идентификация грибов рода fusarium, выделенных из почв

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГРИБОВ РОДА FUSARIUM, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПОЧВ
КАСПИЙСКОЙ АКВАТОРИИ КАЗАХСТАНА, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И СЕКВЕНИРОВАНИЯ IGS-ОБЛАСТИ ДНК
Хапилина О.Н, Новаковская А.П.,
Нечай Н.Л.,Орозалиева Ж.Б,
Турганбаева А.К., Созинова Л.Ф., Какимжанова А.А.
Экологические проблемы Каспийского
моря связаны с интенсивным антропогенным
загрязнением
нефтепродуктами,
токсическими веществами, как в зоне добычи,
так и в прибрежном регионе. Загрязнение
уменьшает
видовое
разнообразие
на
территории Каспийского
бассейна, для
сохранения которого требуется проведение
мониторинговых
исследований
биологического сообщества на территории,
прилегающей к морю, на загрязненных
пестицидами, нефтью и солями участках
суши. Особый интерес вызывает микобиота
почв на загрязненных и прилегающих к ним
территориях, представители которой могут
служить
биоиндикаторами
степени
загрязнения. Почвенные микроорганизмы,
которые как компонент наземной экосистемы,
испытывают на себе негативное воздействие
антропогенного и техногенного факторов и
наиболее чутко реагируют на любое
изменение условий среды обитания [1]. Их
развитие и активность находятся в прямой
связи с составом органических и неорганических
веществ
в
среде,
так
как
микроорганизмы
способны
разрушать
соединения естественного и антропогенного
происхождений [2].
Нестабильность
условий,
динамичность и недостаточная выраженность
почвообразовательных
процессов
чрезвычайно
затрудняют
диагностику
почвенно-растительного
сообщества.
В
последнее
время
к
традиционным
микробиологическим
методам
идентификации
добавились
новые,
основанные на использовании молекулярногенетических технологий. Преимуществами
молекулярных
методов
идентификации
микроорганизмов являются быстрота и точность определения вида и расы возбудителя;
возможность
определения
видовой
принадлежности без выделения гриба в
чистую культуру [3].
Универсальность,
высокая
чувствительность и относительная простота
исполнения сделали методы молекулярной
биологии
ПЦР,
секвенирование
незаменимыми для решения различных
диагностических задач, в том числе таких, как
прямое обнаружение и идентификация
возбудителей заболеваний, молекулярное
типирование
и
исследование
свойств
патогенных микроорганизмов [4].
Интенсивность
секвенирования
полных геномов в настоящее время достигла
индустриальных темпов. В 2001 году был
секвенирован
геном
человека
и
в
последующие годы геномы некоторых других
млекопитающих: мыши, крысы, собаки,
шимпанзе и оппосума. Огромный интерес
существует к последовательностям геномов
различных микроорганизмов как про- так и
эукариот.
Очевидно,
что
темпы
секвенирования
значительно
опережают
темпы экспериментального анализа геномов
[5].
IGS (Intergenic spacer)- единственная
кодирующая
непрерывная
область,
содержащая
значительные
изменения
последовательностей нуклеотидов. Размер
этой области довольно большой – более 2 КБ.
В некоторых аскомицетах IGS содержит
единственную кодирующую область – ген 5S
РНК, который делит IGS на две меньших
области, в зависимости от ориентации и
положения
гена
5S
РНК,
данная
последовательность
может
быть
секвенирована
для
идентификации
микромицетов [6].
IGS-область
ДНК
представляет
особый интерес для синтеза праймеров,
использующихся в диагностических целях.
Данная область повторяется множество раз в
геноме,
и,
по
мнению
некоторых
исследователей, является самым
С.Сейфуллин
атындағы
ҚазАТУ-ң
ғылым жаршысы / Вестник науки КазАТУ им.
С.Сейфуллина. – 2011. - №3(70). – С.38-43
38
чувствительной целью в геноме для
проведения идентификации [7].
