP состоят в простой
последовательности равновесных состояний креатин киназных реакций.
Рассмотрим эти два процесса по отдельности. Запишем реакции гидролиза и
рефосфорилирования в миофибриллах:
2
ATP 4   H 2O  ADP 3  HPO4  H 
ADP 3  CrP  H   ATP 4   Cr
Обобщенная реакция 1:
2
CrP  H 2O  Cr  HPO4
Реакции образования ATP и CrP в митохондриях:
2
ADP 3  HPO4  H   ATP 4   H 2O
Cr  ATP 4   CrP  ADP 3  H 
Обобщенная реакция 2:
2
Cr  HPO4  CrP  H 2O
В первом случае креатин и ион-фосфат являются продуктами реакций, во втором –
расходными компонентами. Обе реакции находятся под контролем креатин киназы. Это
свидетельствует о том, что в челночном механизме участвуют креатин и ион-фосфат с
одной стороны и креатин фосфат с другой, а ATP и ADP в этом не участвуют. У всех
беспозвоночных и насекомых в частности, вместо креатин фосфата в обеспечении
работающих мышц энергией принимает участие более древнее соединение – аргинин
фосфат. Креатин позвоночных является производным аргинина.
Существует гипотеза, что если челночный креатин киназный механизм в состоянии
обеспечить максимально необходимую скорость преобразования богатых энергией
фосфатных соединений в работающих мышцах, то его скорость должна значительно
превосходить скорость оборота АТР в митохондриях (Newsholme, Crabtree, 1976). Оценка
активности креатин киназы и аргинин киназы, проведенная у разных видов животных
13
(рыбы, моллюски, ракообразные, насекомые) (Newsholme et al., 1978), выявила у шмелей
активность аргинин киназы в 7 раз ниже скорости оборота АТР в митохондриях, 138 и
1017 mol / min per g muscle соответственно. На этом основании авторы приходят к
выводу, что аргинин киназа не играет существенной роли в передаче богатых энергией
фосфатов из митохондрий в миофибриллы, по крайней мере, в условиях более высокой
скорости оборота АТР. Необходимо отметить два существенных момента: 1) величина
оборота АТР получена на основе перерасчета неопубликованных данных по активности
оксоглутарат дегидрогеназы (J.Paul, E.A.Newsholme, unpublished work) со ссылкой на
аналогичную по методу работу (Read et al., 1977); 2) в опытах по определению активности
аргинин киназы использовано всего 3 (!!!) экземпляра шмелей).
В этой связи представляется важным анализ условий сбора и хранения живого
материала до проведения анализов. Согласно Read et al. (1977), насекомые (шмели, осы,
пчелы) отлавливались во время фуражирования и использовались в тот же день или на
следующий и сохранялись при температуре 50 С (insect flight muscles were removed after
cooling the insect at 5°C), а по Newsholme et al. (1978) - материал использовался сразу после
отлова, без указания температуры. Перерасчет активности оксоглутарат дегидрогеназы в
скорость оборота АТР приведен в таблице 7. В работе Wegener et al. (1986) приводятся
данные по активности аденилат киназы и скорости оборота АТР у шмелей Bombus
agrorum (120 и 1017 mol / min per g muscle соответственно) и пчел Apis mellifera (49 и
954 mol / min per g muscle соответственно) со ссылкой на Newsholme et al. (1978), где,
однако, данные для пчел отсутствуют. Аденилат киназная (миокиназная) реакция в
миофибриллах осуществляет рефосфорилирование АТР при избытке ADP, что совместно
с аргинин киназой увеличивает оборот АТР в мышцах: 2 ADP  ATP  AMP . Тем не
менее, даже совместное действие аргинин киназы и аденилат киназы значительно
уступает скорости оборота АТР в митохондриях. Поскольку температура, при которой
содержится живой материал, может существенно влиять на скорость гликолиза и,
соответственно, на скорость оборота АТР в работающих мышцах, представляется
полезным провести сравнение скорости оборота АТР с условиями содержания материала
до проведения биохимических анализов (таблица 7).
Таблица 7. Влияние внешней температуры и функциональной нагрузки на скорость оборота АТР
у пчел и шмелей.
Активность ферментов
( mol  g  min )
1
Объект
HK
Read et al. (1977):
Bombus hortorum
B. terrestris
B. pratorum
B. agrorum
Vespa vulgaris
Newsholme et al. (1978):
Bombus sp.
