Семена кукурузы

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
СТБ/ПР_1
СЕМЕНА КУКУРУЗЫ
Метод определения уровня гибридности первого поколения, оценка
однородности и маркирование инбредных линий
НАСЕННЕ КУКУРУЗЫ
Вызначэнне ỳзроỳню гiбрыднастi першага пакалення, ацэнка
аднароднастi i маркiраванне iнбрэдных лiнiй
Издание официальное
Настоящий проект стандарта не подлежит применению до его утверждения
Госстандарт
Минск
СТБ/ПР_1
______________________________________________________________________________________
УДК
633.15: 631.531: 631.527.5
МКС 65. 020.20
КП 03
Ключевые слова: семена кукурузы, гибридные семена, электрофорез, простой
гибрид, двойной гибрид, трехлинейный гибрид, уровень гибридности, инбредная линия, самоопыленная линия
ОКП РБ
Предисловие
Цели, основные принципы, положения по государственному регулированию и управлению в области технического нормирования и стандартизации установлены Законом Республики Беларусь «О техническом нормировании и стандартизации»
1 РАЗРАБОТАН научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации
(БелГИСС)»
ВНЕСЕН отделом стандартизации Госстандарта Республики Беларусь
2 УТВЕРЖДЁН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ постановлением Госстандарта Республики Беларусь от
№
3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Настоящий стандарт не может быть тиражирован и распространен без разрешения Госстандарта
Республики Беларусь
Издан на русском языке
II
СТБ/ПР_1
Содержание
Введение
1 Область применения-----------------------------------------------------------------------------1
2 Нормативные ссылки---------------------------------------------------------------------------- 1
3 Термины и определения-------------------------------------------------------------------------2
4 Аппаратура, оборудование, материалы, реактивы-------------------------------------3
5 Отбор проб-------------------------------------------------------------------------------------------4
6 Подготовка к проведению анализа-----------------------------------------------------------4
7 Проведение анализа------------------------------------------------------------------------------6
8 Обработка результатов анализа--------------------------------------------------------------7
9 Требования безопасности ---------------------------------------------------------------------8
Приложение А (обязательное). Белковые типы: оценка гибридов
различного происхождения--------------------------------------------------8
Приложение Б (рекомендуемое). Доверительные интервалы-----------------------10
Приложение В (справочное). Библиография----------------------------------------------13
III
СТБ/ПР_1
Введение
В селекции и семеноводстве кукурузы особенно актуальны проблемы гибридности семян, контроля однородности и маркирование инбредных линий. На основе современного уровня знаний о белках и нуклеиновых кислотах был открыт принцип
маркирования генетических систем организма. Он основан на том, что каждый белок
– первичный, уникальный продукт экспрессии гена (наследственность организма),
который является обязательным составляющим любой клетки. Применение белковых маркеров является фактором идентификации гибридов кукурузы.
Электрофоретический анализ запасных белков (зеинов) позволяет контролировать уровень гибридности семян кукурузы, что служит повышению качества ввозимых партий при международной торговле. По органолептическим признакам семян
определить показатели гибридности не представляется возможным. По белкам, в
частности зеинам, у кукурузы гибридный спектр, благодаря кодоминантности, включает компоненты обоих родителей и если имеются родительские спектры, то это
является показателем неполноты скрещивания. Таким гибридам обычно сопутствуют семена материнской формы. Практическое использование таких семян не оправдывает прогнозов по урожаю. Поэтому для каждой партии семян необходимо проведение оценок на гибридность.
Использование белковых маркеров в настоящее время является наиболее объективным способом для установления подлинности, однородности самоопыленной
линии. Такая линия должна иметь один спектр белка. Наличие зерен с другими типами спектра свидетельствует о засорении. От скрещивания таких линий получается
высокая гетерогенность, что снижает показатель гибридности.
Однородные по спектру зеина простые гибриды дают только генетически однородные инбредные родительские линии.
За каждый процент снижения гибридности ниже приведенных показателей уменьшается закупочная цена семян. Проводимый контроль за качеством семян имеет огромное значение для повышения урожайности и окупаемости затрат на внесение
удобрений, пестицидов и других видов подкормки.
