КЛОНИРОВАНИЕ acdS-ГЕНА БАКТЕРИЙ P. MENDOCINA В

3. Fuentes-Ramirez L.E., Jimenez-Salgado T., Abarca-Ocampo I.R. and Cabellero-Mellado J. Acetobacter
Diazotrophicus, an indoleacetic acid producing bacterium isolated from sugar cane cultivars of Mexico//Plant Soil,
1993. – Vol.154. – Р.145 – 150
4. Leinhos V. Effects of pH and glucose on auxin production of phosphate-solubilizing rhizobacteria in vitro //
Microbiol. Res. - 1994. - V. 149. P. 135-138
5. Маниатис, Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 479 с.
6. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976.- 384с
7. Mavrides C., Orr W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli//J. Biol.
Chem.-1975.-V.250.-P.4128-4133
8. Asakawa T., Wada H., Yamano T. Enzymatic conversion of phenylpyruvate to phenylacetate. Biochim. Biophys.
Acta.- 1968. –V.170. –P. 375.
9. Honma M., Shimomura T. Metabolism of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid // Agric. Biol. Chem. – 1978. –
V. 42(10). – p.1825-1831.
10. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramguantities of protein utilizing the
principle of protein-dye bindingt // Anal. Biochem. – 1976. – V. 72. – p. 2489-254.
КЛОНИРОВАНИЕ acdS-ГЕНА БАКТЕРИЙ P. MENDOCINA В КЛЕТКАХ E. COLI
С.С. Жардецкий, Е.А. Храмцова, Н.П. Максимова
Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь
[email protected]
Бактерии, стимулирующие рост растений – это свободноживущие почвенные
микроорганизмы, обитающие в ризосфере и находящиеся в тесной взаимосвязи с корнями
растений. Бактерии, относящиеся к этой группе, оказывают положительное влияние на рост
и развитие растений, способствуют поддержанию их здоровья и сохранению плодородности
почв [1]. Данные микроорганизмы, стимулирующие рост растений, оказывают
положительное влияние на рост и развитие растений двумя путями [2; 3; 4]. Опосредованное
действие бактерий обусловлено подавлением размножения патогенных почвенных
микроорганизмов и предотвращением их негативного влияния на растение [5]. К одному из
основных механизмов стимуляции роста растений микроорганизмами «прямого действия»
относится синтез ферментов, способных регулировать количество растительных гормонов
[6; 3]. Одним из механизмов, который используется бактериями для стимуляции роста
растений, является снижение уровня растительного гормона этилена путем
дезаминирования непосредственного предшественника этилена 1-аминоциклопропан-1карбоксилата (АЦК). Эту реакцию осуществляет фермент АЦК – дезаминаза, обнаруженный
у многих почвенных бактерий. Благодаря активности этого фермента бактерии снижают
негативный эффект этилена на растение, способствуют удлинению корней растения и
образованию клубеньков. В 1998 году B. R. Glick et al. [3] предположили, что
микроорганизмы, способные синтезировать фермент АЦК – дезаминазу, могут усиливать
рост растения, поскольку они используют в качестве источника азота АЦК, снижая таким
образом уровень этилена в развивающемся или подверженном стрессу растении.
Нами была проведена работа по клонированию гена acdS, ответственного за синтез
АЦК-дезаминазы у бактерий Pseudomonas.
В качестве объекта исследований использовали штаммы ризосферных бактерий рода
Pseudomonas, полученные из коллекции НИЛ молекулярной генетики биологического
факультета БГУ. Измерение активности фермента 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат –
дезаминазы проводили методом описанным M. Honma, T. Shimomura, 1978 [7].
Выделение плазмидной и хромосомной ДНК, трансформацию, электрофорез в
агарозном геле проводили согласно руководству Маниатис [8]. Рестрикцию и лигирование
выполняли согласно инструкциям фирмы изготовителя используемых ферментов
(Fermentas).
237
Для амплификации acdS гена использовались вырожденные праймеры, предложенные
D. Blaha et al., 2006 [9]: 1937 (прямой): 5’-MGVAAGCTGGAATAYMTBRT-3’;
1938 (обратный): 5’-ATCATVCCVTGCATBGAYTT-3’.
В результате скрининга на наличие гена acdS с помощью ПЦР у трех из восемнадцати
исследованных штаммов бактерий рода Pseudomonas был получен ПЦР-продукт
ожидаемого размера. Амплифицированный ген бактерий P. mendocina был клонирован в
составе Т-вектора в клетки Escherichia coli DH5α. Отбор трансформантов осуществляли на
селективной среде, содержащей антибиотик ампициллин в концентрации 40 мкг/мл. В
результате эксперимента было отобрано 13 клонов. Все отобранные клоны содержали
плазмиду (pACC) размером около 4000 п.н., что соответствует Т-вектору, несущему ПЦРфрагмент (рис. 1). Осуществлен рестрикционный анализ полученной плазмиды (рис. 2).
1400 п.н.
P. mendocina
BKMB 1299
Рис. 1. Электрофоретический анализ продукта ПЦР в
0,7% агарозном геле: указан фрагмент размером ~1400
п.н. предположительно соответствующий гену acdS
бактерий P. mendocina BKMB 1299.
