ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК На правах рукописи Коршунова Ирина Олеговна ВЛИЯНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И НАНОМЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РОДОКОККОВ 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Куюкина Мария Станиславовна Пермь – 2016 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..................................................................................... 4 ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................... 11 Глава 1. Биологические особенности родококков и возможности их использования в биотехнологии ...................................................................... 11 Глава 2. Применение органических растворителей в биокатализе гидрофобных соединений ................................................................................. 15 2.1. Получение продуктов биокаталитических реакций с использованием устойчивых к растворителям штаммов микроорганизмов ........................ 18 2.2. Физиологические основы устойчивости бактерий к воздействию органических растворителей ......................................................................... 28 Глава 3. Использование методов атомно-силовой и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в исследовании морфофункциональной стабильности бактериальных клеток ............................................................... 33 3.1. Исследование наноморфологии и упруго-механических свойств бактериальных клеток .................................................................................... 35 3.2. Применение комбинированных систем микрокопирования в микробиологических исследованиях ........................................................... 38 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ..................................................................... 41 Глава 4. Материалы и методы исследования .................................................. 41 4.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования ......................... 41 4.2. Определение жизнеспособности родококков после воздействия органических растворителей ......................................................................... 45 4.3. Исследование влияния органических растворителей на структурноморфологические особенности родококков ................................................ 48 4.3.1. Морфология клеточной поверхности ................................................. 48 4.3.2. Адгезионные и упруго-механические характеристики клеток ....... 50 4.4. Исследование влияния органических растворителей на физиологические свойства родококков ....................................................... 51 3 4.4.1. Дыхательная активность клеток ......................................................... 51 4.4.2. Определение работы эффлюксных насосов ...................................... 51 4.4.3. Определение суммарных клеточных липидов .................................. 52 4.5. Поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генов эффлюксных насосов ..................................................................................... 53 4.6. Статистическая обработка результатов ................................................ 53 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ............................. 54 Глава 5. Исследование жизнеспособности родококков при инкубировании в присутствии органических растворителей ................................................... 54 Глава 6. Устойчивость родококков к органическим растворителям в зависимости от условий культивирования...................................................... 62 Глава 7. Морфофункциональные свойства родококков при инкубировании в органических растворителях ......................................................................... 69 Глава 8. Влияние органических растворителей на упруго-механические свойства клеток родококков ............................................................................. 86 Глава 9. Изучение активности эффлюксных насосов при формировании устойчивости родококков к органическим растворителям ........................... 90 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................................... 97 ВЫВОДЫ ............................................................................................................. 102 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................... 103 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АСМ – атомно-силовая микроскопия ИНТХ – йодонитротетразолия хлорид КЛСМ – конфокальная лазерная сканирующая микроскопия МПА – мясопептонный агар НФБ – натрий-фосфатный буфер ФАβН – фенил-аргинин β-нафтиламид ABC – ATP-binding cassette LB – Luria Bertrani MATE – multidrug and toxic compound extrusion MFS – major facilitator superfamily RND – resistance/nodulation/cell division RS – Rhodococcus Surfactant SMR – small multidrug resistance 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Биокаталитические системы, включающие органические растворители в качестве среды для биотрансформации гидрофобных стереоизомеров соединений, и используются энантиомеров с при высокой получении химической регио-, чистотой, стабильностью и выходом целевого продукта (Braco, 1995; Cabral et al., 1997; Carrea, Riva, 2000). Существует несколько вариантов таких систем: (1) смеси водной среды и гидрофильного растворителя; (2) двухфазные системы, состоящие из водной среды и гидрофобного растворителя; (3) органические системы (Carrea, Riva, 2000; Schmid et al., 2001). При этом в качестве биокатализаторов применяют целые клетки или ферменты микроорганизмов. Использование целых клеток снижает стоимость производства и число этапов пробоподготовки, а также обеспечивает защиту ферментов от денатурации под действием растворителей (Ishige et al., 2005). Устойчивые к растворителям в современных бактериальные штаммы биотехнологических все чаще используют производствах, например, при получении ароматизаторов, фармацевтических препаратов, химически чистых реактивов (Schmid et al., 2001; Heipieper et al., 2007). Следует отметить, что проведение биокатализа в органической или водноорганической среде позволяет увеличить трансформации водонерастворимых выход целевых продуктов субстратов и облегчить процесс их выделения, а также снизить вероятность образования побочных продуктов и обеспечить термодинамическое равновесие реакционной системы (Безбородов и др., 2008; Braco, 1995; Cabral et al., 1997; Carrea, Riva, 2000; Schmid et al., 2001; Bühler et al., 2003; Bhattacharyya et al., 2012; Zingaro et al., 2013). Известно, что органические растворители нарушают структурную и функциональную целостность мембран, приводя к гибели клеток. Обнаружена корреляция между токсичностью растворителя и его гидрофобностью, измеряемой как коэффициент распределения 6 в системе н-октанол-вода logPO/W. Как правило, чем выше значение logPO/W, тем ниже токсичность растворителя для клеток (Sikkema et al., 1995). Однако, в литературе имеются противоречивые сведения о воздействии растворителей на различные группы микроорганизмов и не выяснены до конца закономерности формирования устойчивых к растворителям фенотипов (Isken, de Bont, 1998; Segura et al., 1999; Duque et al., 2010). Актинобактерии рода Rhodococcus являются перспективными агентами биотехнологии, они способны к селективной трансформации широкого спектра сложных органических веществ и устойчивы к экстремальным физико-химическим факторам среды (Ившина и др. 2007; de Carvahlo, 2010; Kuyukina, Ivshina, 2010; Ivshina et al., 2012). Поэтому актуально исследование механизмов устойчивости родококков к воздействию растворителей. Атомно-силовая изучения микроскопия структуры (АСМ) поверхности и обеспечивает возможность наномеханических свойств микроорганизмов в физиологических условиях среды (Dufrêne, 2002). Сравнительно недавно появились совмещенные системы сканирования, в частности АСМ и конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ), перспективные для анализа морфологических, упругомеханических и наноструктурных перестроек бактериальных клеток под действием органических растворителей (Flores, Toca-Herrera, 2009). Цель настоящей работы – исследование влияния органических растворителей на морфофункциональные и наномеханические свойства актинобактерий рода Rhodococcus, отбор устойчивых штаммов, перспективных для биотехнологического использования. Основные задачи исследования: 1. Изучить влияние органических растворителей на жизнеспособность бактерий и отобрать наиболее устойчивые штаммы родококков. 2. Исследовать динамику морфофункциональных родококков при воздействии органических растворителей. перестроек 7 Определить упругомеханические и адгезионные характеристики 3. устойчивых к растворителям бактерий. Оценить 4. роль эффлюксных насосов в формировании устойчивости родококков к органическим растворителям. Научная новизна. Установлено, что актинобактерии рода Rhodococcus характеризуются высокой (жизнеспособность составляла от 72 до 119%) устойчивостью к воздействию гидрофобных растворителей (logPO/W ≥ 2,5) и чувствительны составляла (жизнеспособность от до 22 46%) к гидрофильным растворителям (logPO/W ≤ 0,9). Выявлено 1,2–7-кратное повышение степени жизнеспособности родококков в присутствии растворителей при культивировании в богатой органической среде LB по сравнению с клетками, выращенными в минеральной среде RS. Показана способность и родококков циклогексана с к диссоциации формированием более в присутствии устойчивых (на н-декана 36–86%) к растворителям R-форм. С помощью комбинированного КЛСМ-АСМ сканирования впервые изучена динамика морфологических перестроек родококков под действием растворителей, выявлены изменения микрои нанорельефа (на 14–79 и 1,3–2,5 нм соответственно) и увеличение относительной площади поверхности (на 5–9%) жизнеспособных клеток. В режиме силового АСМ-картирования обнаружено снижение модуля упругости и перераспределение адгезивных участков на поверхности бактериальных клеток под действием растворителей. Выявленные изменения морфологических и наномеханических свойств коррелировали с повышением количества суммарных липидов (на 9–42%) и скорости дыхания (на 3–34 мкл/мин) устойчивых к растворителям родококков. Впервые показано участие H+- и Na+-зависимых эффлюксных насосов в формировании устойчивости родококков к воздействию органических растворителей. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о механизмах устойчивости грамположительных бактерий к воздействию органических растворителей. 8 Выявленные адаптационные механизмы включают изменение морфологических и наномеханических свойств и активацию работы эффлюксных насосов. В результате исследования отобраны штаммы родококков ‘R. longus’ ИЭГМ 32, ИЭГМ 69, ИЭГМ 589, R. opacus ИЭГМ 57, ИЭГМ 58, R. ruber ИЭГМ 326, ИЭГМ 343 обладающие множественной устойчивостью к органическим растворителям и перспективные для биотехнологического использования. Разработан метод количественной оценки влияния растворителей на бактерии с помощью комбинированного КЛСМ-АСМ-сканирования, включающий дифференцированное определение морфометрических и наноупругих показателей живых и мертвых клеток. Предложенный метод и устойчивые к растворителям штаммы могут использоваться при оптимизации процессов биокатализа в двухфазных водно-органических системах. Основные положения, выносимые на защиту 1. Актинобактерии рода Rhodococcus устойчивы к гидрофобным (logPO/W ≥ 2,5) и чувствительны к гидрофильным (logPO/W ≤ 0,9) растворителям. Отдельные представители R. opacus, R. ruber и ‘R. longus’ характеризуются множественной устойчивостью к органическим растворителям. 2. Воздействие органических растворителей приводит к изменению морфофизиологических характеристик родококков (относительной площади и шероховатости клеточной поверхности, количества суммарных липидов и дыхательной активности, а также диссоциации и агрегации клеток). 3. Воздействие органических растворителей приводит к изменению наномеханических свойств родококков, в частности к снижению их эластичности и перераспределению адгезивных участков клеточной поверхности. 4. В формировании устойчивости родококков к органическим растворителям принимают участие H+ и Na+-зависимые эффлюксные насосы. 9 Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на VI, VII и VIII Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия», Иркутск, 2013, Екатеринбург, 2014, Новосибирск, 2015; 18-й и 19-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2014, 2015; II Всероссийской школе-конференции микробиологии, молодых иммунологии ученых и «Современные биотехнологии», проблемы Пермь, 2015; 18th International Microscopy Congress, Прага, Чехия, 2014; 12th Mutinational Congress on Microscopy, Эгер, Венгрия, 2015. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в утвержденный ВАК перечень рецензируемых научных изданий и в международную систему научного цитирования Scopus (Прикладная биохимия и микробиология, Journal of Microbiological Methods). Объем и структура работы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 27 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы, включающего 239 наименований работ, в том числе 28 отечественных и 211 зарубежных авторов. Связь работы с крупными программами и собственный вклад автора. Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение функционального и видового разнообразия микроорганизмов, полезных для экоценозов и практической деятельности человека» (номер Программой госрегистрации фундаментальных 01201353247). исследований Работа поддержана Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (12-П-4-1052), грантами Российского 10 фонда фундаментальных исследований 14-14-00643 и госзадания Минобрнауки (6.1194.2014/К). Научные положения и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. 11 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Биологические особенности родококков и возможности их использования в биотехнологии Актинобактерии рода Rhodococcus широко распространены в природе и выделяются из водных (поверхностных, сточных, грунтовых) и почвенных биотопов. Благодаря высокой устойчивости к токсическим соединениям (Ившина и др., 2007), наличию сложных ферментных систем и уникальных метаболических путей, позволяющих трансформировать или использовать в качестве источника углерода и энергии сложные органические соединения (Larkin et al., 2005; Martinkova et al., 2009), наличию генов биодеградации и механизмов горизонтального переноса генов (Larkin et al., 2010) представители данного рода являются перспективным объектом биотехнологических исследований (Ившина и др., 1987; Жуков и др., 2006). Среди родококков обнаружено сравнительно небольшое число патогенных видов (R. equi, R. fascians) по сравнению с представителями близких родов Corynebacterium, Micobacterium, Nocardia (Finnerty, 1992; Rieβ et al., 2003; Stes et al., 2010; Vázquez-Boland et al., 2010). Родококки представляют собой грамположительные, палочковидные (0,6–0,9 мкм в толщину и от 2–5 до 7–12, редко до 15–18, мкм в длину), неподвижные, некислотоустойчивые формы, слабоветвящиеся или с тенденцией к истинному ветвлению и V-образному распределению клеток, характерной особенностью которых является плеоморфизм и трехстадийный цикл развития (кокки – ветвящиеся нитевидные клетки – кокки). Родококки способны к росту на жидких и агаризованных полноценных питательных средах при температуре 28 оС и рН от 6,8 до 7,0, а также на минеральных средах с добавлением источников углерода и энергии (Ившина и др., 1987). Родококки имеют IVA хемотип клеточной стенки, которая предполагает наличие мезо-диаминопимелиновой кислоты, арабинозы, галактозы и миколовых кислот. Клеточная стенка данных бактерий 12 представляет собой пептидогликановый слой ковалентно связанный с полисахаридом арабиногалактаном, этерефицированным миколовыми кислотами. Наличие α-разветвленные миколовых кислот, β-гидроксилированные представляющих жирные кислоты, собой является уникальной особенностью актинобактерий рода Rhodococcus, а также родов Corynebacterium, Dietzia, Mycobacterium, Nocardia, Skermania, Tsukamurella, которые объединены в особую группу «mycolata». Данные соединения придают клеточной стенке липофильный характер и, как следствие, высокое сродство с углеводородными субстратами (Коронелли, 1996; Ившина, 2014; Nishiuchi et al., 2000; Sutcliffe et al., 2010). Бактериальная адгезия является первоначальным этапом биотрансформации любого гидрофобного соединения и предполагает наличие гидрофобной клеточной стенки. Представители рода Rhodococcus, в особенности R. ruber, характеризуются высокой степенью адгезии к углеводородным субстратам (Рубцова и др., 2012) и продуцируют гликолипидные биосурфактанты, представляющие собой молекулы трегалозы, ацилированные жирнокислотными остатками различной длины углеродной цепи. Биосурфактанты синтезируются при росте родококков в присутствии углеводородов, снижают поверхностное натяжение воды, способствуют эмульгированию субстрата и его проникновению внутрь клетки. Данные соединения выполняют также важную биологическую функцию в межклеточной сигнализации при микробных взаимодействиях, участвуют в формировании биопленок и клеточной дифференциации, бактериальном патогенезе и антагонизме (Куюкина, 2006; Kuyukina, Ivshina, 2010a). Биосурфактантные препараты применяются для гидрофобизации гранул поливинилового спирта (Kuyukina et al., 2006) и древесных опилок (Ivshina et al., 2013) с целью повышения эффективности иммобилизации клеток углеводородокисляющих родококков. Кроме того, перспективно использование нетоксичных биосурфактантов родококков в биомедицине 13 в качестве иммуномодуляторов и противоопухолевых агентов. Так, трегалолипиды из R. ruber стимулировали продукцию интерлейкина-1β и фактора некроза опухоли (TNF-α) в моноцитах человека (Gein et al., 2011). Благодаря функциональной стабильности, низкой токсичности и безопасности для окружающей среды Rhodococcus-биосурфактанты могут быть использованы деэмульгаторов, в промышленности увлажняющих и в качестве эмульгаторов, пенообразующих реагентов, функциональных пищевых ингредиентов, детергентов или флокулянтов. Другая область применения биосурфактантов – десорбция и солюбилизация нефтяных углеводородов и их производных из загрязненной почвы и, таким образом, увеличение их биодоступности для микробных клеток в процессах биоремидиации нефтезагрязненных ландшафтов (Kuyukina, Ivshina, 2010a). Родококки способны утилизировать широкий спектр гидрофобных органических соединений, таких как алифатические и ароматические углеводороды, моно- и полициклические ароматические соединения и их галогензамещенные производные, органические сульфиды, фенолы, галогенированные фенолы, ароматические кислоты, замещенные бензолы, анилины, нитрилы (Finnerty, 1992; Warhust, Fewson, 1994; Martínkova et al., 2009). Данные соединения использовались в промышленном производстве десятки лет и на сегодняшний день для многих из них (в частности, для полихлорированных бифенилов) установлены высокая токсичность, канцерогенность, тенденция к биоаккумуляции и, вместе с тем, высокая химическая стабильность (Seeger, Pieper, 2010). Известно, что микроорганизмы играют важнейшую роль в вовлечении антропогенного углерода в естественные круговороты и очистке окружающей среды от стойких органических загрязнителей. При этом родококки являются одной из самых перспективных групп бактерий, пригодных для использования в биоремедиации (Соляникова и др., 2010; Larkin et al., 2005; Kuyukina et al., 2009a, 2009b; Martínkova et al., 2009; Kuyukina, Ivshina, 2010b). 14 Способность родококков к биотрансформации и энантиоселективному синтезу биологически активных веществ, красителей и интермедиатов для органического синтеза обуславливает еще одну область их применения. Штаммы родококков используются в трансформации индола (Yamashita et al., 2007), тиоанизола (Елькин и др., 2010), β-ситостерола (Ноговицина и др., 2011) и других стеролов и стероидов (Yam et al., 2011), бетулина (Grishko et al., 2013), дигидроабиетиновой кислоты (Черемных, 2014; Vorob’ev et al., 2001), акрилонитрила (Kamal et al., 2011) и других соединений (Warhust, Fewson, 1994; Yam et al., 2011). Поскольку для трансформации гидрофобных субстратов требуется их предварительное растворение в органическом растворителе, актуален поиск устойчивых к данным соединениям штаммов родококков и путей проведения данных реакций в водно-органических средах (de Carvalho, 2010). Так, обнаружены штаммы R. equi, устойчивые к циклогексану и тетрахлороэтану (Ahmad, Johri, 1993), R. erythropolis – к додекану и тетрадекану (de Carvalho et al., 2005; Hamada et al., 2008; Morrish et al., 2008), R. opacus – к бис(2этилгексил) фталату и тетрадекану (Yamashita et al., 2007; Hamada et al., 2008), R. ruber – к ацетону и 2-пропанолу (Stampfer et al., 2003; Karabec et al., 2010). Таким образом, актинобактерии рода Rhodococcus обладают широким спектром преимуществ по сравнению с другими группами микроорганизмов и являются перспективными в биокатализе гидрофобных соединений. для использования 15 Глава 2. Применение органических растворителей в биокатализе гидрофобных соединений Биокатализ является относительно безопасным для окружающей среды и экономически выгодным способом производства соединений для химической, фармацевтической и пищевой промышленности. В качестве биокатализаторов используют целые клетки или ферменты микроорганизмов, а реакции проводят, как правило, в водных средах. Однако количественный выход целевых продуктов при данном способе производства может оказаться низким по сравнению с их получением методом химического синтеза, в частности из-за низкой растворимости субстратов и продуктов реакции в воде. К недостаткам использования водных сред также относятся образование побочных продуктов, сложность обеспечения термодинамического равновесия и, как следствие, трудности при выделении продуктов реакции (Schmid et al., 2001). Можно биохимических добиться реакций значительного с повышения использованием ферментов эффективности или клеток, если проводить их в органических растворителях. При этом повышается эффективность реакционной системы, облегчается процесс выделения продукта из органической фазы, не происходит ингибирование процесса трансформации субстрата или образования продукта, и практически отсутствуют побочные реакции (Cabral et al., 1997; Carrea, Riva, 2000). Использование органических растворителей позволяет увеличить выход целевого продукта и уменьшить стоимость биотехнологического производства за счет снижения затрат на реактивы и электроэнергию, проводить невозможные в воде биохимические реакции и получать регио-, стерео- и энантиомерно чистые продукты. Например, в воде некоторые липазы, эстреазы и протеазы катализируют гидролиз эфиров до соответствующих спиртов и кислот, тогда как в спиртах, аминах и тиолах проходят реакции трансэтерификации, аминолиза и тиотрансэтерификации, соответственно, невозможные в водной среде. В растворителях возможны 16 реакции синтеза сложных эфиров из их кислот и спиртов (реакции этерификации) (Carrea, Riva, 2000; Klibanov, 2001; Schmid et al., 2001). Распространено мнение, что ферменты денатурируются в агрессивной органической среде, однако данное утверждение верно главным образом для водно-органических сред. В работе Zaks и Klibanov (1988) показано, что чистый растворитель практически не влияет на каталитическую активность фермента. Ферменты, находясь в органической среде с минимальным содержанием или при полном отсутствии воды, оказываются в так называемой «кинетической ловушке», т.