Staples et al. (2004) :
B. rufocinctus
B. vagans
B. bimaculatus
B. impatiens
B. perplectus
B. affinis
B. terrestris
Schultze-Motel, Lamprecht
PFK
1
FbPase
(55,5)
(69,4)
(116,5)
(88,6)
(132,5)
(107)
(160)
(123)
(132)
(109)
(66,7)
(99,0)
(57,5)
(18,7)
(6,7)
(3,0)
(28,6)
(4,7)
(54,9)
Скорость
оборота АТР в
митохондриях
( mol  g  min )
1
1
Ta 0C
1665
2498
4176
3190
4770
(5?)
(5)
(5)
(5)
(5)
1017
(22?)
1782
5086
4186
4644
2894
2232
1587
(4?)
(4)
(4)
(4)
(4)
(4)
(4?)
14
(1994):
B. terrestris
Терморегуляция
в пределах
одного цикла
Read et al. (1977):
Apis mellifera
Wegener et al. (1986):
A. mellifera
Suarez et al. (1996):
Летающие пчелы (free flying)
Stabentheiner et al. (2003):
Пассивные пчелы (sitting)
Newsholme et al. (1972):
Пассивные пчелы
(54,1)
(39,6)
29,5
15,2
4,5
(29)
(20)
1575
1258
811
377
(26)
(26)
(26)
(26)
1947
(?)
(954)
(?)
(1440)
1062
547
162
(22)
(15)
(25)
(40)
720
(22?)
*
Примечание. Значения в круглых скобках взяты из цитируемого источника, остальные
рассчитаны автором статьи.
Совершенно очевидно, что на результаты влияет сложный поведенческий креатив,
зависящий не только от температуры, но и от функциональной нагрузки. Пчелы с их
сложной поведенческой моделью требуют особой строгости в экспериментах по оценке
биохимической активности интермедиатов термогенеза и не только в отношении
температуры. Тем не менее, интересен факт, что у всех исследованных насекомых
активность аргинин киназы меньше скорости оборота АТР, в противоположность
моллюскам и ракообразным, где активность аргинин киназы в десятки раз превышает
оборот АТР (Newsholme et al., 1978), но при этом плотность фибрилл и митохондрий в
миофибриллах намного меньше. У пчел зафиксирован также самый низкий уровень
содержания в летных мышцах аргинин фосфата (анализ проводился всего на 2 (!!!) особях
пчел), в 5-20 меньший, чем у других изученных видов из 7 отрядов насекомых (Beis,
Newsholme, 1975). В ряде работ отрицается транспортная функция аргинин фосфата и
других фосфагенов (за исключением креатин фосфата) у беспозвоночных вообще
(Ellington, 1989; Ellington, Hines, 1991).
Однако другие исследования подтверждают роль аргинин киназы и аргинин фосфата в
транспорте высокоэнергетических фосфатов от митохондрий до мест их использования.
Высокая активность трех изоформ аргинин киназы обнаружена в нервной ткани и в
сложных глазах пчел (Kucharski, Maleszka, 1998), в сперматеке пчелиной матки (Al-Lawati
et al., 2009), в средней кишке бабочки Manduca sexta при низкой концентрации свободной
ADP (Chamberlin, 1997). Полагая, что низкая концентрация свободной ADP в цитозоле
мышечной клетки существенно ограничивает скорость оборота ATP между
митохондриями и фибриллами в работающей мышце, Schneider et al. (1989) приходят к
выводу о транспортной роли аргинина и аргинин фосфата в летных мышцах саранчи
Locusta migratoria. Анализ концентрации ATP, ADP, фосфата и аргинин фосфата в
мышцах мухи Phormia regina в течение 60 минут полета (Sacktor, Hurlbut, 1966), показал,
что снижение концентрации аргинин фосфата пропорционально повышению
концентрации фосфата, а снижение ATP соответствует повышению ADP, что согласуется
с челночной гипотезой. Тем не менее, вопрос транспорта энергии остается открытым.
