Сперанская Анна Сергеевна ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ТИПА
advertisement
На правах рукописи Сперанская Анна Сергеевна ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ТИПА КУНИТЦА ИЗ КАРТОФЕЛЯ: МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ Специальность 03.00.04 – «Биохимия» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук МОСКВА 2008 Работа выполнена в лаборатории биохимии протеолиза Института биохимии им А.Н. Баха РАН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор ВАЛУЕВА Татьяна Александровна Официальные оппоненты: доктор химических наук РОТАНОВА Татьяна Васильевна доктор биологических наук КОРОЛЕВА Ольга Владимировна Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова Защита состоится « 30 » октября 2008 г. в «14.00 » часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Институте биохимии им А.Н. Баха РАН по адресу:119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2 С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу:119071, Москва, Ленинский проспект, д.33 стр. 1 Автореферат разослан «_29_»_сентября____2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Орловский А.Ф. 2 Общая характеристика работы Актуальность темы. Ингибиторы протеолитических ферментов представляют собой большую группу белков, способных образовывать комплексы с протеиназами, в составе которых ферменты утрачивают свою активность. Белковые ингибиторы протеиназ, обнаруженные у представителей всех доменов живых организмов, на основании особенностей строения их молекул разделяют на структурные семейства, число которых различается в зависимости от принятой системы классификации [Laskovsky&Kato, 1980; Rawlings et al., 2004]. Ингибиторы, принадлежащие к семейству соевого ингибитора трипсина Кунитца (SKTI, soybean Kunitz trypsin inhibitor), широко распространены среди растений различных систематических групп, как однодольных, так и двудольных. Белки этого семейства могут подавлять активность сериновых, цистеиновых или аспартатных протеиназ, помимо этого некоторые из них проявляют активность по отношению к непротеолитическим ферментам, таким, как растительные инвертазы и α-амилазы [Rodenburg et al., 1995; Heibges et al., 2003]. Белки семейства SKTI в большом количестве присутствуют в семенах и запасающих органах растений, а также в механически поврежденных или пораженных фитопатогенами органах растений. Физиологические функции белков семейства SKTI в организме растений окончательно не установлены, тем не менее, очевидно, что они участвуют в защите растений от патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Показано, что белки SKTI могут действовать как на экстрацеллюлярные протеиназы, секретируемые фитопатогенами, так и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых, которые повреждают растительную ткань [Мосолов, Валуева, 2005]. В связи с новейшими достижениями биотехнологии по созданию растений, обладающих повышенной устойчивостью к вредителям и болезням, изучение белков данного семейства имеет не только теоретическое, но также важное практическое значение. К настоящему времени накоплено значительное количество сведений о структуре и свойствах белков-ингибиторов семейства SKTI из картофеля (Solanum tuberosum L.), являющегося одной из важнейших сельскохозяйственных культур. Эти белки выделяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz proteinase inhibitors). Установлено, что в картофеле белки PKPI представлены многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и C-концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере, пять различных структурных групп, три из которых — PKPI-A, PKPI-B и PKPI-С — относительно хорошо изучены [Ishikawa 3 et al., 1994; Heibges et al., 2003; Bauw et al., 2006]. Однако структурные особенности белков PKPI, протеиназами, определяющие остаются специфичность малоисследованными. взаимодействия Несмотря на то, с различными что изучены биохимические свойства целого ряда белков PKPI, выделенных из клубней картофеля, их полная первичная структура, как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически отсутствуют данные о биохимических свойствах этих белков. Таким образом, исследование взаимосвязи структуры и свойств новых белков PKPI, является актуальной задачей современной биохимии. В настоящее время известно около сотни нуклеотидных последовательностей (в основном кДНК), кодирующих белки PKPI из различных сортов картофеля таких, как Provita, Saturna, Bintje, Pentland squire, Superior, Desire; Danshaku, Ulsten Sceptre [Heibges et al., 2003, Gruden et al., 1997; Strukej et al., 1992; Hannapel, 1993; Herbers at al., 1994; Ishikawa et al., 1994; Stiekema et al., 1988]. Показано, что гены ингибиторов PKPI в геноме картофеля, представленные множественными копиями, отличаются высоким уровнем полиморфизма, при этом нуклеотидные последовательностями, относящиеся к трем наиболее изученным группам, различаются на 88-99% (PKPI-А), 85-99% (PKPI-В) и 5499% (PKPI-С). В то же время и последовательности кДНК (или генов) PKPI, обнаруженные в различных сортах картофеля, отличаются друг от друга. Это позволило высказать предположение, что каждый сорт картофеля содержит свой уникальный набор генов PKPI, а различия между ними обусловлены высокой скоростью их эволюции [Heibges et al., 2003]. Информация о структуре ранее не изученных генов PKPI картофеля, а также растений близких видов, представляет значительный интерес, поскольку позволяет судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo. Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение генов PKPI из генома картофеля сорта Истринский и неклубненосного дикого вида Solanum brevidens Phill. (синоним S. palustre Poepp. ex Schltdl.), их сравнительный структурно-функциональный анализ, а также исследование взаимосвязи между структурой и специфичностью продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи: 1. Разработать метод полногеномного ПЦР-анализа генов PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C растений рода Solanum, включая установление их числа и структуры. Синтезировать 4 универсальные олигонуклеотидные праймеры, специфичные к высоко консервативным фланговым последовательностям генов, кодирующих белки PKPI, и на их основе создать схему клонирования и реконструкции нуклеотидных последовательностей из набора геномных генов PKPI картофеля сорта Истринский и неклубненосного S. brevidens. 2. Провести сравнительный анализ последовательностей реконструированных генов картофеля сорта Истринский и S. brevidens, а также известных по данным литературы последовательностей PKPI других сортов картофеля и видов растений рода Solanum. На основании полученных данных оценить скорость эволюции генов PKPI, а также перспективность поиска новых форм ингибиторов этого подсемейства в других видах растений рода Solanum. 3. Идентифицировать вариабельные и консервативные области в последовательностях генов PKPI, а также «горячие точки» рекомбинации. Усовершенствовать классификацию последовательностей в пределах групп. 4. Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии клонированных генов PKPI в Escherichia coli. Получить ряд рекомбинантных белков, кодируемых новыми, ранее не изученными генами PKPI, и охарактеризовать специфичность их действия на протеиназы: трипсин, химотрипсин, субтилизин Карлсберг, протеиназу К, эластазу из лейкоцитов человека (HLE) и папаин. Научная новизна и практическая значимость работы: Впервые предложен и успешно апробирован метод полногеномного ПЦР-анализа последовательностей генов семейств PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C. Показана возможность его применения для растительных изолятов рода Solanum, включая представителей различных секций, в частности Petota. Установлены последовательности ряда новых генов PKPI трех структурных групп PKPI-А, PKPI-В и PKPI-С, кодирующих ингибиторы протеиназ типа Кунитца в геноме картофеля сорта Истринский. Впервые установлены последовательности генов, кодирующих в геноме неклубненосного S. brevidens (Phill.) белки-ингибиторы протеиназ типа Кунитца, гомологичные белкам PKPI-А и PKPI-B из культурного картофеля. Эти гены обозначены Spls-KPI. Путем сравнительного анализа выделенных нуклеотидных последовательностей генов, а также известных по данным литературы, показано, что различия между последовательностями генов PKPI S. brevidens и S. tuberosum незначительны, а последовательности некоторых генов Spls-KPI и PKPI практически идентичны и 5 кодируют полностью идентичные по структуре белки. Установлено, что нуклеотидные последовательности генов PKPI состоят из мозаично расположенных блоков, характер локализации которых позволяет предположить, что в растениях семейства пасленовых (Solanaceae) гены PKPI подвергаются рекомбинации, которая и обусловливает природную вариабельность структуры генов, кодирующих белки PKPI в картофеле. В нуклеотидных последовательностях генов PKPI выявлены консервативные и вариабельные области. На основании анализа доступных в литературе и определенных в настоящей работе последовательностей генов предложена модель блочной организации генов PKPI, согласно которой новые гены возникают в результате рекомбинации и обмена блоками, что сочетается со случайным мутагенезом в районе вариабельных зон. Предложенная модель позволяет объяснить факт природной вариабельности структуры генов PKPI в картофеле и других растениях семейства Solanaceae. Разработаны методы экспрессии генов PKPI в E. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделены, очищены и охарактеризованы рекомбинантные белки PKPI-B10 и PKPI-C2, кодируемые в геноме картофеля сорта Истринский генами PKPI-B10 и PKPIC2, а также белки Spls-KPI-B1, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемые соответствующими генами в геноме S. brevidens. Показано, что рекомбинантные белки не действовали на протеиназу К, HLE и папаин, но были способны с разной степенью эффективности подавлять активность трипсина, химотрипсина и субтилизина Карлсберг. Показано, что рекомбинантный белок PKPI-B10 способен подавлять рост и развитие фитопатогенного гриба Fusarium culmorum. Сделано заключение о возможности использования выделенных генов, кодирующих исследованные белки, для создания трансгенных растений, устойчивых к действию фитопатогенным микроорганизмов. Апробация работы и публикации: Основные результаты работы были представлены на III, IV и V Международных конференциях «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Белоруссия, Минск, 2003, 2005, 2007); Международной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология" (Белоруссия, Минск, 2004); Конгрессе общества SISV-SIGA (Италия, Лечче, 2004); XVI и XVII Зимних молодежных научных школах биотехнологии" "Перспективные (Москва, 2004, направления 2005); физико-химической Международной биологии и научно-практической конференции «Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» (Белоруссия, Минск, 2005), 1-ом и 2-ом Международном симпозиуме по геному пасленовых (Нидерланды, Вагенинген, 2004; 6 Италия, Искья, 2005); VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007). По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из которых — 6 статей и 12 тезисов докладов. Структура и объем работы: Диссертация изложена на 190 страницах; содержит 39 рисунков и 7 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 284 наименования. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Характеристика генов, кодирующих ингибиторы PKPI в геноме картофеля сорта Истринский. В клубнях картофеля сорта Истринский присутствует изоформы белков PKPI, из которых два белка, PSPI-21-5.2 и PSPI-21-6.3 (м. м. 21 кДа), были выделены и подробно охарактеризованы, а два других PSPI-22 и PCPI-23 (м. м. 22 и 23 кДа, соответственно) лишь частично. В настоящей работе проведено клонирование генов PKPI из генома этого сорта картофеля. Для этого были синтезированы праймеры для независимой амплификации генов, относящихся к трем группам PKPI-А, PKPI-В и PKPI-С. Праймеры фланкировали области генов, кодирующие полноразмерные зрелые белки, несущие дополнительно в качестве N-концевого остаток -Asn, С-концевой остаток сигнального пептида. Кроме того, был синтезирован дополнительный праймер, с помощью которого осуществляли амплификацию фрагментов генов PKPI-С (около 450 п.н. при кодирующей области гена 650 п.н.). Методом ПЦР-клонирования геномных генов PKPI с использованием праймеров и выделенного из проростков картофеля сорта Истринский тотального генома был создан мини-банк из 79 независимых последовательностей. Их секвенирование и последующий анализ показали, что они являются амплифицированными копиями 18 генов, из которых шесть были отнесены к структурной группе А (PKPI-A1 – PKPI-A6); четыре – к группе В (PKPI-B1, PKPI-B2, PKPI-B9 и PKPI-B10) и восемь — к группе С (PKPI-С1 – PKPI-С8). Для большинства из перечисленных генов, за исключением двух генов (PKPI-С7 и PKPIС8), были реконструированы последовательности, соответствующие областям, кодирующим полноразмерные зрелые белки. Последовательности PKPI-С7 и PKPI-С8 установлены частично. Кроме того, было показано, что клон С12-9 на >54% отличался от других известных последовательностей PKPI, но на 98% совпадал с уникальной 7 последовательностью кДНК S9С11 [AF460237] из картофеля сорта Saturna, условно отнесенной авторами к группе PKPI-С. Можно предположить, что в геноме картофеля присутствуют гены еще одной группы PKPI-D, кодирующие белки с неизвестными свойствами. Анализ аминокислотной последовательности, восстановленной по нуклеотидной последовательности гена PKPI-B9, позволил определить, что он кодирует одну из изоформ двухцепочечного белка PSPI-21-6.3, выделенного ранее из клубней картофеля сорта Истринский. Аминокислотные последовательности А- и В-цепей этого белка с 1 по 178 и с 185 по 202 а.о., соответственно, и белка, кодируемого геном PKPI-B9, идентичны. Эти данные позволили заключить, что наличие в структуре белка PSPI-21-6.3 двух полипептидных цепей является результатом посттрансляционного протеолиза по пептидным связям Ser178-Thr179 и Phe184–Ser185. Сравнение последовательностей выделенных нами генов и других PKPI, представленных в базе данных NCBI, показало, что большинство генов группы А и все гены группы В из картофеля сорта Истринский либо полностью совпадали с генами из других сортов картофеля (PKPI-А1, PKPI-А3, PKPI-А4, PKPI-А6 и PKPI-В9) либо различались единичными заменами (PKPI-А2, PKPI-B1, PKPI-B2, PKPI-B10). При этом оказалось, что единственный ген PKPI-A5, имеющий меньшее сходство (95%) с генами из других сортов картофеля, отличался только по одному нуклеотиду от последовательности кДНК Cdi [AF283464], выделенной из паслена черного (S. nigrum L.), растения другого вида того же рода. Проведенный сравнительный анализ последовательностей PKPI-А и -В из различных сортов картофеля показал, что большинство из них высоко гомологичны. Последовательности генов PKPI-С из картофеля сорта Истринский значительно отличались от известных последовательностей той же группы, выделенной из других сортов. Было показано, что последовательности трех генов (PKPI-C5, PKPI-C6, PKPI-C8) и ряда генов из других сортов различались лишь единичными заменами, гены PKPI-C1, PKPI-C2, PKPI-C3, PKPI-C4 и PKPI-C7 имели существенно меньшее сходство (89-95%) с известными последовательностями PKPI-С. Таким образом, можно предположить, что скорость эволюции генов PKPI не столь высока, как это предполагалось ранее. Возможно, существующее их многообразие создано ограниченным числом предковых форм, общих для рода Solanum. При этом, разнообразие сочетаний этих генов в геномах картофеля современных сортов можно объяснить сложным происхождением культурного картофеля в результате скрещивания 8 нескольких южноамериканских видов и форм картофеля с привлечением в процессе селекции различных диких видов. 2. Характеристика генов, кодирующих ингибиторы PKPI в геноме Solanum brevidens. Для проверки гипотезы, согласно которой в геноме диких некультивируемых видах Solanum, филогенетически близких к культурному картофелю, содержатся гены идентичные или близкие по структуре генам PKPI, были клонированы гены, кодирующие белки того же подсемейства из генома неклубненосного вида S. brevidens. Клонирование проводили с помощью праймеров, разработанных для амплификации генов PKPI-A и PKPI-B из культурного картофеля. Был создан мини-банк из 66 индивидуальных клонов. Определенные путем секвенирования нуклеотидные проанализированы. При этом последовательности были полученных реконструированы клонов были последовательности 11 оригинальных генов, соответствующие областям, кодирующим полноразмерные зрелые белки PKPI. Гены обозначены как Spls-KPI. Из этих генов шесть относятся к структурной группе А (Spls-KPI-A1 – Spls-KPI-A6) и пять – к группе В (Spls-KPI-B1 – Spls-KPI-B5). Сравнение