е. сохраняют ту же конформацию, в которой они были лиофилизованы из водной среды. Вода участвует в формировании водородных связей с функциональными группами молекул белков. Однако при отсутствии необходимого минимума воды (например, вода формирует монослой на поверхности молекулы лизоцима при концентрации 0,38 г воды на 1 г фермента), заряженные группы соединяются между собой и образуют «замкнутую» конформацию. Таким образом, лиофилизованные конформационную стабильность и ферменты часто термостабильность сохраняют при переносе из водной среды в органическую. Так же авторами (Zaks, Klibanov, установлено, 1988) что ферментативная активность напрямую зависит от концентрации воды в органической взаимодействуют среде. со Органические связанным с растворители ферментом в основном водным слоем, а не непосредственно с ферментом. Оптимальное для проведения реакций содержание воды в среде составляет от 20 до 40%. Кроме того, продемонстрирована повышенная активность ферментов в водно- органической среде по сравнению с водной средой. Так, активность алкоголь-оксидазы возрастала на 21% в третамиловом спирте, содержащем 10% воды, по сравнению с водой. Происходило 40%-ное увеличение активности раствора полифенол-оксидазы октанола в качестве при использовании среды. 97%-го Использование водного 99,5%-ного 17 изопропилового эфира способствовало повышению активности алкоголь дегидрогеназы на 25%. Считается, что полярные растворители оказывают более разрушительный эффект на структуру фермента по сравнению с неполярными, так как являются водорастворимыми, смывают необходимый водный слой с поверхности фермента и, как следствие, способны лучше проникать внутрь их молекул, вызывая потерю активности и денатурацию. По этой причине, для обеспечения максимальной активности фермента, требуется большее количество воды в смесях с гидрофильными растворителями, по сравнению с гидрофобными (Gupta, 1992; Braco, 1995; Griebenow, Klibanov, 1996; Khmelnitsky, Rich, 1999; Klibanov, 2001). Тем не менее, воздействие высоких концентраций растворителей (в особенности, полярных) приводит к денатурации ферментов. В работе Mozhaev с соавт. (1989) и Khmelnitsky с соавт. (1991) показаны пороговая зависимость активности фермента от концентрации растворителя, а также обратимый характер денатурации ферментов. Griebenow и Klibanov (1996) отметили, что процентное содержание амида I и III в форме α-спирали постепенно снижалось с повышением концентрации ацетонитрила (до 60%) в водной среде. Однако при дальнейшем увеличении концентрации растворителя происходило повышение количества не разрушенного амида. Последнее объясняется тем, что при уменьшении содержания воды в среде, происходит снижение конформационной и термодинамической подвижности фермента и, следовательно, вероятности его денатурации. Следует индивидуальной отметить, что разные восприимчивостью к ферменты различным характеризуются концентрациям растворителя в среде. В исследовании Kamal с соавт. (2013) активность липазы снижалась пропорционально повышению концентрации ацетона, ацетонитрила и диметилформамида, однако максимальная активность фермента была зафиксирована при концентрациях 10, диметилсульфоксида, изопропанола и метанола соответственно. 20 и 30% 18 2.1. Получение продуктов биокаталитических реакций с использованием устойчивых к растворителям штаммов микроорганизмов Применение гидрофобных целых клеток соединений имеет микроорганизмов преимущество в перед биокатализе ферментными препаратами, так как клеточная стенка и мембрана обеспечивают защиту ферментов от денатурации под действием растворителей. Метаболически активные клетки часто используют в реакциях биосинтеза, требующих участия коферментов и кофакторов, таких как НАД(Ф)Н или АТФ. Использование целых клеток позволяет проводить многостадийные биокаталитические реакции, что делает данный процесс экономически выгодным (Schmid et al., 2001; Ishige et al., 2005; Heipieper et al., 2007; Kim et al., 2007). Впервые штамм Pseudomonas putida IH-2000, устойчивый к высоким концентрациям толуола (≥ 50%) и не использующий его в качестве источника углерода и энергии, был выделен Inoue и Horikoshi (1989). В дальнейшем были обнаружены другие представители рода Pseudomonas, а также Sphingomonas, Arthrobacter, Bacillus, Staphylococcus, Rhodococcus, гептанола, устойчивые бензола, к воздействию хлороформа и других толуола, диметилфталата, растворителей (Heipieper et al., 2007). Биокаталитические системы, в которых используются клетки микроорганизмов, включают в свой состав органические растворители в качестве среды для биотрансформации гидрофобных соединений. Существует несколько вариантов таких систем: (1) смеси водной среды и гидрофильного растворителя; (2) двухфазные системы, состоящие из водной среды и гидрофобного растворителя; (3) растворители (Carrea and Riva, 2000; Schmid et al., 2001). Многие неполярные субстраты и продукты биокаталитических реакций (ароматические, алифатические или гетероциклические соединения) токсичны для клеток, они нарушают структурную и функциональную целостность мембран, приводя к гибели микроорганизмов. Использование 19 двухфазных водно-органических систем, в которых клетки находятся в водной среде, а субстрат и продукты трансформации – в растворителе, делает возможным исключить или снизить данный токсический эффект на клетки. При этом также снижается ингибирующий эффект продуктов реакции на клетки и облегчается процесс их выделения. Возможность добавлять субстрат в процессе трансформации и контролировать его концентрацию в среде позволяет проводить реакции в течении длительного времени и, как следствие, получать больше продукта. Согласно данным ряда европейских химических и фармацевтических компаний, объем производства продуктов, получаемых данным способом, может составлять от единиц до нескольких тысяч тонн в год. В связи с этим, в биотехнологических процессах чаще используются двухфазные водноорганические системы (Salter, Kell, 1995; Isken, de Bont, 1998; Schmid et al., 2001; Heipieper et al., 2007). Эффективность биокаталитического процесса зависит от состава среды культивирования, возраста и плотности инокулята, температуры и давления, уровня pH среды, степени аэрации и продолжительности инкубирования (Zingaro et al., 2013). При этом основной проблемой использования целых бактерий в качестве биокатализаторов является их низкая стабильность и активность в результате токсического действия растворителя (Isken, de Bont, 1998). Выявлена и его корреляция гидрофобностью, между измеряемой токсичностью как логарифм растворителя коэффициента распределения в системе н-октанол-вода logPO/W (отношения равновесных концентраций тестируемого вещества в н-октаноле, насыщенном водой (CO), и в воде, насыщенной н-октанолом (CW)): logPO/W = log(CO/CW) (1) Как правило, чем выше значение logPO/W, тем ниже токсичность растворителя для клеток (так называемое правило Овертона) (Sikkema et al., 1992). Растворители со значением коэффициента logPO/W < 2 считаются 20 наиболее токсичными для клеток, logPO/W > – 4 нетоксичными. Чувствительность к растворителям со значением коэффициента logPO/W от 2 до 4 зависит от видовой и штаммовой принадлежности микроорганизма (Sardessai, Bhosle, 2004; de Carvahlo, 2010). Другими авторами предложены различные методы оценки воздействия растворителей, такие как параметр растворимости Гильдебранда, сольватохромизм красителя, диэлектрическая постоянная, дипольный момент, но для коэффициента logPO/W показана лучшая корреляция с подавлением активности ферментов и степенью токсичности для клеток (Gupta, 1992; Sardessai, Bhosle, 2004; Heipieper et al., 2007; Jasti et al., 2014). Показано, что токсический эффект растворителя зависит не столько от структурных особенностей его молекул, сколько от его способности аккумулироваться в мембране, т.е. от степени гидрофобности, которая как раз и отражена в показателе logPO/W (Heipieper, de Bont, Значение 1994). коэффициента рассчитывается logPO/W экспериментально (OECD, Test No. 123:2006, IDT; ГОСТ 32291-2013) или с помощью специальных программ, таких как Molinspiration (http://www.molinspiration.com), основанных на анализе структуры молекулы растворителя и соотнесения ее со структурами молекул в уже имеющейся базе данных, насчитывающей более 12-ти тысяч соединений. Рядом исследователей (Gupta, 1992; Isken, de Bont, 1998; Sardessai, Bhosle, 2004; de Carvahlo, 2010; Zingaro et al., отмечено, 2013) что вышеуказанная зависимость токсичности растворителя от коэффициента logPO/W наблюдается не во всех случаях. Следует отметить, что данный способ оценки не функциональных в учитывает групп специфические молекулярную растворителя, взаимодействия структуру которые с могут и природу вовлекаться бактериальными клетками, поверхностные свойства которых, в свою очередь, могут меняться в зависимости от вида или штамма (Heipieper et al., 2007). Свойства разных растворителей, такие как полярность, поверхностный заряд, электрохимический потенциал, оказывают влияние на селективность реакций 21 с участием одних и тех же ферментов и субстратов (Carrea, Riva, 2000). Концентрация растворителя на поверхности клетки напрямую зависит от его концентрации в воде (Heipieper, Martínez, 2010; de Carvahlo, 2010). Можно считать, что наилучшим выбором для проведения конкретной реакции биотрансформации будет растворитель, коэффициент logPO/W которого примерно совпадает с коэффициентом logPO/W субстрата и продукта. Например, если в качестве субстрата выступает 4-хлорофенол (logPO/W = 2,4), а продуктом является 4-хлорокатехол (logPO/W = 2,0), то оптимальным растворителем для биотрансформации будет, например, толуол (logPO/W = 2,5) (Heipieper et al., 2007). Органические растворители используются в процессах биосинтеза продуктов пищевой, фармацевтической, химической промышленности. Ферментные системы дегидрирования, микроорганизмов гидролиза, селективного катализируют отщепления, реакции ацилирования, гидроксилирования субстратов и др. (de Bont, 1998; Schmid, 2001; Sardessai, Bhosle, 2004; Ishige et al., 2005; Heipieper et al., 2007; Polland, Woodely, 2007; Zingaro для et al., Примеры 2013). биотрансформации приведены в таблице 1. в использования присутствии микроорганизмов органических растворителей Таблица 1 – Примеры биотрансформаций с использованием микроорганизмов в присутствии органических растворителей Субстрат Продукт Область применения продукта Биокатализатор Растворитель (logPO/W), его оптимальная объемная концентрация Время биотрансформации Литература Ацетат кортизола Ацетат преднизона Фармакологически активное вещество Arthrobacter simplex TCCC 11037-UV15X1-2 Этанол (-0,29), 8-32,6% 24 ч Luo et al., 2014 1-ацетонафтон (S)-(+)-1-(1’нафтил) этанол Химическая и фармацевтическая промышленность Geotrichum candidum NCIM 908 Бензиловый спирт (1,1), 50% 11–23 ч Bhattacharyya et al., 2012 Изоэвгенол Ванилин Пищевой ароматизатор Brevibacillus agri 13 Бутилацетат (1,8*), 30% 72 ч Wangrangsimagul et al., 2012 Нитрил миндальной кислоты (R)-(–)миндальная кислота Прекурсор для E. coli синтеза JM109/pNLE фармакологически активных веществ Толуол (2,5), 50% 12 ч Zhang et al., 2011 23 Продолжение таблицы 1 Субстрат β-ситостерол Продукт 4-андростен3,17-дион Область применения продукта Биокатализатор Интермедиат в производстве фармацевтических стероидов Mycobacterium sp. NRRL B-3805 Растворитель (logPO/W), его оптимальная объемная концентрация Время биотрансформации Литература Толуол (2,5) 24 ч или тетрахлорметан (2,8*), 50% Marques et al., 2010 Эпихлоргидрин (S)-эпихлоргидрин Прекурсор для Aspergillus niger фармакологиZJB-09173 чески активных веществ Циклогексан (3,2), 95-100% 3ч Jin et al., 2012 1-βарбинофуранозилцитозин Фармакологически активное вещество Гексан (3,5) и пиридин (0,7*), 17% и 50% 120 ч Li et al., 2012 5’-O-ацетил 1-β-арбинофуранозилцитозин и 3’-O-ацетил 1-β-арбинофуранозилцитозин Aspergillus orizae 3.5232 24 Продолжение таблицы 1 Субстрат Продукт Область применения продукта Биокатализатор Растворитель (logPO/W), его оптимальная объемная концентрация Время биотрансформации Литература транс-3фенилглицидат (2S,3R)-3фенилглицидата Прекурсор для Enterobacter sp. производства ECU1107 фармакологически активных веществ Изооктан (3,7*), 24 ч 50% Zhou et al., 2013 Хинальдин 4-гидроксихинальдин Химическая промышленность Додеканол (4,8), 20% 10–18 ч Ütkür et al., 2012 Фарнезил пирофосфат аморфа-4,11диен Интермедиат E. coli W3110 в синтезе фармакологически активных веществ Додекан (6,6), 20% 60 ч Newman et al., 2006 Индол Индиго Краситель Додекан (6,6), 42,27% 6ч Shi et al., 2013 P. putida KT2440 E. coli BL21 (DE3) 25 Продолжение таблицы 1 Субстрат Продукт Область применения продукта Ароматизатор Биокатализатор Растворитель (logPO/W), его оптимальная объемная концентрация Литература 8ч Girhard et al., 2009 Додекан (6,6), 15% и 30% 73 ч de Carvalho et al., 2005; Morrish et al., 2008 1-нафтол Компонент E. coli Лаурил ацетат красителей, TG1/pBS(Kan)TO (7,0), 20–80% лекарств, M-Green инсектицидов, ароматизаторов и сурфактантов 48 ч Garikipati et al., 2009 Индиго Краситель 24 ч Yamashita et al., 2007 (+)-валенсен (+)-нуткатон (–)-транскарвеол (R)-(–)-карвон Ароматизатор Нафталин Индол E. coli CYP109B1 Додекан (6,6) или гексадекан (8,8*), 10% и 20% Время биотрансформации R. erythropolis DCL14 R. opacus B-4 бис(2этилгексил) фталат (9,6), около 99% 26 Продолжение таблицы 1 Субстрат Продукт Область применения продукта Биокатализатор Растворитель (logPO/W), его оптимальная объемная концентрация Время биотрансформации Литература Псевдокумол 3,4диметилбенза льдегид Ароматизатор, E. coli JM101 компонент полимеров, фармакологически активных веществ, чистых реактивов бис(2этилгексил) фталат (9,6), 50% 30 ч Bühler et al., 2003 (S)-лимонен (S)-периллиловый спирт Фармакологически активное вещество, компонент косметики, синтетический прекурсор бис(2этилгексил) фталат (9,6), около 30% 26 ч Cornelissen et al., 2012 P. putida KT2440 27 Окончание таблицы 1 Субстрат Толуол Продукт 3-метилкатехол Область применения продукта Химическая промышленность Биокатализатор P. putida MC2 Растворитель (logPO/W), его оптимальная объемная концентрация бис(2этилгексил) себациновой кислоты (10,1), 10–50% Время биотрансформации 14 ч Литература Prpich et al., 2007 Примечание – * значение logPO/W рассчитано с помощью программы Molinspiration (http://www.molinspiration.com). 28 2.2. Физиологические основы устойчивости бактерий к воздействию органических растворителей Известно, что органические растворители разрушают биомакромолекулы, такие как ДНК и РНК, липиды и белки, что, в свою очередь, приводит к нарушению клеточного транспорта, энергообмена, синтеза и репарации ДНК, синтеза белков, к ингибированию метаболических процессов и электрон-транспортных взаимодействий (McDonnell, Russell, 1999; Zingaro et al., 2013). По данным электронной микроскопии (de Smet et al., 1978; Aono et al., 1994; Alvarez et al., 1996), растворители накапливаются в клеточной мембране и изменяют ее проницаемость. В частности обнаружено, что фенол приводит к выбросу ионов калия и молекул АТФ из клеток E. coli, а толуол провоцирует выброс РНК, фосфолипидов и белков в результате разрушения цитоплазматической мембраны. При этом происходит увеличение площади поверхности мембраны и скорости пассивного транспорта, что ведет к снижению протонного градиента и зета-потенциала клеток. В результате понижается энергетический статус клетки, подавляется синтез АТФ, активность АТФ-азы и ферментов, вовлеченных в процесс переноса электронов. Также в результате аккумуляции растворителей в мембране снижается активность мембранных белков, увеличивается текучесть мембраны и, как следствие, снижается ее стабильность, меняется структура и характер взаимодействия между компонентами мембраны (Isken, de Bont, 1998). К защитным механизмам бактериальных клеток от токсического воздействия физико-химических факторов относятся: (1) активация системы стресс-ответа, включая систему белков теплового шока, (2) изменение состава и структуры клеточных стенок и мембран, (3) активация метаболических и транспорт-зависимых систем детоксикации, (4) изменения в процессах транскрипции и трансляции (Zingaro et al., 2013). Бактерии используют перечисленные адаптационные приемы для преодоления токсического эффекта органических растворителей. 29 Так, меняется текучесть цитоплазматической мембраны посредством изменения в соотношении ненасыщенных (цис- и транс-изомеров) и насыщенных жирных кислот, в ходе гомеоэластичной адаптации. Трансненасыщенные и насыщенные жирные кислоты имеют более компактную, по сравнению с цис-ненасыщенными кислотами, структуру, поэтому их повышенное содержание ведет к снижению текучести мембраны. Способность к транс-изомеризации с участием энергетически независимой изомеразы наблюдается у устойчивых к растворителям бактериальных культур. Как правило, воздействие полярных растворителей приводит к увеличению содержания ненасыщенных жирных кислот, тогда как воздействие неполярных растворителей, напротив, приводит к снижению их количества. Интересно, что цис/транс-изомеризация наблюдается также при голодании, в присутствии антибиотиков и тяжелых металлов и, предположительно, может служить механизмом общего стрессответа микроорганизмов. Помимо гомеоэластичной адаптации происходит увеличение количества и скорости синтеза фосфолипидных компонентов в устойчивых к органическим растворителям бактериальных клетках. Наружная мембрана грамотрицательных бактерий может принимать пассивное участие в формировании устойчивости бактерий к органическим растворителям, выступая в качестве молекулярного барьера, сквозь который не способны проникать частицы с молекулярной массой от 600 до 1000 Да. Показана низкая проницаемость наружной мембраны для многих гидрофобных соединений у устойчивых к органическим растворителям бактерий (Sikkema et al., 1995; Isken, de Bont, 1998). Считается, что грамотрицательные бактерии менее чувствительны к действию органических растворителей, чем грамположительные, так как первые обладают внешней мембраной, которая, в ходе адаптации, способна стабилизироваться посредством прокачки ионов калия и магния, изменения липополисахаридного состава и снижения, таким образом, гидрофобности, а также работы поринов (Isken, de Bont, 1998; Segura 30 et al., 1999). Однако, клеточная стенка грамположительных микобактерий и родококков с высоким содержанием миколовых кислот и липидов может служить физическим барьером и также принимать участие в формировании устойчивости к органическим растворителям (de Carvahlo, 2010). Гидрофобная клеточная стенка имеет большее сродство с гидрофобными соединениями, по сравнению с более гидрофильной стенкой микроорганизмов (van Loosdrecht et al., 1990; Jarlier, Nikaido, 1994). Снижение гидрофильности клеточной стенки может быть адаптационным механизмом к воздействию токсичных растворителей. В то же время, клетки могут адаптироваться к воздействию гидрофобных растворителей благодаря способности к трансформации их в менее токсичные соединения или использованию в качестве источника углерода и энергии (Isken, de Bont, 1998). В данном случае способность некоторых групп микроорганизмов к синтезу биосурфактантов, способствующих солюбилизации гидрофобных соединений, позволяет обеспечить лучшее проникновение субстрата внутрь клетки (Kuyukina, Ivshina, 2010a). Работа снижения эффлюксных токсического микроорганизмов. насосов эффекта Эффлюксные является эффективным химических факторов насосы ответственны за способом на клетки выведение различных типов токсичных соединений (антибиотиков, тяжелых металлов, органических растворителей и т.д.) из клеток и снижение их концентрации до субтоксического уровня (Zheleznova et al., 2000; Ramos et al., 2002). Типы насосов, их кристаллическая структура и механизмы работы активно изучаются с 1980-х гг. в рамках исследования механизмов устойчивости бактерий к антибиотикам (Huda et al., 2003; Lee at al., 2003; Piddock, 2006; Rossi et al., 2006; Fischer et al., 2014). Структура α-спирали белков, являющихся структурными компонентами насосов, изучается методами кругового дихроизма, инфракрасной спектроскопии Фурье, рентгеновской кристаллографии, электронной и криоэлектронной микроскопии. Основной сложностью при постановке экспериментов является воспроизведение 31 нативной трехмерной структуры молекул белков-доменов (Borges-Walmsley et al., 2003). В зависимости от первичной структуры и механизма передачи энергии эффлюксные насосы делятся на два главных семейства: (1) первичные транспортеры, использующие АТФ как источник энергии, или АТФзависимые транспортеры (ATP-binding cassette, ABC); (2) вторичные транспортеры, использующие протонный или натриевый градиент как источник энергии (H+- и Na+-зависимые транспортеры). На основе структурного и функционального сходства вторичные транспортеры делят на четыре семейства (Borges-Walmsley et al., 2003; Marques, 2005): 1. MFS (major facilitator superfamily), обеспечивающие транспорт сахаров, интермедиатов и фармакологически активных веществ. 2. Семейство SMR (small multidrug resistance), отвечающие за транспорт липофильных катионных фармакологически активных веществ. 3. за Семейство RND (resistance/nodulation/cell division), ответственные транспорт липофильных и амфифильных молекул, токсичных двухвалентных катионов, органических растворителей. 