Вестник Башкирского университета.2006.№3 раздел БИОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА УДК 581:635.21:632.7 ББК 28.5:42.15:44.6

Вестник Башкирского университета.2006.№3
49
раздел БИОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА
УДК 581:635.21:632.7
ББК 28.5:42.15:44.6
ПОДАВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
ЛИЧИНОК КОЛОРАДСКОГО ЖУКА РАСТИТЕЛЬНЫМИ БЕЛКАМИ
Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И., Умаров И.А.
Из личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata, выделены
гидролитические ферменты, протеиназы и α-амилаза. Изучена протеолитическая
активность на разных субстратах и взаимодействие с белками – ингибиторами
гидролаз из растений различных видов. Приводятся данные о содержании
ингибиторов протеиназ в вегетативных органах картофеля Solanum tuberosum.
Показана связь между устойчивостью растений к вредителям и содержанием в
них белков – ингибиторов протеиназ.
Колорадский жук является основным вредителем посадок картофеля во многих странах. Для регуляции его
численности используются в основном, химические средства защиты, которые обладают побочным вредным
эффектом воздействия на природные экосистемы [1]. В связи с этим, является актуальным исследования
теоретических и практических аспектов взаимоотношений растений и насекомых - для разработки новых,
экологически безопасных способов защиты растений от вредителей.
В комплексе свойств, определяющих степень агрессивности и вирулентности фитопатогенов и вредителей,
существенная роль принадлежит их гидролитическим ферментам, при помощи которых вредные организмы,
перерабатывая ткани растения хозяина, обеспечивают себе условия для роста и дальнейшего развития [2].
Другой стороной этих взаимодействий являются особенности кормового растения, выражающиеся в различных
факторах, препятствующих действию гидролаз на растительные ткани. Среди них особое значение имеют
белки-ингибиторы, которые присутствуют в семенах и вегетативных органах растений многих семейств:
пасленовых, злаковых, бобовых и др.[3]. Эти молекулы способны инактивировать гидролазы чужеродных
организмов, что является одним из факторов устойчивости растений.
Несмотря на то, что исследования взаимодействия ферментов насекомых и природных ингибиторов
ведутся уже долгое время, роль ингибиторов как факторов иммунитета остается невыясненной. Очевидно, что
для получения целостных представлений о физиологической роли этих молекул необходимы исследования как
самих растительных ингибиторов, так и ферментов насекомых, на которые направлено их действие [4].
Целью нашей работы было изучение действия белков-ингибиторов из вегетативных органов растений на
активность протеиназ и α- амилаз личинок колорадского жука.
МЕТОДИКА
Объектами служили личинки колорадского жука (далее ЛКЖ) размером 6-8 мм; клубни, ростки до 1см,
листья и стебли, сортов картофеля Романо, Удача, Невский, Луговской, Снегирь, листья и плоды растений
различных видов.
Гидролитические ферменты выделяли из ЛКЖ, ингибиторы гидролаз – из растительных тканей, в качестве
экстрагента использовали дистиллированную воду, подробное описание методики выделения приведено в
публикациях [2;5]. В экстрактах ЛКЖ определяли протеолитическую, амилазную активность методам
агарозных пластин [6] для определения активности протеиназ, гидролизующих N,α-бензоил-DL-аргинин-4нитроанилид (БАПНА) использовали метод Эрлангера [7]. Содержание белка определяли по методу Бредфорд
[8]. Статистическую обработку проводили в программе Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что в тканях личинок колорадского жука функционирует комплекс гидролитических ферментов
[9], в связи с этим нами исследовалась способность протеиназ колорадского жука к гидролизу различных
субстратов.
Выделенные ферменты оказались способными гидролизовать различные белки (казеин, гемоглобин,
желатин, яичный белок).
За единицу активности (ПЕ) принимали такое количество фермента, которое гидролизовало 1 мм2
субстрата.
Высокую активность эти протеиназы проявляли к желатину, гемоглобину, яичному белку. Как видно,
активность протеиназ ЛКЖ по отношению к различным субстратам определяется сопоставимо с уровнем
активности высокоочищенных коммерческих препаратов ферментов. Так, активность ЛКЖ по отношению к
желатине составляет 32 % от активности проназы E (протеиназы актиномицетов) в концентрации 1 мг/мл
(рис.1).
