лебедева ольга петровна прогнозирование, ранняя диагностика и
реклама
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» На правах рукописи УДК 618.1:612.017.1 ЛЕБЕДЕВА ОЛЬГА ПЕТРОВНА ПРОГНОЗИРОВАНИЕ, РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА И ОБОСНОВАНИЕ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ГЕСТАЦИОННОГО ПРОЦЕССА 14.01.01- акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук С.П. Пахомов доктор медицинских наук, проф. П.В. Калуцкий Москва 2014 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АЧТВ –активированное частичное тромбопластиновое время ВУИ – внутриутробное инфицирование ГСЗ – гнойно-септические заболевания ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИППП – инфекции, передаваемые половым путем ИФА – иммуноферментный анализ кДНК – комплиментарная дезоксирибонуклеиновая кислота КП – комплексный препарат, содержащий 50 мг лиофилизата ацидофильных лактобактерий и 30 мкг эстриола мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота п/я – палочкоядерные нейтрофилы отн. ед. – относительные единицы ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота СОЭ – скорость оседания эритроцитов СЗРП – синдром задержки роста плода с/я – сегментоядерные нейтрофилы ТВ - тромбиновое время У.е. – условные единицы УЗИ – ультразвуковое исследование CASP-3α – каспаза-3α CASP-3αE – каспаза-3α в эндометрии CASP-3β - каспаза-3β COX-2 - циклооксигеназа-2 COX-2E - циклооксигеназа-2 в эндометрии IDO – индоламин - 2,3 – диоксигеназа IDOE - индоламин - 2,3 – диоксигеназа в эндометрии 2 IL1 – интерлейкин-1 IL6 – интерлейкин-6 HPDG – гидроксипростагландиндегидрогеназа HPDGE – гидроксипростагландиндегидрогеназа в эндометрии HsP – белки теплового шока MyD88- миелоидный фактор дифференцировки 88 NF-kB – нуклеарный фактор-kB TLR – Толл-подобные рецепторы TLRE – Толл-подобные рецепторы в эндометрии TNF-α – фактор некроза опухоли-α 3 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2 ВВЕДЕНИЕ 7 ГЛАВА 1. ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ АКУШЕРСТВЕ И ГИНЕКОЛОГИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ И ИХ РОЛЬ В В ПАТОГЕНЕЗЕ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ (ОБЗОР 17 ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Воспаление в патогенезе акушерских и гинекологических осложнений 1.2. Невынашивание беременности как проблема иммунного конфликта 1.3. Послеродовый эндометрит: современные аспекты диагностики, лечения и профилактики 1.4. Система сигнальных рецепторов врожденного иммунитета и ее роль в развитии акушерских и гинекологических осложнений 1.4.1. Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета как первая линия иммунной защиты 1.4.2. Экспрессия Толл-подобных рецепторов 17 19 21 31 31 врожденного иммунитета в женском репродуктивном тракте и их роль в 37 развитии акушерских и гинекологических заболеваний Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 53 2.1. Объект исследования 53 2.2. Методы исследования 58 2.2.1. Клиническое обследование и сбор материала 58 2.2.2. Бактериоскопическое и бактериологическое исследование 60 2.2.3. Иммунологическое исследование 62 2.2.4. Статистическая обработка материала 65 Глава 3. ДИНАМИКА ОСНОВНЫХ ДЕМОГРАФИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЧАСТОТА ИНФЕКЦИОННО- ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖЕНЩИН 67 БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ Глава 4. МЕДИКО-СОЦИАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 71 ПАЦИЕНТОК С САМОПРОИЗВОЛЬНЫМ ПРЕРЫВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ РАННИХ СРОКОВ 4.1.Социально-биологическая характеристика пациенток с 71 самопроизвольным прерыванием беременности ранних сроков 4.2. Характеристика микробиоценоза женских половых путей у пациенток с невынашиванием беременности ранних сроков 83 4.3. Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета и их роль в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков 86 Глава 5. ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ, ЕЕ ИСХОДЫ И ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ СОСТОЯНИЕ У ЖЕНЩИН МЕСТНОЙ С ВЫСОКОЙ 128 СТЕПЕНЬЮ ИНФЕКЦИОННОГО РИСКА 5.1. Особенности социально-биологического статуса и клиниколабораторных данных у беременных с высокой степенью 128 инфекционного риска 5.2. Характеристика микробиоценоза женских половых путей на поздних сроках беременности и его роль в развитии послеродового эндометрита 148 5.3. Особенности экспрессии Толл-подобных рецепторов на поздних сроках беременности и их роль в развитии осложнений беременности и послеродового периода 155 5 Глава 6. АЛГОРИТМ ВЕДЕНИЯ ПАЦИЕНТОК С ВЫСОКИМ РИСКОМ ПОСЛЕРОДОВЫХ ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ 164 ОСЛОЖНЕНИЙ 6.1. Профилактика и лечение послеродового эндометрита с помощью лигандов Толл-подобных рецепторов 6.2. Алгоритм ведения пациенток в зависимости от уровня экспрессии Толл-подобных рецепторов 164 168 Глава 7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 172 ВЫВОДЫ 210 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 213 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 215 ПРИЛОЖЕНИЯ 257 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность. Охрана материнства и детства в настоящее время является одной из приоритетных задач государства [76, 77, 78, 79, 80]. Снижение материнской смертности является одним из основных критериев не только качества организации работы родовспомогательных учреждений и системы здравоохранения, но и показателем благополучия общества и приоритетов государственной политики [2, 252]. Несмотря на то, что уровень материнской смертности в России неуклонно снижается, до настоящего времени на Российскую Федерацию приходится 40% всей материнской смертности в Европе [49]. Одной из самых частых причин материнской смертности, несмотря на совершенствование методов диагностики и терапии, остаются гнойно-септические осложнения в послеродовом и послеабортном периоде, которые занимают четвертое место в ее структуре [121, 49, 28, 264]. Формирование всех последующих осложнений у акушерских больных (пельвиоперитонит, инфекционно-токсический шок, тазовый тромбофлебит, сепсис, септический эндокардит) является следствием прогрессирующего метроэндометрита [59, 294]. Акушерский перитонит, инфекционно- токсический шок и сепсис, развившиеся на фоне послеродового эндометрита, являются показанием для экстирпации матки, что делает невозможным дальнейшее выполнение женщиной репродуктивной функции, даже в случае, если женщина не погибает («едва не умершие» пациентки, near-missedwomen) [146]. Гнойно-септические заболевания (ГСЗ) вне беременности приводят к развитию бесплодия и невынашивания беременности на всех сроках гестации, что влияет на показатели рождаемости и перинатальной смертности [88, 100, 242]. 7 Самопроизвольные выкидыши на ранних сроках встречаются в 15% среди всех зарегистрированных случаев беременности. При этом до 80% репродуктивных потерь приходится на I триместр [154, 155]. На самом деле число женщин с невынашиванием может быть несколько выше, так как часть самопроизвольных выкидышей происходит еще до обращения женщины к гинекологу в связи с фактом беременности [85]. Около 1-2% женщин страдают привычным невынашиванием беременности. Привычный выкидыш может быть связан с наличием хромосомных аномалий [62, 237], антифосфолипидного синдрома [280, 283], а также с иммунными и эндокринными нарушениями [85, 306]. Среди причин преждевременного прерывания беременности одно из лидирующих мест занимают воспалительные заболевания [67, 242]. Однако в 50% случаев причина выкидыша оказывается неустановленной [172, 244]. Поэтому изучение причин невынашивания беременности до сих пор является одной из актуальных проблем в акушерстве и гинекологии. Развитие воспалительного процесса зависит от трех основных факторов: количества и вирулентности возбудителя, состояния первичного очага, а также особенностей местной иммунореактивности [89]. В современных условиях инфекционно-воспалительные процессы половых органов характеризуются полимикробной этиологией, присутствием штаммов с поливалентной антибиотикорезистентностью, формированием биопленок, уменьшающих эффективность антибактериальных препаратов [9, 208, 363]. На развитие инфекционно-воспалительных заболеваний оказывает влияние также раннее начало половой жизни, большое количество абортов в анамнезе [57, 220]. Однако ведущей причиной развития воспаления является реакция макроорганизма, которая делает возможным развитие воспалительного процесса даже при небольшом количестве возбудителя вследствие неадекватного иммунного ответа. В первую очередь это связано с изменением местной иммунореактивности [340]. 8 Быстрый иммунный ответ на инфекционный агент развивается благодаря факторам врожденного иммунитета, представляющего собой наследственно закрепленную систему защиты от патогенов, обеспечивающую их распознавание и элиминацию в первые часы после вторжения и выработку сигналов, обусловливающих формирование специфического иммунного ответа [10]. Распознавание микроорганизмов эффекторами врожденного иммунитета основано на детекции высококонсервативных структур, свойственных большой группе микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов, простейших) [328]. Толл-подобные рецепторы (TLR) являются основными сигнальными рецепторами и экспрессируются внутриклеточно и на поверхности нейтрофилов, макрофагов, дендритных, эндотелиальных и эпителиальных клеток, а также натуральных киллеров [236]. Связываясь с лигандами патогенных микроорганизмов, TLR индуцируют выброс провоспалительных цитокинов, хемокинов, активируют систему адаптивного иммунитета, запуская и определяя выраженность развития воспаления [245, 319]. Однако роль TLR гинекологических в патогенезе воспалительных акушерских и заболеваний до настоящего времени остается малоизученной, несмотря на критическую значимость репродуктивной системы для воспроизводства человека как вида. Это и определило необходимость проведения данного исследования. Цель работы: улучшить репродуктивное здоровье женщин с инфекционно-воспалительными осложнениями во время беременности и в послеродовом периоде путем совершенствования системы прогнозирования, диагностики и профилактики нарушений местного иммунного ответа. Задачи исследования. 1. Определить распространенность инфекционно-воспалительных осложнений гестационного процесса у женщин в Белгородской области. 9 2. Установить невынашивания социально-биологические беременности факторы риска инфекционно-воспалительного развития генеза и послеродового эндометрита. 3. Выявить наиболее значимые этиологические факторы инфекционно- воспалительных осложнений у беременных и родильниц на основании бактериоскопических, бактериологических и молекулярно-биологических методов исследования. 4. Определить значимость экспрессии рецепторов системы врожденного иммунитета в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков и послеродового эндометрита. 5. Оценить уровень экспрессии TLR 1-10, индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), циклооксигеназы-2 (COX-2), гидроксипростагландиндегидрогеназы (HPDG), каспазы-3α (CASP-3α) при невынашивании беременности ранних сроков инфекционного генеза и предложить диагностический способ для выявления женщин, угрожаемых по невынашиванию беременности, основанный на определении экспрессии мРНК CASP-3α и COX-2. 6. Изучить особенности экспрессии TLR 1-10 в эпителии цервикального канала на поздних сроках беременности и их роль в патогенезе инфекционновоспалительных осложнений исходов беременности. 7. Разработать способы индивидуального прогноза и профилактики послеродового эндометрита у беременных с высокой степенью инфекционного риска, основанные на определении интенсивности воспалительного ответа. 8. Оценить эффективность предложенных методов прогнозирования и профилактики послеродового эндометрита. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Инфекционно-воспалительные осложнения гестационного процесса у женщин, состоявших на учете в женской консультации по Белгородской 10 области, не имеют тенденции к снижению. Частота самопроизвольных выкидышей на ранних сроках беременности увеличивается ежегодно на 1,3%, послеродовых эндометритов – в среднем на 0,2-0,30/00 в год. 2. Факторами риска невынашивания беременности инфекционного генеза является наличие самопроизвольного прерывания беременности в анамнезе, аллергических реакций на медпрепараты, выявление кокковой микрофлоры при бактериоскопическом исследовании, наличие серозного и гнойного хориодецидуита и дистрофических изменений в эндометрии. Факторами риска развития послеродового эндометрита являются низкая масса тела пациентки, удлинение III периода родов, увеличение длительности кесарева сечения и объема кровопотери в родах. Основными возбудителями при послеродовом эндометрите являются клебсиелла и эпидермальный стафилококк. По данным гистологического исследования для эндометрита характерно наличие гнойного хориодецидуита. 3. В патогенезе невынашивания беременности ранних сроков инфекционного генеза играет роль увеличение экспрессии в цервикальном канале TLR1 и TLR2, TLR4 и TLR10. Это сопровождается увеличением экспрессии в эндоцервиксе IDO, обладающей иммуносупрессивным и противовирусным действием. В эндометрии у пациенток с самопроизвольными выкидышами происходит стимуляция экспрессии TLR3 с одновременным снижением TLR4, TLR6 и TLR8. При этом наиболее значимым является снижение экспрессии TLR6, коррелирующее с увеличением экспрессии мРНК CASP-3α, индуцирующей необратимый апоптоз. В эндометрии у женщин с невынашиванием беременности ранних сроков наблюдается уменьшение экспрессии мРНК HPDG при нормальной экспрессии COX-2. 4. Развитие послеродового эндометрита обусловлено нарушением местного врожденного иммунитета – снижением экспрессии TLR4 (лиганд – липополисахарид грамотрицательных бактерий), TLR5 (лиганд - флагеллин) и 11 белка их сигнального пути NF-kB. Снижение экспрессии TLR 3-10 в цервикальном канале приводит к увеличению бактериальной обсемененности женских половых путей. 5. Способ индивидуального прогнозирования невынашивания беременности ранних сроков, основанный на определении экспрессии мРНК COX-2 и CASP-3α в цервикальном канале, с вероятностью в 92,1% позволяет предположить возникновение самопроизвольного прерывания беременности. 6. Способ индивидуального прогнозирования развития послеродового эндометрита у женщин группы высокого инфекционного риска позволяет повысить его эффективность с 24,7% до 67,7% (на 43,03%) по сравнению с использованием только клинических данных. 7. Способ профилактики послеродового эндометрита, основанный на комплексной терапии с интравагинальным введением эубиотиков, стимулирующих TLR5 и TLR10 лигандами лактобактерий, снижает частоту его возникновения у пациенток группы высокого инфекционного риска с 24,7±4,7% до 2,9±2,9% (на 21,8%). Научная новизна. Представления о патогенезе невынашивания беременности инфекционновоспалительного генеза дополнены новыми знаниями об индукции воспалительного ответа факторами системы врожденного иммунитета. Впервые описано увеличение экспрессии TLR1 и TLR2 (лиганд - липопептиды бактерий), TLR4 (лиганд–липополисахариды грамотрицательных бактерий) и TLR10 (лиганд неизвестен) в эндоцервиксе на ранних сроках беременности и определена его роль в патогенезе невынашивания беременности. Впервые у человека установлена роль повышения экспрессии TLR3 (лиганд – двухцепочечная вирусная РНК), а также протективная роль экспрессии TLR6 (лиганд – липопептиды бактерий) в эндометрии в патогенезе 12 самопроизвольных выкидышей. Описан механизм индукции апоптоза в эндометрии, связанный с изменением экспрессии TLR. Показана роль TLR в метаболизме простагландинов, что приводит к прерыванию беременности на ранних сроках. Определены границы нормальных величин экспрессии мРНК ТLR1-10 и белков их сигнального пути NF-kB и MyD88 в эпителии шейки матки на сроке беременности 6-10 недель, доношенном сроке беременности и 3 сутки послеродового периода, а также в эндометрии на ранних сроках беременности. Впервые показано, что снижение экспрессии TLR приводит к увеличению бактериальной обсемененности женских половых путей и развитию инфекционно-воспалительных осложнений у новорожденных. Установлены новые элементы патогенеза послеродового эндометрита. Показано, что при послеродовом эндометрите наблюдается снижение экспрессии TLR3, TLR4, TLR5 (лиганд – флагеллин бактерий), белков их сигнального пути MyD88 и NF-kB как на поздних сроках беременности, так и в послеродовом периоде. Это позволяет рассматривать их в качестве прогностических факторов развития послеродовых гнойно-воспалительных осложнений. Впервые установлена эффективность применения комплексного препарата, содержащего лактобактерии и эстриол, при интравагинальном применении для профилактики послеродового эндометрита. Описаны новые механизмы влияния лактобактерий на местную иммунореактивность, которые заключаются в стимуляции экспрессии TLR5 и TLR10 в эндоцервиксе. Практическая значимость. Разработанные и внедренные способы прогнозирования и профилактики невынашивания беременности ранних сроков и послеродового эндометрита позволяют улучшить исходы беременности и родов у пациенток с 13 воспалительными заболевания органов малого таза, что способствует сохранению репродуктивного здоровья женщин. Предложен способ прогноза самопроизвольных выкидышей на ранних сроках беременности, основанный на определении экспрессии мРНК CASP-3α и COX-2 в цервикальном канале. Создан алгоритм ведения пациенток, угрожаемых по развитию ГСЗ в послеродовом периоде, в зависимости от уровня экспрессии TLR, пригодный для применения в условиях стационара. Предложенный способ способствует снижению прямых затрат на пребывание пациенток в стационаре и косвенных – за счет уменьшения затрат на диагностику и лечение пациенток в отдаленном периоде за счет снижения частоты осложнений. Способ малоинвазивен, не требует больших затрат времени, прост в исполнении. Разработан способ коррекции экспрессии TLR у пациенток, угрожаемых по развитию послеродового эндометрита, с использованием интравагинальных эубиотиков, стимулирующих экспрессию TLR5 и TLR10. Усовершенствован способ определения экспрессии TRL1-10 в эпителии цервикального канала и полости матки, оптимизированный для использования в клинике. Преимуществом метода является возможность длительного хранения материала без распада РНК, простота сбора материала. Точность определения экспрессии РНК достигается за счет подбора наиболее стабильно экспрессируемых генов в эпителии цервикального канала и эндометрии. Апробация результатов работы. Основные положения работы представлены на научно-практических конференциях НИУ «БелГУ» (2010 - 2013), II Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Медико- биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011),IV и V Общероссийских научно-практических семинарах«Репродуктивный потенциал 14 России» (Сочи, 2011 и 2012), VI междисциплинарной конференции по акушерству, перинатологии, неонатологии «Здоровая женщина – здоровый новорожденный» (Санкт-Петербург, 2011), III ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов "Репродуктивная медицина: взгляд молодых-2012" конференциях (Санкт-Петербург, «Актуальные вопросы 2012), Международных акушерства, гинекологии и перинатологии» (Судак, 2012 и 2013) , II конференции с международным участием «Инфекции и инфекционный контроль в акушерстве и гинекологии» (Москва, 2012),VI Межрегиональной научно-практической конференции «Здоровье женщины – здоровье нации» (Белгород, 2013), научно-практическом семинаре «MaternalandInfantHealth» (Зальцбург, Австрия, 2010), 15-й международной конференции по иммунологии слизистых (IСMI-2011) (Париж, Франция, 2011), XV Всемирном Конгрессе по репродуктивной эндокринологии (Флоренция, Италия, 2012), 17 Всемирном конгрессе по противоречиям в акушерстве, гинекологии и бесплодии (Лиссабон, Португалия, 2012), 15 Всемирном конгрессе по репродукции человека (Венеция, Италия, 2013), XI Всемирном конгрессе по перинатологии (Москва, Россия, 2013), XXIII Европейском конгрессе по акушерству и гинекологии (Глазго, Великобритания, 2014). По теме диссертации опубликовано 37 печатных работ, из них – 20 в изданиях из Перечня ВАК, получен 1 патент на изобретение. Исследование выполнено при поддержке Гранта Президента РФ МК1564.2010.7 и государственного контракта ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» №14.740.11.0248 от 17 сентября 2010 г. 15 Внедрение результатов исследования. Полученные способы прогноза развития невынашивания беременности ранних сроков и послеродового эндометрита внедрены в практику Перинатального центра Белгородской Областной клинической больницы Св. Иоасафа и МУЗ «Городская женская консультация №2». Полученные данные о роли TLR в патогенезе акушерских и гинекологических осложнений используются в учебном процессе на кафедре акушерства и гинекологии и кафедре медико-биологических дисциплин НИУ «БелГУ», кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет». Структура диссертации. Диссертация изложена на 271 странице машинописного текста, иллюстрирована 81 таблицей, 15 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава I), материалов и методов исследования (глава II), результатов собственного исследования (главы III, IV, V, VI), обсуждения результатов (глава VII), выводов, практических рекомендаций и приложений. Список литературы включает 364 источника литературы, из них - 127 отечественных и 237 - иностранных. 16 ГЛАВА 1. ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ В АКУШЕРСТВЕ И ГИНЕКОЛОГИИ И ИХ РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Воспаление в патогенезе акушерских и гинекологических осложнений Воспаление - это процесс, индуцированный вирусной/бактериальной инфекцией или механической травмой тканей, характеризующийся выбросом цитокинов и хемокинов с последующим рекрутингом иммунных клеток в пораженный участок ткани [227, 228]. Медиаторы воспаления в норме являются компонентами многих процессов в женской репродуктивной системе: овуляции, имплантации эмбриона, развития беременности [231, 230]. Воспаление играет ключевую роль в поддержании гомеостаза, однако избыточная или недостаточная воспалительная реакция может играть роль в развитии патологических изменений [185]. Инфекционно-воспалительные заболевания занимают первое место в структуре акушерских и гинекологических заболеваний и определяют развитие тяжелых осложнений (бесплодие, невынашивание, антенатальная гибель плода, гестоз, пельвиоперитонит), угрожающих жизни и здоровью женщины [88, 146]. При этом известно, что на возникновение осложнений инфекционновоспалительных процессов влияют не столько возбудители и их токсины, сколько запуск цитокинового каскада, вызываемый ими и продуктами распада тканей. Вследствие этого антибактериальная терапия не является и не должна рассматриваться единственной и ведущей [97]. Синдром системного воспалительного ответа в акушерстве и гинекологии в настоящее время рассматривается не только как пусковой фактор развития сепсиса и септического шока, но и является ведущим в патогенезе преэкслампсии, при 17 которой беременность отличается от нормальной лишь степенью выраженности ответной реакции на антигены плода [56]. Нарушения местной иммунореактивности также играют роль в патогенезе маточно-плацентарной недостаточности и невынашивания беременности [96, 246]. Преждевременное самопроизвольное прерывание беременности рассматривается как избыточная реакция иммунной системы на антигены плодного яйца и/или патогенные или условно-патогенные микроорганизмы женских половых путей [229]. Типичный иммунный ответ инициируется клетками системы врожденного иммунитета, которая реагирует на экзогенные и эндогенные стимулы быстрее, чем система приобретенного (адаптивного) иммунитета [340]. В ответ на эти стимулы клетки врожденного иммунитета активируются через систему образраспознающих рецепторов, в частности, TLR, лигандами которых являются химические структуры патогенов, что в дальнейшем способствует активации провоспалительных цитокинов, увеличивает проницаемость сосудов, обеспечивая миграцию лейкоцитов и моноцитов из кровеносного русла в очаги воспаления [267]. Это происходит благодаря синтезу хемокинов активированными клетками врожденного иммунитета (эпителиальными клетками, нейтрофилами, дендритными клетками). В дальнейшем наблюдается дифференцировка моноцитов в макрофаги, которые осуществляют фагоцитоз и элиминацию клеток, подвергшихся апоптозу [272]. Активированные макрофаги и дендритные клетки также являются антигенпрезентирующими клетками для клеток адаптивного иммунитета. При контакте с подвергшимися апоптозу клетками макрофаги способны выделять противовоспалительные цитокины: фактор роста опухоли-β и интерлейкин-10, ограничивающие очаг воспаления и индуцирующие репарацию тканей [308]. Натуральные киллеры, которые попадают в очаг воспаления позже, чем 18 макрофаги, обладают цитолитической и иммуномодулирующей активностью [205]. Таким образом, система врожденного иммунитета первой распознает патогены и обеспечивает адекватный иммунный ответ. В случае ее нормального функционирования воспалительный процесс способен к самоограничению и разрешается без избыточного повреждения тканей. В случае, когда наблюдается избыточная или недостаточная реакция системы врожденного иммунитета на патоген, возникает неконтролируемое хроническое воспаление со значительным повреждением тканей, что приводит к развитию патологических состояний [277]. В женской репродуктивной системе TLR обладают способностью инициировать и контролировать воспалительный ответ, являясь первичным звеном, реагирующим на присутствие патогена. 