последовательностей генов Spls-KPI и PKPI, выделенных в настоящей работе, а также представленных в базе данных NCBI, показало, что только два гена группы А (Spls-KPI-A1 и Spls-KPI-A3) и два гена группы В (Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B3) характеризовались относительно невысоким (96-97% идентичных нуклеотидов) сходством с известными последовательностями PKPI-A и PKPI-B из картофеля. Такой же уровень межсортовой вариабельности можно было наблюдать при сравнении последовательностей PKPI-А и -В из разных сортов картофеля. В то же время, последовательность гена Spls-KPI-A4 была идентичной некоторым последовательностям PKPI-А из картофеля сортов Истринский и Kuras, а гены Spls-KPIA2, Spls-KPI-A5, Spls-KPI-A6, Spls-KPI-B1, Spls-KPI-B3 и Spls-KPI-B5 отличались от PKPIА и PKPI-В лишь отдельными нуклеотидными заменами, по характеру и локализации совпадавшими с заменами, отмеченными при сравнении последовательностей PKPI из разных сортов картофеля. Наличие практически идентичных генов в растениях sect. Petota ser. Potatoe (S. tuberosum), sect. Petota ser. Etuberosa (S. brevidens) и sect. Solanum (S. nigrum), относящихся как к различным сериям Potatoe и Etuberosa секции Petota, так и к разным секциям Petota и Solanum [согласно классификации рода Solanum, приведенной в базе 9 данных GRIN: http: //www.ars-grin.gov] свидетельствует, скорее, об относительной консервативности генов PKPI в геномах растений рода Solanum. Эти наблюдения подтверждаются и филогенетическим анализом полноразмерных последовательностей генов, кодирующих белки PKPI из картофеля разных сортов, который проводили стандартными методами молекулярно-генетического анализа (максимальной парсимонии, UPGMA). Оказалось, что последовательности генов и кДНК, обнаруженные в разных сортах картофеля и S. brevidens, распределялись по кластерам случайным образом и не образовывали видо- или сортоспецифичных кластеров. 3. Рекомбинация генов, кодирующих ингибиторы PKPI в растениях рода Solanum. Анализ расположения несинонимичных нуклеотидных замен, которыми отличаются между собой гены PKPI, входящие в состав какой-либо группы, показал, что они часто возникают в одних и тех же позициях и имеют неслучайный характер. Был проведен детальный анализ последовательностей генов PKPI-В и кодируемых ими аминокислотных последовательностей. Характер расположения замен аминокислотных остатков позволил выделить в последовательностях белков PKPI-В консервативные и вариабельные участки (рис. 1). Дальнейший анализ восстановленной структуры белков показал, что некоторые из выделенных вариабельных участков соответствуют областям, включающим реактивные центры. При этом остатки, функциональная значимость которых была ранее показана экспериментально, за редкими исключениями остаются строго консервативными,. Рис. 1. Схема распределения консервативных (Cons, обозначены белым цветом) и вариабельных (Var, обозначены серым или темно-серым цветом, в зависимости от числа аминокислотных замен) участков в молекулах белков PKPI-B. Числами отмечены положения аминокислотных остатков в последовательности белков; R и M – остатки, входящие в состав реактивных центров (Arg68, Met116, Met153); дисульфидные связи Cys49–Cys98 и Cys147–Cys164 обозначены одной и двумя звездочками соответственно 10 Анализ фрагментов нуклеотидных последовательностей PKPI-В, соответствующих вариабельным участкам, показал, что для каждого участка существует ограниченное число возможных вариантов несинонимичных замен. На дендрограммах сравнения, построенных отдельно для каждого из этих участков, выделялись четкие кластеры, число которых соответствовало количеству возможных вариантов нуклеотидных замен. В то же время наблюдалось очевидное несоответствие результатов распределения по кластерам фрагментов последовательностей PKPI, соответствующих разным вариабельным участкам. Это дало основание предположить, что особенности структуры генов PKPI могут объясняться их происхождением в результате рекомбинации предковых форм генов. Рис. 2. Схема распределения гомологичных участков в аминокислотных последовательностях, кодируемых генами PKPI-В из картофеля сорта Истринский и Provita [Heibges et al., 2003] и генами Spls-KPI-В из S. brevidens PKPI-В1, PKPI-B2, PKPI-B9 и PKPI-B10 из картофеля сорта Истринский; P1D4, P1G7, P1H5, P2F10, P2G2, P4D11, P4B1 из картофеля сорта Provita [Heibges et al., 2003]: SplsKPI-B1, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4 из S. brevidens. Гомологичные участки последовательностей обозначены серым цветом различной интенсивности. Цифрами указано положение точек рекомбинации. Пунктирной линией обозначены участки последовательностей, анализ которых не проводили. 11 С помощью программного обеспечения DnaSP 4.0, TOPALi v0.28 и TOPALi v2.19 был проведен поиск в нуклеотидных последовательностях PKPI-B областей, содержащих сайты рекомбинации. Полученные результаты позволили определить в последовательностях PKPI-В области, по которым, вероятно, происходила рекомбинация генов: 1) область 135 н.п. (соответствует положению 45 а.о в белках PKPI); 2) область 170 н.п. (соответствует положению 57 а.о.); 3) область 230 н.п. (соответствует положению77 а.о.); 4) область 355 н.п. (соответствует положению 118 а.о.) и 5) область 415 н.п. (соответствует положению139 а.о.). Проведенный повторный анализ нуклеотидных и кодируемых генами PKPI-B аминокислотных последовательностей с учетом полученных данных о локализации сайтов рекомбинации, позволил определить сходство фрагментов, ограниченных положением установленных точек рекомбинации (рис. 2). 