Применение зародышевого теста для анализа жизнеспособных

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН
2013, том 56, №8
ЦИТОЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 576.3:631.52
М.Н.Негматов, С.В.Рыжов,
член-корреспондент АН Республики Таджикистан Х.А.Абдуллаев*
ПРИМЕНЕНИЕ ЗАРОДЫШЕВОГО ТЕСТА ДЛЯ АНАЛИЗА
ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ И НЕЖИЗНЕСПОСОБНЫХ СЕМЯПОЧЕК В ЗАВЯЗЯХ
ЦВЕТКА ХЛОПЧАТНИКА
Худжандский научный центр АН Республики Таджикистан,
*Институт ботаники, физиологии и генетики растений АН Республики Таджикистан
В статье приводятся результаты сравнительного анализа числа и уровня жизнеспособности семяпочек в завязях цветка четырёх видов хлопчатника G.herbaceum L., G.arboreum L.,
G.hirsutum L., G.barbadense L., различающихся по уровню плоидности генома. Установлено, что эти
виды хлопчатника статистически достоверно отличаются друг от друга по количеству семяпочек
в завязях цветка при числе степеней свободы n'=(n1+n2)-2=198 и уровне значимости P=0.01. Впервые
с использованием метода давленных препаратов и специального способа окрашивания получен оригинальный снимок – процесс вхождения пыльцевой трубки в зародышевый мешок фертильной семяпочки. Разработан зародышевый тест для выявления фертильных и стерильных семяпочек по степени развития зародышевого мешка. С помощью этого теста проведён скрининг жизнеспособных и
нежизнеспособных семяпочек в завязях цветка разных генотипов хлопчатника. Выявлено, что исследованные виды и сорта хлопчатника в процентном отношении содержат почти одинаковое число
жизнеспособных и нежизнеспособных семяпочек в завязях цветка.
Ключевые слова: хлопчатник – диплоидные (Gossypium herbaceum L., Gossypium arboreum L.) и аллотетраплоидные (амфидиплоидные) (Gossypium hirsutum L., Gossypium barbadense L.) виды – семяпочка стерильная и фертильная.
Величина и качество урожая растений в значительной степени зависят от двух важнейших
биологических процессов – опыления цветка и оплодотворения семяпочки. В свою очередь успешное
прохождение этих процессов строго зависит от уровня жизнеспособности пыльцы и семяпочки. Число семяпочек в завязях цветка и уровень их жизнеспособности являются показателями самофертильности и семенной продуктивности сортов хлопчатника.
Обычно при выведении новых высокопродуктивных сортов селекционеры мало обращают
внимание или вообще не учитывают жизнеспособность семяпочек. Это, возможно, связано с тем, что
до сих пор для практической селекции не разработаны и не рекомендованы достаточно удобные и
простые методы анализа степень жизнеспособности семяпочек. Существующие цитоэмбриологические и анатомические методы анализа с приготовлением поперечных срезов (разрезов) являются
Адрес для корреспонденции: Негматов Мирзонаби Негматович. 735777, Республика Таджикистан, Худжанд,
Северо-Восточная промзона. Худжандский научный центр АН РТ. E-mail:mirzonabinegmatov47@mail.ru
649
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2013, том 56, №8
слишком трудоёмкими, требующими больших затрат времени, сил и энергии и создают много трудностей при проведении серийных анализов и измерений, необходимых для получения статистически
достоверных результатов.
В этой связи мы поставили цель - разработать удобную методику для фенетического анализа
жизнеспособных и нежизнеспособных семяпочек и провести их количественный анализ в завязях
цветка некоторых видов и сортов хлопчатника.
Объекты и методы исследований
В качестве экспериментального материала были использованы аллотетраплоидные G.
hirsutum L. (сорт Ташкент-1), G. barbadense L. (сорт 9906-И) и диплоидные G. arboreum L. (форма
02906), G. herbaceum L. (сорт 2929) виды хлопчатника.
Растения для опытов выращивали в одинаковых условиях согласно агрорекомендациям по
возделыванию сельскохозяйственных культур в Таджикистане [1].
Подсчёт числа семяпочек в завязях цветков проводили по методике И.Д.Романова [2].
