ЛАРИНА Ираида Васильевна - Официальный сайт Научного
реклама
На правах рукописи ЛАРИНА Ираида Васильевна РАССЕЯННЫЙ СКЛЕРОЗ И АДГЕЗИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ И СЫВОРОТКИ КРОВИ (КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.00.13 – нервные болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 2 Работа выполнена в Научном центре неврологии Российской академии медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Завалишин Игорь Алексеевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Кадыков Альберт Серафимович доктор медицинских наук, профессор Кипарисова Елена Сергеевна Ведущая организация: Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет Защита состоится «3» марта 2009 г. в 12 часов на заседании совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 001.006.01 при Научном центре неврологии Российской академии медицинских наук по адресу: 125367 Москва, Волоколамское шоссе, 80. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦН РАМН Автореферат разослан «___»________2009г. Учёный секретарь совета по защите кандидатских и докторских диссертаций Д 001.006.01, кандидат медицинских наук Домашенко М.А. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Рассеянный склероз (РС) - одно из наиболее распространённых демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы (ЦНС). По распространённости среди заболеваний ЦНС РС занимает четвертое место после острых нарушений мозгового кровообращения, эпилепсии и паркинсонизма, в молодом возрасте – второе место после эпилепсии. Хроническое прогрессирующее течение РС, поражение преимущественно лиц молодого и среднего возраста, ранняя инвалидизация, недостаточная эффективность проводимой терапии подтверждают медицинскую и социальную значимость проблемы. Исследования последних лет показали сложность и многогранность патогенеза РС. РС является заболеванием с выраженной клинической вариабельностью, непредсказуемостью прогноза. Несмотря на активное изучение, этиология и патогенез РС остаются не вполне ясными. Актуальной проблемой является изучение механизмов развития неврологической симптоматики и вариантов течения заболевания. Очаги демиелинизации в ЦНС, выявляемые с помощью магнитнорезонансной томографии (МРТ), не всегда и не в полной мере соответствуют клиническим данным. В последние годы большое внимание уделяется не только изучению иммунологических и биохимических нарушений, приводящих к обострению болезни и формированию ремиссий, но и также сопоставлению патогенетических особенностей различных вариантов течения РС. (Гусев Е.И., Завалишин И.А., Бойко А.Н., 2004; Беляева И.А., 2000; Кротенкова М.В., 2002; Тринитатский Ю.В., 2003; Олейников В.Г., 2004, Опольский М.Б., 2005). Ключевую роль в миграции специфичных к антигенам нервной ткани (основному белку миелина (ОБМ) и др.) аутореактивных Т- лимфоцитов через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в ЦНС играют молекулы адгезии, экспрессирующиеся как на поверхности Т-лимфоцитов, 4 так и на эндотелиальных клетках. На современном этапе, изучение адгезивных молекул (МА) является актуальным как в понимании патогенеза различных типов течения РС, так и разработки перспективных направлений патогенетической терапии РС. В последние годы проводятся исследования возможности использования моноклональных антител против некоторых форм МА с терапевтической целью. В осуществлении целого ряда физиологических и патологических процессов важнейшую роль играют адгезивные свойства лейкоцитов крови. Способность лейкоцитов крови к адгезии (прилипанию) была известна давно. Однако значимость этого свойства долгое время недооценивалась. В настоящее время адгезионным взаимодействиям различного типа клеток между собой, а также их взаимодействию с межклеточным матриксом отводится ведущая роль во многих процессах, развивающихся как в физиологических условиях, так и в условиях патологии. К их числу относятся такие, как активация и дифференцировка иммунокомпетентных клеток, преодоление клетками гистогематических барьеров, развитие воспалительных реакций, передача всевозможных сигналов и другие. Субстратом, межклеточного опосредующим матрикса, взаимную являются адгезивные адгезию клеток молекулы, и причём прилипание (или распластывание клеток на субстрате) служит одним из проявлений их функциональной активации. В целостном организме адгезия клеток развивается по отношению к другим клеткам, эндотелию сосудов, межклеточному матриксу, а в условиях in vitro она воспроизводится к неспецифическим субстратам, в частности, стеклу, пластиковой поверхности; при этом предполагается, что данное явление отражает способность клеток к прилипанию к эндотелию. Идентифицировано более 5 групп МА, в их числе интегрины, селектины, суперсемейство иммуноглобулинов и другие. Известно существование двух различных форм МА: растворимой (рМА) и связанной с поверхностью клеточных мембран (мМА). Методы определения уровня молекул адгезии в клинических условиях принципиально 5 разработаны, однако остаются малодоступными в связи с большой трудоёмкостью и высокой стоимостью тест – систем для определения рМА, что объясняет ограниченное число исследований роли МА при РС. Все вышеизложенное послужило основанием для определения и изучения клинического значения адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови при РС. Цель исследование исследования. Провести клинико-иммунологическое с оценкой различных параметров адгезивной активности клеток и сыворотки крови больных РС. Задачи исследования 1. Изучить адгезивную активность лейкоцитов и сыворотки крови у больных рассеянным склерозом (РС) с помощью оригинального способа, разработанного на основе нового реакции подавления прилипания лейкоцитов (РППЛ). 