Фундаментальные и клинические аспекты использования

Фундаментальные и клинические аспекты
использования скелета склерактиниевых кораллов
семейства Acroporidae и их аквакультур для
реконструкции дефектов костной ткани
Докладчик – проф. Н.С. Сергеева
Москва – 2014г.
Цель: тканеинженерное конструирование эквивалентов
живых тканей, способных морфологически и
функционально заместить утраченные ткани
Органотипическое
восстановление
костной ткани предполагает
формирование:




надкостницы,
компактной костной ткани
(остеонов),
губчатой костной ткани,
костно-мозгового кроветворения
2
Компоненты тканеинженерных
конструкций
•
3D-биосовместимый матрикс,
обеспечивающий адекватное
микроокружение для клеток
•
Культуры аутологичных
мультипотентных
мезенхимальных стромальных
клеток костного мозга или
жировой ткани
3
Кораллы Acropora cervicоrnis, выбранные для
замещения костных дефектов
СЭМ (снимки проф. Н.П.Омельяненко,
ЦИТО им. Н.Н.Приорова, 2008г.)
Демонстрация:
- фрахтальность поверхности коралла с зерном в нанодиапазоне
4
Внешний вид образцов скелета натуральных
кораллов
Семейство:
Oculinidae
Вид:
Madrepora oculata
Семейство:
Caryophyllidae
Семейство:
Acroporidae
Вид:
Acropora cf. digitata
Семейство:
Acroporidae
Вид:
Lophelia pertusa
Вид:
Acropora carduus
Семейство:
Pocilloporidae
Семейство:
Pocilloporidae
Вид:
Pocillopora eydouxi
Вид:
Pocillopora cf. meandrina
5
Внешний вид образцов скелета натуральных
кораллов
Семейство:
Acroporidae
Семейство:
Faviidae
Вид:
Acropora sp 4
Вид:
Goniastrea retiformis
Семейство:
Fungiidae
Вид:
Fungia cf. Horrida
Семейство:
Pocilloporidae
Семейство:
Pocilloporidae
Вид:
Pocilloppora damicornis
Семейство:
Acroporidae
Вид:
Pocillopor cf. elegans
Вид:
Acropora sp 3
6
Изучение физико-химических свойств
керамических и коралловых матриксов
 Топография (микрорельеф) поверхности (АСМ).
 Состав и структура материала (химический
анализ, рентгенофазовый анализ, ИКспектроскопия).
 Микроструктура материала (СЭМ).
 Скорость биодеградации (по изменению
концентрации ионов Ca++ с помощью ионселективного электрода).
 Пористость (гидростатическое взвешивание, из
данных СЭМ).
 Объемная (3D) структура (микро-КТ).
 Механические характеристики (прочность при
сжатии, прочность при изгибе, микротвердость).
7
Алгоритм исследования биоматериалов
ЗАДАЧА
МОДЕЛЬ, СРОКИ
ИССЛЕДОВАНИЙ
МЕТОД
ОЦЕНКИ
In vitro:
оценка острой
цитотоксичности
Тест-культуры клеток,
24 часа
МТТ-тест
In vitro:
изучение матриксных
свойств поверхности
Тест-культуры клеток,
1, 3, 7, 10, 14, 21 сутки
МТТ-тест
In vivo:
изучение
биосовместимости
Подкожная имплантация
мышам биоматериалов,
2,4,8,12 недель
Гистология
In vivo:
замещение костного дефекта
голени крысы,
бедренной кости барана
С ММСК
без ММСК
Рентген,
гистология
8
Результаты физико-химических
исследований кораллов
1.
Фазовый состав:
– закристаллизованный арагонит – 21/23,
– железозамещенный арагонит – 2/23.
2.
Химический состав:
– примеси переходных металлов – на уровне
ПДЗ (стандарт ASTM 1185) – 21/23, – 2/23
– основной примесный элемент – стронций.
