Занятие. Иммунограмма в клинической практике Организация

1
Занятие. Иммунограмма в клинической практике
Организация иммунологической лаборатории.
Показания к назначению иммунологического обследования.
Иммунодиагностика нарушений фагоцитоза, клеточного звена иммунитета, синтеза
иммуноглобулинов.
Цель иммунодиагностики – идентификация нарушенного звена иммунной системы, от
которого зависит развитие данного заболевания.
Иммунограмма – набор тестов, позволяющих оценить различные звенья иммунной
системы.
Выделяют четыре группы заболеваний иммунной системы, при которых показано
иммунологическое обследование:
 иммунодефициты;
 аутоиммунные заболевания;
 аллергические заболевания;
 лимфопролиферативные заболевания.
Наибольшее значение иммунодиагностика имеет при иммунодефицитах, которые
подразделяют на первичные и вторичные.
Первичные иммунодефициты возникают при наличии в организме генетического
дефекта. В соответствии с критериями ВОЗ к настораживающим признакам первичных
иммунодефицитов относят:
1. наличие семейного анамнеза, факты ранних смертей от тяжелых инфекций;
2. частые отиты (8 и более в течение года);
3. тяжелые синуситы (2 и более в течение года);
4. пневмонии не менее 2 раз в год;
5. длительное применение антибиотиков (в течение 2-х месяцев и более за год);
6. осложнения при вакцинации живыми вакцинами;
7. отставание в росте и развитии грудного ребенка;
8. рецидивирующие глубокие абсцессы кожи или внутренних органов;
9. не менее двух тяжелых инфекций в год (менингит, остеомиелит, сепсис);
10. персистирующий кандидоз кожи и слизистых а течение 1 года;
11. гастроэнтерологические расстройства в раннем детском возрасте;
12. рецидивирующие системные инфекции, вызванные атипичными микобактериями.
Вторичные иммунодефициты делят на приобретенные (ВИЧ) и индуцированные.
Вторичные иммунодефициты развиваются у детей и взрослых с исходно нормальной
иммунной системой на фоне иммуносупрессивных воздействий:
 применение иммунодепрессантов, кортикостероидов, моноклональных антител;
 болезни обмена: уремия, сахарный диабет, гиповитаминозы, гипотрофия,
нефротический синдром;
 хирургическая патология: спленэктомия, ожоги, анестезия;
 инфекции: ВИЧ, инфекционный мононуклеоз, врожденная краснуха, ЦМВИ, тяжелые
бактериальные инфекции,
 прочие причины: СКВ, хронический
гепатит, цирроз печени, прием
противосудорожных препаратов.
Подозрение на
вторичные иммунодефициты возникает при наличии у пациента
хронических или рецидивирующих инфекций бронхолегочной системы, придаточных пазух носа,
ЖКТ, кожи, мягких тканей, нередко вызванных условно-патогенными микроорганизмами.
В соответствии с российскими рекомендациями (Р.В. Петров, Б.В. Пинегин, 1984, 2014 гг)
все методы иммунодиагностики разделены на тесты I и II уровня. Тесты I уровня направлены на
идентификацию грубых дефектов иммунной системы и позволяют осуществить диагностику
основных первичных иммунодефицитов. Тесты II предназначены для углубленного изучения
функционального состояния иммунной системы и применяются для выявления причин вторичной
иммунной недостаточности. При этом их объем для каждого конкретного случая должен быть
строго индивидуален.
2
Иммунодиагностика нарушений фагоцитоза
Фагоцитоз – комплекс клеточных реакций, направленных на распознавание, поглощение и
элиминацию из организма корпускулярных частиц размером более 0,5 мкм. Процесс фагоцитоза
состоит из следующих стадий: хемотаксис, адгезия, поглощение, киллинг и переваривание
объекта.