4. Семейство MATE (multidrug and toxic compound extrusion), использующие натриевый градиент для откачки фармакологически активных веществ. Сегодня наиболее подробно изучены структура и функции эффлюксных насосов из RND-семейства: AcrAB-TolC, обнаруженные у E. coli, и MexAB-OprM у P. aeruginosa (Ma et al., 1993; Fralick, 1996; Li et al., 1998; et al., 2014). Ramos et al., Эффлюксные 2002; Akama насосы могут et al., обладать 2004; Fischer активностью по отношению к различным группам веществ, в том числе к органическим растворителям. Так, показано что воздействие ароматических и алифатических углеводородов и спиртов индуцировало активность системы эффлюксов SrpABC (семейство RND) у P. putida S12 (Kieboom et al., 1998; Sun et al., 2011). У штамма S accharomyces cerevisiae KK-211 32 обнаружено два ABC транспортера, Pdr10p и Snq2p, участвующих в эффлюксе гидрофобных н-декана и н-ундекана, и два ABC транспортера, Snq2p и Yor1p, участвующих в эффлюксе гидрофильного диметилсульфоксида (Nishida et al., 2013). Ингибиторы эффлюксных насосов используются, в частности, для преодоления проблемы устойчивости вирулентных штаммов бактерий к антибиотикам. Поиск ингибиторов эффлюксных насосов микроорганизмов осуществляется путем модификации химической структуры антибиотика, скрининга уже известных ингибиторов эффлюксов эукариот или скрининга библиотек химических веществ (Marques, 2005; Cortez-Cordova, Kumar, 2011). Например, обнаружено, что парокситин в 8 раз снижает минимальную ингибирующую концентрацию норфлоксацина против S. aureus, ингибируя активность насоса NorA (семейство RND) (Kaatz et al., 2003; Wei et al., 2004; Marques, 2005). Фенил-аргинин β-нафтиламид (ФАβН, семейство MATE) снижает активность насосов MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN у P. aureginosa и AcrAB-TolC у E. coli, Salmonella typhimurium, Enterobacter aerogenes и ряда других видов бактерий (Marques, 2005). орто-Ванадат – ингибитор пара-гликопротеина (семейство ABC) (Endicott, Ling, 1989), использовался как ингибитор насоса, обеспечивающего эффлюкс изониазида из клеток Mycobacterium smegmatis, также он частично ингибировал эффлюкс бромистого этидия из клеток Lactococcus lactis (Choudhuri et al., 1999; Bolhuis et al., 1994). Отдельными авторами ингибиторы использовались для установления роли различных типов эффлюксных насосов в выведении растворителей из клеток грамположительных бактерий (Matsumoto et al., 2002; Kongpol et al., 2012). Ранее у устойчивых к антибиотикам патогенных штаммов Rhodococcus equi и Rhodococcus fascians были обнаружены гены, ассоциированные с эффлюксными насосами (Gressler et al., 2014; Desomer et al., 1992), а в геном штамма Rhodococcus erythropolis осуществлена транспозиция гена устойчивости к хлорамфениколу (Nagy et al., 1997). 33 Глава 3. Использование методов атомно-силовой и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в исследовании морфофункциональной стабильности бактериальных клеток В настоящее время метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) активно применяется в микробиологических исследованиях. АСМ относится к классу сканирующих зондовых микроскопов, и принцип его работы основан на измерении короткодействующих сил взаимодействия между исследуемой поверхностью образца и зондом. Зонд установлен под углом примерно 11о относительно плоскости образца и представляет собой наноразмерное острие, располагающееся на конце упругой консоли (кантилевера). На обратную сторону кантилевера направлен луч лазера. Сканирование проводится с помощью пьезоэлектрических актюаторов, приводящих в движение предметный столик и осуществляющих перемещение образца по осям x и y и/или нанопозиционирования кантилевер измеряют по оси относительное z. Датчики системы положение образца и кантилевера в трех измерениях. При движении зонда вдоль неровной поверхности происходит его изгибание и изменение угла отражения света, который, пройдя через линзу, регистрируется с помощью сегментированного фотодетектора (рисунок 1). На основании полученных данных строится топографическое изображение объекта. Разрешение АСМ составляет от 0,1 до 1 мкм. В зависимости от типа взаимодействия между кантилевером и образцом выделяют три режима работы АСМ: (1) контактный (contact mode), при котором сканирование осуществляется в режиме постоянной силы; (2) полуконтактный (semi-contact/tapping mode), при котором кантилеверу задается постоянная частота колебаний и соприкосновение зонда с образцом происходит только при движении его вниз; (3) бесконтактный (non-contact mode), при котором регистрируются силы (с основном ван-дер-ваальсовы), воздействующие на кантилевер со стороны 34 образца (Потатуркина-Нестерова и др., 2012; Dufrêne, 2002; Bolshakova et al., 2004; Zhexue et al., 2005; Wright, Armstrong, 2006; Dorobantu et al., 2012). Рисунок 1 – Схематическое изображение основных функциональных элементов АСМ (Zhexue et al., 2005). Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (КЛСМ) является мощным инструментом биологических исследований, позволяющим исследовать внутреннюю структуру живых клеток и отдельных органелл и белков в реальном времени и получать двух- и трехмерные изображения. КЛСМ делит последовательное образец на оптические сканирование при секции помощи и осуществляет лазерного луча, сфокусированного на образце. Луч лазера направляется на образец через светоделительную пластину, сканирующее устройство и объектив и фокусируется в условной точке А (рисунок 2), представляющей собой флуоресцентный зонд. Воздействие лазера на зонд приводит к возбуждению и последующей эмиссии света. Поток флуоресценции направляется от образца через объектив, светоделительную пластину, и второй объектив, фокусируется в плоскости игольчатой диафрагмы и регистрируется фотодетектором. При этом свет от точек В и С, лежащих вне фокуса, не попадает в плоскость игольчатой диафрагмы (Лежнев и др., 2001а; Лежнев и др., 2001б; Paddock, 1999; Sanderson et al., 2014). 35 Рисунок 2 – Принципиальная схема, иллюстрирующая работу КЛСМ. 1 — сканирующий столик, 2 — исследуемый образец, 3, 7 — объективы, 4 — сканирующее устройство, 5 — светоделительная пластина, 6 — луч света от лазера, 8, 12 — изображение точек В и С, 9 — игольчатая диафрагма, 10 — изображение точки А в центре игольчатой диафрагмы, 11 — приемник излучения, 13, 15 — свечение точек В и С, находящихся вне фокуса объектива 3, 14 — свечение точки А, находящейся в фокусе объектива 3 (Лежнев и др., 2001а). Совмещение фокуса объектива и плоскости сканирования, а также фокуса второго объектива с игольчатой диафрагмой отражено в термине «конфокальность». Именно благодаря наличию специальной диафрагмы достигается высокое разрешение изображений. Латеральное разрешение dc(R) по Рэлею для КЛСМ рассчитывается по формуле: dc(R) = 0,56λ / NA (2) где λ – длина волны источника света в нм, NA – числовая апертура объектива (Лежнев и др., 2001а). 3.1. Исследование наноморфологии и упруго-механических свойств бактериальных клеток АСМ позволяет изучать морфологию поверхности объекта с нанометровым разрешением. С помощью данного прибора возможно 36 получать трехмерные изображения бактериальных клеток (Олюнина и др., 2009; Мачулин и др., 2012; Артамонова, Потатуркина-Нестерова, 2014; Валышев, Васильченко, 2013; Ahimou et al., 2003; Pelling et al., 2005; Alsteens et al., 2008; Crismaru et al., 2011; Dong et al., 2011; Tyagi, Malik, 2012), биопленок (Ерохин и др., 2012; Zelaya et al., 2010) и объектов биологической и небиологической природы на поверхности клеток (Schönherr, 2012; Méndez-Vilas et al., 2011; Oestreicher et al., 2012; Rheinlaender et al., 2012; Zhang et al., 2012) в физиологических условиях среды. В режиме силовой спектроскопии АСМ может быть использован для изучения упругомеханических свойств клеток, в частности молекулярных взаимодействий (Waar et al., 2005; Cao et al., 2007; Burgain et al., 2013), сил адгезии (VadilloRodríguez et al., 2004a, 2004b; Boks et al., 2008; Park et al., 2009; Chen et al., 2010; Tao et al., 2011; Younes et al., 2012), поверхностного заряда (Chandraprabha et al., 2010; Francius et al., 2011) и упругости (van der Mei et al., 2000; Beckmann et al., 2006; Gaboriaud et al., 2008; Vadillo-Rodríguez et al., 2008; Kang, Elimelech, 2009; Soon et al., 2011; Formosa et al., 2012; Dhahri et al., 2013). Важным достоинством АСМ является простая процедура пробоподготовки, позволяющая свести к минимуму повреждения живых микробных клеток. Наиболее распространенные проблемы при АСМсканировании микроорганизмов – это ненадежное закрепление клеток, их десорбция с поверхности подложки при добавлении жидкой среды и/или смещение клеток иглой кантилевера во время сканирования. Поэтому для проведения сканирования в жидкости требуется применение дополнительных методов иммобилизации клеток, от качества которой в итоге зависят качество АСМ-изображений и получение воспроизводимых данных об упруго-механических свойствах исследуемых объектов (Dufrêne, 2002; Bolshakova et al., 2004; Meyer et al., 2010). К указанным методам относятся (1) механическое закрепление клеток на твердых поверхностях с помощью мембранных фильтров (Kasas, Ikai, 1995) или литографических 37 решеток (Kailas et al., 2009; Ressier et al., 2008; Dague et al., 2011); (2) адсорбция на поверхности полимеров, таких как желатин (Doktycz et al., 2003), агар (Gad, Ikai, 1995) или агаризованная питательная среда (De et al., 2010), агароза (Micic et al., 2004), поли-L-лизин (Robichon et al., 1999; Waar et al., 2005; Crismaru et al., 2011; Younes et al., 2012; Zhang et al., 2012) и др. (Куюкина и др., 2014); (3) ковалентное связывание (Camesano et al., 2000; Tao et al., 2011), (4) прикрепление с помощью адгезивных белков и лектинов (Kang, Elimelech, 2009; Dague et al., 2011), (5) иммуноадсорбция (Suo et al., 2008, 2009, 2012), (6) химическая фиксация (Razatos et al., 1998; Chao, Zhang, 2011). В свою очередь КЛСМ позволяет визуализировать динамические процессы в живых клетках, включая отдельные молекулы, с помощью дифференцированного флуоресцентного окрашивания. При отслеживании таких параметров как интенсивность, длина волны, поляризация и время флуоресценции, оказывается возможным получать качественную и количественную информации о биологическом образце. С помощью КЛСМ изучают структуру биопленок (Lawrence et al., 1998; Lau et al., 2009; Wouters et al., 2010; Hess et al., 2012; García-Meza et al., 2012), динамику жизнеспособности бактериальных клеток (de Carvalho, da Fonseca, 2004; de Carvalho et al., 2004, 2005, 2007; Li-fen et al., 2007; Crismaru et al., 2011; Dwidjosiswojo et al., 2011; Roberts et al., 2012; de Carvalho, 2012). Базовым принципом флуоресцентной микроскопии является высокоспецифичная визуализация клеточных компонентов при помощи флуоресцентных зондов, которые могут связываться с нуклеиновыми кислотами, полисахаридами такими ионы как распространенным кальция и небиологическими (Stricker, флуоресцентным Whitaker, зондам 1999). относятся структурами, К наиболее производные флуоресцина (например, FITC), родамина (например, TRITC), цианина (например, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7). В зависимости от компонента клетки, с которым связываются красители, их можно разделить на (1) 38 иммунофлуоресцентные, прямо или опосредованно связывающиеся со специфическими белками, (2) красители нуклеиновых кислот (например, DAPI, SYTO 9, пропидиум иодид, акридиновый оранжевый), (3) красители органелл и клеточных компартментов, (4) красители ионов, представляющие собой флуоресцентно меченые хелатирующие агенты (Greb, 2012). 3.2. Применение комбинированных систем микрокопирования в микробиологических исследованиях В последние годы совмещенная микроскопия, объединяющая возможности разных способов визуализации, стала важным инструментом биомедицинских исследований. Фирмы-производители выпускают готовые комбинированные системы (Asylum Research, Zeiss, Leica Microsystems, FEI, JPK, Bruker Corporation, Veeco Instruments и др.) или отдельные приборы с возможностью их совмещения с микроскопами, выпущенными другими компаниями. Также в микроскопических исследованиях все чаще используются системы, совмещающие методы световой и электронной микроскопии (Sjollema et al., 2012; de Boer et al., 2015; Ou et al., 2015; Timmermans, Otto, 2015), рентгеновской и электронной микроскопии (Goode et al., 2015), АСМ и оптической микроскопии (Mathur et al., 2000; Kusick et al., 2005; Mangold et al., 2008; Flores, Toca-Herrera, 2009), в частности АСМ и КЛСМ, и другие (Fonta, Humbel, 2015). Главным недостатком оптической микроскопии является низкое пространственное разрешение, ограниченное дифракцией, равной половине длины волны используемого света (дифракционный предел). В то же время, с помощью АСМ не всегда возможно идентифицировать разнородные поверхностные структуры бактериальных клеток. Совмещение этих двух методов позволяет компенсировать перечисленные недостатки, что дает возможность получать оптическое изображение отдельных клеточных структур и совмещать их с топографическим изображением высокого разрешения, полученным с помощью АСМ (Ludwig et al., 2008; Flores, TocaHerrera, 2009). Однако отдельными исследователями успешно реализовано 39 совмещение АСМ- и КЛСМ-изображений, полученных с помощью отдельных приборов (Fukumoto et al., 2005; Soumetz et al., 2010; Singh et al., 2011; Siuti et al., 2011; Roberts et al., 2012). Так, Meller и Theiss (2006) поочередно получали изображения одного и того же помеченного участка препарата актиновых филламентов зафиксированных на покровном стекле, после чего совмещали два изображения с помощью программы Adobe Photoshop. Комбинированный микроскоп (рисунок 3) представляет собой конструкцию, состоящую из блока АСМ и инвертированного КЛСМ, установленную на виброизоляционном столике. Прибор имеет общий предметный столик, куда устанавливается образец. А Б Рисунок 3 – Схема (Flores, Toca-Herrera, 2009) (А) и фотография внешнего вида (Б) совмещенной системы сканирования, состоящей из АСМ Asylum-MFP-3D-BIO (Asylum Research, США) и КЛСМ Olympus FV1000 (Olympus Corporation, Япония). Помимо микроскопов прибор оснащен компьютерами, мониторами, блоками управления и контроллерами. Прибор установлен на специальном 40 столике и помещен в шкаф, оснащенный системой регистрации и подавления внешней вибрации (Kassies et al., 2005; Flores, Toca-Herrera, 2009). Впервые применение совмещенного в одном приборе АСМ-КЛСМ описано в работе Neagu с соавт. (1994) по изучению лимфоцитов человека. В дальнейшем продемонстрированы возможности применения совмещенного АСМ-КЛСМ на примере сканирования клеток нейроглии лягушки рода Xenopus, политенных хромосом дрозофил, плазмидной ДНК (Vesenka et al., 1995), клеток меланомы (Horton et al., 2000), эпителия человека (Doak et al., 2008). С использованием комбинированного высокоскоростного АСМ и КЛСМ исследовано влияние антимикробного пептида СМ15 на динамику жизнеспособности и поверхностной морфологии клеток E. coli (Fantner et al., 2010). В работе Mosier с соавт. (2012) помимо совмещенной АСМ-КЛСМ системы использована микрофлюидная камера, разработанная специально для выращивания и дальнейшего исследования биопленок. 41 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 4. Материалы и методы исследования 4.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования В работе использованы 29 штаммов, принадлежащих к 6 видам: R. erythropolis (5 штаммов), R. fascians (5 штаммов), ‘R. longus’ (4 штамма), R. opacus (5 штаммов), R. rhodochrous (5 штаммов) и R. ruber (5 штаммов) – из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, WDCM # 768; www.iegmcol.ru). Штаммы выделены из различных источников, способны к биотрансформации гидрофобных субстратов и использовать углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии (таблица 2). Таблица 2 – Штаммы родококков, использованные в работе Номер Источник выделения, Биотехнологически значимые штамма географическое положение свойства Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 24 Грунтовая вода, нефтяное Использует углеводороды как месторождение, Пермский единственный источник край углерода, разлагает эфиры и ароматические кислоты ИЭГМ 186 Вода, загрязненная нефтью, Использует нормальные Камское водохранилище, углеводороды, алифатические Пермский край спирты и ароматические углеводороды как единственный источник углерода ИЭГМ 268, Почва, загрязненная нефтью, Использует углеводороды как ИЭГМ 271 нефтяное месторождение, единственный источник Пермский край углерода 42 Продолжение таблицы 2 Номер Источник выделения, Биотехнологически значимые штамма географическое положение свойства ИЭГМ 767 Шлам, нефтезагрязненный, Использует углеводороды как Пермский край единственный источник углерода Rhodococccus fascians ИЭГМ 35 ИЭГМ 170 ИЭГМ 173 ИЭГМ 278 Грунтовая вода, нефтяное Использует углеводороды как месторождение, Пермский единственный источник край углерода Снежный покров, Использует углеводороды как нефтедобывающее единственный источник предприятие, Пермский край углерода Вода, загрязненная нефтью, Использует углеводороды как Камское водохранилище, единственный источник Пермский край углерода Вода речная, Тюменская Использует углеводороды как область единственный источник углерода ИЭГМ 526 Почва, нефтедобывающее Использует углеводороды как предприятие, Пермский край единственный источник углерода ‘Rhodococcus longus’ ИЭГМ 29, Почва, загрязненная нефтью, Использует углеводороды как ИЭГМ 32 нефтегазовое месторождение, единственный источник Полтавская обл., Украина углерода Почва, р-н Полазненского Использует углеводороды как нефтепромысла, Пермский единственный источник край, Россия углерода. Деградирует нефть ИЭГМ 69 43 Продолжение таблицы 2 Номер Источник выделения, Биотехнологически значимые штамма географическое положение свойства ИЭГМ 589 Почва Использует углеводороды как единственный источник углерода Rhodococcus opacus ИЭГМ 57 Почва, загрязненная нефтью, Использует углеводороды как Украина единственный источник углерода ИЭГМ 58 Почва луговая, Украина Трансформирует тиоанизол ИЭГМ 249 Почва, производство лавсана, Использует углеводороды как Беларусь единственный источник углерода, способен к биодеградации нефти ИЭГМ 263 ИЭГМ 717 Почва, загрязненная нефтью, Деградирует нефть Беларусь и нефтепродукты Почва Устойчив к VO3Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66 Почва, Украина Использует углеводороды как единственный источник углерода, способен к биотрансформации бетулина, органических сульфидов ИЭГМ 67 Почва, Великобритания Использует пропан как единственный источник углерода 44 Продолжение таблицы 2 Номер Источник выделения, Биотехнологически значимые штамма географическое положение свойства ИЭГМ 608 Вода, Пермский край, Россия Использует углеводороды как единственный источник углерода ИЭГМ 639 Снежный покров, Использует пропан, н-бутан, нефтегазовое месторождение, жидкие н-алканы, Пермский край, Россия алифатические спирты как единственный источник углерода ИЭГМ 647 Вода, загрязненная нефтью, Трансформирует тиоанизол Пермский край, Россия Rhodococcus ruber ИЭГМ 219 Вода, река Верхний Ильич, Использует пропан, н-бутан Россия и жидкие н-алканы как единственный источник углерода ИЭГМ 231 ИЭГМ 235 Вода, нефтедобывающее Использует пропан, н-бутан предприятие, Пермский край, как единственный источник Россия углерода Снежный покров, Использует пропан, н-бутан нефтедобывающее как единственный источник предприятие, Пермский край, углерода Россия ИЭГМ 326 Почва торфяная, нефтегазовое Использует пропан, н-бутан месторождение, Пермский как единственный источник край, Россия углерода 45 Окончание таблицы 2 Номер Источник выделения, Биотехнологически значимые штамма географическое положение свойства ИЭГМ 343 Сточные воды, Харбин, Китай Использует пропан и н-бутан как единственный источник углерода Бактерии выращивали на питательном агаре (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия) в термостате при температуре 28 оС в течение 2-х сут, затем в жидкой питательной среде Luria Bertrani (LB) [состав (г/л): триптон – 10,0, дрожжевой экстракт – 5,0, NaCl – 5,0] (Sigma-Aldrich, США) на орбитальном шейкере при 28 оС и 160 об./мин в течение 28 ч. Культуру, выращенную в среде LB, осаждали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 15 мин, дважды отмывали 0,05М натрий-фосфатным буфером (НФБ) [состав (г/л): Na2HPO4 – 3,53, KH2PO4 – 3,39] и ресуспендировали в НФБ, растворителе или в системе растворитель-водная среда до достижения показателя оптической плотности ОП600нм 0,5. 4.2. Определение жизнеспособности родококков после воздействия органических растворителей Инкубирование клеток в присутствии органических растворителей (таблица 3) проводили в НФБ, либо минеральной среде Rhodococcus Surfactant (RS) [состав (г/л): KH2PO4 – 2,0, K2HPO4 – 2,0, KNO3 – 1,0, (NH4)2SO4 – 2,0, NaCl – 1,0, MgSO4 x 7H2O – 0,2, CaCl2 x 2H2O – 0,02, FeCl3 x 7H2O – 0,001] (Ivshina et al., 1998) без добавления дополнительного источника углерода, либо в полноценной среде LB. В качестве биотического контроля использовали суспензию клеток без добавления растворителя, в качестве абиотических или неинокулированную среду. контролей – растворитель, НФБ 46 Таблица 3 – Органические растворители, использованные в работе Использованные Коэффициент органические гидрофобности растворители (logPO/W) н-Декан 5,6 Ч (Россия) н-Гексан 3,5 ХЧ (Россия) Циклогексан 3,2 ≥99% (Sigma-Aldrich, США) Толуол 2,5 ЧДА (Россия) Бутанол-1 0,88 ХЧ (Россия) Изобутанол 0,81 ХЧ (Россия) Этилацетат 0,73 ХЧ (Россия) Ацетон –0,23 ОС.Ч (Россия) Этанол –0,29 ХЧ (Россия) Ацетонитрил –0,33 ЧДА (Россия) Жизнеспособность бактерий Чистота (производитель) после воздействия растворителя оценивали микролуночным методом (Hayashi et al., 2003) с помощью селективного окрашивания 0,2 масс. % водным раствором йодонитротетразолия хлорида (ИНТХ) (Sigma-Aldrich, США). Для этого в 96-луночные полипропиленовые планшеты (Медполимер, Санкт- Петербург) вносили 100 мкл суспензии клеток (ОП600нм 0,5) в среде RS и добавляли растворители до конечной концентрации 20, 50, 80 об. % или в виде паров и инкубировали при 28 ºС, 750 об./мин в течение 1 сут на микропланшетном шейкере-инкубаторе Titramax 1000 (Heidolf- Instruments, Германия). Затем вносили 50 мкл ИНТХ и через 3 ч измеряли ОП630нм окрашенной ИНТХ суспензии (рисунок 4) на микропланшетном фотометре Multiscan Ascent (Thermo Electron Corporation, Финляндия) с программным обеспечением Ascent Software v.2.6 (Thermo Labsystems, Финляндия). Жизнеспособность клеток (в %) рассчитывали по разнице ОП630нм с контрольной (без внесения растворителя) суспензией. 47 1 2 3 5 6 7 4 8 Рисунок 4 – Окрашивание ИНТХ суспензии родококков в микролунках. 