2. Провести сопоставление индекса спонтанной адгезии (ИСА) и эффекта усиления адгезии под действием аутосыворотки (ЭУс-а) со степенью активности патологического процесса, длительностью, тяжестью и клиническими проявлениями заболевания. 3. Исследовать сенсибилизацию лейкоцитов крови к основному белку миелина, смеси ганглиозидов из мозга быка (ГМ) и туберкулопротеину (ТП) с помощью РППЛ у больных РС. 4. Уточнить состояние количественных показателей клеточного иммунитета с помощью определения основных субпопуляций лимфоцитов крови (фенотипы CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+) и активированных клеток (CD25+, CD95+, HLA-DR+) у больных РС. 5. Исследовать гуморальный иммунитет с определением содержания иммуноглобулинов G, A, М и иммунных комплексов (ИК) в сыворотке крови больных РС. 6. Изучить взаимосвязь показателей адгезии с другими показателями иммунного статуса больных РС, и оценить диагностическую и 6 прогностическую значимость адгезивной активности лейкоцитов и сыворотки крови у больных РС. Научная новизна. Впервые применён оригинальный метод определения суммарной адгезивной активности лейкоцитов и сыворотки крови. Получен патент на изобретение №2246728 "Способ определения адгезивных свойств лейкоцитов крови", приоритет изобретения от 03 апреля 2003; зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.02.2005г. Проведённое исследование позволило получить новые данные, характеризующие адгезивную активность лейкоцитов и сыворотки крови, взаимосвязи показателей адгезии с клиническими проявлениями у больных РС, а также с особенностями клеточного, гуморального иммунитета при различных типах течения, длительности и тяжести заболевания. Сравнительный анализ показателей адгезии и иммунного статуса в зависимости от типа течения, длительности и тяжести заболевания показал значительные отличия в изменении изучаемых параметров, что отражает этапы демиелинизирующего процесса. Теоретическая и практическая значимость работы Установлены параметры показателей адгезии (значение индексов спонтанной адгезии и эффекта аутосыворотки), которые могут дополнительных лабораторных усиления быть адгезии под использованы критериев действием в качестве прогнозирования характера течения РС. Предложенный способ определения показателей азгезии и вычисления величин ИСА и ЭУс-а позволил выявить повышение адгезивной активности лейкоцитов и сыворотки при РС и использовать их для скринингового определения суммарного содержания мембранных и растворимых форм адгезивных молекул заболеваниях. исследование Проведённое расширяет как при РС, так и при других комплексное представление о клинико-иммунологическое механизмах формирования 7 иммунного ответа при РС, и влияние факторов адгезии на гетерогенность клинических проявлений. Основные положения, выносимые на защиту 1. У больных РС обнаружено повышение адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови. Установлена взаимосвязь показателей адгезии с характером течения РС, активностью патологического процесса, а также с клиническими проявлениями заболевания. 2. Показатели адгезии (индекс спонтанной адгезии, эффект усиления адгезии под действием сыворотки) могут использоваться как критерий подтверждения развития обострения заболевания и выхода в ремиссию, а также прогнозирования типа течения РС. 3. Различный характер и особенности взаимосвязей иммунных параметров с показателями адгезии при разных клинических проявлениях РС подтверждают их существенный вклад в клиническую гетерогенность заболевания. Апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании научных сотрудников лаборатории экспериментальной патологии нервной системы, нейроинфекционного и нейрогенетического отделений, сосудистых, научно-консультативного, отделения II, III нейрореанимации, лаборатории клинической нейрофизиологии ГУ НЦН РАМН от 02.07.08г. Материалы диссертации международным участием: были представлены на конференциях с на III Всемирном конгрессе «Клиническая патология и реабилитация в медицине», Тайланд, 2005; IX Международном конгрессе по клинической патологии, 2004. На ХII Всероссийской научно-практической конференции неврологов «Нейроиммунология», Санкт-Петербург, 2003г. стендовый доклад «Новый способ оценки адгезивной активности лейкоцитов крови и влияния сыворотки на адгезию клеток» занял 3 место. Публикации: по материалам диссертации опубликовано 16 научных работ. 8 Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырёх глав, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 37 работ российских и 81 работу иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 33 таблицами и 24 рисунками. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Пациенты. В обследуемую клиническую группу вошло 100 больных рассеянным склерозом. Контрольная группа состояла из 54 здоровых доноров крови, сопоставимых с больными РС по возрасту и полу. Группу сравнения заболеваниями составили (ДНЗ), 33 пациента с другими преимущественно с неврологическими нейродегенеративными заболеваниями нервной системы. В соответствии с поставленными задачами исследования больные основной группы были распределены по основным критериям течения РС: типу течения, длительности заболевания и степени тяжести. Для распределения больных по типу течения РС использованы критерии О.А. Хондкариана и соавт. (1987). Большинство больных были представлены ремиттирующим и прогредиентным течением РС (48 и 46 человек соответственно). При ремиттирующем течении РС выделены группы больных в стадии ремиссии (РРС-р) -9 больных, и в стадии обострения (РРСо)- 39 больных. Также была выделена группа больных с дебютом РС (РС-д) 6 больных. Среди прогредиентных форм - 12 больных были с первичнопрогредиентным рассеянным склерозом (ППРС) и 34 пациента со вторичнопрогредиентным рассеянным склерозом (ВПРС) с обострениями. Большинство больных РС (55%) имело среднетяжелое течение от 4 до 6,5 баллов по шкале EDSS (Kurtzke J.F., 1983). Легкое течение было у 29% больных и тяжелое у 16%. В целом в группе больных РС средний балл по шкале EDSS составил 4,6±1,9 (М±SD). Методы. Оценивались основные показатели гуморального и клеточного иммунитета. У всех исследуемых пациентов (n=100) определяли 9 реактивность клеток крови к ОБМ, к смеси ганглиозидов из мозга быка и к ТП, а также эффект усиления адгезии под действием аутосыворотки с помощью реакции подавления прилипания лейкоцитов (РППЛ). РППЛ ранее использовалась для выявления сенсибилизации лимфоцитов к различным антигенам. Однако данный способ не предполагал оценку адгезивных свойств лейкоцитов крови и влияния аутосыворотки на адгезию лейкоцитов в виде возможного усиления адгезии лейкоцитов крови, не зависящего от действия антигенов. Для учёта указанных выше показателей на основе РППЛ был предложен новый метод суммарной адгезивной активности сыворотки и с оценкой лейкоцитов крови. Применяли микромодификацию теста с использованием пластиковых микропланшет. В кратком изложении способ заключается в постановке дополнительных проб, дающих возможность произвести подсчёты общего числа клеток в пробе до и после инкубации как в среде без аутосыворотки, так и с добавлением аутосыворотки. Индекс спонтанной адгезии (ИСА) - величина отношения числа адгезивных клеток к числу не адгезивных клеток в составе выделенного лейкоконцентрата крови после 1,5 часовой инкубации при t°=37°С, выраженная в процентах (%). ИСА - показатель, отражающий адгезивные свойства лейкоцитов, и предложен для оценки суммарного уровня экспрессии МА на поверхности лейкоцитов крови мМА. Исследование ИСА проведено у 79 больных РС и у 23 доноров, группу сравнения составил 31 пациент с ДНЗ. Аналогичным образом оценивалось повышение адгезивных свойств сыворотки. С этой целью ставилась проба с инкубацией клеток в среде с добавлением аутосыворотки. Отношение числа клеток, подвергшихся дополнительной адгезии к числу не прилипших клеток в пробе с аутосывороткой после 1,5 часовой инкубации при t°=37°С, выраженное в процентах, названо эффектом усиления адгезии под аутосыворотки (ЭУс-а), и учитывалось при величине 30% и более. действием 10 Для определения лимфоцитов количественных показателей субпопуляций использовался метод непрямой иммунофлюоресценции с (флюоресцеинизотиоцианат) FITC – конъюгатами против иммуноглобулинов мыши. Определяли относительное и абсолютное содержание Т- и Влимфоцитов и отдельных субпопуляций иммунокомпетентных клеток: СD3, СD4, СD8, СD16 и СD20 (n= 91). Определяли активированные лимфоциты трех фенотипов: СD25+ (экспрессирующие рецептор к интерлейкину-2), который считается маркером “ранней” активации; фенотип СD95+, выявляющий Fas – антиген, опосредующий апоптоз клеток (n=41); фенотип HLA-DR+, антиген, экспрессирующийся на В-клетках и активированных Тлимфоцитах, более характерный для длительной антигенной стимуляции – маркер «поздней» активации (n=54). Группа контроля оценки содержания активационных лимфоцитов состояла из 21 донора. Проведено исследование содержания иммуноглобулинов G, A, M классов методом радиальной иммунодиффузии по методу Манчини (1965) у 94 больных РС и у 36 доноров. Фракционный состав иммунных комплексов (ИК) исследовали по методу Фролова В.М. и соавт. (1986) преципитацией 2%, 3,75%, 5,5% растворами полиэтиленгликоля 6000 М, в боратном буфере с рН 8,4 с последующей спектрофотометрией на фотометре КФК-3-01 при длине волны – 450 нм. Исследование содержания фракционного состава ИК (крупно-, средне-, мелкомолекулярных фракций) выполнено у 38 больных РС и у 15 доноров. Статистическая обработка материала проведена с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США). Использовались методы описательной статистики, непараметрический метод сравнения двух независимых величин, корреляционный анализ. При анализе вида распределения исследованных признаков использован критерий Шапиро Уилка. Распределение признаков описывалось средними значениями и среднеквадратичными отклонениями (М±SD). В случае нормальных 11 распределений для сравнения средних значений в группах использовался Ткритерий Стъюдента. Признаки, распределение которых отличалось от