Для определения чувствительности лимфоцитов к

“УТВЕРЖДАЮ”
Директор НПО “Иммунотэкс”
________________ Батурин М.В.
«____»___________ 200 г.
ИНСТРУКЦИЯ
Набор реагентов предназначен для диагностики медикаментозной аллергии и непереносимости лекарственных препаратов у 24 пациентов (по 7
препаратов + контроль).
В последние годы все более пристально внимание врачей к проблеме
аллергии к лекарственным препаратам. Это обусловлено различными причинами, в том числе и тем, что все шире ассортимент поддельных или некачественных лекарственных средств.
Аллергические реакции или реакции гиперчувствительности на лекарственные препараты – это иммунологический ответ на препарат или его метаболиты, приводящий к развитию клинически значимых нежелательных реакций
(отечность, сыпь, зуд и т.д.). Для этих реакций характерны следующие черты:
- в их основе лежат иммунологические механизмы.
- возникают после предшествующего контакта с данным лекарственным препаратом или препаратом с подобным химическим строением.
- развиваются быстро, при повторной встрече с аллергеном.
Диагностика лекарственной аллергии основывается на комплексе мероприятий, включающих: анамнез, клинические данные и результаты лабораторного обследования.
Показаниями для применения лабораторных методов выявления лекарственной аллергии являются:
- больные с непереносимостью лекарств,
- больные с отягощенным аллергоанамнезом;
- больные с профессиональной аллергией (для постановки диагноза и трудоустройства);
- неясные случаи для диагностики, подозрения на висцеральные формы лекарственной аллергии;
- необходимость исключения псевдоаллергических реакций при введении лекарств и медикаментов больным с предрасположенностью к ним;
-желание больного и/или врача (перед введением лекарства, операцией и др.).
- шок, тяжелые токсикодермии в анамнезе на неизвестный препарат и необходимость лекарственной терапии;
- непереносимость лекарств у детей раннего возраста и взрослых, когда кожные пробы недемонстративны или отрицательны на гистамин;
- при обширных поражениях кожи (тяжелые токсикодермии) и необходимости подбора переносимых препаратов (антибиотики и др.);
- на фоне приема антимедиаторных средств, при необходимости введения потенциально опасных лекарств и медикаментов.
Специфические методы аллергодиагностики in vitro направлены на:
- выявление свободных антител в сыворотке крови и секретах,
- обнаружение антител, связанных с лейкоцитами (базофилами, нейтрофилами,
тромбоцитами и др.),
- определение Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к аллергену.
Известно, что реакции реагинового типа индуцированы сенсибилизированными Т-лимфоцитами, следует предположить, что комплекс лабораторных тестов, включающий выявление Т- клеточной сенсибилизации, позволяет
определить наличие немедленного и клеточно-опосредованого типов лекарственной аллергии у больного. Метод основан на специфическом изменении адгезивной способности поверхностных рецепторов клеток после предварительной инкубации с лекарственным препаратом. Оценка реакции рецепторов клеток на препарат проводится in vitro в тестах “активного” и “cпонтанного”ЕРОК.
Лабораторные тесты, включающие выявление специфических иммунных комплексов и среднемолекулярных олигопептидов позволяют определить
наличие лекарственной аллергии иммунокомплексных и цитотоксических реакций у больного. Метод основан на специфическом образовании иммунных
комплексов после предварительной инкубации с лекарственным препаратом.
Определение специфических иммунных комплексов и среднемолекулярных олигопептидов проводят с использованием иммунологических планшет, регистрируя результаты на спектрофотометре при длине волны 450 нм.
В состав набора входят:
Р1 – Разводящий и промывающий раствор 10-кратный
Р2 - раствор для осаждения иммунных комплексов
Р3 - раствор для выделения среднемолекулярных
олигопептидов
Р4 – эритроциты барана 10% взвесь
Р5 - градиент для выделения мононуклеаров
Р6 - фиксатор
Р7 -96-луночный стриповый планшет
- 50 мл 2 фл.
- 30 мл 2 фл.
- 25 мл 1 фл.
- 5 мл 1 фл.
- 12 мл 1 фл.
- 0,5 мл 1 фл.
- 2 шт.