1–7 – суспензия родококков разных штаммов, 8 – отрицательный контроль. В другом варианте опыта для изучения влияния среды инкубирования и плотности культуры на устойчивость родококков к растворителям использовали 2-мл микропробирки (Eppendorf, США), в которые вносили 0,5 мл суспензии клеток (ОП600нм 0,5 или 1,0) в НФБ, или среде RS, или LB, добавляли растворители в тех же концентрациях и инкубировали при 28 оС, 1020 об./мин в течение 1 сут. После окрашивания суспензии ИНТХ (100 мкл) образующийся через 3 ч формазан экстрагировали 1 мл этилацетата в течение 1 сут в тех же условиях (рисунок 5). Для полной экстракции формазана микропробирки помещали в ультразвуковую баню Elmasonic S 10/(H) (Elma, Германия) при 37 кГц, 30 оС в течение 15 мин, затем центрифугировали при 12000 об./мин в течение 3 мин для разделения водной и органической фаз и осаждения разрушенных клеток. Концентрацию формазана в этилацетате измеряли на спектрофотометре Lambda EZ 201 (Perkin-Elmer, США) в кварцевых кюветах шириной 10 мм при длине волны 480 нм. Число жизнеспособных клеток рассчитывали по калибровочным графикам зависимости ОП480нм раствора формазана в этилацетате от концентрации клеток (КОЕ/мл), определенной высевом на питательный агар. 48 1 2 3 4 Рисунок 5 – Экстракция формазана этилацетатом из окрашенных ИНТХ суспензий. Клетки R. ИЭГМ ruber 231 в контроле (1) и после инкубирования в н-декане (2), бутаноле-1 (3) и ацетонитриле (4). 4.3. Исследование влияния органических растворителей на структурноморфологические особенности родококков Клетки родококков предварительно инкубировали в течение 1–5 сут в присутствии органических растворителей как указано выше, трижды отмывали от растворителя и ресуспендировали в НФБ до достижения показателя ОП600нм 0,5–0,7. 4.3.1. Морфология клеточной поверхности Исследование родококков морфологии проводили с и структуры использованием поверхности совмещенной клеток системы сканирования, состоящей из атомно-силового микроскопа (АСМ) AsylumMFP-3D-BIO (Asylum Research, США) и конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) Olympus FV1000 (Olympus Corporation, Япония), на базе кабинета микроскопии Пермского государственного национального исследовательского университета. Перед сканированием каплю клеточной суспензии (15–20 мкл) помещали на очищенное 70%-ным этанолом покровное стекло (24 х 50 х 0,15 мм), смешивали с эквивалентным объемом двухкомпонентного флуоресцентного красителя LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit 49 [состав: SYTO 9 (проникает во все клетки) – 6,0 μМ, пропидиум иодид (проникает в клетки с поврежденной мембраной) – 30,0 μМ] (Invitrogen, США) и подсушивали на воздухе в темноте в течение 10–15 мин. Затем препарат промывали деионизированной водой для удаления незакрепившихся клеток и остатков красителя и сканировали с помощью КЛСМ с использованием 100 х иммерсионного объектива (числовая апертура 1,4). Для возбуждения флуоресценции SYTO 9 и пропидиум иодида применяли аргоновый лазер (λ = 488 нм) с 505/525-нм барьерным фильтром и гелий-неоновый лазер (λ = 543 нм) с 560/660-нм барьерным фильтром, соответственно. Изображения размером 0,12 х 0,12 мм (с разрешением 1600 х 1600 пикселей) получали с использованием 1,4 мегапиксельной цифровой камеры со скоростью 40 нм/пиксель. Интенсивность лазеров подбирали таким образом, что бы избежать фонового свечения. Анализ изображений проводили с помощью программы FV10-ASW 3.1 (Olympus Corporation, Япония). Клетки, флуоресцирующие зеленым цветом, считали живыми, красным – мертвыми. В случае появления двойного окрашивания (оранжевой флуоресценции) проводили дополнительную обработку данных КЛСМ-сканирования. Для этого в выбранной области сканирования соответствующей бактериальной клетки подсчитывали число пикселей. В случае, если число зеленых пикселей было больше, чем красных, данную клетку считали жизнеспособной, а при преобладании числа красных пикселей – мертвой. Затем КЛСМ-изображения импортировали в программное обеспечение АСМ (Igor Pro 6.22A, WaveMetrics, США) и проводили АСМ-сканирование нужной области на воздухе в полуконтактном режиме со скоростью 0,2 Гц. Использовали кремниевые кантилеверы АС240ТS (Olympus Corporation, Япония) без покрытия с резонансной частотой 50–90 кГц, константной жесткости 0,5–4,4 Н/м и радиусом кривизны зонда 9 нм. Параметры АСМсканирования (заданное значение, коэффициент усиления, амплитуда приводного сигнала) подбирали так, чтобы избежать механического 50 повреждения клетки. Размеры АСМ-изображений составляли 10–12 мкм или 200 нм. Размеры клеток (длина и ширина) и среднеквадратичную шероховатость поверхности клеток рассчитывали по данным с канала высоты (Height). Объем и площадь клеток рассчитывали по формулам, приведенным Newmann с соавт. (2012) и Kongpol с соавт. (2012): V = r2 π h (3) S = 2r2 π + 2 π r h (4) где V – объем клеток (мкм3), S – площадь клеток (мкм2), r – радиус клеток (= 0,5 ширины, мкм), h – длина клеток (мкм). 4.3.2. Адгезионные и упруго-механические характеристики клеток Наномеханические свойства родококков определяли с помощью АСМ в режиме силовой спектроскопии. Перед сканированием проводили иммобилизацию клеток на подложке. Для этого 15–20 мкл водного раствора поли-L-лизина (0,1 мг/мл) (Sigma-Aldrich, США) помещали на покровное стекло, высушивали на воздухе в течение 30–40 мин, после чего на модифицированную поверхность наносили каплю клеточной суспензии аналогичного объема, подсушивали на воздухе в течение 10–15 мин и промывали деионизированной водой для удаления незакрепившихся клеток. Сканирование проводили в жидкой среде (НФБ) с использованием кремний-нитридных кантилеверов TR400PB (Olympus Corporation, Япония) с Cr/Au напылением, резонансной частотой 7–14 кГц, константой жесткости 0,01–0,05 Н/м, радиусом кривизны зонда 42 нм. Стартовое расстояние, расстояние силы и резонансную частоту кантилевера определяли согласно протоколу компании-производителя (Asylum Research, США). Получали АСМ-изображения размером 10 мкм в контактном режиме со скоростью 1 Гц, после чего проводили силовое картирование сканированной области, путем приближения зонда к образцу и получения силовых кривых в каждой 51 точке (32 х 32 = 1024 точки) и получали карты адгезии зонда кантилевера к поверхности. Модуль упругости (Юнга) измеряли путем индентирования клеток в центре и регистрации силовых кривых. Значение модуля упругости рассчитывали по модели Герца с использованием программы Igor Pro 6.22A согласно формуле: (5) где F – регистрируемая сила (Н), δ – глубина продавливания образца (нм), Е – модуль Юнга (Па), v – коэффициент Пуассона (= 0,33), σ – 0,5 угла вершины зонда (о) (Francius et al., 2011; Formosa et al., 2012). 4.4. Исследование влияния органических растворителей на физиологические свойства родококков 4.4.1. Дыхательная активность клеток Определение с помощью дыхательной 6-канального активности респирометра родококков проводили Micro-Oxymax® (Columbus Instruments, США) в стеклянных флаконах Micro-Oxymax® вместимостью 300 мл, содержащих 100 мл бактериальной суспензии (ОП600нм 0,5) в НФБ, или среде RS, или среде LB и 20 об. % н-декана или 1 об. % этанола. Постоянное перемешивание (400 об./мин) осуществляли с помощью многоместной магнитной мешалки RT 10 (Power IKAMAG, Германия) в течение 1 сут при температуре 25±2 оС. Оценивали скорость дыхания (мкл/мин). В качестве контролей использовали бактериальную суспензию в НФБ, в среде RS или в среде LB без добавления растворителя. 4.4.2. Определение работы эффлюксных насосов В 100-мл колбы Эрленмейера одновременно вносили суспензию клеток в среде LB, органический растворитель и ингибитор эффлюкных насосов в подобранных соотношениях до конечного объема 20 мл. При этом концентрация клеток соответствовала значению ОП600нм 0,05. Концентрация 52 растворителей со значением logPO/W > 3 (н-декан, н-гексан, циклогексан) составляла 20 об. %, со значением logPO/W < 3 (толуол, бутанол-1, этанол, ацетон, этилацетат, ацетонитрил) – 1 об. %. В качестве ингибиторов эффлюксных насосов использовали 10мМ орто-ванадат натрия, 0,025 мМ парокситина гидрохлорид и 0,1 мМ фениларгинин β-нафтиламида (ФАβН) дигидрохлорид (Sigma-Aldrich, США). Подобранные концентрации растворителей и ингибиторов по отдельности не оказывали подавляющего воздействия на рост родококков. В качестве биотических контролей использовали варианты опытов без добавления (1) ингибиторов; (2) растворителей; (3) растворителей и ингибиторов. В качестве абиотического контроля использовали неинокулированную среду LB. Суспензии инкубировали на орбитальном шейкере при 28 оС и 160 об./мин. Рост клеток контролировали путем измерения ОП600нм через 6–12 ч. 4.4.3. Определение суммарных клеточных липидов Суммарные клеточные липиды экстрагировали традиционным методом (Кейтс, 1975). При этом 0,05 г сухой биомассы, суспендировали в 1 мл дистиллированной воды с последующим добавлением 3 мл смеси хлороформ-метанол (2 : 1). Полученную смесь встряхивали в течение 2 мин и оставляли на 1 сут. Затем центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 мин. Хлороформеный слой сливали в отдельную центрифужную пробирку, а к осадку добавляли 5 мл смеси хлороформ-метанол-вода (2 : 1 : 0,8), встряхивали и центрифугировали. Хлороформеную часть объединяли с ранее полученным экстрактом и добавляли 5 мл смеси хлороформ-вода (1 : 1), повторно центрифугировали. Экстракт переносили в предварительно взвешенную круглодонную колбу и упаривали на роторном испарителе при 60 °С, после чего колбу взвешивали до достижения постоянной массы на высокоточных аналитических весах AUW 120D (Shimadzu, Япония). Количество общих липидов выражали в процентах от сухой массы клеток. 53 4.5. Поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генов эффлюксных насосов Поиск нуклеотидных последовательностей в геноме R. ruber ИЭГМ 231, соответствующих активностью генам устойчивости (drug/multidrug к resistance) и веществам генам, с лекарственной кодирующим белки эффлюксных насосов (efflux protein) осуществляли по базе данных MicroScope (https://www.genoscope.cns.fr/agc/microscope). Поиск и анализ гомологичных последовательностей производили по базам данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 4.6. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Office Exel 2003 (Microsoft Corporation, США). Рассчитывали среднее арифметическое, стандартное отклонение, стандартную ошибку. Достоверность различий между двумя несвязанными выборками оценивали с помощью расчета t-критерия Стьюдента в программе STATISTICA 8 (StatSoft, США). 54 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 5. Исследование жизнеспособности родококков при инкубировании в присутствии органических растворителей В результате ранжирования полученных данных о жизнеспособности исследуемых родококков в присутствии растворителей выявлены группы штаммов с относительно высокой и низкой устойчивостью. В целом, родококки характеризовались сравнительно высокими показателями жизнеспособности при воздействии гидрофобных растворителей (н-декана, н-гексана, циклогексана) со значением logPO/W > 3 (рисунок 6). При инкубировании с н-деканом (logPO/W = 5,6) наблюдалось увеличение числа жизнеспособных клеток для штаммов из 1-ой (устойчивой) группы на 9–73% по сравнению с контролем. Штаммы из 2-ой (чувствительной) группы также сохраняли высокую (85–97%) жизнеспособность при концентрации н-декана ≤ 20 об. %, хотя выживаемость клеток снижалась до 36–38% в присутствии 50–80 об. % растворителя. н-Гексан (logPO/W = 3,5) оказывал еще менее выраженный токсический эффект на клетки родококков, поддерживая рост культур из 3-ей (устойчивой) группы на уровне 11–59% по сравнению с контролем. При этом жизнеспособность культур из 4-ой (чувствительной) группы также увеличивалась на 4–28% по сравнению с контролем при воздействии 50–80 об. % н-гексана. В то же время, более низкая (≤ 20 об. %) концентрация растворителя вызывала 12–26%-ное снижение жизнеспособности родококков данной группы. Жизнеспособность устойчивых (5-ая группа) к циклогексану (logPO/W = 3,2) родококков составляла 98–122%, тогда как для штаммов 6-ой (чувствительной) группы отмечена 39–60% гибель клеток. 55 Рисунок 6 – Влияние гидрофобных органических растворителей на выживаемость родококков. Время инкубирования – 24 ч. I – пары, II – 20 об. %, III – 50 об. %, IV – 80 об. %. Приведены средние значения для групп родококков с высокими (1, 3, 5, 7) и с низкими (2, 4, 6, 8) показателями жизнеспособности: R. erythropolis ИЭГМ 24 (6, 8), ИЭГМ 186 (2, 3, 6, 8), ИЭГМ 268 (6, 8), ИЭГМ 271 (2), ИЭГМ 767 (2, 6, 7), R. fascians ИЭГМ 35 (3, 5, 7), ИЭГМ 170 (2, 3, 5, 8), ИЭГМ 173 (2, 4, 5, 8), ИЭГМ 278 (2, 4, 6, 8), ИЭГМ 526 (2, 4, 6, 8), ‘R. longus’ ИЭГМ 29 (1, 4), ИЭГМ 32 (1, 4, 6, 7), ИЭГМ 69 (1, 4, 6, 7), ИЭГМ 589 (6, 8), R. opacus ИЭГМ 57 (2, 3, 6, 8), ИЭГМ 58 (2, 3, 6, 7), ИЭГМ 249 (2, 4, 6, 8), ИЭГМ 263 (2, 4, 6, 8), ИЭГМ 717 (1, 3, 6, 8), R. rhodochrous ИЭГМ 66 (3, 6, 8), ИЭГМ 67 (2, 3, 6, 8), ИЭГМ 608 (2, 4, 6, 8), ИЭГМ 639 (2, 3, 6, 8), ИЭГМ 647 (1, 4, 6, 8), R. ruber ИЭГМ 219 (2, 4, 6, 8), ИЭГМ 231 (2, 4, 6, 8), ИЭГМ 235 (3, 6, 8), ИЭГМ 326 (2, 3, 6, 8), ИЭГМ 343 (2, 3, 6, 8). 56 Рисунок 7 – Влияние гидрофильных органических растворителей на выживаемость родококков. Время инкубирования – 24 ч. I – пары, II – 20 об. %, III – 50 об. %, IV – 80 об. %. Приведены средние значения для групп родококков с высокими (9, 11, 13, 15, 17, 19) и с низкими (10, 12, 14, 16, 18, 20) показателями жизнеспособности: R. erythropolis ИЭГМ 24 (12, 14, 16, 20), ИЭГМ 186 (12, 14, 16, 20), ИЭГМ 268 (12, 14, 16, 20), ИЭГМ 767 (12, 14, 16, 20), R. fascians ИЭГМ 35 (12, 14, 16, 20), ИЭГМ 170 (12, 14, 16, 20), ИЭГМ 173 (9, 12, 14, 16, 17, 20), ИЭГМ 278 (12, 14, 16, 20), ИЭГМ 526 (10, 12, 14, 16, 18, 20), ‘R. longus’ ИЭГМ 29 (1, 4), ИЭГМ 32 (11, 13, 15, 19), ИЭГМ 69 (11, 13, 16, 18, 19), ИЭГМ 589 (11, 13, 15, 19), R. opacus ИЭГМ 57 (10, 11, 13, 15, 17, 19), ИЭГМ 58 (9, 12, 14, 16, 17, 20), ИЭГМ 249 (10, 12, 14, 16, 17, 20), ИЭГМ 263 (8, 12, 14, 16, 20), ИЭГМ 717 (9, 12, 14, 16, 17, 20), R. rhodochrous ИЭГМ 66 (12, 14, 16, 17, 20), ИЭГМ 67 (12, 14, 16, 17, 20), ИЭГМ 608 (10, 12, 14, 16, 18, 20), ИЭГМ 639 (10, 12, 14, 16, 20), ИЭГМ 647 (9, 12, 14, 16, 17, 20), R. ruber ИЭГМ 219 (9, 12, 14, 16, 17, 20), ИЭГМ 231 (9, 12, 14, 16, 17, 20), ИЭГМ 235 (12, 14, 16, 18, 20), ИЭГМ 326 (9, 12, 13, 15, 17, 19), ИЭГМ 343 (9, 12, 14, 16, 17, 20). Во всех исследуемых концентрациях толуол (logPO/W = 2,5) оказывал сильное ингибирующее воздействие на 8-ую (чувствительную) группу родококков, в которой показатель выживаемости составлял 26–41%. 57 При этом жизнеспособность культур из 7-ой (устойчивой) группы снижалась лишь на 6–14%, а отдельные штаммы (R. fascians ИЭГМ 35, ‘R. longus’ ИЭГМ 32, ИЭГМ 69, R. opacus ИЭГМ 58) оказались способны расти в присутствии толуола (рисунок 6). Как и следовало ожидать, родококки были чувствительны к действию более гидрофильных (logPO/W < 1) растворителей: бутанола-1, изобутанола, этилацетата, ацетона, этанола и ацетонитрила (рисунок 7). Так, штаммы из 9-ой (устойчивой) группы сохраняли лишь 25–39%-ную жизнеспособность при инкубировании с бутанолом-1 (logPO/W = 0,88). Еще более низкие показатели выживаемости (5–21%) зафиксированы для 10-ой (чувствительной) группы штаммов. Изобутанол (logPO/W = 0,81) приводил к при 76–84% гибели концентрации 12-ой до 50 (чувствительной) об. % группы, родококки тогда сохраняли как 60%-ную жизнеспособность, а при воздействии 80 об. % растворителя наблюдался 30%-ный рост числа жизнеспособных клеток у отдельных штаммов 11-ой (устойчивой) группы. В частности, исключительно высокую устойчивость к изобутанолу проявили штаммы 'R. longus’ ИЭГМ 69 и ИЭГМ 589. При воздействии этилацетата (logPO/W = 0,73) сохранялась 42–60% жизнеспособность родококков устойчивой (13-ой) группы, а жизнеспособность чувствительных штаммов (14-ой группы) составляла всего 20–22%. Ацетон (logPO/W = –0,23), вызывал 75–78% снижение жизнеспособности штаммов 16-ой (чувствительной) группы. Устойчивые штаммы (15-ой группы) сохраняли 45–68% жизнеспособность. В то же время, в присутствии этанола (logPO/W = –0,29), наблюдалось 19–81%-ное сохранение жизнеспособности родококков из 17-ой (устойчивой) группы. Однако выживаемость бактерий из 18-ой (чувствительной) группы составляла всего 8–36% в зависимости от процентной концентрации растворителя. При воздействии ацетонитрила (logPO/W = –0,33) жизнеспособность 19-ой (устойчивой) группы составила в среднем 50–62%, а 20-ой (чувствительной) – 20–22%. 58 Нами не обнаружено строгой концентрационной зависимости токсического действия растворителей на клетки родококков. Напротив, в некоторых случаях наблюдалось увеличение числа жизнеспособных клеток при повышении концентрации растворителя (см. рисунок 6, 7). Для менее токсичных н-декана, н-гексана, циклогексана и толуола выявленный факт может быть связан со способностью родококков использовать данные соединения в качестве ростовых субстратов (Ившина и др., 2007; de Carvalho, 2010), увеличение концентрации которых в среде приводило к повышению роста бактерий. В работе de Carvalho et al. (2005) также отмечено повышение жизнеспособности концентрации При клеток R. гидрофобного воздействии более erythropolis н-додекана токсичных DCL14 в при среде увеличении инкубирования. гидрофильных растворителей аналогичный результат может быть частично обусловлен агрегацией клеток (Ившина и др., 2007). Как видно из рисунка 8, после воздействия растворителя наблюдается гибель родококков на поверхности агрегатов. При этом, вследствие защиты клеток, находящихся внутри агрегатов, сохраняется высокая жизнеспособность клеточной популяции даже при повышенных концентрациях токсичных растворителей (Cassidy et al., 1996). А Рисунок 8 – Б КЛСМ-АСМ изображения R. ruber ИЭГМ 231 до (А) и после (Б) 24 ч инкубирования в органическом растворителе. Светящиеся зеленым цветом – живые, красным – мертвые клетки 59 Выявлены штаммы, обладающие множественной устойчивостью к растворителям с высоким и низким значением коэффициента logPO/W (рисунок 9). Так, ‘R. longus’ ИЭГМ 32 проявил устойчивость к н-декану, толуолу, изобутанолу, этилацетату, ацетону, ацетонитрилу, ‘R. longus’ ИЭГМ 69 – к н-декану, толуолу, этилацетату, бутанолу-1, изобутанолу, этилацетату и ацетонитрилу. ‘R. longus’ ИЭГМ 589 сохранял высокие показатели выживаемости при воздействии высокотоксичных изобутанола, этилацетата, ацетона и ацетонитрила. R. opacus ИЭГМ 57 был устойчив к н-гексану, изобутанолу, этилацетату, ацетону, этанолу, ацетонитрилу, R. opacus ИЭГМ 58 – к н-гексану, толуолу, бутанолу-1, этанолу, R. ruber ИЭГМ 326 – к н-гексану, бутанолу-1, этилацетату, ацетону, этанолу, ацетонитрилу, R. ruber ИЭГМ 343 – к н-гексану, бутанолу-1, этанолу. Следует отметить выявленную высокую устойчивость к н-гексану и этанолу штамма R. rhodochrous ИЭГМ 66, способного к биотрансформации бетулина (Тарасова, 2014) и органических сульфидов (Елькин, 2011), а так же устойчивость штамма R. rhodochrous ИЭГМ 647, являющегося активным деструктором дротаверина гидрохлорида (Мухутдинова, 2014), к н-декану, бутанолу-1 и этанолу и штамма R. opacus ИЭГМ 249, способного к биодеградации нефтяных углеводородов (Серебренникова, 2014) – к этанолу. Полученные данные свидетельствуют о возможности проведения биотрансформации данных соединений родококками в присутствии органических растворителей. Установлена сильная положительная корреляция (R = 0,78, mr = 0,22) между средними показателями жизнеспособности исследованных штаммов родококков и степенью гидрофобности (logPO/W) растворителей. Наряду с этим, отмечена индивидуальная восприимчивость бактерий к растворителям, что подтверждает мнение многих исследователей о влиянии штаммовых особенностей на устойчивость к данным соединениям (Gupta, 1992; Sikkema et al., 1995; Isken, de Bont, 1998; Sardessai, Bhosle, 2004; de Carvalho, 2010). 60 А Б В Рисунок 9 – Влияние органических растворителей на выживаемость родококков. Время инкубирования – 24 ч. А – 'R. longus’ ИЭГМ 589, Б – R. opacus ИЭГМ 57, В – R. ruber ИЭГМ 326. I – пары, II – 20 об. %, III – 50 об. %, IV – 80 об. %. 1 – н-гексан, 2 – н-декан, 3 – циклогексан, 4 – толуол, 5 – бутанол-1, 6 – изобутанол, 7 – этилацетат, 8 – ацетон, 9 – этанол, 10 – ацетонитрил. 61 Таким образом, родококки обладают высокой устойчивостью (72–119%) к воздействию гидрофобных растворителей и сравнительно низкой устойчивостью (22–46%) к гидрофильным растворителям. При этом выявлены мультирезистентные штаммы, пригодные для использования в биотрансформации гидрофобных соединений в водно-органической системе. 62 Глава 6. Устойчивость родококков к органическим растворителям в зависимости от условий культивирования Для исследования влияния условий культивирования на выживаемость родококков в присутствии растворителей, а также их морфологические, механические и функциональные свойства после воздействия растворителей, нами был выбран штамм R. ruber ИЭГМ 231. Как показано в ранних исследованиях, данный штамм обладает высокой степенью адгезии к углеводородным субстратам (Рубцова, 2011; Рубцова и др., 2012), продуцирует биосурфактант при росте на н-алканах (Philp et al., 2002), способен к биодеградации сложных ароматических соединений, обладающих фармакологической активностью (Ившина и др., 2006) и к использованию углеводородов в качестве источника углерода и энергии (Ившина и др., 1995). Для штамма R. ruber ИЭГМ 231 полностью определена нуклеотидная последовательность (Ivshina et al., 2014). Важное значение для сохранения жизнеспособности бактериальной культуры имеет среда культивирования, в частности наличие источников углерода и энергии, а также микроэлементов, необходимых для поддержания жизненно-важных клеточных процессов (Zingaro et al., 2013). Как видно из рисунка 10, наиболее сильное воздействие на родококки оказывали чистые растворители, вызывая значительную (> 67%) гибель клеток R. ruber ИЭГМ 231. Инкубирование в двухфазной среде растворитель-буферный раствор с относительно нетоксичными н-деканом и н-гексаном приводило к 24–64%-ному снижению жизнеспособности клеток данного штамма, тогда как присутствие в буфере других растворителей вызывало практически полную гибель (> 85%) родококков. Наличие минеральных солей в среде RS способствовало 7–70%-ному повышению степени выживаемости клеток при воздействии большинства растворителей, однако этот эффект не был отмечен для н-декана и н-гексана. В богатой органической среде LB родококки сохраняли сравнительно наиболее (30–97%) жизнеспособность при воздействии растворителей и даже проявляли способность к росту 63 в присутствии н-декана, циклогексана и этанола (жизнеспособность составила 109–255%). Рисунок 10 – Сравнение показателей выживаемости R. ruber ИЭГМ 231 при инкубировании в разных средах в присутствии органических растворителей в течение 24 ч. 1 – н-декан, 2 – н-гексан, 3 – циклогексан, 4 – толуол, 5 – бутанол-1, 6 – изобутанол, 7 – этилацетат, 8 – ацетон, 9 – этанол, 10 – ацетонитрил. I –растворитель, II – растворитель : НФБ (1 : 1), III – растворитель : среда RS (1 : 1), IV – растворитель : среда LB (1 : 1). Далее нами была изучена динамика жизнеспособности клеток R. ruber ИЭГМ 231 при инкубировании в присутствии органических растворителей. На рисунке 11 показано влияние плотности клеточной суспензии на жизнеспособность клеток в присутствии растворителей. Оказалось, что показатель выживаемости в экспериментах с изначально большим числом клеток в 1,5–3 раза выше, что, по-видимому, объясняется способностью родококков к коагрегации в неблагоприятных условиях среды (см. рисунок 8). 