4. Свойства белков, кодируемых генами PKPI-B10 и PKPI-С2 из Solanum tuberosum сорта Истринский и генами Spls-KPI группы В из Solanum brevidens. Для проверки функциональной активности белков, кодируемых некоторыми из клонированных генов, была осуществлена их экспрессия в культуре клеток E. coli (штамм BL21(DE3)). 4.1. Гетерологичная экспрессия, очистка и характеристика белка PKPI-B10 Рекомбинантная плазмида для осуществления гетерологичной экспрессии белка PKPI-B10, была создана на основе экспрессионного вектора pET23. Продукт экспрессии, представляющий собой рекомбинантный белок PKPI-B10, был обнаружен в основном в тельцах включения и в меньшем количестве — в растворимой фракции клеточных белков E. coli. М. м. полученного белка имела значение около 22 кДа и совпадала с расчетной величиной, составлявшей 21,7 кДа. В клетках контрольных бактерий, трансформированных вектором pET23, не содержащим вставки, белковый продукт с такой м. м. отсутствовал. Нерастворимая фракция с тельцами включения E. coli была солюбилизирована в денатурирующем буфере. Проведенные эксперименты показали, что ренатурация белка PKPI-B10 из полученного раствора, содержащего небелковые примеси, приводит к крайне низкому выходу целевого продукта. В связи с этим денатурированные тельца 12 включения были очищены от белковых и небелковых примесей на колонке (2,5×30 см) с Mono Q, уравновешенным 0,05 М трис-HCl-буфером, pH 8,0, содержащем 7 М мочевину. Связавшийся с сорбентом материал элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере. Полученный белок был практически отделен от примесей, содержавшихся в клеточном лизате E. coli. Было установлено, что фолдинг PKPI-B10 протекает с высокой эффективностью, как при быстром разбавлении денатурирующего раствора, так и при диализе. Основная масса белка была ренатурирована путем диализа против 0,05 M трис-НСl-буфера, pH 8,0. Методом анионообменной FPLC-хроматографии на DEAE-ToyoPearl ренатурированный PKPI-B10 дополнительно очищали до гомогенности. Связавшийся с ионообменником белок элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М. Полученный белок PKPI-B10 по данным DS-Na-ПААГ электрофореза был гомогенным (рис. 3А). Активность очищенного белка оценивали по степени подавления активности ферментов (трипсина, химотрипсина, HLE, субтилизина Карлсберг, протеиназы К и папаина) и по влиянию на рост и развитие фитопатогенного гриба Fusarium culmorum. Было показано, что рекомбинантный белок PKPI-B10 не действовал на HLE, субтилизин Карлсберг и протеиназу К, но эффективно подавлял активность трипсина и в меньшей степени химотрипсина (рис. 3Б): 1 моль PKPI-B10 реагировал стехиометрически с 1 молем трипсина. В то же время зависимость степени ингибирования химотрипсина от количества добавленного белка PKPI-B10 имела нестехиометрический характер: для достижения 50%-ного ингибирования требовался более чем трехкратный избыток ингибитора. Белок PKPI-B10 не только подавлял прорастание гиф, но и ускорял разрушение макроконидий гриба F. culmorum, являющегося возбудителем фузариозного увядания картофеля [Попкова и др., 1980] (рис. 4). При добавлении к суспензии макроконидий гриба 160 мкг белка PKPI-B10 длина прорастающих гиф уменьшалась на 50% по сравнению с контролем, а при добавлении 500 мкг обнаруживалось практически полное подавление прорастания макроконидий (кривая 1), которые при этом полностью разрушались (кривая 2). 13 Рис. 3. Ds-Na-ПААГ-электрофорез очищенного рекомбинантного белка PKPI-B10 (А) и его влияние на активность трипсина и химотрипсина (Б) А: 1 – Белок PKPI-B10, 2 – белки-маркеры (сверху вниз): β-галактозидаза, БСА, яичный альбумин, лактатдегидрогеназа, эндонуклеаза BSP981, β-лактоглобулин Б: 1 – химотрипсин, 2 – трипсин. В качестве субстратов для определения ферментативной активности использовали Suc-Gly-Gly-Phe-pNa (1) и БАПА (2) Рис. 4. Влияние рекомбинантного белка PKPI-B10 на прорастание гиф и лизис макроконидий гриба Fusarium culmorum 1 – размер гиф (% от контроля), 2 – количество лизированных конидий (% поврежденных); представлены средние значения трех независимых экспериментов со стандартной ошибкой от 2 до 10%. 4.2. Гетерологичная экспрессия, очистка и характеристика белка PKPI-С2 Рекомбинантная плазмида для осуществления гетерологичной экспрессии белка PKPI-С2 была создана на основе экспрессионного вектора pQE30, содержащего 6xHis-таг на 5'-конце полилинкера. 14 Ожидаемый продукт экспрессии с м. м. около 22 кДа, близкой к расчетной величине 21,2 кДа для белка PKPI-С2, был обнаружен в тельцах включения, но в основном в растворимой фракции клеточных белков E. coli. В клетках контрольных бактерий, трансформированных вектором pQE30, не содержащим вставки, белковый продукт аналогичный PKPI-C2 отсутствовал. Очистку нативно фолдировавшегося рекомбинантного белка PKPI-C2, содержащегося в растворимой клеточной фракции, проводили методом металло-хелатной аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-агарозой. Полученные препараты анализировали с помощью DS-Na-ПААГ-электрофореза (рис. 5А). Активность рекомбинантного белка оценивали по подавлению активности субтилизина Карлсберг, трипсина, химотрипсина и папаина. Было показано, что рекомбинантный белок PKPI-C2 не действовал на трипсин, химотрипсин и папаин, но подавлял активность субтилизина (рис. 5Б). Однако зависимость степени ингибирования фермента от количества добавленного белка имела нестехиометрический характер: для достижения 50%-ного ингибирования требовался двухкратный избыток ингибитора. Из клубней картофеля сорта Истринский был выделен и очищен до гомогенного состояния белок PKSI, м. м. которого имела