выделение и характеристика бактериальных эндофитов моркови

Естественные науки
УДК 579.64
Благова Д.К., Сарварова Е.Р., Хайруллин Р.М.
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа
E#mail: blagova_darya@mail.ru
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОФИТОВ
МОРКОВИ (DAUCUS CAROTA L. VAR. SATIVUS)
Эндофитные бактерии были выделены из 44 поверхностно стерилизованных корнеплодов
моркови. Двадцать пять изолятов из 63 различались по RAPDпрофилю. Из них семь обладали
антагонистической активностью в отношении грибов рода Fusarium, девять растворяли неорга
нические фосфаты и девять синтезировали ауксины от 1,59 до 15,38 мкг/мл. Восемь изолятов
принадлежали к семейству Enterobacteriaceae (род Enterobacter и Pantoea), четыре – к роду
Pseudomonas и один – к роду Bacillus.
Ключевые слова: бактериальные эндофиты, PGPB, антагонистическая активность, ауксины,
растворение фоcфатов, сидерофоры.
Введение
В последнее десятилетие особое внимание
микробиологов привлекают эндофитные бак
терии, изолируемые из поверхностно стерили
зованных (внутренних) растительных тканей.
Растущий интерес к этим микроорганизмам
связан не только с возможностью их использо
вания в растениеводстве, но и в связи с распро
странением среди них возбудителей инфекци
онных болезней человека. Согласно определе
нию Bai с соавторами [1] к эндофитам относят
ся микроорганизмы, колонизирующие внутрен
ние растительные ткани, поддерживающие
рост и развитие растений и не вызывающие у
них болезней.
Среди эндофитов обнаружено большое ко
личество штаммов, способных защищать расте
ния от фитопатогенов, а так же положительно
влиять на рост растений за счет синтеза ИУК,
АЦКдеаминазы и растворения фосфатов [2], [3].
Инокуляция растений такими бактериями вы
зывает эффекты, сопоставимые с обработкой
синтетическими стимуляторами роста, примене
нием минеральных удобрений, а также средств
химической защиты от патогенов [4], [5]. По
скольку свойства микроорганизмов, заселяющих
ткани различных растений, могут сильно отли
чаться, представляет большой интерес изучение
эндофитов, присутствующих в культурных рас
тениях с целью их возможного последующего ис
пользования в биологических удобрениях и сред
ствах защиты растений.
Целью работы являлось выделение бакте
риальных эндофитов из корнеплодов моркови,
изучение их разнообразия и выявление таких
хозяйственнополезных признаков, как антаго
нистическая активность по отношению к фито
10
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
патогенам, синтез ауксинов и сидерофоров и спо
собность растворять неорганические фосфаты.
Материалы и методы
Технически зрелые (100 дней после посева)
корнеплоды моркови сорта «Московская зимняя»
отмывали от почвы, стерилизовали в 3% раство
ре гипохлорита натрия в течение получаса, затем
промывали стерильной водой. После этого из цен
тра верхней, средней и нижней частей корнепло
да вырезали диски толщиной 2 см, выкладывали
в чашки Петри с картофельноглюкозным ага
ром и инкубировали трое суток при температуре
27оС. Всего было проанализировано 132 диска из
44 корнеплодов. Выросшие колонии изолятов сус
пендировали в стерильном растворе 0,15М NaCl
и титровали до единичных колоний, из которых
затем при помощи Chelix выделяли ДНК и про
водили RAPDPCR со случайно подобранным
праймером Lmbd (GGG CGC TG).
Фунгистатическая активность изолятов
бактерий в отношении фитопатогенных грибов
Fusarium oxysporum, F.avenaceum и
F.sporotrichioides оценивалась методом двойной
культуры [6]. Для проверки способности мик
роорганизмов синтезировать сидерофоры (низ
комолекулярные органические вещества, спо
собные образовывать стабильный комплекс с
железом), использовали среду с хромазуролом
[7]. Фосфатмобилизирующая активность про
верялась на среде Муромцева [8].