64 Рисунок 11 – Влияние исходной оптической плотности суспензии на выживаемость R. ruber ИЭГМ 231 в органических растворителях. Время инкубирования – 24 ч. I – ОП600нм = 1, II – ОП600нм = 0,5. 1 – циклогексан, 2 – циклогексан : НФБ (1 : 1), 3 – толуол, 4 – толуол : НФБ (1 : 1). В биотехнологических процессах биотрансформации, проводимой с использованием целых клеток микроорганизмов, продолжительность может составлять от нескольких часов до нескольких суток (см. таблицу 1), поэтому при исследовании динамики жизнеспособности родококков в присутствии растворителей нами были выбраны три временные точки: кратковременные (1 ч), средней продолжительности (24 ч) и длительного (120 ч) ферментирования. Как видно на рисунке 12А, после часового инкубирования в чистом растворителе родококки сохраняли жизнеспособность в пределах от 1 до 39%. Спустя 24 ч показатель выживаемости составлял 0–33%, а через 120 ч – всего 0–19%. 65 А Б 66 В Рисунок 12 – Динамика жизнеспособности клеток R. ruber ИЭГМ 231 при инкубировании в растворителях (А), в смеси растворитель : НФБ (1 : 1) (Б), в смеси растворитель : среда LB (B). 1 – н-декан, 2 – н-гексан, 3 – циклогексан, 4 – толуол, 5 – бутанол-1, 6 – изобутанол, 7 – этилацетат, 8 – ацетон, 9 – этанол, 10 – ацетонитрил. I – 1 ч, II – 24 ч, III – 120 ч инкубирования. В двухфазной системе растворитель : НФБ (1 : 1) жизнеспособность родококков составляла 3–96%, 0–76% и 0–27% для 1 ч, 24 ч и 120 ч инкубирования, соответственно (рисунок 12Б). Число жизнеспособных клеток после 24 ч инкубирования в системе растворитель : НФБ было меньше, чем в чистом растворителе за аналогичный период времени. Такой характер уменьшения жизнеспособности клеток, по-видимому, связан с различной биодоступностью гидрофобных растворителей в двухфазной системе: они остаются недоступными в течение первых нескольких часов, но оказывают более разрушительное действие на клеточную стенку и мембрану вследствие эмульгирования и солюбилизации (Griebenow, Klibanov, 1996; Garikipati et al., 2009). 67 В двухфазной среде растворитель : среда LB (1 : 1) родококки проявили способность к росту (на 36–205%) в присутствии н-декана и н-гексана в течение всего эксперимента (120 ч) (рисунок 12В). При этом наблюдалось увеличение показателей жизнеспособности на 9–63% в первые 24 ч инкубировании в присутствии циклогексана и этанола. Также в первые часы эксперимента росло число жизнеспособных клеток, подверженных воздействию толуола, на 27%. В среде с этилацетатом и ацетоном родококки полностью сохраняли жизнеспособность в течении первого часа, тогда как бутанол-1, изобутанол и ацетонитрил приводили к 10–82%-ной гибели клеток. Известно, что актинобактерии способны к диссоциации под действием физико-химических факторов и состава среды инкубирования (Милько, Егоров, 1991). При высеве нами культуры R. ruber ИЭГМ 231 на МПА после инкубирования в н-декане или циклогексане наблюдалась диссоциация колоний на гладкие (S) и шероховатые (R) формы (рисунок 13). Последние (R-формы) обладают, как правило, утолщенной клеточной стенкой и характеризуются повышенным содержанием липидов. После селекции более устойчивых R-форм и повторного инкубирования их в н-декане или циклогексане зарегистрировано 3–12-кратное повышение жизнеспособности родококков (рисунок 14). Рисунок 13 – Диссоциация после 24 ч инкубирования в н-декане. колоний R. ruber ИЭГМ 231 68 Рисунок 14 – Выживаемость неадаптированных (I) и адаптированных* (II) клеток R. ruber ИЭГМ 231 в органических растворителях. 1 –н-декан, 2 – смесь н-декана : НФБ (1 : 1), 3 –циклогексан, 4 – смесь циклогексана : НФБ (1 : 1). * – клетки, предварительно инкубированные в присутствии чистых растворителей в течение 24 ч. В работе de Carvalho et al. (2007) также показана 10,5%-ная выживаемость неадаптированных клеток R. erythropolis DCL14 в присутствии 20 об. % толуола, тогда как число адаптированных жизнеспособных клеток после 24-часового инкубирования в присутствии данного растворителя составляло уже 70–80% при повышении концентрации толуола до 60 об. %. Таким образом, для родококков показана возможность адаптации к высоким (до 100 об. %) концентрациям органических растворителей и относительно высокая (до 96% в течение 1 ч) жизнеспособность в присутствии растворителей, которая сохраняется в течение 120 ч эксперимента и зависит от начальной концентрации клеток и состава среды культивирования. 69 Глава 7. Морфофункциональные свойства родококков при инкубировании в органических растворителях Метод визуализации микроорганизмов с помощью КЛСМ с использованием красителя LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit позволяет дифференцировать живые и мертвые клетки, и поэтому был использован нами для оценки жизнеспособности родококков после воздействия растворителей. Установлено, что в клеточной популяции R. ruber ИЭГМ 231 после инкубации в растворителях четко выделяются три фракции: живые (зеленые, толерантные), мертвые (красные, чувствительные) и поврежденные (зелено-оранжевые, частично устойчивые) клетки. Так, воздействие н-декана и циклогексана приводило к нарушению целостности клеточной мембраны и гибели бактерий, что проявлялось в виде красного флуоресцентного окрашивания мертвых клеток на фоне преобладающего зеленого свечения живых клеток в контрольных образцах (рисунок 15). А Б Рисунок 15 – КЛСМ-изображения клеток R. ruber ИЭГМ 231 в контроле (А) и после инкубирования в н-декане (Б) в течение 24 ч. При этом н-гексан, толуол, бутанол-1, этилацетат, ацетон, этанол и ацетонитрил вызывали характерное «двойное» (зелено-оранжевое) свечение, проявляющееся либо на отдельных участках, либо полностью 70 заполнявшее бактериальную клетку, по-видимому, свидетельствующее о частичной деформации и повреждении клеточной мембраны еще жизнеспособных клеток. На рисунке 16 показаны живые и мертвые клетки (слева) и поврежденные после инкубирования в толуоле (справа) клетки R. ruber ИЭГМ 231. 1А 2А 1Б 2Б Рисунок 16 – КЛСМ-изображения R. ruber ИЭГМ 231 до (1А) и после (2А) флуоресценции 24 ч SYTO9 воздействия (зеленый) толуола. и Графики пропидиум интенсивности иодид (красный) при нормальном (1Б) и «двойном» (2Б) окрашивании. Следует отметить, что Roberts с соавт. (2012) также отмечали «двойное» окрашивание клеток P. aeruginosa ATCC 9027 после обработки лесным медом манука, обладающим антибактериальной активностью. Высокая интенсивность красной флюоресценции пропидиум иодида отмечена в центре клеток, тогда как зеленая флюоресценция SYTO9 характерна для всей клетки, что, по мнению авторов, указывает на способность пропидиум иодида проникать внутрь живых клеток с поврежденной мембраной. Ранее в работе Alvarez с соавт. (1996) с использованием метода электронной микроскопии ультратонких срезов 71 клеток R. opacus PD630, выращенных на фенилдекане, показано формирование сферических внутриклеточных структур. Результаты «двойного» окрашивания были обработаны при помощи разработанного алгоритма количественного анализа флуоресцентных сигналов от двух лазеров, что позволило дифференцировать живые и мертвые клетки. На рисунке 17 показано, что при применении КЛСМ и спектрофотометрического метода получаются сопоставимые данные по жизнеспособности родококков в присутствии растворителей. Рисунок 17 – Сравнение двух методов оценки влияния растворителей на выживаемость R. ruber ИЭГМ 231. I – КЛСМ-сканирование (окрашивание LIVE/DEAD® BacLightTM Viability kit), II – спектрофотометрия (окрашивание ИНТ). 1 – н-декан, 2 – циклогексан, 3 – толуол, 4 – бутанол-1, 5 – ацетонитрил. Использование комбинированной КЛСМ-АСМ системы сканирования позволило получить точные дифференцированные данные о размерных параметрах и особенностях рельефа живых и мертвых клеток родококков при воздействии на них органических растворителей. Следует отметить, что ключевым моментом при АСМ-сканировании является подбор оптимального размера сканируемой области. Благодаря варьированию размерных параметров АСМ-изображений были получены данные 72 о микрорельефе (размер сканирования – 10–12 мкм) и нанорельефе (размер сканирования – 200 нм) клеток после взаимодействия с растворителями (рисунок 18). А Б 73 В Г 74 Д Е 75 Ж З 76 И К Рисунок 18 – КЛСМ (а), АСМ (б), 3D КЛСМ-АСМ (в) изображения и нанопрофилометрия (г) клеток R. ruber ИЭГМ 231 в контроле (А) и после 24 ч инкубирования в н-декане (Б), н-гексане (В), циклогексане (Г), толуоле (Д), бутаноле-1 (Е), этилацетате (Ж), ацетоне (З), этаноле (И) и ацетонитриле (К). Размер линейки на КЛСМ-изображении – 5 мкм. 77 Количественная обработка множественных данных (60–100 клеток одного варианта) АСМ-профилометрии (рисунок 19, 20) показала увеличение высоты рельефа живых клеток на 19–38% после воздействия н-гексана. Инкубирование с н-деканом, циклогексаном и толуолом также приводило к 12–21%-ному увеличению профиля микрорельефа и, напротив, разглаживанию нанорельефа поверхности родококков на 33–54%. Бутанол-1 вызывал небольшое (на 3%) увеличение высоты микрорельефа и значительное (на 71%) повышение нанорельефа. Воздействие этилацетата, напротив, приводило к снижению микрорельефа на 10% и увеличению амплитуды нанорельефа почти в два раза. При инкубировании с ацетоном, этанолом и ацетонитрилом зафиксирован рост шероховатости клеток на 17–42, 29–57 и 10–33% соответственно. 1А 1Б 1В 2А 2Б 2В Рисунок 19 – АСМ-изображения (А, Б) и профили (В) R. ruber ИЭГМ 231 после 24 ч инкубирования в органических растворителях. 1 – микрорельеф, 2 – нанорельеф. 78 Рисунок 20 – Влияние органических растворителей на шероховатость поверхности R. ruber ИЭГМ 231. Время инкубирования – 24 ч. Размеры сканирования: I – 10 мкм (микрорельеф), II – 200 нм (нанорельеф). 1 – н-декан, 2 – н-гексан,3 – циклогексан, 4 – толуол, 5 – бутанол-1, 6 –этилацетат, 7 – ацетон, 8 – этанол, 9 – ацетонитрил. Данные о динамических изменениях показателей рельефа поверхности родококков при инкубировании в присутствии растворителей приведены в таблице 4. Как видно, после длительного инкубирования с н-деканом, циклогексаном, этилацетатом и этанолом наблюдалось дальнейшее повышение шероховатости микрорельефа поверхности клеток родококков, тогда как воздействие н-гексана, толуола, бутанола-1, ацетонитрила и ацетона, наоборот, приводило к снижению данного показателя. Следует отметить, что > 95% клеток утрачивало жизнеспособность после 5-ти суток инкубирования с толуолом, бутанолом-1, этилацетатом, ацетоном, этанолом и ацетонитрилом (см. рисунок 12), поэтому в таблице 4 приведены данные для поврежденных клеток. 79 Таблица 4 – Данные АСМ-профилометрии поверхности клеток R. ruber ИЭГМ 231 при инкубировании в растворителях Растворитель Среднеквадратичная Среднеквадратичная шероховатость шероховатость микрорельефа, нм нанорельефа, нм Контроль (в НФБ) 133 ± 59 127 ± 52 3,2 ± 1,0 4,1 ± 2,0 н-Декан 168 ± 56* 180 ± 55* 1,6 ±0,8* 1,1 ±0,7* н-Гексан 166 ± 57* 144 ± 44 3,3 ± 0,7 2,8 ± 1,1 Циклогексан 156 ± 83* 170 ± 50* 1,1 ± 0,3* 1,3 ± 0,7* Толуол 156 ± 63* 117 ± 49** 1,2 ± 0,8* 1,2 ± 0,4*,** Бутанол-1 143 ± 40 127 ± 55** 4,1 ± 1,7 0,9 ±0,3*,** Этилацетат 125 ± 42 216 ± 50*,** 4,9 ± 1,2* 3,7 ± 1,5** Ацетон 162 ± 86 147 ± 65** 3,4 ± 1,6 3,0 ± 2,8** Этанол 218 ± 52* 230 ± 59*,** 3,1 ± 1,7 3,0 ± 2,8** Ацетонитрил 153 ± 55* 136 ± 61** 3,2 ± 2,0 1,5 ± 0,5*,** Примечание. В числителе указаны значения после 24 ч, в знаменателе – после 120 ч инкубирования в присутствии растворителей. Исходные показатели микро- и нанорельефа составляли 139 ± 52 нм и 2,4 ± 1,2 нм соответственно. * – данные достоверно отличаются от контроля при р < 0,05. ** – приведены (поврежденных). данные для клеток с «двойным» окрашиванием 80 По нашим данным, шероховатость микрорельефа мертвых клеток родококков под действием растворителей практически не изменялась, и колебания данных значений не превышали 11%, в противоположные тенденции изменения частности для циклогексана. Выявленные микро- и нанорельефа, вызванные воздействием разных растворителей, могут быть связаны с разноплановым характером структурных изменений клеточной оболочки бактерий (Dufrêne, 2002; Dorobantu et al., 2012). Динамика изменения размерных характеристик живых клеток R. ruber ИЭГМ 231 в присутствии растворителей приведены в таблице 5. Инкубирование в присутствии н-декана, циклогексана и толуола приводило к уменьшению размеров клеток. Так, длина клеток снижалась на 0,4–1,0 мкм, ширина – на 0,1–0,3 мкм, площадь поверхности – на 3,4–5,1 мкм2, объем – на 1,1–1,9 мкм3 по сравнению с изначальными размерами клеток. Согласно закону Бергмана, чем меньше размер живого объекта, тем выше отношение площади его поверхности к объему (S/V), т.е. относительная площадь контакта объекта с окружающей средой (Newmann et al., 2005; Kongpol et al., 2012). Нами зафиксировано увеличение относительной площади живых клеток на 0,3–0,5 мкм-1 после 24 ч инкубирования в присутствии н-декана и циклогексана, тогда как воздействие толуола вызывало уменьшение данного показателя клеток на 0,6 мкм-1 по сравнению с контрольными значениями. Следовательно, происходило увеличение площади контакта родококков с относительно нетоксичными н-деканом и циклогексаном и, напротив, снижение данного показателя при контакте клеток с токсичным толуолом, что может служить адаптационным механизмом устойчивости бактерий к данным растворителям. В дальнейшем наблюдалось равномерное снижение показателя S/V на 0,2–0,9 мкм-1 в контроле и при инкубировании с н-деканом и циклогексаном. 81 Таблица 5 – Морфометрические параметры клеток R. ruber ИЭГМ 231, инкубированных в органических растворителях Длина, Ширина, Площадь Объем Площадь мкм мкм поверх- (V), мкм3 поверх- ности (S), ности/ мкм2 объем (S/V), мкм-1 Живые клетки Контроль 2,9±1,0 0,9±0,2 9,1±3,5 1,8±1,1 5,6±1,0 (в НФБ) 2,6±1,1 1,0±0,2 9,3±3,0 1,9±0,8 5,2±0,7 н-Декан 2,4±0,7 0,8±0,1 6,9±2,2* 1,2±0,5* 6,1±0,6 2,3±0,5* 1,0±0,1 8,4±1,9* 1,7±0,6 5,2±0,7 2,2±0,8* 0,9±0,2 7,2±2,8* 1,3±0,8* 5,9±1,1 1,7±0,5* 0,9±0,2 6,6±2,2* 1,3±0,6* 5,7±1,1* 2,8±0,8 1,0±0,1 9,6±2,2 2,0±0,6 5,0±0,4* 3,0±1,0 0,9±0,1 9,9±2,7 2,0±0,7 5,1±0,4 Циклогексан Толуол Мертвые клетки Контроль 2,3±0,4 1,0±0,3 8,9±3,6 1,9±1,3 5,2±1,2 (в НФБ) 2,5±1,0 0,8±0,1 7,6±2,4 1,4±0,6 5,8±0,7 н-Декан 2,3±0,6 0,9±0,1 7,5±2,1 1,4±0,6* 5,7±0,8 2,4±0,7 0,9±0,2 7,6±2,0 1,4±0,6 5,7±0,8 2,0±0,5 0,7±0,1 5,2±1,3* 0,8±0,3* 6,8±0,8* 2,4±0,6 1,0±0,2 9,1±2,2* 1,9±0,8* 5,0±0,6* 2,5±0,7 0,9±0,1 8,7±1,9 1,7±0,5 5,1±0,4 2,8±0,9 0,9±0,1 9,1±1,9 1,7±0,4 5,3±0,2* Циклогексан Толуол 82 Окончание таблицы 5 Поврежденные клетки Длина, Ширина, Площадь Объем Площадь мкм мкм поверх- (V), мкм3 поверх- ности (S), ности/ мкм2 объем (S/V), мкм-1 Бутанол-1 2,5±0,7 0,8±0,1 7,6±1,6 1,4±0,4 5,8±0,7 2,4±0,8 0,7±0,1 6,4±1,6 1,0±0,3 6,4±0,7 2,2+0,5 1,0+0,2 8,4+4,1 1,8+1,6 5,3+0,8 2,3+0,5 1,0+0,1 7,0+0,8 1,8+0,6 4,2+0,9 2,5±0,6 0,9±0,1 8,4±2,2 1,6±0,6 5,3±0,6 2,4±0,5 1,0±0,2 9,4±1,4 2,0±0,5 4,9±0,5 Ацето- 2,6±0,9 0,8±0,1 7,3±1,9 1,2±0,5 6,1±0,8 нитрил 2,7±0,9 0,9±0,1 8,4±2,6 1,6±0,6 5,6±0,8 Этилацетат Этанол Примечание. Исходные размеры живых клеток: длина – 3,2±0,8 мкм, ширина – 1,1±0,2 мкм, площадь – 13,0±3,5 мкм2, объем – 3,1±1,2 мкм3, площадь поверхности/объем – 4,4±0,6 мкм-1. В числителе указаны значения после 24 ч, в знаменателе – после 120 ч инкубирования. * данные достоверно отличаются от контроля при р < 0,05. Известно, что клеточная стенка родококков содержит большое количество липидных компонентов, в частности свободных и связанных миколовых кислот (Коронелли, 1996; Ившина, 2014). Нами выявлено повышение количества суммарных липидов (на 9–42%) в клетках R. ruber ИЭГМ 231 (таблица 6), что может служить эффективным приемом защиты от воздействия растворителей. При этом наиболее выраженное повышение липидного компонента (в 2 раза) наблюдалось при воздействии гидрофобного н-декана. Ранее в работе Tsitko с соавт. (1999) показан рост 83 содержания жирных кислот на 3–34% от контрольных показателей при культивировании клеток R. opacus в присутствии бензола, фенола, 4-хлорфенола, хлорбензола и толуола в качестве единственного источника углерода и энергии. Таблица 6 – Содержание общих липидов в клетках R. ruber ИЭГМ 231 после 24 ч инкубирования в органических растворителях Растворитель % от сухого веса Контроль (в LB) 41,9 ± 7,0 н-Декан 83,9 ± 2,3* н-Гексан 59,6 ± 3,7* Циклогексан 53,0 ± 16,7 Толуол 64,0 ± 3,0* Бутанол-1 66,2 ± 4,2 Этилацетат 50,7 ± 7,8 Ацетон 61,2 ± 6,5* Этанол 67,9 ± 3,7* Ацетонитрил 52,6 ± 8,3 Примечание. * данные достоверно отличаются от контроля при р < 0,05. По нашим данным максимальная респираторная активность клеток (24–66 мкл/мин) в присутствии растворителей наблюдалась при инкубировании в богатой среде LB. Тогда как в минеральной среде RS и НФБ происходило снижение показателей скорости дыхания на 58–77% и 88–96% соответственно (рисунок 21). 84 А Б Рисунок 21 – Динамика дыхательной активности R. ruber ИЭГМ 231 при инкубировании в НФБ (линия 3, 4), среде RS (линия 2, 5), среде LB (линия 1, 6) в присутствии н-декана (А) и этанола (Б). Сравнительный анализ динамики дыхательной активности родококков в присутствии растворителей (таблица 7) показал повышение скорости респирации в 0,7–16,6 раз при инкубировании с н-деканом, по-видимому, обусловленное использованием данного растворителя в качестве источника углерода и энергии. Однако в минеральных средах с этанолом наблюдалось снижение показателей дыхания родококков в 0,9–1,6 раза, тогда как при использовании среды LB с данным растворителем скорость дыхания не отличалась от контрольных значений. 85 Таблица 7 – Сравнительные параметры дыхательной активности (мкл/мин) R. ruber ИЭГМ 231 в средах с органическими растворителями и без них Контроль / н-Декан Контроль / Этанол Потребление Выделение Потребление Выделение О2 СО2 О2 СО2 1,4 ± 0,9 0,9 ± 0,1 4,4 ± 0,2 2,2 ± 0,2 4,5 ± 0,7* 2,9 ± 0,3* 3,0 ± 0,2* 1,4 ± 0,2* Cреда 1,6 ± 0,6 0,7 ± 0,1 11,5 ± 0,5 12,5 ± 4,3 RS 14,7± 0,8* 11,6 ± 2,8* 10, 0 ± 0,4* 7,4 ± 0,4* Среда 32,6 ± 1,3 32,0 ± 7,5 23,5 ± 0,5 21,7 ± 4,4 LB 66,2 ± 1,1* 47,7 ± 0,8 24,2 ± 1,1 23,5 ± 4,2 НФБ Примечание. * Данные достоверно отличаются от контрольных при р < 0,05. Таким образом, показано изменение параметров шероховатости и увеличение относительной площади (на 5–9%) как ответная реакция живых клеток родококков на воздействие растворителей. Обнаружено увеличение количества суммарных клеточных липидов (на 21–100%) и респираторной активности (в 0,7–16,6 раз) при воздействии нетоксичных растворителей. 86 Глава 8. Влияние органических растворителей на упруго-механические свойства клеток родококков Данные, полученные путем АСМ-индентирования поверхности живых родококков, регистрации и анализа силовых кривых (рисунок 22), демонстрируют уменьшение модуля упругости клеток от 1,4 до 0,3–0,8 МПа после действия всех используемых растворителей (рисунок 23), что свидетельствует о снижении жесткости связей между компонентами клеточной стенки. Очевидно, действие органических растворителей приводило к структурно-механическим перестройкам клеток родококков, в частности, к появлению более эластичных участков клеточной оболочки. Рисунок 22 – Силовая кривая, полученная при измерении модуля упругости клетки R. ruber ИЭГМ 231. Траектория движения кантилевера: красная линия – кривая подвода, синяя линия – кривая отвода, пересечение пунктирных линий – нулевое положение кантилевера по оси x и y. 87 Модуль Юнга, МПа 1,5 * 1,2 * * * * 0,9 * 0,6 * 0,3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Рисунок 23 – Изменение упругости клеток R. ruber ИЭГМ 231 после 24 ч инкубирования в органических растворителях. 1 – контроль, 2 – н-декан, 3 – н-гексан, 4 – циклогексан, 5 – толуол, 6 – бутанол-1, 7 – этанол, 8 – ацетонитрил. * Данные достоверно отличаются от контроля при р < 0,05. Так, анализ карт адгезии зонда кантилевера к поверхности клеток родококков, полученных в режиме силовой спектроскопии АСМ (рисунок 24), показал незначительное (на 0,2 нН) увеличение среднего значения упругих сил взаимодействия между зондом кантилевера и поверхностью клеток, инкубированных в присутствии циклогексана по сравнению с контрольными клетками (рисунок 25). Воздействие на клетки менее гидрофобного толуола, напротив, приводило к снижению силы адгезии на 42%, а гидрофильный этанол уменьшал данный показательв 6,5 раз. 88 1А 1Б 2А 2Б 3А 3Б 4А 4Б Рисунок 24 – АСМ-изображения (А) и карты адгезии зонда кантилевера к поверхности клеток родококков (Б). 1 – контроль, 2 – циклогексан, 3 – толуол, 4 – этанол. Время инкубирования – 24 ч. 89 А Б В Г Рисунок 25 – Гистограммы адгезии кантилевера АСМ к поверхности клеток R. ruber ИЭГМ 231 после инкубирования в органических растворителях в течение 24 ч. А – контроль, Б – циклогексан, В – толуол, Г – этанол. Указаны среднеквадратическое значение адгезии ± стандартное отклонение. В целом, при воздействии всех тестируемых растворителей снижалось число высокоадгезивных сайтов на поверхности клеток родококков и, наоборот, повышалось количество низкоадгезивных (< 5 нН) участков. По-видимому, воздействие органических растворителей приводило к денатурации белков и растворению липидных компонентов клеточной стенки и мембраны бактерий (McDonnell, Russell, 1999) и, как следствие снижению упруго-механических и адгезионных показателей. 