Необходимые материалы: -центрифужные пробирки, дозаторные пипетки, наконечники, химические пробирки, термостат, иммуноферментный планшетный
анализатор, предметные стекла, микроскоп, холодильник, краска РомановскогоГимза.
Подготовка реагентов к работе:
Рабочий (однократный) разводящий и промывающий раствор, используемый для разведения лекарственных препаратов, отмывки эритроцитов барана и лимфоцитов крови получают при смешивании 1 части Р1 с 9 частями дистиллированной или деионизированной воды: рН раствора – 7.2-7.4 (дистиллированную воду предварительно кипятят);
Рабочий раствор водорастворимых лекарственных препаратов (таблетированных или ампульных) готовят в двух разведениях в химических или центрифужных пробирках за 20-30 мин до использования.
Для определения специфических иммунных комплексов и среднемолекулярных олигопептидов при расчете концентрации лекарственного препарата
руководствуются суточной терапевтической дозой в 1 литре раствора, с последующим пересчетом на 1 мл. Для диагностики лекарственной аллергии в
нагрузочных тестах с Е-РОК, во избежание неспецифических токсических реакций на рецепторный аппарат клеток, приготовленные разведения препаратов
разводят еще раз 1:1 рабочим раствором Р1. (П.Д.Новиков, Д.К.Новиков,
Ю.В.Сергеев - Диагностика лекарственной аллергии,- Витебск, 2001).
1. Лидокаин 2% - 2 мл. По М.Д. Машковскому суточная доза составляет
750 – 1500 мг
следовательно, в 1 мл Р1 должно содержаться 375 мкг препарата. В ампуле
– 40 мг вещества: 40000 мкг – 2000 мкл
40 мкл лидокаина доводим до 1 мл рабочим раствором Р1.
2. Кавинтон 10 мг в 2 мл раствора, или 5 мкг в 1 мкл. Берем 40 мкл
раствора и доводим до 1 мл рабочим раствором Р1.
3. Ультракаин (Убистезин и другие анестетики) – 100 мкл доводим до 1
мл рабочего раствора Р1
Таблетированные препараты предварительно тщательно измельчают,
помещают в рабочий раствор Р1, перемешивают и через 20-30 мин нерастворимые компоненты (наполнители таблетированных препаратов) осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 2-3 мин. Оболочку, при необходимости, исследуют отдельно. Рабочие растворы лекарственных препаратов
хранению не подлежат.
В бланках результатов рекомендуется указывать данные исследования
и лекарственного препарата и оболочки, а также фирму-изготовителя. Это обусловлено тем, что аналогичные препараты разных фирм-изготовителей могут
вызывать неоднозначную реакцию у пациента, что может быть связано с использованием различных наполнителей и консервантов.
Формалинизированные эритроциты барана Р4 отмывают центрифугированием в большом объеме (3-4 мл) рабочего раствора Р1 3-4 раза, сливая
надосадочную жидкость. Из плотного осадка, который принимаем за 100%, готовим рабочую взвесь из расчета 0,1 мл осадка + 9,9 мл. рабочего раствора Р1.
Рабочая взвесь стабильно хранится в течение 5 суток при t° от +2 до +6° С
(в холодильнике).
Рабочий раствор фиксатора готовять смешиванием 0,1 мл Р6 с 9,9 мл
бидистиллированной или деионизированной воды (можно использовать кипяченую дистиллированную воду).
Подготовка биологического материала.
Из локтевой вены пациента берут 7-10 мл крови, переносят 3 мл в
пробирку с раствором гепарина (25 ЕД на 1 мл), осторожно перемешивают покачиванием или вращением в ладонях, во избежание образования сгустков.
Оставшуюся кровь помещают в сухую чистую центрифужную пробирку и
оставляют на 30 мин в термостат при 37° С для образования сгустка. Сыворотку
отделяют центрифугированием в течение 5 мин при 3000 об/мин или 10- 15 мин
при 1500 об/мин.
Ход реакции выявления специфических иммунных комплексов
К 300 мкл сыворотки крови, помещаемым в центрифужную пробирку,
добавляют равное количество раствора лекарственного препарата (каждая проба набирается отдельным наконечником). В качестве контроля к 300 мкл сыворотки крови добавляют равное количество рабочего раствора Р1. Пробы перемешивают пипетированием (без образования пены) и инкубируют при 37° С в
течение 1 часа.