1.2. Невынашивание беременности как проблема иммунного конфликта Невынашивание беременности ранних сроков представляет собой актуальную проблему современного акушерства, так как является полиэтиологическим состоянием, объединяющим различные нарушения как в репродуктивной системе, так и в организме женщины в целом [114]. Среди причин преждевременного прерывания беременности одно из лидирующих мест занимают воспалительные заболевания [67, 242, 285]. Морфологические особенности хориального ложа при самопроизвольных выкидышах и неразвивающейся беременности представлены воспалительными изменениями по типу микроабсцессов [42, 86, 106, 242]. Доказательством роли хронического эндометрита в генезе самопроизвольных выкидышей раннего срока также является тот факт, что женщины с хроническим эндометритом имеют достоверно более низкую 19 частоту имплантации эмбриона по сравнению с пациентками с нормальным эндометрием (11% и 58% соответственно) [45, 46, 163]. Однако диагностика хронического эндометрита в настоящее время представляет собой значительные трудности. В настоящее время для этого используется комплекс клинико-анамнестических данных, а также данных биопсии эндометрия, полученных при аспирации или диагностическом выскабливании слизистой полости матки под контролем гистероскопии. Однако гистологическое исследование эндометрия, полученного при диагностическом выскабливании слизистой полости матки, не всегда дает представление о наличии хронического воспалительного процесса ввиду высокой вариабельности гистологической картины даже у здоровых пациенток, особенно в середине менструального цикла [322]. В большинстве случаев при выявлении хронического эндометрита, являющегося причиной невынашивания, специфический возбудитель выявить не удается, что свидетельствует о неспецифическом характере воспаления в связи с изменениями местной иммунореактивности [151]. Рассматривая плодово-материнские взаимодействия с точки зрения иммунного ответа, следует подчеркнуть, что взаимодействие матери и плода является иммунологически уникальным, так как должно обеспечивать толерантность к аллогенному плоду и в то же время поддерживать защиту от возможных патогенов [137, 325]. В норме на ранних сроках беременности в эндометрии преобладает процесс иммуносупрессии, который обеспечивает толерантность организма матери к антигенам плода [226]. Однако в присутствии инфекционного агента в децидуальной оболочке происходит сдвиг иммунного ответа в сторону активации, что приводит к нарушению механизма толерантности к эмбриональным антигенам [310]. Система врожденного иммунитета является первой линией иммунной защиты из-за ее способности отличать инфекционное «чужое» от 20 неинфекционного «своего» [202, 267]. Более того, активация врожденного иммунитета является ключевым шагом для развития антиген-специфического приобретенного иммунного ответа [323]. Поэтому исследование особенностей экспрессии TLR клеток врожденного иммунитета представляет интерес не только с точки зрения изучения особенностей патогенеза невынашивания беременности ранних сроков, но и открывает новые возможности его профилактики и лечения. 1.3. Послеродовый эндометрит: современные аспекты диагностики, лечения и профилактики Согласно Резолюции Генеральной Ассамблеи ООН от 2000 года, снижение материнской заболеваемости и смертности в ближайшие 15 лет является одной из важнейших задач международного сообщества [356]. По данным Всемирной организации здравоохранения, послеродовые гнойновоспалительные осложнения занимают одно из ведущих мест среди причин материнской смертности в мире. Ежегодно в мире от септических осложнений умирает более 100 000 родильниц [362]. Большая часть материнской смертности от послеродовых ГСЗ приходится на развивающиеся страны Африки, Азии, Латинской Америки и Карибского бассейна. Однако и в развитых странах существующие современные методы диагностики, профилактики и лечения послеродовых воспалительных осложнений недостаточно эффективны, поэтому число гнойно-септических осложнений остается стабильно высоким. Так, в развитых странах на 1000 родов приходится 0,1-0,6 случая послеродового сепсиса [247]. Как в развитых, так и в развивающихся странах сепсис является одной из трех основных причин развития тяжелой полиорганной недостаточности у едва не умерших женщин (near-missedwomen) [55, 264, 281]. 21 Послеродовый эндометрит приводит к бесплодию и невынашиванию беременности, способствует формированию неполноценного рубца на матке после операции кесарева сечения, генерализации инфекции. Формирование всех последующих гнойных осложнений у акушерских больных является следствием прогрессирующего метроэндометрита [87, 98, 294]. Акушерский перитонит, инфекционно-токсический шок и сепсис, развившиеся на фоне послеродового эндометрита, являются показанием для экстирпации матки, что делает невозможным дальнейшее выполнение женщиной репродуктивной функции [146]. Кроме того, все случаи послеродового эндометрита требуют стационарного лечения, что не только отражается на психо-эмоциональном состоянии женщины и членов ее семьи, способствует снижению или прекращению лактации, но и требует больших экономических затрат на лечение в стационарах [40, 125]. В Российской Федерации доля септических осложнений в структуре материнской смертности составляет 10,9%. Из них 5,1% составляет акушерский сепсис [49]. Это связано, прежде всего, с увеличением частоты кесарева сечения, селекцией нозокомиальных штаммов микроорганизмов, обладающих поливалентной устойчивостью, а также увеличением доли родильниц, имеющих экстрагенитальные заболевания. Наблюдаемое постоянное увеличение числа кесаревых сечений, в среднем на 1% в год, способствовало снижению перинатальной смертности [3, 108]. Однако с расширением показаний к кесареву сечению связано увеличение частоты и тяжести ГСЗ [19, 297]. Несмотря на прогресс в технике операции, совершенствование методик зашивания, профилактическое назначение антибиотиков широкого спектра действия, доля ГСЗ как в раннем послеоперационном периоде, так и в отдаленные сроки после КС не имеет тенденции к снижению [66, 99], достигая у женщин с высоким инфекционным 22 риском 85 % [3, 26, 108]. Экстренное кесарево сечение гораздо чаще является причиной развития послеродового эндометрита, чем плановое [50]. Вторая причина, препятствующая снижению частоты послеродовых ГСЗ, особенно в развитых странах, – это появление госпитальных штаммов микроорганизмов с множественной антибиотикоустойчивостью [36, 182, 188]. Этому способствует бесконтрольное использование новых антибиотиков широкого спектра действия и антибактериальных препаратов второго ряда, нарушение санитарно-эпидемических мероприятий [8, 12]. Еще одна из причин роста ГСЗ – это увеличение числа пациенток с экстрагенитальными заболеваниями, как за счет значительного роста в последнее десятилетие числа возрастных первородящих женщин, так и увеличения доли повторнородящих старше 35 лет [299]. Наличие анемии, хронического и гестационного пиелонефрита, других очагов хронических инфекций, сахарного диабета и гипертонической болезни является фактором риска возникновения септических осложнений [6, 73]. Таким образом, несмотря на современные методы диагностики и лечения, в России и в мире не отмечается значительного снижения ГСЗ, которые продолжают вносить весомый вклад в показатели материнской заболеваемости и смертности. Все это делает своевременную диагностику, профилактику и лечение послеродовых ГСЗ одной из ведущих задач в сохранении репродуктивного здоровья населения. Послеродовый эндометрит – это воспаление слизистой матки, возникающее в послеродовом периоде, в большинстве случаев - в результате аутоактивации собственной условно-патогенной флоры. Послеродовый эндометрит следует считать проявлением раневой инфекции, так как внутренняя поверхность матки после отделения последа представляет собой обширную раневую поверхность [102]. Согласно классификации послеродовых инфекционных заболеванийС.В.Сазонова и А.В. Бартельса (1973), 23 послеродовый эндометрит является первым этапом развития послеродовых ГСЗ, когда инфекция ограничена областью родовой раны [13]. Эндометрит — начальное локализованное проявление динамически развивающегося септического процесса. В структуре ГСЗ послеродовый эндометрит сохраняет свое лидирующее положение. После нормальных родов частота послеродового эндометрита составляет 3-8%, после осложненных родов этот показатель возрастает до 10-20% [71, 239]. Вероятность развития послеродового эндометрита после кесарева сечения возрастает в 5-10 раз по сравнению с родами через естественные родовые пути, а после повторного кесарева сечения риск ГСЗ увеличивается еще в 2,5 раза [59]. Кесарево сечение, составляя 20-30% от всех родов, обусловливает 80 – 90 % всех послеродовых эндометритов [357]. Тем не менее, в последние годы увеличилась частота возникновения сепсиса после родов через естественные родовые пути преимущественно в стационарах 1-2 уровня, что связано с запоздалой диагностикой послеродового эндометрита [111]. Актуальность проблемы послеродового эндометрита определяется не только его значительной частотой и экономическими затратами, но и возможными осложнениями. При прогрессировании инфекционного процесса эндометрит может приводить к развитию инфекционно-токсического шока, тазового тромбофлебита, пельвиоперитонита, перитонита и сепсиса [304]. Отличительными особенностями клинической картины при послеродовом эндометрите в настоящее время являются его поздняя манифестация, наличие стертых и атипичных форм, несоответствие общих клинических проявлений и степени тяжести местного воспалительного процесса [61, 74, 296]. Чаще всего основными симптомами заболевания становятся субинволюция матки и лохиометра, которые большинство авторов рассматривают как эндометрит, протекающий бессимптомно [71, 109]. Такие классические симптомы 24 послеродового эндометрита, как нарушение общего самочувствия, лихорадка, изменения периферической крови встречаются менее чем у половины родильниц. Наиболее частыми клиническими проявлениями являются субинволюция матки и патологический характер лохий. Такое течение заболевания часто приводит к запоздалой диагностике, неадекватному лечению и генерализации процесса [1, 54]. Рост числа стертых форм эндометрита большинство авторов связывают с широким внедрением в акушерскую практику значительного арсенала профилактических средств, а также с увеличением количества нозокомиальных штаммов микроорганизмов [70, 203]. В большинстве случаев возбудителями послеродового эндометрита являются условно-патогенные микроорганизмы. При этом в последние годы отмечается изменение видового состава микробной флоры с возникновением агрессивных и антибиотикоустойчивых форм бактериальной инфекции [8, 12, 83, 313]. Важным в формировании послеродового эндометрита в настоящее время является его полимикробная этиология, и основная роль здесь принадлежит ассоциациям аэробных и анаэробных неспорообразующих условно-патогенных микроорганизмов (80–90%), составляющих нормальную микрофлору половых путей у женщин [124, 289]. Отмечено, что присутствие факультативно-анаэробных бактерий обусловливает повышение патогенности анаэробов и приводит к формированию наиболее тяжелых форм заболевания [120]. Ассоциации микроорганизмов обладают более выраженными патогенными свойствами в связи с наличием синергизма между ними. Это явление носит название «quorumsensing», или «чувство кворума» [17, 274]. Бактерии способны обмениваться друг с другом сигналами с помощью белковых молекул, и при накоплении определенного количества биомассы бактерий выделение ими факторов патогенности повышается [47]. 25 Персистенции раневой инфекции способствует также феномен «бактериальной пленки» (biofilm) [208]. Это скопление микроорганизмов на инородных телах, которыми в акушерстве могут быть шов на шейке матки во время беременности или шовный материал в полости матки после кесарева сечения. Микроорганизмы образуют скопления, покрытые толстым слоем мукополисахаридов, препятствующих проникновению антибиотиков, что снижает эффективность антибактериальной терапии [9]. Классическими возбудителями послеродовых ГСЗ являются грамотрицательные аэробные микроорганизмы – кишечная и синегнойная палочка, протей, клебсиелла [2]. Однако в последнее десятилетие видовой спектр возбудителей изменился: наряду с грамотрицательной флорой увеличивается значимость грамположительных микроорганизмов. Так, частота выявления энтеробактерий (кишечной палочки, клебсиеллы и др.) в настоящее время составляет не более 20-30%, стафилококков – 13,3% случаев, энтерококков – до 64%. Это связано с широким применением в акушерских стационарах цефалоспоринов I-II поколения и аминогликозидов, к которым энтерококки нечувствительны [15, 83]. Возбудителями послеродовых инфекционных заболеваний могут быть также стрептококки группы А и В, а также пневмококки (Streptococcuspneumoniae) [143, 289]. Часто при послеродовых ГСЗ обнаруживаются облигатные анаэробные неспорообразующие микроорганизмы. К ним относятся гарднереллы, бактероиды и грамположительные кокки - пептококки и пептострептококки, которые при эндометрите выявляются в 25–40% случаев [1, 73]. Нередко причиной возникновения послеродового эндометрита в настоящее время являются микроорганизмы, передаваемые половым путем - Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Chlamydia trachomatis, а также вирусы. Микоплазмы и хламидии вызывают абортивые и стертые формы эндометрита, для которых характерно позднее начало на 2-3 неделе после родов [27]. 26 Принимая во внимание, что выявление возбудителей сопряжено с определенными трудностями (микрофлора цервикального канала лишь в 25% случаев совпадает с микрофлорой полости матки), важное значение в диагностике эндометрита имеет разработка критериев количественной оценки микробной обсемененности содержимого полости матки. Считается, что диагностическим критерием можно считать количество возбудителя 104 КОЕ/мл и выше. Однако бактериологическое исследование, которое наиболее часто используется в клинике, имеет существенный недостаток - фактор времени, так как его результаты врач, как правило, получает на 5-7 сутки, то есть после выписки пациентки из родильного дома. При этом степень обсемененности не всегда коррелирует с риском развития инфекционного процесса. Так, у одной пациентки эндометрит развивается при бактериальной обсемененности 104 КОЕ/мл, в то время как у другой для его развития достаточно 102 КОЕ/мл возбудителя,что связано с особенностями иммунореактивности у каждой конкретной пациентки. Для выявления условно-патогенной микрофлоры также применяют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе с использованием микрофлуидальных чипов [105]. Однако само по себе наличие микроорганизмов, выявляемое методом ПЦР, тем не менее, не является прогностически значимым признаком для развития эндометрита. Поэтому для прогнозирования и диагностики послеродового эндометрита, наряду с клиническими и бактериологическими методами исследования, используют также инструментальные. Эхографическое и гистероскопическое исследование открывает новые возможности для диагностики и лечения при послеродовом эндометрите [16, 22]. Ультразвуковое исследование (УЗИ) позволяет оценить размеры и состояние полости матки, динамику ее инволюции и состояние послеоперационного шва. Все это позволяет рекомендовать метод УЗИ в качестве скринингового у родильниц 27 [48, 25]. Однако нередко результаты эхографического исследования не дают представления о развитии эндометрита. Это связано с тем, что наряду с типичной ультразвуковой картиной (субинволюция матки, расширение ее полости, скопление сгустков крови, визуализация остатков плацентарной ткани, инфильтрация послеоперационного шва) наблюдается так называемый «второй вариант» ультразвуковой картины. Это эндометрит при условно «чистой» полости матки характеризуется наличием гиперэхогенных отложений на стенках матки и ее незначительной субинволюцией. Такой эндометрит развивается в 28% случаев и является трудным для УЗИ-диагностики [116]. Поэтому были предложены другие вспомогательные методы, в частности, цветовое допплеровское картирование, которое позволяет выявить гипоперфузию матки у пациенток с послеродовым эндометритом [22], а также сочетание УЗИ с лазерной биофотометрией последа после родов [65]. Для повышения точности диагностики послеродового эндометрита методом эхоскопии некоторые авторы рекомендуют производить его дважды – в раннем послеродовом периоде и на 3 сутки после родов [29]. Актуальность проблемы ГСЗ вызывает необходимость постоянного совершенствования и поиска новых методик в диагностике и лечении послеродовых эндометритов. В современных условиях для прогноза и ранней диагностики послеродового эндометрита используют высокоинформативные иммунологические методы [112]. Однако, несмотря на достаточно широкий спектр диагностических методов исследования, существует ряд недостатков отдельных методов и методик, что не позволяет создать единый стандарт скрининговой диагностики послеродового эндометрита, особенно его стёртых форм. По данным литературы, при наличии у родильниц послеродового эндометрита отмечаются выраженная лимфопения, снижение количества Т- и B-лимфоцитов, иммунорегуляторного индекса, а также уровня 28 иммуноглобулинов. Также для данных пациенток характерны изменения врожденного иммунитета, выражающиеся в снижении фагоцитарной активности [35, 127]. Снижение интерферонпродуцирующей способности лейкоцитов, которое определяется по значительному снижению уровня α- и γинтерферона, а также повышение сывороточного интерферона говорят об имеющих место нарушениях неспецифической резистентности организма родильниц и остроте воспалительного процесса [5]. Также показана возможность использования для диагностики воспалительных заболеваний определения уровней провоспалительных цитокинов, представляющих класс растворимых пептидных медиаторов иммунной системы, вырабатываемых преимущественно активированными клетками иммунной системы, такими как моноциты, макрофаги, Т-клетки. Определение в периферической крови их высоких уровней свидетельствует о интенсивных воспалительных процессах, сопровождающихся генерализованной активацией иммунной системы. По данным литературы, диагностически значимыми являются повышенные уровни провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α) в сыворотке крови и лохиях [14, 72]. О риске развития послеродового эндометрита можно судить также по индексу лейкоцитарной инфильтрации по Кальф-Калифу [20], а также значительному угнетению активности сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в нейтрофилах периферической крови с одновременным повышением активности глюкозофосфатдегидрогеназы [41]. Ряд авторов предлагает использовать для диагностики послеродового эндометрита определение уровня прокальцитонина в плазме крови как одного из маркеров синдрома системного воспалительного ответа [31, 104, 123]. Была показана также диагностическая значимость определения эндотоксинов в сыворотке крови и лохиях. Уровень эндотоксина в сыворотке крови может отражать начальные этапы реакции организма на внедрение инфекционного агента [37, 95]. Для оценки течения послеродового 29 периода определяли уровень гистамина в крови, являющегося одним из основных медиаторов воспаления. Исследования авторов показали, что соответственно тяжести деструктивного процесса в тканях изменяется уровень гистамина в крови и ее элементах, при этом тяжесть местного воспалительного процесса четко коррелирует с изменениями концентрации гистамина в крови.С прогностической целью предлагается также использовать определение в сыворотке крови концентрации белков острой фазы – преальбумина и Среактивного белка [7]. Однако все вышеуказанные методы обладают низкой специфичностью, так как уровни провоспалительных цитокинов и других маркеров воспаления в системном кровотоке могут быть повышены при инфекционных процессах любой локализации и не могут служить достоверными прогностическими признаками развития послеродового эндометрита. Поэтому было предложено измерять уровень pH, PCO2, PO2 лохий, изменения которых предшествуют появлению клинических симптомов послеродового эндометрита [52, 53]. Было предложено также определять уровень провоспалительных цитокинов в лохиях [113]. Однако недостатками этих методов являются трудности сбора материала, а для методики, связанной с определением pH и парциального давления газов, – еще и необходимость работы только со свежим материалом, что исключает возможность его хранения. Эти методы также имеют низкую специфичность. Использование газовой хроматографии и масс-спектрометрии для выявления сигнальных соединений “quorumsensing” (чувства кворума) микроорганизмов считается высокоинформативным методом для скринингового исследования на ГСЗ [23], однако использование этих методов недоступно даже в большинстве областных клиник из-за отсутствия дорогостоящего оборудования. Таким образом, в настоящее время назрела необходимость разработки 30 высокоспецифичного, точного и доступного в стационарах высокого риска скринингового метода прогнозирования и диагностики острого и хронического эндометрита, которые напрямую влияют на состояние женской репродуктивной системы. 1.4. Система сигнальных рецепторов врожденного иммунитета и ее роль в развитии акушерских и гинекологических осложнений 1.4.1. Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета как первая линия иммунной защиты Слизистая оболочка женских половых путей является сложной системой, уникальность которой заключается в способности сохранять баланс между необходимостью адекватного иммунного ответа на патогены и иммунологической толерантностью к собственной микрофлоре и антигенам развивающегося плода. Механизмы антиинфекционной защиты слизистой половых органов и влияние на нее эндо- и экзогенных факторов изучены гораздо меньше, чем иммунная система кишечника, полости рта и бронхолегочной системы, несмотря на ее критическую значимость для воспроизводства человека как вида [233, 311]. Быстрый иммунный ответ на инфекционный агент развивается благодаря факторам врожденного иммунитета, который представляет собой наследственно закрепленную систему защиты от патогенов, обеспечивающую распознавание и элиминацию патогенов в первые часы после их вторжения и выработку сигналов, обусловливающих формирование специфического иммунного ответа [10]. Система врожденного иммунитета включает в себя эпителиальный барьер, гуморальные факторы (систему комплемента, лизоцим, растворимые 31 белки – сурфактанты, дефензины, лизоцим и др.), клеточные элементы (естественные киллеры, макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы и др.) [276]. Эпителиальные клетки слизистой оболочки женских половых путей являются ключевым элементом системы врожденного иммунитета и первой линией антимикробной защиты. Их функция заключается не только в создании механического препятствия для проникновения патогенов, но и в распознавании структур микроорганизмов, с последующей секрецией цитокинов и запуском процесса воспаления. Распознавание микроорганизмов эффекторами врожденного высококонсервативных иммунитета структур, основано свойственных на детекции большой группе микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов, простейших). Эти структуры, постоянно присутствующие у многих микробных агентов (липополисахариды, флагеллин, нуклеиновые кислоты и др.), в отличие от специфических антигенов, разных для каждого микроорганизма, называются патогенассоциированными молекулярными образами (pathogen- associatedmolecularpatterns- PAMPs), а распознающие их рецепторы врожденной иммунной системы recognitionreceptors - - образраспознающими рецепторами (pattern- PRRs). Распознавание микроорганизмов системой врожденного иммунитета является пусковым моментом, обеспечивающим успешную защиту от патогенов [236, 235]. Среди сигнальных рецепторов, расположенных на мембранах и в цитоплазме иммунокомпетентных клеток, выделяют 2 вида образраспознающих рецепторов – NOD–рецепторы (нуклеотидсвязывающие олигомеризующие домены –nucleotide-bindingoligomerizationdomain) и TLR [244]. NOD–рецепторы расположены в цитоплазме клеток хозяина и участвуют в распознавании пептидогликанов внутриклеточных бактерий. NOD1 32 распознает диаминопимелиновую кислоту, присутствующую в пептидогликане клеточной стенки грамотрицательных бактерий, а NOD2 – мурамилпептидные структуры клеточной стенки любых бактерий [10]. Толл-подобные рецепторы (Toll-likereceptors, TLR) являются основными сигнальными рецепторами и экспрессируются внутриклеточно и на поверхности нейтрофилов, макрофагов, дендритных, эндотелиальных и эпителиальных клеток, а также натуральных киллеров [327]. Впервые ген, кодирующий TLR, был описан в 1985 году Кристианой Нюсляйн-Фольхард у дрозофилы [189]. Обнаружив, что один и тот же ген кодирует формирование дорсо-вентральной полярности в эмбриогенезе и устойчивость к грибковым инфекциям у дрозофил, исследователь назвала это удивительным (нем. «toll»), тем самым дав название всей группе образраспознающих рецепторов. У человека гомологичный ген, кодирующий TLR4, впервые описали R. Medzhitov и C. Janeway в 1997 году [129]. У млекопитающих описаны 13TLR, из них у человека встречаются 10. Эффекторные клетки врожденного иммунитета женских половых путей экспрессируют все 10 типов TLR, каждый из которых связывается со специфическим лигандом (табл. 1.) [236]. Распознавание бактериальных структур (липополисахаридов, липопротеина, флагеллина и т.д.) происходит через активацию TLR 1, 2, 4, 5 и 6. Четыре TLR способны распознавать нуклеиновые кислоты – это TLR 3, 7, 8 и 9 [350, 234]. TLR7 и TLR 8 распознают собственную и вирусную одноцепочечную РНК, а TLR9 связывает неметилированную ДНК бактерий.TLR3 способен распознавать двухцепочечную РНК вирусов, поэтому данный рецептор играет ключевую роль в противовирусном иммунном ответе [150]. TLR, распознающие структуры клеточной стенки бактерий, экспрессируются преимущественно на поверхности клетки, в то время как TLR 33 3, 7, 8 и 9, способные связываться с нуклеиновыми кислотами, располагаются внутриклеточно на поверхности эндосом. Связывание внутриклеточных рецепторов с лигандами происходит только после их попадания в клетку. Принято считать, что это происходит двумя путями. Если нуклеиновые кислоты находятся вне клетки (например, высвобождаются из поврежденных тканей в результате каких-либо инфекционных или неинфекционных процессов), то они поглощаются путем эндоцитоза и презентуются внутриклеточным образраспознающим рецепторам. Нуклеиновые кислоты бактерий и вирусов, размножающихся непосредственно внутри клетки, захватываются мембранными везикулами и доставляются к TLR, находящихся в эндосомах. Внутриклеточное расположение TLR, распознающих нуклеиновые кислоты, по-видимому, призвано значительно ограничить контакт лиганда и рецептора и тем самым предотвратить нежелательный или чрезмерный воспалительный ответ в организме хозяина [276]. Ранее считалось, что TLR связывают только вещества, присущие вирусам, бактериям и простейшим, но отсутствующие у млекопитающих. Однако в настоящее время доказано, что некоторые из них могут быть активированы при связывании с эндогенными лигандами, высвобождающимися из собственных тканей при их повреждении [353]. Связывание TLR с лигандом приводит к выработке цитокинов и антимикробных пептидов (табл. 1). Внутриклеточная передача сигнала происходит двумя возможными путями (рис. 1). Первый путь связан с включением адаптерного белка MyD88 (белок первичного ответа миелоидной дифференцировки 88), который активирует ядерный транскрипционный фактор NF-kB, инициирующий в ядре транскрипцию генов провоспалительных цитокинов и антимикробных пептидов. 