90 Глава 9. Изучение активности эффлюксных насосов при формировании устойчивости родококков к органическим растворителям Процессы выведения токсических веществ из клеток микроорганизмов с помощью эффлюксных насосов наиболее подробно изучены на примере формирования устойчивости патогенных штаммов к антибиотикам (Borges-Walmsley et al., 2003; Piddock, 2006). Однако некоторыми авторами показано участие систем эффлюкса в выведении из клеток органических растворителей. Matsumoto валиномицин и с соавт. орто-ванадат (2002) для использовали ингибитор доказательства участия H+- и АТФ-зависимых насосов в выведении толуола из клеток Bacillus cereus R1. Ингибиторы парокситин (блокирующие H+-зависимые эффлюксные насосы) и ФАβН (блокирующие H+- и Na+-зависимые эффлюксные насосы) подавляли рост Exiguobacterium sp. SBH81 в присутствии ацетонитрила, тогда как орто-ванадат (ингибитор АТФ-зависимых эффлюксных насосов) не оказывал подобного эффекта (Kongpol et al., 2012). В связи с этим нами проведено исследование участия эффлюксных насосов в выведении растворителей из клеток родококков. Как видно из рисунка 26, предварительно подобранные нами концентрации ингибиторов эффлюксных насосов не оказывали выраженного подавляющего действия на рост родококков, хотя выявлено увеличение продолжительности лаг-фазы в среде с парокситином и ФАβН. 3 ОП600нм 2,5 2 2 1,5 3 1 4 1 0,5 0 0 Рисунок 26 – Влияние 50 100 Время, ч ингибиторов 150 200 эффлюксных насосов R. ruber ИЭГМ 231. 1 – контроль, 2 – орто-ванадат, 3 – парокситин, 4 – ФАβН. на рост 91 Установлено, что парокситин и ФАβН практически полностью подавляют рост клеток в присутствии н-гексана и циклогексана (рисунок 27, линия 4 и 5), что указывает на вероятное участие H+- и Na+-зависимых эффлюкных насосов в формировании устойчивости родококков к данным растворителям. Напротив, присутствие в среде орто-ванадата не оказывало ингибирующего воздействия на бактериальный рост, так как АТФ-зависимые насосы, по-видимому, не участвуют в выведении избытка растворителей из клеток. При этом длительность лаг-фазы роста родококков (78–96 ч) в среде с растворителем и орто-ванадатом совпадала с длительностью подготовительной фазы в присутствии только растворителя (рисунок 27, линии 2 и 3). А 3 1 ОП600нм 2,5 2 1,5 1 2 0,5 3 4, 5 0 0 50 100 Время, ч 150 200 Б 3 1 ОП600нм 2,5 2 1,5 1 2 0,5 3 4, 5 0 0 50 100 Время, ч 150 200 Рисунок 27 – Влияние ингибиторов эффлюксных насосов на рост R. ruber ИЭГМ 231 в присутствии 20 об. % органических растворителей. А – н-гексан, Б – циклогексан. 1 – контроль без растворителя, 2 – контроль с растворителем, 3 – орто-ванадат, 4 – парокситин, 5 – ФАβН. 92 В другом варианте эксперимента по качественному определению роста R. ruber ИЭГМ 231 в присутствии расширенного спектра растворителей и ингибиторов также показано, что в выведении растворителей из клеток участвуют в основном H+-зависимые насосы (таблица 8). Исключение составили родококки, инкубированные в присутствии толуола, которые продемонстрировали участие всех типов насосов в его выведении. Таблица 8 – Влияние ингибиторов эффлюксных насосов на рост R. ruber ИЭГМ 231 в присутствии растворителей в среде LB Ингибитор АТФ- Ингибитор Н+- и Ингибитор Н+- зависимых Na+-зависимых зависимых эффлюксных эффлюксных эффлюксных насосов насосов насосов семейства ABC семейства RND и семейства RND (орто-ванадат) MATE (ФАβН) (парокситин) н-Декан +/+ +/+ +/– Толуол +/– +/– +/– Бутанол-1 +/+ +/+ +/– Ацетон +/+ +/+ +/– Этанол +/+ +/– +/– Этилацетат –/– –/– –/– Ацетонитрил +/+ +/+ +/– Примечание. «+» – положительное окрашивание ИНТХ, «–» – нет окрашивания ИНТХ. В числителе –инкубирование с растворителем, в знаменателе – с растворителем и ингибитором. Время инкубирования – 7 сут. В результате биоинформационного анализа генома коллекционного штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ 231, расшифрованного и опубликованного ранее в открытых базах данных DDBJ/EMBL/GenBank под номерами CCSD01000001–CCSD01000115 (Ivshina et al., 2014), с использованием 93 программы MicroScope (https://www.genoscope.cns.fr/agc/microscope/home) обнаружено 13 нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки устойчивости к фармакологически активным веществам и эффлюксные насосы (таблица 9). Так, в геноме родококков присутствуют последовательности (RHRU231v1_600003, RHRU231v1_330072), кодирующие белки систем эффлюкса тяжелых металлов Co2+, Zn2+ и Cd2+ (CzcD) (Nies, Silver, 1995). Найден ген emrB (RHRU231v1_450049) и гены, кодирующие белки подсемейства EmrB/QacA (RHRU231v1_200048, RHRU231v1_960069, RHRU231v1_480072). Последние являются функциональным гомологами и относятся к семейству MFS H+-зависимых эффлюксных насосов, обеспечивающих, как правило, выведение антибиотиков из клеток (Lomovskaya, Lewis, 1992; Furukawa et al., 1993). В работе Sekavec с соавт. (2013) показано участие данных белков в формировании устойчивости Aeromonas hydrophila к хлоргексидину. Кроме того, у родококков обнаружен ген (RHRU231v1_230213), кодирующий белки Bcr/CflA эффлюксных насосов (семейство MFS). В работе Garcia с соавт. (2010) отмечено участие АТФ-зависимых эффлюксных насосов в выведении толуола из клеток Pseudomonas putida DOT-T1E, однако гомологи Bcr/CflA не учавствовали в данном процессе. Также в геноме R. ruber присутствуют пять других последовательностей (RHRU231v1_450058, RHRU231v1_560022, RHRU231v1_710017, RHRU231v1_710087, RHRU231v1_810021), соответсвующих эффлюксам из семейства MFS, и одна последовательность (RHRU231v1_450270), соответствующая эффлюксам из семейства ABC. Участие АТФ-зависимых транспортеров (семейство ABC) в выведении растворителей из клеток показано для S. cerevisiae KK-211 (Nishida et al., 2013). Также в работе Vencá (2012) показано участие АТФ- и Н+-зависимых насосов в формировании устойчивости Rhodococcus erythropolis DCL14 к антибиотикам ванкомицину и ципрофлоксацину. 94 Таблица 9 – Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей R. ruber ИЭГМ 231(номер в GenBank CCSD01000001–CCSD01000115) и R. aetherivorans IcdP1 (номер в GenBank CP011341.1) Ген czcD emrB – – Продукт Локус Номер в базе данных MicroScope Сходство с R. aetherivorans IcdP1 / Продукт 1057156…1058088 Размер гена (п.н.) 933 Белок системы эффлюкса катионов CzcD Гомолог белка В мультиустойчивости к веществам с лекарственной активностью Белок подсемейства EmrB/QacA устойчивости к веществам с лекарственной активностью Предполагаемый транспортер эффлюкса веществ с лекарственной активностью RHRU231v1_330072 99% / Транспортер катионов 3443399…3444370 972 RHRU231v1_600003 С/о 2261857…2263386 1530 RHRU231v1_450049 94% / Транспортер веществ с лекарственной активностью 560535…562163 1629 RHRU231v1_200048 С/о 2871899…2873434 1536 RHRU231v1_480072 С/о 5838435…5839922 1488 RHRU231v1_960069 2268190…2269830 1641 RHRU231v1_450058 3126446…3127867 1422 RHRU231v1_560022 3706371…3707567 1197 RHRU231v1_710017 96% / Транспортер веществ с лекарственной активностью 91% / Транспортер подсемейства MFS 99% / Транспортер веществ с лекарственной активностью 91% / Транспортер веществ с лекарственной активностью 95 Окончание таблицы 9 Ген Продукт – – – Транспортер подсемейства Bcr/CflA, обеспечивающий устойчивость к веществам с лекарственной активностью Белок подсемейства MFS мультиустойчивости к веществам с лекарственной активностью Транспортер антибиотиков семейства ABC Локус Номер в базе данных MicroScope Сходство с R. aetherivorans IcdP1 / Продукт 853615…854895 Размер гена (п.н.) 1281 RHRU231v1_230213 88% / Транспортер подсемейства Bcr/CflA, обеспечивающий устойчивость к веществам с лекарственной активностью 3779304…3780803 1500 RHRU231v1_710087 93% / Транспортер подсемейства MFS 4575362…4576528 1167 RHRU231v1_810021 92% / Транспортер подсемейства MFS 2392880…2394514 1635 RHRU231v1_450270 89% / Транспортер антибиотиков семейства ABC Примечание. «–» – нет названия гена, с/о – сходство отсутствует. 96 При и этом авторами орто-ванадат были натрия использованы (ингибиторы тиоридазин, насосов верапамил семейства ABC), мета-хлорофенилгидразон цианида и омепразол (ингибиторы семейства MFS). Таким образом, в геноме исследуемого нами штамма R. ruber ИЭГМ 231 выявлено два гена белков эффлюкса тяжелых металлов, один – транспортных насосов семейства АВС, и 10 последовательностей эффлюксов семейства MFS. При сравнении найденных нами последовательностей с опубликованными в базе данных GenBank установлен наиболее высокий (89–99%) процент гомологии с фрагментами генома штамма Rhodococcus aetherivorans IcdP1, кодирующими транспортные белки. Далее нами проведено сравнение генов acrA, acrB, tolC штамма E. coli K-12 (substr. MG1655; номер эталонной последовательности в GenBank NC_000913.3) и mexA, mexB, oprM штамма Pseudomonas aeruginosa PAO1 (номер эталонной последовательности NC_002516.2), кодирующих структурные белки Н+-зависимых эффлюксных насосов семейства RND, с полным геномом R. ruber ИЭГМ 231. При этом не было выявлено сходства (качество покрытия – всего 1–2 %) между генами транспортных каналов грамотрицательных бактерий и таковых генома родококков, что может свидетельствовать о наличии у последних уникальных последовательностей, кодирующих белки эффлюксных насосов. Таким образом, показано возможное участие H+- и Na+-зависимых эффлюксных насосов в формировании устойчивости родококков к растворителям и наличие в их геноме нуклеотидных последовательностей, ассоциированных с функциональными белками эффлюксных насосов. 97 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Устойчивые к органическим растворителям микроорганизмы используются для селективной трансформации гидрофобных субстратов с целью получения прекурсоров и интермедиатов фармакологически активных веществ, ароматизаторов, красителей, химически чистых реактивов (Ishige et al., 2005). Применение органических и водно-органических систем в качестве сред для биотранформации сложных соединений при оптимальном подборе условий инкубирования биокатализаторов (Kim et al., 2007; Zingaro et al., 2013) позволяет добиться высокой специфичности химических реакций и выхода целевого продукта с минимальным образованием побочных продуктов (Carrea, Riva, 2000; Klibanov, 2001; Schmid et al., 2001). При этом, в некоторых случаях, показано увеличение ферментативной активности в средах с органическими растворителями по сравнению с водными средами (Zaks, Klibanov, 1988; Mozhaev et al., 1989; Khmelnitsky et al., 1991). В биокаталитических процессах с использованием органических растворителей применяются целые клетки бактерий и грибов (Schmid et al., 2001; Heipieper et al., 2007). Перспективными для биотехнологии являются актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие широкой субстратной специфичностью и высокой устойчивостью к высокотоксичным органическим соединениям (Larkin et al., 2005; Kuyukina, Ivshina, 2010b). Устойчивость бактерий к органическим растворителям обусловлена их способностью к цис/транс-изомеризации жирных кислот и снижению текучести мембраны, биотрансформации de Bont, 1998; увеличению или Heipieper количества биодеструкции et al., 2007; мембранных липидов, растворителей (Isken, Heipieper, Martínez, 2010), а также работой эффлюксных насосов (Zheleznova et al., 2000; Ramos et al., 2001; Borges-Walmsley et al., 2003; Marques, 2005). У родококков важную роль играет клеточная стенка, выступающая в качестве физического барьера от токсического воздействия растворителя (de Carvalho, 2010). Одним 98 из современных морфологические связанные с методов, и позволяющих наномеханические функциональными эффективно изменения, перестройками в изучать непосредственно клетках в ходе формирования устойчивости к растворителям, является совмещенная конфокальная лазерная и атомно-силовая микроскопия (Flores, Toca-Herrera, 2009). В результате ранжирования полученных нами данных о жизнеспособности исследуемых родококков в присутствии растворителей выявлены группы устойчивостью. штаммов В целом, с относительно родококки высокой и характеризовались низкой высокой устойчивостью (72–119%) к воздействию гидрофобного н-декана, н-гексана, циклогексана и толуола. Как и следовало ожидать, родококки были чувствительны (22–46%) к воздействию гидрофильных растворителей, а именно: к бутанолу, изобутанолу, этилацетату, ацетону, этанолу и ацетонитрилу. Нами не выявлено строгой концентрационной зависимости токсического действия растворителей на клетки родококков. Напротив, в некоторых случаях наблюдалось увеличение числа жизнеспособных клеток при повышении концентрации растворителя, что, в случае гидрофобных растворителей, может быть связано со способностью родококков использовать данные соединения в качестве ростовых субстратов (Ившина и др., 2007; de Carvahlo et al., 2005; de Carvahlo, 2010), а в случае гидрофильных – с коагрегацией клеток (Милько, Егоров, 1991; Cassidy et al., 1996). Нами выявлены штаммы, обладающие множественной устойчивостью к органическим растворителям. Так, представители ‘R. longus’ ИЭГМ 32, ИЭГМ 69, R. opacus ИЭГМ 57 и R. ruber ИЭГМ 326 проявили устойчивость к шести из десяти исследуемых растворителей, а штамм ‘R. longus’ ИЭГМ 589 сохранял высокие показатели выживаемости при воздействии высокотоксичных изобутанола, этилацетата, ацетона и ацетонитрила. Для исследования влияния органических растворителей 99 на морфофункциональные и наномеханические свойства родококков был выбран подробно изученный ранее штамм R. ruber ИЭГМ 231 – биодеструктор углеводородных соединений и продуцент биосурфактантов (Ившина и др., 1995; Ившина и др., 2006; Рубцова и др., 2011; Рубцова и др., 2012; Philp et al., 2002). При исследовании влияния среды инкубирования на жизнеспособность бактерий в присутствии растворителей показано, что наиболее сильное (гибель 67–100% клеток) воздействие на родококки оказывали растворители в чистом виде либо в двухфазной системе растворитель-буферный раствор (1 : 1), вызывая 85–100%-ную гибель родококков. При этом наличие минеральных солей в среде RS способствовало повышению (на 2–70%) выживаемости клеток при воздействии растворителей, а в богатой органической среде LB родококки сохраняли сравнительно высокую (30–97%) жизнеспособность и даже проявляли способность к росту в присутствии н-декана, циклогексана и этанола. Полученные данные согласуются с опубликованными сведениями о влиянии компонентов среды культивирования на выживаемость бактериальных клеток в присутствии растворителей (Zingaro et al., 2013). После предварительного инкубирования клеток R. ruber ИЭГМ 231 в присутствии н-декана или циклогексана и селекции R-форм диссоциантов отмечено 3–12-кратное повышение жизнеспособности родококков под действием данных растворителей. При этом выживаемость родококков в экспериментах с изначально большим числом клеток также была в 1,5–3 раза выше, что может объясняться их способностью к клеточной диссоциации и коагрегации в присутствии растворителей. С помощью комбинированной КЛСМ-АСМ микроскопии показано, что воздействие н-декана и циклогексана приводило к четкому разделению популяции на живые и мертвые клетки, что проявлялось в виде зеленой и красной флуоресценции. В то же время более токсичные толуол, бутанол-1, этилацетат, ацетон, этанол и ацетонитрил даже при минимальной 100 концентрации вызывали повреждение клеточной мембраны еще жизнеспособных клеток, о чем свидетельствовало характерное «двойное» свечение (Roberts et al., 2012), которое разделялось нами при помощи дифференцированного анализа флуоресцентных сигналов. Анализ морфометрических данных КЛСМ-АСМ-сканирования показал увеличение (на 0,3–0,5 мкм-1) относительной площади контакта живых клеток родококков с нетоксичными н-деканом и циклогексаном. При этом воздействие толуола вызывало уменьшение этого показателя (на 0,6 мкм-1) по сравнению с контрольными значениями, что может служить защитным механизмом от токсического действия растворителя (Newmann et al., 2005; Kongpol et al., 2012). Нами проанализированы профили микрои нанорельефа клеток родококков после воздействия на них растворителей. В частности, показано увеличение (на 12–21%) высоты микрорельефа и снижение (на 33–54%) показателей нанорельефа живых клеток родококков после воздействия гидрофобных растворителей. Напротив, при воздействии гидрофильных растворителей наблюдался рост (на 3–104%) показателей шероховатости клеточной поверхности. Выявлено увеличение количества суммарных липидов в клетках R. ruber, что может служить эффективным приемом защиты от воздействия растворителей (Ившина, 2014; Tsitko et al., 1999). При этом наиболее выраженное (в 2 раза) повышение липидного компонента наблюдалось при воздействии гидрофобного н-декана, а наименьшее – после воздействия этилацетата. Сравнительный анализ дыхательной активности родококков, инкубированных в разных средах, показал рост скорости потребления O2 и выделения CO2 в присутствии н-декана, тогда как воздействие этанола, напротив, приводило к ее снижению. Следовательно, воздействие растворителей вызывало дифференцированные изменения морфологических и функциональных свойств R. ruber. Данные, полученные путем АСМ-индентирования клеток родококков и анализа полученных силовых кривых, демонстрируют уменьшение модуля 101 упругости в 2–4,5 раза под действием всех использованных растворителей, что свидетельствует о снижении жесткости связей между компонентами клеточной стенки. Очевидно, действие органических растворителей приводит к структурно-механическим перестройкам, в частности, появлению более эластичных участков клеточной оболочки. Так, в режиме АСМ-спектроскопии получены карты адгезии зонда силовой кантилевера к поверхности родококков. Выявлено увеличение (на 0,2 нН) сил взаимодействия между зондом кантилевера и поверхностью клеток, инкубированных в циклогексане, по сравнению с контрольными клетками. Воздействие толуола и этанола, напротив, приводило к снижению силы адгезии зонда (на 1,1 и 2,2 нН, соответственно), которое могло быть вызвано денатурацией белков и растворением липидных компонентов клеточной оболочки (McDonnell, Russell, 1999). Установлено, что парокситин и фенил-аргинин практически полностью подавляют рост клеток родококков в присутствии н-гексана и циклогексана, что указывает на возможное участие H+- и Na+-зависимых эффлюкных насосов в формировании устойчивости родококков к данным растворителям. Напротив, присутствие в среде орто-ванадата натрия не оказывало ингибирующего воздействия на бактериальный рост, так как АТФ-зависимые насосы, по-видимому, не участвуют в выведении избытка растворителей из клеток (Matsumoto et al., 2002; Kongpol et al., 2012). Полученные данные частично подтверждаются биоинформационным анализом, выявившим в геноме родококков 13 генов, предположительно кодирующих белки эффлюксных насосов. В результате исследования отобраны штаммы родококков, обладающие высокой устойчивостью к органическим растворителям, которые могут быть использованы в биокатализе для получения биотехнологически значимых соединений. 102 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что исследованные коллекционные штаммы актинобактерий рода Rhodococcus устойчивы (жизнеспособность клеток составляет от 72 до 119 %) к гидрофобным (logPO/W ≥ 2,5) и чувствительны (жизнеспособность клеток составляет от 22 до 46 %) к гидрофильным (logPO/W ≤ 0,9) растворителям. Отдельные представители R. opacus ИЭГМ 57, ИЭГМ 58, R. ruber ИЭГМ 326, ИЭГМ 343 и ‘R. longus’ ИЭГМ 32, ИЭГМ 69, ИЭГМ 589 характеризуются множественной устойчивостью к органическим растворителям. 2. Показано, органических что родококки, растворителей, устойчивые характеризуются к воздействию изменением степени шероховатости (микрорельефа – на 14–79 нм, нанорельефа – на 1,3–2,5 нм) клеточной поверхности, а также увеличением относительной площади поверхности клеток (на 5–9 %), респираторной активности (на 3–34 мкл/мин) и количества суммарных липидов (на 9–42 %). 3. На примере R. ruber ИЭГМ 231 обнаружено, что воздействие гидрофобных и гидрофильных растворителей приводит к изменению наномеханических свойств родококков, в частности к снижению модуля упругости (на 0,6–1,1 МПа) и перераспределению адгезивных участков клеточной поверхности. 4. Выявлено участие H+- и Na+-зависимых эффлюксных насосов в выведении избытка органических растворителей (н-гексана, циклогексана) из клеток R. ruber ИЭГМ 231, что подтверждается наличием в геноме родококков характерных нуклеотидных последовательностей транспортных белков. 103 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Адаптационные механизмы выживания алканотрофных родококков, реализованные в неблагоприятных условиях / И.Б. Ившина [и др.] // Вестник Пермского Университета. – 2007. – № 10. – С. 107–112. 2. Артамонова, М.Н. Исследование топографии поверхности Bacillus subtilis в условиях гипотермии / М.Н. Артамонова, Н.И. ПотатуркинаНестерова // Фундаментальные исследования. – 2014. - № 11. – С. 1035–1039. 3. Атомно-силовая микроскопия как метод исследования в микробиологии / Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, А.В. Даньшина // Современные проблемы науки и образования. – 2012. - № 3. – С. 316. 4. Валышев, А.В. Изучение особенностей действия катионного антимикробного пептида низина на бактерии Listeria monocytogenes с использованием атомно-силовой микроскопии / А.В. Валышев, А.С. Васильченко // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии – 2013. – № 5. – С. 8–13. 5. Деградация парацетамола с истекшим сроком годности свободными клетками актинобактерий / И.Б. Ившина [и др.] // Катализ в промышленности. – 2006. – № 2. – С. 44–49. 6. Елькин, А.А. Биокаталитическое окисление тиоанизола свободными и иммобилизованными клетками родококков : дис. … канд. биол. наук : 03.02.03 / Елькин Андрей Анатольевич. – Пермь, 2011. – 121 с. 7. Елькин, А. А. Окислительная биотрансформация тиоанизола клетками Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66 / А.А. Елькин, В.В. Гришко, И.Б. Ившина // Прикладная биохимия и микробиология. – 2010. – Т. 46, № 6. – С. 637–643. 8. Ившина, И.Б. Адаптационные механизмы выживания алканотрофных родококков, реализованные в неблагоприятных условиях / И.Б. Ившина, Т.Н. Каменских, Б.А. Анохин // Вестник Пермского Университета. – 2007. – № 10. – С. 107–112. 104 9. Ившина, И.Б. Большой практикум «Микробиология» : учебное пособие / И.Б. Ившина. – СПб. : Проспект науки, 2014. – 112 с. 10. Ившина, И.Б. Пропанокисляющие родококки / И.Б. Ившина, Р.А. Пшеничнов, А.А. Оборин. – Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. – 127 с. 11. Исследование морфологии клеток дикого типа и ipt-трансформанта фототрофной пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides методами атомносиловой и электронной микроскопии / А.В. Мачулин [и др.] // Биофизика. – 2012. – Т. 57, № 1. – С. 88–92. 12. Кейтс, М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. – М.: Мир, 1975. – 324 с. 13. Комплексный подход к изучению биопленок микроорганизмов методом атомно-силовой микроскопии / П.С. Ерохин [и др.] // Известия Саратовского Университета. – 2012. – Т. 12, № 1. – С. 42–46. 14. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: принципы, устройство, применение (часть 1) / Э.