Тесты I уровня
Стадия поглощения
Поглотительная активность (фагоцитарное число – ФЧ). Метод исследования:
микроскопический. Выявляет процент нейтрофилов, способных поглощать корпускулярные
антигены (дрожжи, латекс, культура стафилококка). Поглотительная активность нарушается реже,
чем другие функции фагоцитирующих клеток. Норма (объект фагоцитоза – дрожжи): 60-90%.
Поглотительная активность снижена – миелопролиферативные заболевания, тяжелые
инфекции, сепсис, перитонит/
Стадия переваривания (завершенность фагоцитоза)
Методы исследования: микроскопический, проточная цитометрия. Микроскопический
метод основан на подсчете количества живых и мертвых микробных клеток в 100 нейтрофилах и
вычислении индекса бактерицидности (ФИ=Чубитых/Чживых). Метод проточной цитометрии
включает автоматизированную регистрацию количества живых и мертвых микробных клеток до и
после их взаимодействия с нейтрофилами. Норма (микроскопический метод): 60-70%.
Переваривающая активность снижена – рецидивирующие бактериальные инфекции;
вялотекущие гнойно-воспалительные процессы; длительно не заживающие раны; миелолейкозы,
сахарный диабет, уремия, ожоги, полостные операции, иммуносупрессивная терапия.
Бактерицидная активность (киллинг)
Антимикробные факторы нейтрофилов делятся на кислородзависимые и кислороднезависимые.
Методы
исследования
кислородзависимых
факторов:
НСТ-тест,
хемилюминесценция.
НСТ-тест спонтанный (тест восстановления нитросинего тетрозолия) основан на
способности частиц нитросинего тетразолия, поглощенных нейтрофилом, менять окраску под
действием активных форм кислорода. Тест выявляет процент нейтрофилов с активными формами
кислорода. Метод исследования: микроскопический. Норма: 4-10%.
НСТ-тест повышен – острые бактериальные инфекции (в начальном периоде),
генерализация очаговых воспалительных процессов, туберкулез легких, хронические гепатиты,
ревматизм, ревматоидный артрит.
НСТ-тест снижен – хронизация воспалительного процесса, злокачественные
новообразования, тяжелые ожоги, травмы, стресс, недостаточность питания, лечение
цитостатиками и иммунодепрессантами.
НСТ-тест отрицателен – врожденный дефект фагоцитоза (хроническая гранулематозная
болезнь).
НСТ-тест стимулированный (фагоцитарный резерв) отражает потенциальную
способность нейтрофилов продуцировать активные формы кислорода в ответ на антигенное
раздражение. Норма (фагоцитарный резерв) 2,4-3,5.
Фагоцитарный резерв снижен – гнойно-воспалительные процессы, тяжелые пиогенные
инфекции кожи; миелолейкоз, сахарный диабет, уремия, ожоги, полостные операции,
иммуносупрессивная терапия.
Иммунодиагностика нарушений клеточного звена иммунитета
Тесты I уровня. Фенотипирование лимфоцитов
Согласно рекомендациям ВОЗ оценка популяционного состава лимфоцитов имеет
диагностическое
значение
при
первичных
и
вторичных
иммунодефицитах,
лимфопролиферативных заболеваниях и ВИЧ-инфекции.
Под световым микроскопом все лимфоциты выглядят одинаково, однако их можно
отличить по антигенам клеточной поверхности, их обозначают CD-молекулами (СD1, СD2, СDЗ и
т.д. до СD130) и выявляют с помощью моноклональных антител. Набор антигенов зависит от типа
клеток и их функций. В соответствии с общепринятой в мире СD-кластерной классификацией
маркером всех Т-лимфоцитов считают CD3, маркером Т-хелперов CD4, маркером Ткиллеров/цитотоксических CD8 и т.д.
3
Метод исследования: проточная цитофлуориметрия с использованием меченых
флуорохромными
красителями
моноклональных
антител
к
специфическим
поверхностным маркерам этих клеток и последующей автоматической регистрацией.
