Биологические исследования

ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
19
2010. Вып. 3
Биологические исследования
УДК 573.6:58.08523
О.Г. Баранова, Е.А. Китова, Е.Н. Кузнецова, Е.Ю. Лукиных
ОСОБЕННОСТИ ПРОРАСТАНИЯ СЕМЯН И РАЗВИТИЯ НА ЮВЕНИЛЬНОМ ЭТАПЕ
РЯДА РЕДКИХ РАСТЕНИЙ УДМУРТИИ
Даны результаты поиска оптимальных условий проращивания семян ряда редких растений Удмуртии, а также
приведены итоги наблюдений за развитием растений на ювенильном этапе в условиях in vitro.
Ключевые слова: редкие растения, всхожесть семян, развитие растений in vitro.
Охрана редких и исчезающих видов является одним из аспектов сохранения биологического
разнообразия. В настоящее время на территории Удмуртии насчитывается 194 вида растений, занесенных в Красную книгу УР [1]. Для сохранения местной флоры, в частности редких видов, используется ряд методов, в том числе охрана природных местообитаний, введение в культуру. Помимо указанных методов, эффективными являются создание генетического банка семян и банка растений in
vitro. Основная цель данной работы – поиск оптимальных условий проращивания семян ряда редких
и исчезающих видов растений флоры Удмуртии и наблюдение за особенностями развития этих растений in vitro.
Материалы и методика исследований
Для исследования нами был выбран ряд редких видов растений из различных семейств, ранее
интродуцированных в Ботаническом саду Удмуртского государственного университета: Adenophora
lilifolia (L.) A.DC, Allium schoenoprasum L., Astragalus falcatus Lam., Lychnis chalcedonica L., Plantago
maxima Juss. Ex. Lacq .
Семена для эксперимента были собраны в Ботаническом саду Удмуртского университета
в 2009 г. Сам эксперимент был начат в феврале 2010 г. и проводился в два этапа: первый этап – выявление условий для прорастания семян в лабораторных нестерильных условиях, второй – введение в
культуру in vitro семян и наблюдение за развитием растений. Для эксперимента нами использована
среда Мурасиге и Скуга без добавления фитогормонов, так как семена изначально содержат эндогенные фитогормоны [2; 3].
На первом этапе мы оценивали влияние света на всхожесть семян. Кроме того, была проведена
закладка опытов по стратификации при температуре 5оС сроком на один месяц. Также для семян Astragalus falcatus, обладающих водонепроницаемой кожурой, была проведена скарификация [4-6].
На первом этапе проращивание семян проводилось в четырех выбранных вариантах:
1) 25 оС, 16-часовое освещение;
2) стратификация, затем – 25 оС, 16-часовое освещение;
3) 25 оС, отсутствие освещения;
4) стратификация, затем – 25 оС, отсутствие освещения.
В ходе эксперимента регистрировали прорастание семян.
Всхожесть семян определяли в лабораторных условиях в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге: крупные семена Astragalus falcatus проращивали в количестве 10 шт. в трехкратной
повторности, более мелкие семена остальных видов – по 20 шт. в трехкратной повторности.
На втором этапе при введении эксплантов в культуру нами проведен выбор стерилизующего
вещества, оказывающего минимальное влияние на показатели всхожести семян. Для стерилизации
растительного экспланта на втором этапе было выбрано несколько стерилизующих агентов: 70%-й
раствор этилового спирта (время стерилизации семян составило 1 мин), 15%-й раствор перекиси водорода (время стерилизации – 5 мин), 3%-й раствор перекиси водорода (время стерилизации –
20 мин), 1%-й раствор нитрата серебра (время стерилизации – 1 мин), 20%-й раствор «Доместоса»
(время стерилизации – 10 мин); 35%-й раствор этилового спирта (время стерилизации – 5 мин)
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
О.Г. Баранова, Е.А. Китова, Е.Н. Кузнецова, Е.Ю. Лукиных
20
2010. Вып. 3
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
[2; 5; 7]. В ходе эксперимента была проведена ступенчатая стерилизация с различным сочетанием
стерилизующих веществ.
За всеми изучаемыми видами во время всего периода исследования велись регулярные наблюдения. В ходе эксперимента мы отмечали сроки появления всходов с момента закладки опыта, процент проросших семян. После прорастания семян изучали динамику роста, продолжительность этапов и особенности развития на каждом из них.