9
Распределение пор в кораллах
Acropora cf.digitata (А), Acropora
carduus (Б), Acropora sp.1(В):
А
А1
Б
Б1
В
В1
Acropora sp.5 (А) и Montipora
digitata (Б):
А
А1
Б
Б1
10
Распределение пор по размерам у
кораллов разных видов
Распределение пор по размерам, в %
100
Размер пор, мкм
Б
Pore' s distribution, %
90
80
> 1000 m
70
500-1000 m
60
250-500 m
А
50
40
100-250 m
30
< 100 m
20
10
0
3
Acropora
cf. digitata
4
Acropora
carduus
5
Acropora
sp 1
6
7
8
9
10
Acropora
Acropora
sp 3
sp5
Acropora
Acropora
Montipora
sp 2
sp4
digitata
Вид коралла
11
Образование биологического апатита
на поверхности кораллов (СЭМ):
I– Acropora сervicornis, II - Pocillopora eydouxi
10 сутки
в растворе SBF
Исходные образцы
А
Б
А
Б
В
Г
В
Г
60 сутки
в растворе SBF
А
Б
I
II
В
Г
* Стрелками обозначен слой биологического апатита.
12
Некоторые физико-механические характеристики
коралловых имплантатов
Характеристики
Кость
Коралл
Гидроксиапатит
Продольная
прочность, МПа
166,0
29,0
4,0-6,0
Радиальная
прочность, МПа
136,0
19,2
4,0-6,0
Пористость, %
-
40-50
40-50
Размер пор, мм
-
0,6-1,0
0,05-0,3
Характер пор
-
Сквозные
взаимосвязанные
Взаимосвязанные
поры, в т.ч., открытые
13
Экспрессия остеогенных маркерных генов
в ММСК при индукции дифференцировки
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
коллаген I
ЩФ
сиалопротеин остеопонтин
контроль
индукция дифференцировки in vitro на пластике
индукция дифференцировки in vitro на коралле
(Совместно с ФФМ МГУ им. М.В.Ломоносова)
14
Кораллы Acropora cervicoris (нативные и после
культивирования in vitro с клетками)
Прирост пула
фибробластов человека
на коралле (МТТ-тест)
600
х8
500
ПРИРОСТ, (%)
х8
400
300
200
100
0
1 СУТ.
3 СУТ.
7 СУТ.
14 СУТ.
17 СУТ.
ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
КОНТРОЛЬ
х32
КОРАЛЛ
х64
15
Схема замещения дефекта бедренной кости барана
коралловым имплантатом (нативным или насыщенным
аутологичными стволовыми клетками)
Коралловый имплантат
ТИК с ММСК на коралле
16
Макропрепарат участка бедренной кости барана
(замещение дефекта коралловым имплантатом, насыщенным
аутологичными ММСК, 4 мес. после операции)
зона дефекта
Демонстрация:
- органотипическое замещение дефекта,
- гипероссификация.
17
Формирование остеонов на месте биоинженерной
конструкции (коралл+ММСК) в дефекте бедренной
кости барана через 4 месяца после операции
Неполная декальцинация, х100
Полная декальцинация, х100
18
Органотипическое восстановление костной ткани
у крысы на месте дефекта, заполненного ТИК
(коралл+ММСК)
(через 6 месяцев после операции)
х25
х100
Демонстрация:
- скорость биорезорбции кораллов соответствует
скорости остеогенеза,
- образование остеонов по всей толще коралла.
19
Пациентка Т. 36 лет. Диагноз:
Гигантоклеточная опухоль промежуточной
фаланги II пальца правой кисти.
Обследование и лечение:
1)
Сцинтиграфия скелета 13.05.08г.: Отмечается зона
повышенного накопления радиофармпрепарата в
области промежуточной фаланги II пальца правой
кисти (230%).
2)
Рентген II пальца правой кисти: 26.05.08г.
Определяется
вздутие
кортикального
слоя
промежуточной фаланги и истончение, имеются
множественные костные перемычки, создающие
мелкие ячейки. Суставные поверхности не
изменены.
3)
Морфология: Гигантоклеточная опухоль без
морфологических признаков злокачественности.
4)
Операция: 25.06.08г. Внутрикостная резекция
промежуточной фаланги II пальца правой кисти с
пластикой дефекта натуральным кораллом.
7-е сутки п/о
6 месяцев п/о
12 месяцев п/о
20
Пациент К., 18 лет.
Диагноз: гигантоклеточная опухоль
левой пяточной кости.