В лунки планшета раскапывают по 150 мкл раствора Р2 и по 50 мкл
исследуемых проб и контроля. Исследования проводят в дублях. (Например:
лунки А1 и А2 – контроль; В1 и В2 – исследуемая проба) Планшет накрывают
крышкой, выдерживают 60-90 мин при комнатной температуре (20-22° С).
Проводят измерение оптической плотности на планшетном иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм. Определяют среднюю величину показателей контроля и исследуемой пробы.
Разность оптической плотности опыта и контроля оценивают в процентах, при этом, оптическую плотность контроля принимают за 100%.
Нарастание уровня оптической плотности опытной пробы до 10%
расценивают как нормальное значение. От 10 до 15% - возможность развития аллергической реакции, свыше 15% - наличие аллергической реакции.
Пример 1: ОП контроля = 0,234
ОП пробы = 0, 312 - 0,312 х 100 : 0,234 = 133,3%
нарастание на 33,3% - наличие аллергической реакции;
Пример 2: ОП контроля = 0,164
ОП пробы = 0,153
0,153 х 100 : 0,164 = 93,3%
уменьшение на 6,7% - реакции к препарату не выявлено.
Ход определения специфических среднемолекулярных олигопептидов
К оставшимся 500 мкл пробы сыворотки крови с лекарственным препаратом и контролю приливают по 125 мкл Р3 (объем Р3 равен половине объема
сыворотки крови, без учета объема лекарственного препарата), тщательно перемешивают пипетированием и центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин (или 30
мин при 1500 об/мин).
В лунки планшета раскапывают по 100 мкл рабочего раствора Р1 и
по 100 мкл надосадочной жидкости исследуемых проб и контроля. Надосадочную жидкость отбирают осторожно, чтобы не зацепить осадок, осевший на дне
и стенках пробирок. Исследования также проводят в дублях. Планшет накрывают крышкой, выдерживают 30 мин при комнатной температуре (20-22° С).
Проводят измерение оптической плотности на планшетном иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм.
Разность оптической плотности опыта и контроля оценивают так же,
как и в предыдущем исследовании.
Получение взвеси мононуклеаров ( лимфоцитов):
В пробирку, где помещена кровь с гепарином , добавляют рабочий
раствор Р1 в соотношении 2:1 (2 части крови + 1 часть раствора Р1) и тщательно, чтобы не вызывать пенообразования, перемешивают пипетированием.
В новую центрифужную пробирку помещают 500 мкл Р5 и осторожно,
по стенке пробирки, наслаивают смесь крови с Р1. Соотношение градиента и
крови 1:2 или 1:3. (500 мкл Р5+ 1-1,5 мл смеси кровь/раствор Р1).
Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин. Осторожно отбирают интерфазный слой, содержащий лимфоциты (на 98%), отмывают один раз
центрифугированием в большом объеме (≈ 3-4 мл) раствора Р1 в течение 2
мин. при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок разводят
раствором Р1 до рабочей взвеси (2 млн/мл. или 12-18 клеток в 1 большом квадрате камеры Горяева).
Ход реакции ”активного” розеткообразования
1-я пробирка – контроль: 50 мкл взвеси лимфоцитов + 50 мкл раствора Р1;
2-я и последующие (при необходимости) пробирки: 50 мкл взвеси лимфоцитов + 50 мкл раствора лекарственного препарата. Пробирки инкубируют в
течение 60мин. в термостате при 37° С. Приливают 50 мкл рабочей взвеси эритроцитов барана, опять помещают на 10 мин. в термостат. Немедленно осаждают
центрифугированием в течение 2 мин. при 1500 об/мин.
Отбирают надосадочную жидкость, добавляют 50 мкл рабочего
раствора Р6 и из осадка, осторожно пипетируя его, готовят мазок ( на 3-4
кв.см.). Высушивают при комнатной температуре, окрашивают краской Романовского-Гимза. Смывают краску дистиллированной водой, снова сушат и
считают количество образованных розеток на 100 лимфоцитов. За розетку принимают мононуклеар (лимфоцит), четко присоединивший к себе 3 и более эритроцитов барана.