Для подсчёта семяпочек с растений каждого исследуемого генотипа срезали по 100 цветков
на следующий день после цветения и обнажали их завязь от всех покровов и тычиночной колонки.
Затем с помощью бритвы осторожно производили вскрытие гнёзд завязей цветка так, чтобы были
видны семяпочки и плаценты, на которых они сидят. Подсчёт числа семяпочек проводили с помощью
бинокулярной лупы и препаровальной иглы.
Для определения уровня жизнеспособности семяпочек у исследуемых сортов через каждые
сутки после опыления (в течение четырёх суток) срезали по 25 цветков и помещали в фиксатор Карнуа (3:1) на 24 ч.
Таким образом, для каждого исследуемого генотипа генеральная совокупность составляла по
100 цветков. Экспериментальный материал после фиксации хранили в 96%-ном этиловом спирте.
Для приготовления давленных препаратов фиксированный материал мацерировали в концентрированном растворе NaOH и окрашивали в растворе флюорохрома (анилиновый синий) по методике Л.И.Орёл, Л.Н.Константиновой и других [3]. Приготовленный препарат просматривали под люминисцентным микроскопом LABOVAL-2a-fl (Карл Цейсс, Йена, Германия). Семяпочки, пыльцевые
трубки и зародышевые мешки легко идентифицируются благодаря люминисценции анилинового
синего в УФ-лучах (рис.1).
Статистический анализ полученных данных проводили по Б.А.Доспехову [4].
В таблице приведены среднеарифметические величины и стандартные ошибки 100 определений из 100 биологических повторностей.
Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента при числе степеней свободы
n'=(n1+n2)-2=198 и уровне значимости P=0.01.
650
Цитоэмбриология
М.Н.Негматов, С.В.Рыжов, Х.А.Абдуллаев
Рис.1. Семяпочки, изолированные путём мацерации завязей цветка хлопчатника.
Обозначения: ЗМ – зародышевый мешок, ПТ – пыльцевая трубка, дошедшая до зародышевого мешка,
Н – нуцеллус (основная часть семяпочки), Г – гипостаза (клеточное образование, имеющее вид шапочки или
шляпки). (Микрофотография С.В.Рыжова).
Результаты и обсуждение
Результаты подсчёта числа семяпочек в завязях цветка и их фенетический анализ у четырёх
видов хлопчатника с различным уровнем плоидности генома представлены в таблице и на рис.1 и 2.
Как видно из таблицы, исследованные генотипы хлопчатника сильно отличаются между собой по
количеству семяпочек в завязях цветка. Так, среднее число семяпочек в завязях цветка средневолокнистого сорта Ташкент-1 аллотетраплоидного вида G.hirsutum L. (4n=52) равно 36 шт., а у другого
аллотетраплоидного вида хлопчатника G. barbadense L. (4n=52) сорта 9906-И в каждой завязи цветка
в среднем содержится по 23 семяпочки. Число семяпочек в завязях цветков диплоидных видов хлопчатника G.arboreum L. и G.herbaceum L. (2n=26) было в 1.5 раза меньше и соответственно составило
22 и 21 шт.
Сравнительный анализ данных, представленных в таблице, показал, что по числу семяпочек в
завязях цветка исследованные виды и сорта хлопчатника достоверно отличаются друг от друга при
уровне значимости P=0.01, за исключением диплоидного вида G.arboreum L. и аллотетраплоидного
(амфидиплоидного) вида G. barbadense L., между которыми по этому показателю нет достоверных
различий (таблица).
651
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2013, том 56, №8
Таблица
Число семяпочек в завязях цветка у различных видов и сортов хлопчатника
Виды и сорта
Уровень плоидности генома
Среднее число
семяпочек в завязях цветков
Из них
жизнеспособных
нежизнеспособных
(%)
(%)
G.herbaceum L.,
2n
21.10±0.33
89.54
сорт 2929
G.arboreum L.,
2n
22.79±0.31*
88.16
форма 02906
G.barbadense L.,
4n
23.33±0.26*
91.26
сорт 9906-И
G. hirsutum L.,
4n
38.68±0.49
90.33
сорт Ташкент-1
Примечание: * – различие между этими видами и сортами при P=0.01 не достоверно.