Обследование и лечение:
1)
Анамнез: Около 2-х лет отмечает боли в левой стопе при
физической нагрузке, при КТ в марте 2006г. выявлена киста левой
пяточной кости. 04.04.06г. Внутрикостная резекция левой пяточной
кости, пластика дефекта аутотрансплантатом из левой
подвздошной кости.
2)
Сцинтиграфия скелета: Повышенное накопление РФП в левой
пяточной кости.
3)
КТ - Картина опухоли пяточной кости
4)
Морфология:
№О63092-122/оп
гистологические
признаки
гигантоклеточной опухоли
5)
Операция: 19.03.07г. Внутрикостная резекция левой пяточной
кости с пластикой синтетическими материалом.
3 месяца п/о
18 месяцев п/о
Материал «Силориф» для
замещения костных дефектов
22
Высокая скорость биорезорбции
кораллов, вероятно, определяется:











высокой пористостью,
взаимосвязанностью пор,
большим диаметром пор ( >1,0мм),
развитой поверхностью стенок пор,
толщиной стенок пор.
активной васкуляризацией коралла,
доставкой по каналам предшественников костных клеток,
обеспечением распределения субстратов, факторов роста,
газов и метаболитов по каналам,
высокой адгезивностью для клеток поверхности и стенок
пор,
остеоиндуктивными свойствами вещества кораллов,
снижением рН среды при остеогенезе.
23
Проблемы в использовании скелета кораллов из
естественных поселений как материала для
замещения костных дефектов
1. Запрет добычи кораллов
2. Трудности стандартизации вследствие варьирования
микроэлементного состава и наличия примесей в зависимости от
среды обитания
Аквакультура кораллов
«Искусственные» кораллы,
биомиметический подход
24
Методика выращивания склерактиниевых кораллов
сем. Pocilloporidae и Аcroporidae в аквакультуре на
искусственных носителях (Российско-Вьетнамский
международный научно-технический центр,
Начанг, Вьетнам)
Установка носителей с фрагментами
кораллов сем. Pocilloporidae и Аcroporidae:
а – установка носителей,
б – посадка кораллов,
в – носители с посаженными кораллами на
твердом грунте (полигон 1),
г – мягком грунте (полигон 3).
Для проведения экспериментов
был выбран участок
прибрежной акватории,
примыкающий к морской
научно-испытательной станции
Дамбай с юга (о. Че, залив
Нячанг, Вьетнам). Для
проведения экспериментов
было выбрано 3 полигона,
два мелководных (№№ 1 и 2,
глубина 1,8-2,3 м) на твердом
грунте, различающихся
уровнем прибойности и один
«глубоководный» (№ 3,
глубина 3,5-4,0 м) на песчаном
грунте
25
Собрана коллекция образцов
скелета склерактиниевых
кораллов из естественных
(природных) поселений и
соответствующие им
аквакультуры первого года
жизни:
• быстрорастущие (A. formosa),
• с умеренным темпом роста
(P. verrucosa, P. meandrina, A.
florida, A. nobilis, A. robusta, A.
abrotanoides, A.samoensis, А.
cervicornis),
• тугорослые (Pavona sp.).
Внешний вид образцов
скелета аквакультур
кораллов
26
Анализ особенностей структурной организации образцов СКЕП
и СКАК в сопоставлении с условиями их произрастания
проведен на примере коралла Pocillopora verrucosa
Внешний вид скелета и кораллитов коралла
P. verrucosa, выращенного в аквакультуре (а, б)
и из естественных поселений ( в, г),
соответственно
1. Значимых различий в структурной
организации СКЕП и СКАК на
уровне световой микроскопии не
выявлено.
2. Обнаружены существенные
различия в темпах роста СКАК P.
verrucosa на полигонах с разными
параметрами среды (скорость
течения, прибойность).
3. Установлена взаимосвязь
скорости кальцификации скелета
и скорости течения.
