Романова О.С. , Гоголева Н.Е. , Немцева Н.В. , Плотников А.О.

Естественные науки
УДК 579.262
Романова О.С.1, Гоголева Н.Е.2, Немцева Н.В.3, Плотников А.О.3
1
Оренбургский государственный университет
2
Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН
3
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН
Email: [email protected]
ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И СВОЙСТВА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ БАКТЕРИЙ,
ОБРАЗУЮЩИХ АССОЦИАЦИИ С ПРОСТЕЙШИМИ
Из водоемов Оренбургской области выделено 7 культур простейших, из них бактериологи6
ческим методом получено 18 штаммов бактерий6ассоциантов. Численность бактерий6ассоци6
антов составила от 50 до 10000 КОЕ/мл. Отобранные штаммы были представлены грамположи6
тельными (61%) и грамотрицательными бактериями (39%). Методом секвенирования гена 16S
рРНК определено филогенетическое положение выделенных бактерий, которые относились к
филумам Proteobacteria, Actinobacteria и Firmicutes. Среди выделенных бактерий установлено
широкое распространение каталазной активности, антилизоцимной активности и способности
образовывать биопленки.
Ключевые слова: простейшие, бактерии6ассоцианты, каталазная активность, антилизоцим6
ная активность, биопленки.
Свободноживущие простейшие # обязатель#
ный компонент почвенных и водных экосистем,
где они достигают большого разнообразия и чис#
ленности. Несмотря на то, что бактериотрофные
простейшие широко распространены в водных
экосистемах [1] и часто выступают в роли факто#
ра, лимитирующего численность бактерий [2],
целый ряд бактериальных видов способны дли#
тельно сохраняться в ассоциациях с простейши#
ми [3]. Важнейшим практическим аспектом пер#
систенции бактерий в сообществах с простейши#
ми является резервуарное значение последних для
сохранения в природе патогенных и условно#па#
тогенных микроорганизмов. В обзоре [3] показа#
но, что в клетках свободноживущих амеб персис#
тирует как минимум 46 таксонов различных бак#
терий, 30 из которых относятся к протеобактери#
ям, из них более половины могут вызывать забо#
левания у человека. В работе [4] установлена спо#
собность уже 70 видов бактерий сохраняться внут#
ри клеток свободноживущих амеб.
Установлено, что бактерии используют раз#
личные стратегии для выживания и размноже#
ния в ассоциациях с простейшими. Первая стра#
тегия направлена на сохранение и развитие вне#
клеточной части бактериальной популяции, ис#
пользующей разные способы уклонения от фаго#
цитоза простейшими: формирование нитевидных
и удлиненных морфотипов, образование биопле#
нок, переход в некультивируемые и покоящиеся
формы, синтез и выделение протистоцидных ток#
синов [5]. Вторая стратегия основана на включе#
нии разных механизмов, защищающих фагоци#
тированные простейшими внутриклеточно лока#
лизованные бактериальные клетки от киллинга
лизосомальными ферментами и радикалами: об#
88
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
разование капсулы, предотвращение фагосомаль#
но#лизосомального слияния, инактивация лити#
ческих ферментов и кислородных радикалов, «ус#
кользание» из фагосомы в цитоплазму и др. [3], [6].
Несмотря на крайнее разнообразие протис#
тов, неизвестно, насколько выражено таксоно#
мическое разнообразие бактерий, в ассоциациях
с протистами разных таксонов. Единственные
представители протистов, хорошо изученные в
этом плане – голые лобозные амебы, в первую
очередь акантамебы [4], тогда как другие груп#
пы протистов, в частности жгутиконосцев и ин#
фузорий изучались эпизодически. Отсутствует
надежная методика, позволяющая четко диффе#
ренцировать внутриклеточных бактерий#ассо#
циантов от внеклеточной части популяции. Не#
известно, каково разнообразие функциональных
свойств, обеспечивающих выживание и размно#
жение протеобактерий в водных экосистемах, с
учетом стратегии персистенции вида (внекле#
точные или внутриклеточные механизмы). В свя#
зи с вышеизложенным, целью данной работы
стала разработка методики выделения бакте#
рий#ассоциантов простейших, а также характе#
ристика филогенетического разнообразия и фун#
кциональных свойств бактерий в ассоциациях
со свободноживущими простейшими.
Материалы и методы исследования
Материалом для работы послужили микро#
организмы # бактерии и простейшие, выделенные
из природных водоемов Оренбургской области.
Из водоемов были обследованы река Тузлукколь
(Беляевский район, Оренбургская область) # ле#
восторонний приток реки Урал, воды которого
смешиваются с родниковой водой высокой соле#
Романова О.С. и др.