10.46
11.84
8.74
9.67
Из работ по экспериментальной полиплоидии известно, что при повышении уровня плоидности генома увеличивается величина цветков и элементов структуры цветка, размеры и массы плодов,
семян и т.д. [5].
В связи с этим возникает естественный вопрос: почему полученные нами данные по числу
семяпочек в завязях цветка аллотетраплоидного сорта 9906-И не вписываются в это правило? С чем
это связано?
Возможно, это связано с наличием завязей с разным количеством гнёзд или формированием
разного количества семяпочек внутри гнёзд и.т.д.
Обычно диплоидные виды хлопчатника G.arboreum L., G.herbaceum L. и аллотетраплоидный
вид G.barbadense L. в большинстве случаев имеют завязи трёхгнёздные, а для амфидиплоидного вида
G.hirsutum L. характерны четырёх- и пятигнёздные завязи.
Результаты наших исследований показали, что у средневолокнистого хлопчатника сорта
Ташкент-1 свыше 60% завязей цветка являются четырёхгнёздными, и около 40% - пятигнёздными и в
каждом гнезде завязи данного сорта могут формироваться от 6 до 12 шт. семяпочек.
Свыше 90% завязей аллотетраплоидного сорта 9906-И являются трёхгнёздными и около 810% - четырёхгнёздными. При этом в каждом гнезде завязей может формироваться от 5 до 8 шт. семяпочек.
Результаты фенетического анализа фертильных и стерильных семяпочек в завязях цветка
средневолокнистого и тонковолокнистого хлопчатника представлены на рис. 2А-Г.
Как видно из рис.1 и рис.2А-Г, в большинстве случаев семяпочка у исследованных нами видов и сортов хлопчатника яйцевидной формы, с тупым и заостренным концом (тупой конец халазальная, а заостренный – микропилярная часть семяпочки). Анализ макроструктуры семяпочки показал, что в день раскрытия и опыления цветка основную часть семяпочки занимает нуцеллус (H), покрытый двумя интегументами – наружным и внутренним. В центре нуцеллуса расположен крупный,
вполне сформировавшийся зародышевый мешок (ЗМ), который имеет длину около 0.6-0.7 мм. Он
расширен в верхней части, обращённой к микропиле. Антиподиальную часть зародышевого мешка
закрывает гипостаза (Г).
652
Цитоэмбриология
М.Н.Негматов, С.В.Рыжов, Х.А.Абдуллаев
Клетки гипостазы с утолщёнными и одревесневшими стенками не имеют внутреннего содержимого, они объединены в группу клеток, имеющих вид шапочки или шляпки, как у ацетабулярии
или гриба.
А
В
Рис.2. Семяпочки видов хлопчатника G.hirsutum L. (А – фертильная, Б – стерильная), G.barbadense L. (В – фертильная, Г – стерильная). Обозначения: ЗМ – зародышевый мешок, РЗМ – редуцированный зародышевый мешок, ПТ - пыльцевая трубка, дошедшая до зародышевого мешка, Н – нуцеллус (основная часть семяпочки), Г –
гипостаза (клеточное образование, имеющее вид шапочки или шляпки). (Микрофотографии С.В.Рыжова).
653
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2013, том 56, №8
На рис. 2А виден процесс врастания и вхождения пыльцевой трубки в микропилярную часть
семяпочки, а из рис.2В очень хорошо видно, как светлоокрашенная пыльцевая трубка вместе со
спермиями входит в зародышевый мешок фертильной, готовой к оплодотворению семяпочки. Такой
оригинальный снимок получен впервые нами. В известных нам научных публикациях по хлопчатнику [6-9], где детально описаны процессы опыления цветка и оплодотворения семяпочки такую картину обнаружить не удалось. До сих пор многие исследователи в своих цитоэмбриологических экспериментах наблюдали лишь пыльцевые трубки, соприкасающиеся с семяпочками, а истинную картину
вхождения пыльцевых трубок в микропиле и в зародышевый мешок – нет, поэтому в своих работах
они давали схематический рисунок этого процесса.