IV
СТБ/ПР_1
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
СЕМЕНА КУКУРУЗЫ
Метод определения уровня гибридности первого поколения, оценка однородности и маркирование инбредных линий
НАСЕННЕ КУКУРУЗЫ
Вызначэнне ỳзроỳню гiбрыднастi першага пакалення, ацэнка аднароднастi i
маркiраванне iнбрэдных лiнiй
Corn΄s seeds
Method for determination of hybridity΄s level of the fist generation, evaluation of homogeneity and
marking of inbred strains
Дата введения
Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения уровня гибридности
первого поколения семян кукурузы, оценку однородности и маркирование инбредных
линий по электрофоретическим спектрам зеина.
Метод основан на проведении электрофоретического анализа определения гибридности и генетического качества семян кукурузы, на идентификации гибридов и
оценке однородности самоопыленных линий кукурузы методом электрофореза зеинов.
Метод позволяет выявить отличительные белковые признаки у линий, особенно
используемых в качестве отцовских, и открывает принципиально новую возможность
в оценке гибридности семян первого поколения. Белковый спектр генотипичен, подобен «отпечаткам пальцев», служит для составления стандартных матриц электрофореграмм для линий и гибридов с указанием маркерных компонентов, необходимых в практике испытательных лабораторий.
Использование эталонных электрофореграмм позволяет объективно с высокой
точностью установить уровень гибридности семян.
Электрофоретический анализ белков является универсальным методом в семеводстве для осуществления контроля качества семян.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
СТБ 1334-2003 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарногигиенические требования к воздуху рабочей зоны
1
СТБ/ПР_1
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Классификация и
общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.19 -79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность.
Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника
для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы винтиляционные. Общие требования
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры мензурки,
колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ10652-73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N\,N\ тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б). Технические условия
ГОСТ 12036-85 Семена сельскохозяйственных культур. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 18953-73 Источники питания электрические ГСП. Общие технические условия
ГОСТ 20903-75 Кюветы прямоугольные кварцевые для спекрофотометров. Основные размеры. Технические требования
ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения.
Общие технические условия и методы испытаний
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические условия
ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 24861-2005 Шприцы медицинские инъекционные однократного применения. Основные параметры. Технические условия
ГОСТ 25046-2005 Шприцы медицинские инъекционные однократного применения. Основные параметры. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25377-82 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения.
Технические условия
ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные.
Часть 1. Общие требования
Примечание ─ При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие технических нормативных правовых актов (далее – ТНПА) в области технического
нормирования и стандартизации по каталогу, составленному по состоянию на 1 января текучего года и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году.
2
СТБ/ПР_1
Если ссылочные ТНПА заменены (изменены), то при пользовании настоящим государственным стандартом, следует руководствоваться замененными (измененными) ТНПА. Если
ссылочные ТНПА отменены без замены, то положение, в котором дана ссылка на них, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими
определениями:
3.1 гибридные семена: Семена, полученные при скрещивании генетически отличающихся растений, родительских форм гибридов.
3.2 двойной гибрид: Гибрид, получаемый при скрещивании двух простых гибридов.
3.3 инбредная линия: Генетически чистая, после длительного самоопыления
линия, гомозиготная по большинству генов и имеющая один, оригинальный тип спектра зеина, выявляемый методом электрофоретического анализа.
3.4 однородность самоопыленной линии: Содержание в анализируемой выборке идентичных семян, выраженное в процентах.
3.5 простой гибрид: Гибрид, получаемый при скрещивании двух самоопыленных
линий.
3.6 трехлинейный гибрид: Гибрид, получаемый при скрещивании простого гибрида и самоопыленной линии.
3.7 уровень гибридности: Содержание в анализируемой выборке гибридных
семян, выраженное в процентах.
3.8 электрофорез: Метод разделения белковых молекул в гелях, основанный на
разной подвижности молекул в электрическом поле.
4 Аппаратура, оборудование, материалы, реактивы
Для проведения анализа используют следующие аппаратуру, оборудование, материалы, реактивы:
4.1 Холодильник бытовой электрический (любой марки) по ГОСТ 26678.
4.2 Весы лабораторные высокого класса точности (условное обозначение (II) с
наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.
4.3 Палочки стеклянные по ТНПА.
4.4 Приспособление для измельчения зерновки (подставка для индивидуальных
зерен, металлическая трубка диаметром 15-20 мм, стальной стержень).
4.5 Кисточки для очистки частей зерновки по ТНПА.