значение около 21 кДа (рис. 5В). Было показано, что белок PKSI не действовал на трипсин, химотрипсин и папаин, однако эффективно подавлял активность субтилизина Карлсберг (Ki=1,67±0,2 нМ). Белок PKSI взаимодействовал с ферментом стехиометрически в соотношении 1:1 (моль/моль) (рис. 5Г). Методом деградации по Эдману была определена N-концевая последовательность белка, состоящая из 19 аминокислотных остатков, которая совпала с фрагментом последовательности, кодируемой одним из изученных генов группы С. Ранее в работах нашей лаборатории было показано, что патогенный оомицет Phytophtora infestans (Mont.) de Bary при выращивании на среде, содержащей белки из клубней картофеля, продуцирует комплекс сериновых протеиназ с субтилизиноподобной активностью [Гвоздева и др., 2004]. Кроме того, было установлено, что в клубнях картофеля в ответ на поражение P. infestans накапливались белки с м. м. около 20-24 кДа [Valueva et al., 1998; Валуева и др., 2003]. Можно предположить, что белки, кодируемые генами PKPI-C, принимают активное участие в защите картофеля от патогена. 15 Рис. 5. Ds-Na-ПААГ-электрофорез рекомбинантного белка PKPI-С2 (А) и выделенного из клубней белка PKSI (В) и их влияние на активность субтилизина Карлсберг (Б и Г, соответственно). A: 1 – белки-маркеры, 2 – белки, не связавшиеся с Ni-NTA-агарозой, после нанесения на колонку растворимой клеточной фракции Е. coli, 3 – элюат, содержащий рекомбинантный белок PKPI-С2. Б: влияние на активность субтилизина белка PKPI-C2. В: 1 – белки-маркеры, 2 – белок PKSI. Г: влияние на активность субтилизина белка PKSI. В качестве субстрата для определения ферментативной активности использовали Z-AlaAla-Leu-pNa. 4.3. Гетерологичная экспрессия, очистка и характеристика белков, кодируемых генами Spls-KPI-B из S. brevidens Для проведения гетерологичной экспрессии белков Spls-KPI-B1, Spls-KPI-B2, SplsKPI-B3, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемых соответствующими генами из S. brevidens, были созданы экспрессионные плазмиды на основе вектора pQE30. Использованные для этой цели клоны двух генов Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B3 содержали несинонимичные замены по сравнению с последовательностями оригинальных генов. В результате рекомбинантный белок Spls-KPI-B1 содержал одну замену Thr13→Ala13, а белок Spls-KPI-B3 — две замены: Ser4→Gly4 и Lys133→Arg133. Аминокислотные последовательности белков Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5 полностью соответствовали белкам, кодируемым оригинальными генами. После экспрессии в клетки E. coli белковые продукты с м.м. около 26 кДа, отсутствовавшие у контрольных бактерий, трансформированных вектором pQE30, не содержащим вставки, были обнаружены и в растворимой фракции клеточных белков, и в тельцах включения. Очистку белков растворимой фракции, проводили методом металло16 хелатной аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-агарозой. Полученные белки анализировали DS-Na-ПААГ-электрофорезом (рис. 6). Как видно на рис. 6А в препаратах Spls-KPI-B1 (2) и Spls-KPI-B4 (5) наряду с целевыми белками присутствовали примеси, поэтому они были дополнительно очищены методом анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Гомогенность белков Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B4 была подтверждена DS-Na-ПААГ-электрофорезом (рис. 6Б). Рис. 6. Ds-Na-ПААГ-электрофорез рекомбинантных белков Spls-KPI-B после очистки на колонке с Ni-NTA-агарозой (А) и белков Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B4 после анионообменной хроматографии (Б). А: 1 – белки-маркеры; 2 - Spls-KPI-B1; 3 - Spls-KPI-B2; 4 - Spls-KPI-B3; 5 - Spls-KPI-B4; 6 - Spls-KPI-B5 Б: 1 – белки-маркеры; 2 - Spls-KPI-B1; 3 - Spls-KPI-B4 Активность рекомбинантных белков Spls-KPI-B оценивали по степени подавления активности трипсина, химотрипсина, HLE и папаина. Было установлено, что все пять белков не действовали на HLE и папаин, хотя с разной степенью эффективности ингибировали трипсин (таблица). Два из пяти рекомбинантных белков, Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B4, эффективно подавляли и активность химотрипсина. При эквимолярном соотношении фермент:ингибитор достигалось подавление 50% активности фермента (рис. 7). Таблица. Ингибирование трипсина белками Spls-KPI-B Белок Spls-KPI-B1 Spls-KPI-B2 Spls-KPI-B3 Spls-KPI-B4 Spls-KPI-B5 Концентрация BANA, мМ 0,125 0,25 0,125 0,25 0,125 0,25 0,125 0,25 0,125 0,25 Ki (нМ) 345,5 1310,6 8370 84,8 3883,5 17 Рис. 7. Влияние белков Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B4 на активность химотрипсина 1 – Spls-KPI-B1, 2 – Spls-KPI-B4. В качестве субстратов для определения ферментативной активности использовали N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa. Сравнение аминокислотных последовательностей полученных рекомбинантных белков и известных поданным литературы белков PKPI, для которых установлены как аминокислотные последовательности, так и их действие на сериновые протеиназы приведено на (рис. 8). Все представленные белки способны подавлять активность трипсина, но различаются по способности действовать на химотрипсин. Белки PKPI являются так называемыми «каноническими» ингибиторами сериновых протеиназ и взаимодействуют с ферментами по субстратоподобному механизму. Молекулы ингибиторов этого типа имеют на поверхности специфическую структуру – «петлю связывания», в которой располагается пептидная связь P1-P1', образующая реактивный центр ингибитора. Действительно, как видно из данных представленных на рис. 8, в аминокислотных последовательностях всех ингибиторов PKPI-B присутствует консервативный