Во многих исследованиях по биохимии термогенеза у насекомых мы сталкиваемся с
игнорированием или непониманием важности поведенческого аспекта живого материала,
существенно влияющего на метаболизм объекта. Насекомые в ответ на внешнее
раздражение или стрессовый фактор реагируют по-разному. Если, к примеру, тараканы в
ответ на внешний раздражитель стремятся убежать (локомоторная функция), то шмели и
пчелы – улететь. Именно поэтому во всех опытах по изучению активности летной
15
мускулатуры у пчел в условиях их фиксации (Heinrich, Kammer, 1973; Kammer, Heinrich,
1974) неизбежно наблюдается потенциал возбуждения летных мышц при отсутствии
полета и при определенных температурных условиях переходящий в тетанус (Esch, Goller,
1991; Schultze-Motel, Lamprecht, 1994). Вывод о том, что летные мышцы пчел и шмелей
постоянно активны даже в отсутствие полета (при фуражировании) или находятся в
состоянии тетануса, представляется не совсем корректным.
Наличие термогенеза у пчел, выражающееся в поднятии температуры груди,
объективно регистрируется уже в случае объединения 50-100 особей даже вне улья и
устойчиво проявляется при агрегации большого числа особей при роении или подготовке
клуба к зимовке, а также при наличии печатного расплода. Во всех указанных случаях
основным мотиватором термогенеза является степень и форма агрегации. Вследствие
значительной общей численности пчелы способны более эффективно использовать
периоды с высокой температурой воздуха, нежели шмели. Самке основательнице у
шмелей даже с немногочисленным первым потомством из мелких рабочих особей
приходиться заниматься фуражированием в значительно более жестких условиях, при
которых без индивидуального термогенеза при низких температурах воздуха просто не
обойтись. У изолированных пчел, лишенных мотиваторов функционального поведения,
способность к термогенезу намного ниже, чем у шмелей.
6. Литература.
Матвеев В.В. (2006). Революция в физиологии клетки? (статья размещена на сайте:
http://www.bioparadigma.spb.ru/revolution.htm) (еще: Химия и жизнь, 1994, 8, 42-47).
Al-Lawati H., Kamp G., Bienefeld K. (2009). Characteristics of the spermathecal contents of old and
young honeybee queens. - Journal of Insect Physiology, 55, 2, 117-122.
Allen M. D. (1959). Respiration rates of worker honeybees of different ages and at different
temperatures. - The Journal of Experimental Biology, 36, 92-101.
Askew G.N., Tregear R.T., Ellington Ch.P. (2010). The scaling of myofibrillar actomyosin ATPase
activity in apid bee flight muscle in relation to hovering flight energetics. - The Journal of Experimental
Biology 213, 1195-1206
Beenakkers A.M.T., Van der Horst D.J, Van Marrewijk J.A. (1984). Insect flight muscle metabolism
(Review). - Insect Biochemistry, 14, 3, 243–260.
Becker A., Schlöder P., Steele J.E., Wegener G. (1996). The regulation of trehalose metabolism in
insects. – Experientia (Cellular and Molecular Life Sciences), 52, 5, 433-439
Beis I., Newsholme E.A. (1975). The contents of adenine nucleotides, phosphagens and some glycolytic
intermediates in resting muscles from vertebrates and invertebrates. - Biochemical Journal, 152, 23-32
Blatt J., Roces F. (2001). Haemolymph sugar levels in foraging honeybees (Apis mellifera carnica):
dependence on metabolic rate and in vivo measurement of maximal rates of trehalose synthesis. – The
Journal of Experimental Biology, 204, 2709-2716.
Bloxham D.P., Clark M.G., Holland P.C., Lardy H.A. (1973). A model study of the fructose
diphosphatase-phosphofructokinase substrate cycle. - Biochemical Journal, 134, 581-586
Bosca L., Challiss R.A., Newsholme E.A. (1985). The effect of fructose 2,6-bisphosphate on muscle
fructose-1,6-bisphosphatase activity. – Biochim. Biophys. Acta, 828, 2, 151-154.
Bounias M., Morgan M. R. J. (1984). Induction of honeybee haemolymph sucrase activity by high
levels of dietary sucrose. - Comp.Biochem. Physiol., 79B, 75–80.
Bozic J., Woodring J. (1997). Effect of activity on the haemolymph sugar titres in honey bees. - J. Apic.
Res., 36, 33–39.
Brandt N.R., Huber R.E. (1979). Carbohydrate utilisation in the thoraces of honey bee (Apis
mellifera) during early times of flight. - Journal of Insect Physiology, 25, 6, 483-486
Brandt N.R., Huber R.E. (1979a). The localization of honey bee thorax trehalose.- Canadian Journal of
Biochemistry, 57, 2, 145-154.