34 Таблица 1 TLR и их лиганды TLR Лиганды Экзогенные Эндогенные TLR1 триацетилированные не обнаружены липопротеиды (вместе с TLR2) TLR2 пептидогликан, не обнаружены липопептиды, липотейхоевая кислота, зимозан TLR3 двухцепочечная РНК собственная РНК TLR4 липополисахариды, паклитаксел (противоопухолевый препарат растительного происхождения) белки теплового шока (HsP60, HsP 70, HsP 90), сурфактантный белок А, белок HMGB1 фибриноген, фибронектин, олигосахариды гиалуроновой кислоты, эозинофильный нейротоксин TLR5 флагеллин не обнаружены TLR6 диацетилированный не обнаружены липопротеин (вместе с TLR2) TLR7 одноцепочечная РНК не обнаружены TLR8 одноцепочечная РНК не обнаружены TLR9 неметилированная ДНК, аутоиммунный герпесвирусная комплекс хроматина с инфекция иммуноглобулином G 35 TLR10 не обнаружены не обнаружены Рис. 1. MyD88-зависимый и MyD88-независимый сигнальные пути TLR Кроме того, TLR3 и TLR4 способны запускать иммунный ответ по MyD88-независимому пути. Он осуществляется посредством адаптерного белка, индуцирующего интерферон-1β containingadaptorinducinginterferon-1β, фосфорилированию TRIF), интерферон-регулирующего (Toll/IL-1 что domain- приводит фактора-3 к (IRF-3). Альтернативный путь стимулирует выработку интерферонов I типа и активацию интерферон-индуцируемых генов [240]. Было показано, что у MyD88-дефицитных мышей ухудшается способность передачи сигнала через TLR, и их макрофаги не продуцируют провоспалительные цитокины в ответ на бактериальные компоненты. Несмотря на то, что TLR3 и 4 могут запускать MyD88-независимый сигнальный путь, 36 врожденная иммунная система у MyD88 делетированных мышей оказывается неспособной вызвать эффективный иммунный ответ [180]. 1.4.2. Экспрессия Толл-подобных рецепторов врожденного иммунитета в женском репродуктивном тракте и их роль в развитии акушерских и гинекологических заболеваний Эпителиальные клетки женских половых путей экспрессируют 10 типов Толл-подобных рецепторов (Toll-likereceptors, TLR), каждый из которых связывается только со специфичными лигандами [157, 348]. В связи с тем, что Толл-подобные рецепторы врожденного иммунитета являются первыми структурами иммунной системы, контактирующими с лигандами инфекционных агентов и запускающими иммунный ответ, они играют важную роль в патогенезе ряда акушерских и гинекологических осложнений. TLR1, TLR2 и TLR6 являютсярецепторами, распознающими преимущественно бактериальные лиганды. TLR2 по структуре сходен с TLR1 и TLR6. TLR2 формирует гетеродимеры с TLR1 и TLR6, что необходимо для распознавания диацетилированных и триацетилированных липопептидов. Комплекс TLR 1 и TLR 2 распознает различные микробные компоненты, такие, как пептидогликан грамположительных и грамотрицательных бактерий, фенолрастворимый модулин Staphylococcusaureusи гликолипиды Treponemamaltophylum. В женских половых путях TLR2 способен также распознавать пептидогликан Chlamydiatrachomatis, фрагменты пептидогликана фософолипоманнанCandidaalbicans. липополисахариды и Neisseriagonorrhoeae, TLR2 также вовлечен в распознавание компонентов вирусов простого герпеса I типа и цитомегаловируса.TLR2 в совокупности с TLR6 распознает белки клеточной стенки микоплазмы [240]. 37 Экспрессия TLR1 и TLR6 обнаружена в эпителиальных клетках маточных труб, эндометрии, эндоцервиксе, эктоцервиксе и влагалище. TLR1 экспрессируется также маточными эндотелиоцитами, гладкомышечными натуральными клетками шейки киллерами, матки и миометрия.TLR6 экспрессируется маточными натуральными киллерами и стромальными фибробластами влагалища. Экспрессия TLR2 выявлена в эпителии фаллопиевых труб, эндометрия, шейки матки и влагалища, а также гладкомышечных клетках шейки матки и влагалища, клетках стромы эндометрия и маточных натуральных киллерах [159]. TLR3. Этот рецепторраспознает двухцепочечную РНК и рассматривается как основной медиатор противовирусного иммунного ответа. Двухцепочечная РНК при вирусной инфекции может возникать из нескольких источников. Геном вируса может изначально быть в виде двухцепочечной РНК. Однако даже одноцепочечные РНК-вирусы могут содержать дефектные части, состоящие их двух цепей РНК. Внутриклеточная двухцепочечная РНК может образоваться несколькими путями. У вирусов, содержащих одну цепь РНК, образование второй цепи является обязательной стадией репродукции. У ДНКвирусов комплиментарная мРНК часто синтезируется на концах вирусного генома. Реже встречаются случаи, когда TLR3 активируется мРНК хозяина, которая выделяется из распадающихся клеток организма хозяина. TLR3 распознают мРНК целого ряда вирусов, попадающих в половые пути женщины – вирус простого герпеса, вирус папилломы человека, вирус гепатитов B и С, цитомегаловирус, ВИЧ. Кроме того, TLR3 способен распознавать двухцепочечную РНК простейших. Это свидетельствует о вовлечении этого рецептора не только в противовирусный, но и в противопротозойный ответ [293]. TLR3 экспрессируется в эпителии маточных труб, эндометрия, шейки матки и влагалища, а также в стромальных фибробластах влагалища и шейки матки и маточных натуральных 38 киллерах.Так, invitro была получена реакция в виде усиленной продукции цитокинов в ответ на стимуляцию культур эпителиальных клеток эндометрия, шейки матки, маточных труб полицитидиловой кислотой (роlу I:С), которая является лигандом TLR3 [249]. TLR3 запускают MyD88-независимый путь передачи сигнала, что приводит к выработке интерферонов и провоспалительных цитокинов через позднюю активацию NF-kB [141]. TLR4. Лигандом этого рецептора являются липополисахариды клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Кроме того, TLR4 распознает белок теплового шока 60, гликофосфолипиды простейших и белковую оболочку вирусов. В клинических исследованиях показана способность TLR4 связываться с липополисахаридамии липополисахаридами белками маннаномCandidaalbicans. теплового Neisseriagonorrhoeae, шока Chlamydiatrachomatis, TLR4 экспрессируется в маточных трубах, эндометрии, шейке матки и влагалище, гладкомышечных клетках матки и шейки матки, стромальных клетках эндометрия и маточных натуральных киллерах [190]. TLR5 распознает флагеллин, который является белковым компонентом бактериальных жгутиков. Предполагается, что TLR5 служит сенсором для бактерий, способных проникать через эпителий. TLR5 экспрессируется в эпителиоцитах маточных труб, эндометрия, влагалища, шейки матки, эндо- и эктоцервикса, гладкомышечных и эндотелиальных клетках, маточных натуральных киллерах. Флагеллин посредством активации TLR5 индуцирует секрецию провоспалительных цитокинов [133]. TLR7 и TLR8 распознают собственную и вирусную одноцепочечную РНК (например, ВИЧ). Оба вида рецепторов обнаружены в эпителиоцитах фаллопиевых труб, эндометрия, влагалища, шейки матки, строме эндометрия. TLR7 экспрессируются также маточными натуральными киллерами, в то время 39 как экспрессия TLR8 этими клетками не выявлена. Имиквимод (агонист TLR7) и CL075 (агонист TLR8) способны стимулировать продукцию ИЛ-8 в клетках эндометрия, маточных труб и шейки матки [204]. TLR9 распознает неметилированную ДНК бактериальных и вирусных геномов. Показано, что TLR9 играет роль в первичном иммунном ответе при генитальном герпесе и цитомегаловирусной инфекции. Экспрессия TLR9 обнаружена в эпителиоцитах фаллопиевых труб, эндометрия, влагалища, шейки матки, строме эндометрия, но отсутствует в натуральных маточных киллерах [350, 204]. TLR10. Специфические лиганды дляTLR10 не найдены. Предполагают, что ими могут являться структуры бактерий [170]. Однако в последних работах показано, что на активацию TLR10 может влиять и вирусная инфекция, в частности, вирус гриппа [341]. Экспрессия TLR10 рецептора выявлена только в эпителии маточных труб и натуральных маточных киллерах [181]. Экспрессия TLR также зависит от фазы менструального цикла, однако данные исследований противоречивы. Так, T. Hirata et al. [196] предполагают, что экспрессия мРНК TLR 2-4 и TLR 9 выше в перименструальный период [190], в то время как R. Aflatoonian et al. (2007) выявили пиковую экспрессию мРНК TLR 2-6, TLR 9 и TLR 10 в секреторную фазу цикла [269]. По данным U. Denisson et al. (2012), экспрессия TLR2, TLR4 и TLR5 значительно увеличивается в раннюю секреторную фазу менструального цикла [268]. TLRприсутствуют в матке во время беременности. В нескольких исследованиях был проведен количественный анализ экспрессии TLR в ранние и поздние сроки гестации. TLR 2 и 4 были широко представлены в клетках трофобласта [344]. Исследования invitro показали, что TLR 3 и TLR 4 клеток трофобласта, полученного на ранних сроках беременности, отвечают на соответствующие лиганды увеличением выработки цитокинов и хемокинов и усилением хемотаксиса нейтрофилов и лимфоцитов [132]. Эти данные служат 40 подтверждением способности клеток трофобласта активировать врожденный иммунитет и участвовать в индукции специфического иммунного ответа. Показана роль TLR в распознавании возбудителей половых инфекций и влиянии на тяжесть воспалительного процесса [212, 314, 317]. О.А. Ганковская с соавт. (2008) установили, что экспрессия TLR1 и TLR2 в эпителии слизистой цервикального канала достоверно увеличивается при наличии урогенитальной инфекции, что приводит к активации синтеза антимикробных пептидов и провоспалительных цитокинов [90]. ВработахP. Fisette et al. (2003) также было показано, что распознавание липопротеидов Neisseriagonorrhoeaeпроисходит путем их связывания с TLR1 и TLR2 [320]. Также в индукции иммунного ответа на гонококк участвует TLR4 [303]. В распознавании хламидийной инфекции участвуют 3 типа TLR: TLR2 (лиганд - пептидогликан), TLR4 (лиганды – липополисахарид и белки теплового шока) и TLR9 (лиганд – ДНК хламидий) [342]. При этом, несмотря на то, что TLR9 экспрессируется эпителиоцитами слизистой оболочки матки, его роль в патогенезе хламидийной инфекции практически не изучалась [179]. Что касается TLR2 и TLR4, то данные об их экспрессии в эксперименте на мышах и в культуре клеток человека имеют различия. Эксперименты с линией мышей, нокаутированных по гену TLR2, показали, что в случае их заражения Chlamydiamuridarumуровни провоспалительных цитокинов, объем секрета и выраженность воспалительного процесса в маточных трубах были значительно ниже, чем у нормальных мышей контрольной группы, при этом количество возбудителя в обеих группах не отличалось. У мышей, нокаутированных по гену TLR2, достоверных различий в выраженности воспалительной реакции по сравнению с нормальной линией мышей отмечено не было [171]. Эти данные позволяют предположить, что различия в экспрессии TLR2 могут влиять на степень выраженности воспалительного процесса при одинаковом количестве патогена. 41 В работах на культурах клеток человека было показано, что в распознавании Chlamydiatrachomatisучаствуют не только TLR2, но и TLR4. Так, O’Connell et al. (2006) показали, что хламидии активируют иммунный ответ в культуре эмбриональных клеток почки HEK-293 через связывание с TLR2, а белок теплового шока хламидий HsP60 через TLR4 активирует NF-kB, что приводит к увеличению секреции интерлейкина-8 [258]. Роль TLR в возникновении спаечного процесса в маточных трубах подлежит дальнейшему изучению, однако результаты последних исследований, касающихся полиморфизма генов TLR9, TLR4, СD14 и NOD2 у пациенток с хламидийной инфекцией, показывают, что наличие измененных пар нуклеотидных последовательностей двух и более из них увеличивает риск развития спаечного процесса маточных труб [179]. Mycoplasmagenitaliumспособна увеличивать экспрессию NF-kB через стимуляцию TLR2 и TLR6 в эпителиальных клетках, при этом в эпителии влагалища это увеличение было менее выраженным, чем в эпителии цервикального канала [175, 251].Ureaplasmaurealyticum активирует экспрессию TLR2 и TLR4 в моноцитах, а также TLR 2, TLR 4, TLR 6, TLR9 и NF-kB в клетках трофобласта и эпителии амниона, что приводит к увеличению синтеза циклооксигеназы (COX) и простагландинов [158, 253, 318]. В работах, посвященных трихомониазу, было показано, что на поверхности возбудителя Trichomonasvaginalisнаходятся сложные углеводы, в частности, липофосфогликаны, которые способны распознаваться TLR. R. Fichorovaetal. (2006) в экспериментах на культуре эмбриональных клеток влагалищного и цервикального эпителия показали, что их культивирование с нецитотоксическими дозами липофосфогликана в течение 6 и 24 часов вызывало значительное дозозависимое увеличение уровней хемокинов: интерлейкина-8 (IL-8) и макрофагального воспалительного протеина-3α (MIP3α), а после блокады адаптерного белка MyD88 секреция вышеуказанных 42 хемокинов значительно снижалась. Блокирование же NF-kB приводило к полному прекращению секреции данных хемокинов. На основании полученных выводов было сделано заключение, что липофосфогликаны способны запускать как MyD88-зависимый, так и MyD88-независимый пути активации синтеза цитокинов. IL-8, в свою очередь, является основным хемокином, способным осуществлять рекрутинг нейтрофилов в очаг воспаления, а также способен активировать репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [355].MIP3α осуществляет рекрутинг предшественников дендритных клеток в очаг воспаления, их переход через базальную мембрану на поверхность эпителия и созревание [307]. Дендритные клетки являются антиген-презентирующими клетками, играющими значительную роль в заражении ВИЧ как путем прямого инфицирования, так и путем захвата вирусных частиц с последующей их презентацией Т-лимфоцитам в лимфоузлах [361]. Поэтому высокий риск заражения ВИЧ среди пациентов с трихомониазом связан с активацией системы врожденного иммунитета посредством связывания липофосфогликанов трихомонад с TLR [167]. В распознавании вирусной инфекции эпителиальными клетками женских половых путей значительную роль играет TLR3, активация которого индуцирует секрецию IL-6, IL-8 и гранулоцитарного хемотаксического протеина-2 [212]. Обработка эмбриональных клеток эндоцервикса, зараженных вирусом простого герпеса 2 типа, полицитидиловой кислотой (polyI:C) значительно снижает возможность передачи вирусов вследствие выработки цитокинов и интерферонов [317]. Исследования, проведенные в культуре клеток и на моделях животных, показали, что TLR играют роль в патогенезе выкидышей и преждевременных родов. В исследованиях, касающихся экспрессии TLR в культуре клеток трофобласта, было показано, что в первом триместре они экспрессируют TLR1, TLR2, TLR3 и TLR4, но не TLR6 [178]. К концу третьего триместра в плаценте 43 появляется экспрессия TLR6, что предположительно указывает на зависимость его экспрессии от гормональных факторов [132].E.C. Bejaretal. (2006) показали, что трофобласт экспрессирует TLR4 в первом триместре значительно меньшей степени, чем в третьем [194]. Эти данные позволяют предположить, что хорион на ранних сроках беременности менее восприимчив к действию патогенов, чем на доношенном сроке, хотя механизмы этого явления еще нуждаются в изучении [245]. Кроме того, показано, что TLR в первом триместре экспрессируются только в ворсинчатом цитотрофобласте и вневорсинчатом трофобласте, но не в синцитиотрофобласте [132]. Предполагают, что незначительная экспрессия TLR в синцитиотрофобласте, который является наружным слоем, позволяет хориону формировать иммунный ответ только в случае, если микроорганизм разрушает этот наружный слой [132, 157]. В отличие от эндометрия вне беременности, очень мало данных об экспрессии TLR в децидуальной ткани. Методом количественной ПЦР у человека в децидуальной оболочке была выявлена экспрессия мРНК всех TLR, а экспрессия TLR2 и TLR4 была выявлена на уровне белка [197]. Иммуногистохимическим методом была выявлена экспрессия в эндометрии во время беременности TLR 1-6 [152]. Invitro было показано, что активация различных TLR в трофобласте в I триместре беременности приводит к различным эффектам. Так, стимуляция липополисахаридами TLR4 в I триместре приводит к незначительному выбросу провоспалительных цитокинов. В то же время пептидогликан, активирующий TLR2, индуцирует апоптоз клеток трофобласта в гораздо большей степени, чем выработку цитокинов [338]. Однако следует подчеркнуть, что индукция синтеза цитокинов зависит не только от типа рецептора, но и от индуктора. Хотя липополисахариды грамотрицательных бактерий invitro не способны вызвать значительный выброс 44 цитокинов, белки теплового шока хламидий (HSP60) способны индуцировать апопотоз клеток трофобласта [160]. Кроме того, на конечный эффект связывания с лигандом влияет синергизм TLR. Так, показано, что активация TLR2 в третьем триместре беременности приводит не к апоптозу трофобласта, а к экспрессии циклооксигеназы-2 и простагландина Е2. По-видимому, это различие между активацией TLR2 в первом и третьем триместре беременности связано с появлением в третьем триместре экспрессии TLR6 [261]. В работах на мышах было показано, что для активации TLR2 пептидогликаном требуется его кооперация с рецепторами TLR1 и TLR6. При этом апоптотический эффект наблюдается при стимуляции пептидогликаном гетеродимерного комплекса TLR1/TLR2, что приводит к активации каспазы-3, каспазы-8 и каспазы-9 через MyD88/FADD-зависимый путь, в то время как присутствие TLR6 может изменить тип ответа, что позволит избежать апоптоза и стимулирует выработку цитокинов через активацию NF-kB [338] (рис. 2). Однако в работах J.A. Sanchez-Lopez et al. (2014) было показано, что активация TLR6 совместно с TLR2 в культуре клеток снижает способность трофобласта к адгезии [256]. Аналогичный эффект наблюдается и при активации TLR5 [134]. Лиганды грамположительных бактерий также могут вызывать преждевременные роды. Давно известно, что у грызунов липотейхоевая кислота способна индуцировать прерывание беременности [255]. Этот эффект, по всей вероятности, является следствием активации TLR2. Недавно было показано, что пептидогликан и липотейхоевая кислота, оба являющиеся лигандами TLR2, при внутриматочном введении индуцируют преждевременные роды. Однако, в отличие от TLR4, связывание с TLR2 не приводит к индукции воспалительного ответа, что подтверждается отсутствием увеличения продукции в тканях провоспалительных цитокинов TNF-α и IL1-β при введении пептидогликана [135]. 45 Эти данные подтверждаются исследованиями V. Abrahams et al. (2008), согласно которым при интраперитонеальном введении беременным мышам пептидогликана не было выявлено увеличения продукции провоспалительных цитокинов, в отличии от группы мышей, которым вводили липополисахариды [338]. Рис. 2. Связывание антибактериальных структур с TLR1, TLR2, TLR4 и TLR6 С другой стороны, у мышей, получавших пептидогликан, наблюдались явления апоптоза в трофобласте [144, 287]. Эти данные свидетельствуют о том, что механизмом прерывания беременности, вызванным пептидогликаном, является не воспалительная реакция, а апоптоз. На различных видах животных было показано, что индукция самопроизвольных выкидышей происходит через активацию TLR4, которая запускается липополисахаридами грамотрицательных бактерий. Так, H. Wang и E. Hirsh (2003) показали, что инъекция убитой нагреванием культуры кишечной палочки в полость матки у нормальной линии мышей приводила к прерыванию 46 беременности в 100% случаев. В то же время у мутантной по TLR4 линии мышей выкидышей не произошло ни в одном случае [145]. Подобный результат был получен и в другом независимом исследовании [130]. В том же исследовании H. Wangи E. Hirsh (2003) установили, что связывание липополисахаридов с TLR4 приводит гидроксипростагландиндегидрогеназы, к которая ингибированию является 15- ферментом, катаболизирующим простагландины в плодовых и материнских тканях [145]. Таким образом, активация TLR4 подавляет деградацию простагландинов. Введение липополисахаридов также увеличивает содержание в сыворотке крови матери концентраций фактора некроза опухоли-α (TNF- α) и цитокинов IL-6 и IL-1α [265], что может влиять на системный и местный иммунный ответ. Интересно, что связывание липополисахаридов с TLR4 способствует увеличению экспрессии TLR2,. Это позволяет предположить, что запуск каскада реакций происходит несколькими путями, вызывая избыточный иммунный ответ, особенно при наличии сочетанных инфекций [184]. Кроме того, TLR способны играть роль в патогенезе антифосфолипидного синдрома как причины невынашивания беременности. Рассматривая антифософолипидный синдром с позиций его полиэтиологичности, Y. Shoenfield et al. (2008) описывают его возникновение гипотезой «двух ударов» [140]. Она объясняет, почему тромбозы возникают не всегда даже при наличии антифосфолипидных антител. Антифосфолипидные антитела («первый удар») увеличивают тромбофилический риск, но свертывание возникает в присутствии других тромбофилических факторов («второй удар»). Было высказано предположение, что инфекционные процессы могут быть «вторым ударом», поскольку они часто предшествуют манифестации антифосфолипидного синдрома и могут быть инициаторами его катастрофического подтипа [225]. Рецепторы врожденного иммунитета, в частности, TLR, вовлеченные в распознавание микробных структур, могут 47 выступать синергистами в этом процессе и запускать механизм свертывания. Предположительно, TLR4 является медиатором для β2-липопротеида, способствуя активации свертывания [312, 331]. TLR4 также присутствует на тромбоцитах. Однако не было найдено доказательств, что TLR4 участвует в их активации [291]. Иногда наличие полиморфизма генов, кодирующих сигнальные пути, способствующие выбросу медиаторов воспаления (в частности, TLR4), может защищать от тромбоза вследствие ослабления воспалительного процесса, который может способствовать его развитию [349]. В культуре клеток было показано, что антитфосфолипидные антитела могут вызывать иммунный ответ, активируя TLR4 по MyD88-зависимому пути. В высоких концентрациях они также способны вызывать индуцированную каспазой гибель трофобласта. Данный эффект ослабляется при блокаде MyD88зависимого пути [139]. Клинические исследования, проведенные у беременных и рожениц, также подтверждают ключевую роль TLR, активируемых бактериальными лигандами, в развитии преждевременных родов инфекционного генеза. Было показано, что экспрессия TLR2 и TLR4 в децидуальной оболочке и плаценте увеличивается при преждевременных родах с развитием хориоамнионита [351, 82]. Было предложено использовать определение экспрессии TLR2 в качестве маркера преждевременных родов на сроке 28-36 недель у пациенток с внутриутробной инфекцией [91]. В настоящее время, исходя из результатов клинико-эпидемиологических исследований, не подвергается сомнению роль вирусной инфекции в патогенезе самопроизвольных выкидышей [75, 142, 210]. В литературе описаны результаты ряда экспериментальных исследований на мышах, касающихся влияния экспрессии TLR, лигандами которых являются нуклеиновые кислоты, на развитие самопроизвольных выкидышей. 