Таблица
Численность основных субпопуляций лимфоцитов крови (нормальные значения)
Показатель
0-3 мес.
3-12 мес.
1-2 года
2-6 лет
6-16 лет
16-80 лет
%
abs *109/л
%
abs *109/л
%
55-78
2,07-6,54
41-64
1,46-5,12
16-35
45-79
2,28-6,45
36-61
1,69-4,60
16-34
53-81
1,46-5,54
31-54
1,02-3,60
16-38
62-80
1,61-4,23
35-51
0,90-2,86
22-38
66-76
1,40-2,00
33-41
0,7-1,10
27-35
55-80
0,80-2,00
31-49
0,6-1,60
12-30
abs *109/л
%
CD16+CD56+ abs *109/л
%
CD19+(CD20+) abs *109/л
0,65-2,45
2-14
0,04-0,92
19-31
0,50-1,50
0,72-2,49
2-13
0,04-0,92
19-31
0,50-1,50
0,57-2,23
3-16
0,04-0,92
19-31
0,50-1,50
0,63-1,91
4-23
0,10-1,33
21-28
0,70-1,30
0,60-0,90
4-27
0,10-0,50
12-22
0,30-0,50
0,19-0,65
6-20
0,15-0,60
5-19
0,10-0,50
1-9
1-7
3-12
3-13
3-10
0-12
CD3+
CD3+CD4+
CD3+CD8+
CD3+HLADR+ %
Т-лимфоциты (CD3)
Уровень CD3+ повышен – начальный период острого воспалительного процесса,
лимфолейкоз, обострение хронического воспалительного процесса.
Уровень CD3+ снижен – первичные и вторичные иммунодефициты с нарушением Тклеточного звена иммунитета; воспалительные заболевания, злокачественные новообразования,
состояние после травмы, операции, прием цитостатиков, гормонов, иммунодепрессантов.
Активированные Т-лимфоциты (СD25, НLA-DR)
Активационные маркеры – CD25, НLA-DR. появляются на Т-лимфоцитах, находящихся в
стадии активации и могут быть использованы для диагностики, оценки активности
иммунопатологических заболеваний, мониторинга лечения.
Уровень CD3+CD25+, CD3+НLA-DR+ повышен – активация иммунного ответа: острый или
хронический воспалительный процесс, пневмония, ВИЧ-инфекция, аутоиммунные и
онкологические заболевания. Показатели снижаются до нормы при благоприятном течении
заболевания.
Уровень CD3+CD25+, CD3+НLA-DR+ снижен – иммунодефициты с нарушением Тклеточного звена иммунитета.
Т-хелперы (CD3CD4)
Уровень CD3+CD4+ повышен – острый инфекционно-воспалительный процесс, обострение
аллергических и аутоиммунных заболеваний.
Уровень CD3+CD4+ снижен – врожденные и приобретенные иммунодефициты, ВИЧинфекция, инфекционный мононуклеоз, злокачественные новообразования, длительное лечение
цитостатиками, гормонами, иммунодепрессантами.
Т-цитотоксические (Т-киллеры) (CD3CD8)
Уровень CD3+CD8+ повышен – инфекции, вызванные внутриклеточными паразитами
(вирусы, бактерии, грибы, простейшие).
Уровень CD3+CD8+ снижен – первичные и вторичные иммунодефициты,
прогрессирующие злокачественные новообразования, лучевая терапия, длительное лечение
цитостатиками, гомонами, иммунодепрессантами.
Иммунорегуляторный индекс
При некоторых заболеваниях диагностическое и прогностическое значение имеет
соотношение CD4/CD8 или иммунологический индекс (ИРИ). Норма: 1,2-2,5.
CD4/CD8 (ИРИ) повышен –аутоиммунные заболевания, острый Т-лимфобластный лейкоз,
тимома.