Рассчитывают индекс нагрузки: количество розеток после инкубации
с препаратом делят на количество розеток в контроле. В норме индекс нагрузки
не превышает 1,0. Показатель индекса нагрузки от 1.0 до 1.5 может свидетельствовать о возможном развитии сенсибилизации (аллергии) к препарату;
свыше 1.5 – о наличии аллергической реакции. Можно рассчитывать и в процентах, принимая показатель контроля за 100%. В этом случае интерпретация
ведется следующим образом: увеличение розеток до 10% - может свидетельствовать о возможном развитии аллергической реакции к препарату при последующем применении его в лечении; свыше 10 % - о наличии аллергической
реакции.
Ход реакции “спонтанного” розеткообразования
1-я пробирка – контроль: 50 мкл взвеси лимфоцитов + 50 мкл рабочего
раствора Р1.
2-я и последующие пробирки: 50 мкл взвеси лимфоцитов + 50 мкл
раствора лекарственного препарата. Пробирки инкубируют в течение 60 мин в
термостате, при 37° С, затем добавляют 50 мкл рабочей взвеси эритроцитов барана. Помещают на 5 мин. в термостат, осаждают центрифугированием в течение 2 мин. и оставляют на 40-60 мин. в холодильнике.
Осторожно отбирают надосадочную жидкость, приливают 50 мкл рабочего раствора Р6 и из осадка готовят мазок. Высушивают при комнатной температуре, окрашивают краской Романовского-Гимза в течение 5-7 мин. Отмывают от краски дистиллированной водой и считают количество образованных
розеток на 100 лимфоцитов. При этом уменьшение количества Е-розеткообразующих лимфоцитов по сравнению с контрольным показателем расценивается как наличие гиперчувствительности к тестируемому препарату. Увеличение уровня Е-РОК или отсутствие изменений в их числе, констатируется как отсутствие гиперчувствительности к препарату.
Рассчитывают индекс нагрузки (ИН): количество розеток после инкубации с препаратом делят на количество розеток в контроле. Интерпретацию
результатов ведут от 1.0: если ИН <1.0 - 0.04, то это является свидетельством
наличия гиперчувствительности; ИН > 1.0 + 0.04 – свидетельство отрицательной чувствительности;
Требования безопасности
1. Набор предназначен только для диагностики іn vіtro.
2. Средствами индивидуальной защиты при работе с наборами являются резиновые перчатки.
3. Обеззараживание сывороток проводить согласно приказу МЗ СССР N408 от
29.12.89 г. «О мерах по снижению заболеваемости вирусными гепатитами в
стране».
Условия транспортирования и хранения
1 Наборы транспортируют всеми видами закрытого транспорта при температуре от +4 до +10°C.
2 Наборы должны храниться при температуре от +2 до +8°C. Не допускается замораживание!
ЛИТЕРАТУРА:
1. И.А. Тузанкина, О.Г. Огурцова, Т.Ю. Азовская, В.Н. Шершнев - Лабораторные методы диагностики иммунной недостаточности у детей,- Методические
рекомендации для врачей, иммунологов, студентов и интернов, 2002 г.
2. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике.М.:Наука, 1991.
3. Новиков П.Д., Новиков Д.К. Механизмы аллергии на лекарства-гаптены. Иммунопатология, аллергол., инфектол., 2000; 4:48-64.
4.Новиков Д.К., Сергеев Ю.В., Новиков П.Д. – Лекарственная аллергия, - Москва, 2001.
5. Паттерсон Р и др. – Аллергические болезни: диагностика и лечение – ГЭОТАР Медицина, 2000.
6. Mauri-Hellweg D., Bettens F., Mauri D., Brander C., Hunziker T., Pichler W.J.
Activation of drug-specific CD4+ T cells in individuals allergic to sulfonamides,
phenytoin, and carbamazepine. J. Immunol. 1995 Jul 1; 155(1): 462.
355008, Россия, г. Ставрополь, ул. Гражданская, 9,
тел/факс для справок и заявок 8 (8652) 28-34-60