48 Так, было показано, что TLR3 способствует продукции интерферонов и активирует продукцию провоспалительных цитокинов и антимикробных пептидов через MyD88-независимый путь и позднюю активацию NF-kB (рис.3). Рис. 3. Распознавание вирусных компонентов через TLR3 J.Zhanget al. (2007) в экспериментах на мышах показали, что назначение полицитидиловой кислоты (polyI:C), являющейся лигандом TLR3, нарушает формирование сосудов в беременной матке из-за увеличения выработки TNF-α и предположили, что это приводит к потере беременности [343]. Кроме того, результатом активации TLR3 является выработка β-интерферона и цитокина 5 (RANTES), что также может способствовать преждевременным родам [135]. Было также показано, что сочетанная активация TLR полицитидиловой кислотой и пептидогликаном усиливает вероятность возникновения преждевременных родов. Эти результаты свидетельствуют о наличии триггерного механизма, который минимизирует ответы на одиночные стимулы, 49 но в то же время приводит к прекращению беременности при синергичном воздействии нескольких из них [217]. Кроме того, представляет интерес изучение роли фермента индоламин2,3-диоксигеназы (indoleamine-2,3-dioxygenase, иммуносупрессивным и антимикробным IDO), действием, обладающей в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков, так как известно, что ее экспрессия зависит от активации TLR3 [352]. IDO представляет собой фермент, который катаболизирует триптофан по кинурениновому пути и тем самым способствует супрессии Т-клеточного звена иммунитета из-за образования токсичных для них продуктов катаболизма [195, 241, 316]. Так, показана способность IDO блокировать пролиферацию Т-лимфоцитов и подавлять активацию комплемента [199]. IDO экспрессируется в клетках многих опухолей и в инфильтрирующих их макрофагах, позволяя им избегать иммунологической атаки со стороны организма [284]. Ингибиторы IDO, напротив, способствуют замедлению роста опухолей и способствуют увеличению эффективности химиотерапии [222]. IDO широко экспрессируется в большинстве органов и тканей, в том числе в хорионе, плаценте и децидуальной оболочке [257, 324].Invitro было установлено, что активация IDO в клетках трофобласта способствует подавлению клеточного иммунитета и развитию иммунологической толерантности к эмбриону [223, 309]. Экспрессия IDO стимулируется γинтерфероном, синтез которого, в свою очередь, зависит от экспрессии TLR3 [352]. Кроме того, IDO является основным внутриклеточным механизмом защиты от ряда патогенов, в частности, хламидий, лишая их незаменимой аминокислоты – триптофана [165, 300]. Механизмы регуляции экспрессии IDO до сих пор остаются неустановленными. Известно, что одни и те же индукторы, например, прогестерон, способны угнетать или стимулировать индукцию IDO в культуре 50 клеток или invivo [266]. Действие IDO также является разнонаправленным. С одной стороны, повышенная продукция IDO способствует формированию иммунологической толерантности к антигенам плодного яйца и угнетает рост внутриклеточных патогенов. С другой стороны, это может способствовать избыточной иммуносупрессии вплоть до развития септических состояний [187]. В связи с этим представляет интерес изучение особенностей экспрессии IDO у пациенток с самопроизвольными выкидышами ранних сроков. Была изучена также роль TLR в патогенезе заболеваний новорожденных. В экспериментах на мышах было показано, что повреждения белого вещества головного мозга, часто встречающиеся при преждевременных родах, могут быть связаны с активацией TLR4 у плода. Было установлено, что низкие дозы липополисахаридов, не вызывающие тяжелых осложнений беременности, тем не менее способны значительно усиливать повреждения головного мозга плода гипоксического генеза на модели новорожденных мышей [173]. Полученные данные согласуются с клиническими наблюдениями, в которых степень тяжести повреждений головного мозга у новорожденных зависит не только от факта преждевременных родов, но и от наличия инфекции. В литературе есть данные о ведущей роли системы врожденного иммунитета в развитии сепсиса у новорожденных [198]. Развитие иммунного ответа в иммунокомпетентных клетках, ответственных за местный иммунитет, включая макрофаги, эпителиоциты, эндотелиальные клетки, гранулоциты и дендритные клетки, зависит от обнаружения возбудителя или наличия повреждения тканей. Образраспознающие рецепторы (РRRs), в том числе TLR, способны распознавать как лиганды, ассоциированные с повреждениями (danger-associatedmolecularpatterns - DАMРs) (цитокины, внутриклеточные белки, и медиаторы, выделяемые поврежденными или погибшими клетками), так и белки возбудителей инфекционных заболеваний. При этом в ответ на микробные стимулы, вовлечение образраспознающих рецепторов на 51 лейкоцитах, циркулирующих в крови новорожденных, приводит к модели иммунного ответа, отличающегося от старших детей и взрослых замедленной продукцией провоспалительных цитокинов, которые могли бы увеличить риск развития и прогрессирования инфекции. У взрослых пациентов с сепсисом прогностически неблагоприятным считается снижение экспрессии TLR2 в моноцитах периферической крови, что ассоциировано с высокой летальностью из-за снижения продукции цитокинов [271]. Исследований роли TLR в развитии послеродовых ГСЗ у женщин не проводилось. В работах на коровах, однако, было показано, что введение убитой нагреванием Escherichiacoliили липополисахаридовв полость матки приводит к TLR4-опосредованному увеличению продукции фактора некроза опухоли-α, NО-синтазы, и простагландинов групп Е и F. Прогестерон и эстрадиол ингибировали продукцию простагландинов в эндометрии, вызванную липополисахаридами, что косвенно свидетельствует о том, что экспрессия TLR4 является гормонзависимой [193, 174]. Таким образом, в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют данные о роли TLR в патогенезе послеродового эндометрита. Исследования, посвященные роли TLR в развитии невынашивания беременности, проводились преимущественно на моделях животных и в культуре клеток. Роль TLR клеток врожденного иммунитета, критически значимых для развития инфекционновоспалительных заболеваний женской репродуктивной системы, изучена недостаточно, что препятствует разработке эффективных методов их профилактики и лечения. Это диктует необходимость проведения данного исследования. 52 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объект исследования Сбор материала проводили на базе Перинатального центра Белгородской Областной клинической больницы (БОКБ) Св. Иоасафа (главный врач –д.м.н., проф. Чефранова Ж.Ю.) и МУЗ «Городская клиническая больница №1 г. Белгорода» (главный врач – д.м.н. Сотников А.С.). Общеклиническое исследование проводилось на базе клинической лаборатории БОКБ Св. Иоасафа (зав. лабораторией – к.м.н. Клочкова Г.Н.), бактериоскопическое и бактериологическое исследование – на базе бактериологической лаборатории БОКБ Св. Иоасафа (зав. лабораторией – Тафинцева Г.А.). иммуноферментный анализ и ПЦР – на базе НИЛ «Молекулярная генетика человека» (руководитель лаборатории – профессор, д.м.н. Чурносов М.И.). В проспективном исследовании было обследовано 233 пациентки, госпитализированных в Перинатальный центр Белгородской Областной клинической больницы Св. Иоасафа и МУЗ «Городская клиническая больница №1» на ранних (6-10 нед.) и поздних (38-40 нед.) сроках беременности за период с 2010 по 2012 год (рис. 4). Пациентки были отобраны методом систематической вероятностной выборки. Перинатальный центр БОКБ Св. Иоасафа является стационаром высокой степени риска, в котором родоразрешаются 5500-6000 женщин ежегодно. Стационар состоит из 401 койки, из них – 251 акушерского и 60 гинекологического профиля, а также включает 12 коек для женщин в отделении реанимации и интенсивной терапии, 18 коек в отделении реанимации новорожденных, 60 коек в отделении II этапа выхаживания для новорожденных с неврологическими осложнениями, маловесных и недоношенных детей. Акушерский стационар состоит из 3 отделений патологии беременных, включающих 141 койку, родового отделения, состоящего из 12 53 индивидуальных палат, и 3 послеродовых отделений, включающих 110 коек. Выписка из послеродового отделения производится на 3 сутки после родразрешения через естественные родовые пути и на 5-6 – после оперативных родов. В составе МУЗ «Городская клиническая больница №1» г. Белгорода находится гинекологическое отделение, состоящее из 65 коек. Для исследования клинико-патогенетических особенностей самопроизвольных выкидышей было обследовано 114 женщин на ранних сроках беременности (6-10 недель), поступивших в МУЗ «Городская клиническая больница №1» г. Белгорода. Основную группу (I) составили 57 пациенток с самопроизвольным выкидышем или неразвивающейся беременностью ранних сроков (6-10 нед.). Критериями включения в данную группу были: - согласие женщины на проведение исследования (прил. 1);; - срок беременности 6-10 недель;; - клиническая картина неразвивающейся беременности, аборта в ходу;; -отсутствие тяжелых экстрагенитальных заболеваний, эндокринных нарушений, антифосфолипидного синдрома. Критериями исключения из данной группы являлись: - отсутствие согласия на проведения исследования;; - срок беременности менее 6 и более 10 недель;; - прогрессирующая беременность;; 54 Общее количество пациенток n=233 Пациентки на сроке 6-10 нед. беременности n=114 Самопроизвольное прерывание беременности (I группа) n=57 Искусственный аборт, группа контроля (II группа) n=57 чел. Рис. 4. Исследованные группы пациенток. Беременные на сроке 38-40 нед. с высокой степенью инфекционного риска n=85 С развившимся впоследствии эндометритом (III) n=21 С неосложненным послеродовым периодом (IV) n=64 Беременные высокой степени инфекционного риска на сроке 38-39 нед.,, получавшие профилактическое лечение лигандами TLR (V) n=34 До лечения После лечения - наличие тяжелых экстрагенитальных заболеваний, самопроизвольные выкидыши, вызванные эндокринными нарушениями и наличием антифосфолипидного синдрома. В качестве группы контроля (II) были обследованы 57 здоровых женщин, поступивших для проведения искусственного аборта на тех же сроках. Пациентки группы контроля были сопоставимы с основной группой по возрасту, не имели соматических и гинекологических заболеваний. На поздних сроках беременности объектом исследования явились 85 женщин на сроке 38-41 нед. с высокой степенью инфекционного риска. Критериями включения в данную группу являлись: - согласие женщины на проведение исследования (прил. 1) - клинико-анамнестические данные (гестационный пиелонефрит или обострения хронического пиелонефрита в течение беременности, угроза прерывания беременности на протяжении всего срока гестации, наличие в анамнезе неспецифических воспалительных заболеваний женских половых органов, послеродовых и послеабортных эндометритов);; - одноплодная беременность на сроке 38-41 неделя;; - клинические, бактериологические и бактериоскопические признаки воспалительного процесса (наличие кольпита, подтвержденного данными бактериоскопического исследования, выявление условно-патогенной флоры в цервикальном канале в количестве более 103-4 КОЕ/мл по данным бактериологического исследования);; - признаки внутриутробного инфицирования по данным эхографического исследования: плацентомегалия, наличие взвеси в околоплодных водах, вентрикуломегалия и пиелоэктазия у плода. Критериями исключения из группы были: - срок беременности менее 37 недель, в том числе преждевременное излитие околоплодных вод при недоношенной беременности;; - наличие тяжелой акушерской и экстрагенитальной патологии (тяжелый гестоз, сахарный диабет, в том числе гестационный, дыхательная и сердечная недостаточность и др.);; - лица с поливалентной аллергической реакцией на лекарственные препараты;; - пациенты, отказавшиеся от проводимого исследования. После родоразрешения все 85 пациенток были разделены на 2 группы – с развившимся послеродовым эндометритом (III группа, n=21) и с нормально протекавшим послеродовым периодом (IV группа, n=64). Критериями послеродового эндометрита (включение в III группу) являлись: повышение температуры тела у пациенток со стертой формой эндометрита - до 37,5 – 38,5ºС, с тяжелой – до 39 ºС, симптомы общей интоксикации, лейкоцитоз (более 11*109/л) с нейтрофильным сдвигом, СОЭ>30 мм/час, субинволюция матки, при гистологическом исследовании – признаки хориодецидуита и амниохориодецидуита. Эхографическое исследование матки использовали как вспомогательный метод, рассматривая в качестве эхографических признаков эндометрита субинволюцию матки и расширение ее полости более 10 мм. Всем женщинам III и IV группы в послеродовом периоде проводилась антибактериальная терапия, в III группе вакуум-аспирация содержимого полости матки и инфузионная терапия. Так как одной из задач исследования являлась коррекция выявленных нарушений экспрессии сигнальных рецепторов, V группу составили 34 пациентки на сроке беременности 38-39 недель, имевшие высокую степень риска развития инфекционных осложнений, которым на поздних сроках проводилось профилактическое введение интравагинального препарата, содержащего лиганды TLR, а в послеродовом периоде – антибактериальная 57 терапия. Критерии включения и исключения из группы были те же, что и группах III и IV. Так как бактериальная микрофлора способна стимулировать экспрессию TLR, для профилактики послеродового эндометрита у беременных высокой степени инфекционного риска был выбран комплексный препарат (КП), содержащий 50 мг лиофилизата ацидофильных лактобактерий и 30 мкг * эстриола . Пациентки были ознакомлены с целью исследования, механизмом действия препарата, противопоказаниями для применения. Было получено их согласие на применения препарата. КП вводили интравагинально, по 1 свече 1 раз в день в течение 6 дней. Оценивали клиническую, бактериологическую эффективность и иммунный статус до и после применения препарата. 2.2 Методы исследования. 2.2.1 Клиническое обследование и сбор материала Всем женщинам проводилось анкетирование согласно специально разработанным опросникам (приложение 2 для невынашивания беременности ранних сроков, приложение 3 для поздних сроков беременности). Данные лабораторных и инструментальных методов исследования в женской консультации вносили в анкету путем выкопировки из обменной карты. На момент госпитализации всем женщинам проводилось объективное исследование согласно приказу №572н, общеклиническое обследование: общий анализ крови -на автоматическом гематологическом анализаторе «CoulterLH 500» («BeckmanCoulter», США), общий анализ мочи – на анализаторе мочи «Uriscanpro» («YD Diagnostics», Южная Корея), биохимический анализ крови – * - в качестве комплексного препарата использовали «Гинофлор-Э» (“Medinova”, Швейцария) 58 на биохимическом анализаторе «OlympusAU640» («Olympus», США), коагулограмма на приборе «DiacheckCP4» («Dialab», Австрия). Эхографическое исследование во время беременности и после родов и допплерометрия были выполнены на аппарате «ESAOTEMyLab 20» (Нидерланды). Сбор крови для иммуноферментного анализа (ИФА) с целью определения плацентарных гормонов на поздних сроках беременности у женщин с высокой степенью инфекционного риска производили из кубитальной вены в пробирку Vacuutainer («GreinerBioOne», Австрия) с последующим центрифугированием при 8000 об./мин («Eppendorf--5418R», Германия) в течение 10 минут. Полученную сыворотку переносили в стерильные пробирки (SSI, США) и замораживали при -20°С. Для исследования уровней плацентарного лактогена, эстриола и прогестерона в сыворотке крови у пациенток с доношенным сроком беременности использовали наборы для ИФА «Плацентарный лактоген EIA1283», «Эстриол свободный EIA1612», «Прогестерон EIA1561» («DRG», Германия), анализ выполняли согласно инструкции производителя на иммуноферментном анализаторе ”Мультискан EX” (Thermolabsystems, Финляндия). Сбор материала из цервикального канала для бактериологического исследованияпроизводили стерильным тампоном после удаления цервикальной слизи. Тампоны помещали в угольную транспортировочную среду Amies (“NuovaAptaka”, Италия). У каждой пациентки материал собирали в 2 пробирки – одну помещали ванаэростат BectonDickinsonGasPak-100, снабженный газогенераторными пакетами. В дальнейшем из этой пробирки выделяли анаэробные микроорганизмы. Из второй пробирки делали посев на среды для выявления аэробных микроорганизмов. Полученный материал в течение часа транспортировали в бактериологическую лабораторию. 59 Материалом для определения экспрессии мРНК TLR 1-10, белков их сигнального пути и ферментов на ранних сроках беременности являлся эпителий цервикального канала и полости матки, на поздних сроках беременности - клетки эпителия цервикального канала. Взятие материала на ранних сроках беременности. В качестве материала использовали соскоб эпителия цервикального канала, который получали с помощью ложки Фолькмана, обнажая шейку матки в зеркалах и удаляя стерильным тампоном слизь из цервикального канала, а также соскоб эндометрия, который получали при выскабливании стенок полости матки кюреткой №4 при самопроизвольном выкидыше или проведении искусственного аборта. Материал помещали в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл консервирующей среды RNAlater (“Ambion”, США). Взятие материала проводили на доношенном сроке беременности и 3 сутки после родов. Шейку матки обнажали в зеркалах, стерильным тампоном удаляли слизь из цервикального канала. Затем с помощью цитощетки производили сбор материала в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл консервирующей среды RNAlater (“Ambion”, США). После помещения материала в раствор RNAlater пробирки оставляли в холодильнике при температуре +4 ºС на 1 сутки согласно инструкции производителя, затем помещали в морозильную камеру и в дальнейшем хранили при температуре –28 ºС. 2.2.2. Бактериоскопическое и бактериологическое исследование Бактериоскопическое исследование содержимого влагалища и цервикального канала проводили после окрашивания мазков по Граму. Для верификации видов аэробных и анаэробных микроорганизмов был использован бактериологический метод исследования в соответствии с 60 методикой действующего Приказа МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 [68] и методическими рекомендациями Б.А. Ефимова с соавт. (2002) [32]. Подсчет колониеобразующих единиц производили по методу Коха [34]. Аэробные термостате микроорганизмы ТВ-80-1 культивировали («Касимовский завод», в суховоздушном Россия). Исследование анаэробных микроорганизмов проводили в бескислородных условиях в термостате - анаэростате MCO-15AC(«Sanyo», Япония). Посев аэробных микроорганизмов первоначально производили на 5% кровяной агар с последующим отсевом на селективные среды. Для выделения энтерококков использовали селективный Bileesculinazidagar («Sigma-Aldrich», США), позволяющий дифференцировать их от других стрептококков на основании способности расти в присутствии желчи. Для выделения стафилококков применяли желточно-солевой агар Staphylococcusagar («Conda», Испания). Дифференциальную диагностику между эпидермальным и золотистым стафилококком проводили на основании способности последнего к плазмокоагуляции. Для обнаружения кишечной палочки производили посев на среду Эндо (ЗАО «НИЦФ», Россия). Культивирование энтеробактерий, клебсиеллы, протея, синегнойной палочки проводили на среде MacConkey(«Conda», Испания) с верификацией последующей на основании микроскопической определения идентификацией оксидазной, и каталазной, лецитиназной активности. Лактобактерии культивировали на среде MRS (ЗАО «НИЦФ», Россия), на которой они росли в виде белых гладких или шероховатых колоний и не обладали оксидазной и каталазной активностью. 61 Бифидобактерии высевались на твердой среде Блаурокка («Conda», Испания) в течение 72 часов. Они имели типичный вид «куриной косточки» при бактериоскопическом исследовании колоний. Для обнаружения грамположительных спорообразующих клостридий посевы проводили на среду Columbiaagarbase(«Sigma-Aldrich», США) с добавлением 5% крови и 24-х часовой анаэробной инкубацией. Бактероиды высевали на селективной среде BacteroidesBileesculinagar(«Sigma-Aldrich», США). Для выделения других облигатно- и факультативно анаэробных бактерий использовали Schaedleragar(«Sigma-Aldrich», США) и жидкую тиогликолевую среду FluidThioglycollatemedium(«Becton-Dickinson», США). Грибы рода Candida высевались на среде Сабуро (ЗАО «НИЦФ», Россия) в течение 72 часов. 2.2.2. Иммунологическое исследование Определение экспрессии мРНК TLR, белков их сигнального пути, ферментов синтеза простагландинов и апоптоза проводили методом количественной ПЦР в НИЛ «Молекулярная генетика человека» НИУ БелГУ (руководитель лаборатории – проф., д.м.н. Чурносов М.И.). Количественная ПЦР выполнялась согласно рекомендациям MIQE [321]. Для выделения РНК из образцов пробирки размораживали при комнатной температуре, затем центрифугировали при 12000 об. («Eppendorf-5418R», Германия) в течение 5 – 10 минут, надосадочную жидкость удаляли. Полученный осадок представлял собой взвесь эпителиальных клеток, которые были пригодны для выделения РНК. После размораживания проб экстракцию РНК проводили методом фенолхлороформной экстракции [162] с использованием реагента Тризол (“Invitrogen”, США). 62 Качество РНК проверяли методом электрофореза в течение 15 минут при напряжении 10V/см по интенсивности свечения полос рибосомальной РНК в 1,1% агарозном геле с бромистым этидием. Затем образцы обрабатывали ДНКазой DNAseIRNAsefree (“Fermentas”, США) для удаления геномной ДНК согласно инструкции производителя. Для проведения обратной транскрипции использовали обратную транскриптазу Mint использовали (“Евроген”, Россия). Для олигодезоксинуклеотиды инициации (oligoDT), реакции синтезированные фирмой «Евроген». В реакцию вносили 500 нг. РНК, предварительно прогретой до 55 градусов (концентрацию мРНК проверяли на спектрофотометре Nanodrop (“Thermoscientific”, США) и 4 мкл oligoDT (20 мкМ). Обратную транскрипцию проводили согласно инструкции производителя. Качество полученной кДНК оценивали с помощью гельэлектрофореза в 1,1% агарозном геле с бромистым этидием. Для дальнейшей ПЦР использовали разведение полученной кДНК со стерильной водой в объеме 2 к 50. Для количественной ПЦР подбор праймеров генов осуществлялся с помощью базы данных BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov). Одним из условий поиска праймеров было отличие температуры амплификации прямого и обратного праймера не более 2 ºС. Все полученные пары праймеров были протестированы на возможность образования «шпилек» и димеров с помощью программы BeaconDesignerFreeEdition (http://www.premierbiosoft.com/qOligo/Oligo.jsp?PID=1). Кроме того, с целью тестирования на димеры праймеров в программу для ПЦР был добавлен этап анализа кривой плавления (meltcurve). Были выбраны следующие праймеры (табл. 2). Среди всех генов – нормировщиков по данным литературы [177, 269] (http://www.rtprtprimerdb.org) и были базы данных выбраны RT-PrimerDatabase наиболее стабильно 63 экспрессируемые в эпителиоцитах шейки матки и эндометрия гены и проведена их оценка с помощью программы Ge-Norm- Plus(www.biogazelle.com). В качестве генов-нормировщиков были выбраны бета-актин (beta-actin) и пептидилпролилизомераза А (PPIA). Таблица 2 Праймеры для количественной ПЦР № Ген Прямой праймер Обратный праймер п/п T отжига, ºС 1. TLR1 CAGGCACCAGGGCGTGATGG GATGGAGGGGCCGGACTCGT 57 2. TLR2 ATCCTGCTCACGGGGGTCCTG TGCTGGGAGCTTTCCTGGGC 57 3. TLR3 ACTGATGCTCCGAAGGGTGGC TGCGTGTTTCCAGAGCCGTGC 56 4. TLR4 GGAGCCCTGCGTGGAGGTGGTT GTTGAGAAGGGGAGGTTGTCGGG 57 GA 5. TLR5 GGGTCAGTTCTGGACTTCAGAG GGCTTCAAGGCACCAGCCATCTC 58 6. TLR6 ACCCTTTAGGATAGCCACTGC GACCTGAAGCTCAGCGATGT 59 7. TLR7 GTGGGGCCAGGAGCACACAAG ACAGACGTTGGTGGCTCCCCT 57 8. TLR8 AGGCTACGGCAGCGGATCTGT GCAGGCCATCCCAGGACAGCA 65 9. TLR9 AGACCTGAGGGTGGAAGTGT TCCCCTCTCAGACAGCCTAC 61 10. TLR10 AGTGCAAGCCGTGGGGGTTT GTGGCTGGGGTCAAGTCTGCG 60 11. MyD88 CCCCCGCCTCCGCACTTTTG CCCCGTGGCCTTCTAGCCAACCT 57 12. NF-kB 2 GCACTGCCAACAGATGGCCCA CATGAGCCGCACCACGCTGA 64 13. IDO TGCTAAACATCTGCCTGATC GGAGCAATTGACTCAAATCA 61 14. COX-2 ATCTACGGTTTGCTGTGGGG TTCTGTACTGCGGGTGGAAC 57 15. HPDG TTGGTCAATAATGCTGGAGTGAA CGGGCATGAGTCCTGCTAAA 55 16. CASP-3α GTGCTATTGTGAGGCGGTTG CACGGATACACAGCCACAGG 55 17. CASP -3β TGTGAGGCGGTTGTAGAAGTT TCTGTTGCCACCTTTCGGTT 56 18. β-актин CAGGCACCAGGGCGTGATGG GATGGAGGGGCCGGACTCGT 64 19. PPIA CCGCCGAGGAAAACCGTGTACT TGGACAAGATGCCAGGACCCGT 64 Для ПЦР в режиме реального времени использовали смесь qPCRmixHSSYBR с интеркалирующим красителем SYBRI, в который входит 64 высокопроцессивная Taq-полимераза с горячим стартом, смесь нуклеотидтрифосфатов, магний и буферный раствор. Для приготовления смеси на одну пробирку вносили 2 мкл кДНК, по 2 мкл прямого и обратного праймера, 5 мкл смеси qPCRmix-HSSYBR, 14 мкл стерильной воды. Амплификацию проводили на амплификаторе CFX96 («Biorad», США). Режим амплификации: 1. Предварительная денатурация - 1 цикл 95 ºС 5 мин.;; 2. Денатурация – 1 цикл 95 ºС 30 сек.; 3. Отжиг при соответствующей каждому праймеру температуре (см. таблицу) – 30 сек.;; 4. Элонгация при 68 ºС – 30 сек. Количество циклов – 50. Дополнительным этапом после амплификации была добавлена кривая плавления (meltcurve) от 55 до 95 градусов по 6 секунд с целью детекции возможных димеров праймеров. Полученные результаты выражали в относительных единицах (relativeunits), вычисляя их по формуле R= 2((Cqref1+ Cqref2)/2 – Cqtarget) , где R – нормализованная экспрессия мРНК исследованных генов, Cqref1 и Cqref2 –Cq генов-нормировщиков, Cqtarget – Cq исследованного гена [290]. 2.2.4. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Statistica 6.0» лицензия №AXXR505C705306FAN12 (Statsoft, США). 65 Проверка нормальности распределения признаков проводилась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения выборки по данному признаку результат представляли как среднее арифметическое ± среднеквадратическое отклонение (M±σ). Для оценки достоверности различий признаков, подчиняющихся закону нормального распределения, использовали t-критерий Стьюдента для двух независимых выборок. В случае отсутствия нормального распределения выборки результат представляли как медиану (нижний квартиль;; верхний квартиль) и оценивали с помощью критерия Манна-Уитни. Для корреляционного анализа использовали критерий Спирмена. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,05. Для создания индивидуального прогноза невынашивания беременности ранних сроков использовали метод дискриминантного анализа. Весь материал собран, формализован и обработан лично автором. 66 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 3. ДИНАМИКА ОСНОВНЫХ ДЕМОГРАФИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ И ЧАСТОТА ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖЕНЩИН БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ В соответствии с первой задачей исследования были проанализированы демографические показатели, а также частота инфекционно-воспалительных заболеваний у женщин репродуктивного возраста, родильниц и новорожденных по Белгородской области. Несмотря на увеличение рождаемости и снижение смертности, в Белгородской области наблюдается естественная убыль населения (табл. 3). Таблица 3 Динамика основных демографических показателей в Белгородской области за 2010-2013 гг. № Показатели 2010 п/п 1. Рождаемость, на 1000 11,1 населения 2. Общая смертность, на 14,4 1000 населения 3. Естественный прирост, -3,5 на 1000 населения 4. Младенческая 5,2 смертность, на 1000 родившихся живыми 5. Материнская 11,9 смертность, на 100000 родившихся живыми 2011 2012 2013 11,04 11,7 11,6 14,11 14,0 13,9 -3,07 -2,3 -2,3 5,1 7,1 6,5 5,91 5,58 11,0 В связи с тем, что на показатели рождаемости прямое влияние оказыает состояние репродуктивного здоровья женщины, нами был проведен анализ гинекологической заболеваемости женщин репродуктивного возраста (табл. 4). 