4
CD4/CD8 (ИРИ) снижен – вирусные инфекции (герпес, корь вирусный гепатит,
инфекционный мононуклеоз, ВИЧ/СПИД), хронические заболевания, опухоли, множественная
миелома. Величина ИРИ менее 1 косвенно соответствует иммунодефициту.
Натуральные киллеры (НK-клетки, CD16 CD56)
НK-клетки – большие гранулярные лимфоциты,
лизирующие клетки - мишени,
инфицированные вирусами, внутриклеточными возбудителями, а также мутантные и опухолевые
клетки, без специфического распознавания, необходимого для Т-киллеров.
Уровень НK-клеток (CD3+-CD16+CD56+) повышен – острый воспалительный процесс,
бронхиальная астма, злокачественные новообразования, лейкоз.
Уровень НK-клеток (CD3-CD16+CD56+) снижен – врожденные иммунодефициты,
паразитарные инфекции, аутоиммунные заболевания, опухоли, стресс, прием цитостатиков и
кортикосероидов.
НКТ-клетки (CD3CD16CD56)
НKТ-клетки имеют рецепторы, как НK-клеток, так и Т-лимфоцитов. Осуществляют
регуляторную функцию, синтезируя цитокины.
Уровень (CD3+ CD16+ CD56+) повышен – при острых тяжелых воспалительных процессах,
онкологических заболеваниях.
Уровень (CD3+ CD16+ CD56+) снижен – при аутоиммунных заболеваниях.
В-лимфоциты (CD19,CD20)
Уровень СD19+,CD20+ повышен – бактериальные и паразитарные инфекции, ВИЧинфекция; хронический В-лимфолейкоз, аутоиммунные заболевания (СКВ, ревматоидный артрит);
бронхиальная астма.
Уровень СD19+,CD20+ снижен – гипо- и агаммаглобулинемии (врожденные и
приобретенные); лимфолейкозы, лимфомы не В-клеточного типа; спленэктомия; прием
иммунодепрессантов.
Иммунодиагностика нарушений синтеза иммуноглобулинов
Определение содержания иммуноглобулинов важно при диагностике и клиническом
мониторинге врожденных иммунодефицитов, моноклональных гаммапатий, инфекций и
аутоиммунных
заболеваний.
Методы
определения
иммуноглобулинов:
радиальная
иммунодиффузия по Манчини, нефелометрия. Уровень IgE определяют методом ИФА.
Таблица
Содержание сывороточных иммуноглобулинов у здоровых людей (г/л)
Возраст
пуповинная кровь
до 1 мес.
1-6 мес.
6-12 мес.
1-3 года
3-7 лет
7-16 лет
Взрослые
IgG
6,5-14,0
2,5-9,0
2,0-7,0
2,2-9,0
2,9-12,0
4,6-12,4
6,5-16,0
6,5-16,0
IgA
0,01-0,04
0,02-0,5
0,1-0,8
0,18-0,9
0,33-1,43
0,58-2,01
0,80-3,19
0,55-2,50
IgM
<0,25
0,2-0,8
0,25-1,0
0,35-1,50
0,55-1,76
0,64-1,76
0,63-1,72
0,60-4,05
Иммуноглобулин М (IgM) - белок глобулиновой природы, молекулярной массой 900
кДА, синтезируемый В-лимфоцитами преимущественно при первичном контакте с антигеном.
Иммуноглобулин М образуется через 3-6 дней после взаимодействия с антигеном и
осуществляет основную защиту организма при бактериемии. Не проникает через сосудистую
стенку, плацентарный барьер.
Уровень IgM повышен – ранние стадии вирусных, бактериальных или паразитарных
инфекций; внутриутробные инфекции; болезни печени (гепатит, цирроз); аутоиммунные
заболевания, миеломная болезнь; острый и хронический лимфолейкоз.