И. Лежнев [и др.] // Научное приборостроение. – 2001а. – Т. 11, № 2. – С. 3–20. 15. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: принципы, устройство, применение (часть 2) / Э.И. Лежнев [и др.] // Научное приборостроение. – 2001б. – Т. 11, № 3. – С. 26–42. 16. Куюкина, М.С. Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение : дисс. … д-ра биол. наук : 03.00.07 / Куюкина Мария Станиславовна. – Пермь, 2006. – 295 с. 17. Методы иммобилизации микроорганизмов для динамических атомносиловых исследований (обзор) / М.С. Куюкина [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2014. – Т. 50, №1. – С. 7–16. 18. Милько, Е.С. Гетерогенность популяций бактерий и процесс диссоциации: (Корине- и нокардиоподобные бактерии) / Е.С. Милько, Н.С. Егоров. – М.: МГУ, 1991. – 141 с. 105 19. Мухутдинова, А.Н. Биодеструкция дротаверина гидрохлорида актинобактериями рода Rhodococcus : дис. … канд. биол. наук : 03.02.03 / Мухутдинова Анна Наилевна. – Пермь, 2014. – 126 с. 20. Ноговицина, Е. М. Биокаталитическое получение фармакологически перспективного стигмаст-4-ен-3-она с использованием клеток родококков / Е.М. Ноговицина, В.В. Гришко, И.Б. Ившина // Биоорганическая химия. – 2011. – Т. 37, № 5. – С. 697–704. 21. Оценка терморезистентности Azotobacter chroococcum 66 методом атомно-силовой микроскопии / Л.Н. Олюнина [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2009. – Т. 45, № 1. – С. 45–50. 22. Рубцова, Е.В. Адгезия клеток родококков к жидким углеводородам и их производным : дис. … канд. биол. наук : 03.02.03 / Рубцова Екатерина Владиславовна. – Пермь, 2011. – 188 с. 23. Рубцова, Е.В. Влияние условий культивирования на адгезивную активность родококков в отношении н-гексадекана / Е.В. Рубцова, М.С. Куюкина, И.Б. Ившина // Прикладная биохимия и микробиология. – 2012. – Т. 48, № 5. – С. 501–509. 24. Серебренникова, М.К. Биодеградация нефтяных углеводородов иммобилизованными родококками в колоночном биореакторе : дис. … канд. биол. наук : 03.02.03 / Серебренникова Марина Константиновна. – Пермь, 2014. – 159 с. 25. Тарасова, Е.В. Биотрансформация бетулина актинобактериями рода Rhodococcus : дис. … канд. биол. наук : 03.02.03 / Тарасова Екатерина Владимировна. – Пермь, 2014. – 136 с. 26. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем / И.Б. Ившина [и др.] // Микробиология. – 1995. – Т. 64, № 4. – С. 507–513. 27. Черемных, К.М. биодеструкция смоляных кислот – доминирующих токсичных соединений в отходах целлюлозно-бумажной промышленности / 106 К. М. Черемных // Вестник Пермского Университета. – 2014. – № 3. – С. 57–62. 28. Коронелли, Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) / Т.В. Коронелли // Прикладная биохимия и микробиология. – 1996. – Т. 32, № 6. – С. 579–585. 29. ABC transporters and cell wall proteins involved in organic solvent tolerance in Saccharomyces cerevisiae / N. Nishida [et al.] // Journal of Bacteriology. – 2013. – V. 165, N. 2. – P. 145–152. 30. A comparison of various methods to predict bacterial predilection for organic solvents used as reaction media / T. Hamada [et al.] // Journal of Bioscience and Bioengineering. – 2008. – V. 106, N. 4. – P. 357–362. 31. Active efflux of organic solvents by Pseudomonas putida S12 is induced by solvents / J. Kieboom [et al.] // Journal of Bacteriology. – 1998. – V. 180, N. 24. – P. 6769–6772. 32.Adaptation of Rhodococcus erythropolis cells to high concentrations of toluene / C.C.C.R. de Carvalho [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2007. – V. 76, N. 6. – P. 1423–1430. 33. Adhesion forces and coaggregation between vaginal staphylococci and lactobacilli / J.A. Younes [et al.] // PLoS One. – 2012. – V. 7, N. 5. – e36917. 34. Adventures in Rhodococcus — from steroids to explosives / K.C. Yam [et al.] // Canadian Journal of Microbiology. – 2011. – V. 57, N. 3. – P. 155–168. 35. AFM imaging of bacteria in liquid media immobilized on gelatin coated mica surfaces / M.J. Doktycz [et al.] // Ultramicroscopy. – 2003. – V. 97, N. 1–4. – P. 209–216. 36. Ahimou, F. Real-time imaging of the surface topography of living yeast cells by atomic force microscopy / F. Ahimou, A. Touhami, Y.F. Dufrêne // Yeast. – 2003. – V. 20, N. 1. – P. 25–30. 37. Ahmad, S. Microbial transformation of sterols in organic media / S. Ahmad, B.N. Johri // Indian Journal of Chemistry (Section B). – 1993. – V. 32. – P. 67–69. 107 38. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer / J.C. Philp [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2002. – V. 59, N. 2–3. – P. 318–324. 39. Analysis of immunolabeled cells by atomic force microscopy, optical microscopy, and flow cytometry / C. Neagy [et al.] // Journal of Structural Biology. – 1994. – V. 112, N. 1. – P. 32–40. 40. An antirepressor, SrpR, is involved in transcriptional regulation of the SrpABC solvent tolerance efflux pump of Pseudomonas putida S12 / X. Sun [et al.] // Journal of Bacteriology. – 2011. – V. 193, N. 11. – P. 2717–2725. 41. A non-invasive fluorescent staining procedure allows Confocal Laser Scanning Microscopy based imaging of Mycobacterium in multispecies biofilms colonizing and degrading polycyclic aromatic hydrocarbons / K. Wouters [et al.] // Journal of Microbiological Methods. – 2012. – V. 83. – P. 317–325. 42. A novel biocatalytic approach to acetylation of 1-β-D-arabinofuranosylcytosine by Aspergillus oryzae whole cell in organic solvents / X.-F. Li [et al] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2012. – V. 93, N. 1. – P. 143–150. 43. Antibody selection for immobilizing living bacteria / Z. Suo [et al.] // Analytical Chemistry. – 2009. – V. 81, N. 18. – P. 7571–7578. 44. Antimicrobial action of ε-poly-L-lysine / S. Shima [et al.] // The Journal of Antibiotics. – 1984. – V. 37, N. 11. – P. 1449–1455. 45. Are the soft, liquid-like structures detected around bacteria by ambient dynamic atomic force microscopy capsules? / A. Méndez-Vilas [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. – 2011. – V. 77, N. 9. – P. 3102–3114. 46. Assembly of live micro-organisms on microstructured PDMS stamps by convective/capillary deposition for AFM bio-experiments / E. Dague [et al.] // Nanotechnology. – 2011. – V. 22, N. 39. – P. 395102. 47. A structure-based mechanism for drug binding by multidrug transporters / E.E. Zheleznova [et al.] // Trends in Biochemical Sciences. – 2000. – V. 25, N. 2. – P. 39–43. 108 48. Atomic force microscopy imaging of dried or living bacteria / D. Robichon [et al.] // Comptes Rendus De L Academie Des Sciences Serie III. – 1999. – V. 322, N. 8. – P. 687–693. 49. Atomic force microscopy of a ctpA mutant in Rhizobium leguminosarum reveals surface defects linking CtpA function to biofilm formation / J. Dong [et al.] // Microbiology. – 2011. – V. 157, N. 11. – P. 3049–3058. 50. Atomic force microscopy study on specificity and non-specificity of interaction forces between Enterococcus faecalis cells with and without aggregation substance / K. Waar [et al.] // Microbiology. – 2005. – V. 151, N. 7. – P. 2459–2464. 51.Bacterial surface appendages strongly impact nanomechanical and electrokinetic properties of Escherichia coli cells subjected to osmotic stress / G. Francius [et al.] // PLoS One. – 2011. – V. 6, N. 5. – e20066. 52. Bhattacharyya, M.S. Asymmetric reduction of a ketone by wet and lyophilized cells of Geotrichum candidum in organic solvents / M.S. Bhattacharyya, A. Singh, U.C. Banerjee // New Biotechnology. – 2012. – V. 29, N. 3. – P. 359–364. 53. Bioconversion of acrylonitrile to acrylic acid by Rhodococcus ruber strain AKSH-84 / A. Kamal [et al.] // Journal of Microbiology and Biotechnology. – 2011. – V. 21, N. 1. – P. 37–42. 54. Biodegradation of drotaverine hydrohloride by free and immobilized cell of Rhodococcus rhodochrous IEGM 608 / I.B. Ivshina [et al.] // World Journal of Microbiology and Biotechnology. – 2012. – V. 28, N. 10. – P. 2997–3006. 55. Bioproduction of vanillin using an organic solvent-tolerant Brevibacillus agri 13 / N. Wangrangsimagul [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2012. – V. 93, N. 2. – P. 555–563. 56.Biodegradation potential of the genus Rhodococcus / L. Martínkova [et al.] // Environment International. – 2009. – V. 35, N. 1. – P. 162–177. 109 57. Biosurfactant-enhanced immobilization of hydrocarbon-oxidizing Rhodococcus ruber on sawdust / I.B. Ivshina [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2013. – V. 97, N. 12. – P. 5315–5327. 58. Biotransformation in organic media by enzymes and whole cells / J.M.S. Cabral [et al.] // Journal of Biotechnology. – 1997. – V. 59, N. 1–2. – P. 133–143. 59. Biotransformation of indole to indigo by the whole cells of phenol hydroxylase engineered strain in biphasic systems / S. Shi [et al.] // Applied Biochemistry and Biotechnology. – 2013. – V. 169, N. 4. – P. 1088–1097. 60. Bolshakova, A.V. Microbial surfaces investigated using atomic force microscopy / A.V. Bolshakova, O.I. Kiselyova, I.V. Yaminsky // Biotechnology in Progress. – 2004. – V. 20, N. 6. – P. 1615–1622. 61. Borges-Walmsley, M.I. Structure and function of efflux pumps that confer resistance to drugs / M.I. Borges-Walmsley, K.S. McKeegan, A.R. Walmsley // Biochemical Journal. – 2003. – V. 376, N. 2. – P. 313–338. 62. Braco, L. Biocatalysis and biorecognition in nonaqueous media. Some perspectives in analytical biochemistry / L. Braco // Microchimica Acta. – 1995. – V. 120. – P. 231–242. 63. Camesano, T.A. Observation of changes in bacterial cell morphology using tapping mode atomic force microscopy / T.A. Camesano, M.J. Natan, B.E. Logan // Langmuir. – 2000. – V. 16, N. 10. – P. 4563–4572. 64. Capture efficiency of Escherichia coli in fimbriae-mediated immunoimmobilization / Z. Suo [et al.] // Langmuir. – 2012. – V. 28, N. 2. – P. 1351–1359. 65. Carrea, G. Properties and synthetic applications of enzymes in organic solvents / G. Carrea, S. Riva // Angewandte Chemie International Edition. – 2000. – V. 39, N. 13. – P. 2226–2254. 66. Cassidy, M.B. Environmental applications of immobilized microbial cells: a review / M.B. Cassidy, H. Lee, J.T. Trevors // Journal of Industrial Microbiology. – 1996. – V. 16, N. 2. – P. 79–101. 110 67. Catalytic activity and denaturation of enzymes in water/organic cosolvent mixtures α-Chymotrypsin and laccase in mixed water/alcohol, water/glycol and water/formamide solvents / V.V. Mozhaev [et al.] // European Journal of Biochemistry. – 1989. – V. 184, N. 3. – P. 597–602. 68. Cells of Pseudomonas putida and Enterobacter sp. adapt to toxic organic compounds by increasing their size / G. Newmann [et al.] // Extremophiles. – 2005. – V. 9, N. 2. – P. 163–168. 69. Chandraprabha, M.N. Modeling and analysis of nanoscale interaction forces between Acidithiobacillus ferrooxidans and AFM tip / M.N. Chandraprabha, P. Somasundaran, K.A. Natarajan // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. – 2010. – V. 75, N. 1. – P. 310–318. 70. Changes in biofilm structure during the colonization of chalcopyrite by Acidithiobacillus thiooxidans / J.V. García-Meza [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2013. – V. 97, N. 13. – P. 6065–6075. 71. Chao, Y. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy / Y. Chao, T. Zhang // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2011. – V. 92, N. 2. – P. 381–392. 72. Characterization of acetonitrile-tolerant marine bacterium Exiguobacterium sp. SBH81 and its tolerance mechanism // A. Kongpol [et al.] // Microbes and Environments. – 2012. – V. 27, N. 1. – P. 30–35. 73. Choudhuri, B.S. Isoniazid accumulation in Mycobacterium smegmatis is modulated by proton motive force-driven and ATP-dependent extrusion systems / B.S. Choudhuri, S. Sen, P. Chakrabarti // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 1999. – V. 256. – P. 682–684. 74. Combination of convective/capillary deposition and AFM oxidation lithography for colloid directed assembly / L. Ressier [et al.] // Langmuir. – 2008. – V. 24, N. 23. – P. 13254–13257. 111 75. Combined AFM and confocal fluorescence microscope for applications in bio-nanotechnology / R. Kassies [et al.] // Journal of Microscopy. – 2005. – V. 217, N. 1. – P. 109–116. 76. Combining optical and atomic force microscopy for life sciences research / J. Vesenka [et al.] // Biotechniques. – 1995. – V. 19, N. 2. – P. 240–248. 77. Comparison of atomic force microscopy interaction forces between bacteria and silicon nitride substrata for three commonly used immobilization methods / V. Vadillo-Rodríguez [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. – 2004b. – V. 70, N. 9. – P. 5441–5446. 78. Comparison of polymer induced and solvent induced trypsin denaturation: The role of hydrophobicity / L.S. Jasti [et al.] // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. – 2014. – V. 116. – P. 201–205. 79.Contour and persistence length of Corynebacterium diphtheriae pili by atomic force microscopy / J. Rheinlaender [et al.] // European Biophysical Journal. – 2012. – V. 41, N. 6. – P. 561–570. 80. Correlated atomic force microscopy and fluorescence lifetime imaging of live bacterial cells / M. Micic [et al.] // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. – 2004. – V. 34, N. 4. – P. 205–212. 81. Correlated light microscopy and electron microscopy / K.A. Sjollema [et al.] // Methods in Cell Biology. – 2012. – V. 111. – P. 157–173. 82. Correlative electron and X-ray microscopy: probing chemistry and bonding with high spatial resolution / A.E. Goode [et al.] // Nanoscale. – 2015. – V. 7, N. 5. – P. 1534–1548. 83. Cortez-Cordova, J. Activity of the efflux pump inhibitor phenylalaninearginine β-naphthylamide against the AdeFGH pump of Acinetobacter baumannii / J. Cortez-Cordova, A. Kumar // International Journal of Antimicrobial Agents. – 2011. – V. 37, N. 5. – P. 420–424. 84. Crystal structure of the drug discharge outer membrane protein, OprM, of Pseudomonas aeruginosa / H. Akama [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. – 2004. – V. 279, N. 51. – P. 52816–52819. 112 85. de Boer, P. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up! / P. de Boer, J.P. Hoogenboom, B.N. Giepmans // Nature Methods. – 2015. – V. 12, N. 6. – P 503–513. 86. de Bont, J.A.M. Solvent tolerant bacteria in biocatalysis / J.A.M. de Bont // Trends in Biotechnology. – 1998. – V. 16. – P. 493–499. 87. de Carvalho, C.C.C.R. Adaptation of Rhodococcus erythropolis cells for growth and bioremediation under extreme conditions / C.C.C.R. de Carvalho // Research in Microbiology. – 2012. – V. 163, N. 2. – P. 125–136. 88. de Carvalho, C.C.C.R. Adaptation of Rhodococcus to organic solvents/ C.C.C.R. de Carvalho // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 109–131. 89. de Carvalho, C.C.C.R. Cell adaptation to solvent, substrate and product: a successful strategy to overcome product inhibition in a bioconversion system / C.C.C.R. de Carvalho, A. Poretti, M.M.R. da Fonseca // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2005. – V. 69, N. 3. – P. 268–275. 90. de Carvalho, C.C.C.R. The remarkable Rhodococcus erythropolis / C.C.C.R. de Carvalho, M.M.R. da Fonseca // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2005. – V. 67, N. 6. – P. 715–726. 91. Denaturation capacity: a new quantitative criterion for selection of organic solvents as reaction media in biocatalysis / Y.L. Khmelnitsky [et al.] // European Journal of Biochemistry. – 1991. – V. 198, N. 1. – P. 31–41. 92. de Smet, M.J. The effect of toluene on the structure and permeability of the outer and cytoplasmic membranes of Escherichia coli / M.J. de Smet, J. Kingma, B. Witholt // Biochimica et Biophysica Acta. – 1978. – V. 506, N. 1. – P. 64–80. 93. Dhahri, S. In-situ determination of the mechanical properties of gliding or non-motile bacteria by atomic force microscopy under physiological conditions without immobilization / S. Dhahri, M. Ramonda, C. Marlíere // PLoS One. – V. 8, N. 4. – e61663. 113 94. Differential lipopolysaccharide core capping leads to quantitative and correlated modifications of mechanical and structural properties in Pseudomonas aeruginosa biofilms / P.C.Y. Lau [et al.] // Journal of Bacteriology. – 2009. – V. 191, N. 21. – P. 6618–6631. 95. Direct probing by atomic force microscopy of the cell surface softness of a fibrillated and nonfibrillated oral streptococcal strain / H.C. van der Mei [et al.] // Biophysical. – 2000. – V. 78, N. 5. – P. 2668–2674. 96. Draft genome sequence of propane- and butane-oxidizing actinobacterium Rhodococcus ruber IEGM 231 / I.B. Ivshina [et al.] // Genome Announcements. – 2014. – V. 2, N. 6. – e01297-14. 97. Dufrêne, Y.F. Atomic force microscopy, a powerful tool in microbiology / Y.F. Dufrêne // Journal of Bacteriology. – 2002. – V. 184, N. 19. – P. 5205–5213. 98. Effect of colistin exposure and growth phase on the surface properties of live Acinetobacter baumannii cells examined by atomic force microscopy / Soon [et al.] // International Journal of Antimicrobial Agents. – 2011. – V. 38, N. 6. – P. 493–501. 99. Effect of organic solvents on growth of Escherichia coli K-12 / R. Aono [et al.] // Bioscience Biotechnology and Biochemistry. – 1994. – V. 58, N. 11. – P. 2009–2014. 100. Efficient immobilization and patterning of live bacterial cells / Z. Suo [et al.] // Langmuir. – 2008. – V. 24, N. 8. – P. 4161–4167. 101. Efflux pump-mediated antibiotics resistance: insights from computational structural biology / N. Fischer [et al.] // Interdisciplinary Sciences: Computational Life Sciences. – 2014. – V. 6, N. 1. – P. 1–12. 102. EfrAB, an ABC multidrug efflux pump in Enterococcus faecalis / E.-W. Lee [et al.] // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. – 2003. – V. 47, N. 12. – P. 3733–3738. 103. Endicott, J.A. The biochemistry of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance / J.A. Endicott, V. Ling // Annual Review of Biochemistry. – 1989. – V. 58. – P. 137–171. 114 104. Enhanced bioproduction of carvone in a two-liquid-phase partitioning bioreactor with a highly hydrophobic biocatalyst / J.L.E. Morrish [et al.] // Biotechnology and Bioengineering. – 2008. – V. 101, N. 4. – P. 768–775. 105. Finnerty, W.R. The biology and genetics of the genus Rhodococcus / W.R. Finnerty // Annual Review of Microbiology. – 1992. – V. 46. – P. 193–218. 106. Flores, S.M. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques / S.M. Flores, J.L. Toca-Herrera // Nanoscale. – 2009. – V. 1. – P. 40–49. 107. Fluorescence microscopy / M.J. Sanderson [et al.] // Cold Spring Harbor Laboratory Press. – 2015. – V. 10. – P. 1042–1066. 108. Fonta, C.L. Correlative microscopy / C.L. Fonta, B.M. Humbel // Archives of Biochemistry and Biophysics. – 2015. – V. 581. – P. 98–110. 109. Forces involved in bacterial adhesion to hydrophilic and hydrophobic surfaces / N.P. Boks [et al.] // Microbiology. – 2008. – V. 154, N. 10. – P. 3122–3133. 110. Formation of intracytoplasmic lipid inclusions by Rhodococcus opacus strain PD630 / H.M. Alvarez [et al.] // Archives of Microbiology. – 1996. – V. 165, N. 6. – P. 377–386. 111. Fralick, J.A. Evidence that TolC is required for functioning of the Mar/AcrAB efflux pump of Escherichia coli / J.A. Fralick // Journal of Bacteriology. – 1996. – V. 178, N. 19. – P. 5803–5805. 112. Fukumoto, T. Atomic force microscopy and laser confocal scanning microscopy analysis of callose fibers developed from protoplasts of embryogenic cells of a conifer / T. Fukumoto, N. Hayashi, H. Sasamoto // Planta. – 2005. – V. 223. – P. 40–45. 113. Functional analysis of new transporters involved in stress tolerance in Pseudomonas putida DOT-T1E / V. García [et al.] // Environmental Microbiology Reports. – 2010. – V. 2, N. 3. – P. 389–395. 115 114. Gad, M. Method for immobilizing microbial cells on gel surface for dynamic AFM studies / M. Gad, A. Ikai // Biophysical Journal. – V. 69, N. 6. – P. 2226–2233. 115. Garikipati, S.V.B.J. Whole-cell biocatalysis for 1-naphthol production in liquid-liquid biphasic systems / S.V.B.J. Garikipati, A.M. McIver, T.L. Peeples // Applied and Environmental Microbiology. – 2009. – V. 75, N. 20. – P. 6545–6552. 116. Genotypic and phenotypic detection of efflux pump in Rhodococcus equi / L.T. Gressler [et al.] // Brazilian Journal of Microbiology. – 2014. – V. 45, N. 2. – P. 661–665. 117. Science Greb, C. Fluorescent Dyes [Электронный ресурс] / C. Greb // Lab. – 2012. – Режим доступа: http://www.leica- microsystems.com/science-lab/fluorescent-dyes/ 118. Griebenow, K. On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure organic solvents / K. Griebenow, A.M. Klibanov // Journal of the American Chemical Society. – 1996. – V. 118, N. 47. – P. 11695–11700. 119. Grishko, V.V. Biotransformation of betulin to betulone by growing and resting cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 66 / V.V. Grishko, E.V. Tarasova, I.B. Ivshina // Process Biochemistry. − 2013. − V. 48, N. 11. − P. 1640−1644. 120. Gupta, M.N. Enzyme function in organic solvents / M.N. Gupta // European Journal of Biochemistry. – 1992. – V. 203, N. 1–2. – P. 25–32. 121. Hayashi, S. Simple and rapid cell growth assay using tetrazolium violet coloring method for screening of organic solvent tolerant bacteria / S. Hayashi, T. Kobayashi, H. Honda // Journal of Bioscience and Bioengineering. – 2003. – V. 96, N. 4. – P. 360–363. 122. Heipieper, H.J. Adaptation of Pseudomonas putida S12 to ethanol and toluene at the level of fatty acid composition of membrane / H.J. Heipieper, J.A.M. de Bont // Applied and Environmental Microbiology. – 1994. – V. 60, N. 12. – P. 4440–4444. 116 123. Heipieper, H.J. Toxicity of hydrocarbons to microorganisms / H.J. Heipieper, P.M. Martínez // Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology / Ed. K.N. Timmis. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 1565–1573. 124. High-level production of amorpha-4,11-diene in a two-phase partitioning bioreactor of metabolically engineered Escherichia coli / J.D. Newman [et al.] // Biotechnology and Bioengineering. – 2006. – V. 95, N. 4. – P. 684–691. 125. High-resolution imaging using a novel atomic force microscope and confocal laser scanning microscope hybrid instrument: essential sample preparation aspects / S.H. Doak [et al.] // Histochemistry and Cell Biology. – 2008. – V. 130. – P. 909–916. 126. Immobilization method of yeast cells for intermittent contact mode imaging using the atomic force microscope / T. De [et al.] // Ultramicroscopy. – 2010. – V. 110, N. 3. – P. 254–258. 