нормального, описывались медианами (Ме) и интерквартильными отрезками между нижним (LQ) и верхним (UQ) квартилями в формате Me[LQ;UQ]. Для сравнения связанных групп по количественным и качественным признакам использовался сопряжённости непараметрический использовался метод ранговый Манна-Уитни. Для корреляционный оценки анализ с применением критерия Спирмена и тау-Кендалла. Для всех видов статистического анализа различия считались статистически значимыми при р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ Исследование ИССЛЕДОВАНИЯ адгезивной активности лейкоцитов крови и эффекта усиления адгезии под действием аутосыворотки При анализе результатов определения ИСА и ЭУс-а у больных РС выявлены различия этих показателей по сравнению с контролем и больными с ДНЗ (табл. 1). Таблица 1 Показатели адгезивной активности лейкоцитов и сыворотки крови в сравниваемых группах (M±SD; Me[LQ;UQ]) Показатели ИСА (значения ИСА) ЭУс-а (доля от n) РС 26,93± 11,62 23[18;35] (n=79) 0,40 (n=100) Доноры ДНЗ Р 20,56± 7,72 32,35±12,90 рI-II=0,01 18[14;27] 30[23;40] рI-III= 0,03 (n=23) (n=31) рIII-II= 0,0002 0,17 0,24 рI-II=0,003 (n=53) (n=33) При РС значения ИСА колебались от 11% до 63% (табл. 2), средний показатель составил 26,93±11,60%, что отличалось от контрольной группы (р=0,01), в которой значения ИСА колебались от 9% до 38%, а средний показатель ИСА составил 20,56±7,72%. В группе больных с ДНЗ диапазон колебаний составил от 14% до 64%, и среднее значение ИСА было выше, чем в группе контроля (р=0,0002). При анализе результатов было выделено 12 три диапазона показателей ИСА (табл. 2): низкие значения ИСА до 20%, средние - от 21 до 30% и высокие - ИСА> 30%. Таблица 2 Результаты определения индекса спонтанной адгезии у больных РС и лиц контрольных группы Частота встречаемости различных диапазонов ИСА Группа Группа Группа больных сравнения контроля РС (ДНЗ) + (норма)* n = 79 n=31 n=23 % от числа обследованных лиц (в скобках - абс. число). 36,7% (29) 19,4%(6) 56,5% (13) I. Низкие показатели ИСА: до 20 %. II.Средние показатели ИСА: 29,1% (23) 32,25% (10) от 21% до 30% III.Высокие показатели ИСА: 34,2% (27) 48,4% (15) > 30% *р = 0,01 *р =0,001 Весь диапазон значений ИСА в группах от 11 до 63% от 14 до 64% 34,8% (8) 8,7% (2) от 9 до 38% В группе контроля максимальный показатель ИСА составил 38% и лишь у 2 доноров он превышал 30%. В группе больных РС и ДНЗ встречались значительно более высокие значения этого показателя (до 64%). ИСА >30 50% 45% ИСА>40 * * 40% * 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% РС Норма ДНЗ * р<0,05 по сравнению с нормой Рис.1. Структура высоких значений ИСА в сравниваемых группах 13 Высокие показатели ИСА (>30%) значительно чаще, чем в группе контроля, встречались у больных РС (р=0,01) и в группе больных с ДНЗ (р=0,001). В структуре высоких значений ИСА выделен диапазон «очень высоких» показателей - более 40% (рис.1), который чаще отмечался при РС (р=0,05) и ДНЗ (р=0,01). Второй показатель, который анализировался в работе - эффект усиления адгезии под действием аутосыворотки выявлялся (ЭУс-а), у больных РС значительно чаще, чем в группах сравнения (р=0,003) и группе ДНЗ (табл.1). При проведении анализа показателей адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови в подгруппах течения, а также больных РС с различным характером с длительностью и тяжестью заболевания, выявлена их наибольшая взаимосвязь с типом течения РС (рис.2). 70% * * Высокие ИСА Очень высокие ИСА + 60% * 50% * * * 40% 30% ЭУс-а + * * 20% * 10% 0% ППРС * p<0,05 ВПРС РРС-о по сравнению с нормой РРС-р РС-д норма + р<0,05 по сравнению с ДНЗ Рис. 2. Частота выявления высоких значений ДНЗ ИСА и ЭУс-а при разных типах течения РС Максимально частое выявление высоких значений ИСА (р=0,0009) и ЭУс-а (р=0,0002) обнаружено при первично-прогредиентном течении РС, а также в стадии обострения (р=0,02 и р=0,01 соответственно) при ремиттирующей форме РС. 14 При ВПРС, как и при дебюте РС, не было отмечено значительного повышения ИСА с чёткой тенденцией к более частому выявлению ЭУс-а. Стадия ремиссии РРС ассоциируется со снижением выявления как ЭУс-а, так и высоких показателей ИСА, и достоверных различий с нормой не имеет. Следует отметить, что характер изменений ИСА и ЭУс-а при длительности заболевания более 10 лет и тяжести неврологического дефицита более 6,5 баллов имеет сходство со структурой аналогичных показателей в группе больных с ДНЗ. При этом отмечается наиболее выраженное и статистически значимое повышение лишь уровня мембранных адгезивных молекул. Можно предположить, что это сходство обусловлено выраженными дегенеративными, аксональными повреждениями у больных указанных групп. Таким образом, установлена взаимосвязь показателей адгезии с характером течения РС, активностью процесса и, в меньшей степени, с тяжестью заболевания и его длительностью. Повышение показателей адгезии в дебюте и на ранних стадиях заболевания указывают на важную роль мембранных (мМА) и растворимых форм молекул адгезии (рМА) в инициации иммунопатологического процесса при РС, а при большой его длительности и тяжести заболевания - в его прогрессировании. Исследование клеточной реактивности к основному белку миелина (ОБМ), туберкулоротеину (ТП), ганглиозидам мозга (ГМ) с помощью метода РППЛ При сопоставлении результатов исследования антигенреактивности клеток крови выявлено статистически значимое (р<0,01) повышение гиперчувствительности клеток крови больных РС ко всем использованным в работе антигенам: ОБМ, ГМ и ТП. В группе сравнения (ДНЗ) не выявлено повышения реактивности ни к одному из использованных нами антигенов (рис.3). 