5
Уровень IgM снижен – первичные иммунодефициты с нарушением гуморального звена,
гастроэнтеропатии с потерей белка, ожоговая болезнь, множественная миелома IgG или IgA-типа,
спленэктомия, иммуносупрессивная терапия.
Иммуноглобулин G (IgG) – белок глобулиновой природы молекулярной массой 150 кДА,
синтезируемый В-лимфоцитами в ответ на антигенный стимул. При первичном инфицировании
появляется через 8-14 дней и осуществляет защиту организма от возбудителей и их токсинов. IgG
проникает через сосудистую стенку и плаценту.
Уровень IgG повышен – затяжные, хронические и рецидивирующие инфекции,
аутоиммунные заболевания (ревматоидный артрит, СКВ, болезнь Шегрена), болезни печени
(гепатиты, циррозы), злокачественные новообразования, множественная миелома IgG-типа,
доброкачественная парапротеинемия.
Уровень IgG снижен – первичные иммунодефициты с нарушением гуморального звена,
гастроэнтеропатии с потерей белка, ожоговая болезнь, нефротический синдром, множественная
миелома IgA или IgM-типа, спленэктомия, иммуносупрессивная терапия.
Иммуноглобулин А (IgA) - белок сыворотки крови и секретов слизистых оболочек с
молекулярной массой 160 кДА, синтезируемый В-лимфоцитами в ответ на антигенное
воздействие. Появляется через 15-21 день после контакта с антигеном, преобладает в выделениях
слизистых (слюна, слезная жидкость, носовой секрет, пот, бронхиальный секрет), где
обеспечивает защиту от возбудителей, пыльцевых и пищевых аллергенов.
Уровень IgA повышен – хронические инфекции органов пищеварения и дыхательных
путей, опухоли нижних отделов ЖКТ, аутоиммунные заболевания (на ранней стадии),
множественная миелома IgA-типа, болезни печени (гепатит, цирроз), остеосаркома, миеломная
болезнь, муковисцидоз.
Уровень IgA снижен – врожденные дефициты с нарушением гуморального звена,
хронические и рецидивирующие заболевания респираторного тракта, гастроэнтеропатии с потерей
белка, ожоговая болезнь, нефротический синдром, множественная миелома IgG и IgM-типа,
спленэктомия, иммуносупрессивная терапия.
Иммуноглобулин Е (IgE) – белок сыворотки крови и секретов слизистых оболочек с
молекулярной массой 200 кДА. Синтезируется В-лимфоцитами в ответ на антигены внешней
среды (домашняя пыль, пыльца растений, инфекционные агенты, пищевые продукты и т.д.) и
вызывают аллергические реакции немедленного типа.
Определение общего IgE показано при подозрении на болезнь Джоба (синдром гипер IgE),
при аллергических заболеваниях атопического генеза, паразитарных инфекциях.
Таблица
Референсные значения общего IgE в сыворотке крови
Возраст
1-3 месяца
3-6 месяцев
1 год
5 лет
15 лет
Взрослые
Концентрация кЕ/л
0-2
3-10
8-20
10-50
15-50
20-100
Уровень IgE повышен – паразитарные инфекции, бронхолегочный аспергиллез,
бронхиальная астма, поллиноз, атопический дерматит, крапивница, некоторые виды пищевой и
лекарственной аллергии, анафилаксия, отек Квинке.
Уровень IgE значительно повышен при миеломе IgE-типа, ряде первичных
иммунодефицитов (болезнь Джоба, синдром Вискотта-Олдрича, хронический гранулематоз,
селективный дефицит IgА).
Уровень IgE снижен – некоторые прогрессирующие опухоли, первичные иммунодефициты
(атаксия-телеангиоэктазия, болезнь Брутона).
6
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК)
ЦИК – это продукт взаимодействия антигена и соответствующего антитела. Образование
ЦИК – естественный процесс, направленный на нейтрализацию и удаление антигенов.