Интересно отметить, что мукопротеид яичного белка, подавляющий активность трипсина [10], не
ингибировал протеолитическую активность ЛКЖ.
раздел БИОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА
50
П роназа Е
45 0
Т рипс ин
40 0
Э кс тракт Л К Ж
35 0
Sмм2
30 0
25 0
20 0
15 0
10 0
50
0
ж елатин
казеин
гем оглобин
яич ны й белок
Рис.1. Гидролиз белков протеолитическими ферментами
Кроме различных белков, протеиназы ЛКЖ активно гидролизовали синтетический субстрат БАПНА.
Эти факты свидетельствуют о том что, в протеолитическом комплексе личинок содержатся протеиназы
различных типов.
Из литературных источников известно, что у растений ингибиторы протеиназ локализуются в основном в
семенах и других запасающих органах [3;11], в связи с этим нас интересовала активность ингибиторов
протеиназ ЛКЖ и проназы Е из вегетативных органов картофеля, разных сортов. Использовали субстрат
БАПНА, за 1 единицу (Е) активности фермента принимали такое его количество, которое в стандартных
условиях, образует 1µМ п-нитроанилид за 1 мин. За единицу ингибиторной активности (ИЕ) принимали такое
количество ингибитора, которое на 100% подавляет активность 1 единицы фермента.
Как показали наши эксперименты (табл.1,2) вегетативные органы содержат белки – ингибиторы,
подавляющие активность БАПНА- гидролизующих протеиназ. Наибольшей удельной активностью белков ингибиторов БАПНА-аз ЛКЖ обладали стебли, возможно это один из факторов их устойчивости, наименьшей листья картофеля, как известно, самая уязвимая часть при поражении вредителем. Белки картофеля
неодинаково влияют на активность проназы Е и протеиназы колорадского жука. Как видно из табл. 2
вегетативные органы разных сортов картофеля незначительно отличаются активностью ингибиторов проназы,
наибольшей удельной активностью обладают ростки, наименьшей – стебли картофеля
Таблица 1
Активность ингибиторов БАПНА-азы ЛКЖ из вегетативных органах картофеля
Ингибиторы БАПНА-азы ЛКЖ
клубни
ростки
листья
стебли
Сорт
ИЕ/г
мИЕ/мг
ИЕ/г
мИЕ/мг
ИЕ/г
мИЕ/мг
ИЕ/г
мИЕ/мг
массы
белка
массы
белка
массы
белка
массы
белка
Романо
0,22±0,02
0,9±0,06
0,3±0,011
3,3±0,2
0,32±0,01
1,1±0,07
0,41±0,02
4,3±0,31
Удача
0,2±0,03
0,8±0,03
0,33±0,013 3,9±0,31 0,56±0,04
1,9±0,1
0,42±0,02
2,6±0,12
Снегирь
0,3±0,02
1,5±0,12
0,29±0,02 2,4±0,15 0,27±0,02
1,2±0,09
0,56±0,04 4,13±0,36
Луговской 0,33±0,05 1,56±0,11 0,28±0,015 2,5±0,08
0,3±0,011
2,4±0,14
Невский 0,28±0,02 1,09±0,09 0,27±0,018 2,3±0,03 0,37±0,025 1,4±0,11 0,56±0,041 4,13±0,25
- данные отсутствуют
Таблица 2
Активность ингибиторов проназы Е из вегетативных органах картофеля
Ингибиторы проназы Е
клубни
ростки
листья
стебли
Сорт
ИЕ/г массы мИЕ/мг ИЕ/г массы мИЕ/мг
ИЕ/г
мИЕ/мг
ИЕ/г массы
мИЕ/мг
белка
белка
массы
белка
белка
Романо
1,2±0,1 5,01±0,41 0,8±0,01
8,9±0,7
0,84±0,04
2,9±0,2
0,08±0,002
0,8±0,07
Удача
1,04±0,09 4,0±0,37 0,44±0,01 5,14±0,42 0,73±0,06
2,5±0,15
0,4±0,02
2,3±0,15
Снегирь 1,06±0,05 5,3±0,34 0,9±0,03
7,3±0,63
0,8±0,05
3,6±0,28
0,3±0,015
2,2±0,01
Луговской 1,05±0,07 5,01±0,28 0,9±0,03
7,8±0,52
0,7±0,05
2,5±0,16
0,08±0,002
0,6±0,04
Невский 1,05±0,1 4,05±0,36 0,9±0,025 7,2±0,29
0,64±0,03
2,4±0,14
0
0
Следует отметить, что белки из разных частей картофеля неодинаково подавляют активность проназы и
протеиназы ЛКЖ. Еще более наглядно эта закономерность проявляется при анализе средних значений данных
по активности ингибиторов протеиназ из пяти сортов картофеля. На рис.2 представлены средние значения
активности ингибиторов протеиназ: ЛКЖ и проназы Е из клубней, ростков, листьев и стеблей. Из рис.2 видно,
что, к примеру стебли картофеля при наибольшей активности ингибиторов протеиназ ЛКЖ (сравнительно с
другими органами картофеля), характеризуются наименьшей активностью ингибиторов проназы Е.