Для изучения способности микроорганиз
мов синтезировать ауксины их выращивали на
среде DYGS с добавлением 1 мг/мл D,Lтрипто
фана в течение 5 суток, после чего культуру цен
трифугировали 5 мин при 1300 об/мин, затем к
супернатанту добавляли реактив Сальковско
го. Определение уровня ауксинов в супернатан
Благова Д.К. и др.
Выделение и характеристика бактериальных эндофитов моркови...
те проводили колориметрическим методом по
калибровочной кривой, построенной с исполь
зованием растворов ИУК с концентрацией 1, 2,
3, 4, 5, 10, 15, 20 мкг/мл [9].
Для отдельных изолятов бактерий была
проведена идентификация путем секвенирова
ния фрагментов гена 16S рРНК, амплифици
рованных при помощи праймеров DlongF (со
став: CCC GGG ATC CAA GCT TAA GGA
GGT GAT CCA GCC) и DlongR (состав: CCG
AAT TCG ACA ACA GAG TTT GAT CCT GGC
TCA G) и сравнения полученных последова
тельностей нуклеотидов с гомологичными из
базы данных NCBI (blast.ncbi.nlm.nih.gov).
Результаты и обсуждение
Бактерии были обнаружены в тридцати
семи корнеплодах из сорока четырех (84%). Пос
ле инкубирования тканей растений на пита
тельной среде было выделено 63 изолята бакте
рий, 20 из нижних, 23 из средних и 20 из верх
них частей корнеплодов. Грибных эндофитов
обнаружено не было. 25 изолятов различались
по RAPDпрофилю (рис 1). Они были исполь
зованы для дальнейших экспериментов.
Таблица 1. Ингибирование роста грибов различными
бактериальными изолятами (%)
Ãðèáû
¹
èçîëÿòà F.avenaceum F. oxysporum F.sporotrichioides
5
66
–
33
8
41
–
50
11
71
–
41
14
72
14
53
20
56
23
33
21
–
28
25
23
–
23
–
Одним из ключевых хозяйственнополезных
свойств эндофитов по отношению к растениям
является их способность подавлять рост фитопа
тогенов. Семь из исследованных нами изолятов
обладали антагонистической активностью по от
ношению к грибам рода Fusarium (табл. 1). Инги
бирование роста F. avenaceum в двойной культуре
составило 4172%, F. oxysporum – 14–28%,
F. sporotrichioides – 25–53%.
Синтез ауксинов, а также улучшение мине
рального питания растений повышением дос
тупности неорганических фосфатов путем их
солюбилизации в почве являются одними из
свойств, обуславливающих ростостимулирую
щую способность эндофитов. Среди исследован
ных нами изолятов девять были способны ра
створять фосфаты, причем три из них так же
синтезировали от 15,04 до 15,38 мкг/мл аукси
нов (таб.2). В дальнейшем планируется изучить
способность этих микроорганизмов непосред
ственно влиять на рост растений.
Нами были идентифицированы отдельные
изоляты, обладающие хозяйственнополезны
ми признаками. Среди них восемь принадлежа
ли к семейству Enterobacteriaceae (род
Enterobacter и Pantoea), четыре – к роду
Pseudomonas (табл. 2). Ранее энтеробактерии,
способные стимулировать рост растений были
обнаружены в кукурузе [10] и тополе [11]. Сре
ди эндофитов с анагонистической активностью
один изолят, выделяющий сидерофоры, был
идентифицирован нами как Bacillus subtilis.
Заключение
Таким образом, среди исследованных эндо
фитов моркови нами было выявлено несколько
изолятов, обладающих хозяйственнополезны
ми признаками. Большинство из них относи
лось к семейству энтеробактерий. В дальней
Рисунок 1. Электрофоретические спектры RAPDфрагментов эндофитов моркови
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
11
Естественные науки
Таблица 2. Видовая принадлежность и характеристики отдельных эндофитов моркови
¹
èçîëÿòà
Àíòàãîíèñòè÷åñêàÿ
Ñèíòåç
Ôîñôàòìîáèëèçèðóþùàÿ Ñèíòåç àóêñèíîâ
àêòèâíîñòü
ñèäåðîôîðîâ
àêòèâíîñòü
(ìêã/ìë)
Áàêòåðèè
2
Enterobacter sp.