67 Установлено, что у пациенток старше 18 лет в структуре гинекологических осложнений первое место занимают воспалительные заболевания женских половых органов, частота которых ежегодно увеличивается. Таблица 4 Гинекологическая заболеваемость женского населения в возрасте от 18 лет и старше в Белгородской области (на 100000 женского населения соответствующего возраста) № п/п Показатели 1. Воспалительные заболевания женских тазовых органов (N70-77) 2. Осложнения беременности и родов (O00-O99) 3. Лейомиома матки (D25) 4. Эктопия шейки матки (N86) 5. Злокачественные новообразования женских половых органов (C51-58) 6. Нарушения менструального цикла (N92) 7. Эндометриоз (N80) 8. Климактерические расстройства (N95) 9. Выпадение женских половых органов (N81) 10. Доброкачественные новообразования яичников (D27) 11. Полип ш/матки (N84) 12. Женское бесплодие (N97) 13. Невоспалительные болезни вульвы и промежности (N90) 2010 2011 2012 2013 58,49 67,91 67,72 71,25 33,13 12,97 8,80 32,30 13,39 9,12 32,66 11,46 6,50 32,00 9,57 8,08 8,38 7,35 7,15 6,79 6,79 5,44 6,90 5,10 6,63 5,40 5,87 4,18 4,41 5,03 4,52 5,41 4,41 5,44 4,26 4,12 2,26 2,11 1,93 1,93 2,12 1,87 1,23 1,87 1,82 1,79 1,83 1,80 1,88 0,79 1,28 0,62 Кроме того, в Белгородской области отсутствует тенденция к снижению частоты бесплодия (табл. 4), а также как ранних, так и поздних самопроизвольных выкидышей (рис. 5, прил. 5). Так, частота выкидышей на сроке до 12 недель среди всех женщин, находившихся на учете в женской 68 консультации, имела тенденцию к росту за последние 3 годана 1,3% в год. Частота выкидышей на сроке от 12 до 21 недели также увеличивается ежегодно на 0,13%. Рис. 5. Частота самопроизвольных выкидышей (%) по Белгородской области среди женщин, состоявших на учете в женской консультации, в 2010-2013 гг. Осложнения послеродового периода, вызванные условно-патогенной флорой, в Белгородской области тенденции к снижению также не имеют (табл. 5). Таблица 5 Показатели ГСЗ родильниц и новорожденных в Белгородской области (на 1000 госпитализированных) № п/п 1. 2. 3. Показатели 2010 2011 2012 2013 Послеродовый эндометрит ГСЗ новорожденных Реализация ВУИ 2,15 2,4 2,8 3,1 1,39 14,59 1,2 16,2 2,5 13,12 4,5 20,4 69 Так, в 2010 году частота выявления послеродового эндометрита составила 2,150/00, в 2011- 2,40/00, в 2012 г. – 2,80/00 , в 2013 г. - 3,10/00. Таким образом, наблюдается увеличение частоты эндометрита у родильниц в среднем на 0,20,30/00 в год. Заболеваемость гнойно-септическими инфекциями у новорожденных (конъюнктивит, омфалит, пиодермия) за период с 2011 по 2013 год увеличилась более чем в 3 раза, а частота реализации ВУИ – в 1,5 раза. Вышесказанное явилось причиной для разработки мер профилактики и ранней диагностики инфекционно-воспалительных осложнений гестационного процесса, способствующих увеличению рождаемости и сохранению репродуктивного здоровья женщин. 70 ГЛАВА 4. МЕДИКО-СОЦИАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАЦИЕНТОК С САМОПРОИЗВОЛЬНЫМ ПРЕРЫВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ РАННИХ СРОКОВ 4.1.Социально-биологическая характеристика пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности ранних сроков С целью оценки особенностей экспрессии мРНК TLR при невынашивании беременности ранних сроков были обследованы 114 пациенток на сроке беременности 6-10 недель. Основную группу (I) составили 57 пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности (самопроизвольными выкидышами и неразвивающейся беременностью) на сроке 5-9 недель. В качестве группы контроля (II) были обследованы 57 здоровых женщин с низкой степенью инфекционного риска, которым был произведен искусственный аборт на тех же сроках беременности. Длительность госпитализации в основной группе составила 9,20±3,46 койко/дней против 2,14±0,35 койко/дней в контрольной группе (p<0,01). Согласно второй задаче исследования, был проведен анализ социальнобиологического статуса пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности и у пациенток, поступивших для проведения искусственного аборта, в качестве контрольной группы. Пациентки с невынашиванием и группа контроля были сопоставимы по возрасту и сроку гестации, на котором произошло прерывание беременности, а также морфометрическим показателям (табл. 6). Большинство пациенток в обеих группах было представлено городскими жительницами (табл. 7). Таблица 6 Характеристика пациенток с самопроизвольными выкидышами и группы контроля (M±σ) № п/п Признак Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) 6. Средний возраст, лет 27,4±4,4 7. Срок прерывания данной 7,37±1,39 беременности, нед. 8. Рост, см. 164,64±6,03 9. Вес, кг. 63,63±13,28 Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 26,4±3,9 8,22±1,36 163,23±10,51 63,69±11,24 Таблица 7 Социальная характеристика пациенток с самопроизвольными выкидышами и группы контроля, % (P±p) № п/п Признак 1. Место жительства: город село 2. Образование: высшее среднее 3. Характер работы: умственная физическая не работает 4. Материальное положение: хорошее удовлетворительное плохое 5. Брак: замужем не замужем * - p<0,05; **- p<0,01. Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 89,47±4,06 10,53±4,06 87,72±4,35 12,28±4,35 56,14±6,57* 43,86±6,57 33,33±6,24 66,67±6,24* 45,61±6,60 33,33±6,24 21,05±5,40 28,07±5,95 33,33±6,24 38,60±6,45* 21,05±5,40* 50,88±6,62 28,07±5,95 5,26±2,96 57,89±6,54 36,84±6,39 91,2±3,37** 8,77±7,35 61,40±6,45 38,60±6,45** 72 Пациенток, имевших высшее образование, в основной группе было достоверно больше, чем в контрольной. Среди пациенток, поступивших для проведения искусственного аборта, напротив, преобладали женщины со средним образованием. Доля неработавших женщин среди поступивших для проведения искусственного аборта была достоверно выше, чем среди пациенток с самопроизвольными выкидышами. Материальное положение оценили как «хорошее» 21,05±5,40% пациенток основной группы и только 5,26±2,96% пациенток контрольной группы (p<0,05). Подавляющее большинство женщин основной группы состояли в браке, чем достоверно отличались от пациенток из группы контроля, где каждая третья женщина в браке не состояла. Особенности социального статуса в основном характеризуют пациенток группы контроля, обратившихся для проведения искусственного аборта. Достоверных различий по морфометрическим показателям выявлено не было. Известно, что при наличии привычного невынашивания в анамнезе вероятность самопроизвольного выкидыша возрастает, а роды являются прогностически благоприятным фактором. Поэтому был проанализирован акушерско-гинекологический анамнез у пациенток обеих групп. Характеристики менструального цикла у пациенток с самопроизвольными выкидышами и неразвивающейся беременностью не отличались от группы контроля (табл. 8). Было установлено, что пациентки с самопроизвольным прерыванием беременности отличались достоверно более поздним началом половой жизни (табл. 9), что также в большей степени характеризует не основную, а контрольную группу. Общее количество беременностей в основной группе и группе контроля достоверно не отличалось. 73 Таблица 8 Особенности менструальной функции у женщин с самопроизвольным прерыванием беременности и в контроле № п/п 1. 2. 3. Признак Самопроизвольное Искусственный прерывание аборт (контрольная беременности группа, n=57) (n=57) Средний возраст менархе, 13,00±1,53 12,68±1,05 лет Нерегулярный цикл, % 1,75±1,75 Болезненность 10,53 ±4,06 14,04 ±4,60 менструаций, % 4. Длительность цикла, дней 29,99±9,3 28,03 ±1,38 5. Длительность менструации, дней 4,54±0,56 4,89±0,65 Таблица 9 Акушерско-гинекологический анамнез у женщин основной и контрольной группы (M±σ) № п/п 1. 2. 3. Признак Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) Средний возраст начала 18,1±1,4* половой жизни, лет Количество половых 2,12±1,13 партнеров, чел. Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 17,5±1,4 2,92 ±1,89 2,78±1,93 3,07±1,66 4. Количество беременностей Количество родов 0,81±1,02 1,22±0,78** 5. Количество абортов 1,12±1,35 1,80±1,24** 6. Количество выкидышей и неразвивающихся беременностей * - p<0,05; ** - p<0,01. 0,81±0,58** 0,03±0,19 74 Однако у пациенток основной группы в анамнезе было отмечено в 1,5 раза меньше родов и абортов по сравнению сконтрольной. Количество самопроизвольных выкидышей в анамнезе у пациенток основной группы, напротив, было значительно выше, чем в контроле. Привычное невынашивание наблюдалось у 66,67±6,24% пациенток основной группы и ни у одной пациентки из группы контроля (p<0,01). Был проведен корреляционный анализ взаимосвязи частоты невынашивания беременности с особенностями анамнеза в общей выборке (табл. 10). Установлено, что достоверная умеренная отрицательная корреляционная связь наблюдалась между частотой выкидышей и абортов (R=0,35; p=0,0001). Так, предшествующие аборты наблюдались в контрольной группе – в 19,3±5,23% случаев, а в основной – только в 3,51±2,44 % случаев. Также отмечалась умеренная отрицательная корреляционная связь между невынашиванием беременности в анамнезе и наличием законного брака (R=0,31; p=0,002). Таким образом, полученные данные подтверждают тот факт, что самопроизвольные выкидыши в анамнезе являлись прогностически неблагоприятным фактором невынашивания беременности. У пациенток основной и контрольной группы в анамнезе был выявлен ряд гинекологических заболеваний, однако различия между обеими группами по отдельным нозологическим формам были недостоверными (табл. 11). Тем не менее, доля пациенток контрольной группы, у которых в анамнезе не было гинекологических заболеваний, была достоверно выше, чем в основной группе. 75 Таблица 10 Корреляция между частотойневынашивания беременности с особенностями анамнеза (n=114), бисериальная корреляция № Наименование п/п Критерий t p Спирмена 1. Невынашивание в анамнезе/ возраст 0,14 1,52 0,13 2. Невынашивание в анамнезе / общее количество беременностей 0,07 0,76 0,45 3. Невынашивание в анамнезе / количество родов -0,13 -1,4 -0,16 4. Невынашивание в анамнезе / количество абортов -0,35 -4,04 0,0001 5. Невынашивание в анамнезе / возраст менархе 0,07 0,76 0,45 6. Невынашивание в анамнезе / регулярность цикла 0,11 1,17 0,24 7. Невынашивание в анамнезе / длительность менструации 0,03 0,28 0,78 8. Невынашивание в анамнезе / длительность менструального цикла 0,11 1,17 0,24 9. Невынашивание в анамнезе / начало половой жизни 0,01 1,00 0,31 10. Невынашивание в анамнезе / число половых партнеров -0,07 -0,77 0,44 11. Невынашивание в анамнезе / семейное положение (брак) -0,31 -3,13 0,002 76 Таблица 11 Репродуктивный анамнез у пациенток с самопроизвольными выкидышами и в контроле, % (P±p) № Признак п/п Самопроизвольное Искусственный прерывание аборт беременности (контрольная (n=57) группа, n=57) 1. Сальпингооофорит 36,84±6,39 28,07±5,95 2. Миома матки 5,26±2,96 - 3. Эндометриоз 7,02±3,38 - 4. Псевдоэрозия шейки матки 3,51±2,44 7,02±3,38 5. Хронический эндометрит 3,51±2,44 1,75±1,74 6. Апоплексия яичника - 1,75±1,74 7. Бесплодие 1,75±1,74 1,75±1,74 8. Бартолинит - 3,51±2,44 28,07±5,95 26,35±5,83 8,77±3,75 10,53±4,06 3,51±2,44 1,75±1,74 3,51±2,44 14,04±4,06 5,26±2,96 1,75±1,74 1,75±1,74 1,75±1,74 9. ИППП в анамнезе, в том числе: хламидийная инфекция уреаплазменная инфекция микоплазменная инфекция гонорея трихомониаз вирус папилломы человека *- p<0,05. Корреляционный анализ невынашивания беременности и ИППП в анамнезе показал (табл. 12), что положительная слабая корреляционная связь присутствала только между невынашиванием беременности в анамнезе и наличием уреаплазменной инфекции (R= 0,21; p=0,03). Наличие других ИППП достоверно не коррелировало с самопроизвольными выкидышами в анамнезе. 77 Таблица 12 Корреляция между частотойневынашивания беременности и наличием ИППП (n=114), бисериальная корреляция № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. Наименование Критерий Спирмена t р Невынашивание в анамнезе/ хламидийная инфекция Невынашивание в анамнезе/ уреаплазменная инфекция Невынашивание в анамнезе/ микоплазменная инфекция Невынашивание в анамнезе/ гонорея Невынашивание в анамнезе/ трихомониаз -0,12 -1,27 0,21 0,21 2,21 0,03 0,11 1,18 0,24 -0,07 -0,76 0,44 -0,07 -0,76 0,44 Невынашивание в анамнезе/ вирус папилломы человека -0,07 -0,76 0,44 Были также проанализированы особенности экстрагенитальных заболеваний у женщин обеих групп (табл. 13). По большинству нозологических форм достоверных различий между пациентками с невынашиванием и группой контроля выявлено не было. Однако обращал на себя внимание тот факт, что у пациенток с самопроизвольными выкидышами достоверно чаще наблюдались аллергические реакции на медицинские препараты. При поступлении у пациенток основной группы в 36,84±6,39% случаев наблюдались кровянистые выделения из половых путей в объеме 125,0±23,4 мл., в 29,82±6,06% - боли внизу живота, 28,07±5,95% - слабость, в 15,79±4,83% - субфебрильная температура. У пациенток контрольной группы в 5,26±2,96% случаев наблюдалась субфебрильная температура. Других симптомов у пациенток с прогрессирующей беременностью раннего срока не отмечалось. 78 По данным эхографического исследования было выявлено, что в основной группе неразвивающаяся беременность наблюдалась в 57,89±6,54% случаев, анэмбриония – в 14,04±4,60%, аборт в ходу – в 28,07±5,95% случаев. По данным эхографического исследования у пациенток контрольной группы, которым впоследствии был произведен искусственный аборт, наблюдалась прогрессирующая беременность, соответствующая гестационному сроку. Таблица 13 Наличие экстрагенитальных заболеваний у пациенток обеих групп, % (P±p) № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Признак Самопроизвольное Искусственный прерывание аборт беременности (контрольная (n=57) группа, n=57) Хронический бронхит 3,51±2,44 5,26±2,96 Заболевания ЛОР-органов 5,26±2,96 - Хронический пиелонфрит 7,02±3,38 5,26±2,96 Заболевания ЖКТ 5,26±2,96 - - 5,26±2,96 Эндокринная патология 3,51±2,44 - Вирусный гепатит С 1,75±1,74 1,75±1,74 Вирусный гепатит А в анамнезе 1,75±1,74 1,75±1,74 Варикозная болезнь нижних конченостей 1,75±1,74 - Остеохондроз 1,75±1,74 - 15,79±4,83* 1,75±1,74 70,18±6,06 75,44±5,70 Нейро-циркуляторная дистония Аллергические реакции Отсутствие экстрагенитальных заболеваний * - p<0,05 79 В общем анализе крови у женщин основной группы отмечался достоверно более низкий уровень гемоглобина, а также эритроцитов по сравнению с контролем (табл. 14). Таблица 14 Особенности общего анализа крови у пациенток с самопроизвольными выкидышами и в контроле (M±σ) Признак Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) 4,13±0,06* Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 4,33±0,05 124,61±1,72** 131,19±1,72 7,05±2,01 7,33±1,61 2,65±1,61 3,56±4,57 57,87±8,76 63,22±9,19 32,34±13,57 29,75±19,78 моноциты, % 7,74±2,40 6,62±2,02 эозинофилы, % 1,20±0,76 1,13±1,06 231,57±49,65 246,00±55,82 Эритроциты, 1012/л Hb, г/л Лейкоциты, 109/л Палочкоядерные нейтрофилы (п/я), % Сегментоядерные нейтрофилы (с/я), % лимфоциты, % Тромбоциты, 109/л *- p<0,05; ** - p<0,01 Количество лейкоцитов и тромбоцитов, а также состав лейкоформулы у пациенток обеих групп достоверно не отличались. Не было выявлено достоверных различий в биохимическом анализе крови, общем анализе мочи у пациенток с самопроизвольными выкидышами и в контроле. Так как одной из причин невынашивания беременности являются тромбофилические состояния, были проанализированы данные коагулограммы 80 у пациенток обеих групп (табл. 15). Было установлено, что у пациенток с самопроизвольными выкидышами протромбиновый индекс был достоверно выше, чем в контроле (99,97±1,46% против90,45±1,12% соответственно) (p<0,05). Таблица 15 Показатели коагуляционного звена гемостаза у пациенток с самопроизвольными выкидышами и в контроле (M±σ) № Признак п/п Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 2,82±0,61 2,93±0,99 1. Фибриноген, г/л 2. ПТИ, % 99,97±1,46* 90,45±1,12 3. АЧТВ, сек 36,88±4,37 35,38±3,66 4. ТВ, сек 16,15±1,07 15,85±1,15 5. МНО, у.е. 0,99±0,12 1,05±0,12 *- p<0,05 По данным гистологического исследования, признаки воспаления в эндометрии и трофобласте были выявлены у пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности в 59,65±6,50% случаев, в то время как в контрольной группе – только в 19,30±5,23% (p<0,01)(табл. 16). Дистрофические изменения в децидуальной ткани у женщин с невынашиванием наблюдались в 10 раз чаще, чем в группе контроля. Кроме того, в основной группе наблюдался тромбоз сосудов и очаги некроза в децидуальной ткани, а также гиалиноз сосудов децидуальной ткани. Для пациенток с прогрессирующей беременностью раннего срока в большинстве случаев было характерно отсутствие патологических изменений в эндометрии и хорионе. 81 Таблица 16 Результаты гистологического исследования у пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности и в контроле, % (P±p) № п/п Гистологическое заключение 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Серозный децидуит Гнойный децидуит Гнойно-некротический хориодецидуит Дистрофические изменения в децидуальной ткани Тромбоз сосудов в децидуальной ткани Гиалиноз сосудов децидуальной ткани Частичный пузырный занос Нормальное гистологическое строение децидуальной оболочки, плодного яйца Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) 28,07±5,95* 21,05±5,40* 10,53±4,05 Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 3,51±2,44 7,02±3,38 8,77±3,75 17,54±5,04* 1,75±1,74 3,51±2,44 - 3,51±2,44 - 1,75±1,74 - 14,04±4,60 78,95±5,40** Таким образом, для пациенток с невынашиванием беременности было характерно наличие аллергических заболеваний, что может рассматриваться как тенденция развития избыточного иммунного ответа на антигены. Более чем в половине случаев у них наблюдались признаки децидуита и хориодецидуита при гистологическом исследовании. Это подтверждает, что воспалительный генез невынашивания беременности на ранних сроках беременности является ведущим. 82 4.2. Характеристика микробиоценоза женских половых путей у пациенток с невынашиванием беременности ранних сроков Так как одной из наиболее частых причин самопроизвольного прерывания беременности ранних сроков являются инфекционно- воспалительные процессы, был проведен анализ особенностей микробиоценоза женских половых путей у пациенток с невынашиванием беременности ранних сроков. По данным бактериоскопического исследования не было выявлено достоверных различий числа лейкоцитов и эпителиоцитов в поле зрения, а также частоты обнаружения грибов рода Candida и «ключевых клеток» у пациенток обеих групп (табл. 17). Таблица 17 Особенности бактериоскопического исследования у пациенток с невынашиванием беременности и в контроле Признак Лейкоциты, в п/зрения Эпителий, в п/зрения Флора, % Палочковая Смешанная Кокковая Грибы рода Candida, % “Ключевые клетки”, % Трихомонады, % Гонококки, % - p<0,05 Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) 15,7 (6,0; 22,5) 5,6±5,7 Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 11,15 (6,5; 15,0) 6,3±4,4 57,89±6,54 7,02±3,38 35,09±6,32* 68,42±6,16 22,81±5,56* 8,77±3,75 17,54±5,04 8,77±3,75 1,75±1,75 14,04±4,60 10,53±4,06 1,75±1,75 - 83 Палочковая флора также с одинаковой частотой встречалась в основной и контрольной группе. Однако кокковая флора в 4 раза чаще выявлялась у пациенток с самопроизвольными выкидышами по сравнению с контролем, в то время как в группе контроля достоверно чаще встречалась смешанная флора. Не было выявлено достоверных различий в частоте обнаружения возбудителей ИППП и представителей условно-патогенной флоры (табл. 18, 19). Таким образом, основным различием между пациентками с невынашиванием беременности ранних сроков и группой контроля было только увеличение доли кокковой флоры при бактериоскопическом исследовании в основной группе. Таблица 18 Результаты бактериологического исследования у пациенток с невынашивание беременности и в контроле, % (P±p) № Наименование п/п Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 1. Enterococcus 12,28±4,35 8,77±3,75 2. Staphylococcus epidermidis 21,05±5,40 24,56±5,70 3. Staphylococcus aureus 8,77±3,75 12,28±4,35 4. Corynebacterium 10,53±4,06 7,02±3,38 5. Escherishia coli 7,02±3,38 5,26±2,96 6. Proteus vulgaris - 1,75±1,75 7. Streptococcus hemolyticus 1,75±1,75 - 84 Таблица 19 Частота выявления ИППП у пациенток с невынашивание беременности и в контроле, % (P±p) № п/п Признак Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 1. Хламидийная инфекция 17,54±5,04 14,04±4,60 2. Микоплазменная 14,04±4,60 8,77±3,75 8,77±3,75 10,53±4,06 1,75±1,74 1,75±1,74 3,50±2,44 1,75±1,74 - 1,75±1,75 инфекция 3. Уреаплазменная инфекция 4. Вирус простого герпеса II типа 5. Вирус папилломы человека 6. Трихомониаз При бактериологическом исследовании и ПЦР достоверных отличий между обеими группами выявлено не было. Можно предположить, что основным механизмом развития воспалительного процесса при невынашивании беременности является не столько количество возбудителя, сколько избыточный иммунный ответ на его антигены. Поэтому следующей задачей исследования стала оценка роли системы врожденного (неспецифического) иммунитета в индукции воспалительного ответа. 85 4.3. Сигнальные рецепторы врожденного иммунитета и их роль в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков В соответствии с четвертой задачей исследования было проведено исследование состояния системы врожденного иммунитета у пациенток с невынашиванием беременности. Так как основными рецепторами клеток врожденного иммунитета (макрофагов, нейтрофилов, дендритных клеток, эпителиоцитов, натуральных киллеров), распознающими лиганды бактерий, грибов, вирусов и простейших, являются TLR, был проведен анализ их экспрессии и влияния на синтез простагландинов и ферментов апоптоза у пациенток с самопроизвольными выкидышами и в контроле. Было выявлено, что у пациенток с самопроизвольными выкидышами отмечалась в 50 раз более высокая по сравнению с контролем экспрессия мРНК TLR1 и в 11 раз более высокая - TLR2. Лигандами этих TLR являются липопептиды грамположительных бактерий и зимозан (табл. 20). Это сопровождалось увеличением более чем в 200 раз экспрессии в основной группе TLR10, лиганд для которого неизвестен, однако предположительно является структурой бактериальной природы. У пациенток с невынашиванием беременности наблюдалось также увеличение в 7 раз экспрессии мРНК TLR4, лигандом которого являются липополисахариды грамположительных бактерий. Однако экспрессия TLR5, активируемого флагеллином, достоверно не изменялась. Достоверных различий экспрессии мРНК TLR6 у пациенток обеих групп также не наблюдалось. Одновременно была проанализирована экспрессия TLR, лигандами которых являются нуклеиновые кислоты – TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9. 86 Было установлено, что экспрессия TLR7, TLR8 и TLR9, лигандами которых является одноцепочечная РНК, достоверно не изменялась. Экспрессия TLR3, лигандом которого является двухцепочечная вирусная РНК, не имела достоверных различий между пациентками из группы невынашивания и в контроле. Был проведен корреляционный анализ экспрессии мРНК различных TLR в общей выборке (n=104) (табл. 21). Отмечалась достоверная сильная корреляционная связь между уровнем экспрессии мРНК TLR1 и TLR2 (R=0,76;; p=0,000028). Также наблюдалась умеренная достоверная корреляция между экспрессией мРНК TLR1 и TLR10 (R=0,51;; p=0,009) и TLR2 и TLR10 (R=0,45; p=0,0003). Среди рецепторов, лигандами которых являются бактериальные структуры, была выявлена умеренная взаимосвязь между экспрессией мРНК TLR1 и TLR4 (R=0,39;; p=0,049). Экспрессия мРНК TLR5, лигандом которого является флагеллин, не имела достоверной корреляции ни с одним из TLR. Наблюдалась достоверная умеренная корреляционная связь экспрессии мРНК TLR6, с TLR2 (R=0,47;; p=0,008) и TLR5 (R=0,37; p=0,033). Высокодостоверная корреляционная связь экспрессии TLR6 с TLR2 объясняется способностью этих рецепторов образовывать гетеродимерный комплекс для распознавания триацетилированных липопептидов [240]. Также наблюдалась высокодостоверная корреляционная связь между экспрессией мРНК TLR6 и рецепторов, активируемых нуклеиновыми кислотами. Так, сильная достоверная связь прослеживалась между экспрессией TLR6 и TLR9 (R=0,82;; p=0,04), а слабая достоверная – между TLR6 и TLR7 (R=0,34; p=0,04). 87 Таблица 20 Экспрессия TLR и IDO в эпителии цервикального канала у пациенток с самопроизвольными выкидышами и в контроле, отн. ед. [Me (25%;75%)] № Наименование п/п Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 1. TLR1 0,00051 (0,000005; 0,00130)** 0,00001 (0,000001; 0,000005) 2. TLR2 0,00266 (0,00061; 0,00923)** 0,00024 (0,00005; 0,00123) 3. TLR3 0,2483 (0,0828; 0,7196) 0,1472 (0,0502; 0,3763) 4. TLR4 0,000021(0,000002; 0,000078)* 0,000003(0,000001; 0,000046) 5. TLR5 0,000001 (0,000001; 0,000028) 0,000003 (0,000001; 0,000054) 6. TLR6 0,002 (0,00004; 0,0016) 0,0002 (0,00004; 0,0011) 7. TLR7 0,15526 (0,01845; 0,50609) 0,15941 (0,06403; 0,46009) 8. TLR8 0,0002 (0,00006; 0,0200) 0,0041(0,00009; 0,5141) 9. TLR9 0,0254 (0,0115; 0,0775) 0,0078 (0,0013; 0,1335) 10. TLR10 0,0420 (0,0040; 0,1125)** 0,0020 (0,0008; 0,0168) 11. IDO 33,61 (0,69; 314,08)** 11,47 (0,39; 1230,47) *- p<0,05; ** - p<0,01 88 Таблица 21 Корреляционный анализ экспрессии TLR в эндоцервиксе в общей выборке (n=114), критерий Спирмена TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 TLR1 - 0,76** 0,27 0,39* 0,004 0,31 0,23 0,51 0,82* 0,51** TLR2 0,76** - 0,35** 0,24 0,08 0,47** 0,23 -0,03 0,27 0,45** TLR3 0,27 0,35** - 0,07 0,07 0,28 0,17 -0,09 0,09 0,45** TLR4 0,39* 0,24 0,07 - 0,16 0,18 0,17 0,09 0,25 0,26 TLR5 0,004 0,08 0,07 0,16 - 0,37* 0,09 -0,12 0,41 0,10 TLR6 0,23 0,47** 0,28 0,18 0,37* - 0,34* -0,03 0,63** 0,17 TLR7 0,23 0,23 0,17 0,17 0,09 0,34* - 0,07 0,33 0,32** TLR8 0,74* -0,15 0,35 0,18 -0,16 -0,38 0,21 - -0,50 0,30 TLR9 0,82* 0,27 0,09 0,25 0,41 0,63** 0,33 0,16 - 0,17 TLR10 0,51** 0,45** 0,45** 0,26 0,10 0,17 0,32** 0,16 0,17 - * - p<0,05; ** - p<0,01 89 Экспрессия мРНК TLR1 коррелировала с TLR8 (R=0,74; p=0,04). Наблюдалась также сильная корреляционная зависимость между экспрессией TLR2 и TLR9 (R=0,63; p=0,04). Среди рецепторов, лигандами которых являются нуклеиновые кислоты, отмечалась высокодостоверная умеренная положительная корреляция экспрессии мРНК TLR3 и TLR2 (R=0,35;; p=0,006) и TLR3 и TLR10 (R=0,43; p=0,0001). Наблюдалась достоверная умеренная корреляционная связь TLR7, лигандом которого является одноцепочечная РНК, с TLR10 (R=0,32; p=0,006). Не было выявлено достоверной корреляции других TLR с TLR8. Также был проведен анализ корреляции экспрессии мРНК TLR в эндоцервиксе у женщин с самопроизвольными выкидышами и в контрольной группе (табл. 22). У пациенток с самопроизвольными выкидышами отсутствовала корреляция между экспрессией мРНК TLR1 и TLR2. Однако наблюдалась достоверная положительная умеренная корреляция между уровнем TLR2 и TLR6 (R=0,49; p=0,04). Экспрессия TLR2 также коррелировала с TLR3 (R=0,45; p=0,01). Кроме того, наблюдалась достоверная умеренная положительная корреляция между уровнем экспрессии мРНК TLR10 и TLR4 (R=0,31; p=0,04), а также TLR10 и TLR3 (R=0,38; p=0,01), TLR10 и TLR7 (R=0,34; p=0,03). Не было выявлено корреляционных взаимодействий с другими рецепторами у TLR1, TLR5, TLR8 и TLR9. У пациенток группы контроля было выявлено больше корреляционных связей между экспрессией TLR (табл. 23). 