4.6 Эксикатор по ГОСТ 25336.
4.7 Прибор для проведения вертикального гель-электрофореза (фирм «Sigma»,
«Pharmacia Biotech», «Хийу Калур» или др.);
4.8 Пробирки по ГОСТ 25336.
4.9 Цилиндры мерные на 1000 см3 по ГОСТ 1770.
4.10 Колбы мерные вместимостью 50, 100, 300, 1000, 2000 см3 по ГОСТ 1770.
4.11 Воронки по ГОСТ 25336.
4.12 Пипетки по ГОСТ 29227.
4.13 Стаканы вместимостью 25, 400 см3 по ГОСТ 25336.
4.14 Шприцы по ГОСТ 22967, ГОСТ 24861, ГОСТ 25046.
4.15 Насос водоструйный или вакуумный (любой марки) по ГОСТ 25336.
3
СТБ/ПР_1
4.16 Источник постоянного тока (должен обеспечивать постоянный ток напряжением до 500 В и силой тока до 100 мА) по ГОСТ 18953.
4.17 Вата по ТНПА.
4.18 Кюветы по ГОСТ 20903.
4.19 Кислота уксусная ледяная по ТНПА.
4.20 Кислота уксусная по ГОСТ 61, ч.д.а.
4.21 Мочевина по ТНПА, ч.д.а.
4.22 2-меркаптоэтанол по ТНПА.
4.23 Акриламид по ТНПА.
4.24 Метиленбисакриламид по ТНПА.
4.25 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
4.26 Железо сернокислое закисное по ТНПА.
4.27 Калия персульфат по ТНПА.
4.28 Глицин по ТНПА.
4.29 Кислота аскорбиновая по ТНПА, ч.д.а.
4.30 Ацетон по ГОСТ 2603.
4.31 Спирт этиловый ректификованный «Экстра» по СТБ 1334.
4.32 Кумасси бриллиантовый R-250 по ТНПА.
4.33 Калия гидроокись по ГОСТ 24363.
4.34 Тетраметилэтилендиамин по ГОСТ 10652.
4.35 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч. или ч.д.а.
4.36 Кислота трихлоруксусная по ТНПА.
4.37Термометр стеклянный лабораторный с ценой деления 0,5ºС по
ГОСТ 28498.
4.38 Баня водяная по ТНПА.
4.39 Электроплитка бытовая с закрытой спиралью и регулятором нагревания по
ГОСТ 14919.
4.40 Емкости стеклянные вместимостью 5, 10 дм3 по ТНПА.
4.41 Эталоны электрофоретических спектров зеина семян самоопылённых линий
и гибридов первого поколения.
4.42 Отвертка по ТНПА.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, оборудования с техническими характеристиками, материалов и реактивов по качеству не ниже указанных.
5 Отбор проб
5.1 Отбор проб семян кукурузы проводят в соответствии с требованиями
ГОСТ 12036.
5.2 Отбор проб, представление их на испытания осуществляется заказчиком, семенными инспекциями.
5.3 Средняя проба снабжается внутренней и внешней этикетками с указанием наименования области, района, хозяйства, культуры, гибрида (линии), репродукции,
года урожая, бригады и площади поля, номера партии, массы партии, контрольной
единицы, вида анализа и даты отбора.
5.4 Упаковка, оформление и хранение средних проб осуществляется по
ГОСТ 12036.
4
СТБ/ПР_1
5.5 Из средней пробы, поступившей в лабораторию, отбирают для анализа на
однородность самоопыленных линий или уровень гибридности без выбора 100 семян (зерновка).
6 Подготовка к проведению анализа
6.1 Приготовление растворов
6.1.1 Приготовление раствора для экстракции
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят цилиндром 700 см3 96 %-ного
спирта этилового ректификованного «Экстра», доводят объем дистилированной водой до метки и перемешивают. Температура спирта и воды при внесении должны
быть 20 ºС.
6.1.2 Приготовление раствора для растворения сухих белков
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 48,0 г мочевины, растворяют в
40 см3 дистилированной воды при интенсивном перемешивании, затем добавляют
1,2 см3 уксусной кислоты и 5 см3 2-меркаптоэтанола. Доводят объем дистилированной водой до метки и перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 20 дней.