В то же время большинство
мицелиальных
аскомицетов
имеют
единственную непрерывную область IGS
(между концом LSU и началом следующей
последовательности SSU), которая может
измениться по длине от 2-5 КБ или больше
[8].
В
2009
г.
в
лаборатории
биотехнологии и селекции растений РГП
«Национальный
центр
биотехнологии
Республики Казахстан» начата отработка
методики
молекулярно-генетической
идентификации микроскопических грибов на
основе
определения
нуклеотидных
последовательностей в ITS- и IGS-областях
ДНК.
Исследования были выполнены в
рамках программы «Комплексное экологоэпидемиологическое обследование биоценоза
каспийской акватории и разработка мер по его
оздоровлению на 2008-2010 годы».
Материалы и методы
Объектом исследований являлись
штаммы микроскопических грибов рода
Fusarium, выделенные из почв Каспийского
региона - штамм 12/5-4, штамм 31-5-1 и
штамм
П 3-2. Выделение и учет
микромицетов осуществлялись стандартными
микологическими методами [9, 10, 11].
Для выделения геномной ДНК
штаммы грибов культивировали на жидкой
картофельной среде, содержащей 30 г/л
сахарозы в течение 5 суток. Затем в
стерильных условиях биомассу грибов весом
100-200 мг переносили в микропробирки и
помещали в криотермостат при -70°С на 15-20
минут. Экстракцию геномной ДНК проводили
с использованием СТАВ-буфера (2M Tris, 5 M
NaCl,
0,5
M
EDTA,
5%
СТАВ).
Предварительно замораживали пробы весом
100-200 мг в микропробирках при -70°С в
течение
15
минут.
Затем
пробы
гомогенизировали в 600 мкл STAB-буфера,
предварительно нагретого до 65°, инкубацию
проводили
в термостате 1 час при
температуре 56°С. Затем к пробам добавляли
600 мкл хлороформ-изопропаноловой смеси
и оставляли при комнатной температуре в
течение 1 часа. После этого проводили
центрифугирование при 3000 об/мин
в
течение 5 минут, супернатант без интерфазы
переносили в чистые пробирки. Осаждение
ДНК
проводили
изопропанолом
при
комнатной температуре в течение 10-12 часов.
После этого проводили центрифугирование
при 12000 об/мин в течение 10 мин для
удаления супернатанта, осадок подсушивали
и растворяли
его в 20 мкл воды.
Электрофорез проводили в 1% агарозном
геле, в камере с ТЕ-буфером при 299 mA и 90
V в течение 15
минут, детекцию ДНК
осуществляли в УФ-свете.
Анализ
нуклеотидной
последовательности IGS-области ДНК проводили
с помощью автоматического секвенатора ABI
Prism
I377
(Applied
Biosystems)
c
использованием ABI PrismBigDye Terminator
v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit
согласно
протоколам
производителя.
Результаты исследований и их обсуждение
Результаты исследований показали, геномной ДНК. Детекция результатов
что использование СТАВ-метода является экстракции
показала
положительный
наиболее оптимальным способом экстракции результат для всех проб (рисунок 1).
1
2
39
3
1 – 72-часовая культура микромицетов Fusarium; 2 – гомогенизация; 3 – электрофорез
ДНК микроскопических грибов Fusarium
Рисунок 1 – Этапы выделения ДНК микромицетов с использованием СТАВ-буфера
Амплификацию ДНК для сиквенса IGSregion проводили с использованием праймеров
LR12R 5´gaa cgc ctc taa gtc aga atcc ´3 и invSR1R
5´act ggc aga atc aac cag gta´3 (Vilgalys lab) [6].
Амплификацию проводили при следующих
условиях: 1) 94ºС – 5 мин; 2) 94ºС – 1 мин;
55ºС – 2 мин; 72ºС – 1 мин – всего 5 циклов;
3) 94ºС – 30 сек; 55ºС – 1 мин; 72ºС – 40 сек –
всего 30 циклов; 4) 72ºС – 10 мин.