Brandt N.R., Hurlburt K.L., Huber R.E. (1979).The kinetic parameters of trehalase in whole and
disrupted mitochondrial preparations from two insects with asynchronous muscle. - Canadian Journal of
Biochemistry, 57, 10, 1210-5.
Chamberlin M.E. (1997). Mitochondrial arginine kinase in the midgut of the tobacco hornworm
(Manduca sexta). – The Journal of Experimental Biology, 200, 2789-2796.
16
Clark M.G., Bloxham D.P., Holland P.C., Lardy H.A. (1973). Estimation of the fructose
diphosphatase-phosphofructokinase substrate cycle in the flight muscle of Bombus affinis. – Biochemical
Journal, 134, 2, 589-597
Clegg J.S., Evans D.R. (1961). The physiology of blood trehalose and its function during flight in the
blowfly. - The Journal of Experimental Biology, 38, 771-792.
Crabtree B., Newsholme E. A. (1972). The activities of phosphorylase, hexokinase,
phosphofructokinase, lactate dehydrogenase and the glycerol 3-phosphate dehydrogenase in muscle from
vertebrates and invertebrates. - Biochemical Journal, 126, 49-58.
Crabtree B., Newsholme E. A. (1972a). The activities of lipases and carnitine palmitoyltransferase in
muscles from vertebrates and invertebrates. - Biochemical Journal, 130, 697-705.
Crailsheim K. (1985). Distribution of haemolymph in the honeybee in relation to season, age and
temperature. J. Insect Physiol., 31, 707–713.
Dzeja P. P., Terzic A. (2003). Phosphotransfer networks and cellular energetic. - The Journal of
Experimental Biology, 206, 2039-2047.
Ellington C.P., Machin K.E., Casey T.M. (1990). Oxygen consumption of bumblebees forward flight. –
Nature, 347, 472-473.
Ellington W.R. (1989). Phosphocreatine represents a thermodynamic and functional improvement over
other muscle phosphagenes. - The Journal of Experimental Biology, 143, 177-189
Ellington W.R., Hines A.C. (1991). Mitochondrial activities of phosphagen kinases are not widely
distributed in the invertebrates. – Biol. Bull., 180, 505-507.
Esch H. (1976). Body temperature and flight performance of honey bees in a servomechanically
controlled wind tunnel. - Journal of Comparative Physiology, 109, 265-277.
Esch H. (1988). The effects of temperature on flight muscle potentials in honeybees and cuculiinid
winter moths.- The Journal of Experimental Biology, 135, 109-117.
Esch H., Nachtigall W., Kogge S. N. (1975). Correlations between aerodynamic output, electrical
activity in the indirect flight muscles and wing positions of bees flying in a servomechanically controlled
wind tunnel. - Journal of Comparative Physiology, 100, 147-159.
Esch H., Goller F. (1991). Neural control of fibrillar muscles in bees during shivering and flight. –
Journal of Experimental Biology, 159, 419-431
Gmeinbauer R., Crailsheim K. (1993). Glucose utilization during flight of honeybee (Apis mellifera)
workers, drones and queens. - Journal of Insect Physiology, 39, 11, 959-967
Goller F., Esch H. (1990). Comparative study of chill-coma temperatures and muscle potentials in insect
flight muscles. - Journal of Experimental Biology, 150, 221-231.
Greive H., Surholt B. (1990). Dependence of fructose-bis-phosphatase from flight muscles of the
bumblebee (Bombus terrestris L.) on calcium. - Comp. Biochem. Physiol., 97B,197-200.
Fell R. D. (1990). The qualitative and quantitative analysis of insect hemolymph sugars by high
performance thin-layer chromatography. - Comp.Biochem. Physiol., 95A, 539–544.
Harrison J.M. (1987). Roles of individual honeybee workers and drones in colonial thermogenesis Journal of Experimental Biology, 129, 53-61.
Heinrich B. (1972). Temperature regulation in the bumblebee Bombus vagans: a field study. – Science,
175, 185-187.
Heinrich B. (1980). Mechanisms of body-temperature regulation in honeybees, Apis mellifera. I.
Regulation of head temperature. - Journal of Experimental Biology, 85, 61-72.
Heinrich B. (1980). Mechanisms of body-temperature regulation in honeybees, Apis mellifera. II.
Regulation of thoracic temperature at high air temperatures. - Journal of Experimental Biology, 85, 73-87.