Видовое разнообразие и свойства культивируемых...
ности в урочище Тузлукколь; и Ириклинское во#
дохранилище, расположенное в Гайском районе
Оренбургской области, и представляющее собой
крупнейший пресный водоем данного региона.
Выделение бактерий производилось из на#
копительных культур простейших. Чистые
культуры бактерий получали бактериологичес#
ким методом с использованием элективных
сред. Идентификация бактерий проводилась по
культуральным, морфологическим (окраска по
Граму, тест с КОН), биохимическим (оксидаза,
каталаза, окисление/ферментация глюкозы,
ферментация других углеводов, рост изолятов
на средах Эндо, Flo и Columbia agar) и генети#
ческим признакам (клонирование и секвениро#
вание гена 16S рРНК).
ДНК бактерий выделяли с использовани#
ем набора лабораторных реагентов PureGene
(Gentra). Система праймеров для типирования
микроорганизмов (табл. 1) была разработана
на основе последовательностей гена 16S рРНК
и 16S#23S межгенного спейсера [7].
Для сравнительного анализа полученных
последовательностей гена 16S с известными
сиквенсами, депонированными в GenBank, при#
меняли пакет компьютерных программ BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
У бактерий # ассоциантов простейших оп#
ределяли каталазную активность количествен#
ным методами [8]. Антилизоцимную актив#
ность микроорганизмов определяли чашечным
методом [9]. Количественную оценку способно#
сти микроорганизмов формировать биоплёнки
проводили фотометрическим методом в 96#лу#
ночных планшетах для иммуноферментного
анализа [10]. Количественным выражением сте#
пени образования биопленок служили значения
оптической плотности, измеряемые на фотомет#
ре ELx808 (BioTek, США).
Результаты и обсуждение
В результате исследования разработана
методика разделения внутриклеточных бакте#
рий # ассоциантов от внеклеточной части попу#
ляции с применением антибиотиков.
Методика включает в себя несколько этапов:
1) отбор планктонной пробы;
2) выделение чистой культуры простейших
одного морфовида путём прямого выделения
клеток микропипеткой под малым увеличени#
ем микроскопа (ув. в 200 раз) или методом се#
рийных разведений в жидкой среде (среда Пра#
та для пресноводных культур или среда Шмаль#
ца#Прата для солоноватоводных простейших).
Таблица 1. Последовательности праймеров,
используемых для типирования микроорганизмов.
Íàçâàíèå
ïðàéìåðà
Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü
1 Univ16SF1
GGCTCAGATTGAACGCTGGC
2 Univ16SF2
CTACGGGAGGCAGCAGTGG
3 Univ16SR3
GTCATCCCCACCTTCCTCC
4 Univ16SF4
CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG
5 Univ16SR4
CCTTGTTACGACTTCACCCCAG
6 Univ23SR1
CTCGGTTGATTTCTTTTCCTC
3) Подкормка выделенной чистой культу#
ры простейших бактериями Pseudomonas
fluorescens, убитыми кипячением.
4) Инкубация 2#5 суток с целью накопле#
ния численности простейших.
5) Обработка культур простейших антибио#
тиками в течение 24 ч # цефотаксим (концентра#
ция в среде # 100 мкг/мл) и гентамицин (концент#
рация в среде # 50 мкг/мл). Сочетание антибиоти#
ков в указанных концентрациях было подобрано
на основании следующих критериев: сохранение
жизнеспособности протистов; чувствительность
бактериальных культур во всех изученных план#
ктонных пробах, включая солёные; отсутствие
действия на процесс репликации ДНК; сохране#
ние структуры и свойств в водном минеральном
растворе в течение периода инкубации.
6) Отмывка от антибиотиков путем трех#
кратного центрифугирования при 1500#3000 об/
мин со сменой среды на стерильную. После пос#
леднего центрифугирования супернатант осто#
рожно удаляют, чтобы в пробирке осталось око#
ло 0,5 мл концентрированной культуры проти#
стов.
7) Высев 0,1 мл концентрированной куль#
туры простейших на Columbia agar. В процессе
испытаний данная среда показала преимуще#
ства перед средами Эндо, Плоскирева, 1,5% мясо#
пептонный агар, поскольку на ней высевается
существенно больше разных таксонов бактерий,
включая актинобактерии, альфа#, бета# и гам#
мапротеобактерии. На 1,5% мясо#пептонном
агаре преимущественно вырастают гаммапро#
теобактерии, а на средах Эндо, Плоскирева #
вибрионы и энтеробактерии, тогда как осталь#
ные таксоны регистрируются эпизодически.