Вестник Башкирского университета.2006.№3
51
ингибиторы проназы
8
ингибиторы протеиназы ЛКЖ
7
мИЕ/мг белка
6
5
4
3
2
1
0
клубни
ростки
листья
стебли
Рис.2. Активность ингибиторов проназы Е и ингибиторов протеиназы ЛКЖ из картофеля.
Паслёновые
Данные различия - свидетельство высокоспецифичного взаимодействия белка с ферментом, и как
следствие растения и насекомого.
Интересные закономерности обнаруживаются при сравнительном анализе активности белков ингибиторов
протеиназ, из различных частей растений (табл.3)., разных видов.
Таблица 3
Активность белков – ингибиторов протеиназ из различных растений
Ингибиторы проназы Е Ингибиторы протеиназы ЛКЖ Содержание
Объект
Часть
растения ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка белка, мкг/мл
Одуванчик (Taraxacum sp.) листья
1,5±0,21
8,8±0,35
0,36±0,02
2,1±0,14
170
листья
0
0
0,31±0,018
6,2±0,34
50
Тополь (Populus nigra L.)
Морковь
листья
0,85±0,06
4,0±0,28
*
*
215
(Daucus carota)
корнеплод
0
0
*
*
165
ингибитор трипсина из
*
*
*
*
1000
сои (ком. препарат)
Томат
листья
1,2±0,09
4,6±0,36
0,54±0,03
2,1±0,17
260
(Solanum
плоды
0
0
*
*
90
lycopersicum)
Баклажан
листья
1,4±0,12
6,1±0,45
0,22±0,011
0,96±0,05
230
(Solanum melongena)
листья
0,36±0,01
1,6±0,09
0
0
230
Физалис (Physalis
sp.)
Картофель
листья
0,74±0,05
2,8±0,18
0,3±0,019
1,12±0,07
290
(Solanum tuberosum) ростки
0,8±0,03
7,3±0,51
0,3±0,015
2,9±0,22
100
стебли
0,74±0,03
2,8±0,12
0,45±0,03
3,5±0,24
130
клубни
1,08±0,09
4,7±0,41
0,27±0,02
1,2±0,09
220
цветы
0,8±0,03
4,7±0,39
0,28±0,02
1,65±0,06
170
Примечание: *- полное подавление активности ферментов (активность БАПНА-азы ЛКЖ составила - 45,8
мЕ/мл; активность проназы Е – 190 мЕ/мл.
Растения из семейства пасленовых, известные как неустойчивые культуры к колорадскому жуку, обладают
высоким содержанием белков ингибиторов проназы, и напротив, сниженной, по сравнению с растениями
других семейств активностью ингибиторов к протеиназе ЛКЖ.
Белки из плодов томата и корнеплодов моркови подавляют активность протеиназы жука, однако
активность ингибиторов проназы в них не выявлена. По-видимому, низкая активность ингибиторов
микроорганизмов в них обясняет низкую устойчивость к болезням, вызванными бактериями и патогенными
грибами.
Таким образом, ингибиторы протеолитических ферментов, наряду с другими растительными веществами
играют существенную роль в устойчивости растения к насекомым вредителям. Однако активность природных
ингибиторов ферментов не стабильна. Она колеблется в онтогенезе и зависит от условий внешней среды [2].