15 Обращает на себя внимание наиболее высокая в сравнении с другими подгруппами, гиперчувствительность к ОБМ у больных с дебютом РС и в ранние сроки заболевания. Наряду с этим, уже в дебюте РС у больных регистрируется значимая реактивность и к ГМ, и к ТП. ОБМ * * ТП ГМ + + 40% * 35% + 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% РС * Норма Группа сравнения (ДНЗ) р<0,05 по сравнению с нормой + р<0,05 по сравнению с ДНЗ Рис.3. Показатели клеточной реактивности к ОБМ, ГМ ТП у больных РС Выявлена прямая взаимосвязь гиперчувствительности к реактивностью как к ОБМ, так и к ГМ. Это, по-видимому, подтверждать расширение репертуара антигенов, ТП с может участвующих в аутоиммунном процессе, в основе которого может лежать механизм перекрёстной реактивности. Состояние гиперчувствительности к ОБМ, ГМ и ТП обнаружено в подгруппах со ВПРС и РРС в период обострения заболевания. В подгруппе ППРС отмечено значимое повышение реактивности лишь по отношению к ГМ. Для подгруппы РРС на стадии ремиссии не характерно повышение реактивности к исследованным антигенам, при этом ни в одном 16 наблюдении не установлено положительного ответа на ТП. Из этого следует возможность практического применения РППЛ с ОБМ, ГМ, и, особенно ТП, в комплексе с другими параметрами для подтверждения стадий ремиссии и обострения при РРС. Клеточная гиперчувствительность к ОБМ и ГМ была представлена в подгруппах больных с различной длительностью заболевания, начиная уже с первых лет развития, а также в сроки более 10 лет, что подтверждает роль ОБМ как в инициации аутоиммунного процесса, так и в развитии вторичного прогрессирования РС в поздние сроки. Клеточная реактивность к ТП наиболее часто выявлялась у больных с длительностью РС от 2 до 10 лет (р=0,01), что, вероятно, связано с типом течения и активностью патологического процесса при РС. У больных РС с неврологическим дефицитом более 6,5 баллов выявление реактивности к ОБМ и ТП несколько снижается, а гиперчувствительность к ГМ имеет тенденцию к нарастанию. Аналогичные тенденции прослеживаются и по мере увеличения длительности заболевания, что может отражать ослабление роли аутоиммунных проявлений и преобладание дегенеративных изменений. Следует отметить, что реактивность к ГМ у больных ППРС и длительностью РС более 10 лет статистически не отличалась от группы больных ДНЗ, что может отражать прогредиентность течения и преобладание дегенеративных изменений у этих больных. Определение субпопуляций лимфоцитов крови (фенотипы CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+) и активированных клеток (CD25+, CD95+, HLADR+) при РС В группе больных РС в сравнении с группой доноров, выявлено достоверное повышение количества лейкоцитов (р=0,02), снижение 17 процентного содержания Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), цитотоксических Т-клеток (CD8+), а также абсолютного содержания субпопуляций CD25+ клеток, что подтверждает данные ряда авторов. Выраженные изменения фенотипического состава лимфоцитов крови были выявлены нами в подгруппе больных с дебютом заболевания и при ремиттирующем течении РС. Следует отметить, что характерной только для дебюта РС была низкая экспрессия CD95+ фенотипа, маркера Fas- антигена (рис. 4). Мы полагаем, что активированные лимфоциты на стадии дебюта мигрируют в очаги поражения, однако этот процесс не сопровождается апоптозом иммунокомпетентных клеток периферической крови. Рис. 4 Фенотипический состав лимфоцитов крови в дебюте РС * сравнение с нормой р<0,05 Характерным для дебюта РС является также разнонаправленность относительного (процентного) и абсолютного содержания Т клеток, субпопуляций СD4+, и в меньшей степени CD8+ клеток. В связи с развитием заболевания на фоне лейко- и лимфоцитоза, абсолютные значения этих субпопуляций у больных РС-д повышены, тогда как их относительное содержание снижено. В период обострения РРС отмечается снижение относительного содержания CD8+ лимфоцитов (рис.5). В отличие от дебюта РС, отмечалось 18 повышение содержания CD95+ клеток, маркёров апоптоза, кроме того, отмечается более выраженное (р=0,04), чем при других подтипах РС, снижение содержания CD25+ клеток крови. Период ремиссии при РРС (рис.6) характеризуется возрастанием содержания основных субпопуляций, в том числе CD8+ клеток в сочетании со снижением количества В-лимфоцитов (CD20+) и наибольшим, по отношению к другим формам РС, увеличением экспрессии на лимфоцитах крови антигена CD95+. Мы полагаем, что такой характер изменений связан с элиминацией посредством апоптоза активированных лимфоцитов, то есть развитием так называемого «активационного» апоптоза. * р<0,05 сравнение с нормой Рис.5 Фенотипический состав лимфоцитов крови при обострении РРС * р<0,05 сравнение с нормой Рис. 6 Фенотипический состав лимфоцитов крови при ремиссии РРС 19 В подгруппах больных с прогредиентным течением заболевания выявлено снижение процентного содержания CD3+, CD4+, CD8+ при повышении их абсолютного количества при ППРС. Содержание Влимфоцитов (CD20+), HLA-DR+ и экспрессия CD95+ имели тенденцию к повышению, что, по-видимому, отражает вялотекущий воспалительный аутоиммунный процесс. Таким образом, выявлены изменения иммунограмм уже на стадии дебюта заболевания и при небольшой его длительности, и отмечены некоторые различия при прогредиентном и ремиттирующем течении болезни. Изменения фенотипического состава лимфоцитов у больных РС в наибольшей степени были связаны с типом течения РС и активностью иммунопатологического процесса, и в меньшей степени с длительностью и тяжестью неврологического дефицита при РС. Определение содержания иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM), иммунных комплексов, их фракционного состава (крупно-, средне- и мелко-молекулярной фракций) в сыворотке крови при РС. В группе больных РС в целом, выявлено повышение содержания IgМ (р<0,001), общего количества ИК (р=0,02) и уровня мелкомолекулярной фракции ИК (р=0,03). При исследовании иммуноглобулинов и ИК при РС, выявлена взаимосвязь этих показателей с типом течения РС, активностью процесса, а также с тяжестью неврологического дефицита. Значительное повышение количества IgM обнаружено при всех типах РС, кроме РРС в стадии ремиссии. Отмечается значительное снижение уровня IgA при ППРС (р=0,02) и тенденция его к снижению в период ремиссии при РРС. В дебюте РС повышение уровня IgM сочетается со статистически значимым повышением содержания IgG. Содержание IgG прямо коррелировало с тяжестью течения РС, а также с уровнем IgM. Увеличение содержания IgM ассоциировалось с повышением мелкомолекулярной фракции ИК. 20 Отмечалось постепенное повышение содержания ИК и их фракций в зависимости от тяжести заболевания. В подгруппе больных со средней тяжестью заболевания отмечалось увеличение общего количества и мелкомолекулярной фракции ИК. При неврологическом дефиците более 6,5 баллов выявлено повышение как общего содержания ИК, так и максимальное повышение уровня всех фракций ИК. Сопоставление адгезивных свойств крови и показателей клеточного, гуморального иммунитета и клиническая гетерогенность РС Отмечено расширение числа корреляционных связей у больных с повышенными значениями показателей адгезии, что свидетельствует об их значительной роли в повреждении нервной ткани. Как следует из таблицы 3 «очень высокие» значения ИСА(>40%) были взаимосвязаны с повышением лейкоцитов, В-лимфоцитов, HLA-DR+ клеток, маркёра АПК; CD16+ (NK клеток) и уровнем CD95+ и IgM, особенно в период обострения РРС. Таблица 3 Корреляционные связи ИСА с другими иммунологическими показателями крови при РС Показатели ИСА (весь диапазон %) РС (n=79) ИСА >30% ИСА >40% Реактивность к ТП r= -0,47 р=0,01 Лейкоциты (абс.ч.) CD4+ (%) n=79 r=0,16 p=0,04 r=0,34 p=0,003 B-лф (%) n=79 CD25+(абс.ч.)n=35 r=0,36 p=0,04 NK (%) n=72 NK (абс.ч.) n=72 HLA-DR+(%) n=45 HLA-DR+ абс.ч.) CD95+(абс.ч.)n=36 IgA (г/л) n=73 r=0,16 p=0,04 IgM (г/л) n=73 r=0,39 p=0,01 r=0,36 p=0,02 r=0,41 p=0,01 r=0,36 p=0,02 r=0,49 p=0,007 r=0,46 p=0,01 r=0,49 p=0,01 r=0,35 р=0,03 21 При проведении корреляционного анализа была отмечена прямая взаимосвязь «очень» высоких значений ИСА при РС с нарушением функции зрительного нерва и тенденцией статистически значимой взаимосвязи высоких значений ИСА с тазовыми нарушениями, и соответственно, и значительная ассоциация с тяжестью неврологического дефицита при РС (табл. 4). Координаторные и тазовые нарушения прямо ассоциировались с уровнем ЭУс-а. Тазовые нарушения ассоциировались с повышением содержания CD95+ клеток - Fas- рецепторов, опосредующих апоптоз, и тенденцией статистически значимой взаимосвязи (r=0,36, p=0,053) с частотой выявления очень высоких значений ИСА (>40%). Таблица 4 Клинико-иммунологические взаимосвязи показателей адгезии при РС Показатели Координ. ИСА, n=79 ИСА>30, n=79 ИСА>40, n=79 ЭУс-а, n= 100 Чувствит. Зрительн. Тазовые Тяжесть r=0,25 p=0,02 r=-0,43 p=0,01 r=0,37 p=0,04 r=0,38 p=0,03 r=0,24 P=0,03 r=0,23 p=0,04 При усилении тяжести неврологического дефицита при РС отмечалось учащение выявления «очень» высоких значений ИСА>40, а также тенденция к выявлению ЭУс-а (р=0,08). Выявлены различия в характере и числе взаимосвязей показателей адгезии с клиническими и иммунологическими показателями у больных с различным типом течения и активностью РС. Уже в дебюте РС выявлена взаимосвязь повышения ИСА с тяжестью неврологического дефицита, реактивностью крупномолекуляной фракции ИК, IgM и IgG. к ТП, содержанием 22 Существенные различия в характере корреляционных связей высоких значений ИСА >40 выявлены при ремиттирующем течении РС в стадии обострения. В период обострения РРС эти показатели ассоциировались с содержанием HLA-DR+, Т-лимфоцитов (r=0,76; n=7), субпопуляцией CD95+ (r=0,86) и уровнем IgM. При ремиссии ни одна из перечисленных взаимосвязей не была выявлена. Обнаружен разнонаправленный характер корреляций ЭУс-а с ИРИ и количеством CD4+ клеток на стадиях обострения и ремиссии при РРС. Положительная корреляция этих показателей отмечалась в период обострения, отрицательная - в период ремиссии РРС. Выявленные взаимосвязи ещё раз подтвердили ассоциацию обострения РРС с повышением значений ИСА и ЭУс-а, изменением фенотипического состава лимфоцитов