Характеристика филогенетического разно#
образия бактерий в ассоциациях со свободно#
живущими простейшими
Из двух участков Ириклинского водохрани#
лища выделены две чистые культуры амебоид#
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
89
Естественные науки
ных простейших Vanella sp., из которых в резуль#
тате высева на среду "Columbia agar" получены
8 культур бактерий. 4 штамма относились к фи#
луму Actinobacteria (Microbacterium oxydans,
Microbacterium sp., Leucobacter chromiireducens,
Micrococcus luteus) и 4 # к филуму Proteobacteria
(Acidovorax sp., Agrobacterium tumefaciens,
Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas
mendocina). Численность бактерий в культурах
простейших, выделенных из водохранилища
(после обработки антибиотиками) составила
200#3250 КОЕ/мл культуры.
Из пяти участков реки Тузлукколь выделе#
но 3 чистых культуры жгутиковых простейших
(Percolomonas cosmopolitus, Flagellata sp.,
Cafeteria roenbergensis) и 2 чистых культуры
инфузорий (Cyclidium sp., Colpoda sp.). В клет#
ках жгутиконосцев и инфузорий методом высе#
ва на питательной среде "Columbia agar" выде#
лено 10 культур бактерий. 4 штамма относились
к филуму Actinobacteria (Kocuria rosea, Kocuria
sp., Microbacterium sp., Leucobacter chromiire#
ducens), 5 # к филуму Proteobacteria (Halomonas
venusta, Halomonas pacifica, Pseudomonas pseu#
doalcaligenes, Raoultella sp.) и 1 # к филуму Firmi#
cutes (Staphylococcus epidermidis). Численность
бактерий в культурах простейших, выделенных
из р. Тузлукколь (после обработки антибиоти#
ками) составила 50#10000 КОЕ/мл культуры.
Несмотря на небольшой объём полученных
данных, обращает на себя внимание, что фило#
генетическое разнообразие бактерий, персисти#
рующих в клетках простейших, достаточно вы#
соко. Наиболее частыми таксонами в культурах
простейших являются актинобактерии и про#
теобактерии, причем среди последних лидиру#
ет класс Gammaproteobacteria (Pseudomonas,
Halomonas, Raoultella). Эпизодически встреча#
ются фирмикуты (Staphylococcus epidermidis).
Встречаемость прокариотных таксонов в за#
висимости от типа водной экосистемы характе#
ризуется разным набором родов и видов. В клет#
ках простейших соленых водоемов не обнаруже#
ны представители энтеробактерий за исключени#
ем единственного штамма Raoultella sp., но выяв#
лены протеобактерии родов Halomonas и
Pseudomonas. Актинобактерии представлены ро#
дами Leucobacter, Microbacterium, Kocuria. В эко#
системе водохранилища в культурах простейших
отмечено разнообразие родов актинобактерий
Microbacterium, Leucobacter, Micrococcus, и гам#
мапротеобактерий Acidovorax, Agrobacterium,
Pseudomonas. Роды Microbacterium, Leucobacter,
Pseudomonas встречались как в пресных, так и в
соленых местообитаниях.
Характеристика функциональных свойств
бактерий в ассоциациях со свободноживущими
простейшими
Распространенность каталазной активно#
сти среди исследуемых изолятов составила
100%. Среди бактерий # ассоциантов простей#
ших реки Тузлукколь доминировали бактери#
альные штаммы со значениями каталазной ак#
тивности от 0,002 до 0,39 усл.ед. (рис. 1).
В Ириклинском водохранилище домини#
ровали штаммы со значениями каталазной ак#
тивности от 2,12 до 2,7 усл.ед., второе место по
численности занимали штаммы со значениями
признака до 3,9 усл. ед. (рис. 2). Доля штаммов с
более низкими значениями (≥ 0,28 усл. ед.) была
незначительна.
Способность микроорганизмов инактиви#
ровать лизоцим # антилизоцимная активность
была определена у всех исследуемых изолятов.
Распространенность антилизоцимной ак#
тивности среди бактерий, выделенных из про#
Рисунок 1. Распределение штаммов в зависимости
от выраженности каталазной активности среди
бактерий # ассоциантов простейших реки Тузлукколь
Рисунок 2. Распределение штаммов в зависимости
от выраженности каталазной активности среди
бактерий # ассоциантов простейших Ириклинского
водохранилища
90
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
Романова О.С. и др.
Видовое разнообразие и свойства культивируемых...
