Миронова Виктория Владимировна КОМПЬЮТЕРНОЕ
реклама
На правах рукописи Миронова Виктория Владимировна КОМПЬЮТЕРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ АУКСИНА В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ КОРНЯ РАСТЕНИЙ 03.01.09 – математическая биология, биоинформатика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАН в лаборатории теоретической генетики, г. Новосибирск Научный руководитель: Доктор биологических наук, доцент В.А. Лихошвай Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: Кандидат биологических наук А. В. Кочетов Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Доктор биологических наук С.И. Бажан ФГУН ГНЦВБ «Вектор», пгт. Кольцово Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный политехнический университет г. Санкт-Петербург Защита диссертации состоится “ ” мая 2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. Тел/факс: (383) 3331278, (383)-363-49-06*1321, e-mail: [email protected]. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН Автореферат разослан “____”__________2010 года Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т. М. Хлебодарова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение механизмов поддержания стволовых клеток в развитии является одной из актуальнейших проблем современной биологии. У растений стволовые клетки локализованы в специальных органах – меристемах, которые, по сути, являются нишами стволовых клеток. В отличие от животных, у растений ниши стволовых клеток, и, как следствие, новые органы, формируются не только в эмбриогенезе, но и во взрослом растении: в апикальных меристемах боковых побегов, боковых и придаточных корней, меристемах цветка. Несомненно, механизмы формирования меристем и поддержания в них ниш стволовых клеток определяют как архитектуру растения в целом, так и его семенную продуктивность, мощность корневой системы, величину зеленой массы и множество других агрономически важных признаков. В настоящее время накоплено большое количество экспериментальных данных, в которых показана ключевая роль гормона ауксина (индолилуксусная кислота, ИУК) в формировании и сохранении меристем в развитии. Максимумы концентрации ауксина формируются в апикальных меристемах растений и обеспечивают как поддержание ниши стволовых клеток в них, так и формирование по определенному паттерну новых меристем и новых органов. В апикальной меристеме корня (АМК) максимум концентрации ауксина формируется в результате его активного перераспределения из побега. Белкитранспортеры ауксина ассиметрично локализованы на мембране клеток и определяют направленные потоки ауксина: акропетальный поток из побега в корень и базипетальный поток из корня в побег. Показано, что экспрессия белков-транспортеров регулируется ауксином на молекулярно-генетическом уровне, однако роль этих механизмов в развитии корневой системы до сих пор неизвестна. В настоящий момент закономерности распределения ауксина в ткани растений интенсивно изучаются в совместных экспериментально-теоретических исследованиях. Методами математического моделирования проверены выявленные на основе экспериментальных данных гипотезы о роли распределения ауксина в формировании филлотаксиса [de Reuille et al., 2006; Smith et al., 2006; Jonsson et al., 2006; Sahlin et al., 2009], жилковании листа [Rolland-Lagan et al., 2004], поддержании ниши стволовых клеток в АМК [Grieneisen et al., 2007], формирования боковых корней [Laskowski et al., 2008] . В работе Grieneisen et al. (2007) численно показано, что максимум концентрации ауксина в АМК зрелого корня формируется по так называемому механизму «обратного фонтана». Согласно этой концепции, в анатомической структуре АМК направленные потоки ауксина взаимодействуют так, что ауксин циркулирует по замкнутому контуру внутри АМК. В кончике корня ауксин из акропетального потока попадает в базипетальный, а в меристематической зоне АМК ауксин из базипетального снова возвращается в акропетальный. Эти процессы обеспечивают формирование распределения ауксина в уже сформированной нише стволовых клеток АМК. Однако до сих пор остается актуальным вопрос о механизмах формирования ниши стволовых клеток апикальной меристемы на ранних стадиях развития главного корня, при инициации меристем боковых и придаточных корней, а также при регенерации 3 АМК после повреждений. В данной диссертационной работе исследуются молекулярно-генетические механизмы распределения ауксина в развивающихся корнях растений и их роль в формировании анатомической структуры АМК. Цели и задачи работы. Целью настоящей работы является исследование роли ауксина в контроле ранних этапов морфогенеза корня растений с помощью методов биоинформатики и математического моделирования. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. Разработка онтологии развития корневой системы и базы данных по генетической регуляции морфогенеза корня разных видов растений, интегрирующих опубликованные экспериментальные данные о функциях ауксина в корне; 2. Разработка математических моделей, описывающих транспорт ауксина в корне растения с различной детализацией; 3. Анализ и математическое моделирование механизмов формирования и сохранения в развитии максимума концентрации ауксина в кончике корня; 4. Анализ и математическое моделирование механизмов формирования максимумов концентрации ауксина в базальной меристеме и гипокотиле, предетерминирующих развитие боковых и придаточных корней, соответственно. Научная новизна и практическая ценность. Впервые разработаны онтология процессов развития корневой системы и база данных PGNS-root по экспрессии генов различных видов растений в корне. Оба этих ресурса доступны через Интернет, и уже в настоящее время используются как источник информации по этим вопросам. Автоматические запросы, реализованные в PGNS-root, позволяют проводить системный анализ данных о паттернах экспрессии генов в развитии корневой системы растений, их изменения в мутантах, трансгенах и при обработке активными веществами и факторами, а также о фенотипических аномалиях развития корня. В диссертационной работе выявлены новые механизмы регуляции развития корневой системы растения под действием ауксина, которые обобщают и дают объяснение всем опубликованным на данный момент экспериментальным данные о распределении ауксина в корне растений. Так, предложены и проверены в математических моделях гипотезы о механизмах (1) самоорганизации паттерна распределения ауксина в АМК; (2) формирования и регуляции паттернов закладки боковых корней растения; (3) о ключевой роли механизмов автоингибирования транспорта ауксина в формировании разных типов корневой системы (стержневой и мочковатой). Эти гипотезы, теоретически подтвержденные экспериментами in silico, представляют собой задел для последующей проверки в экспериментах in vivo. Впервые разработана математическая модель, использующая гипотезу о механизме самоорганизации паттерна распределения ауксина вдоль корня. Модель учитывает молекулярно-генетические механизмы активации и ингибирования ауксином экспрессии его белков-транспортеров PIN1. В численных экспериментах показано формирование и сохранение паттерна распределения ауксина в развивающемся корне в соответствии с 4 экспериментальными данными. Практическая ценность разработанной математической модели транспорта ауксина заключается в том, что она не только обобщает полученные ранее экспериментальные данные о роли ауксина в корнеобразовании, но и представляет их системно, в виде компьютерной программы. Эта программа может быть использована в дальнейшем при решении практических задач, таких как изучение действия активных веществ в различных комбинациях и концентрациях на развитие корневой системы. Численные эксперименты могут быть использованы для проверки различных гипотез о механизмах регуляции развития корня с учетом процессов, происходящих на разных уровнях организации: молекулярно-генетическом, клеточном и тканевом. Разработанная модель также может быть использована для исследования развития корневых систем различных видов растений, выявления общих и специфических механизмов регуляции процесса развития корня, их изменчивости в эволюции. Полученные в диссертации результаты используются при чтении лекционного курса «Системная биология: математическое моделирование генных сетей». Положения, выносимые на защиту. 1. Разработанная онтология процессов развития корневой системы растений и база данных PGNS-root по экспрессии генов и фенотипическим аномалиям в корневых системах различных видов растений может быть использована как средство унифицированной классификации экспериментальных данных по генетике развития корней растений и их систематического анализа. 2. В основе механизма самоорганизации экспериментально наблюдаемого паттерна распределения ауксина в меристеме корня лежат молекулярногенетические механизмы регуляции ауксином своего активного транспорта. 3. В основе механизма формирования и регуляции паттернов закладки боковых корней растения могут лежать процессы регуляции экспрессии транспортеров ауксина, опосредующих его акропетальный поток. 4. Различия механизмов регуляции ингибирования транспорта ауксина в различных видах растений могут лежать в основе формирования разных типов корневых систем (мочковатых или стержневых). Апробация работы. Материалы настоящей работы были представлены на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН 2006 и 2009 годов, вошли в отчеты по интеграционным проектам СО РАН №107, 119; а также были представлены как основной результат в отчете ИЦиГ по Программе РАН 22. Молекулярная и клеточная биология. Проект 8. от 2009 года. Основные результаты работы были представлены на следующих научных конференциях и семинарах: Российско-Германский форум по Биотехнологии (Новосибирск, 2009); минипрограмма «Morphodynamics in Plants, Animals and Beyond". (SantaBarbara, USA, 2009; Moscow Conferences on Computational Molecular Biology (Москва, Россия, 2007; 2009 гг); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2008" (Москва, Россия, 2008); The 6th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS'2008, Novosibirsk, Russia, 2008); GARnet – SEB Symposium of experimental biologists (GARnet’08, Nottingham, UK, 2008); Autumn school for 5 young scientists in system biology (Novosibirsk, Russia, 2008); The Eighth International Conference on System Biology (ICSB’07, Long Beach, California, USA) и другие. По тематике исследования получено свидетельство о государственной регистрации базы данных (Свидетельство №2006620170, июнь 2006). Публикации. По теме диссертации опубликовано: пять работ в рецензируемых журналах, одна – в рецензируемой коллективной монографии и одна – в учебном пособии по биоинформатике, семнадцать в трудах конференций, в том числе в трех зарубежных. Получен 1 сертификат Роспатента. Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов работы, заключения, выводов, списка литературы (167 наименования), а также списка используемых в работе сокращений. Материал изложен на 167 страницах, содержит 29 рисунков, 13 таблиц и 2 приложения. Благодарности. Выражаю свою искреннюю благодарность В.А. Лихошваю, Н.А. Омельянчук, Н.А. Колчанову, С.И. Фадееву, Е.М. Залевскому, И.Р. Акбердину, Ф.В. Казанцеву, Д.Н. Горпинченко, К.Д. Безматерных, В.В. Лаврехе, М.П. Пономаренко, С.С. Ибрагимовой, Г. Йосифону, Э. Мелснессу. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы В разделах 1.1.-1.2. обзора литературы рассмотрены особенности структурно-функциональной организации меристемы корней растения, гормональной регуляции развития главного и боковых корней, молекулярногенетические механизмы распределения ауксина и его действия на развитие корней растений. В разделах 1.3. и 1.4. представлены обзоры существующих баз данных и математических моделей по развитию растений. В разделе 1.5. суммируются данные экспериментальных и теоретических исследований, представленных в обзоре, и формулируются задачи диссертации. Для решения поставленных задач в диссертационной работе используется системный подход. Методология системного подхода включает четыре этапа исследования механизмов морфогенеза: (1) формализация гетерогенного массива экспериментальных данных и его интеграция в базах данных (глава 2); (2) логический анализ накопленной в базах данных информации, выявление общих закономерностей, извлечение новых знаний о механизмах регуляции морфогенеза (глава 3); (3) математическое моделирование процессов морфогенеза на основе проведенного логического анализа (глава 4); (4) формулирование и тестирование в моделях новых гипотез о регуляции процессов морфогенеза, планирование экспериментов (глава 4, заключение). Глава 2. База данных по генетическому развитию корней растений PGNS-root В главе 2 описана разработанная автором база данных по генетическому развитию корней растений, которая включает в себя следующие разделы: 1. Онтология процессов развития корневых систем. Онтология состоит из контролируемых словарей по (1) стадиям развития корневой системы и (2) по анатомии и морфологии корневой системы. Также, онтология содержит 6 термины, синонимы, краткое и полное описание с выдержками из публикаций и количественными данными. 2. База данных нуклеотидных последовательностей генов, их мутантных аллелей и трансгенных конструкций на их основе (PGNS SD). 3. База данных по экспрессии генов. В PGNS ED аннотируются данные трех типов: (1) паттерны экспрессии генов (стадия, орган, уровень) в растениях дикого типа; (2) изменение паттернов экспрессии после обработки активными веществами и факторами (действие гормонов, солей, температуры, света и др.); (3) изменение паттернов экспрессии в мутантных или трансгенных растениях. 4. База данных по фенотипическим аномалиям корневых систем. В PGNS PD аннотируются данные двух типов: (1) фенотипические аномалии развития корневой системы в мутантных или трансгенных растениях, а также (2) фенотипические аномалии, проявившиеся в результате обработки активными веществами и факторами. 5. База данных по проаннотированным публикациям (PGNS RD). 6. Терминологические словари по видам растений, фенотипическим аномалиям развития, типам экспериментов, уровням экспрессии, активным факторам и веществам. PGNS-root имеет уникальное, по сравнению с другими базами данных, содержание, аннотируемое из опубликованных статей. В первую очередь, это данные экспериментов (ПЦР, in situ гибридизация, репортерные конструкции и др.) по изучению паттернов экспрессии ключевых в развитии растения генов. Во-вторых, это данные о фенотипических аномалиях развития корневой системы, и их причинах на тканевом уровне (например, повышенная скорость делений, уменьшение количества стволовых клеток и т.д.). Стоит подчеркнуть, что данные по экспрессии генов в растениях, подвергнутых обработке активными веществами (например, гормонами и их аналогами) и факторами (например, лазерная абляция, температура) не представлены на данный момент ни в одной другой базе данных. Онтология процессов развития корневых систем растений PGNS-root, по сравнению с существующими онтологиями развития растений содержит не только общепринятые термины биологии развития растений, но и их детальные описания, взятые из опубликованных статей и книг. По своей сути онтология PGNS-root является базой знаний, которая может быть использована в образовательных целях. В интернет версии PGNS-root (http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/pgns) реализован ряд автоматических запросов, которые обрабатывают содержимое PGNS-root по определенным правилам, и выдают структурированную в виде таблиц информацию об особенностях экспрессии генов на молекулярном, клеточном, тканевом и фенотипическом уровнях. При заполнении PGNS-root основное внимание было уделено аннотированию информации о процессах распределения ауксина в корнях арабидопсиса, кукурузы, риса и люцерны. Глава 3. Компьютерный анализ данных PGNS-root Третья глава посвящена аналитическому анализу опубликованных данных о механизмах распределения ауксина в корне с использованием автоматических запросов PGNS-root. 7 Ранее в работе Grieneisen et al. (2007) была предложена структурная гипотеза формирования паттерна распределения