Результаты и их обсуждение
Семена выбранных нами редких видов растений находились в стадии полной (физиологической) зрелости. Перед проведением основных опытов были исследованы количественные и качественные параметры семян (табл. 1). Семена изучаемых видов растений легковесны и имеют небольшие размеры, только семена Astagalus falcatus относятся к средним по размерным характеристикам и
достаточно тяжеловесны. Для семян всех исследованных видов мы отмечаем, что семенная кожура
без особенностей, гладкая, что позволяет нам унифицировать процесс подготовки и саму процедуру
стерилизации. У семян Astagalus falcatus отмечена высокая степень прочности семенной кожуры, что
существенно влияет на ее влаго- и воздухопроницаемость.
Таблица 1
Характеристика семян изученных редких видов
Название таксона
Campanulaceae Juss.
Adenophora lilifolia(L.) A.DC
Alliaceae Borkh
Allium schoenoprasum L.
Fabaceae Lindi
Astagalus falcatus Lam.
Caryophyllaceae Juss.
Lychnis chalcedonica L
Plantaginaceae Lindi.
Plantago maxima Juss. Ex. Lacq
Категория
в Красной книге
УР [1]
Масса
1000 семян, г.
Средний размер семян,
мм
3
0,377±0,043
(2,17х1)±0,77
1
0,840±0,053
(2,27х1,33)±0,77
3
3,962±0,036
(2,67x2)±0,77
3
0,307±0,036
(1,17х1)±0,77
3
0,387±0,058
(2,33х1)±0,77
По результатам исследований было выявлено, что наилучшей всхожестью среди всех исследуемых видов обладает Plantago maxima (около 96%) (табл. 2). Для вида отмечено наличие всходов
во всех вариантах опыта. Максимальная всхожесть отмечена в варианте без освещения при температуре 25 оС. Кроме того, отмечено прорастание семян во время стратификации, таким образом, мы говорим о положительном влиянии низких плюсовых температур на всхожесть. Всхожесть семян
Lychnis chalcedonica выше в варианте со стратификацией (83-85%). Также отмечено, что для семян
Lychnis chalcedonica свет не играет стимулирующей роли, количество проросших семян в вариантах с
освещением и без него существенно не отличается. Семена Astagalus falcatus проросли только после
проведения скарификации, наилучший показатель прорастания наблюдается в темноте (53%), в вариантах со стратификацией всхожесть нулевая, то есть в условиях низких положительных температур
не происходит разрушения семенных покровов и не повышается их влаго- и воздухопроницаемость.
Всхожесть семян Allium schoenoprasum выше в варианте со стратификацией (62-77%). Всхожесть семян Adenophora lilifolia высокая во всех вариантах опыта (50% и выше), но наилучшая всхожесть –
после стратификации, при проращивании на свету (83%).
Таким образом, нами выявлены необходимые для прорастания семян условия культивирования.
Опыты по проращиванию семян in vitro на питательной среде в стерильных условиях первоначально проведены на двух видах – Allium schoenoprasum и Plantago maxima. Результаты показали нецелесообразность использования ряда стерилизующих агентов ввиду низкой всхожести обработанных семян по сравнению с результатами первой части эксперимента (табл. 2, 3).
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Особенности прорастания семян и развития…
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
21
2010. Вып. 3
Таблица 2
Всхожесть семян изученных видов в лабораторных нестерильных условиях
Вид
Adenophora lilifolia
Allium schoenoprasum
Astagalus falcatus *
Lychnis chalcedonica
Plantago maxima
25оС, 16-часовое освещение
НестратифиСтратифицированные, цированные,
%
%
65,00±0,37
82,50±1,59
35,00±0,69
76,67±0,19
36,67±0,13
0
31,67±0,52
83,33±0,26
91,67±0,19
95,00±0,13
25оС, отсутствие освещения
НестратиСтратифицированфицированные, в %
ные, %
78,33±0,14
50,00±0
56,67±0,258
61,67±0,44
53,33±0,38
0
20,00±0,45
85,00±0,22
96,67±0,14
96,67±0,07
* Для Astragalus falcatus в условиях без стратификации была проведена скарификация.