–
–
+
–
5
Enterobacter aerogenes
+
–
–
3,24
6
Íå îïðåäåëåí
–
–
+
15,38
8
Bacillus subtilis
+
+
–
–
11
Íå îïðåäåëåí
+
–
–
–
12
Enterobacter sp.
–
–
+
15,04
14
Enterobacter sp.
+
–
+
1,59
15
Pseudomonas sp.
–
–
+
6,44
17
Pseudomonas sp.
–
–
–
2,10
18
Enterobacter cloacae
–
–
+
–
19
Enterobacter aerogenes
–
–
+
15,17
20
Pseudomonas oryzihabitans
+
–
+
–
21
Enterobacter sp.
+
–
–
–
23
Pantoea sp.
+
–
+
7,16
26
Pseudomonas sp.
–
–
–
1,94
шем планируется изучение непосредственного
влияния данных микроорганизмов на рост и
устойчивость растений к болезням.
17.09.2014
Работа выполнена на основе ФЦП №14.604.21.0016
Список литературы:
1. Bai Y., Zhou X., Smith D.L. Enhanced soybean plant growth resulting from co inoculation of Bacillus strains with Bradyrhizobium
japonicum. Crop science. 2003. 43 (5): 17741781.
2. Mitter B, Brader G., Afzal M. et al. Advances in elucidating beneficial interactions between plants, soil and bacteria. Adv Agron.
2013. 121: 381–445.
3. Dudeja S. S., Giri R. Beneficial properties, colonization, establishment and molecular diversity of endophytic bacteria in legumes
and non legumes. African Journal of Microbiology Research. 2014. 8(15): 15621572.
4. Adesemoye A.O., Torbert H.A., Kloepper J.W. Plant growthpromoting rhizobacteria allow reduced application rates of chemical
fertilizers. Microbial Ecology. 2009. 58 (4):921929.
5. Sundaramoorthy S., Balabaskar P. Consortial effect of endophytic and plant growth promoting rhizobacteria for the management
of early blight of tomato incited by Alternaria Solani. J Plant Pathol Microb. 2012. 3 (145): 14.
6. Whipps J.M. Effect of media on growth and interactions between a range of soilborne glasshouse pathogens and antagonistic
fungi. New Phytologyst. 1987. 107: 127142.
7. Schwyn B., Neilands J.B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical biochemistry.
1987. 160 (1): 4756.
8. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии. М.: Колос, 1983. 162 с.
9. Yasmin F., Othman, R., Sijam K., Saad M. S. Characterization of beneficial properties of plant growthpromoting rhizobacteria
isolated from sweet potato rhizosphere. African Journal of Microbiology Research. 2010. 3 (11): 815821.
10. Ogbo F., Okonkwo J. Some Characteristics of a Plant Growth Promoting Enterobacter sp. Isolated from the Roots of Maize.
Advances in Microbiology. 2012. 2 (3): 368374
11. Taghavi S. et al. Genome sequence of the plant growth promoting endophytic bacterium Enterobacter sp. 638. PLoS genetics.
2010. 6 (5): e1000943.
Сведения об авторах:
Благова Дарья Константиновна, научный сотрудник лаборатории биохимии иммунитета растений
Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук,
кандидат биологических наук, еmail: blagova_darya@mail.ru
Сарварова Елена Рафисовна, аспирант лаборатории биохимии иммунитета растений
Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук,
еmail: sarvarova_lena@mail.ru
Хайруллин Рамиль Магзинурович, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии иммунитета
растений Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук,
доктор биологических наук, профессор, еmail: krm62@mail.ru
450054, г. Уфа, пр. Октября, 71
12
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014