ауксина в корне, согласно которой основным фактором формирования распределения концентрации ауксина в корне является анатомическая структура АМК, в которой клетки разных типов перераспределяют ауксин в определенном направлении. Однако выявленные в последние годы экспериментальные данные об экспрессии основных транспортеров ауксина свидетельствуют о существовании механизмов самоорганизации распределения ауксина в развитии, предшествующей формированию анатомической структуры. С целью выявления этих механизмов мы провели компьютерный анализ аннотированных в PGNS-root данных. Ниже представлены основные результаты такого анализа. Распределение ауксина в корневой системе в норме. По автоматическому запросу ED1 (Как экспрессируется ген в растениях дикого типа?) к базе данных PGNS-root (см. главу 2.3) по термину Auxin в растении Arabidopsis thaliana выдается информация о 23 доменах экспрессии ауксина в корневой системе на разных стадиях ее развития. Экспериментальные данные о распределении ауксина, как правило, представляют собой описание активности DR5 ауксинчувствительного промотора в трансгенных линиях DR5:GUS, DR5:GFP, DR5:PEH. Согласно работе Пожванова и Медведева (2008), по паттерну экспрессии репортерного гена DR5 можно с достаточной точностью судить о паттерне распределения ауксина в ткани. На основе анализа экспериментальных данных по 11 работам, можно сделать вывод, что паттерн распределения ауксина в кончике корня на качественном уровне одинаков – во всех работах показан максимум концентрации ауксина в 4-5 клетках от конца корня и градиент концентрации ауксина от максимума в сторону конца корня (Рис. 1В-Г). Еще два максимума концентрации – в базальной меристеме и в основании корня периодически формируются в развитии и предетерминируют развитие боковых и придаточных корней, соответственно (Рис. 3Б-В). Изменения распределения ауксина при обработке активными веществами и факторами. Автоматический запрос ED2 (Обработка какими активными веществами и факторами и изменяет экспрессию данного гена?) к PGNS-root по термину Auxin, выдает информацию о том, что изменение активности DR5 наблюдалось в опытах по обработке корня НФК, ИУК, 2,4-Д, АСС, ВА и при выжигании ЦП лазером. Анализ данных показал, что наиболее сильный эффект на распределение ауксина был выявлен в экспериментах по обработке корней ауксином и его аналогами. Паттерн распределения ауксина самоорганизуется в кончике корня даже после нарушении его структуры (выжигания ЦП), а значит, структурные механизмы формирования максимума концентрации ауксина, описанные в работе [Grieneisen et al., 2007] не являются единственными. Механизмы синтеза ауксина в корне. По автоматическому запросу ED5 (Мутации/трансгены каких генов изменяют экспрессию данного гена?) к базе данных PGNS-root с термином Auxin, получена информация о мутантных растениях, в которых был изменен домен и уровень экспрессии DR5. Среди них были мутанты по генам ASA1 и ASB1, которые регулируют биосинтез ауксина. На основе анализа паттернов экспрессии ASA1 и ASB1 по автоматическим запросам ED1 и ED2 (см. выше) можно заключить, что синтез ауксина в кончике 8 корня влияет на его общую концентрацию в меристеме, но не является ключевым механизмом в позиционировании максимума концентрации ауксина в клетках инициалов корневого чехлика. Механизмы транспорта ауксина. По автоматическому запросу ED1 (см. выше) была проанализирована информация о паттернах экспрессии белковтранспортеров ауксина в корне в растениях дикого типа. По автоматическому запросу PD1 (Какие фенотипические аномалии наблюдаются при мутациях/в трансгенах по заданному гену?) была получена информация о фенотипических аномалиях в растениях, мутантных по генам транспортеров ауксина. В результате анализа этих данных можно сделать вывод, что наибольшее значение в формировании распределения ауксина в развивающихся корнях имеют транспортеры, определяющие акропетальный поток ауксина. Действие ауксина на экспрессию основных транспортеров ауксина. По автоматическому запросу ED2 к PGNS-root с веществами ИУК, НУК и 2,4-Д был проведен анализ того, влияет ли обработка ауксином на экспрессию его белков транспортеров. Действительно, в разных экспериментальных работах было показано, что ауксин как активирует транскрипцию ряда генов PIN семейства, так и приводит к деградации белков PIN1, PIN7 и PIN3. Таким образом, в корне существуют положительная и отрицательная обратные связи от ауксина на скорость его транспорта (Рис. 1А). На основе перечисленных выше фактов предложена гипотеза о морфогенетическом механизме формирования экспериментально наблюдаемого максимума концентрации ауксина в кончике корня (морфогенетическая гипотеза). Для объяснения механизмов формирования паттерна распределения ауксина в корне, мы предлагаем использовать концепцию, согласно которой распределение морфогена, каковым является ауксин, происходит по механизму самоорганизации. Благодаря положительной и отрицательной генетической регуляции ауксином экспрессии PIN генов, регулирующих поток ауксина из побега в корень (Рис. 1А), в изначально неспециализированной ткани корня может происходить самоорганизация распределения ауксина с максимумом концентрации, сохраняющимся на определенном расстоянии от кончика корня. Это стабильное во времени распределение морфогена интерпретируется клетками кончика корня как позиционная информация, которая