90 Таблица 22 Корреляционный анализ экспрессии TLR в эндоцервиксе у пациенток с самопроизвольными выкидышами (n=57), критерий Спирмена TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 TLR1 - 0,18 0,10 0,45 0,055 -0,07 0,32 -0,10 0,11 0,35 TLR2 0,18 - 0,45* 0,26 0,32 0,49* 0,01 -0,20 0,006 0,32 TLR3 0,10 0,45* - 0,18 0,30 0,27 0,24 -0,33 -0,20 0,38* TLR4 0,45 0,26 0,18 - 0,21 0,08 0,22 0,20 0,13 0,31* TLR5 0,055 0,08 0,07 0,21 - 0,29 0,24 -0,28 0,28 0,19 TLR6 -0,07 0,49* 0,27 0,08 0,29 - 0,17 -0,33 0,34 0,19 TLR7 0,32 0,23 0,17 0,22 0,24 0,17 - -0,21 0,05 0,34* TLR8 -0,10 -0,03 -0,09 0,20 -0,28 -0,33 -0,21 - 0,70 0,20 TLR9 0,11 0,006 -0,20 0,13 0,28 0,34 0,05 0,70 - 0,10 TLR10 0,35 0,32 0,38* 0,31* 0,19 0,19 0,34* 0,20 0,10 - * - p<0,05; ** - p<0,01 91 Таблица 23 Корреляционный анализ экспрессии TLR в эндоцервиксе у пациенток группы контроля (искусственныйаборт) (n=57), критерий Спирмена TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 TLR1 - 0,66* 0,41 0,58* 0,24 0,70* 0,38 0,74* 0,11 0,29 TLR2 0,66* - 0,31 -0,08 0,16 0,52 0,62** -0,15 0,63* 0,40* TLR3 0,41 0,31 - -0,27 -0,24 0,31 0,17 0,16 0,21 0,60** TLR4 0,58* -0,08 -0,27 - 0,09 0,32 0,08 0,30 0,58 -0,05 TLR5 0,24 0,16 -0,24 0,09 - 0,51 -0,04 -0,02 0,48 -0,02 TLR6 0,70* 0,52 0,31 0,32 0,51 - 0,59* 0,38 0,64 0,16 TLR7 0,38 0,62** 0,22 0,08 -0,04 0,59* - 0,32 0,40 0,42* TLR8 0,73* -0,15 0,20 0,30 -0,02 0,38 0,32 - -0,50 0,20 TLR9 0,11 0,63* 0,21 0,58 0,48 0,64 0,40 -0,50 - 0,18 TLR10 0,29 0,32 0,60* -0,05 -0,02 0,16 0,42* 0,20 0,18 - * - p<0,05; ** - p<0,01 92 Так, отмечалась сильная положительная достоверная корреляционная связь между экспрессией мРНК рецепторов, распознающих бактериальные лиганды - TLR1 и TLR2 (R=0,66; p=0,02), TLR1 и TLR4 (R=0,58; p=0,04). Кроме того, экспрессия мРНК TLR7 имела высокодостоверную высокую корреляционную связь с TLR2 (R=0,62;; p=0,00043) и умеренную достоверную корреляционную связь с TLR10 (R=0,42;; p=0,02). Кроме того, наблюдалась высокая корреляционная зависимость между экспрессией мРНК TLR10 и еще одним рецептором, лигандом которого являются нуклеиновые кислоты – TLR3 (R=0,60;; p=0,0005). Экспрессия TLR6 имела достоверную сильную корреляционную связь с TLR1 (R=0,70;; p=0,04) и умеренную – с TLR7 (R=0,59; p=0,27). Была проанализирована взаимосвязь экспрессии мРНК TLR с данными акушерско-гинекологического анамнеза (табл. 24). По данным корреляционного анализа, наблюдалась обратная умеренная достоверная корреляционная связь между экспрессией TLR2 и TLR10 с количеством абортов в анамнезе (R=-0,33;; p=0,009 и R=-0,37; p=0,001 соответственно). Отмечалась слабая отрицательная достоверная корреляционная связь между числом половых партнеров и экспрессией TLR4 (R=0,26;; p=0,03), достоверная положительная корреляционная связь между количеством неразвивающихся беременностей в анамнезе и экспрессией TLR1 (R=0,52; p=0,007), TLR2 (R=0,41;; p=0,001) и TLR10 (R=0,39; p=0,0006), лигандами которых являются бактериальные структуры. Экспрессия мРНК TLR6 имела умеренную достоверную корреляционную связь с количеством выкидышей в анамнезе (R=0,33;; p=0,043). Также наблюдалась положительная корреляция между данным признаком и экспрессией TLR7 (лиганд – одноцепочечная РНК) (R=0,30; p=0,011). 93 Таблица 24 Корреляционный анализ экспрессии TLR и данных анамнеза (n=114), критерий Спирмена Признак TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Количество беременностей 0,22 0,02 0,11 0,04 0,12 0,15 0,18 -0,29 -0,04 0,05 Количество родов 0,29 0,06 0,04 0,03 0,16 0,14 0,15 -0,35 0,12 0,04 Количество абортов -0,33 -0,34** -0,16 -0,04 0,06 0,04 -0,008 -0,21 -0,27 -0,37** Количество выкидышей 0,06 0,01 0,16 0,14 0,04 0,33* -0,31** -0,15 0,26 0,21 0,52** 0,41** 0,23 0,11 0,03 -0,03 0,30* 0,10 0,10 0,40** 0,19 -0,05 0,19 0,07 -0,11 0,08 0,04 0,13 0,08 -0,12 0,13 -0,26* -0,01 0,11 -0,14 0,0005 -0,26 -0,16 Количество неразвивающихся беременностей Начало половой -0,08 жизни Число половых -0,13 партнеров * - p<0,05; ** - p<0,01 94 Не было выявлено зависимости экспрессии TLR от возраста женщины и особенностей менструальной функции – возраста менархе, длительности менструального цикла и продолжительности менструации. Отмечалась достоверная отрицательная корреляционная обратная связь уровня экспрессии TLR1 и TLR2 в общей выборке в зависимости от срока беременности (R=-0,51;; p=0,009 и R=-0,29;; p=0,026 соответственно) (табл. 25). В основной и контрольной группах по отдельности корреляционной зависимости между сроком прерывания беременности и уровнем экспрессии TLR выявлено не было. Таблица 25 Зависимость экспрессии TLR от срока прерывания беременности, критерий Спирмена В общей выборке Основная группа Контрольная группа (n=114) (n=57) (n=57) R р R р R р TLR1 -0,51 0,009 -0,14 0,63 0,10 0,75 TLR2 -0,29 0,026 -0,04 0,78 0,10 0,62 TLR3 0,16 0,17 0,03 0,82 0,19 0,32 TLR4 -0,08 0,51 0,16 0,27 0,28 0,15 TLR5 0,11 0,40 0,11 0,50 -0,13 0,54 TLR6 -0,02 0,91 -0,09 0,67 -0,01 0,96 TLR7 0,002 0,98 -0,16 0,30 -0,16 0,40 TLR8 -0,16 0,38 -0,28 0,38 0,12 0,61 TLR9 -0,04 0,86 -0,0009 0,97 0,23 0,48 TLR10 -0,07 О,53 -0,11 0,44 0,04 0,82 * - p<0,05; ** - p<0,01 95 Вес пациенток в основной и контрольной группах умеренно коррелировал с уровнем экспрессии TLR3 (R=0,38;; p=0,01 и R=0,38; p=0,046 сответственно), а контроле – также с TLR2 (R=0,47;; p=0,014) и TLR7 (R=0,46; p=0,015) (табл. 26). Таблица 26 Зависимость экспрессии TLR от веса пациентки, критерий Спирмена В общей выборке Основная группа Контрольная группа (n=114) (n=57) (n=57) R р R р R р TLR1 0,05 0,80 -0,06 0,83 0,06 0,83 TLR2 -0,02 0,87 0,03 0,87 0,47 0,014 TLR3 0,21 0,08 0,38 0,01 0,38 0,046 TLR4 0,11 0,35 0,03 0,82 0,04 0,86 TLR5 -0,004 0,97 0,12 0,45 0,09 0,64 TLR6 0,18 0,27 -0,03 0,87 0,52 0,06 TLR7 0,10 0,39 -0,01 0,90 0,46 0,015 TLR8 -0,12 0,50 -0,10 0,75 -0,02 -0,91 TLR9 0,13 0,54 -0,05 0,88 0,30 0,39 TLR10 0,14 О,22 -0,03 0,81 0,28 0,15 * - p<0,05; ** - p<0,01 Рост пациентки в общей выборке также имел слабую достоверную корреляцию с уровнем TLR7 (R=0,25;; p=0,03), а в контрольной группе – умеренную достоверную корреляцию с TLR8 (R=0,52;; p=0,01) (табл. 27). 96 Таблица 27 Зависимость экспрессии TLR от роста пациентки, критерий Спирмена В общей выборке Основная группа Контрольная группа R р R р R р TLR1 0,05 0,79 -0,24 0,81 0,34 0,27 TLR2 0,07 0,55 0,07 0,30 0,011 0,95 TLR3 0,21 0,07 0,20 0,19 0,23 0,23 TLR4 0,002 0,98 0,28 0,06 0,26 0,18 TLR5 -0,03 0,81 0,14 0,33 -0,02 0,9 TLR6 0,09 0,52 -0,04 0,84 0,35 0,23 TLR7 0,25 0,03 0,13 0,40 0,36 0,06 TLR8 -0,16 0,37 -0,30 0,36 0,52 0,01 TLR9 0,09 0,69 -0,42 0,15 0,31 0,38 TLR10 0,11 О,32 0,07 0,66 0,07 0,71 * - p<0,05; ** - p<0,01 В общем анализе крови экспрессия TLR закономерно коррелировала с показателями лейкоформулы (табл. 28). Была выявлена сильная отрицательная обратная связь между общим количеством лейкоцитов и уровнем экспрессии мРНК TLR1 (R=-0,66; p=0,002). Экспрессия TLR6 коррелировала с количеством палочкоядерных нейтрофилов (R=0,49;; p=0,023). Обратная закономерность наблюдалась для палочкоядерных нейтрофилов с TLR3 и TLR8 (R=-0,052;; p=0,001 и R=-0,54; p=0,02 соответственно). Количество сегментоядерных нейтрофилов имело умеренную обратную корреляционную взаимосвязь с TLR2 (R=-0,36; p=0,04). 97 Таблица 28 Корреляция экспрессии мРНК TLR и показателей общего анализа крови (n=114), критерий Спирмена Признак TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Эритроциты, 109/л. -0,24 0,007 -0,05 0,11 0,008 -0,22 -0,06 -0,13 -0,01 -0,08 Гемоглобин, г/л -0,23 0,08 -0,01 0,08 0,007 -0,04 0,09 0,04 0,28 0,09 Лейкоциты, 106/л -0,66** -0,22 0,15 -0,07 -0,03 0,17 -0,03 0,18 0,18 -0,06 п/я, % -0,07 -0,12 -0,52** -0,14 0,17 0,49* 0,017 -0,54* 0,11 -0,19 с/я, % -0,19 -0,36* 0,19 -0,05 -0,05 0,06 -0,17 0,21 -0,32 -0,16 лимфоциты,% 0,02 0,004 0,001 -0,17 -0,29 -0,29 0,11 0,26 0,11 -0,11 моноциты,% 0,29 0,27 0,04 -0,03 0,03 -0,13 0,17 -0,31 0,56 0,43** эозинофилы,% 0,14 -0,04 0,02 0,18 0,06 -0,32 0,08 0,20 -0,03 0,089 Тромбоциты, 109/л -0,28 -0,34 0,14 -0,26 -0,008 0,19 0,15 -0,04 -0,24 0,08 * - p<0,05; ** - p<0,01 98 Уровень TLR10 коррелировал с количеством моноцитов в периферической крови (R=0,43; p=0,005). Отсутствие корреляции с уровнем экспрессии TLR количества эритроцитов и тромбоцитов, а также уровня гемоглобина можно считать закономерным. Не было выявлено корреляционной взаимосвязи между экспрессией мРНК TLR и показателями коагулограммы. Также были изучены особенности экспрессии мРНК TLR в эндометрии и проведен корреляционный анализ с их экспрессией в цервикальном канале. Было установлено, что в эндометрии, в отличие от шейки матки, наблюдается снижение экспрессии ряда TLR (табл. 29). Так, экспрессия мРНК TLR4 в эндометрии (TLR4E) у пациенток с самопроизвольными выкидышами была достоверно ниже, чем в группе контроля (0,17 (0,06;; 0,36) против 0,26 (0,12;; 0,51) соответственно, p<0,05). Это сопровождалось снижением уровня экспрессии в эндометрии другого TLR, активируемого бактериальными лигандами – TLR6 (TLR6E). В основной группе экспрессия составила 0,044 (0,006;; 0,129) против5,063 (0,105;; 9,747) в контроле (p<0,01). Также отмечались различия в экспрессии в эндометрии TLR, активируемых вирусными лигандами. Экспрессия в эндометрии TLR3 (TLR3E), активируемого двухцепочечной РНК, была достоверно выше, чем в группе контроля (105,42 (55,52;; 297,14) против 63,78 (32,22;; 144,01) соответственно, p<0,01). Экспрессия TLR8 в эндометрии (TLR8E), активируемого одноцепочечной РНК вирусов, напротив, была ниже (0,2862 (0,1451; 0,7579)), чем в группе контроля (0,5230 (0,2793; 1,0353)) (p<0,05). 99 Таблица 29 Экспрессия TLR в эндометрии, отн. ед. [Me(25%;75%)] № п/п Наименование Основная группа (n=57) Контрольная группа (n=57) 1. TLR1E 7,16 (1,57; 27,66) 4,41 (1,97; 2,48) 2. TLR2E 0,72 (0,35; 1,46) 0,54 (0,32; 1,15) 3. TLR3E 105,42 (55,52; 297,14)** 63,78 (32,22; 144,01) 4. TLR4E 0,17 (0,06; 0,36)* 0,26 (0,12; 0,51) 5. TLR5E 0,0002 (0,00008; 0,0004) 6. TLR6E 0,044 (0,006; 0,129)** 0,0002 (0,0001; 0,0007) 5,063 (0,105; 9,747) 7. TLR7E 131,14 (66,72; 224,41) 153,27(106,52;261,37) 8. TLR8E 0,2862 (0,1451; 0,7579)* 9. TLR9E 0,0434 (0,0073; 0,3322) 10. TLR10E 1,3803 (0,6417; 3,1059) 0,5230 (0,2793; 1,0353) 0,0209 (0,0009; 0,1713) 1,2527 (0,5141; 2,4708) 44,63 (23,34; 99,38) 11. IDOE * - p<0,05; ** - p<0,01 47,84 (25,63; 96,67) Анализ экспрессии мРНК TLR 1-10 в эндометрии выявил умеренные и сильные корреляционные взаимосвязи между большинством из них (табл. 30). Выявлена слабая достоверная корреляция между экспрессией мРНК TLR1E и TLR2E (R=0,29; p=0,002), TLR3E (R=0,29;; p=0,002) и TLR7E (R=0,20; p=0,04). Кроме того, экспрессия TLR2E коррелировала с экспрессией TLR3E (R=0,55; p=0,0000001), TLR4E (R=0,57; p=0,0000001), TLR7E (R=0,62; p=0,0000009), TLR8E (R=0,51;; p=0,000001) и TLR10E (R=0,56; p=0,0000001). 100 Таблица 30 Корреляционный анализ экспрессии мРНК TLR в эндометрии в общей выборке (n=114), критерий Спирмена № TLR1E TLR2E TLR3E TLR4E TLR5E TLR6E TLR7E TLR8E TLR9E TLR10E п/п 1. TLR1E - 0,29* 0,29* 0,13 -0,04 0,20 0,20* 0,18 0,13 0,21* 2. TLR2E 0,29* - 0,55** 0,57** 0,11 0,20 0,62** 0,51** 0,23 0,56** 3. TLR3E 0,29* 0,55** - 0,23* 0,20** 0,20 0,57** 0,46** 0,15 0,55** 4. TLR4E 0,13 0,57** 0,23* - 0,09 0,34** 0,41** 0,38 0,28* 0,47** 5. TLR5E -0,04 0,11 0,20* 0,09 - -0,15 0,30** 0,25 0,001 0,20* 6. TLR6E 0,20 0,20 0,20 0,34** -0,15 - 0,42** 0,31* -0,26 0,21 7. TLR7E 0,20* 0,62** 0,47** 0,41** 0,30** 0,42** - 0,63** 0,11 0,61** 8. TLR8E 0,18 0,51** 0,46** 0,38 0,25 0,31* 0,63** - 0,13 0,51** 9. TLR9E 0,13 0,23 0,15 0,28* 0,001 -0,26 0,11 0,13 - 0,40** 10. TLR10E 0,21* 0,56** 0,55** 0,47** 0,20* 0,21 0,61** 0,51** 0,40** - * - p<0,05; ** - p<0,01 101 У TLR3E также наблюдалась достоверная слабая корреляционная связь с TLR4E (R=0,24;; p=0,015) и TLR5E (R=0,20;; p=0,04), и умеренная – с TLR7E (R=0,57; p=0,000001), TLR8E (R=0,48;; p=0,000004) и TLR10E (R=0,55; p=0,0000001). Экспрессия TLR4E, помимо корреляции с TLR2E и TLR3E, описанной выше, имела умеренную корреляционную связь с TLR6E (R=0,34;; p=0,06) и TLR10E (R=0,47;; p=0,000001), и слабую – с TLR9E (R=0,28; p=0,034). Умеренная достоверная корреляция наблюдалась между экспрессией TLR5E и TLR7E (R=0,30;; p=0,001) и слабая – между TLR5E и TLR10E (R=0,20; p=0,041). Экспрессия мРНК TLR6E имела умеренную достоверную корреляционную связь с TLR4E, а также с TLR7E (R=0,42; p=0,065) и TLR8E (R=0,31; p=0,025). Экспрессия TLR7E в эндометрии, помимо корреляции с TLR1E – TLR6E, также имела сильную корреляционную связь с TLR8E (R=0,63;; p=0,025) и TLR10E (R=0,61; p=0,000001). TLR8E, помимо вышеуказанных TLR, коррелировала с TLR10E (R=0,51;; p=0,51;; p=0,0001). Корреляционные взаимосвязи TLR9E и TLR10E были описаны выше. Был проведен корреляционный анализ взаимосвязи экспрессии мРНК TLR в эпителии цервикального канала и эндометрии (табл. 31). Было установлено, что между экспрессией TLR в эндометрии и эпителии цервикального канала наблюдается преимущественно отрицательная обратная связь. Так, экспрессия мРНК TLR6 в цервикальном канале имела отрицательную обратную связь с экспрессией в эндометрии мРНК TLR1E (R=0,40;; p=0,015) и TLR10E (R=-0,39; p=0,016). 102 Таблица 31 Корреляция между уровнем экспрессии TLR в эпителии цервикального канала и в эндометрии в общей выборке (n=114), критерий Спирмена Признак TLR1E TLR2E TLR3E TLR4E TLR5E TLR6E TLR7E TLR8E TLR9E TLR10E TLR1 -0,29 -0,23 -0,49* -0,08 -0,12 -0,15 -0,41* -0,02 -0,63* -0,15 TLR2 -0,45** 0,14 -0,31* 0,03 0,002 0,07 -0,18 0,12 -0,02 -0,20 TLR3 -0,16 -0,08 -0,12 0,03 -0,13 0,16 -0,16 -0,04 0,05 -0,17 TLR4 -0,26* -0,14 -0,08 0,14 -0,11 0,0003 -0,06 0,13 -0,19 0,02 TLR5 0,09 -0,05 -0,07 -0,11 -0,17 0,02 0,03 -0,18 0,25 0,12 TLR6 -0,40* -0,25 -0,32 -0,29 -0,13 -0,31 -0,28 -0,15 -0,31 -0,39* TLR7 0,06 0,11 -0,22 0,04 -0,29* 0,41* -0,21 -0,05 -0,02 -0,17 TLR8 -0,02 -0,12 -0,23 0,13 -0,13 -0,30 -0,21 -0,09 -0,19 -0,18 TLR9 -0,09 -0,30 -0,14 -0,14 -0,39 -0,51 -0,32 0,16 0,34 -0,19 TLR10 -0,15 -0,04 -0,31* 0,15 -0,23 -0,01 -0,09 0,09 -0,23 -0,21 * - p<0,05; ** - p<0,01 103 Была выявлена умеренная отрицательная корреляционная связь между экспрессией мРНК TLR3 в эндометрии (TLR3E) с экспрессией в эпителии цервикального канала TLR1 (R=-0,49;; p=0,012) и TLR2 (R=0,017). Кроме того, наблюдалась умеренная отрицательная обратная связь TLR1 в эндометрии (TLR1E) с экспрессией в цервикальном канале TLR2 (R=-0,45;; p=0,0003) и слабая достоверная обратная связь с TLR4 (R=-0,26;; p=0,03). Также наблюдалась умеренная отрицательная корреляционная связь между экспрессией TLR3E и TLR10 в эпителии цервикального канала (R=-0,31; p=0,08). Кроме того, слабая достоверная отрицательная обратная связь была установлена между экспрессией TLR5 в эндометрии (TLR5E) с экспрессией TLR7 в цервикальном канале (R=-0,29;; p=0,019). Наблюдалась также достоверная умеренная отрицательная обратная корреляционная связь между TLR7 в эндометрии (TLR7E) и TLR1 в цервикальном канале (R=-0,41; p=0,04). Единственный вариант положительной корреляционной связи наблюдался между мРНК TLR7 в цервикальном канале и TLR6E в эндометрии (R=0,41; p=0,013). Не было выявлено достоверных корреляционных связей между экспрессией одноименных рецепторов в эпителии цервикального канала и эндометрии. Обращает на себя внимание тот факт, что корреляционная взаимосвязь отрицательного характера прослеживалась преимущественно между группой TLR, активируемых бактериальными лигандами, и группой сигнальных рецепторов, лигандами которых являются вирусы и нуклеиновые кислоты. Был проведен корреляционный анализ взаимосвязи между уровнем экспрессии TLR и данными анамнеза, а также клинико-лабораторными данными. 104 Была выявлена слабая достоверная обратная связь между количеством самопроизвольных выкидышей и экспрессией TLR3E в эндометрии (R=0,26; p= 0,005) (табл. 32). Умеренная отрицательная корреляцонная связь была выявлена между экспрессией TLR6E и количеством выкидышей в анамнезе (R=-0,30; p=0,013), что косвенно подтверждает роль снижения экспрессии TLR6 в патогенезе невынашивания ранних сроков. Слабая достоверная отрицательная корреляционная связь наблюдалась между возрастом начала половой жизни и экспрессией TLR6E (R=-0,25;; p=0,039), а положительная – между этим же показателем и экспрессией TLR9E (R=0,27;; p=0,045). Напротив, положительная умеренная корреляционная связь наблюдалась между экспрессией TLR6E и количеством родов (R=0,32;; p=0,009) и слабая (R=0,25; p=0,044) – абортов в анамнезе. Также был проведен корреляционный анализ между экспрессией TLR и данными общего анализа крови (табл. 33). Было установлено, что экспрессия TLR3E имела слабую корреляционную связь с количеством эозинофилов (R=0,28;; p=0,04), а TLR6E - с уровнем гемоглобина (R=0,27;; p=0,03). Слабая отрицательная обратная связь наблюдалась между экспрессией TLR7E и количеством моноцитов (R=-0,29; p=0,03). Положительная умеренная корреляционная обратная связь наблюдалась между экспрессией TLR8E и количеством сегментоядерных нейтрофилов (R=0,42;; p=0,005) и отрицательная – с количеством лейкоцитов (R=-0,40; p=0,005). Также отмечалась умеренная отрицательная обратная связь между экспрессией TLR4E и количеством палочкоядерных нейтрофилов (R=-0,35; p=0,01). Корреляционный анализ данных коагулограммы показал, что уровень фибриногена в крови имеет умеренную отрицательную корреляционную взаимосвязь с экспрессией TLR3E (R=-0,33;; p=0,02) (табл. 34). 105 Таблица 32 Корреляционный анализ экспрессии TLR в эндометрии и данных анамнеза (n=114), критерий Спирмена Признак Количество беременностей Количество родов Количество абортов Количество выкидышей и неразвивающихся беременностей Начало половой жизни Число половых партнеров * - p<0,05; ** - p<0,01 TLR1E TLR2E TLR3E TLR4E TLR5E TLR6E TLR7E TLR8E TLR9E -0,01 -0,11 0,04 0,08 -0,002 0,23 -0,006 -0,04 0,06 TLR 10Е -0,07 -0,14 -0,10 -0,006 0,08 0,04 0,32* 0,004 0,13 -0,05 -0,09 -0,13 -0,028 0,06 0,09 0,10 0,25* 0,12 0,02 0,01 0,05 -0,19 0,02 0,26** -0,06 -0,11 -0,29* -0,09 -0,03 0,09 -0,27 0,16 0,06 0,04 -0,14 0,02 -0,26* -0,09 0,008 0,27* 0,06 -0,11 -0,07 -0,02 0,09 0,03 0,15 0,001 -0,011 0,09 0,08 106 Таблица 33 Корреляция экспрессии мРНК TLR и показателей общего анализа крови (n=114), критерий Спирмена Признак TLR1E TLR2E TLR3E TLR4E TLR5E TLR6E TLR7E TLR8E TLR9E TLR10E Эритроциты, 109/л. -0,12 -0,12 -0,11 0,08 0,009 -0,16 -0,08 -0,009 -0,16 -0,06 Гемоглобин, г/л -0,04 -0,13 -0,05 0,07 -0,08 0,27* -0,05 0,07 -0,08 0,09 Лейкоциты, 106/л 0,008 0,11 0,15 0,06 -0,13 0,005 -0,04 0,06 -0,09 0,05 п/я, % -0,07 -0,07 -0,11 -0,35* -0,05 -0,07 0,11 -0,20 -0,25 -0,21 с/я, % 0,03 0,14 0,06 0,13 0,01 0,24 0,25 0,42** 0,18 0,17 лимфоциты,% -0,03 -0,03 -0,07 0,04 0,02 -0,04 -0,13 -0,40** -0,12 -0,04 моноциты,% -0,01 -0,11 0,08 -0,21 -0,21 -0,20 -0,29* -0,06 0,07 -0,16 эозинофилы,% 0,10 0,04 0,28* 0,08 0,10 0,04 0,006 0,11 0,05 -0,01 Тромбоциты, 109/л -0,29 0,11 0,15 0,19 0,22 -0,12 0,17 -0,14 0,13 0,08 * - p<0,05; ** - p<0,01 107 Таблица 34 Корреляция экспрессии мРНК TLR в эндометрии и показателей коагулограммы (n=114), критерий Спирмена Признак TLR1E TLR2E TLR3E TLR4E TLR5E TLR6E TLR7E TLR8E TLR9E TLR 10Е Фибриноген, -0,16 0,15 -0,33* 0,06 -0,10 -0,06 -0,05 -0,03 0,32 -0,005 ПТИ, % 0,32* 0,19 -0,11 0,10 0,06 -0,29 0,12 0,08 0,18 0,09 АЧТВ, сек. 0,26 0,08 0,10 -0,14 -0,03 0,05 0,04 -0,13 -0,13 0,10 ТВ, сек. 0,11 0,13 0,26 -0,18 0,22 -0,04 0,16 0,28 0,31 0,04 -0,34* -0,19 0,10 -0,20 -0,26 0,41* -0,13 -0,22 -0,14 -0,11 г/л МНО * - p<0,05; ** - p<0,01 108 У TLR1E наблюдалась положительная корреляционная связь с уровнем ПТИ (R=0,33;; p=0,02) и отрицательная – с уровнем МНО (R=-0,34; p=0,02). Положительная умеренная корреляционная связь наблюдалась между уровнем TLR6E и МНО (R=0,41; p=0,04). Был также проведен корреляционный анализ взаимосвязей между экспрессией TLR в цервикальном канале и эндометрии и данными гистологического исследования содержимого полости матки (табл. 35). Было показано, что при гнойно-некротическом хориодецидуите имела место умеренная обратная корреляционная зависимость с уровнем экспрессии TLR3 (R=-0,31; p=0,04), TLR5 (R= -0,34; p=0,03), TLR6 (R=-0,45; p=0,03), TLR7 (R=-0,36;; p=0,02) и IDO (R=-0,45;; p=0,02) в цервикальном канале. В тех случаях, когда наблюдалось отсутствие патологических изменений в эндометрии, TLR6, напротив, имел умеренную положительную корреляционную связь с данными гистологического исследования (R=0,48; p=0,02). Также обращал на себя внимание тот факт, что при тромбозе сосудов децидуальной оболочки наблюдалась положительная умеренная корреляционная связь с экспрессией в эндоцервиксе TLR5 (R=0,33;; p=0,04) и TLR7 (R=0,34; p=0,03). Экспрессия TLRЕ 1-10 в эндометрии не имела корреляционной связи с данными гистологического исследования. С целью оценки значимости экспрессии TLR в цервикальном канале и эндометрии у пациенток с самопроизвольными выкидышами ранних сроков был проведен дискриминантный анализ (табл. 36). В результате анализа были установлены значимые параметры экспрессии TLR в цервикальном канале и эндометрии, которые внесли вклад в различие групп пациенток с невынашиванием и прогрессирующей беременностью. 109 Таблица 35 Корреляционный анализ взаимосвязей между экспрессией TLR в цервикальном канале и эндометрии и данными гистологического исследования содержимого полости матки (n=57), бисериальная корреляция Тромбоз № п/п Гены Серозный Гнойный Гнойно-некротический сосудов децидуит децидуит хориодецидуит децидуальной оболочки Дистрофические изменения в эндометрии Без патологических изменений 1. TLR1 0,18 -0,39 -0,23 -0,05 0,08 -0,15 2. TLR2 0,03 -0,08 -0,19 -0,08 0,10 0,27 3. TLR3 0,006 0,02 -0,31* 0,24 0,13 0,05 4. TLR4 0,09 0,04 -0,29 -0,008 -0,05 0,16 5. TLR5 0,06 -0,04 -0,34* 0,33* 0,12 0,19 6. TLR6 0,05 -0,09 -0,45* 0,05 0,11 0,48* 7. TLR7 -0,78 0,05 -0,36* 0,34* -0,06 0,17 8. TLR8 0,15 0,32 0,37 -0,10 0,14 -0,35 9. TLR9 0,25 0,32 -0,25 -0,22 0,12 -0,05 110 № Гены п/п Серозный Гнойный Гнойно-некротический Тромбоз Дистрофические Без патологических децидуит децидуит хориодецидуит сосудов изменения в изменений децидуальной эндометрии оболочки 10. TLR10 -0,15 0,09 -0,26 -0,06 0,09 0,14 11. IDO 0,12 0,25 -0,45** 0,24 0,11 0,04 12. TLR1E 0,03 -0,11 -0,45 0,07 -0,26 -0,10 13. TLR2E 0,09 -0,015 0,12 -0,10 0,01 0,02 14. TLR3E -0,02 -0,09 0,11 -0,14 0,11 0,12 15. TLR4E -0,08 -0,03 0,13 -0,14 0,07 0,12 16. TLR5E 0,08 0,01 -0,07 -0,04 0,08 -0,03 17. TLR6E -0,08 -0,009 -0,04 0,18 -0,11 0,01 18. TLR7E 0,15 0,13 -0,07 -0,13 0,07 0,08 19. TLR8E 0,15 0,05 -0,14 -0,11 -0,03 0,21 20. TLR9E 0,21 -0,11 -0,06 0,09 -0,14 -0,15 21. TLR10E 0,07 -0,13 0,09 -0,06 0,12 0,007 22. IDOE -0,02 0,05 -0,03 -0,13 -0,08 0,09 * - p<0,05; ** - p<0,01 111 Было выявлено, что наиболее весомым признаком, влияющим на прогрессирование беременности, является экспрессия TLR6E (F=13,91; p=0,003). Также большой вклад в возникновение невынашивания беременности ранних сроков вносила экспрессия TLR3E (F=7,55;; p=0,07) и TLR9E (F=4,05; p=0,047). Среди TLR, экспрессируемых в цервикальном канале, на развитие невынашивания достоверно оказывал влияние уровень TLR2 (F=4,95; p=0,028). Таблица 36 Информативные признаки и их коэффициенты дискриминантного сравнительного анализа при самопроизвольных выкидышах и прогрессирующей беременности раннего срока, N=114, F=5,03; p<0,00001 Признак N=114 Fкритерий руровень TLR6E TLR3E TLR2 TLR9E TLR6 TLR4 TLR1 TLR8 TLR1E TLR2E 13,91280 7,55295 4,95106 4,04888 2,04321 2,25176 1,64158 1,55027 1,24269 1,09882 0,000314 0,007075 0,028255 0,046811 0,155912 0,136521 0,202986 0,215921 0,267548 0,296979 Коэффициенты признака Прогрессирующая Невынашивание беременность 0,04296 0,20089 0,00364 0,00098 0,78901 2,75281 3,52355 1,84790 52,44030 92,94172 -0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 8,06523 10,69800 -0,00000 0,00002 0,13908 0,05003 Так как, по данным литературы, формированию иммунологической толерантности способствует активация индоламиндегидрогеназы, которая катализирует распад триптофана [241] и тем самым способствует супрессии Тклеточного звена иммунитета, была изучена экспрессия ее мРНК. У пациенток с самопроизвольными выкидышами отмечалась достоверно более высокая ее экспрессия в цервикальном канале по сравнению с пациентками основной группы - 33,61 (0,69;; 314,08) против 11,47 (0,39;; 1230,47) в контроле (p<0,01). 112 Была проанализирована взаимосвязь экспрессии мРНК IDO и клиникоанамнестических данных. Корреляционной зависимости между экспрессией IDO и данными анамнеза (паритет, наличие гинекологической патологии), морфометрическими данными, результатами биохимического анализа крови, общего анализа крови и мочи, данными ПЦР и бактериологического исследования не было установлено. Не было выявлено также корреляции между экспрессией IDO и данными бактериоскопического исследования (табл. 37). Таблица 37 Корреляция между экспрессией IDO и данными бактериоскопического исследования в общей выборке (n=114), критерий Спирмена и бисериальная корреляция № Наименование п/п Критерий t Р Спирмена 1. Лейкоциты/IDO -0,11 -0,87 0,38 2. Эпителий/IDO -0,39 0,96 0,32 3. Флора: Палочковая/IDO 0,11 0,87 0,38 Смешанная/IDO 0,21 1,77 0,08 кокковая/IDO -0,02 -0,85 0,39 Вместе с тем, была выявлена достоверная умеренная корреляционная зависимость между экспрессией IDO и уровнем фибриногена по данным коагулограммы (R=0,46;; p=0,03) (табл. 38). Был проведен корреляционный анализ зависимости экспрессии мРНК IDO и TLR в цервикальном канале (табл. 39). 