6.1.3 Приготовление раствора акриламида концентрацией 40,0 г/ см3
В стеклянный стакан вместимостью 400 см3 помещают 120,0 г акриламида и 3,2 г
метиленбисакриламида, растворяют в 250 см3 дистиллированной воды, фильтруют
через ватный фильтр в мерную колбу вместимостью 300 см3 и доводят объем дистиллированной водой до 300 см3.
Срок хранения раствора при температуре (2 – 6) ºС - не более двух недель.
6.1.4 Приготовление инициатора полимеризации – раствора сернокислого закисного железа концентрацией 1 г/ см3
В стакан вместимостью 25 см3 помещают 10 мг сернокислого закисного железа,
добавляют 10 см3 дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Раствор готовится ежедневно перед использованием.
6.1.5 Приготовление катализатора – раствора персульфата калия концентрацией
29,6 г/ см3
В колбу вместимостью 50 см3 помещают 740 мг персульфата калия, добавляют
25 см3 дистиллированной воды и тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 5 дней.
6.1.6 Приготовление электродного буфера
В стакан вместимостью 25 см3 помещают 4 г глицина и количественно переносят
с использованием дистиллированной воды в мерную колбу вместимостью 1000 см3,
добавляют 40 см3 уксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до
1000 см3, тщательно перемешивают и количественно переносят с использованием
дистиллированной воды в емкость вместимостью 10 дм3. Объем доводят дистиллированной водой до 10 дм3.
5
СТБ/ПР_1
6.1.7 Приготовление раствора для фиксации и окрашивания пластин геля
В стакан вместимостью 25 см3 помещают 1 г кумасси бриллиантового R-250 и количественно переносят с использованием ацетона в мерную колбу вместимостью
2000 см3, объем ацетона должен быть 840 см3, добавляют 290 см3 ледяной уксусной
кислоты, 300 см3 трихлоруксусной кислоты, все тщательно перемешивают и доводят
объем дистиллированной водой до 2000 см3, тщательно перемешивают и количественно переносят с использованием дистиллированной воды в емкость вместимостью 5 дм3. Объем доводят дистиллированной водой до 5 дм3.
Раствор хранят при комнатной температуре.
6.2 Приготовление белка
6.2.1 Зерновку измельчают с помощью приспособления, состоящего из подставки
для индивидуальных зёрен, металлической трубки диаметром 15 – 20 мм и стального стержня, свободно входящего в трубку, но несколько большей длины по сравнению с длиной самой трубки. Каждую зерновку поочередно накрывают трубкой и измельчают несколькими ударами стержня. После удаления зародыша, отличающегося от остальной части зерновки более мягкой уплотненной консистенцией, шрот кисточкой переносят в пробирку вместимостью 1,5 – 3,0 см3 и заливают раствором для
экстракции (визуально придерживаясь примерного соотношения объёмов шротраствор 1:3). Залитые раствором для экстракции измельчённые зёрна оставляют на
18-20 ч, затем содержимое перемешивают и отбирают 0,1 см3 экстракта, который
высушивают в эксикаторе над гидроокисью калия или гидроокисью натрия при комнатной температуре или высушивают в естественных условиях. Высохшие белки
растворяют в 0,1 см3 раствора для растворения сухих белков.
6.2.2 Непосредственно перед нанесением, но не раньше, чем через 30 – 40 мин
после растворения, растворы белков в течение 5 мин прогревают в вытяжном шкафу
на кипящей водяной бане.
6.3 Приготовление и формирование геля
6.3.1 Соотношение компонентов реактивов для приготовления полиакриламидного геля приведено в таблице 1.
6.3.2 Растворение проводят при подогреве на кипящей водяной бане.
6.3.3 В стакан вместимостью 300 см3 компоненты добавляют в строго перечисленной последовательности.
6
СТБ/ПР_1
Таблица 1
Наименование компонента
Дистиллированная вода
Раствор акриламида
Уксусная кислота
Мочевина
Глицин
Аскорбиновая кислота
Дистиллированная вода, до:
Тетраметилэтилендиамин
Сернокислое закисное железо
Персульфат калия
Единица
измерения
см3
см3
см3
г
см3
см3
см3
см3
см3
см3
Количество
на 1
на 2
на 3
прибор прибора прибора
10,0
20,0
30,0
15,0
30,0
45,0
1,2
2,4
3,6
28,8
57,6
86,4
60,0
120,0
180,0
30,0
60,0
90,0
58,9
117,8
176,7
0,18
0,36
0,54
0,6
по 6.3.5 по 6.3.5
0,3
По 6.3.5 по 6.3.5
6.3.4 Глицин и аскорбиновую кислоту добавляют после полного растворения мочевины на водяной бане.