127. Immobilization of hydrocarbon-oxidizing bacteria in poly(vinyl alcohol) cryogels hydrophobized using a biosurfactant / M.S. Kuyukina [et al.] // Journal of Microbiological Methods. – 2006. – V. 65, N. 3. – P. 596–603. 128. Immobilization of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions / R.L. Meyer [et al.] // Ultramicroscopy. – 2010. – V. 110, N. 11. – P. 1349–1357. 129. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes / L. Kailas [et al.] // Ultramicroscopy. – 2009. – V. 109, N. 7. – P. 775–780. 130. Industrial biocatalysis today and tomorrow / A. Schmid [et al.] // Nature. –2001. – V. 409. – P. 258–268. 131. Influence of copper ions on the viability and cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa under conditions relevant to drinking water environments / Z. Dwidjosiswojo [et al.] // International Journal of Hygiene and Environmental Health. – 2011. – V. 214. – P. 485–492. 117 132. Influence of interfaces on microbial activity / M.C.M. van Loosdrecht [et al.] // Microbiological reviews. – 1990. – V. 54, N. 1. – P. 75–87. 133. Inoue, A. A Pseudomonas thrives in high concentrations of toluene / A. Inoue, K. Horokoshi // Letters of Nature. – 1989. – V. 338. – P. 264–266. 134. Integrated organic-aqueous biocatalysis and product recovery for quinaldine hydroxylation catalyzed by living recombinant Pseudomonas putida / F.O. Ütkür [et al.] // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. – 2012. – V. 39, N. 7. – P. 1049–1059. 135. Integration of atomic force and confocal microscopy / M. Horton [et al.] // Single Molecules. – 2000. – V. 2. – P. 135–137. 136. Investigation of integrin expression on the surface of osteoblast-like cells by atomic force microscopy / F.C. Soumetz [et al.] // Ultramicroscopy. – 2010. – V. 110. – P. 330–338. 137. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM / T. Cao [et al.] // Biotechnology and Bioengineering. – V. 98, N. 6. – P. 1109–1122. 138. In vitro cytokine stimulation assay for glycolipid biosurfactant from Rhodococcus ruber: role of monocyte adhesion / S.V. Gein [et al.] // Cytotechnology. – 2011. – V. 63, N. 6. – P. 559–566. 139. In vitro interactions between probiotic bacteria and milk proteins probed by atomic force microscopy / J. Burgain [et al.] // Colloid and Surfaces B: Biointerfaces. – 2013. – V. 104. – P. 153–162. 140. Ishige, T. Whole organism biocatalysis / T. Ishige, K. Honda, S. Shimizu // Current Opinion in Chemical Biology. – 2005. – V. 9, N. 2. – P. 174–180. 141. Isken, S. Bacteria tolerant to organic solvents / S. Isken, J.A.M. de Bont // Extremophiles. – 1998. – V. 2, N. 3. – P. 229–238. 142. Jarlier, V. Mycobacterial cell wall: Structure and role in natural resistance to antibiotics / V. Jarlier, H. Nikaido // FEMS Microbiology Letters. – 1994. – V. 123, N. 1-2. – P. 11–18. 118 143. Jin, H.-X. Enantioselective hydrolysis of epichlorohydrin using whole Aspergillus niger ZJB-09173 cells in organic solvents / H.-X. Jin, Z.-C. Hu, Y.-G. Zheng // Journal of Biosciences. – 2012. – V. 37, N. 4. – P. 695–702. 144. Kang, S. Bioinspired single bacterial cell force spectroscopy / S. Kang, M. Elimelech // Langmuir. – 2009. – V.25, N. 17. – P. 9656–9659. 145. Kasas, S. A method for anchoring round shaped cells for atomic force microscope imaging / S. Kasas, A. Ikai // Biophysical Journal. – 1995. – V. 68, N. 5. – P. 1678–1680. 146. Khmelnitsky, Y.L. Biocatalysis in nonaqueous solvents / Y.L. Khmelnitsky, J.O. Rich // Current Opinion in Chemical Biology. – 1999. – V. 3, N. 1. – P. 47–53. 147. Kim, P.-Y. Substrate supply for effective biocatalysis / P.-Y. Kim, D.J. Polland, J.M. Woodley // Biotechnology in Progress. – 2007. – V. 23, N. 1. – P. 74–82. 148. Kinetics of antimicrobial peptide activity measured on individual bacterial cells using high-speed atomic force microscopy / G.E. Fantner [et al.] // Nature Nanotechnology. – 2010. – V. 5, N. 4. – P. 280–285. 149. Klibanov, A.M. Improving enzymes by using them in organic solvents / A.M. Klibanov // Nature. – 2001. – V. 409. – P. 241–246. 150. Kuyukina, M.S. Application of Rhodococcus in bioremediation of contaminated environments / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010b. – P. 231–262. 151. Kuyukina, M.S. Rhodococcus biosurfactants: biosynthesis, properties and potential applications / M.S. Kuyukina, I.B. Ivshina // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010a. – P. 292–313. 152. Larkin, M.J. Biodegradation and Rhodococcus – masters of catabolic versatility / M.J. Larkin, L.A. Kulakov, C.C.R. Allen // Current Opinion Biotechnology. – 2005. – V. 16, N. 3. – P. 282–290. 119 153. Larkin, M.J. Genomes and plasmids of Rhodococcus / M.J. Larkin, L.A. Kulakov, C.C.R. Allen // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 73–90. 154. Lawrence, J.R. Application of multiple parameter imaging for the quantification of algal, bacterial and exopolymer components of microbial biofilms / J.R. Lawrence, T.R. Neu, G.D.W. Swerhone // Journal of Microbiological Methods. – 1998. – V. 32. – P. 253–261. 155. Lipase in aqueous-polar organic solvents: activity, structure, and stability / Z. Kamal [et al.] // Protein Science. – 2013. – V. 22, N. 7. – P. 904–915. 156. Li, X.-Z. Role of the multidrug efflux systems of Pseudomonas aeruginosa in organic solvent tolerance / X.-Z. Li, L. Zhang, K. Poole // Journal of Bacteriology. – 1998. – V. 180, N. 11. – P. 2987–2991. 157. Lomovskaya, O. emr, an Escherichia coli locus for multidrug resistance / O. Lomovskaya, K. Lewis // Proceedings of National Academy of Sciences. – 1992. – V. 89. – P. 8938–8942. 158. Magnetosomes and magnetite crystals produced by magnetotactic bacteria as resolved by atomic force microscopy and transmission electron microscopy / Z. Oestreicher [et al.] // Micron. – 2012. – V. 43, N. 12. – P. 1331–1335. 159. Marquez, B. Bacterial efflux systems and efflux pump inhibitors / B. Marquez // Biochimie. – 2005. – V. 87, N. 12. – P. 1137–1147. 160. Mathur, A.B. Atomic force and total internal reflection fluorescence microscopy for the study of force transmission in endothelial cells / A.B. Mathur, G.A. Truskey, W.M. Reichert // Biophysical Journal. – 2000. – V. 78. – P. 1725–1735. 161. Matsumoto, M. Isolation and characterization of the solvent-tolerant Bacillus cereus strain RI / M. Matsumoto, J.A.M. de Bont, S. Isken // Journal of Bioscience and Bioengineering. – 2002. – V. 94, N. 1. – P. 45–51. 120 162. McDonnell, G. Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance / G. McDonnell, A.D. Russell // Clinical Microbiology Reviews. – 1999. – V. 12, N. 1. – P. 147–179. 163. Measuring cell surface elasticity on enteroaggregative Escherichia coli wild type and dispersin mutant by AFM / M.A. Beckmann [et al.] // Ultramicroscopy. – 2006. – V. 106, N. 8–9. – P. 695–702. 164. Mechanisms of solvent tolerance in gram-negative bacteria / J.L. Ramos [et al.] // Annual Review of Microbiology. – 2002. – V. 56. – P. 743–768. 165. Meller, K. Atomic force microscopy and confocal laser scanning microscopy on the cytoskeleton of permeabilised and embedded cells / K. Meller, C. Theiss // Ultramicroscopy. – 2006. – V. 106. – P. 320–325. 166. Microbial transformations of diterpene acids / A.V. Vorob'ev [et al.] // Mendeleev Communications. – 2001. – V. 11, N. 2. – P. 72–73. 167. Molecular cloning and characterization of acrA and acrE genes of Escherichia coli / D. Ma [et al.] // Journal of Bacteriology. – 1993. – V. 175, N. 19. – P. 6299–6313. 168. Molecular cloning and characterization of an ABC multidrug efflux pump, VcaM, in Non-O1 Vibrio cholerae / N. Huda [et al.] // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. – 2003. – V. 47, N. 8. – P. 2413–2417. 169. Molecular determinants of bacterial adhesion monitored by atomic force microscopy / A. Razatos [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1998. – V. 95, N. 19. – P. 11059–11064. 170. Mosier, A.P. A novel microfluidic device for the in situ optical and mechanical analysis of bacterial biofilms / A.P. Mosier, A.E. Kaloyeros, N.C. Candy // Journal of Microbiological Methods. – 2012. – V. 91. – P. 198–204. 171. Multiple responses of Gram-negative bacteria to organic solvents / A. Segura [et al.] // Environmental Microbiology. – 1999. – V. 1, N. 3. – P. 191–198. 121 172. Mycobacterium sp., Rhodococcus erythropolis, and Pseudomonas putida behavior in the presence of organic solvents / C.C.C.R. de Carvalho [et al.] // Microscopy Research and Technique. – 2004. – V. 64, N. 3. – P. 215–222. 173. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain / C. Formosa [et al.] // Scientific Reports. – V. 2, N. 575. – P. 1–9. 174. Nanoscale imaging and quantification of local proteolytic activity / S. Kusick [et al.] // Journal of Cellular Physiology. – 2005. – V. 204, N. 3. – P. 767–774. 175. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy / A.E. Pelling [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2005. – V. 102, N. 18. – P. 6484–6489. 176. Nies, D.H. Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances / D.H. Nies, S. Silver // Journal of Industrial Microbiology. – 1995. – V. 14, N. 2. – P. 186–199. 177. Nishiuchi, Y. Mycolic acids from Rhodococcus, Gordonia, and Dietzia / Y. Nishiuchi, T. Baba, I. Yano // Journal of Microbiological Methods. – 2000. – V. 40, N. 1. – P. 1–9. 178. Non-UV based germicidal activity of metal-doped TiO2 coating on solid surfaces / L. Li-fen [et al.] // Journal of Environmental Sciences. – 2007. – V. 19, N. 6. – P. 745–750. 179. Novel combination of atomic force microscopy and epifluorescence microscopy for visualization of leaching bacteria on pyrite / S. Mangold [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. – 2008. – V. 74, N. 2. – P. 410–415. 180. Oil desorption from mineral and organic materials using biosurfactatnt complexes produced by Rhodococcus species / I.B. Ivshina [et al.] // World Journal of Microbiology and Biotechnology. – 1998. – V. 14. – P. 711–717. 181. On the organic solvent and thermostability of the biocatalytic redox system of Rhodococcus ruber DSM 44541 / W. Stampfer [et al.] // Biotechnology and Bioengineering. – 2003. – V. 81, N. 7. – P. 865–869. 122 182. Oral consumption of cranberry juice cocktail inhibits molecular-scale adhesion of clinical uropathogenic Escherichia coli / Y. Tao [et al.] // Journal of Medical Food. – 2011. – V. 14, N. 7–8. – P. 739–745. 183. Organization of the mycobacterial cell wall: a nanoscale view / D. Alsteens [et al.] // European Journal of Physiology. – 2008. – V. 456, N. 1. – P. 117–125. 184. Paddock, S.W. Confocal laser scanning microscopy / S.W. Paddock // Biotechniques. – 1999. – V. 27, N. 2. – P. 992–1004. 185. Park, B.-J. A correlation between the virulence and the adhesion of Listeria monocytogenes to silicon nitride: An atomic force microscopy study / B.-J. Park, T. Haines, N.I. Abu-Lail // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. – 2009. – V. 73. N. 2. – P. 237–243. 186. Petroleum-contaminated water treatment in a fluidized-bed bioreactor with immobilized Rhodococcus cells / M.S. Kuyukina [et al.] // International Biodeterioration and Biodegradation. – 2009a. – V. 63. – P. 427–432. 187. Phenothiazines and thioxanthenes inhibit multidrug efflux pump activity in Staphylococcus aureus / G.W. Kaatz [et al.] // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. – 2003. – V. 47, N. 2. – P. 719–726. 188. Piddock, L.J.V. Multidrug-resistance efflux pumps – not just for resistance / L.J.V. Piddock // Nature Reviews Microbiology. – 2006. – V. 4, N. 8. – P. 629–636. 189. Polland, D.J. Biocatalysis for pharmaceutical intermediates: the future is now / D.J. Polland, J.M. Woodley // Trends in Biotechnology. – 2007. – V. 25, N. 2. – P. 66–73. 190. Probing cellular microenvironments and tissue remodeling by atomic force microscopy / T. Ludwig [et al.] // Pflügers Archiv. – 2008. – V. 456, N. 1. – P. 29-49. 191. Protocols for the characterization of solvent tolerant microorganisms: construction and characterization of mutants / E. Duque [et al.] // Handbook 123 of Hydrocarbon and Lipid Microbiology / Ed. K.N. Timmis. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 3957–3967. 192. Proton motive force-driven and ATP-dependent drug extrusion systems in multidrug-resistant Lactococcus lactis / H. Bolhuis [et al.] // Journal of Bacteriology. – 1994. – V. 176, N. 22. – P. 6957–6964. 193. Prpich, G.P. Solvent selection for enhanced bioproduction of 3-methylcatechol in a two-phase partitioning bioreactor / G.P. Prpich, A.J. Daugulis // Biotechnology and Bioengineering. – 2007. – V. 97, N. 3. – P. 536–543. 194. Pseudomonas aeruginosa biofilm inactivation: decreased cell culturability, adhesiveness to surfaces, and biofilm thickness upon high-pressure nonthermal plasma treatment / A.J. Zelaya [et al.] // IEEE Transactions on Plasma Science – 2010. – V. 38, N. 12. – P. 3398–3403. 195. Quantitative characterization of the influence of the nanoscale morphology of nanostructured surfaces on bacterial adhesion and biofilm formation / A.V. Singh [et al.] // PLoS One. – 2011. – V. 6, N. 9. – e25029. 196. Regioselective biooxidation of (+)-valencene by recombinant E. coli expressing CYP109B1 from Bacillus subtilis in a two-liquid-phase system / M. Girhard [et al.] // Microbial Cell Factories. – 2009. – V. 8. – P. 36. 197. Relations between macroscopic and microscopic adhesion of Streptococcus mitis strains to surfaces / V. Vadillo-Rodríguez [et al.] // Microbiology. – 2004a. – V. 150, N. 4. – P. 1015–1022. 198. Roberts, A.E.L. Manuka honey is bactericidal against Pseudomonas aeruginosa and results in differential expression of oprF and algD / A.E.L. Roberts, S.E. Maddocks, R.A. Cooper // Microbiology. – 2012. – V. 158. – P. 3005–3013. 199. Rhodococcus equi and its pathogenic mechanisms / J.A. Vázquez- Boland [et al.] // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 331–360. 124 200. Rossi, E.D. Role of mycobacterial efflux transporters in drug resistance: an unresolved question / E.D. Rossi, J.A. Aínsa, G. Riccardi // FEMS Microbiology Reviews. – 2006. – V. 30, N. 1. – P. 36–52. 201. Salter, G.J. Solvent selection for whole cell biotransformations in organic media / G.J. Salter, D.B. Kell // Critical Reviews in Biotechnology. – 1995. – V. 15, N. 2. – P. 139–177. 202. Sardessai, Y.N. Industrial potential of solvent tolerant bacteria / Y.N. Sardessai, S. Bhosle // Biotechnology in Progress. – 2004. – V. 20, N. 3. – P. 655–600. 203. Scaling-up of complex whole-cell bioconversions in conventional and non-conventional media / M.P.C. Marques [et al.] // Biotechnology and Bioengineering. – 2010. – V. 106, N. 4. – P. 619–626. 204. Schönherr, H. AFM to study bio/nonbio interactions / H. Schönherr // Nanotechnology in Regenerative Medicine: Methods and Protocols / Eds. M. Navarro, J.A. Planell. Springer Science+Business Media, 2012. – P. 179–192. 205. Seeger, M. Genetics of biphenyl biodegradation and co-metabolism of PCBs / M. Seeger, D.H. Pieper // Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. – 2010. – V. 26. – P. 1180–1194. 206. Seksvec, J.G. Chlorhexidine resistance in a Gram-negative bacterium isolated from an aquatic source / J.G. Sekavec, W.T. Moore, E.T. Gillock // Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/Hazardous Substances & Environmental Engineering. – 2013. – V. 48, N. 14. – P. 1829–1834. 207. Selective adsorption of hydrocarbon-oxidizing Rhodococcus cells in a column with hydrophobized poly(acrylamide) cryogel / M.S. Kuyukina [et al.] // Journal of Microbiological Methods. – 2009b. – V. 79. – P. 76–81. 208. Significant enhancement of (R)-mandelic acid production by relieving substrate inhibition of recombinant nitrilase in toluene-water biphasic system / Z.-J. Zhang [et al.] // Journal of Biotechnology. – 2011. – V. 152, N. 1–2. – P. 24–29. 125 209. Sikkema, J. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons / J. Sikkema, J.A.M. de Bont, B. Poolman // Microbiological Reviews. – 1995. – V. 59, N. 2. – P. 201–222. 210. Solvent-tolerant bacteria for biotransformations in two-phase fermentation systems / H.J. Heipieper [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2007. – V. 74, N. 5. – P. 961–973. 211. Spatially resolved force spectroscopy of bacterial surfaces using force- volume imaging / F. Gaboriaud [et al.] // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. – 2008. – V. 62, N. 2. – P. 206–213. 212. Stes, E. Phytopathogenic strategies of Rhodococcus fascians / E. Stes, M. Holsters, D. Vereecke // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 315–330. 213. Stricker, S.A. Confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in living cells / S.A. Stricker, M. Whitaker // Microscopy research and Technique. – 1999. – V. 46, N. 6. – P. 356–369. 214. Structural insights into substrate specificity and solvent tolerance in alcohol dehydrogenase ADH-‘A’ from Rhodococcus ruber DSM 44541 / M. Karabec [et al.] // Chemical Communications. – 2010. – V. 46, N. 34. – P. 6314–6316. 215. Survival of adhering staphylococci during exposure to a quaternary ammonium compound evaluated by using atomic force microscopy imaging / M. Crismaru [et al.] // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. – 2011. – V. 55, N. 11. – P. 5010–5017. 216. Target-oriented discovery of a new esterase-producing strain Enterobacter sp. ECU1107 for whole cell-catalyzed production of (2S,3R)-3-phenylglycidate as a chiral synthon of Taxol / D.-J. Zhou [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2013. – V. 97, N. 14. – P. 6293–6300. 217. The cell wall of the pathogenic bacterium Rhodococcus equi contains two channel-forming proteins with different properties / F.G. Rieβ [et al.] // Journal of Bacteriology. – 2003. – V. 185, N. 9. – P. 2952–2960. 126 218. The chemotaxis-like Che1 pathway has an indirect role in adhesive cell properties of Azospirillum brasilense / P. Siuti [et al.] // FEMS Microbiology Letters. – 2011. – V. 323, N. 2. – P. 105–112. 219. The effect of ethanol on cell properties and steroid 1-en-dehydrogenation biotransformation of Arthrobacter simplex / J. Luo [et al.] // Biotechnology and Applied Biochemistry. – 2014. – V. 61, N. 5. – P. 555–564. 220. The plasmid-encoded chloramphenicol-resistance protein of Rhodococcus fascians is homologous to the transmembrane tetracycline efflux proteins / J. Desomer [et al.] // Molecular Microbiology. – 1992. – V. 6, N. 16. – P. 2377–2385. 221. The rhodococcal cell envelope: composition, organization and biosynthesis / I. C. Sutcliffe [et al.] // Biology of Rhodococcus / Ed. H.M. Alvarez. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – P. 29–72. 222. Thiolactomycin resistance in Escherichia coli is associated with the multidrug resistance efflux pump encoded by emrAB / Journal of Bacteriology. – 1993. – V. 175, N. 12. – P. 3723–3729. 223. Timmermans, F.J. Contributed review: Review of integrated correlative light and electron microscopy / F.J. Timmermans, C. Otto // Review of Scientific Instruments. – 2015. – V. 86, N. 1. – P. 011501. 224. Transposition of the IS21-related element IS1415 in Rhodococcus erythropolis / I. Nagy [et al.] // Journal of Bacteriology. – 1997. – V. 179, N. 14. – P. 4635–4638. 225. Tyagi, A.K. Morphostructural damage in food-spoiling bacteria due to the lemon grass oil and its vapour: SEM, TEM, and AFM investigations / A.K. Tyagi, A. Malik // Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. – 2012. – V. 2012. – P. 692625. 226. Ultrastructure of a novel bacterial form located in Staphylococcus aureus in vitro and in vivo catheter-associated biofilms / D.J. Hess [et al.] // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. – 2012. – V. 60, N. 10. – P. 770–776. 127 227. Use of the two-liquid phase concept to exploit kinetically controlled multistep biocatalysis / B. Bühler [et al.] // Biotechnology and Bioengineering. – 2003. – V. 81, N. 6. – P. 683–694. 228. Utilization of hydrophobic bacterium Rhodococcus opacus B-4 as whole-cell catalyst in anhydrous organic solvents / S. Yamashita [et al.] // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2007. – V. 74, N. 4. – P. 761–767. 229. negative Vadillo-Rodríguez, V. Surface viscoelasticity of individual grambacterial cells measured using atomic force microscopy / V. Vadillo-Rodríguez, T.J. Beveridge, J.R. Dutcher // Journal of Bacteriology. – 2008. – V. 190, N. 12. – P. 4225–4232. 230. Vencá, A.C. 2012. Identification and characterisation of efflux pumps in Rhodococcus erythropolis : M.Sc. Thesis in Biotechnology, Instituto Superior Técnico da Universidade Técnica de Lisboa / Ana Carolina Ferreira Vencá. – Lisbon, 2012. – 71 p. 231. Visualizing viral protein structures in cells using genetic probes for correlated light and electron microscopy / H.D. Ou [et al.] // Methods. – 2015. – V.90. – P. 39–48. 232. Warhurst, A.M. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus / A.M. Warhurst, C.A. Fewson // Critical Reviews in Biotechnology. – 1994. – V. 14, N. 1. – P. 29–73. 233. Wei, P. Structural differences between paroxetine and femoxetine responsible for differential inhibition of Staphylococcus aureus efflux pumps / P. Wei, G.W. Kaatz, R.J. Kerns // Bioorganic and Medical Chemistry Letters. – 2004. – V. 14. – P. 3093–3097. 234. Whole-cell-based CYP153A6-catalyzed (S)-limonene hydroxylation efficiency depends on host background and profits from monoterpene uptake via AlkL / S. Cornelissen [et al.] // Biotechnology and Bioengineering. – 2013. – V. 110, N. 5. – P. 1282–1292. 128 235. Wright, C.J. The application of atomic force microscopy force measurements to the characterisation of microbial surfaces / C.J. Wright, I. Armstrong // Surface and Interface Analysis. – 2006. – V. 38. - P. 1419–1428. 236. Zaks, A. The effect of water on enzyme action in organic media / A. Zaks, A.M. Klibanov // The Journal of Biological Chemistry. – 1988. – V. 263, N. 17. – P. 8017–8021. 237. Zhang, W. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of Escherichia coli cells / W. Zhang, J. Hughes, Y. Chen // Applied and Environmental Microbiology. – 2012. – V. 78, N. 11. – P. 3905–3915. 238. Zhexue, L. Atomic force microscopy in cell biology // L. Zhexue, Z. Zhiling, P. Daiwen // Chinese Science Bulletin. – 2005. – V. 50. N. 14. – P. 1409–1414. 239. Zingaro, K.A. Dissecting the assays to assess microbial tolerance to toxic chemicals in bioprocessing / K.A. Zingaro, S.A. Nicolaou, E.T. Papoutsakis // Trends in Biotechnology. – 2013. – V. 31, N. 11. – P. 643–653.