113 Таблица 38 Корреляция между экспрессией IDO и данными коагулограммы в общей выборке (n=114), критерий Спирмена № Наименование п/п Критерий t р Спирмена 1. Фибриноген/ IDO 0,46 3,15 0,003 2. ПТИ/ IDO -0,12 -0,79 0,43 3. АЧТВ/IDO -0,21 -1,44 0,15 4. ТВ/IDO -0,14 -0,92 0,32 5. МНО/ IDO 0,13 0,82 0,41 Таблица 39 Корреляция между экспрессией TLR и IDO в цервикальном канале (n=114), критерий Спирмена № Наименование п/п Критерий t р Спирмена 1. IDO/TLR1 0,36 1,82 0,080 2. IDO/TLR2 0,39 3,21 0,002 3. IDO/TLR3 0,31 2,70 0,009 4. IDO/TLR4 0,30 2,53 0,013 5. IDO/TLR5 0,29 2,35 0,02 6. IDO/TLR6 0,28 1,75 0,08 7. IDO/TLR7 0,27 2,38 0,02 8. IDO/TLR8 0,34 1,95 0,06 9. IDO/TLR9 0,32 1,56 0,13 10. IDO/TLR10 0,35 3,32 0,001 * - p<0,05; ** - p<0,01 114 Так как, по данным литературы, ранее в экспериментах на мышах была показана зависимость экспрессии IDO от активации TLR3, наибольший интерес представляла оценка корреляционной зависимости между ними у человека. Было выявлено, что между экспрессией мРНК IDO и TLR3 наблюдалась умеренная высокодостоверная положительная корреляционная связь (R=0,31; p=0,009). В связи с тем, что достоверных различий в экспрессии мРНК TLR3 в эндоцервиксе между основной и контрольной группой не наблюдалось, можно предположить, что вышеуказанный механизм активации IDO во время беременности не является основным. Поэтому было изучено влияние на экспрессию IDOTLR, стимуляторами которых являются бактериальные лиганды – TLR1, TLR2, TLR4 и TLR6. Выявлено, что экспрессия мРНК IDO достоверно умеренно коррелировала с уровнями TLR2 (R=0,39;; p=0,002) и TLR4 (R=0,30;; p=0,013), а также TLR10 (R=0,35;; p=0,001), лиганд для которого неизвестен, но предположительно имеет бактериальную природу. Также наблюдалась слабая, но достоверная корреляционная связь с TLR5 (R=0,29; p=0,02). Экспрессия мРНК IDO имела слабую достоверную корреляционную связь с TLR7 (R=0,27;; p=0,02), распознающим вирусную одноцепочечную РНК. Установлено, что уровень экспрессии мРНК IDO в эндометрии (IDOE) у пациенток обеих групп достоверно не отличался и составил 47,83 (25,63;; 96,67) в основной группе и 44,63 (23,34;; 99,38) в контроле (табл. 40). Уровень экспрессии IDOE в эндометрии не коррелировал с экспрессией IDO в эпителии цервикального канала (R=-0,06;; p=0,56). Экспрессия IDOE имела слабую достоверную обратную корреляционную связь с числом беременностей в анамнезе (R=-0,23; p=0,01). 115 Таблица 40 Корреляционная зависимость между данными анамнеза и экспрессией IDO в эндометрии (n=114), критерий Спирмена № п/п Признак R t р 1. Количество беременностей/IDOE Количество родов/IDOE -0,12 -1,31 0,19 -0,23 -2,45 0,01 Количество абортов/IDOE Количество выкидышей/IDOE Количество неразвивающихся беременностей/IDOE Начало половой жизни/IDOE Число половых партнеров/IDOE -0,02 0,22 0,83 0,017 0,18 0,85 0,06 0,61 0,55 -0,12 -1,34 0,18 0,01 0,14 0,89 2. 3. 4. 5. 6. 7. Проанализирована взаимосвязь между экспрессией мРНК IDO в эндометрии (IDOE) и TLR в эндометрии и цервикальном канале (табл. 41). Было установлено, что экспрессия IDOE не коррелирует с экспрессией большинства TLR в цервикальном канале, за исключением TLR1, с которым наблюдалась достоверная умеренная отрицательная обратная связь (R=-0,48; p=0,014). Однако корреляция между экспрессией IDOE и TLR в эндометрии была положительной. Данный факт представляет собой некую закономерность, так как положительная корреляционная зависимость наблюдалась и между экспрессией IDO и TLR в цервикальном канале, что было описано выше. Так, высокодостоверная умеренная корреляционная связь была установлена между экспрессией мРНК IDOE и TLR2E (R=0,43;; p=0,0001), а 116 также IDOE и TLR3E (R=0,47; p=0,0000001). Была выявлена положительная слабая достоверная корреляционная связь между уровнем экспрессии IDOE и TLR4E (R=0,27;; p=0,04). Еще одна достоверная сильная корреляционная зависимость была выявлена между экспрессией IDO и TLR7E (R=0,51; p=0,0000001). Таблица 41 Корреляция между экспрессией IDO в эндометрии и TLR в эпителии цервикального канала и эндометрии (n=114), критерий Спирмена № Признак п/п TLR в эпителии TLR в эндометрии цервикального канала R р R р 1. TLR1/IDOE -0,48 0,014 0,29 0,02 2. TLR2/IDOE -0,23 -1,78 0,43 0,00001 3. TLR3/IDOE -0,15 -1,31 0,47 0,0000001 4. TLR4/IDOE 0,095 0,77 0,27 0,004 5. TLR5/IDOE 0,23 1,8 0,02 0,80 6. TLR6/IDOE 0,28 0,88 -0,22 0,18 7. TLR7/IDOE -0,15 0,21 0,51 0,0000001 8. TLR8/IDOE -0,09 0,60 -0,17 0,38 9. TLR9/IDOE 0,32 0,13 -0,35 0,09 10. TLR10/IDOE -0,21 0,07 -0,22 0,07 Такие же закономерности между экспрессией IDO и TLR2, TLR3, TLR4, TLR7 и TLR10 были описаны выше и в эпителии цервикального канала. В отличие от эпителия цервикального канала, в эндометрии не было выявлено корреляционной зависимости между экспрессией IDOE и TLR5. 117 Также был проведен анализ взаимосвязи экспрессии IDO в цервикальном канале и Толл-подобных рецепторов в эндометрии (табл. 42). Таблица 42 Корреляционная зависимость между экспрессией TLR в эндометрии и IDO в цервикальном канале (n=114), критерий Спирмена № Признак R р п/п 1. TLR1E/IDO -0,25 0,035 2. TLR2E/IDO -0,22 0,06 3. TLR3E/IDO -0,29 0,014 4. TLR4E/IDO 0,007 0,95 5. TLR5E/IDO -0,08 0,52 6. TLR6E/IDO 0,09 0,59 7. TLR7E/IDO -0,003 0,10 8. TLR8E/IDO 0,03 0,82 9. TLR9E/IDO 0,14 0,41 -0,08 0,52 10. TLR10E/IDO Было установлено, что все корреляционные взаимосвязи были отрицательными. Достоверная слабая отрицательная взаимосвязь была выявлена между IDO и TLR1E (R=-0,25;; p=0,03) и IDO и TLR3E (R=-0,29; p=0,014). Экспрессия TLRЕ 1-10 и IDOE в эндометрии не имела корреляционной связи с данными гистологического исследования. С целью дальнейшего изучения механизмов невынашивания беременности при активации TLR было проведено исследование метаболизма простагландинов в цервикальном канале и эндометрии, в частности экспрессии 118 мРНК гидроксипростагландиндегидрогеназы (HPDG), катализирующий деградацию простагландинов в тканях, и циклооксигеназы-2 (COX-2). Также была изучена экспрессия мРНК каспазы-3, которая влияет на механизм запуска апопотоза трофобласта. Полученные результаты представлены в таблице 43. Установлено, что экспрессия в цервикальном канале мРНК CASP-3α, COX-2 и HPDG у пациенток обеих групп достоверно не отличалась (табл. 66). Выявлено, что транскрипционный вариант каспазы CASP-3β в женских половых путях не экспрессируется. Экспрессия мРНК HPDG в эндометрии (HPDGE) была в 3,6 раза ниже у пациенток с самопроизвольными выкидышами по сравнению с группой контроля. При этом экспрессия мРНК COX-2 в эндометрии (COX-2E) достоверно не отличалась. Экспрессия мРНК CASP-3α в эндометрии (CASP-3αE) была в 6,5 выше у пациенток основной группы по сравнению с контрольной. С целью оценки взаимосвязей между экспрессией TLR и мРНК CASP-3α, COX-2 и HPDG у пациенток обеих групп был проведен корреляционный анализ (табл. 44). Установлено, что экспрессия CASP-3α в цервикальном канале умеренно коррелировала с экспрессией в эндоцервиксе TLR, активируемых бактериальными лигандами: TLR1 (R=0,52; p=0,02), TLR2 (R=0,49;; p=0,002) и TLR10 (R=0,43; p=0,004). Экспрессия CASP-3α не имела достоверной взаимосвязи c экспрессией TLR в эндометрии. HPDG в цервикальном канале имела высокую достоверную корреляционную связь с уровнем экспрессии TLR5E в эндометрии (R=0,78; p=0,012). 119 Таблица 43 Экспрессия мРНК CASP-3α, COX-2 и HPDGу пациенток с самопроизвольными выкидышами и в контроле, [Mе(25%;75%)] № Наименование Цервикальный канал Эндометрий п/п 1. CASP-3α 2. COX2 3. HPDG Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) 0,0003 (0,00004; Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 0,0008 (0,0001; Самопроизвольное прерывание беременности (n=57) Искусственный аборт (контрольная группа, n=57) 0,0026 (0,00017; 0,0004 (0,0001; 0,0039) 0,0017) 0,0032) 0,0150)* 0,0011 (0,00012; 0,0019 (0,0010; 0,0148) 0,4293) 0,0665 (0,00045; 0,1749 (0,00058; 0,0149 (0,00045; 0,1143) 0,3492) 0,1143)* 0,0185 (0,00092; 0,0974) 0,0110 (0,0006; 0, 1476) 0,054 (0,046; 0,3132) * - p<0,05 120 Таблица 44 Корреляция экспрессии мРНК CASP-3α, COX-2 и HPDG в цервикальном канале и TLR в цервикальном канале и эндометрии в общей выборке (n=114), критерий Спирмена № Гены CASP-3α HPDG COX-2 1. TLR1 0,52* 0,10 0,20 2. TLR2 0,49** 0,20 0,40 3. TLR3 0,29 -0,21 0,08 4. TLR4 0,22 -0,16 0,08 5. TLR5 0,13 -0,25 0,10 6. TLR6 0,68 -0,64 0,56 7. TLR7 0,31 -0,06 0,31 8. TLR8 -0,09 0,10 0,70 9. TLR9 0,48 -0,14 0,89** 10. TLR10 0,43** 0,27 0,30 11. TLR1E -0,27 0,44 -0,23 12. TLR2E -0,03 0,04 -0,52 13. TLR3E -0,23 -0,15 -0,48 14. TLR4E -0,04 0,47 0,32 15. TLR5E -0,24 0,78* -0,10 16. TLR6E -0,23 0,40 -0,48 17. TLR7E -0,14 0,28 0,23 18. TLR8E -0,004 0,21 -0,12 19. TLR9E -0,004 0,70 -0,25 20. TLR10E -0,27 0,18 -0,24 п/п * - p<0,05, ** - p<0,01 121 Наблюдалась сильная высокодостоверная корреляционная связь между экспрессией в эндоцервиксе COX-2 и TLR9 (R=0,89;; p=0,006). Других взаимосвязей экспрессии COX-2 в цервикальном канале и TLR отмечено не было. Наблюдалась достоверная умеренная отрицательная связь уровня CASP3αE с экспрессией в эндометрии TLR6E (R=-0,52;; p=0,000057) (табл. 45). Экспрессия мРНК HPDGE имела достоверную слабую положительную корреляционную связь с экспрессией мРНК TLR4 (R=0,27; p=0,016). Не было выявлено достоверных взаимосвязей уровня экспрессии CASP-3αE и HPDGE и других TLR в эндометрии и цервикальном канале. Экспрессия COX-2E имела слабую достоверную корреляционную связь с TLR1E в эндометрии (R=0,20;; p=0,049), активируемым бактериальными лигандами. Кроме того, положительная умеренная корреляционная связь наблюдалась между экспрессией COX-2E и TLR9 в цервикальном канале, лигандом которого является неметилированная ДНК (R=0,52;; p=0,027). Также COX-2E имела обратную слабую корреляционную связь с экспрессией в цервикальном канале TLR7 (R=-0,27; p=0,044). Чтобы оценить взаимосвязь экспрессии CASP-3α, COX-2 и HPDG между собой и с IDO в эндометрии и цервикальном канале, был проведен корреляционный анализ (табл. 46). В большинстве случаев экспрессия мРНК CASP-3α, COX-2 и HPDG в эндометрии и цервикальном канале не коррелировали между собой. Исключение составила только экспрессия COX-2 в эндоцервиксе и HPDGE в эндометрии, между которыми наблюдалась сильная отрицательная обратная связь (R=-0,73; p=0,036). Это позволяет предположить, что повышение экспрессии COX-2 в цервикальном канале способствует угнетению экспрессии HPDGE в эндометрии, что имеет однонаправленное действие – увеличение синтеза простагландинов и уменьшение их распада. 122 Таблица 45 Корреляция экспрессии мРНК CASP-3α, COX-2 и HPDG в эндометрии и TLR в цервикальном канале и эндометрии в общей выборке (n=114), критерий Спирмена № Наименование TLR CASP-3αE HPDGE COX-2E 1. TLR1 0,35 0.26 -0,16 2. TLR2 -0,09 -0,05 -0,12 3. TLR3 -0,16 0,19 0,01 4. TLR4 0,04 0,28 -0,09 5. TLR5 -0,04 0,15 -0,14 6. TLR6 -0,24 0,16 -0,03 7. TLR7 0,11 -0,22 -0,27* 8. TLR8 -0,26 0,23 -0,07 9. TLR9 -0,04 0,21 0,52* 10. TLR10 -0,03 -0,10 0,03 11. TLR1E 0,003 -0,04 0,20* 12. TLR2E 0,13 0,08 0,12 13. TLR3E 0,08 -0,04 0,05 14. TLR4E 0,02 0,27* 0,21 15. TLR5E -0,003 -0,22 -0,16 16. TLR6E -0,52** 0,07 0,11 17. TLR7E 0,10 0,14 0,06 18. TLR8E 0,19 0,06 -0,07 19. TLR9E 0,14 0,02 0,15 20. TLR10E 0,08 0,13 0,10 п/п * - p<0,05, ** - p<0,01 123 Таблица 46 Корреляция экспрессии CASP-3α, COX-2 и HPDG между собой и с IDO в эндометрии и цервикальном канале (n=114), критерий Спирмена CASP- COX-2 HPDG IDO 3α CASP- CASP- HPDGE 3αE COX- IDOE 2E - 0,59 -0,13 0,39* 0,003 0,18 0,20 -0,21 COX-2 0,59 - 0,60 0,67* 0,009 -0,73* 0,24 -0,58* HPDG -0,13 0,60 - 0,63* -0,11 -0,67 0,14 0,03 CASP- 0,003 0,009 -0,11 0,03 - 0,06 -0,17 0,03 HPDGE 0,18 -0,73* -0,67 0,16 0,06 - 0,25* 0,16 COX- 0,20 0,24 0,14 0,10 -0,017 0,25* - 0,10 3α 3αE 2E * - p<0,05; ** - p<0,01 Интересно, что между экспрессией COX-2E и HPDGE в эндометрии наблюдалась слабая достоверная прямая зависимость (R=0,25;; p=0,038). Других достоверных корреляционных взаимосвязей экспрессии мРНК вышеуказанных ферментов выявлено не было. В цервикальном канале обращала на себя внимание сильная корреляционная зависимость между экспрессией IDO и ферментов, связанных с синтезом и распадом простагландинов – COX-2 (R=0,67;; p=0,012) и HPDG (R=0,63;; p=0,047). Отрицательная умеренная корреляционная зависимость наблюдалась между экспрессией COX-2 в эндоцервиксе и IDOE в эндометрии (R=-0,58; p=0,036). 124 Был проведен корреляционный анализ взаимосвязи результатов гистологического исследования и экспрессии мРНК CASP-3α, COX-2 и HPDG (табл. 47). Достоверных взаимосвязей экспрессии вышеуказанных ферментов с патологическими изменениями в эндометрии отмечено не было. Однако в случаях, когда в эндометрии наблюдалась нормальная морфологическая картина, наблюдалась достоверная положительная умеренная корреляционная связь с экспрессией CASP-3α в эндоцервиксе (R=0,54;; p=0,006) и отрицательная – с экспрессией COX-2E в эндометрии (R=-0,33; p=0,02). После оценки экспрессии TLR, ферментов апоптоза и синтеза простагландинов в цервикальном канале на поздних сроках беременности были выявлены наиболее информативные факторы, позволяющие прогнозировать возникновение самопроизвольных выкидышей ранних сроков (табл. 48). Было установлено, что наиболее прогностически ценными являлись экспрессия CASP-3α (F=155,76; p=0,00002) и COX-2 (F=83,38; p=0,0003). В таблице 49 приведена матрица классификации анализа, из которой видно, что 91,22 % женщин с самопроизвольными выкидышами ранних сроков были правильно классифицированы, а в группе с прогрессирующей беременностью – 92,98%. Качество распознавания в данной модели составило 92,10%. Достоверность модели была высокой (F=231,97, p<0,00001). В таблице 49 приведены коэффициенты признаков, которые необходимы для подстановки их в дискриминантное уравнение, которое имеет вид: Y=a1x1+a2x2+C, где a – коэффициенты из таблицы 6, х – значение признака, C – константа, y – значение, по которому мы можем отнести женщину в одну или другую группу. 125 Таблица 47 Корреляционный анализ взаимосвязей между экспрессией CASP-3α, COX-2 и HPDGв цервикальном канале и эндометрии и данными гистологического исследования содержимого полости матки (n=57), бисериальная корреляция № Гены п/п Серозный Гнойный Гнойно- Тромбоз Дистрофические Без децидуит децидуит некротический сосудов изменения в патологических хориодецидуит децидуальной эндометрии изменений оболочки 1. CASP-3α -0,33 -0,37 -0,36 0,04 0,10 0,54** 2. COX-2 -0,27 0,27 -0,41 0,13 0,09 0,26 3. HPDG -0,13 -0,11 0,05, -0,15 -0,06 0,31 4. CASP-3αE 0,19 0,26 -0,09 -0,21 0,24 0,03 5. HPDGE 0,08 -0,12 -0,04 -0,16 -0,06 0,31 6. COX-2E 0,22 -0,11 0,17 -0,12 -0,06 -0,33* * - p<0,05; ** - p<0,01 126 Таблица 48 Информативные признаки и их коэффициенты дискриминантного сравнительного анализа при самопроизвольных выкидышах и прогрессирующей беременности раннего срока для COX-2 и CASP-3α, N=114, F (2,5)=231,97 p< 0,00001 Признак Коэффициенты признака F- р-уровень Прогрессирующая N=114 критерий CASP- 267,8731 0,000016 155,7550 3007,030 83,3752 0 ,000264 27,2986 533,609 -0,8383 -207,714 Невынашивание беременность 3α COX-2 Constant Таблица 49 Матрица классификации дискриминантного анализа Группа Невынашивание CASP-3α Прогрессирующая беременность Качество Всего, % распознавания, % 91,22 % 8,77 % 100 91,22% COX-2 7,77% 92,98% 100 92,98% Всего 98,99 % 101,75% 200 92,10% Вероятность возникновения самопроизвольного выкидыша вычисляется по формуле: P=ey/1+ey. Предложенный способ позволяет спрогнозировать возникновение самопроизвольного выкидыша в 92,1% случаев. 127 ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ, ЕЕ ИСХОДЫ И СОСТОЯНИЕ МЕСТНОЙ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ У ЖЕНЩИН С ВЫСОКОЙ СТЕПЕНЬЮ ИНФЕКЦИОННОГО РИСКА 5.1. Особенности социально-биологического статуса и клиниколабораторных данных у беременных с высокой степенью инфекционного риска Для оценки факторов риска развития послеродовых ГСЗ был проведен анализ социально-биологического статуса у 85 женщин с высокой степенью инфекционного риска на сроке 38-41 нед. беременности, которые в дальнейшем они были разделены на 2 группы – с нормально протекавшим послеродовым периодом (III) и с развившимся послеродовым эндометритом (IV), в том числе - моносимптомным (лохиометра) (64 и 21 пациентка соответственно). Было установлено, что пациентки обеих групп были сопоставимы по возрасту, паритету, способу родоразрешения (табл.50). Средний возраст пациенток с развившимся эндометритом составил 26,14±4,57 лет, пациенток с неосложненным послеродовым перидом - 26,48±5,31 лет. Место жительства также не влияло на частоту послеродовых ГСЗ. Однако была выявлена зависимость между характером работы и вероятностью возникновения эндометрита. Так, в группе с развившимся эндометритом доля лиц умственного труда составляла 23,81±9,29%, в то время как в контрольной группе – 48,44±6,25%(p<0,05). Вероятно, пациентки, занятные умственным трудом, являются более дисциплинированными и чаще следуют рекомендациям врача, в том числе и в отношении профилактики инфекционных осложнений. 128 Таблица 50 Характеристика групп беременных, % (P±p) № Признак Основная Контрольная группа, III группа, IV (n=21) (n=64) 76,19±9,29 62,5±6,05 23,81±9,29 37,5±6,05 умственная 23,81±9,29 48,44±6,25* физическая 33,33±10,29 40,63±6,14 не работает 38,10±10,60 26,56±5,52 город 38,10±10,60 42,19±6,17 село 61,90±10,60 57,81±6,17 п/п 1. Способ родоразрешения: - через естественные родовые пути - путем операции кесарево сечение 2. 3. Характер работы Место жительства: * - р< 0,05 Была также проведена оценка влияния длительности пребывания в стационаре пациенток обеих групп. Было установлено, что длительность дородовой госпитализации не является фактором риска развития послеродового эндометрита (табл. 51). Однако закономерным является тот факт, что средняя продолжительность пребывания в стационаре после родов в группе пациенток с эндометритом была выше. Так, длительность госпитализации пациенток в послеродовом отделении составила 6,19±0,25 койко/дней в основной группе и 4,48±0,15койко/дней в группе контроля (p<0,05). 129 Таблица 51 Длительность пребывания в стационаре пациенток с эндометритом и женщин контрольной группы, койко-дни (M±σ) № Признак п/п 1. Длительность госпитализации в Основная Контрольная группа, III группа, IV (n=21) (n=64) 6,81±0,47 6,33±0,52 6,19±0,25* 4,48±0,15 5,82±0,16* 3,62±0,08 8,00±0,14* 5,91±0,59 отделении патологии беременных 2. Длительность госпитализации в послеродовом отделении, в том числе: -после родов через естественные родовые пути -после кесарева сечения * - p<0,05 Из них длительность госпитализации после родов через естественные родовые пути составила 5,82±0,16 койко/дня у пациенток с эндометритом и 3,62 ±0,08койко-дня при неосложненном послеродовом периоде (p<0,05). Длительность госпитализации после кесарева сечения также имела достоверные различия у пациенток обеих групп. Так, у III группы она составила 8,00±0,14 койко/дня, а у IV группы - 5,91±0,59 койко/дня (p<0,05). Был проанализирован акушерско-гинекологический анамнез пациенток обеих групп. Между пациентками обеих групп не было выявлено достоверных различий по числу абортов, выкидышей и внематочных беременностей в анамнезе (табл. 52). 130 Таблица 52 Особенности акушерско-гинекологического анамнеза у беременных основной и контрольной группы (M±σ) № Признак п/п Пациентки с эндометритом, III (n=21) 1. Количество беременностей, Контрольная группа, IV (n=64) 2,12±1,44 2,09±1,04 на 1 чел. 2. Количество родов, на 1 чел. 1,54±0,85 1,62±0,74 3. Количество абортов, на 1 0,05±0,22 0,14±0,36 0,43±0,75 0,23±0,69 0,03±0,027 - чел. 4. Количество выкидышей, на 1 чел. 5. Количество внематочных беременностей, на 1 чел. Не было выявлено достоверных отличий между III и IV группой пациенток по наличию у них гинекологической патологии в анамнезе (табл. 53). Анализ особенностей экстрагенитальной патологии у пациенток обеих групп показал, что достоверных различий в частоте заболеваний бронхолегочной, сердечно-сосудистой, эндокринной системы и заболеваний пищеварительного такта и мочевыводящих путей также не наблюдалось (табл. 54). Однако частота воспалительных заболеваний ЛОР-органов, вопреки ожиданиям, была выше в контрольной группе (34,38±5,94% против 14,29±7,64% у пациенток с эндометритом) (p<0,05). У пациенток контрольной группы достоверно чаще была выявлена миопия (18,75±4,88% против 4,76±4,65% в основной группе) (p<0,05). 131 Таблица 53 Особенности гинекологического анамнеза у пациенток III и IV группы, % (P±p) № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Основная группа, III (n=21) Контрольная группа, IV (n=64) 4,76±4,65 - 33,33±10,29 21,88±5,17 Хронический сальпингооофорит 9,52±6,41 21,88±5,17 Кольпит 19,05±8,57 23,44±5,30 ИППП 28,57±9,86 28,13±5,62 - 1,56±1,55 Миома матки 4,76±4,65 6,25±3,03 Эндометриоз - 1,56±1,55 4,76±4,65 4,69±2,64 Бесплодие - 3,13±2,17 Нарушения менструального цикла - 1,56±1,55 Альгодисменорея - 1,56±1,55 Признак Хронический эндометрит Эктопия шейки матки Luis в анамнезе Киста яичника 132 Таблица 54 Наличие экстрагенитальных заболеваний у пациенток с послеродовым эндометритом и с неосложненным послеродовым периодом, % (P±p) № Признак Основная группа, III (n=21) 4,76±4,65 Контрольная группа, IV (n=64) - п/п 1. Хронический бронхит 2. Заболевания ЛОР-органов 14,29±7,64* 34,38±5,94 3. Хронический пиелонфрит 9,52±6,41 18,75±4,88 4. Заболевания ЖКТ 9,52±6,41 7,81±3,35 5. 14,29±7,64 17,19±4,72 - 1,56±1,55 7. Заболевания сердечнососудистой системы Заболевания щитовидной железы Ожирение 4,76±4,65 1,56±1,55 8. Вирусный гепатит С 4,76±4,65 1,56±1,55 9. 9,52±6,41 4,69±2,64 4,76±4,65 3,13±2,17 11. Вирусный гепатит А в анамнезе Варикозная болезнь нижних конченостей Анемия беременных - 3,13±2,17 12. Миопия 4,76±4,65* 18,75±4,88 13. Черепно-мозговая травма в анамнезе 4,76±4,65 - 6. 10. *-p<0,05 Также у пациенток обеих групп проводили сравнительный анализ числа осложнений беременности по данным обменных карт (табл. 55). Было выявлено, что в группе женщин с развившимся впоследствии послеродовым эндометритом достоверно чаще в I триместре наблюдалась угроза прерывания 133 беременности (33,33±10,29% против 10,94±3,90% в контроле, p<0,05). Достоверных различий в частоте осложнений во II половине беременности между пациентками обеих групп выявлено не было. Таблица 55 Осложнения беременности у пациенток с послеродовым эндометритом и с неосложненным послеродовым периодом, % (P±p) № Признак п/п Основная Контрольная группа, III группа, IV (n=21) (n=64) Осложнения I половины беременности 1. Угрожающий выкидыш 2. Анемия беременных I 33,33±10,29* 10,94±3,90 3,13±2,17 - степени 3. Ранний токсикоз 3,13±2,17 - 4. Без осложнений 66,67±10,29 82,81±4,72 Осложнения II половины беременности 5. Угрожающие 33,33±10,29 26,56±5,52 преждевременные роды 6. Гестоз легкой степени 14,29±7,64 20,31±5,03 7. Гестоз средней степени 4,76±4,65 7,81±3,35 8. Плацентарная 23,81±9,29 9,38±3,64 недостаточность *-p<0,05 Также не было выявлено достоверных различий по результатам трех эхографических скринингов у пациенток обеих групп (табл. 56). 134 Таблица 56 Данные эхографических скринингов у пациенток с послеродовым эндометритом и с неосложненным послеродовым периодом, % Признак № п/п Основная группа, III (n=21) Контрольная группа, IV (n=64) I скрининг 1. Угрожающий выкидыш 14,29±7,64 6,25±3,03 2. Миома матки 4,76±4,65 6,25±3,03 3. Предлежание хориона - 3,13±2,17 4. Без патологических изменений 85,71±7,64 73,44±5,52 23,81±9,29 10,94±3,90 II скрининг 5. Плацентарная недостаточность 6. Миома матки 4,76±4,65 6,25±3,03 7. Признаки внутриутробного инфицирования плода 9,52±6,41 14,06±4,35 8. Угрожающий выкидыш 14,29±7,64 10,94±3,90 9. Предлежание плаценты - 1,56±1,55 71,43±9,86 54,69±6,22 - 3,13±2,17 42,86±10,80 21,88±5,17 13. Миома матки 4,76±4,65 6,25±3,03 14. Признаки внутриутробного инфицирования плода 15. ЗРП I-II степени 14,29±7,64 20,31±5,03 4,76±4,65 3,13±2,17 16. Угрожающие преждевременные роды 17. Без патологических изменений 9,52±6,41 9,38±3,64 42,86±10,80 26,56±5,52 10. Без патологических изменений III скрининг 11. Обвитие пуповины вокруг шеи плода 12. Плацентарная недостаточность 135 Всем пациенткам проводилось объективное исследование, включавшее измерение массо-ростовых показателей, окружности живота и высоты стояния дна матки. В результате объективного исследования не было выявлено достоверных различий в росте пациенток, высоте стояния дна матки и окружности живота. Однако вес при поступлении был достоверно ниже у пациенток из основной группы (71,95±1,35 кг.) по сравнению с группой контроля (79,86±2,02 кг.) (p<0,05). Так как прибавка в весе в обеих группах достоверно не отличалась, можно сделать вывод, что женщины с исходно более низкой массой тела угрожаемы по развитию послеродового эндометрита (табл. 57). Таблица 57 Данные объективного исследования у пациенток с послеродовым эндометритом и с неосложненным послеродовым периодом (M±σ) № Признак п/п Основная Контрольная группа, III группа, IV (n=21) (n=64) 1. Рост, см. 161,80±4,91 164,44±7,25 2. Вес, кг. 71,95±1,35* 79,86±2,02 3. Прибавка в весе, кг. 12,57±4,48 13,31±5,23 4. Окружность живота, см. 100,10±8,90 103,35±7,93 5. Высота стояния дна матки, 35,10±3,16 35,19±3,6 см. * - p<0,05 Также всем пациенткам было проведено эхографическое обследование (табл. 58). По данным эхографического исследования было выявлено, что достоверных различий между пациентками обеих групп отмечено не было. 136 Таблица 58 Данные эхографического исследования при поступлении у пациенток обеих групп, % (P±p) № п/п 1. 2. 3. 