Некоторые показатели структурной организация скелета аквакультур склерактиниевых кораллов
P. verrucosa в зависимости от условий произрастания
Акватория АК Глубина
Уровень
Темпы роста
Характер роста
Плотность кораллитов,
3
посадки, м прибойности колоний, см /год колоний
ед./см2
Открытая
1,8-2,3
высокий
1797,0
неравномерный
(Полигон 1)
100-270
Закрытая
1,8-2,3
низкий
493,0
равномерный
(Полигон 2)
27
4. Установлено, что длина ветвей СКАК больше из закрытых (от течений)
плантаций, а «открытость» ветвей (расстояние между ними) больше на
прибойных плантациях с турбулентностью течений.
5. Плотность кораллитов (как косвенный показатель пористости) в СКАК
выше, чем в соответствующих СКЕП ( до 270/см2 vs до 170/см2).
6. Плотность кораллитов на открытых (прибойных) плантациях выше, чем
на закрытых.
Некоторые показатели структурной организации скелета склерактиниевых
кораллов Pocillopora verrucosa из естественных поселений в зависимости
от условий произрастания
Акватория
ЕП
Глубина места
обитания, м
Уровень
прибойности
Длина
ветвей, см
Расстояние между
ветвями, см
Плотность
кораллитов, ед./см2
Открытая
2,0-4,0
высокий
7,0± 3,5
2,2
130-190
Закрытая
2,0-4,0
низкий
11,5± 5,2
1,3
90-160
Таким образом, сформулирован ряд условий среды обитания, от
которых зависит устойчивый рост аквакультур кораллов для их
последующего использования в медико-биологических
исследованиях.
28
Проведены исследования элементного состава
на кораллах Pocillopora verrucosa, Acropora nobilis
и A.formosa
Рентгеновские дифрактограммы
образцов скелета P. verrucosa,
A. nobilis и
A. formosa из естественных
поселений и аквакультур.
По данным РФА:
• Основной фазой СКАК и СКЕП
является арагонит (картотека JCDD)
высокой кристалличности
• Для образца СКЕП P. verrucosa
наблюдается смещение пиков в
сторону малых углов, что может
указывать на возможные
изоморфные замещения в структуре
основной фазы. В соответствии с
данными картотеки JCDD, этот
образец представлен тремя фазами –
кальцит, арагонит и
стронцийзамещенный арагонит.
• По химическому составу: все образцы
СКАК и СКЕП содержат примеси
переходных металлов на уровне
допустимых значений (стандарт ASTM
1185).
29
Исследование прочностных характеристик СКАК и СКЕП
Предел прочности скелета трех пар
образцов склерактиниевых
кораллов из естественных
поселений и аквакультур
СЭМ образцов скелета кораллов
Аcropora formoza: а – СКАК, б – СКЕП,
А.nobilis: в – СКАК, г – СКЕП,
Рocillopora verrucosa: д – СКАК , е –
30
СКЕП
Динамика деградации образцов кораллов из естественных
поселений и аквакультур исследована по потере массы образцов
в модельной жидкости (физиологический раствор, рН 7,4)
Наименее растворим: Pocillopora verrucosa из естественных поселений;
Наиболее растворим: Pocillopora verrucosa из аквакультуры.
Вывод: можно осуществить отбор образцов
аквакультур со скоростью деградации, близкой к
скорости остеогенеза
31
Оценка цитосовместимости (наличие/отсутствие острой
цитотоксичности и матриксных свойств поверхности) образцов
скелета аквакультур in vitro
7 суток
№
образца
кораллов
Образцы
кораллов
Контроль
(полистирен)
1
Acropora nobilis (АК)
2
A. hyacinthus (АК)
3
A. abrotanoides (АК)
4
A. samoensis (АК)
5
Pocillopora verrucosa
(АК)
6
A. cervicornis (ЕП)
Оптическая плотность раствора формазана (усл.ед.) и ПЖК (% по
отношению к контролю) в динамике эксперимента (сутки)
1
4
7
10
0,424±0,012
0,9±0,028
1,121±0,073
1,58±0,068
100%
100%
100%
100%
0.448±0.048
1,281±0.03*
1,625±0.128*
2.061±0.127*
105,7%
142,3%
142,3%
130,4%
0.596±0.016*
1,157±0.087*
1,227±0,007
1.611±0.08
140,6%
128,6%
109%
102%
0.583±0.012*
1,363±0.039*
1.788±0.069*
2,14±0.04*
137,5%
151,4%
159,5%
135,4%
0.662±0.018*
0.938±0.021
1,245±0.094
1,420±0,021
156,1%
104,2%
111,1%
84,2%
0.529±0.025*
1.381±0.038*
1.622±0.077*
2.024±0.058*
124,8%
153,4%
144,7%
128,1%
0.386±0.017
0.967±0.023
1.441±0.074*
1.942±0.073*
91%
107,4%
128,5%
122,9%
* - достоверность различий величины оптической плотности раствора формазана в
опытных группах от контроля по критерию Стьюдента при p<0.05
10 суток
контроль
А
7 суток
10 суток
Б
№1
В
№2
№3
Г
Плотность посева – 10 тыс.кл. /лунку, МТТ-тест, увел.20х
Ни один из исследованных образцов АК не обладал острой цитотоксичностью в отношении тест- культуры – перевивной
клеточной линии ФЧ (штамм 1608hTERT), (24 часа инкубации). В динамике экспериментов наблюдалось существенное
увеличение популяции фибробластов на образцах АК как в контроле, так и в опыте.