далее определяет развитие и специализацию клеток АМК. Глава 4. Математическое моделирование распределения ауксина в корне растений Для проверки непротиворечивости морфогенетической гипотезы в диссертации были использованы методы математического моделирования, результаты которого описаны в главе 4. Мы разработали минимальную и полную модели, описывающие распределение ауксина в линейной последовательности клеток, лежащих вдоль центральной продольной оси корня (Рис. 1Б). В минимальной модели рассматривается ансамбль клеток фиксированного размера без учета их роста и деления (глава 4.1). В полной модели дополнительно учтено влияние ауксина на рост и деление клеток АМК в развитии (глава 4.2). В обеих моделях учтены процессы диффузии, активного транспорта и деградации 9 ауксина. Активный транспорт описан через PIN1 белки, экспрессия которых в моделях регулируется ауксином. Единственным источником ауксина в корне в обеих моделях является ауксин, поступающий в N-ю клетку моделируемой зоны, имитируя тем самым поток ауксина из побега. Минимальная модель представляет собой систему обыкновенных дифференциальных уравнений реализованных на языке SiBML [Казанцев и др., 2009]. В каждой клетке модели сходным образом (за исключением первой и N-ой клетки, для которых определены граничные условия) рассчитываются концентрации PIN1 и ауксина. Рисунок 1. А. Обобщенный механизм регуляции экспрессии PIN1 ауксином. Б. Клеточный ансамбль в математической модели распределения ауксина вдоль продольной оси корня. Стрелками указаны рассмотренные в модели процессы, влияющие на распределение ауксина. В. Экспериментальные данные [Sabatini et al., 1999] о распределении ауксина в кончике корня. Г. Профиль распределения ауксина полученный в результате обработки изображения (В.) в программе ImageJ. Д. Соответствие стационарного распределения ауксина (черная кривая) в модели экспериментально наблюдаемому распределению расчетов модели распределению ауксина вдоль продольной оси корня. Для минимальной модели были подобраны несколько наборов значений параметров, с которыми в модели реализуются стационарные распределения внутриклеточных концентраций ауксина, качественно соответствующие экспериментальным данным (полный анализ проведен с «базовым» и «жестким» наборами параметров) (Рис. 1В-Д). Численный анализ модели с разными наборами параметров показал, что механизмы, заложенные в морфогенетической гипотезе, являются внутренне непротиворечивыми и обеспечивают образование максимума концентрации ауксина в кончике корня в изначально неспециализированном ансамбле клеток. Для поддержания ниши стволовых клеток в АМК важно не только формирование, но и сохранение положения максимума концентрации ауксина в 10 развитии. Для проверки применимости морфогенетической гипотезы в сохранении паттерна распределения ауксина в растущей ткани была создана полная модель, которая расширяет минимальную модель описанием процессов роста и деления клеток. Для этой цели была использована Динамическая Грамматика [Mjolsness and Yosiphon, 2006], реализованная в виде приложения к системе Mathematica. Скорость деления клеток в полной модели зависит от концентрации в них морфогена Y (Рис. 2Д), который объединяет функции цитокинина и этилена в регуляции деления клеток. Значения параметров полной модели были подобраны таким образом, что рассчитанная in silico скорость деления клеток в ансамбле соответствует экспериментально наблюдаемому профилю митотической активности клеток в АМК с двумя максимумами (в инициалах корневого чехлика и в меристематической зоне АМК) (Рис. 2). Исследование полной модели показало, что рост и деление клеток в корне не препятствует формированию и сохранению максимума концентрации ауксина в кончике корня, что говорит о применимости морфогенетической гипотезы для объяснения формирования распределения ауксина в развивающихся тканях. Рисунок 2. Моделирование формирования анатомической структуры корня растения в развитии под регуляцией гормонов ауксина, цитокинина и этилена (в модели обобщены как морфоген Y). А. Схема анатомической организации кончика корня на продольном срезе, разными цветами обозначены различные клеточные типы (цвета и условные обозначения как на рис. 1). Б. Профиль митотической активности клеток вдоль центральной оси корня (x) с двумя максимумами - в инициалах корневого чехлика (ИКЧ) и в меристематической зоне корня (МЗ). В. Результаты расчета модели: формирование качественных характеристик клеток, определяющих их дифференцировку в разные клеточные типы, расположенные на оси x. Г. Функция, с которой ауксин подавляет активность Y. Д. Функция, с которой Y регулирует скорость деления клетки. В дополнение к поддержанию положения максимума концентрации ауксина, в полной модели мы наблюдали установление таких индивидуальных 11 характеристик клеток (концентрация ауксина, относительное расположение на оси, митотическая активность), по которым можно дифференцировать клетки различных типов, расположенных вдоль центральной оси реального корня (Рис. 2В). Анализ модели. В главе 4.3. приведены результаты анализа минимальной и полной моделей, с помощью которых мы in silico воспроизводили следующие эксперименты in vivo: повышение потока ауксина из побега, обработка корня ингибиторами транспорта ауксина, обработка экзогенным ауксином, лазерное выжигание ЦП. Повышение потока ауксина из побега. В