Рис. 2. Рестрикционная карта плазмиды рАСС3.
Были проведены измерения активности дезаминазы в клетках E. coli DH5α, несущих
клонированный фрагмент ДНК. В качестве контролей измерения проводили измерения
активности фермента у бактерий P. mendocina ВКМВ1299 и в бесплазмидном штамме E. coli
DH5α. Полученные данные, показали, что ген acdS экспрессируется в гетерологичной
системе (клетках E. coli DH5α), содержащих рекомбинантную плазмиду рАСС3. Уровень
экспрессии гена acdS сопоставим с таковым в гомологичной системе P. mendocina.
1. Glick B.R. The enhancement of plant growth by free-living bacteria//Can.J. Microbiol. – 1995. – V.41. – p.109-117
2. Bayliss C., Bent E., Culham D. E., MacLellan S., Clarke A. J., Brown G. L. et. al. Bacterial genetic loci implicated
in Pseudomonas putida GR 12-2R3- canola mutualism: identification of an exudate-inducible sugar transporter //
Can. J. Microbiol. – 1997. – V.43. – p.809-818.
3. Glick B. R., Penrose D. M., Li J. A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth
promoting bacteria // J. Theor. Biol. – 1998. – V.190. – p.63-68.
4. Penrose D. M., Glick B. R. Levels of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid in exudates and extracts of canola
seeds treated with plant growth promoting bacteria // Can. J. Microbiol. – 2001. – V.47. – p.369-372.
5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М.: Мир, 2002
238
6. Patten C. L., Glick B. R. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid // Can. J. Microbiol. – 1996. – V.42. – p.207220.
7. Honma M., Shimomura T. Metabolism of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid // Agric. Biol. Chem. – 1978. –
V.42(10). – p.1825-1831.
8. Маниатис, Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 479 с.
9. Blaha D., Prigent-Combaret C., Mirza M. S., Moenne-Locoz Y. Phylogeny of the 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid deaminase-encoding gene acdS in phytobeneficial and pathogenic Proteobacteria and relation with
strain biogeography // FEMS Microbiol. Ecol. – 2006. – V.56. – p.455-470.
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА
PENICILLIUM ADAMETZII ЛФ F-2044.1.17
Л.А. Жуковская1, Р.В. Михайлова1, Т.В. Семашко1, А.Г. Лобанок1,
Д.Г. Ярмолинский2, Н.А. Картель2
1
- ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь
2
- ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», Минск, Беларусь
[email protected]
Глюкозооксидаза (ГО) (β-D-глюкозо: О2-1-оксидоредуктаза, КФ 1.1.3.4.) – фермент
класса оксидоредуктаз, катализирующий окисление β-D-глюкозы до β-D-глюконолактона и
пероксида водорода. ГО относится к числу ферментов широко используемых в медицине
[1], пищевой и химической промышленностях [2-4].
Рентабельность производства ферментных препаратов в значительной степени зависит
от активности продуцентов, для усовершенствования которых применяются различные
методы, в том числе и методы генетической инженерии.
В лаборатории ферментов ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси» отобран
P. adametzii ЛФ F-2044.1 – продуцент ГО, характеризующийся морфологической и
биохимической стабильностью [5]. Из ДНК данного гриба выделен и охарактеризован ген
gox, кодирующий ГО [6].
Цель работы – сконструировать вектор, несущий ген gox P. adametzii ЛФ F-2044.1,
провести трансформацию P. adametzii ЛФ F-2044.1, получить рекомбинантный штамм с
повышенной по сравнению с исходным штаммом активностью ГО.
Вектор для трансформации P. adametzii ЛФ F-2044.1 1, несущий ген ген gox данного
штамма, конструировали на основе плазмиды pNOM102, любезно предоставленной
доктором P. Punt (Wageningen Center for Food Sciences (WCFS), Wageningen, The
Netherlands). Для этого ген gox P. adametzii ЛФ F-2044.1 встраивали в плазмиду pNOM102
под контроль промотора глицеральдегидфосфатдегидрогеназы A. nidulans и терминатора
гена индолглицеролфосфатсинтазы A. nidulans. Для встраивания гена gox в плазмиду
pNOM102 вводили полилинкер, несущий ряд дополнительных сайтов рестрикции. В буфер,
содержащий 10 мМ трис-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА добавляли 100 пмоль
олигонуклеотидов Linker NcoI-BamHI – F (CATGGATATCG-GTACCG) и Linker NcoIBamHI – R (GATCCGGTACCG-ATATC). Смесь прогревали при 95оС 5 мин на водяной бане
и медленно охлаждали до комнатной температуры. ДНК переосаждали спиртом и
использовали для лигирования с плазмидой pNOM102, линеаризованной ферментами NcoI и
BamHI. Строение полученного вектора исследовали с использованием рестрикционного
анализа. Сконструированный вектор назван pNOM102-GOX (рис. 1).
В связи со сложностью репликации крупных плазмид для трансформации мицелиальных
грибов обычно используют 2 вектора: экспрессионный и селективный [7]. В качестве
селективного вектора нами использовался p35S-NptII, несущий кассету, состоящую из 35S
промотора вируса цветной мозаики капусты, гена неомицин-фосфотрансферазы II (NptII) и
239