РАЗМНОЖЕНИЕ АКТИНИДИИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ПУТЕМ

РАЗМНОЖЕНИЕ АКТИНИДИИ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ПУТЕМ
РЕГЕНЕРАЦИИ
Зарнадзе Н.Ж. Ломтатидзе Н.Д.
Грузия, г. Батуми, Государственный университет им. Ш.Руставели
Д л я и з уч е н и я р е г е н е р а ц и о н н о й с п о с о б н о с т и р а с т е н и й в к а ч е с т в е
э к с п л а н т а т о в и с п о л ь з о в а л и уч а с т к и р а з н ы х л и с т ь е в п р о б ы р о ч н ы х
к у л ь т у р : У с т а н о в л е н о , ч т о д и п л о и д н ы й в и д Ac t i n i d i a c h i n e n s i s
х а р а к т е р и з уе т с я б о л е е в ы с о к о й р е г е н е р а ц и о н н о й с п о с о б н о с т ь ю п о
сравнени ю с ге кс апло идным видо м Act inid ia de lic io sa.
Б и о т е хн о л о г и ч е с к и е
методы
ус к о р е н н о г о
размножения
уни кальны х гено типо в и со здания генетич ес ки разно о бразно г о
м а т е р и а л а д л я с е л е к ц и и м о г ут и м е т ь ш и р о к и й в ы хо д в п р а к т и к у
л и ш ь в т е х с л уч а я х , к о г д а о б е с п е ч и в а е т с я с т а б и л ь н о е п о л уч е н и е
м а с с о в ы х к о л и ч е с т в р е г е н е р а н т о в п ут е м о р г а н о г е н е з а . Т р уд н о с т ь
п р е д с т а в л я е т п о д б о р г о р м о н о в и и х к о н ц е н т р а ц и е в д л я и н д ук ц и и
регенерации растении. Однако надо отметить на сегодняшний день
для др евесны х растении по дбо р фито го рмо но в не является
п р о б л е м н о й , о б э т о м т в е р д и т м н о г о ч и с л е н н ы е р а б о т ы п о к ул ь т у р е
тканей. [2, 3, 4].
Ц е л ь ю н а ш е й р а б о т ы б ы л о о т р а б о т а т ь ус л о в и я и н д ук ц и и
о р г а н о г е н е з а и п о л уч и т ь р а с т е н и я р е г е н е р а н т ы д в ух в и д о в
а к т и н и д и и : Ac t i n i d i a d e l i c io s a и Ac t i n i d i a c h i n e n s i s .
Д л я и з уч е н и я р е г е н е р а ц и о н н о й с п о с о б н о с т и р а с т е н и й в к а ч е с т в е
э к с п л а н т а т о в и с п о л ь з о в а л и уч а с т к и р а з н ы х л и с т ь е в п р о б ы р о ч н ы х
к у л ь т у р : м о л о д ы х, с р е д н и х п о в о з р а с т у и з р е л ы х . Л и с т ь я с р е з а л и с
побегов, с нижней стороны делали в доль жилки надрезы и помещали
н а п и т а т е л ь н ую с р е д у Г а м б о р г а В 5 , с д о б а в л е н и е м , в з а в и с и м о с т и
о т варианто в о пыта, разных ко личеств Б АП
(3-15µм) и НУК
(1,3µм).
П а с с и р о в а н и е н а с в е ж ую с р е д у п р о в о д и л и ч е р е з к а ж д ы е 2 0
д н е й . И з уч е н и е к а ж д о г о в а р и а н т а о п ы т а в е л и в т е ч е н и е о к о л о 8 - 1 0
нед ель (3-4 па ссаж а). К ул ьтивиро вали ли сто вые э кспл антаты п ри
д в у х р е ж и м а х: I ) в т е ч е н и е 1 2 д н е й в т е м н о т е , в т е р м о с т а т е п р и
т е м п е р а т ур е 2 7 ±
1° С
с п о с л е д ую щ и м п е р е н о с о м н а с в е т
( о с в е щ е н н о с т ь 2 - 3 к л ю к с , ф о т о п е р и о д 1 6 / 8 ч а с о в , т е м п е р а т ур а 2 5 ±
1° С), 2). эксп еримент полностью проводился н а св ету п ри
у к а з а н н о м в ы ш е с в е т о в о м и т е м п е р а т ур н о м р е ж и м е .
Морфогенетические потенции з релых
листьев были низкими .