и факторов гуморального иммунитета (повышение IgМ и снижение IgA). При ППРС отмечалась выраженная взаимосвязь значений ИСА с содержанием HLA-DR+ клеток, а ЭУс-а – с реактивностью к ТП. Кроме того, при ППРС ЭУс-а коррелировал со степенью поражения пирамидного тракта. При больными анализе группы ВПРС, представленной преимущественно в корреляционные стадии связи обострения, с также факторами выявлены адгезии. множественные Показатели ИСА коррелировали с реактивностью к ОБМ и ТП, а ЭУс-а - с общим числом лимфоцитов, количеством В-лимфоцитов, содержанием CD8+, NК клеток и CD95+. Таким образом, если при ВПРС показатели фенотипического состава лимфоцитов в большей степени коррелированны со значениями ЭУс-а, то при РРС в стадии обострения - с показателями ИСА. Взаимосвязи показателей адгезии с клиническими проявлениями, выявленные в стадии ремиссии при РРС, а также при прогредиентных типах течения РС, по-видимому, отражают стойкий неврологический дефицит, возможно обусловленный дегенеративными изменениями. 23 Таким образом, различное число и характер корреляционных связей показателей адгезии при разных типах течения и активности процесса свидетельствуют об их существенной роли в патогенезе и клинической гетерогенности РС. ВЫВОДЫ 1. У больных РС обнаружено повышение адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови, что подтверждено частым выявлением высоких значений индекса спонтанной адгезии (ИСА) и эффекта усиления адгезии под действием аутосыворотки (ЭУс-а) по сравнению с группой нормального контроля. 2. Прослеживается взаимосвязь показателей адгезии с характером течения РС, а также активностью патологического процесса и, в меньшей степени, с длительностью заболевания и тяжестью неврологического дефицита. Повышение показателей адгезии отмечается уже в ранние сроки заболевания. Наиболее высокие показатели адгезии выявлены при первичнопрогредиентном течении РС, что отличает этот тип течения от вторичнопрогредиентного. При ремиттирующем течении РС более высокие показатели адгезии соответствуют стадии обострения заболевания. 3. Отмечены значимые взаимосвязи высоких показателей ИСА с содержанием В-лимфоцитов, NK клеток, количеством активированных лимфоцитов, маркёрами которых являются HLA-DR+ и CD95+; а также с реактивностью к основному белку миелина и туберкулопротеину и уровнем IgМ, что отражают активность иммунологического процесса и важную роль показателей адгезии в интегрированном участии всех перечисленных компонентов в патогенезе РС. 4. Различный характер и особенности взаимосвязей показателей адгезии с другими иммунными параметрами при разных типах течения РС, а также расширение клинико-иммунологических корреляционных связей у больных с высокими показателями адгезии отражают этапы патологического процесса и подтверждают патогенетическую роль, как мембранных, так и 24 растворимых форм адгезивных молекул в клинической гетерогенности рассеянного склероза. 5. Структура соотношения индекса спонтанной адгезии (ИСА) и эффекта усиления адгезии под действием аутосыворотки (ЭУс-а) при длительности РС более 10 лет и тяжести неврологического дефицита более 6,5 баллов была сходна с группой больных другими неврологическими заболеваниями (ДНЗ), для которых характерны высокие показатели ИСА в сочетании с незначительным повышением растворимых форм адгезивных молекул. 6. Определение показателей адгезии может использоваться как дополнительный лабораторный критерий для подтверждения обострения заболевания и выхода в ремиссию, а также при прогнозировании типа течения РС. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Предложен новый способ определения показателей азгезии и вычисления величин индекса спонтанной адгезии (ИСА) и эффекта усиления адгезии под действием аутосыворотки (ЭУс-а), который может быть использован для скринингового определения суммарного содержания мембранных и растворимых форм адгезивных молекул как при РС, так и при других заболеваниях. 2. Выявление повышения показателей адгезии (ИСА, ЭУс-а) при РРС может подтверждать развитие обострения. Стабильность высоких показателей ИСА, особенно в сочетании с ЭУс-а прогностически неблагоприятно и может свидетельствовать о прогредиентности течения РС. _________________________________________________________________ Автор выражает искреннюю благодарность за большую научноконсультативную помощь, оказанную на всех этапах исследования академику РАМН профессору И.В.Ганнушкиной, ведущему научному сотруднику к.м.н. И.Г.Жирновой, старшему научному сотруднику к.б.н. Л.В.Комельковой. 25 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Значение "адгезивного фактора" сыворотки и сенсибилизация лейкоцитов крови при рассеянном склерозе. /И.В. Ганнушкина, И.Г. Жирнова, И.В.Ларина, М.И.Царева, А.В.Ерофеева, И.А. Завалишин. // VIII Всероссийский съезд неврологов: Тезисы докладов. - Казань. - 2001. - С.71. 2. Клиническое и прогностическое значение различных иммунологических показателей при рассеянном склерозе. /И.В. Ганнушкина, И.В. Ларина, И.Г. Жирнова, Л.В.Комелькова, А.В.Переседова, И.А.Завалишин. //X Конференция «Нейроиммунология», научно-практич. Конференция неврологов: Тезисы докладов.- С.-Петербург. - 2001. - С.162164. 3. Адгезивная активность сыворотки крови и клеточная реактивность к основному белку миелина и ганглиозидам мозга при рассеянном склерозе. /И.