В табл.4 приведены данные, полученные методом агарозных пластин, по активности гидролаз ЛКЖ
(контроль). Здесь же показано как ингибиторы из вегетативных органов картофеля, разных сортов,
добавленные к экстракту ЛКЖ, в соотношении 1:1, действуют на активность ферментов.
раздел БИОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА
52
За единицу активности ингибитора (ИЕ) принимали такое количество, которое подавляет 1 единицу
активности фермента.
Наши исследования показывают, что в клубнях и стеблях присутствует активность ингибиторов
желатиназы ЛКЖ, в листьях такой активности не обнаружили.
Неочищенный экстракт личинок обладал также, способностью к гидролизу крахмала, т.е. проявлял
амилазную активность. Белки из клубней и стеблей способны незначительно подавлять активность α-амилазы
ЛКЖ. В листьях ингибирующей активности к амилазе не фиксировали (табл.4).
Таблица 4
Активность ингибиторов желатиназы (Иж) и ингибиторов амилазы (Иа) личинок колорадского жука в различных
сортах картофеля
Сорт картофеля
клубни, ИЕ
стебли, ИЕ
листья, ИЕ
Иж
Иа
Иж
Иа
Иж
Иа
Невский
18,1
50,2
16,7
15,1
0
0
Удача
Луговской
Рамона
18,1
34,5
34,5
40
40
34,3
18
12
18
28,3
14,8
18,2
0
0
0
0
0
0
Снегирь
26,5
34,3
20,2
21,8
0
0
желатиназа
,ПЕ
амилаза,
АЕ
113,04
78,5
В итоге проведенных исследований мы можем сделать следующие выводы:
Протеолитические ферменты
личинок колорадского жука, обладают широкой субстратной
специфичностью.
Взаимодействие с белками – ингибиторами из разных частей растений различных видов приводит к
частичному или полному подавлению их активности.
Растения из семейства пасленовых обладают сниженной, по сравнению с растениями из других семейств,
активностью белков-ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука.
ЛИТЕРАТУРА
Методические рекомендации по индикации и мониторингу процессов адаптации колорадского жука к
генетически модифицированным сортам картофеля// Павлюшин В.А., Вилкова Н.А., Сухорученко
Г.И., Фасулати С.Р. и др. издательство ВИЗР, ВНИИБЗР. Санкт-Петербург, 47 с.
2. Применение методов биохимии в исследованиях по защите растений (Методические указания) п/р
К.В.Новожилова, С.Л.Тютерева, издательство ВИЗР, Ленинград, 1976 с.61-62
3. Мосолов ВВ, Валуева ТА. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений//Прикладная биохимия и
микробиология.-2005.-Т.41 №3.-с.261-282
4. Фомичева Ю.А. Пищеварительные α-амилазы и протеиназы насекомых как элемент специфичного
взаимодействия в системе растение – насекомое –фитофаг: Автореф. канд.дис. Санкт –
Петербург,1992. 15 с.
5. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А. Выделение и свойства протеолитических ферментов личинок
Leptinotarsa decemplineata// Тез. докладов второго международного симпозиума Сигнальные системы
клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете. Казань. 2006. С.228-229
6. Шпирная И.А.,Шевченко Н.Д. Определение активности протеолитических ферментов и их
ингибиторов методом гелевых пластин// Тез. докладов второго международного симпозиума
Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете. Казань. 2006. С.230-231
7. Erlanger B.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes
of trypsin // Arch. Biochem. Biophys.- 1961.- V. 95, N 2.- P. 271-278.
8. Bradford M.M. A rapide and sensetive method for the quantitasion of microgramm quantities of protein
utilising the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V.172, N 1. - P. 248 - 254.
9. Конарев Ал.В. Ингибиторы протеиназ и устойчивость картофеля к колорадскому жуку//Современные
системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.М. Наука, 2000.- С.35-40
10. Велобова Е. Н. Переваривание белков. Киев: гродынец,1993, 29 с.
11. Ибрагимов Р.И. Содержание ингибиторов протеиназ в семенах сельскохозяйственных культур //
Качество продукции растениеводства и приемы его повышения.- Уфа: Баш. гос. агр. ун-т. - 1998.С. 146-149.
1.
Поступила в редакцию 14.09.06 г.