тозойно#бактериальных ассоциаций составила
1. Разработана эффективная методика раз#
100%. Выраженность АЛА была незначитель#
деления внутриклеточных бактерий # ассоци#
ной, в пределах от 1 до 2 мкг/мл и различалась
антов от внеклеточной части популяции с при#
в исследуемых группах бактерий.
менением антибиотиков.
По результатам фотометрической оценки
2. Филогенетическое разнообразие бакте#
способности образования биопленок наиболее
рий, персистирующих в клетках простейших,
активными были грамположительные бактери#
достаточно высоко. Наиболее частыми таксо#
альные штаммы филума Actinobacteria, о чем
нами в культурах простейших являются акти#
свидетельствуют средние значения оптической
нобактерии и протеобактерии.
плотности OD630 (более 0,14 ед. ОП). Менее
3. Среди бактерий, выделенных из прото#
интенсивно формировали биопленки штаммы,
зойно#бактериальных ассоциаций, широко рас#
принадлежащие филуму Proteobacteria (менее
пространены каталазная активность, антили#
0,14 ед. ОП). У филума Firmicutes, а именно #
зоцимная активность и биопленкообразование,
единственного штамма S. epidermidis, была от#
что отражает комплексную стратегию персис#
мечена слабая способность к образованию био#
тенции изученных видов бактерий в сообще#
пленок, равная 0,026 ед. ОП.
ствах с простейшими (сочетание внеклеточных
Таким образом, можно сделать следующие
и внутриклеточных механизмов персистенции).
выводы:
01.10.2014
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 14#04#01796, программы
фундаментальных исследований Президиума РАН "Живая природа: современное состояние
и проблемы развития" проект № 12#П#4#1039, гранта Оренбургской области в сфере научной
и научно#технической деятельности (соглашение №38 от 30.06.2014)
Список литературы:
1. Porter K. G., Sherr E. B., Sherr B. F., Pace M., Sanders R. W. Protozoa in planktonic food webs // Journal of Protozooloogy. #
1985. # V. 32. # P. 409#415.
2. Pernthaler J. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications (review) // Nature reviews. Microbiology.
# V. 3. # P. 537# 546.
3. Greub G., Raoult D. Microorganisms Resistant to Free#Living Amoebae // Clinical Microbiology Reviews. # 2004. # V. 17(2).
# P. 413#433.
4. Thomas V., Loret J.#F., Jousset M., Greub G. Biodiversity of amoebae and amoebae#resisting bacteria in a drinking water
treatment plant // Environmental Microbiology. # 2008. # V. 10(10). # P. 2728#2745.
5. Corno G., Jurgens K. Structural and functional patterns of bacterial communities in response to protist predation along an
experimental productivity gradient // Environmental Microbiology. # 2008. # V. 10(10). # P. 2857#2871.
6. Snelling W. J., Moore J. E., McKenna J. P., Lecky D. M., Dooley J. S. G. Bacterial#protozoa interactions; an update on the role
these phenomena play towards human illness (review) // Microbes and Infection. # 2006. # V. 8. # P. 578#587.
7. Kryuchkova Y. V., Burygin G. L., Gogoleva N. E., Gogolev Y. V., Chernyshova M. P., Makarov O. E., Fedorov E. E., Turkovskaya
O. V. Isolation and characterization of a glyphosate#degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7 // Microbiological
Research. # 2014. # V. 169. # P. 99#105.
8. Бухарин О. В., Черкасов С. В., Сгибнев А. В., Забирова Т. М., Иванов Ю. Б. Влияние микробных метаболитов на
активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 Р // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. # 2000.
# Т. 130. # № 7. # С. 80#82.
9. Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я., Малышкин А. Н., Немцева Н. В. Метод определения антилизоцимной активности микро#
организмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. # 1984. # № 2. # С. 27#28.
10. O'Toole G. F., Kaplan H. B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Annual Review of Microbiology. # 2000.
# V. 54 # С. 49#79.
Сведения об авторах:
Романова Оксана Сергеевна, студентка Оренбургского государственного университета,
e#mail: rksuy#[email protected]
Гоголева Наталья Евгеньевна, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии
Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН, кандидат биологических наук,
e#mail: [email protected]
Немцева Наталия Вячеславовна, заведующая лабораторией водной микробиологии Института
клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, доктор медицинских наук, профессор,
e#mail: [email protected]
Плотников Андрей Олегович, заведующий центром коллективного пользования научным
оборудованием "Персистенция микроорганизмов" Института клеточного и внутриклеточного
симбиоза УрО РАН, кандидат медицинских наук, доцент, 03.00.07, e#mail: [email protected]
460000 г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел.: (3532) 775417
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
91