Таблица 3
Влияние стерилизующего агента на прорастание семян в культуре in vitro
Вид
Allium schoenoprasum
Plantago maxima
Варианты опыта
70%-й
70%-й
70%-й
70%-й
спирт,
спирт,
спирт,
спирт,
3%-я
15%-я
3%-я
15%-я
перекись, перекись, перекись,
перекись,
нитрат
нитрат
%
%
серебра,
серебра,
%
%
30,00±0,45 20,00±0,00 30,00±0,90 15,00±0,22
0
0
0
0
20%-й раствор
«Доместоса»,
%
15,00±0,67
0
В дальнейшем были предприняты попытки по повышению всхожести стерилизованных семян
на примере Plantago maxima, Lychnis chalcedonica и Adenophora lilifolia путем снижения концентрации стерилизующих агентов, при этом время экспозиции нами оставлено прежним (табл. 4). При понижении концентрации стерилизующих веществ происходит снижение их губительного действия на
зародыш семени, что приводит к улучшению показателей всхожести. Причем выявлено, что для Adenophora lilifolia, Plantago maxima лучшим из выбранных стерилизующих агентов является 35%-й раствор этилового спирта, а для Lychnis chalcedonica – 3%-й раствор перекиси водорода.
Таблица 4
Всхожесть семян изучаемых видов при различных концентрациях стерилизующих
агентов на питательной среде Мурасиге-Скуга
Вид
Adenophora lilifolia
Lychnis chalcedonica
Plantago maxima
35%-й спирт, %
40,00±0,45
20,00±0,00
25,00±0,22
70%-й спирт, %
15,00±0,22
5,00±0,00
3%-я перекись водорода, %
20,00±0,00
30,00±0,45
10,00±0,00
После проведения серии опытов по прорастанию для этих видов нами отработана схема стерилизации. Опыты по подбору оптимального варианта стерилизации для других видов продолжаются.
Особенности прорастания и развития исследованы для следующих видов: Astragalus falcatus,
Allium schoenoprasum, Plantago maxima.
Результаты наблюдений приведены ниже.
Allium schoenoprasum L. Прорастание надземное: сначала через семенную кожуру пробиваются
кончик корня и короткий гипокотиль. Затем на поверхности появляется нижняя часть семядоли, она
становится зеленой и фотосинтезирующей, тогда как верхняя часть остается в семени. Вскоре и она
оказывается на поверхности вместе с семенной кожурой, которая затем опадает. Постепенно верхняя
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
22
О.Г. Баранова, Е.А. Китова, Е.Н. Кузнецова, Е.Ю. Лукиных
2010. Вып. 3
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
часть семядоли засыхает начиная с верхушки. Тем временем появляются придаточные корни. И наконец, через щель в семядоле пробивается первый лист. Развитие Allium schoenoprasum идет быстрыми темпами. Проростки появляются на 16-й день после посадки семян на питательную среду. Но до
появления настоящих листьев проходит 6 дней. Далее темпы развития возрастают, и в течение 30
дней появляются последовательно 6 листьев (рис.1).
За время исследования никаких отклонений в развитии проростка не отмечено.
Allium schoenoprasum
количество листьев
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1
4
7
10
14
17
20
24
27
30
33
сутки от начала прорастания
Рис.1. Динамика развития проростков Allium schoenoprasum
Astragalus falcatus Lam
Прорастание надземное: первым прорывает семенную кожуру кончик корня, появляющийся
вслед за ним гипокотиль растет неравномерно, образуя петлеобразный изгиб, который и выносит на
поверхность семядоли и заключенную между ними почечку. Затем появляется первый лист.
В развитии растений нами отмечается несколько этапов роста. Быстрые ростовые процессы чередуются с формообразовательными процессами, поэтому перед появлением каждого нового органа
мы отмечаем остановку ростовых процессов. Проростки появляются на 8-й день после посадки семян
на питательную среду. После прорастания семядолей они довольно долго остаются единственным
фотосинтезирующим органом. Затем развитие ускоряется, но после формирования 3-го листа происходит торможение ростовых процессов. Далее развитие опять идет ускоренно, и уже на 24-й день на
растении сформировано 5 листьев (рис. 2).
Astragalus falcatus
количество листьев
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1
4
7
10
14
17
20
24
27
30
33
сутки от начала прорастания
Рис.2. Динамика развития проростков Astragalus falcatus
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
Особенности прорастания семян и развития…
23
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
2010. Вып. 3
число листочков сложного
листа
Astragalus f alcatus
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
номер листа по развитию
Рис.3. Развитие листьев у Astrgalus falcatus
В ходе наблюдения за развивающимися особями нами отмечено постепенное усложнение организации каждого вновь появляющегося органа. Каждый новый лист имеет большее количество листочков сложного листа по сравнению с ранее сформировавшимися (рис. 3).