Heinrich B., Kammer A. E. (1973). Activation of the fibrillar muscles in the bumblebee during warmup, stabilization and flight. - Journal of Experimental Biology, 58, 67-688
Himmer A. (1927). Ein Beitrag zur Kenntnis des Wärmehaushalts im Nestbau Sozialer Hautflüger. Zeitschrift für Vergleichende Physiologie 5, 375-379.
Himmer A. (1927). Der soziale Wärmehaushalt der Höngbiene. II. Die Wärme der Bienenbrut.- Erlanger
Jb. Bienenkd. 5, 1-32.
Himmer A. (1932). Die Temperaturverhaeltnisse bei den sozialen Hymenopteren. Biological Review, 7,
224-253.
Jacobus W. E. (1985). Theoretical support for the heart phosphocreatine energy transport shuttle based
on the intracellular diffusion limited mobility of ADP. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 133, 10351041.
17
Josephson R. K., Malamud J. G., Stokes D. R. (2000). Asynchronous muscle: a primer. - The Journal
of Experimental Biology, 203, 2713-2722.
Kammer A. E., Heinrich B. (1974). Metabolic rates related to muscle activity in bumblebees. - The
Journal of Experimental Biology, 61, 219-227.
Kammer A. E., Heinrich B. (1978). Insect flight metabolism. - Adv. Insect Physiol., 13, 133–228.
Krogh A., Zeuthen E. (1941). The mechanism of flight preparation in some insects. - The Journal of
Experimental Biology, 18, 1-10.
Kucharski R., Maleszka R. (1998). Arginine kinase is highly expressed in the compound eye of the
honey-bee, Apis mellifera. - Gene, 211, 2, 343-349
Jung S-K., Kauri L.M., Qian W-J., Kennedy R.T. (2000).Correlated oscillations in glucose
consumption, oxygen consumption, and intracellular free Ca21 in single islets of Langerhans. - The
Journal of Biological Chemistry, 275, 9, 6642–6650.
Lefebvre Y.A., Huber R.E. (1970). Solubilization, purification and properties of trehalase from
honeybee (Apis mellifera) – Archiv. Biochem. Biophys., 140, 514-518
Lee J., Tsui M., Nakamura M., Nishimito M., Okuyama M., Mori H., Kimura A., Matsui H.,
Chiba S. (2001). Purification and identification of the essential ionizable groups of honeybee trehalase. –
Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 12, 2657-2665
Leite A., Neto J.A., Leyton J.F., Crivellaro O., El-Dorry H.A. (1988) Phosphofructokinase from
bumble bee flight muscle. Molecular and catalytic properties and role of the enzyme in regulation of the
fructose-6-phosphate/fructose-1,6-biphosphate cycle.– The Journal of Biological Chemistry, 263, 33,
17527-17533
Leta M. A., Gilbert C., Morse R. A. (1996). Levels of hemolymph sugars and body glycogen of
honeybees (Apis mellifera L.) from colonies preparing to swarm. - J. Insect Physiol., 42, 239–245.
Lighton J.R., Lovegrove B.G. (1990). A temperature-induced switch from diffusive to convective
ventilation in the honeybee. - Journal of Experimental Biology, 154, 509-516.
McMullen D. C., Ramnanan C. J., Storey K.B. (2010). In cold-hardy insects, seasonal, temperature,
and reversible phosphorylation controls regulate sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA). Physiol Biochem Zool., 83, 4, 677-686.
Meyer R. A., Sweeney H. L., Kushmerick M. J. (1984). A simple analysis of the phosphocreatine
shuttle. – American Journal of Physiology, 246, C365-C377.
Nachtigall W., Rothe U., Feller P., Jungmann R. (1989). Flight of the honey bee. III. Flight metabolic
power calculated from gas analysis, thermoregulation and fuel consumption. – Journal of Comparative
Physiology, B 158, 729–737.
Nachtigall W., Hanauer-Thieser U., Morz M. (1995). Flight of the honey bee VII: metabolic power
versus flight speed relation. J. Comp. Physiol. B 165, 484-489.
Newsholme E.A., Crabtree B., Higgins S.J., Thornton S.D., Start C. (1972). The activities of fructose
diphosphatase in flight muscles from the bumble-bee and the role of this enzyme in heat generation. Biochemical Journal, 128, 89-97
Newsholme E.A, Crabtree B. (1976). Substrate cycles in metabolic regulation and in heat generation. –
Biochem. Soc. Symp., 41, 61-109.