участок, окружающий пептидную связь Arg68−Phe69, который заключен в пептидную петлю, образованную остатками Cys49−Cys98. Этот участок молекулы ингибитора представляет собой первый реактивный центр и ответственен за связывание трипсина. Тем не менее, следует обратить внимание на то, что белок Spls-KPI-B2 оказался способен связываться с трипсином (табл.), несмотря на то, что в положении P1 остаток Arg68 замещен на Ser68. Кроме того, в этом белке присутствует замена аминокислотного остатка в положении P3’ и значительная делеция, которая могла бы вызывать нарушение структуры петли связывания. Можно предположить, что ингибирование трипсина белками PKPI может протекать и по другому не субстратоподобному механизму. В опубликованной ранее работе [Valueva et al., 2000] было сделано заключение, что в молекуле двухцепочечного белка PSPI-21-6.3 пептидная связь между аминокислотными остатками Met116−Leu117 входит в состав второго реактивного 18 центра, ответственного за связывание химотрипсина. Было предположено, что дисульфидная связь между остатками Cys147−Cys164, соединяющая А- и Б-цепи PSPI21-6.3, формирует «каноническую» петлю связывания, в которой располагается пептидная связь реактивного центра связывания химотрипсина (HLE), Met116−Leu117. В то же время у белков Spls-KPI-B2 и Spls-KPI-B3, в структуре которых «каноническая петля» могла бы сформироваться между остатками Cys147 и Cys164 и содержать второй потенциальный реактивный центр связывания химотрипсина, в положении P1–P1' которого локализованы остатки Met153−Thr154, не было обнаружено антихимотрипсиновой активности. В отличие от них белок P1H5, обладающий такими же структурными особенностями, действует как эффективный ингибитор химотрипсина. Белок Spls-KPI-B5, аминокислотная последовательность которого, за исключением N-концевых областей, кодируемых последовательностями нуклеотидов, представляющих фрагменты экспрессионных векторов pET23 и pQE30, совпадает с последовательностью рекомбинантного белка PKPI-B10, также не проявлял способности действовать на химотрипсин. В то время как белок PKPI-B10 был способен нестехиометрически взаимодействовать с этим ферментом. Можно предположить, что белки PKPI-B способны слабо нестехиометрически связывать химотрипсин и по трипсинсвязывающему реактивному центру. Возможность такого рода взаимодействия с протеиназой может легко устраняться либо за счет модификации структуры участков молекулы, не связанных прямо с реактивным центром (как в случае с Spls-KPI-B3 и Spls-KPI-B5), либо за счет мутаций в реактивном центре (замена Arg68−Ser68 в Spls-KPI-B2). Наличие антихимотрипсиновой активности у белка Spls-KPI-B4, в структуре которого в положении P1 предполагаемого второго реактивного центра связывания фермента остаток Met153 заменен на Val153, и отсутствие такой активности у белков Spls-KPI-B2 и Spls-KPI-B3, в структуре которых в P1–P1' положении локализованы остатки Met153−Thr154, свидетельствует о том, что этот остаток не может быть локализован в реактивном центре и участвовать во взаимодействии белков PKPI с химотрипсином. 19 Рис. 8. Сравнение полных аминокислотных последовательностей зрелых белков PKPI-B-ингибиторов трипсина и химотрипсина PKPI-B10, Spls-KPI-B1, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4, Spls-KPI-B5 [в настоящей работе]; PSPI-21-6.3. [Valueva et al., 2000]; P1D4, P1H5, P4B1 [Heibges et al., 2003]. Различающиеся аминокислотные остатки окрашены серым цветом различной интенсивности. Реакционные центры обозначены стрелками. Остатки Cys выделены черным цветом. Дисульфидные связи (Cys49-Cys98 и Cys147- Cys164) обозначены * и **, соответственно. Синим шрифтом показаны последовательности тех белков, которые действуют как ингибиторы химотрипсина. Зеленым цветом обозначена последовательность, кодируемая в белке PKPI-B10 фрагментом полилинкера pET23а. Красным цветом – последовательность, кодируемая в белке Spls-KPI-B5 фрагментом полилинкера pQE30. Оранжевым — последовательность глутатион-S-трансферазного тага (GST) в белках P1D4, P1H5 и P4B1. Последовательность полигистидинового тага (6хHis) подчеркнута одиночной линией; праймера PKPI-B1 - двойной. 20 ВЫВОДЫ: 1. Установлены последовательности 16 генов PKPI, кодирующих в геноме картофеля сорта Истринский ингибиторы протеиназ типа Кунитца. Из них 6 генов кодируют белки PKPI-А, 4 – PKPI-В и 6 – PKPI-С. Частично определены последовательности еще двух генов, кодирующих белки PKPI-С. 2. Установлены последовательности 11 генов Spls-KPI, кодирующих ингибиторы протеиназ типа Кунитца в геноме неклубненосного картофеля (Solanum brevidens Phill.), из них 6 — кодируют белки группы А и 5 — белки группы В. Показано значительное сходство некоторых генов Spls-KPI из S. brevidens и PKPI групп А и В из различных сортов картофеля. 3. Получен рекомбинантный белок PKPI-B10, кодируемый геном PKPI-B10 из генома картофеля сорта Истринский. Показано, что белок PKPI-B10 эффективно подавляет активность трипсина и значительно слабее химотрипсина, но не действует на эластазу из лейкоцитов человека, субтилизин Карлсберг, протеиназу К и папаин. Белок PKPI-10 подавлял также рост и развитие фитопатогенноого гриба Fusarium culmorum. 4. Получен рекомбинантный белок PKPI-С2, кодируемый геном PKPI-C2 из генома картофеля сорта Истринский. Установлено, что белок PKPI-С2 является специфическим ингибитором субтилизина Карлсберг. Белок не действует на трипсин, химотрипсин и папаин. 