Б о л ь ш и н с т в о э к с п л а н т а т о в ( и з н и х о к о л о 8 5 % ) к а л л ус н е
о б р а з о в ы в а л и , с л е г к а ув е л и ч и в а я с ь в о б ъ е м е к к о н ц у 0 - п а с с а ж а
п р и о б р е т а л и б л е д н ую ж е л т о в а т о - з е л е н ую о к р а с к у и в п е р в о м ж е
п а с с а ж е п о г и б а л и . Д р уг и е и з э т о г о т и п а э к с п л а н т а т о в ( 1 5 - 2 0 % )
о б р а з о в ы в а л и к а л л ус в д о л ь ж и л к и п р и н а л и ч и и в с р е д е Н У К в
к о н ц е н т р а ц и и 3 µ м . П р и р о с т б и о м а с с ы у н и х п о в и з уа л ь н о й о ц е н к е
б ы л м е д л е н н ы м , н о с и н х р о н н ы м . В п о с л е д ую щ и х п а с с а ж а х к а л л у с
формировал
почки,
частота
возникновения
которых
была
значите льно ниже, чем при испо льзо вании средни х по во зраст у
листьев.
На эксплантан тах ли стьев среднего возраста через 5-10 дн ей после
и х и з о л я ц и и о т м е ч а л и к а л л ус о о б р а з о в а н и е , к о т о ро е н а ч и н а л о с ь с
центральной
части
эксплантата,
постепенно
о хв а т ы в а я
его
периферию.
Через
20-25
дн ей
наблюдали
ди фференциаци ю
м о р ф о г е н н ы х уз л о в , а ч е р е з 3 0 - 3 5 д н е й о т 0 - п а с с а ж а р е г е н е р а ц и ю
первичны х листьев, почек и побегов. В дальн ейшем в течени е
четырех пассажей интенсивность органогенеза возрастала, к конц у
4-ого пассажа процесс дифференциации становился стаби льным, а к
5 - о м у п а с с а ж у з а м е т н о ум е н ь ш а л с я .
Выращивание
эксплантатов
в
разных
ус л о в и я х
освещения
п о к а з а л о р а з л и ч н ы й э ф ф е к т : к а л л ус о г е н е з п р о и с хо д и л в о б о и х
р е ж и м а х, н о т е м н о т а с т и м ул и р о в а л а и ус к о р я л а е г о и н д ук ц и ю .
Морфогенетические
потенции
эксплантатов,
предв арительно
инк уби ро ванных
в
темноте,
были
более
высокие,
чем
к у л ь т и в и р уе м ы х н е п о с р е д с т в е н н о н а с в е т у, с л е д о в а т е л ь н о , т е м н о в о й
период выращивания в течение 12 дней благоприятно и эффективно
влиял на
деди ференци ацию клеток и дальнейшее заложение
м о р ф о г е н н ы х уз л о в .
И н и ц и а ц и я к а л л ус н о й т к а н и у д и п л о и д н о г о в и д а
A. c h i n e n s i s
н а б л ю д а л а с ь н а 4 - 5 д н е й р а н ь ш е , ч е м г е к с о п л о и д н о г о A. d e l i c io s a .
В о в с е х в а р и а н т а х д и п л о и д н ы й в и д п р о - д уц и р о в а л б о л ь ш е е ч и с л о
к а л л у с о в и с о о т в е т с т в е н н о у н е г о ус т а н о в л е н б о л е е в ы с о к и й
процент регенерации почек и по бегов, чем у г ексоплоидного.
И н д у к ц и я к а л л ус а б о л е е и н т е н с и в н о п р о и с хо д и л а н а с р е д а х с 3 µ м
Н У К , п р и ув е л и ч е н и и е е к о н ц е н т р а ц и и п р о ц е с с ус и л и в а л с я , н о
ф о р м и р о в а н и е к а л л ус о в , ха р а к т е р и з у ю щ и хс я п о в ы ш е н н ы м р е г е н е рационным потенциалом отмечалось на средах о более низ ким
содержани ем НУК (сред ы С 1 - С 5 ) . К а к в и д н о и з т а б л и ц ы A. d e l i c io s a
и A. c h i n e n s i s
про являли также разный уро вень мо рфо генетичес ко го по тенциала,
ко то рый к то м у же з ависел о т го рмо нально го со става среды.
Э к с п л а н т а т ы A. d e l i c i o s a н а с а м ы е н и з к и е к о н ц е н т р а ц и и Б А П н е
о т в е ч а л и о б р а з о в а н и е м м е р и с т е м а т и ч е с к и х уз л о в и п р и м о р д и а л ь н ы х
п о ч е к в к а л л ус е , A. c h i n e n s i s с в о й м о р ф о г е н е т и ч е с к и й п о т е н ц и а л
п р о я в л я л а в э т и х ус л о в и я х о ч е н ь с л а б о . ( с р е д ы С 1 и С 5 ) .