В. Ганнушкина, И.Г. Жирнова, И.В. Ларина, И.А. Завалишин.// 4 съезд иммунологов и аллергологов СНГ, Москва. Аллергология и иммунология.2001. - Том 2, №2.- С.130. 4. Вариабельность иммунологических показателей при различных клинических проявлениях рассеянного склероза. /И.В.Ганнушкина, И.Г.Жирнова, Л.В. Комелькова, И.В.Ларина, А.Н.Переседова, И.А.Завалишин. //В кн: "Нейроиммунология": Материалы XI Всероссийской конференции, научно-практической конференции неврологов: Тезисы докладов.- Санкт-Петербург. Май 2002. - С.104-105. 5. Циркулирующие иммунные комплексы при рассеянном склерозе. /И.В.Ганнушкина, Л.В.Комелькова, И.Г.Жирнова, И.В. Ларина, А.В.Переседова, И.А.Завалишин. //Российская конференция "Нейроиммунопатология": Материалы Второй Российской конференции 2123 мая 2002г.: Тезисы докладов.- Москва. - С.45-46. 6. Соотношение факторов клеточного и гуморального иммунитета при рассеянном склерозе. /И.В.Ларина, И.Г.Жирнова, И.В.Ганнушкина, А.В.Переседова, И.А.Завалишин. //ХII Всероссийская конференция “Нейроиммунология“, Научно-практическая конференция неврологов. С-Пб, 30 июня -4 июля 2003г. Журнал «Нейроиммунология». Т.1.№ 2. - С.81-82. 7. Способ определения адгезивных свойств лейкоцитов крови. /И.Г.Жирнова, И.В.Ларина, М.И.Царёва, И.В, Ганнушкина. // Патент РФ на изобретение № 2246728 Заявка № 2003109324. Приоритет изобретения 03 апреля 2003г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20 февраля 2005г. 8. Новый способ оценки адгезивной активности лейкоцитов крови и влияния сыворотки на адгезию клеток. /И.Г.Жирнова, И.В.Ларина, И.В.Ганнушкина, И.А.Завалишин. //ХII Всероссийская конференция “Нейроиммунология“, Научно-практическая конференция неврологов. С-Пб, 30 июня- 4июля 2003г. Журнал «Нейроиммунология». Т.1. № 2. - С.53-54. 9. Прогностическое значении оценки адгезивных свойств лейкоцитов в сыворотке крови при рассеянном склерозе. /И.В.Ларина, М.И.Царёва, Л.В.Комелькова, А.В.Переседова, И.В.Ганнушкина, И.А.Завалишин. 26 //«Рассеянный склероз: эпидемиология, клиника, лечение». Материалы Сибирской межрегиональной научно-практической конференции: Тезисы докладов.- Новосибирск. 2004. -С.22-23. 10. Взаимосвязь факторов клеточного и гуморального иммунитета при рассеянном склерозе. /И.В.Ларина, И.Г. Жирнова, И.В, Ганнушкина, А.В. Переседова, И.А.Завалишин. //Вып. “Физиология и патология иммунной системы” Т.6, №1. International Journal on immunorehabilitation. IX Международный конгресс по клинической патологии: Тезисы докладов.-. 2004. - С.77. 11. Сопоставление адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови с другими показателями иммунитета при рассеянном склерозе /И.В.Ларина, И.Г. Жирнова, Л.В.Комелькова, И.В, Ганнушкина, И.А.Завалишин. //III Всемирный конгресс «Клиническая патология и реабилитация в медицине». Тайланд 4-11 февраля, 2005. Аллергология и иммунология, 2005, т.6, №2.С.235. 12. Клиническое значение адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови при рассеянном склерозе. /И.В.Ларина, И.Г.Жирнова, Л.В.Комелькова, А.В.Переседова, М.И.Царева, И.В.Ганнушкина, И.А.Завалишин. // Ж. неврологии и психиатрии им.С.С.Корсакова, - 2006.№3. -С 31-36. 13. Натуральные киллеры при первичном антифосфолипидном синдроме с неврологическими проявлениями /И.Г.Жирнова,Л.В. Комелькова, Л.А.Калашникова, Б.Д.Джамантаева, И.В.Ларина, И.В.Ганнушкина. //Матер.Российской конф. «Нейроиммунопатология» (с международным участием): Тезисы докладов. - Москва, 2006. - С.49-50. 14. Роль иммунопатологических изменений в клинической гетерогенности рассеянного склероза. /И.Г.Жирнова, И.В.Ларина, Л.В.Комелькова, М.И.Царёва, И.В.Ганнушкина, И.А.Завалишин. //Материалы IV Российской конференции «Нейроиммунопатология» (с международным участием): Тезисы докладов.- М., 2006. - С.49. 15. Роль адгезивных свойств лейкоцитов и сыворотки крови в патогенезе рассеянного склероза. /И.Г.Жирнова, И.В.Ларина, Л.В.Комелькова, М.И.Царева, И.А.Завалишин. //Ж. неврологии и психиатрии им.С.С.Корсакова, - 2008. - №4. -С.56-61. 16. Значение иммунологических факторов в клинической гетерогенности рассеянного склероза /И.Г.Жирнова, И.В.Ларина, Л.В.Комелькова, М.И.Царева, И.А.Завалишин. //Ж. Практическая неврология и нейрореабилитация, -2008.- №2. - С.36-40. 27 Список сокращений и специальных терминов ВПРС вторично-прогредиентный рассеянный склероз ГМ ганглиозиды мозга ДНЗ другие неврологические заболевания ИК иммунные комплексы ИРИ иммунологический регуляторный индекс ИСА индекс спонтанной адгезии МА адгезивные молекулы мМА мембранные формы молекул адгезии ОБМ основной белок миелина ППРС первично-прогредиентный рассеянный склероз рМА растворимые формы молекул адгезии РППЛ реакция подавления прилипания лейкоцитов РРС ремиттирующий рассеянный склероз РРС-о ремиттирующий рассеянный склероз, обострение РРС-р ремиттирующий рассеянный склероз, ремиссия РС рассеянный склероз РС-д дебют рассеянного склероза ТП туберкулопротеин ЭУс-а эффект усиления адгезии под влиянием аутосыворотки EDSS расширенная шкала инвалидизации по J.F.Kurtzke HLA-молекулы молекулы главного комплекса гистосовместимости ICAM (Intercellular Adhesion Molecule) - молекула межклеточной адгезии VCAM-1 васкулярно-целлюлярно-адгезивная молекула