Newsholme E.A. (1978). Substrate cycles: their metabolic, energetic and thermic consequences in man. –
Biochem. Soc. Symp., 43, 183-205.
Ørtenblad N., Macdonald W.A., Sahlin K. (2009). Glycolysis in contracting rat skeletal muscle is
controlled by factors related to energy state - Biochemistry Journal, 420, 161–168
Read G., Crabtree B., Smith G.H. (1977).The activities of 2-oxoglutarate dehydrogenase and pyruvate
dehydrogenase in hearts and mammary glands from ruminants and non-ruminants. - Biochemistry
Journal, 164, 349-355
Roces F., Blatt J. (1999). Haemolymph sugars and the control of the proventriculus in the honey bee
Apis mellifera. – Journal of Insect Physiology, 45, 221–229.
Schneider A., Wiesner R.J., Grieshaber M.K. (1989). On the role of arginine kinase in insect flight
muscle. - Insect Biochemistry, 19, 471-480
Schultze-Motel P. (1991). Heat loss and thermoregulation in a nest of the bumblebee Bombus
lapidarius (Hymenoptera, Apidae). - Thermochim. Acta, 193, 57–66.
Schultze-Motel P., Lamprecht I. (1994). Correlation of sound generation and metabolic heat flux in the
bumblebee Bombus lapidarius. – The Journal of Experimental Biology, 187, 315-318.
Sinclair B.J., Klok C.J., Chown S.L. (2004). Metabolism of the sub-Antarctic caterpillar Pringleophaga
marioni during cooling, freezing and thawing. - The Journal of Experimental Biology, 207, 1287-1294
18
Staples J.F., Koen E.L., Laverty T.M. (2004). ‘Futile cycle’ enzymes in the flight muscles of North
American bumblebees. - The Journal of Experimental Biology, 207, 749-754
Storey K. B. (1978). Purification and properties of fructose diphosphatase from bumblebee flight muscle.
- Biochim. Biophys. Acta, 523, 443-453.
Suarez R.K. (2003). Shaken and stirred: muscle structure and metabolism. – The Journal of
Experimental Biology, 206, 2021-2029.
Suarez R.K., Lighton J.R.B., Joos B., Roberts S.P., Harrison J.F. (1996). Energy metabolism,
enzymatic flux capacities and metabolic flux rates in flying honeybees. – Proceedings of the National
Academy of Sciences. U.S.A., 93, 12616-12620.
Suarez R. K., Staples J. F., Lighton J. R. B., Mathieu-Costello O. (2000). Mitochondrial
function in flying honeybees (Apis mellifera): respiratory chain enzymes and electron flow from
complex III to oxygen. - Journal of Experimental Biology, 203, 905-911.
Surholt B., Newsholme E.A. (1981). Maximum activities and properties of glucose 6-phosphatase in
muscles from vertebrates and invertebrates. – Biochemistry Journal, 198, 621-629
Surholt B., Greive H., Baal T., Bertsch A. (1990). Non-shivering thermogenesis in asynchronous fligt
muscles of bumblebees? Comparative studies on males of Bombus terrestris, Xylocopa sulcatipes and
Acherontia atropos. – Comp. Biochem. Physiol., A 97, 493-499.
Surholt B., Greive H., Baal T., Bertsch A. (1991). Warm-up and substrate cycling in flight muscles of
male bumblebees, Bombus terrestris. – Comp. Biochem. Physiol., A 98, 299-303.
Talbot B.G., Muir J.G., Huber R.E. (1975). Properties of a free and a solubilized form of
bound a,a-trehalase purified from honey bee thorax. – Canad. J. Biochem., 53, 1106-1117
Wegener G. (1996). Flying insects: model systems in exercise physiology. - Experientia, 52, 5, 404-412.
Wegener G., Schmidt H., Leecht A.R., Newsholme E.A. (1986). Antagonistic effects of hexose 1,6bisphosphates and fructose 2,6-bisphosphate on the activity of 6-phosphofructokinase purified from
honeybee flight muscle. - Biochemical Journal , 236, 925-928.
Wolf T. J., Ellington C. P., Davis S., Feltham M. J. (1996). Validation of the doubly labelled water
technique for bumblebees Bombus terrestris (L.). - The Journal of Experimental Biology, 199, 959-972.
Woodring J., Boulden M., Das S., Gäde G. (1993) Studies on blood sugar homeostasis in the
honeybee (Apis mellifera, L.) - Journal of Insect Physiology, 39, 1, 89-97.
19