минимальной модели скорость поступления ауксина из побега задана одним параметром, в полной модели линейной функцией растущей во времени. Если рост интенсивности потока ауксина из побега в полной модели задать высоким, то в корне in silico при имитации его роста с течением времени будет расти суммарное содержание ауксина, что приведет к периодическому возникновению дополнительных максимумов концентрации ауксина, расположенных на расстоянии от первого (Рис. 3Б). Очень высокий поток приведет к формированию максимума у основания корня (Рис. 3В). В минимальной модели этим событиям соответствуют появление колебательных решений с несколькими максимумами концентрации ауксина (Рис. 3Г) в модели с базовым набором параметров и стационарные решения с несколькими максимумами в модели с жестким набором параметров (Рис. 3Д). Наблюдаемые in silico дополнительные максимумы могут соответствовать экспериментально показанным максимумам концентрации ауксина, которые предетерминируют развитие боковых [de Smet et al., 2007] и придаточных [Gonzali et al., 2005] корней (Рис. 3Б-В). Результаты расчета настоящей модели показывают, что периодическое формирование внутренних максимумов, инициирующих образование боковых и придаточных корней, может происходить в ответ на повышение потока ауксина из побега при росте растения [Lovin et al., 2004] или при флуктуациях потока ауксина в суточном ритме [Jouve et al., 1999]. При этом регулярные флуктуации акропетального потока ауксина в соответствии с суточными ритмами могут быть ответственными за право-левый ризотаксис арабидопсиса, когда при благоприятных условиях закладка следующего бокового корня происходит через регулярные промежутки времени, на определенных расстояниях друг от друга. В численных расчетах моделей с разными наборами параметров были выявлены различия в поведении модели в ответ на повышение потока ауксина из побега. В моделях с жестким набором параметров дополнительные максимумы концентрации ауксина в средней части корня и у его основания появляются при меньших изменениях потока ауксина из побега и максимумы более устойчивы в развитии, по сравнению с моделью с базовым набором параметров (Рис. 3Г-Д). Действие ингибиторов активного транспорта ауксина моделировалось уменьшением значения коэффициента активного транспорта (K0) в базовом наборе параметров минимальной модели (Рис. 3Е). При расчете модели с уменьшенным значением параметра K0, мы наблюдали сдвиг максимума концентрации ауксина вглубь корня и уменьшение концентрации ауксина в 12 области максимума, что хорошо согласуется с экспериментальными данными [Sabatini et al., 1999]. Рисунок 3. А.-В. Формирование в стационарных решениях минимальной модели распределений ауксина, с максимумами концентрации, соответствующими максимумам ауксина, наблюдаемым в эксперименте. А. Максимум концентрации в АМК. Б. Максимумы концентрации в АМК и в средней части корня. В. Максимумы концентрации в средней части корня и у основания. Г.-Е. Изменение распределения ауксина в решениях минимальной модели в ответ на: Г. повышение потока ауксина из побега при базовом наборе параметров; Д. повышение потока ауксина из побега при жестком наборе параметров; Е. уменьшение константы активного транспорта. Регенерация центра покоя после отсечения кончика корня. После отсечения кончика корня или выжигания ЦП лазером (абляция), растение в процессе дальнейшего роста постепенно восстанавливает нормальную структуру АМК, формируя предварительно новый максимум концентрации ауксина в клетках проксимальных к выжженому ПЦ [Sabatini et al., 1999; Xu et al., 2006]. Аналогичный эксперимент мы имитировали in silico, рассчитывая модель с нулевыми начальными данными или с измененным ансамблем клеток (Рис. 4А). Сравнение экспериментов процесса регенерации максимума концентрации ауксина in silico и in vivo показало качественное соответствие изменений в экспрессии PIN1 и DR5, выявленных в работе [Xu et al., 2006] (Рис. 4Б-И), с изменениями концентрации PIN1 и ауксина в настоящей модели (Рис. 4К-Н), соответственно. Помимо «регенерации» максимума ауксина в полной модели мы также наблюдали in silico восстановление специфических характеристик клеток вокруг формирующегося максимума, по которым можно судить о регенерации анатомической структуры АМК в целом (Рис. 2В). Обработка корня экзогенным ауксином имитируется выборочным изменением концентрации ауксина в начальных данных модели. В минимальной модели с базовым набором параметров единственным эффектом повышения концентрации ауксина в начальных данных был незначительный сдвиг максимума концентрации ауксина в стационарных решениях, в полной модели не было никакого эффекта. На основании проведенного исследования можно 13 предположить, что описанный в модели механизм регуляции акропетального транспорта ауксина при базовом наборе значений параметров обеспечивает устойчивость стационарного распределения ауксина с единственным максимумом концентрации в кончике корня к случайному изменению концентраций ауксина в клетках, что согласуется с наблюдениями на арабидопсисе [Friml et al., 2002]. Численные эксперименты с жестким набором параметров показали большую чувствительность модели к изменению начальных данных. В модели формировались дополнительные максимумы концентрации ауксина в средней части корня и у его основания (Рис. 3Б-В). Эти данные хорошо согласуются с экспериментальными данными по обработке корней однодольных растений, например, кукурузы [Kerk et al., 2000]. Рисунок 4. А. Схема компьютерного эксперимента по отсечению кончика корня. Процессы, следующие за выжиганием ЦП лазером in vivo (Б.