6.3.5 Сернокислое закисное железо и персульфат калия добавляют в объем раствора для одного прибора.
6.3.6 После добавления последнего компонента (персульфата калия) раствор
быстро перемешивают и равномерно (по стенке пластины) заливают в полость между стеклянными пластинами прибора для электрофореза.
6.3.7 Быстро и аккуратно вставляют гребенки для формирования ячеек таким образом, чтобы не оставались пузырьки воздуха на концах гребенки.
6.3.8 Через 2 – 3 мин, убедившись, что гель заполимеризовался, резким движением вверх аккуратно извлекают гребенки.
6.3.9 Электродный буфер заливают до уровня, покрывающего на 3 – 4 мм нижнее
стекло.
7 Проведение анализа
7.1 Нанесение белка и подключение аппарата к источнику постоянного тока,
продолжительность электрофореза
7.1.1 Прогретые белки с помощью специального шприца наносят в стартовые
ячейки геля (если ячейки заполнены тонкой пленкой геля, необходимо прочистить их
с помощью иглы и водоструйного или вакуумного насоса).
7.1.2 После нанесения белка (из каждой отдельной пробирки в отдельную ячейку)
и выдержки с нанесенными белками в течение 15 – 20 мин аппарат подключают к
источнику постоянного тока таким образом, чтобы электрод, находящийся во внутренней камере (т.е. между стеклянными пластинами), был подключен к заряду «+».
Убедившись в правильности подключения, включают источник постоянного тока. При
напряжении 500 В продолжительность электрофореза составляет 5 ч.
7.1.3. В жаркую летнюю погоду во избежание перегрева прибора напряжение
следует снизить до 450 В, а продолжительность электрофореза увеличить на 1 ч.
7.2 Порядок снятия гелевых пластин, их окрашивание и отмывка
7
СТБ/ПР_1
7.2.1 После завершения электрофореза сначала отключают источник постоянного тока, затем прибор от самого источника, сливают в мойку электродный буфер и
сосуд вместе с прибором заполняют холодной водопроводной водой для охлаждения и ополаскивания. После этого вынимают стекла с гелевой пластиной. Обычной
отверткой аккуратно разнимают стеклянные пластины и извлекают гелевую пластину, которую помещают в кювету, предварительно заполненную на 2 см по высоте
раствором для фиксации и окрашивания геля.
7.2.2 Продолжительность окрашивания гелевых пластин при свежеприготовленном растворе – не менее 2 ч. При последующем использовании раствора время окрашивания увеличивается. После 8-10-кратного употребления необходимо приготовить свежий раствор.
7.2.3 После окрашивания геля откачивают окрашивающий раствор с помощью
водоструйного насоса в специальный сосуд. Для полного удаления излишней краски
гель на 24 ч помещают в водопроводную воду
8 Обработка результатов
8.1 Определение уровня гибридности семян первого поколения
8.1.1 Определение принадлежности электрофоретического спектра зеина к гибриду производится в зависимости от способа получения гибридов (их типа), приведенному в приложении А.
8.1.2 У каждого конкретного гибрида электрофореграммы зеина анализируемых
зерновок сопоставляют с эталонными электрофореграммами зеина его материнской
и отцовской форм [1, 2, 3, 4,]. Гибридность спектра определяется, присутствием, как
минимум, одного маркерного компонента отцовской формы, который отсутствует в
спектре зеина материнской формы (приложение А).
8.1.3 Уровень гибридности семян первого поколения (УГ) в процентах определяется по формуле
УГ =
Г × 100
,
П
(1)
где Г – число гибридных зерен, шт.;
П – количество анализируемых зерновок, равное 100 шт.
8.1.4 При формировании выводов о гибридности семян на основе анализа отзельных зерен контрольного образца необходимо принимать во внимание доверительные интервалы, приведенные в приложении Б.