Подробный анализ картины вхождении пыльцевых трубок в семяпочки показал, что у хлопчатника в каждую семяпочку, в большинстве случаев, входит только одна единственная пыльцевая
трубка. Вхождение двух или трёх пыльцевых трубок в одну семяпочку (явление полиспермии) наблюдается лишь в относительно редких случаях. По данным Л.Г.Арутюновой и Г.Я.Губанова [10],
число семяпочек с двумя или тремя пыльцевыми трубками при внутрисортовом переопылении составляет всего 5% от общего количества семяпочек. Doak [11] в своей работе также приводит аналогичные данные – 5-6%. В.А.Руми и Н.А.Власова [12] при исследовании статистически нагруженного
большого объёма экспериментального материала сообщают, что эти случаи наблюдаются значительно реже – всего лишь до 0.86% при внутрисортовом опылении. В наших опытах, в популяциях семяпочек каждой завязи, также было обнаружено определённое количество семяпочек с двумя и тремя
пыльцевыми трубками.
На рис.2Б и 2Г представлены микрофотографии стерильных семяпочек сортов средневолокнистого и тонковолокнистого хлопчатника. Как видно из этих данных, в стерильных семяпочках,
хотя хорошо развит нуцеллус, однако в них либо вообще отсутствует зародышевый мешок (рис. 2Г),
либо имеется зародышевый мешок редуцированный (РЗМ) (рис. 2Б). Это, возможно, связано с тем,
что редукционное деление при макроспорогенезе происходило неправильно, в результате чего получаются тетрады макроспор, которые в дальнейшем не способны развиваться в зародышевый мешок.
Следует отметить, что при формировании стерильных семяпочек наблюдается странное селективное (избирательное) поведение пыльцевых трубок. В подавляющем большинстве случаев ни
одна пыльцевая трубка не приближается и не входит в микропиле таких стерильных семяпочек, где
отсутствует зародышевый мешок. Пыльцевые трубки входят только в те семяпочки, в которых образовался и развился зародышевой мешок. Вероятно, зародышевой мешок каким-то образом определяет
возможность нахождения пыльцевыми трубками входа в семяпочку путём выделения через микропиле особых химических веществ типа феромонов (может быть специфического «женского» белка, фитогормонов или ферментов) или посредством передачи сигналов и импульсов раздражения.
Таким образом, результаты наших исследований показали, что на давленных препаратах завязей цветка по степени развития зародышевого мешка можно визуально и чётко различить жизнеспособные и нежизнеспособные семяпочки и проводить подсчёт их количества.
654
Цитоэмбриология
М.Н.Негматов, С.В.Рыжов, Х.А.Абдуллаев
Фенетический анализ семяпочек на давленных препаратах завязей цветков показал, что около
10% семяпочек (9.67%) у средневолокнистого сорта Ташкент-1 являются нежизнеспособными (таблица).
Из таблицы также видно, что у тонковолокнистого сорта 9906-И (G.barbadense L.) из числа
всех семяпочек около 9% (8.74%) оказались нежизнеспособными, а у двух диплоидных видов
(G.arboreum L., G.herbaceum L.) этот показатель равнялся 11.84 и 10.46% соответственно.
Эти данные свидетельствуют о том, что зародышевый тест можно использовать как экспрессметод оценки селекционного материала для скрининга генотипов на высокую семенную продуктивность на ранних этапах генеративного развития растений (в фазу цветения) и, не дожидаясь конечного результата, предварительно можно будет предсказать величину ожидаемого урожая.
Поступило 02.07.2013 г.
Л И Т Е РАТ У РА
1. Научно обоснованная система земледелия Таджикской ССР. -Душанбе: Ирфон, 1984, 498 с.
2. Романов И.Д. – Изв. АН УзССР, 1947, №1.
3. Орёл Л.И., Константинова Л.Н., Огородникова В.Ф., Вишнякова М.А. Дзюбенко Н.И. Отбор растений люцерны с высокой плодовитостью завязей. Методические указания. – Л.: ВИР им.Н.И. Вавилова, 1985, с.1-33.
4. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. – М.: Колос, 1985, 334 с.