Установлено наличие матриксных свойств поверхности всех исследованных образцов кораллов, более выраженные у АК №1
(Acropora nobilis), №3 (A. abrotanoides), №5 (P. verrucosa) и №6 (A. cervicornis).
32
ТИК на основе гранул скелета аквакультур Acropora abrotanoides и
культуры ММСК крысы, меченной флуоресцентным красителем
CM-DiI, под кожей крысы
Подготовленная к имплантации ТИК:
ММСК КМ крысы (3 пассаж), меченные флуоресцентным
красителем CM Tracker CM DiI и префабрикованные в
течение 3-х суток на гранулах CКАК (увел.х 400)
ТИК при подкожной имплантации крысам
линии Wistar в динамике наблюдения
А – фазовый контраст, Б – флуоресцентная микроскопия
(увел.х 400)
А
1 неделя
Б
2 неделя
4 неделя
Демонстрация:
равномерное распределение культуры ММСК
КМ крысы по поверхности кораллового
матрикса
Н.С. Сергеева и соавт. Скелет аквакультур
склерактиниевых кораллов как возможный
3-D матрикс для клеточных культур и
инженерии костной ткани. Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины.
2013г., №10, с. 494-498
5 неделя
Демонстрация:
при флуоресцентной микроскопии выявлена яркая
флуоресценция в ММСК на сроках 1, 2 и 4 недель наблюдения,
ослабевающая к 5 неделе эксперимента
Биосовместимость АК кораллов при подкожной имплантации
крысам линии Wistar
На гистологических препаратах,
полученных в динамике
эксперимента (4, 8 и 12 недель
после подкожной имплантации
гранул АК кораллов и дикого
типа коралла Acropora
cervicornes) макро – и
микропризнаков отторжения,
клеточной реакции воспаления
не обнаружено, т.е. данные
образцы кораллов являются
биосовместимыми.
Гранулы коралла Acropora nobilis при подкожной
иплантации крысам: А - 4 недели, Б - 8 недель, В – 12
недель; увел.х100, окраска гематоксилин-эозином.
Коллектив участников
ФГБУ «Московский
научно-исследовательский онкологический
институт им. П.А.Герцена» МЗ РФ
акад. РАМН Чиссов В.И.
акад. РАМН Франк Г.А.
чл.-корр. РАМН Решетов И.В.
проф., д.б.н. Сергеева Н.С.
д.м.н. Тепляков В.В.
к.б.н. Свиридова И.К.
к.б.н. Кирсанова В.А.
к.б.н. Ахмедова С.А.
Шанский Я.Д.
Кувшинова Е.А.
к.м.н. Филюшин М.М.
к.м.н. Мыслевцев И.В.
ФГБУН «Институт металлургии
и материаловедения
им. А.А. Байкова» РАН
ФГБУН Институт проблем экологии и
эволюции им. А.Н.Северцова РАН
ФФМ, МГУ им. М.В.Ломоносова
ФГБУН Институт океанологии им.
П.П.Ширшова РАН
«Дороги, которые мы выбираем»
О. Генри
35
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!