-И.) и in silico (К.-Н.). Б.-Д. Изменение экспрессии DR5::GFP из Xu et al. (2007); Е.-И. Изменения в накоплении белка PIN1 из Xu et al. (2007); К.-Н. Моделирование распределения ауксина после выжигания ЦП, результаты расчета минимальной модели приведены для последних 7 клеток. Б.,Е.,К. – норма; В.,Ж.,Л. - от 3 до 16 часов после выжигания ЦП; Г.,З.,М. - два дня после выжигания; Д.,И.,Н.- 3 дня после выжигания. Белая стрелка указывает положение выжженного ЦП. Транспорт ауксина в разных видах растений. Механизмы транспорта ауксина являются очень консервативными среди высших растений, поэтому коровый механизм регуляции транспорта ауксина, описанный в модели (Рис. 1А), также может работать в растениях разных видов. В этом случае, специфические свойства транспортных систем разных растений могут быть изучены in silico варьированием параметров в модели. Мы провели полный анализ динамики поведения модели с базовым и жестким набором параметров. Принципиальное отличие моделей с двумя наборами параметров заключается в эффективности подавления скорости активного транспорта при увеличении концентрации ауксина. В модели с жестким набором параметров для 14 эффективного ингибирования PIN1-опосредуемого активного транспорта из клетки требуется в три раза меньшая локальная концентрация ауксина. Модели с разными наборами параметров сходным образом воспроизводят результаты экспериментов по (1) распределению ауксина в норме (Рис. 1В-Д); (2) обработке ингибиторами транспорта ауксина; (3) регенерации максимума концентрации ауксина после отсечения кончика корня (Рис. 4). Однако, в других численных экспериментах были показаны различия в поведении модели с жестким и базисным наборами параметров (см. выше), которые позволяют нам судить о возможных различиях транспортных систем ауксина, формирующих мочковатые и стержневые типы корневых систем (Таблица). Расчеты модели с базовым набором параметров адекватно описывают распределение ауксина в корне арабидопсиса и потенциально, любого другого растения со стержневой корневой системой. В такой системе формируется корневая меристема с небольшими по размеру АМК, боковыми корнями, находящимися на достаточно больших расстояниях друг от друга и незначительным количеством придаточных корней. Расчеты модели с жестким набором параметров хорошо согласуются с соответствующими наблюдениями на злаковых (например, кукурузе). В такой системе будет формироваться АМК больших размеров, большое количество придаточных и боковых корней. Действительно, корневые системы кукурузы характеризуются повышенной способностью к формированию боковых и придаточных корней, и эта способность увеличивается при обработке корней экзогенным ауксином [Kerk et al., 2000]. В полной модели с жестким набором параметров максимум концентрации ауксина не стабилен в развитии и перемещается на отрезке 10-25 клеток. Такой характер распределения ауксина в кончике корня может объяснять формирование ЦП больших размеров (у кукурузы 600-1000 клеток), в которых степень «покоя» зависит от удаленности от центра ЦП. У кукурузы клетки в центре ЦП действительно не делятся, а на границе делятся почти с такой же скоростью, что и клетки промеристемы [Jiang and Feldman, 2005]. Исходя из расчетов полной модели, можно предположить, что границы ЦП злаков вдоль продольной оси корня могут определяться как крайние клетки в районе перемещения максимума концентрации ауксина. В этом случае, центральные клетки ЦП, в которых вероятность нахождения максимума ауксина выше, будут находиться на более глубоком уровне покоя, чем те, в которые максимум ауксина сдвигается реже. На основе анализа моделей с разными наборами параметров, мы предлагаем гипотезу о ключевой роли механизма автоингибирования транспорта ауксина в формировании разных типов корневой системы. Согласно расчетам, представленным в диссертации, мочковатая корневая система развивается, если активность транспортной PIN-системы (например, за счет возрастания скорости деградации белков-траспортеров) резко падает при достижении ауксином определенной пороговой концентрации. В противном случае развивается стержневая корневая система. 15 Таблица. Сравнение поведения моделей с базовым и жестким набором параметров. Численный Базовый набор параметров эксперимент 10-кратное уменьшение Негативная концентрации PIN1 в клетке регуляция наблюдается при увеличении ауксином ауксина в ней а >10 сu экспрессии PIN1 Положение максимума Моделирование роста корня в концентрации ауксина в 5 клетке от кончика корня полной модели стабильное Колебательное решение, Условия найденное в минимальной формирования модели с увеличенным дополнительного потоком ауксина из побега в максимума/ов полной модели проявляется в концентрации периодически ауксина в средней виде части корня (Рис. формирующегося дополнительного максимума 3Б) концентрации ауксина Условия формирования дополнительного максимума концентрации ауксина в основании корня (Рис. 3В) 1) увеличение потока ауксина из побега, или 2) уменьшение скорости активного транспорта, или 3) изменение коэффициентов ауксин-регулируемой экспрессии PIN1 Характеристики транспортной системы ауксина Максимум ауксина в АМК имеет стабильное