Реакционная смесь для амплификации
состояла из 1 мкл праймеров (прямого и
обратного); 2,5 мкл dNTP; 2,5 мкл буфера; 0,2
мкл полимеразы (Fermentos), 2 мкл ДНК и воды.
Общий объем реакционной смеси составил 25
мкл.
Результаты ПЦР ДНК микромицетов с
IGS-праймерами представлены на рисунке 2.
Результаты
амплификации
с
праймерами к IGS-региону ДНК показали
низкую
специфичность
праймеров:
отсутствие амплифицированного фрагмента
для изолята 31-5-1 и наличие неспецифичных
ампликонов в спектрах
двух остальных
изолятов.
В этой связи необходимо для
секвенирования IGS-областей микромицетов
выделить из ПЦР-продукта нужный бэнд,
учитывая его молекулярный вес. Для этого
весь ПЦР-продукт каждого образца вносили в
стартовые колонки 1%-ного агарозного геля.
1
2
1 – результат амплификации ДНК с IGS-праймерами (слева направо: маркер; ДНК штаммов
12/5-4; 31-5-1); 2 – выделение IGS-региона ДНК из ПЦР-продукта
Рисунок 2 – Амплификация проб ДНК микромицетов с IGS -праймерами
Электрофоретическое
разделение
проводили в ТАЕ-буфере, при 299 mA и 99V.
Стерильным скальпелем на стерильных
предметных стеклах в условиях трансиллюминатора проводили вырезание IGS-области
микромицетов. После вырезания нужной
части спектра ПЦР-продукта переносили
часть геля в микропробирки и проводили его
очистку с использованием набора для
экстракции ДНК фирмы Fermentos (в
соответствии с протоколом).
Для
отработки
процесса
секвенирования был взят ПЦР-продукт с IGSпраймерами только одного изолята - 12/5-4
Fusarium. После очистки и выделения из геля
проводится электрофорез: в лунки вносится 1
мкл ДНК-пробы, электрофорез проводится в
1%-ном агарозном геле, помещенном в
камеру с ТАЕ-буфером при 299 mA и 99V.
Результат фиксируется с использованием
гельдокументирующей системы.
Секвенирование
проводится
на
секвенаторе
ABI377,
разрешающая
способность которого находится в пределах
600-700 нуклеотидов, каждый из которых
метится флюоресцентными метками: Азеленый; G-черный; С-синий; Т-красный.
Реакционная смесь состояла из компонентов:
1,5 мкл праймеров, 1,5 мкл Mix (2 V Bigday: 1
V буфера), 0,5 мкл воды и 2 мкл матрицы.
Перед реакцией секвенирования разводятся
праймеры (invSR1R и LR12R) в 10 раз
(концентрация праймера 1,5 pM/мкл). Смесь
раскапывается в микропробирки для ПЦР, все
40
компоненты реакции вносятся каплями на
стенки,
после
каждой
манипуляции
проводится осаждение капель на вортексе, в
заключение перемешивается 10 сек на
центрифуге на минимальной скорости.
Режим для проведения амплификации
следующий: 1) денатурация при 96°С - 1 мин;
2) денатурация при 96°С - 10 сек; отжиг
праймеров при 50°С - 5 сек; элонгация при
60°С -4 сек. Всего 25 циклов.
Одним из важных моментов является
переосаждение
проб
ДНК
для
секвенирования, этот этап проводится в
соответствии с протоколом, рекомендуемым
фирмой-изготовителем оборудования.
В
пробирку с ПЦР-продуктом добавляется 0,5
мкл EDTA (0,125 моль), капли осаждаются на
вортексе. Затем добавляется по 15 мкл смеси
ацетата
натрия
со
спиртом,
вновь
встряхивается на вортексе, после чего
помещается в темноту при комнатной
температуре на 20 минут. Проводится
центрифугирование при +5ºС на скорости
12500 об/мин в течение 15 минут.