8.2 Оценка однородности и маркирование инбредных линий
8.2.1 У генетически чистой линии, как правило, все зерна выборки дают один,
свойственный данной линии, тип спектра зеина. Наличие зерен с другими типами
спектра в небольших количествах (примерно до 5 %) свидетельствует о засорении
линии в результате переопыления или механического засорения [1]. При наличии в
образце двух и более равноценных по частоте встречаемости типов спектра зеина
должен быть сделан вывод об отсутствии линии как таковой.
Практически все изученные инбредные линии в той или иной степени отличаются
по спектру компонентов зеина [1].
8
СТБ/ПР_1
8.2.2 Полученный на гелевой пластине электрофоретический спектр зеина каждого анализируемого семени сравнивают с эталонным спектром соответствующей самоопылённой линии.
8.2.3 Однородность самоопылённой линии (О) в процентах вычисляют по формуле
Н × 100
(2)
О=
,
П
где Н – количество идентичных электрофореграмм, шт.
П – количество анализируемых зерновок, 100 шт.
8.2.4 При наличии у линии нескольких электрофореграмм подсчет ведут по идентичности однородных типов спектра.
8.2.5 При оценке однородности и маркирования инбредных линий кукурузы не
следует обращать внимание на быстро подвижные компоненты белка, расположенные в нижней зоне спектра, т.к. различия компонентов в этой зоне обусловлены как
различной концентрацией белка, связанной с процедурой выделения, так и присутствием в некоторых случаях белков незеиновой природы [1].
8.3 Величина допустимых расхождений между результатами определяется разностным методом по двум сериям анализа одной и той же партии семян.
Допускаемое расхождение определения однородности самоопылённых линий
и уровня гибридности простых гибридов – 2%, между двумя результатами определения уровня гибридности трехлинейного, двойного межлинейного гибрида – 4%.
9 Требования безопасности
9.1 При выполнении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.
9.2 Помещение, в котором проводятся работы, должны быть оборудованы общей
приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в
воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.
9.3 При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.19. Помещение лаборатории должно соответствовать
требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и должно быть оснащено
средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
9
СТБ/ПР_1
Приложение А
(обязательное)
Белковые типы: оценка гибридов различного происхождения
Мать ♀
Отец ♂
Гибрид
Гибрид
Гибрид
Мать ♀
Отец ♂
Определение маркерной зоны, присутствующей у отцовской родительской
линии, но отсутствующей у материнской (маркерная зона отмечена стрелкой)
Рисунок А.1
Мать ♀
Отец ♂
Гибрид
Самоопыленные
Оценка простого гибрида. Только отмеченный стрелкой тип характеризует
гибрид; другие типы появляются при самоопылении (эти типы аналогичны
материнской линии) или являются засорением (маркерная зона отмечена
стрелкой)
Рисунок А.2
Мать ♀
Отец ♂
Гибрид
Гибрид
Самоопыленные
Самоопыленные
Оценка трехлинейного гибрида. Материнская линия – результат скрещивания, и согласно законам Менделя здесь может образовываться два типа
гибридных спектров, но большинство сортов показывает только один (маркерная зона отмечена стрелкой)
Рисунок А.3
10
СТБ/ПР_1
Мать ♀
Отец ♂
Гибрид
Гибрид
Гибрид
Гибрид
Самоопыленные
Самоопыленные
Оценка двойного гибрида. Обе родительские линии получены при скрещивании, и согласно законам Менделя могут образовывать четыре типа гибридных спектров (маркерная зона отмечена стрелкой)
Рисунок А.4
11
СТБ/ПР_1
Приложение Б
(рекомендуемое)
Доверительные интервалы
Доверительные интервалы для вариантов Х в образце, обозначенные в количестве зерен Х, обнаруженных в различных подобразцах (n), для уровня значимости
95% указаны в таблице Б.1.