Во время исследования у некоторых особей отмечен хлороз. Были предприняты меры по его
устранению за счет добавления в среду хелата железа (из расчета 0,0025 мг/л). Отклонений в развитии проростка астрагала серповидного нами не отмечено. Таким образом, проведена модификация
состава питательной среды применительно к виду Astragalus falcatus.
Plantago maxima Juss. Ex. Lacq
Прорастание надземное: первым появляется корешок, затем гипокотиль, который делает петлеобразный изгиб, при этом вынося на поверхность семядоли с семенной кожурой. Затем появляется
первый лист.
Развитие проростков подорожника наибольшего было самым медленным из всех исследованных
видов. Проростки появляются только на 20-й день после посадки семян на питательную среду. Формирование первых настоящих листьев происходит долго, однако появление последующих листьев происходит довольно быстро. На 25-й день наблюдений на растениях уже сформировано 5 листьев (рис. 4).
За время исследования у двух особей отмечен хлороз, который также устранен добавлением хелата железа. Отклонений в развитии проростка подорожника наибольшего не наблюдается. Таким образом, нами проведена модификация состава питательной среды применительно к виду Plantago maxima.
Plantago maxima
количество листьев
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1
4
7
10
14
17
20
24
27
30
33
сутки от начала прорастания
Рис. 4. Динамика развития проростков Plantago maxima
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
О.Г. Баранова, Е.А. Китова, Е.Н. Кузнецова, Е.Ю. Лукиных
24
2010. Вып. 3
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Заключение
В ходе исследования был проведен подбор оптимальных условий для проращивания семян редких растений; получены результаты воздействия различных стерилизующих агентов на показатель
всхожести семян. В итоге было установлено, что наилучшая всхожесть среди выбранных видов (вне
зависимости от условий) наблюдается у Plantago maxima; стратификация влияет положительно на
прорастание семян Adenophora lilifolia, Allium schoenoprasum, Lychnis chalcedonica. Влияние света как
фактора отмечено при прорастании семян Adenophora lilifolia.
Влияние стерилизующего агента разной концентрации на всхожесть было отмечено при прорастании семян Adenophora lilifolia, Lychnis chalcedonica и Plantago maxima.
При проведении данной работы было установлено, что всхожесть, динамика развития редких
растений Удмуртии, таких как Astragalus falcatus, Allium schoenoprasum, Plantago maxima, сильно
различаются.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что выбранные виды редких растений
можно выращивать в стерильных условиях в целях создания банка растений in vitro.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Красная книга Удмуртской Республики: Сосудистые растения, лишайники, грибы / под ред. В.В. Туганаева.
Ижевск: Изд-во Удм. ун-та, 2001. 290 с.
Основы биотехнологии растений: Культура клеток и тканей: учеб. пособие / сост. И.К. Сорокина, Н.И. Старичкова, Т.Б. Решетникова, Н.А. Гринь. Саратов, 2002. 45 с.
Основы микроразмножения редких растений: учеб.-метод. пособие / сост. О.Г. Баранова и др. Ижевск: Издво «Удмуртский университет», 2009. 64 с.
Николаева М.Г., Разумова М.В., Гладкова В.Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян.
Л.: Наука, 1985. 348 с.
Полубоярова Т.В., Новикова Т.И. Проращивание семян дикорастущих видов луков рода Allium L. подрода
Melanocrommyum Webb et. Berth. в условиях in vitro // Вестн. Алт. аграр. ун-та. 2009. №1 (51). С. 22-25.
Сравнительная анатомия семян. Т.5. Двудольные. Rosidae / под ред. А.Л. Тахтаджяна. СПб.: Мир и семья,
1996. 512 с.
Черевченко Т.М., Лаврентьева А.Н., Иванников Р.В. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro. Киев: Наук. думка, 2008. 560 с.
Поступила в редакцию: 20.08.10
O.G. Baranova, doctor of biology, professor
E.A. Kitova, engineer
E.N. Kuznesova, student
E.Yu. Lukinich, student
Features of germination of seeds and development of juvenile stage for some rare plants of Udmurtia
Search results of optimum conditions growth seeds of some rare plants of Udmurtia are given. Results of supervision
over development of nursling in conditions in vitro are resulted.
Keywords: rare plants, grow seeds, development of plants in vitro.
Баранова Ольга Германовна, доктор биологических наук, профессор
Китова Елена Анатольевна, инженер
Кузнецова Екатерина Николаевна, студентка
Лукиных Елена Юрьевна, студентка
ГОУВПО «Удмуртский государственный университет»
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
E-mail: [email protected]
PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com