Супернатант сливается (не задевая дна и
стенок), затем добавляем 17,5 мкл 70%-ного
этанола, вновь центрифугируем при +5ºС на
скорости 12 500 об/мин в течение 10 минут.
Супернатант сливаем, осадок сушим при 96%
в течение 1,5 мин в твердотельном
термостате. К осадку добавляем 1,6 мкл
формамида, встряхиваем 10 мин на вотексе,
после чего проводим денатурацию при 96ºС в
течение 1,5 мин. В таком виде пробы
наносятся в колонки геля для секвенирования.
По
окончании
секвенирования
проводится анализ полученных сиквенсов с
использованием программного обеспечения
Chromas 2.33, Vector NTI Advands 10.
Полученные сиквенсы анализируются, затем
определенная
последовательность
«экспортируется» в программу
BLAST,
используемую для поиска нуклеиновых
кислот с известной первичной структурой.
Используя BLAST, производится сравнение
имеющейся
последовательности
с
последовательностями из базы данных
GenBank
и
с
последовательностью
предполагаемых гомологов.
Полученные
нами
в
процессе
секвенирования IGS-последовательности грибов
рода Fusarium были «экспортирована» в
программу BLAST, проведено сопоставление с
последовательностями типовых штаммов и по
максимальному
показателю
идентичности
проведена идентификация данных штаммов
(рисунок 3).
Проведенное секвенирование IGSобласти ДНК штамма 12/5-4 показало, что
данный регион ДНК имеет следующую
последовательность нуклеотидов:
TCT AGG GCC ACA ACG CCG TGG GGC AAT CCG CTT TCC CCC TCT AGA TTC CCC
AGG GCG TCC TTC CGC CGC ACC GAA CCC GCT GTG GGA GGT GTG GCT TGG GGG CCC
CAG GAG GAG GAC CTA GCA CGC TGC TTC TAC CAT TTC GGT GTC CGT AGC GAG TGG
TTG ACT CCC GAT GCT CAG TTT CAG GCG TAC AGG GCG GCC AGC CAT CCA CAG AAC
CCA ACT GCA GGC AGA GCT AGG ACC GAA GTC CAG CTG CCG TAA CGC AGG CAT CCC
CAG TAC GCG GTC AGT GAA GCC GTT TCG TGG GGG TCG ACT AAC CAC TAT GCT GAG
ACG CTG CGG GAC CAT GGG TCG CCT AAC CAG TGA ATC AGC ACG CAG TGG AAG TCT
GCA AGA TCG GGT ACG AAA GGG TTG CGC CGC AGC TGT GTC CGA CCC TTT CAG GCC
GGG CTG CTT TGC TTC CCT CTC ATA TAC CCT CCG AGG GTG TTT TTG TGG GTC GCA
CGC CAG ACC GGG CTC GTG GGC CAC TTT TTA TTT TCC GCA AAA TTC ATT TGT ATG
GGA AAT TTA AAA AAT CGA CTC ACG GGC CAC CAA ACC ACA AAA CCA TTT CGC ACG
CAT TTT TTT CAA AG.
41
Рисунок 3 – Фрагмент секвенированной последовательности IGS-региона ДНК с
использованием праймера invSR1R (изолят 12/5-4 Fusarium)
Данная
нуклеотидная
последовательность
с
97%
долей
идентичности и 100% гомологии была
отнесена к роду Fusarium виду
F.
sporotrichoides.
Таким образом, метод секвенирования
IGS-области ДНК может быть использован
для идентификации микромицетов рода
Fusarium. Метод является довольно простым
по
исполнению,
а
высокая
степень
генетических изменений в IGS-области делает
данный метод очень перспективным для
идентификации
и
филогенетических
исследований.