5. Бреславец Л.Т. Полиплоидия в природе и опыте. – М.: АН СССР, 1963, 363 с.
6. Романов И.Д. Строение и развитие хлопчатника. Развитие генеративных органов хлопчатника.
Атлас. – М.-Л.: ИЗОГИЗ, 1937, с.19-27.
7. Романов И.Д. – В кн. Хлопчатник, т.III. - Ташкент: Изд-во АН УзССР, 1960, с.326-355.
8. Арутюнова Л.Г., Ибрагимов Ш.И., Автономов А.А. – Биология хлопчатника. Альбом. – М.: Колос,
1980, 80 с.
9. Энциклопедия хлопководства. В 2-х томах. т.2. – Ташкент, 1985, с.235.
10. Арутюнова Л.Г., Губанов Г.Я. – Агробиология. 1950, №3, с.53-55.
11. Doak C.C. – Amer.J.Bot., 1937, v.24, рp.187-194.
12. Руми А., Власова Н.А. – В сб.: Вопросы физиологии хлопчатника и трав//Ин-т генетики и физиологии растений АН УзССР, 1957, вып.1, с.62-73.
М.Н.Неъматов, С.В.Рыжов, Њ.А.Абдуллоев*
ИСТИФОДАИ ТЕСТИ ЉАНИНЇ БАРОИ ТАШХИСИ ТУХММУЃЉАЊОИ
ЌОБИЛИ ЊАЁТ ВА БЕЗУРЁТ ДАР ЃЎРАКИ ГУЛИ ПАХТА
Маркази илмии Хуљанд, Академияи илмњои Љумњурии Тољикистон,
*Институти
ботаника, физиология ва генетикаи растании
Академияи илмњои Љумњурии Тољикистон
Дар маќола натиљаи ташхиси теъдод ва дараљаи њаётнокии тухммуѓљањо дар ѓўраки гули
чор намуди пахта G.herbaceum L., G.arboreum L., G.hirsutum L., ва G.barbadense L., ки аз њамдигар
бо таркиб ва миќдори геномашон фарќият доранд, дода шудааст. Бори аввал бо истифодаи
655
Доклады Академии наук Республики Таджикистан
2013, том 56, №8
препаратњои тазъиќшуда ва рангкунии махсус расми нодири воридшавии гарднайча ба халтаи
љанинии тухммуѓљаи ќобили њаёт аккосї шудааст. Тести љанинї барои рўё намудани
тухммуѓљањои ќобили њаёт ва безурёт аз рўи дараљаи рушду нумўи халтаи љанинї коркард шудааст. Бо истифодаи ин тест муайян карда шудааст, ки намудњо ва навъњои омўхташудаи растании пахта дар ѓўраки гулашон теъдоди якхелаи тухммуѓљањои ќобили њаёт ва безурёт доранд.
Калимањои калидї: растании пахта – намудњои диплоидї (Gossypium herbaceum L., Gossypium
arboreum L.) ва аллотетраплоидї (амфидиплоидї) (Gossypium hirsutum L., Gossypium barbadense
L.) – тухммуѓљањои ќобили њаёт ва безурёт.
M.N.Negmatov, S.V.Rijov, Kh.A.Abdullaev*
USAGE OF THE EMBRIO TEST FOR THE ANALYSIS OF FERTILE AND
STERILE OVULES IN FLOWERS OVARY OF COTTON
Khudjand Scientific Center, Academy of Sciences of the Republic of Tajikistan,
*Institute of Botany, Plant Physiology and Genetics, Academy of Sciences of the Republic of Tajikistan
In this article the results of comparative analysis of the number and viability of the ovules in ovary
flowers of four cotton species G.herbaceum L., G. arboreum L., G.hirsutum L. and G.barbadense L., distinguish by ploidy of the genomes are given. For the first time with usage of the squash preparation and specific
coloration receive of the original photography of the entrance process of pollen tube into fertile ovules.
Key words: cotton – diploid species (Gossypium herbaceum L., Gossypium arboreum L.), allotetraploid species (Gossypium hirsutum L., Gossypium barbadense L.) – fertile and sterile ovules.
656