5. Получены рекомбинантные белки Spls-KPI-B1, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls- KPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемые соответствующими генами из генома S. brevidens. Показано, что все рекомбинантные белки с разной степенью эффективности ингибировали трипсин и не действовали на эластазу из лейкоцитов человека и папаин. Два из них — Spls-KPI-B1 и Spls-KPI-B4 — подавляли активность химотрипсина. 6. Установлено, что нуклеотидные последовательности генов PKPI содержат мозаично расположенные блоки. Полученные данные позволяют предположить, что в процессе эволюции вследствие рекомбинации кодирующие области генов PKPI растений семейства пасленовых (Solanaceae) подвергаются перестройкам, что приводит к вариабельности их структуры и, как следствие, к изменению функции кодируемых белков. 21 Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Сперанская А.С., Дорохин А.В., Новикова С.И., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Клонирование последовательности, кодирующей ингибитор SKTI из картофеля // Генетика. 2003. Т. 39. № 10. С. 1490–1497. 2. Ревина Т.А., Сперанская А.С., Кладницкая Г.В., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Белокингибитор субтилизина из клубней картофеля // Биохимия. 2004. Т. 69 № 10. С. 13451352. 3. Сперанская А.С., Криницына А.А., Полтрониери П., Фазано П., Сантино А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца группы В из картофеля: молекулярное клонирование генов // Биохимия. 2005. Т. 70. № 3. С. 360369. 4. Сперанская А.С., Криницына А.А., Ревина Т.А., Герасимова Н.Г., Керученько Я.С., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гетерологичная экспрессия, очистка и свойства белкаингибитора сериновых протеиназ из картофеля. // Биохимия. 2006. Т. 71. № 11. С. 1451-1458. 5. Speransky A.S., Cimaglia F., Krinitsina A.A., Poltronieri P., Fasano P., Bogacheva A.M., Valueva T.A., Halterman D., Shevelev A.B., Santino A. Kunitz-type protease inhibitors group B from Solanum palustre // Biotechnol. J. 2007 V. 2. № 11. P. 1417-1424. 6. Валуева Т.А., Сперанская А.С., Ревина Т.А., Шевелев А.Б. Молекулярное клонирование и экспрессия генов ингибиторов протеиназ типа Кунитца группы С из картофеля // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. № 3. С. 344-359. 7. Сперанская А.С., Дорохин А.В., Кузнецова Т.В., Хоменков В.Г., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы сериновых протеиназ типа Кунитца из картофеля сорта Истринский / III Международная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Республика Беларусь. Минск. 2003.С. 265 8. Сперанская А.С., Криницына А.А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля сорта Истринский / Тез. XVI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2004. С. 41. 9. Сперанская А.С., Криницына А.А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Три группы генов, кодирующих ингибиторы протеиназ Кунитца из картофеля S. tuberosum / Материалы международной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология". Республика Беларусь. Минск. 2004. С. 347-348. 22 10. Speransky A.S., Krinitsina A.A., Fasano P., Poltronieri P., Valueva T.A., Shevelev A.B., Santino A. Class A Kunitz-type proteinase inhibitor genes polymorphism in Solanum genus / SISV-SIGA joint congress. Italy. Lecce. 2004. Р. 71-72. 11. Speransky A.S., Krinitsina A.A., Poltronieri P., Santino A., Protzenko M.A., Bogacheva A.M., Valueva T.A., Shevelev A.B. Cloning of the Genes encoding for class A and class B Kunitz-type proteinase inhibitor (PKPI) in S. tuberosum cv. Istrinskii, and comparison with related genes cloned in S. brevidens, S. stoloniferum and S. andigenum / 1'st Solanaceae Genome Workshop. Netherlands. Wageningen. 2004. Р. 93. 12. Speransky A.S., Krinitsina A.A., Revina T.A., Poltronieri P., Santino A., Shevelev A.B., Valueva T.A. Cloning the genes encoding for Kunitz-type proteinase inhibitors group C from potato. // FEBS Journal. 2005 V. 272. S. 1. P. 176-176 13. Сперанская А.С., Криницына А.А., Стеганова О.А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гены ингибитора протеиназ типа Кунитца группы С из картофеля // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» Республика Беларусь. Минск. 2005. С. 248-253. 14. Speransky A, Krinitsina A, Shevelev A, Domogatsky S, Valueva T, Poltronieri P, Cimaglia F, Santino A Characterization of genes coding for class A, class B and class C Kunitz-type proteinase inhibitors (PKPI) and their protein products in S. tuberosum and in S. brevidens / 2-d Solanaceae Genome Workshop. Italy. Ischia. 2005. Р. 183. 15. Сперанская А.С., Криницына А.А., Полтрониери П., Сантино А., Шевелев Б.И., Ольшанский А.Я., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Дифференциальная детекция экспрессии генов ингибиторов протеиназ типа Кунитца в различных структурных группах у растений рода Solanum / IV международная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Республика Беларусь. Минск. 2005. С. 219. 16. Сперанская А.С., Криницына А.А., Стеганова О.А., Полтрониери П., Сантино А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гены ингибиторов протеиназ типа Кунитца из Solanum brevidens и Solanum tuberosum / Тез. XVII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2005. С. 63. 17. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Кудрявцева Н.Н., Сперанская А.С. Молекулярное клонирование и экспрессия генов ингибиторов протеиназ типа Кунитца из картофеля / V международная научная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Белоруссия. Минск. 2007. С. 2. 23 18. Ревина Т.А., Кладницкая Г.В., Сперанская А.С., Валуева Т.А. Специфический ингибитор субтилизина типа Кунитца из клубней картофеля / VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С. 111. 24