Литература
1. Киреева Н.А., Рафикова Г.Ф. Разнообразие спорообразующих микроорганизмов в
условиях нефтяного загрязнения
почвы // Тезисы международной конференции
«Микроорганизмы и биосфера». – Москва, 2007. - С. 58-59.
2. Волкова И.Н., Старкова О.В. Использование микробиолгических показателей для
диагностики состояния почв и их мониторинга // Тезисы международной конференции
«Микроорганизмы и биосфера». – Москва, 2007. - С.19-21.
3. Yli-Mattila T, Paavanen S., Hannukkala A., Parikka P., Tahvonen R.,
Karjalainen R. Isozyme and RAPD-PCR analyses of Fusarium avenaceum strains
from Finland // Plant Pathol., 1996. - Vol. 45. - P. 126-134.
4. Ллуэлин М.Б. Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Молекулярная
клиническая диагностика. Методы. - М.: Мир, 1999. - С. 428 - 447.
5. Неверов А.Д. Компьютерный анализ сплайсинга. – Автореферат ….канд. биол. наук. –
М., - 2007. – 35 с.
6. http://mendel.berkeley.edu/boletus/boletus.html
7. Kulik T. Detection of Fusarium tricinctum from cereal grain using PCR assay // Journal
Appl Genet – Vol 49 (3). - 2008. - Р. 305–311.
8. Abd-Elsalam K.A., Aly I.N., Abdel-Satar M.A. , Khalil M.S., Verreet J. A. PCR
identification of Fusarium genus based on nuclear ribosomal-DNA sequence data // African Journal of
Biotechnology. – 2003. - Vol. 2 (4). - Р. 82-85.
9. Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии. – Киев, 1982– 438 с.
10. Методы почвенной микробиологии и биохимии /под ред. Д.Г. Звягинцева/ –
М.: Изд-во МГУ, 1991. – 304 с.
11. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзьева Г.И. Практикум по микробиологии –
М.: Дрофа, 2004. – 256 с.
Түйін
Микромицеттерді молекулярлы әдістермен идентификациялау қазіргі кезде кең
қолданылуда. Микромицеттердің геномды ДНҚ экстракциясының ең тиімдісі - СТАВ әдісі.
ДНҚ-ның IGS-аймағының праймерлермен амплификациясы праймерлердің төменгі
спецификалықты:31 және 5-1 амплифицирленген франменттің изоляты үшін жоқ екенін және
спецификалық емес ампликонның басқа екі изоляттың спекторының бар екенін көрсетті. IGSтізбектің Fusarium саңырауқұлақ түрінің ДНҚсын секвендеу нәтижесінде
Қазақстанның
Каспийдің акваториясындағы топырақтан бөлініп алынған микромицеттер штамының
42
идентификациясы GeneBankтегімен максималды біртекті екені анықталды. Берілген нуклеотидтік
тізбек 97% идентипті және 100% гомология болғандықтан Fusarium тұқымына F. sporotrichoides
түріне жатқызылды. ДНҚ-ның
IGS – аймақтарын секвендеу әдісі
Fusarium тұқымынң
микромицеттерін идентификациялау үшін пайдаланыла алады.
Summary
Molecular methods of identification of fungi has been used quite extensively lately. CTABmethod is the best way to fungal genomic DNA extraction. Results of amplification with primers to
IGS region OF DNA primers showed low specificity: isolation 31-5-1 amplified fragment absence and
in spectrums of two other isolates nonspecific bends availability. The sequencing of IGS-region of
DNA of Fusarium fungi on the maximum rate of identity in GeneBank species identification of fungal
strains isolated from soils of the Caspian Sea in Kazakhstan. The nucleotide sequence of the 97% of
the shares of identity and 100% homology was included due to Fusarium species f. sporotrichoides.
IGS-sequencing method for DNA can be used to identify fungal genus Fusarium.
43