И н т е н с и в н о с т ь с т е б л е в о г о м о р ф о г ен е з а з а м е т н о ус и л и в а л о с ь с
у в е л и ч е н и е м к о н ц е н т р а ц и и Б А П в с р е д е д о о п р е д е л е н н о г о ур о в н я ,
при это м о птимальные со о тно шения ко н- центрации Б АП и НУК
б ы л и р а з н ы м и у и з уч е н н ы х в и д о в . Н а и б о л е е п р о д ук т и в н ы м и д л я А .
c hine ns is
оказались
среды С3 и С4, на которых формировались
м а к с и м а л ь н о е ч и с л о р е г е н е р а н т о в . Д л я д р уг о г о в и д а А. d e l i c io s a ,
эффективные
ур о в н и
р е г ул я т о р о в
роста
были
сравнительно
высокие.(среды С4 и С9).
Р а з н ы е о п т и м а л ь н ы е ур о в н и р е г ул я т о р о в ро с т а д л я и н д ук ц и и
органогенеза
у
и з уч е н ных
видов,
видимо,
о б ус л о в л е н ы
г е н е т и ч е с к и . И з в е с т н о , ч т о з а л о ж е н и е и п о с л е д ую щ а я
реализация
почек является
следствием ди фференциальной активности генов.
Э т а а к т и - в н о с т ь р е г ул и р уе т с я г о р м о н а л ь н ы м и и н д ук т о р а м и [ 1 ] .
Компетентность у разны х г енотипов, в том числе, видимо, и у
а к т и н и д и и р а з н а я , ч т о о б ус л о в и л о р а з л и ч и я
в оптимальных для
р е г е н е р а ц и и в к о н ц е н т р а ц и я х э к з о г е н н ы х р е г ул я т о р о в р о с т а .
Регенери рованные почки и стебли
с р е з а л и с к а л л ус а и
доращивали на среде Гамборга Б 5
с добавлением 3 µ м
Б АП .
Более 60-65%
из регенерированных
почек развивались, в
нормальные побеги. Побеги высотой 20-25 мм. переносили на среду
д л я ук о р е н е н и я , с о д е р ж а щ ую И М К в к о н ц е н т р а ц и и 4 µ м .
И с п о л ь з уе м а я с р е д а о б е с п е ч и л а 9 0 - 1 0 0 % - н о е ук о р е н е н и е п о б е г о в
особих
ви дов
актини дии.Укорененные
растения-регенеранты
п е р е н о с и л и в н е с т е р и л ь н ы е ус л о в и я . Д л я п е р е с а д к и и с п о л ь з о в а л и
смесь почвы и речного песка в соотношении 1:1. Акклиматизацию
проводили в теплице. В течение 5-6 дней поддерживали влажность
1 0 0 % , к о т о р ую п о с т е п е н н о с н и ж а л и и ч е р е з 8 - 1 0 д н е й р а с т е н и я регенеранты
актини дии
могли
нормально
развиваться
в
е с т е с т в е н н ы х ус л о в и я х .
Таким
о б р а з о м , н а м и ус т а н о в л е н о , ч т о д и п л о и д н ы й в и д
Act inid ia
c hine ns is
х а р а к т е р и з уе т с я
более
высокой
регенерационной
способностью
п о сравнению с гексаплоидным
в и д о м A c t i n i d i a d e l i c io s a . Н а б л ю д а л и з а в и с и м о с т ь р е г е н е р а ц и и о т
п о л а р а с т е н и я , в о з р а с т а и с хо д н о г о э к с п л а н т а т а ( л и с т а ) , ус л о в и й
освещения и от гормонального состава питательной среды. Для
о б о и х и з уч е н н ы х
в и д о в п о д о б р а н ы ус л о в и я , о б е с п е ч и в а ю щ и е п о л уч е н и е к а л л у с а ,
его
пассиро вание, регенер ацию из него по чек и по бего в, их
у к о р е н е н и ю , п е р е н о с в о т к р ы т ы й г р ун т и и х п р и ж и в а н и е в
е с т е с т в е н н ы х ус л о в и я х . У с т а н о в л е н о , ч т о г о р м о н а л ь н ы й с о с т а в
среды влияет н а морфологию растен ий-регенерантов, изменяя форм у
листа. Однако эти изменения в процессе онтогенеза растенийр е г е н е р а н т о в и с ч е з а л и и укорененные растения морфологически не отличались
от исходных растений.
Л И Т Е Р А Т У Р А:
1. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток
растений. М.Наука 1975 г.
2. Phehn D., Serrano G., Mercado A. Regeneration of whole plants from apical meristems
of Pinus radiate // Plant Cell, Tissue and organ culture. 2003, 73. N 1.
3. Nanda R.M. In vitro embryogesis and plant regeneration in Acacia Arabica // Plant
Cell, Tissue and Organ culture, 2003 V.73. N 3.
4. Branka P. Sibila J. Thegeneration ability in common oak ( Quercus robur L.) Callus
cultures // Acta pharm. 1995. V.45. N 2.