положение в развитии корня Дополнительный максимум ауксина периодически формируется в средней части корня Дополнительный максимум в основании корня наблюдается редко, при очень серьезных изменениях внешних условий Стержневая Корневая система 16 Жесткий набор параметров 10-кратное уменьшение концентрации PIN1 в клетке наблюдается при увеличении ауксина в ней а >4.1 cu Положение максимума концентрации ауксина (М) в кончике корня плавает в отрезке 10 ≤ M ≤ 25 клеток 1) увеличение потока ауксина из побега, или 2) уменьшение скорости активного транспорта, или 3) изменение коэффициентов ауксин-регулируемой экспрессии PIN1, или 4) уменьшение скорости деградации ауксина, или 5) в ответ на изменение начальных данных 1) увеличение потока ауксина из побега, или 2) уменьшение скорости активного транспорта, или 3) изменение коэффициентов ауксин-регулируемой экспрессии PIN1, или 4) уменьшение скорости деградации ауксина, или 5) в ответ на изменение начальных данных Максимум ауксина в АМК изменяет положение в определенном промежутке при развитии корня Дополнительные максимумы ауксина формируются при незначительном изменении внешних условий Дополнительный максимум в основании корня формируется часто, в ответ на изменения внешних условий Мочковатая Выводы 1. Разработана онтология процессов развития корневой системы и база данных PGNS-root, в которой интегрирована и систематизирована информация о ауксин-зависимой регуляции развития корней растений из опубликованных экспериментальных данных. 2. На основе анализа экспериментальных данных, предложена гипотеза о механизме самоорганизации паттерна распределения ауксина в меристеме корня, которая основана на молекулярно-генетической регуляции ауксином экспрессии белков-транспортеров ауксина. 3. Впервые разработана математическая модель, описывающая механизмы транспорта ауксина в корне с учетом регуляции экспрессии белковтранспортеров ауксина. Модель адекватно описывает все экспериментальные данные по изменению распределения ауксина в корне в различных условиях. 4. Впервые разработана математическая модель распределения ауксина вдоль продольной оси корня с учетом роста и деления клеток. В решениях модели формируются такие характеристики клеток, по которым их можно дифференцировать на разные типы, соответствующие основным типам клеток вдоль продольной оси корня. 5. Предложены механизмы формирования максимумов концентрации ауксина, предетерминирующих развитие боковых и придаточных корней. Их появление в решениях модели связано: (1) со случайными флуктуациями концентрации эндогенного ауксина, (2) с уменьшением скорости активного транспорта ауксина, (3) с увеличением потока ауксина из побега. 6. Численно показано, что частота формирования дополнительных максимумов концентрации ауксина в ответ на изменение внешних условий, существенно зависит от эффективности автоингибирования транспорта ауксина на генетическом уровне. Численно обоснована гипотеза, что различия механизмов регуляции ингибирования транспорта ауксина в различных видах растений могут лежать в основе формирования разных типов корневых систем (мочковатых или стержневых). 17 Список публикаций по теме диссертации в рецензируемых изданиях 1. Омельячук Н.А., Миронова В.В., Колчанов Н.А. Генетика развития растений: интеграция информации из различных наблюдений и экспериментов в базах данных. Генетика, 2009, V. 45, No. 11, pp. 1476– 1492. (перечень ВАК) 2. В.А. Лихошвай, Н.А. Омельянчук, В.В. Миронова, Ф.В. Казанцев, И.Р. Акбердин, В.К. Королев, С.И. Фадеев, Н.А. Колчанов. Моделирование регуляции ауксином инициации латеральных органов у Arabidopsis thaliana. Вестник Вогис. 2009, том 13, №1, С. 176-185. (перечень ВАК) 3. Г.Г. Лазарева, В.В. Миронова, Н.А. Омельянчук, И.В. Шваб, В.А. Вшивков, Д.Н. Горпинченко, С.В. Николаев, Н.А.Колчанов. Математическое моделирование морфогенеза растений // Сибирский Журнал Вычислительной Математики. 2008. Т.11. №2., С.151-166. (перечень ВАК) 4. Омельянчук Н.А., Миронова В.В., Залевский Е.М., Подколодный Н.Л., Пономарев Д.К., Николаев С.В., Акбердин И.Р., Озонов Е.А., Лихошвай В.А., Фадеев С.И., Пененко А.В., Лавреха В.В., Зубаирова У.С., Колчанов Н.А. Морфогенез растений: реконструкция в базах данных и моделирование. Н.: Издательство СО РАН. Системная компьютерная биология. 2008. Под редакцией: Колчанов Н.А., Гончаров С.С., Лихошвай В.А., Иванисенко В.А. С. 539-591. 5. В.А. Лихошвай, Н.А. Омельянчук, В.В. Миронова, С.И. Фадеев, Э.Д. Мелснесс, Н.А. Колчанов. Математическая модель паттерна распределения ауксина в корне растения // Онтогенез. 2007. Т. 38, №. 6, С. 446–456. (перечень ВАК) 6. N. Omelyanchuk, V. Mironova, A. Poplavsky, N. Podkolodny, N. Kolchanov, E. Mjolsness, E. Meyerowitz (2006) AGNS-a database on expression of Arabidopsis genes. Bioinformatics of Genome Regulation and Structure II. Springer Science+Business Media, Inc. 433-442. 7. Омельянчук Н.А., Миронова В.В., Залевский Е.М., Шамов И.С., Поплавский А.С., Подколодный Н.Л., Пономарев Д.К., Николаев С.В., Мелснесс Э.Д., Мейеровитц Е.М., Колчанов Н.А. Системный подход к исследованию морфогенеза Arabidopsis thaliana: I База данных AGNS // Биофизика. 2006 Т.51, S.1, С. 75-83. (перечень ВАК) 18 Подписано к печати 16.03.2010 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. 1 л. Уч. Изд. 07 Тираж 110 экз. Заказ 28 Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10. 19