Таблица Б.1
Количество
обнаруженных
зерен (Х)
n=10
n=20
n=30
n=40
n=50
n=70
n=100
0
0,0 – 31
0,0 – 17
0,0 – 12
0,3 – 45
0,1 – 25
0,1 – 17
0,0 –
7,1
0,1 – 11
2
2,5 – 56
1,2 – 32
0,8 – 22
0,6 – 17
0,5 – 14
3
4
5
6
7
8
9
10
15
20
25
30
35
40
45
50
6,7 – 56
12 – 74
19 – 81
3,2 – 38
5,7 – 44
8,7 – 49
12 – 54
15 – 59
19 – 64
23 – 68
27 – 73
2,1 – 27
3,8 – 31
5,6 – 35
7,7 – 39
10 – 42
12 – 46
15 – 49
17 – 53
31 – 69
1,6 – 20
2,8 – 24
4,2 – 27
5,7 – 30
7,3 – 33
9,1 – 36
11 – 39
13 – 41
23 – 54
34 – 66
1,3 – 17
2,2 – 19
3,3 – 22
4,5 – 24
5,8 – 27
7,2 – 29
8,6 – 31
10 – 34
18 – 45
26 – 55
36 – 64
0,0 –
5,1
0,0 –
7,7
0,4 –
9,9
0,9 – 12
1,6 – 14
2,4 – 16
3,2 – 17
4,1 – 20
5,1 – 21
6,1 – 23
7,1 – 25
13 – 33
18 – 41
25 – 48
31 – 55
38 – 62
0,0 – 3,6
1
0,0 –
8,8
0,1 – 13
12
Доверительные интервалы
0,0 – 5,5
0,2 – 7,0
0,6 – 8,5
1,1 – 9,9
1,6 – 11
2,2 – 13
2,9 – 14
3, – 15
4,2 – 16
4,9 – 18
8,7 – 24
13 – 29
17 – 35
21 – 40
26 – 45
30 – 50
35 – 55
40 – 60
СТБ/ПР_1
Доверительные пределы для вариантов Х в образце, обозначенные в количестве
зерен Х, обнаруженных в различных подобразцах (n), для уровня значимости 95%
указаны в таблице Б.2.
Таблица Б.2
Процент нахождения значения
Х
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Доверительный предел
n=120
0,0 – 3,0
0,1 – 4,8
0,3 – 6,4
0,8 – 7,8
1,3 – 9,3
1,8 – 11
2,5 – 12
3,1 – 13
3,8 – 14
4,5 – 16
5,3 – 17
9,2 – 23
13 – 28
18 – 34
22 – 39
27 – 44
31 – 49
36 – 54
41 – 59
n=200
0,0 – 1,8
0,1 – 3,6
0,6 – 5,0
1,1 – 6,5
1,7 – 7,8
2,4 – 9,0
3,1 – 10
3,9 – 11
4,6 – 13
5,4 – 14
6,2 – 15
10 – 21
15 – 26
19 – 32
24 – 37
28 – 42
33 – 47
38 – 52
43 – 57
n=600
0,0 – 0,6
0,4 – 2,2
1,0 – 3,5
1,8 – 4,7
2,6 – 5,9
3,4 – 7,1
4,2 – 8,2
5,1 – 9,4
6,0 – 10
6, – 12
7,7 – 13
12 – 18
17 – 23
22 – 29
26 – 34
31 – 39
36 – 44
41 – 49
46 – 54
n=1000
0,0 – 0,4
0,5 – 1,8
1,2 – 3,1
2,0 – 4,3
2,9 – 5,4
3,7 – 6,5
4,6 – 7,7
5,5 – 8,8
6,4 – 9,9
7,3 – 11
8,2 – 12
13 – 17
18 – 23
22 – 28
27 – 33
32 – 38
37 – 43
42 – 48
47 – 53
13
СТБ/ПР_1
Приложение В
(справочное)
Библиография
[1] Анализ и регистрация линий, сортов и гибридов кукурузы по зеину методом
электрофореза: метод указания и каталог белковых формул
Сост. В. В. Сидорова, Г. В. Матвеева, Г. И. Тимофеева; под ред. В. Г. Конарева: СПб.
ВИР 1998 г.
[2] Методические указания по электрофорезу зеина кукузузы для определения
процента гибридности семян F1. Методические указания
Сост. Ф. А. Попереля, Ю. А. Асыка. М.: 1988 г.
[3] ОСТ 10003 – 93 Семена кукурузы. Метод определения типичности самоопыленных линий и уровня гибридности семян первого поколения гибридов кукурузы
Введ. 1993 – 11 – 01
[4] Контроль генетической чистоты гибридов кукурузы методом электрофоретического анализа. Рекомендации. М.: Нива, 1994 г.
14
СТБ/ПР_1
И.о. Заместителя директора по
техническому нормированию
и стандартизации БелГИСС
С.К. Греков
Руководитель разработки,
начальник отдела ТО – 11
Л.М. Скорина
Исполнитель,
ведущий инженер ТО - 11
С.В.Морозова
15