Определение ЦИК используют для прогнозирования и мониторинга активности тяжелых
инфекций, аутоиммунных заболеваний, злокачественных новообразований, синдрома эндогенной
интоксикации.
Методы исследования: осаждение полиэтеленглюколем (ПЭГ 6000) - метод недостаточно
чувствителен. Норма: 0-60 ЕД; ЦИК крупнодисперсные – k1,2; ЦИК среднедисперсные 1,2k1,5; ЦИК мелкодисперсные – k1,5.
Крупнодисперсные ЦИК легко удаляются из кровотока и редко вызывают повреждение
тканей. Среднедисперсные и мелкодисперсные ЦИК биологически активны, плохо удаляются из
кровотока, вызывают воспалительные изменений тканей.
ЦИК повышены – острые и хронические инфекции; гепатиты, циррозы; аутоиммунные
заболевания; злокачественные новообразования; сывороточная болезнь, иммунокомплексные
процессы.
Иммунодиагностика нарушений синтеза компонентов комплемента и цитокинов
Тесты I уровня
Комплемент – система сывороточных белов крови, каскадная активация которых
приводит к лизису бактерий, собственных инфицированных клеток, разрушению иммунных
комплексов. Методы исследования: реакция 50% гемолиза. Норма: 50-140 ЕД/мл.
Отдельные компоненты комплемента Методы исследования: нефелометрия. Норма: С3
– 0,5-1,2 г/л; С4 – 0,2-0,5 г/л.
Активность общего комплемента повышена – острые инфекции, чаще бактериальные,
опухоли, аутоиммунные заболевания, бактериальный эндокардит.
Активность общего комплемента снижена – тяжелые болезни печени, бактериальные и
вирусные инфекции, септические состояния, аутоиммунные заболевания, опухоли, тяжелая
травма, ожоги, иммуносупрессивная терапия.
Содержание С3 повышено – острые инфекции, опухоли, активная фаза аутоиммунных
заболеваний, сахарный диабет, тиреоидит, холестаз, желчнокаменная болезнь.
Содержание С3, снижено – наследственная недостаточность образования, тяжелые
заболевания печени, хронические инфекции, болезни ИК ( гломерулонефрит, СКВ, ревматоидный
артрит, бактериальный эндокардит), нарушение белкового питания, ДВС, грамотрицательная
бактериемия, ожоги, гастроэнтеропатии.
Содержание С4 повышено – опухоли.
Содержание С4 снижено – врожденный дефицит, СКВ, ревматоидный артрит,
гломерулонефрит, наследственный ангионевротический отек, ожоги, энтеропатии с потерями
белка, иммуносупрессивная терапия.
Тесты II уровня
Цитокины – белковые продукты активированных клеток иммунной системы.
Обуславливают межклеточные взаимодействия при иммунном ответе, воспалении, гемопоэзе.
Метод исследования: ИФА.
Клиническое значение. Определение цитокинов в секретах позволяет оценить активность
инфекционного, аллергического и аутоиммунного воспаления. Длительная продукция
провоспалительных цитокинов (ФНО, ИЛ1, ИЛ6) поддерживает хронический воспалительный
процесс, вызывая разрушение органа и разрастание соединительной ткани. Изменение активности
цитокинов в плазме крови свидетельствует о развитии системной воспалительной реакции.
Определение синтеза цитокинов отдельных семейств позволяет диагностировать нарушения
иммуногенеза, кроветворения, противоопухолевой резистентности, обмена веществ.
Таблица
Содержание цитокинов в сыворотке крови у здоровых людей (пг/мл)
ИЛ1α
0-50
ИЛ1β
0-50
ИЛ2
0
ИЛ4
0-50
ИЛ6
0-50
ИЛ8
0-50
ИЛ10
0-50
ФНО
0-5
ИФα
0-50
ИФγ Г-КСФ М-КСФ ГМ-КСФ
0-10 10-100 1800-7000 10-100
7