4. Признак Без патологических изменений Обвитие пуповины вокруг шеи плода Плацентарная недостаточность 6. Миома матки Признаки внутриутробного инфицирования плода ЗРП I-II степени 7. Неправильные 5. Основная группа, III (n=21) Контрольная группа, IV (n=64) 42,86±10,80 26,56±5,52 - 9,38±3,64 42,86±10,80 4,76±4,65 21,88±5,17 6,25±3,03 14,29±7,64 9,38±3,64 4,76±4,65 3,13±2,17 9,52±6,41 9,38±3,64 положение плода, тазовое предлежание По данным допплерометрического исследования было установлено, что у пациенток с развившимся впоследствии эндометритом достоверно чаще наблюдалось нарушение маточно-плацентарного кровотока I степени по сравнению с контрольной группой (табл. 59). Гемодинамических нарушений II и III степени у пациенток обеих групп выявлено не было. Таблица 59 Данные допплерометрического иследования у пациенток основной и контрольной группы, % (P±p) Признак Основная Контрольная № группа, III группа, IV п/п (n=21) (n=64) Без гемодинамических 66,67±10,29 87,50±4,13* 1. нарушений I степень гемодинамических 33,33±10,29* 12,50±4,13 2. нарушений * - p<0,05 137 Не было выявлено также достоверных различий в концентрации плацентарных гормонов у пациенток обеих групп (табл. 60). Наблюдалась закономерная умеренная положительная корреляционная связь уровня прогестерона с уровнем плацентарного лактогена (R=0,47;; p<0,01) и эстриола (R=0,31;; p<0,05) (табл. 61). Таблица 60 Концентрация половых гормонов в сыворотке крови на поздних сроках беременности у пациенток с развившимся впоследствии эндометритом и в контроле (M±σ) № Гормон п/п 1. Плацентарный Основная группа, III Контрольная группа, IV (n=21) (n=64) 4,05±1,58 3,97±1,97 212,84±64,90 222,02±80,96 28,85±9,34 37,52±12,59 лактоген, мг/л 2. Прогестерон, нмоль/л 3. Эстриол, нг/мл Таблица 61 Корреляция между концентрацией плацентарных гормонов (n=85), критерий Спирмена № п/п Гормон 1. Плацентарный лактоген 2. Прогестерон 3. Эстриол Плацентарный лактоген Прогестерон Эстриол - 0,47** 0,16 0,47** - 0,31* 0,16 0,31* - ** - p<0,01 138 Были также проанализировны особенности течения родов через естественные родовые пути и особенности родоразрешения у пациенток с развившимся впоследствии послеродовым эндометритом (III) и у пациенток с неосложненным послеродовым периодом (IV). Не было выявлено достоверных различий по срокам родоразрешения (табл. 62), длительности первого и второго периода родов и их общей продолжительности. Однако длительность третьего периода родов была выше у пациенток с развившимся впоследствии послеродовым эндометритом (10,20±0,41мин.) по сравнению с группой контроля (8,01±0,42мин.) (p<0,05). Кроме того, у пациенток III группы была отмечена достоверно большая кровопотеря, чем в IV группе (214,29±10,26 мл. против 176,9±6,72 мл. в контроле) (p<0,05). Таблица 62 Особенности течения родов через естественные родовые пути у женщин обеих групп (M±σ) № Признак Основная группа (III) (n=16) п/п 1. Срок родов, нед. 2. Длительность 38,57±0,98 родов через 7,69±2,73 Контрольная группа (IV) (n=40) 39,13±1,01 7,10±2,68 естественные родовые пути, час. 3. 1 период родов, час. 6,52±2,27 6,59±3,00 4. 2 период родов, мин. 22,41±1,41 22,34±1,14 5. 3 период родов, мин. 10,20±0,41* 8,01±0,42 6. Безводный период, час. 5,23±3,77 4,14±2,63 7. Количество передних вод, мл. 213,3±164,45 351,85±326,24 8. Кровопотеря, мл. 214,29±10,26* 176,9±6,72 139 У пациенток, родоразрешенных путем операции кесарева сечения и имевших осложненный и неосложненный послеродовый период, был проведен сравнительный анализ длительности операции и объема интраоперационной кровопотери (табл. 63). Таблица 63 Особенности оперативного родоразрешения у женщин основной и контрольной группы (M±σ) № Признак 1. Длительность операции, мин. Основная группа (III)(n=5) 77,12±4,42* 2. Безводный период, мин. 100,22±2,42 172,33±5,91 3. Кровопотеря, мл. 533,33±21,82* 430,56±8,17 п/п Контрольная группа (IV)(n=24) 52,22±3,57 * - p<0,05 У пациенток с развившимся послеродовым эндометритом длительность операции была достоверно выше, чем у женщин с неосложненным послеродовым периодом (77,12±4,24 часа против 52,22±3,57 часа соответственно) (p<0,05). У женщин III группы также была отмечена достоверно более высокая интраоперационная кровопотеря (533,33±21,82 мл.) по сравнению с IV (430,56±8,17 мл.) (p<0,05). Это позволяет рассматривать вышеуказанные факторы как прогностически неблагоприятные для развития послеродового эндометрита. Достоверных различий в длительности безводного периода отмечено не было. Также был проведен анализ состояния новорожденного у пациенток с развившимся эндометритом и с неосложненным послеродовым периодом (табл. 64, 65). Не было выявлено достоверных различий в массе и длине плода, оценке по Апгар при рождении, частоте выявления заболеваний и доле новорожденных, переведенных на II этап выхаживания. 140 Таблица 64 Состояние новорожденного у пациенток III и IV групп (M±σ) № п/п Признак Пациентки с эндометритом (III) (n=21) 3422,63±492,68 Контрольная группа (IV) (n=64) 3332,22±361,31 2. Рост новорожденного, см. 52,79±3,11 52,88±2,19 3. Оценка новорожденного по Апгар, баллы на 1 минуте на 5 минуте 6,71±0,71 7,61±0,59 6,94±0,42 7,71±0,47 1. Вес новорожденного, г. Таблица 65 Заболевания новорожденного у пациенток III и IV групп, % (P±p) № п/п Признак 1. Здоров Пациентки с эндометритом (III) (n=21) 80,95±8,57 Контрольная группа (IV) (n=64) 64,06±6,00 2. Обвитие пуповины вокруг шеи плода 3. Энцефалопатия 4,46±4,65 7,81±3,35 19,05±8,57 17,19±4,72 4. ЗРП I-II степени 4,46±4,65 9,38±3,64 5. Реализация ВУИ 4,46±4,65 9,38±3,64 6. Состояние новорожденного при выписке: выписан переведен на IIэтап выхаживания 85,71±7,64 93,75±3,03 14,29±7,64 6,25±3,03 У пациенток основной группы в послеродовом периоде наблюдалось повышение температуры тела: со стертой формой эндометрита - до 37,5 – 141 38,5ºС, с тяжелой – до 39 ºС, отмечались симптомы общей интоксикации, лейкоцитоз (более 11*109/л) с нейтрофильным сдвигом, СОЭ>30 мм/час, субинволюция матки, при гистологическом исследовании – признаки хориодецидуита и амниохориодецидуита. Всем женщинам III и IV групп проводилась антибактериальная терапия цефалоспоринами III поколения и препаратами имидазольной группы, пациенткам III группы – также вакуумаспирация содержимого полости матки, а также инфузионная терапия. В послеродовом периоде всем женщинам было проведено эхографическое исследование (табл. 66). Было выявлено достоверное увеличение передне-заднего размера полости послеродовой матки у пациенток с развившимся эндометритом (III) по сравнению с пациентками контрольной группы (IV) (12,98±0,42 см. против 8,08±0,47 см. в контроле, p<0,05). Таблица 66 Данные эхографического исследования матки в норме и у пациенток с эндометритом вне зависимости от способа родоразрешения (M±σ) № Признак Пациентки с эндометритом (III)(n=21) 134,05±11,69 п/п 1. Длина матки, мм. Контрольная группа (IV)(n=64) 131,52±11,72 2. Ширина матки, мм. 106,55±8,98 103,78±12,63 3. Сагиттальный размер матки, 74,94±11,42 76,05±13,73 12,98±0,42* 8,08±0,47 мм. 4. Передне-задний размер полости матки, мм. * - p<0,05 В общем анализе крови после родов у женщин основной группы (III) отмечались достоверно более высокие показатели лейкоцитов (15,09±0,54 142 *109/л против 10,17±0,37*109/л в контроле, p<0,01) вне зависимости от метода родоразрешения (табл. 67). Количество лимфоцитов, напротив, у пациенток III группы было достоверно ниже, чем в контроле (IV) (16,21±0,90% и 21,02±,93% соответственно, p<0,05). Вышеописанные закономерности показателей общего анализа крови были характерны в послеродовом периоде и для женщин III и IV группы, родоразрешенных через естественные родовые пути (табл. 68). У них лейкоцитоз составил 14,16±0,44*109/л, что было достоверно выше, чем у пациенток с нормально протекавшим послеродовым периодом (10,30±0,39*109/л, p<0,01). Уровень лимфоцитов, напротив, у пациенток основной группы был ниже, чем в контроле (16,27±0,96% против 21,09±0,95% в контроле, p<0,05). У пациенток основной группы (III), родоразрешенных путем операции кесарево сечение, наблюдалось достоверное увеличение количества лейкоцитов по сравнению с контролем как до родоразрешения (16,43±1,15*109/л против 9,88±0,36*109/л соответственно, p<0,05), так и после операции (17,52±0,67*109/л против 12,09±0,64*109/л, p<0,01) (табл. 69). У женщин, родоразрешенных путем операции кесарево сечение, наблюдалось достоверное снижение количества тромбоцитов в послеоперационном периоде (177,00±4,04*109/л против 290,00±10,09*109/л в контроле, p<0,05). Уровень гемоглобина и количество эритроцитов в основной и контрольной группе не имели достоверных различий вне зависимости от способа родоразрешения. Не было выявлено достоверных различий в данных биохомического анализа крови, коагулограммы и общего анализа мочи у пациенток III и IV групп. 143 Таблица 67 Анализ крови у пациенток с эндометритом (III) и контрольной (IV) группе вне зависимости от способа родоразрешения (M±σ) № Признак п/п 1. Эритроциты, Основная группа, III (n=21) Контрольная группа, IV (n=64) р 1. до родов 2. после родов 3. до родов 4. после родов 1-2 3-4 1-3 2-4 3,76±0,47 3,73±0,44 3,91±0,37 3,96±0,53 0,74 0,91 0,22 0,11 12 10 /л 2. Гемоглобин, г/л 115,93±17,05 110,20±12,96 114,78±10,80 112,13±27,06 0,76 0,09 0,75 0,06 3. Лейкоциты, 109/л 12,40±0,64 15,09±0,54 10,86±0,37 10,17±0,37 0,25 0,06 0,12 0,000001 п/я, % 2,50±1,71 2,45±1,44 2,20±1,15 2,19±1,13 0,78 0,39 0,53 0,55 с/я, % 72,55±9,67 72,74±7,43 71,30±7,34 69,30±8,49 0,54 0,08 0,60 0,18 лимфоциты,% 18,62±1,19 16,21±0,90 20,23±0,91 21,02±0,93 0,12 0,33 0,44 0,02 моноциты,% 6,43±2,50 7,05±1,85 7,11±2,35 7,26±2,06 0,47 0,28 0,35 0,75 4. Тромбоциты 268,43±11,00 279,74±10,29 240,73±9,69 258,54±11,92 0,15 0,73 0,21 0,37 5. СОЭ, мм/час 24,52±3,19 35,42±4,78 20,32±4,17 25,78±4,22 0,001 0,07 0,06 0,002 144 Таблица 68 Анализ крови у пациенток с эндометритом (III) и контрольной (IV) группе, родоразрешенных через естественные родовые пути (M±σ) № Признак п/п 1. Эритроциты, Основная группа, III (n=16) Контрольная группа, IV (n=40) р 1. до родов 2. после родов 3. до родов 4. после родов 1-2 3-4 1-3 2-4 3,75±0,49 3,92±0,58 3,95±0,40 3,82±0,44 0,51 0,06 0,18 0,53 12 10 /л 2. Гемоглобин, г/л 116,08±16,56 119,58±13,03 114,63±10,73 109,87±12,47 0,79 0,46 0,73 0,07 3. Лейкоциты, 109/л 11,30±0,48 14,16±0,44 10,98±0,41 10,30±0,39 0,13 0,10 0,76 0,0002 п/я, % 2,75±1,83 2,25±0,87 2,00±0,64 2,35±1,05 0,28 0,90 0,11 0,81 с/я, % 70,97±7,63 72,48±8,33 71,06±8,28 69,67±8,57 0,56 0,30 0,81 0,97 лимфоциты,% 20,15±1,06 16,27±0,96 20,78±0,91 21,09±0,95 0,14 0,71 0,80 0,04 моноциты,% 6,27±2,79 7,16±2,03 7,38±2,32 7,16±2,11 0,47 0,92 0,19 0,99 Тромбоциты 230,25±7,49 273,36±11,70 275,93±11,66 275,30±10,49 0,15 0,75 0,07 0,94 4. ] 145 Таблица 69 Анализ крови у пациенток с эндометритом (III) и контрольной (IV) группе, родоразрешенных путем операции кесарево сечение (M±σ) № Признак п/п 1. Эритроциты, Основная группа, III (n=5) Контрольная группа, IV (n=24) р 1. до родов 2. после родов 3. до родов 4. после родов 1-2 3-4 1 -3 2-4 3,90±0,73 3,76±0,51 3,80±0,48 3,73±0,45 0,81 0,10 0,89 0,31 1012/л 2. Гемоглобин, г/л 115,33±23,11 105,61±14,44 115,06±11,29 112,33±6,4 0,89 0,08 0,97 0,008 3. Лейкоциты, 109/л 16,43±1,15 17,52±0,67 9,88±0,36 12,09±0,64 0,73 0,15 0,014 0,0003 п/я, % 1,5±0,70 3,00±2,64 2,60±1,77 1,88±1,26 0,50 0,08 0,42 0,33 с/я, % 78,33±15,88 73,67±3,21 71,80±5,02 68,46±8,57 0,90 0,11 0,16 0,32 лимфоциты,% 13,00±9,8 16,00±5,56 19,11±3,41 20,83±6,62 0,75 0,24 0,11 0,26 моноциты,% 7,00±1,00 6,66±1,15 6,54±2,37 7,46±1,98 0,56 0,68 0,75 0,52 Тромбоциты 282,67±16,76 177,00±4,04 252,93±9,46 290,00±10,09 0,65 0,10 0,53 0,04 4. 146 При гистологическом исследовании плаценты у пациенток с эндометритом признаки хориодецидуита и амниохориодецидуита наблюдались в 71,43±9,86%, в то время как в контрольной группе – в 29,69±5,71% (p<0,05) (табл. 70). Таблица 70 Результаты гистологического исследования у пациенток с эндометритом и в контроле(P±p) № Признак 1. Серозный хориодецидуит Пациентки с эндометритом (III)(n=21) 23,81±9,29 2. Гнойный хориодецидуит 33,33±10,29* 6,25±3,03 3. Гнойный 14,29±7,64 3,13±2,17 28,57±9,86 70,31±5,71* п/п Контрольная группа (IV)(n=64) 20,31±5,03 амниохориодецидуит 4. Зрелая плацентарная ткань, с компенсаторными реакциями * - p<0,05 Таким образом, основными клинико-анамнестическими особенностями у пациенток с послеродовым эндометритом были угроза прерывания беременности ранних сроков, которая может являться маркером наличия инфекции в полости матки, а также более низкий вес пациенток, что может быть связано с более высокой антигенной нагрузкой на килограмм веса пациентки. Роды у пациенток с послеродовым эндометритом характеризовались более длительным течением III периода, в случае оперативного родоразрешения – увеличением времени операции в среднем на 20 минут, а также большей кровопотерей. Из лабораторных показателей наиболее информативным были лейкоцитоз со сдвигом лейкоформулы влево и увеличение СОЭ, по данным эхографического исследования матки – увеличение ее передне-заднего размера. 147 5.2. Характеристика микробиоценоза женских половых путей на поздних сроках беременности и его роль в развитии послеродового эндометрита Для оценки микробиоценоза половых путей у пациенток с послеродовым эндометритом и с неосложненным послеродовым периодом проводилось бактериоскопическое исследование мазков из влагалища после их окраски по Граму. Различий в характере микрофлоры, частоте выявления дрожжеподобных грибов и «ключевых клеток» у пациенток с развившимся впоследствии эндометритом и с нормальным послеродовым периодом выявлено не было (табл. 71). Трихомонады и гонококки при бактериоскопическом исследовании не были обнаружены ни у одной пациентки. Таблица 71 Особенности бактериоскопической картины у пациенток обеих групп. № Признак Основная группа, Контрольная группа, III (n=21) IV (n=64) - палочковая, % 4,76±4,65 18,75±4,88 - кокковая, % 28,57±9,86 15,63±4,54 - смешанная, % 66,67±10,29 65,63±5,94 п/п 1. Характер микрофлоры: 2. Количество лейкоцитов 10,00 (6,00; 17,00) 3. Дрожжеподобные 12,00 (7,00; 17,00) 28,57±9,86 50,00±6,25 4,76±4,65 4,69±2,64 грибы, % 4. «Ключевые клетки», % 148 Все беременные были обследованы на ИППП методом прямой иммунофлуоресценции и ИФА. Возбудители заболеваний, передающихся половым путем (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы), с одинаковой частотой встречались у пациенток обеих групп (рис. 6). Ни у одной пациентки из основной (III) и контрольной (IV) группы не был выявлен трихомониаз, сифилис, остроконечные кондиломы, гонорея. 90 80 70 % 60 50 риск эндомет рит а 40 норма 30 20 10 ы ур еа п ла зм ы ик оп ла зм м хл ам ид ии 0 Рис. 6. Частота выявления ИППП у пациенток с эндометритом (n=21) и в контроле (n=64). На возникновение эндометрита у пациенток с высокой степенью инфекционного риска также не влияло количество возбудителей ИППП, одновременно обнаруживаемых у одной пациентки (рис. 7). У пациенток с неосложненным послеродовым периодом возбудители ЗППП отсутствовали чаще, чем в основной группе, однако различие между группами было недостоверным. 149 Так как основными возбудителями послеродовых эндометритов являются условно-патогенные микроорганизмы, пациенткам обеих групп было проведено бактериологическое исследование. 100% 80% 2 60% 1 40% 0 20% 0% риск эндометрита норма Рис. 7. Количество одновременно выявленных возбудителей ИППП у пациенток основной (III) (n=21) и контрольной (IV) (n=64) группы. Так как III и IV группы были изначально представлены пациентками с высокой степенью инфекционного риска, в обеих группах у одной пациентки одновременно высевалось до 5 представителей условно-патогенной флоры. Было установлено, что ассоциации микроорганизмов (3 и более возбудителя) у пациенток с развившимся в дальнейшем эндометритом выделялись в 1,4 раза чаще, чем у женщин, не имевших осложнений в послеродовом периоде (рис. 8). Количество пациенток, у которых условно-патогенные микроорганизмы не обнаруживались, было достоверно выше в группе контроля (20,31±5,03 и 4,76±4,5 соответственно) (p<0,05). 150 100% 90% 80% 5 и более 70% 60% 4 3 50% 40% 2 1 30% 20% не обнаружены* 10% 0% Риск развития эндометрита Нормальный послеродовый период Рис. 8. Доля беременных женщин из группы высокого инфекционного риска, у которых обнаруживались ассоциации микроорганизмов при эндометрите (III) (n=21) и в норме (IV) (n=64)(*-p<0,05). Был проанализирован состав аэробной и анаэробной бактериальной микрофлоры. Установлено, что большинство условно-патогенных микроорганизмов с одинаковой частотой присутствовали в обеих группах (рис. 9, прил. 5). Однако частота выявления микроорганизмов рода Staphylococcus была достоверно выше у пациенток с развившимся впоследствии эндометритом (80,95±8,57% по сравнению с 45,31±6,22% в контроле) (p<0,05)(рис. 10). Также у пациенток с развившимся впоследствии эндометритом достоверно чаще обнаруживались грамотрицательные аэробные бактерии рода Klebsiella (33,33±10,29% против 1,56±1,55% в контроле). Таким образом, стафилококк выделялся у пациенток основной группы в 2 раза чаще, а клебсиелла – в 20 чаще, чем в группе контроля (p<0,05). 151 30,00 25,00 20,00 эндометрит 15,00 нормальный послеродовый период 10,00 5,00 Enterobacter cloacae Candida Acinetobacter Streptococcus E. coli Proteus Enterococcus Corynebacterium 0,00 Рис. 9. Результаты бактериологического исследования аэробной флоры у пациенток с развившимся в дальнейшем эндометритом (III) (n=21) и неосложненным послеродовым периодом (IV) (n=64). 90,00 80,00 70,00 60,00 эндометрит 50,00 нормальный послеродов ый период 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Klebsiella* Staphylococcus* Рис. 10. Частота выявления клебсиеллы и стафилококков у пациенток с развившимся впоследствии послеродовым эндометритом (III) (n=21) и в контрольной группе (IV) (n=64) (p<0,05). 152 Была оценена видовая принадлежность стафилококков и выявлено, что увеличение частоты их высеваемости у пациенток с послеродовым эндометритом связано с наличием Staphylococcusepidermidis, который обнаруживался достоверно чаще у пациенток III группы (61,90±10,60% против 37,50±6,05% во IV группе)(p<0,05)(рис. 11). Частота обнаружения Staphylococcusaureus в обеих группах достоверно не отличалась. 70,00 60,00 эндометрит 50,00 40,00 нормальный послеродов ый период 30,00 20,00 10,00 0,00 St. epidermidis* St. aureus Рис. 11. Частота выявления эпидермального и золотистого стафилококка у пациенток с развившимся впоследствии послеродовым эндометритом (III) (n=21) и в контроле (IV) (n=64) (*- p<0,05). Анализ результатов бактериологического исследования анаэробной микрофлоры влагалища не выявил достоверных различий между основной и контрольной группой. Частота выявления большинства анаэробов в норме была несколько выше, чем в основной группе, однако эти различия не были достоверными (рис. 12). У пациенток с послеродовым эндометритом в 2 случаях был выявлен Citrobacter. Известно, что цитробактер является одной из самых частых причин внутрибольничных ангиогенных инфекций и инфекций мочевыводящих путей, он способен вызывать вспышки гастроэнтеритов и токсикоинфекций, 153 внутрибольничные инфекции, менингиты, абсцессы мозга, урологические заболевания, гнойные инфекции и сепсис у детей и взрослых [164]. Повидимому, в данном случае имел место гематогенный путь распространения инфекции, так как обе пациентки страдали хроническим пиелонефритом. 25,00 20,00 эндометрит 15,00 нормальный послеродовый период 10,00 Propionobacter Citrobacter Bacteroides Peptococcus 0,00 Clostridium 5,00 Рис. 12. Анаэробная микрофлора у пациенток с развившимся впоследствии послеродовым эндометритом (III) (n=21) и в группе контроля (IV) (n=64). Был также проведен сравнительный анализ влияния количества возбудителя на риск возникновения послеродового эндометрита. Выявлено, что у пациенток с развившимся эндометритом на поздних сроках беременности бактериальная обсемененность клебсиеллой была на 5 порядков выше, чем в контрольной группе, а эпидермальным стафилококком – на 2 порядка выше, чем в группе контроля. У других видов микроорганизмов бактериальная обсемененность не влияла на развитие воспалительного процесса. Таким образом, уровень бактериальной обсемененности не всегда играет роль в развитии послеродового эндометрита. 154 5.3. Особенности экспрессии TLR на поздних сроках беременности и их роль в развитии осложнений беременности и послеродового периода С целью оценки экспрессии мРНК TLR, лигандами которых являются бактериальные антигены, у пациенток с развившимся эндометритом и в контрольной группе была проведена количественная ПЦР. Установлено, что экспрессия мРНК TLR у пациенток с развившимся впоследствии эндометритом была достоверно ниже, чем в контроле (табл.72). Таблица 72 Экспрессия TLR в эпителии цервикального канала у беременных высокой степени инфекционного риска [Me(25%;75%)] № п/п Наименование С развившимся впоследствии эндометритом, III (n=21) 1. TLR1 0,0001 (0,00076; 0,0190) С нормально протекавшим послеродовым периодом, IV (n=64) 0,0002 (0,00001; 0,0012) 2. TLR2 1,54 (0,29; 4,24) 1,96 (0,10; 5,11) 3. TLR3 0,58 (0,11; 1,03) 0,34 (0,05; 0,93) 4. TLR4 0,095 (0,04; 1,24) 0,32 (0,09; 2,23)* 5. TLR5 0,0032 (0,0009; 0,0160) 0,090 (0,009; 0,0880)** 6. TLR6 2,44 (1,42; 4,84) 2,95 (1,66; 4,48) 7. TLR7 0,28 (0,18; 0,45) 0,23 (0,19; 0,44) 8. TLR8 0,0050 (0,0002; 0,142) 0,04 (0,0004; 0,19) 9. TLR9 0,38 (0,17; 0,86) 0,244 (0,19; 0,71) 10. TLR10 3,36 (1,51; 6,80) 2,44 (0,80; 9,09) 11. NF-kB 0,00001 (0,0000001; 0,000234) 0,0002 (0,00003; 0,1230)** 12. MyD88 0,0008 (0,00001; 0,00003) 0,0004 (0,0002; 0,00126) *- p<0,05; **- p<0,01 Не было выявлено достоверных отличий в уровнях экспрессии мРНК TLR1 и TLR2. Уровень экспрессии мРНК TLR1 был выше, а TLR2 – несколько ниже, чем в послеродовом периоде. Экспрессия мРНКTLR4 и TLR5 была 155 достоверно ниже у тех пациенток, которым в послеродовом периоде был выставлен диагноз послеродового эндометрита. Для мРНКTLR4 она составила 0,095 (0,04;; 1,24) против 0,32 (0,09;; 2,23)в контроле, для TLR5 0,0032 (0,0009; 0,0160) против 0,090 (0,009; 0,0880)в контроле (p<0,05). Таким образом, экспрессия этих рецепторов имеет прогностическое значение для оценки развития послеродовых гнойно-септических осложнений. Также была проведена оценка экспрессии белков MyD88-независимого пути во время беременности. Было установлено, что сниженная экспрессия NFkB является фактором риска развития послеродового эндомерита (0,00001 (0,0000001; 0,000234) в группе с развившимся впоследствии эндометритом и 0,0002 (0,00003; 0,1230)в контроле, p<0,01). Уровень экспрессии MyD88 у паценток с нормальным и осложненным течением послеродового периода не имел достоверных различий, так как он определялся в очень низких, пороговых значениях. Был проведен корреляционный анализ между концентрацией в цервикальной слизи условно-патогенных микроорганизмов и уровнем экспрессии TLR, лигандами которых являются нуклеиновые кислоты (табл. 73). Установлено, что экспрессия TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 и TLR10 имеет отрицательную корреляционную связь с концентрацией грамположительных и грамотрицательных бактерий, преимущественно умеренную и сильную. С целью оценки влияния TLR на развитие плацентарной недостаточности был проведен корреляционный анализ между их экспрессией в цервикальном канале и уровнем плацентарных гормонов в сыворотке крови (табл. 74). Выявлена умеренная достоверная корреляционная связь между экспрессией TLR1 и концентрацией в сыворотке крови эстрадиола и прогестерона (R=0,41; p<0,05 и R=0,35;; p<0,05). 156 Таблица 73 Корреляция между количеством микроорганизмов и экспрессией TLR1-10 в цервикальном канале на поздних сроках беременности (n=85), критерий Спирмена № п/п Наименование микроорганизма TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 1. Staphylococcusaureus, КОЕ/мл -0,19 -0,19 -0,55** -0,20 -0,35* -0,50** -0,46** -0,47** -0,31 -0,20 2. Staphylococcus epidermidis, КОЕ/мл -0,18 -0,01 -0,02 -0,28 -0,24* -0,02 -0,08 -0,07 0,09 0,07 3. Streptococcus, КОЕ/мл -0,31 -0,18 -0,48** -0,02 0,08 -0,28* -0,41* -0,41* -0,23 -0,24 4. Enterococcus, КОЕ/мл -0,27 0,17 0,003 -0,42** 0,32* -0,31** 0,016 0,02 -0,03 -0,009 5. Acinetobacter, КОЕ/мл -0,17 0,23 -0,62** 0,003 -0,52** -0,02 -0,51** -0,27** -0,27 -0,40* 6. Escherishia coli, КОЕ/мл -0,31 -0,01 -0,06 -0,61** -0,06 -0,07 -0,06 -0,16 0,03 -0,04 7. Corynebacterium, КОЕ/мл -0,13 -0,15 -0,15 -0,15 -0,15 -0,15 -0,23 -0,13 -0,18 -0,16 8. Klebsiella, КОЕ/мл 0,11 0,26 -0,48** -0,48** -0,32* -0,12 -0,15 -0,45 -0,31 -0,33* 9. Proteus, КОЕ/мл -0,31 -0,16 -0,02 --0,41 -0,02 -0,02 -0,05 -0,36* -0,05 -0,03 10. Enterobacter cloacae, КОЕ/мл -0,26 -0,08 -0,50** -0,02 -0,45** -0,15 -0,45** -0,53** -0,35 -0,39* 11. Propionobacter, КОЕ/мл 0,07 0,02 -0,41* -0,15 0,08 -0,11 -0,38* -0,34 -0,34 -0,33* 12. Citrobacter, КОЕ/мл 0,02 0,07 -0,41* 0,05 -0,12 -0,18 -0,38* -0,32 -0,31 -0,27 13. Clostridium, КОЕ/мл -0,13 0,01 -0,68** -0,38 -0,24 -0,18 -0,54** -0,66** -0,51** -0,39* 14. Peptococcus, КОЕ/мл -0,02 -0,27 -0,02 -0,02 -0,02 -0,24 -0,21 -0,15 -0,13 0,07 15. Bacteroides, КОЕ/мл -0,07 0,20 -0,03 -0,03 -0,03 -0,03 -0,13 -0,14 -0,05 -0,05 16. Candida, КОЕ/мл -0,34* -0,24 -0,72** -0,13 -0,10 -0,52** -0,68** -0,18 -0,59** -0,55** * - p<0,05; **-p<0,01 157 Таблица 74 Корреляция между экспрессией TLR и уровнем плацентарных гормонов в сыворотке крови на поздних сроках беременности, критерий Спирмена № Экспрессия TLR Эстриол Плацентарный п/п Прогестерон лактоген 1. TLR1 0,41* 0,034 0,35* 2. TLR2 -0,02 0,22 -0,07 3. TLR3 0,13 0,18 0,17 4. TLR4 0,20 0,07 0,07 5. TLR5 -0,27 0,13 0,04 6. TLR6 -0,01 0,16 -0,06 7. TLR7 -0,03 0,28 0,03 8. TLR8 -0,02 -0,01 0,06 9. TLR9 -0,07 0,09 -0,09 10. TLR10 -0,19 0,26 -0,04 * - p<0,05 С целью оценки влияния экспрессии TLR на состояние новорожденного был произведен корреляционный анализ. Установлено, что экспрессия TLR имела достоверную обратную корреляционную связь с оценкой по Апгар (таблица 75). Показано, что экспрессия TLR2 и TLR9 имела слабую положительную корреляционную связь с оценкой по шкале Апгар на 5-й минуте после родов (R=0,27;; p=0,036 и R=0,22;; p=0,01 соответственно). Достоверных различий с оценкой по Апгар на 1-й минуте выявлено не было. 158 Таблица 75 Корреляционный анализ влияния экспрессии TLR на состояние новорожденного (n=85), критерий Спирмена № п/п TLR Оценка по Апгар На 1-й минуте На 5-й минуте 1. TLR1 -0,11 0,15 2. TLR2 0,18 0,27* 3. TLR3 0,03 -0,03 4. TLR4 -0,24 -0,19 5. TLR5 -0,23 -0,19 6. TLR6 0,12 0,04 7. TLR7 0,13 0,11 8. TLR8 0,07 0,06 9. TLR9 -0,06 0,22** 10. TLR10 0,03 -0,06 * - p<0,05; **-p<0,01 С целью оценки роли TLR на течение периода новорожденности был проведен корреляционный анализ их экспрессии и длительности госпитализации детей, которая в ряде случаев удлинялась за счет перевода на второй этап выхаживания вследствие наличия осложнений инфекционного и гипоксического генеза (табл. 76). Установлено, что длительность госпитализации новорожденных имеет обратную корреляционную связь с экспрессией большинства TLR. Так, наблюдалась умеренная корреляционная связь между этим показателем и экспрессией бактериальных сигнальных рецепторов TLR1 (R=-0,40; p<0,01), TLR2 (R=-0,30; p<0,05) и TLR10 (R=-0,30; p<0,01). Кроме того, умеренная корреляционная связь была выявлена с TLR7, лигандом для которого является вирусная РНК (R=-0,39; p<0,01). Наблюдалась также слабая достоверная корреляционная связь с экспрессией TLR3, активируемой двухцепочечной вирусной РНК (R=-0,19; p<-0,05). 159 Таблица 76 Корреляция между экспрессией TLR в цервикальном канале и длительностью госпитализации новорожденных после родов (n=85), критерий Спирмена № п/п Экспрессия TLR R р 1. TLR1 -0,40 0,006 2. TLR2 -0,30 0,027 3. TLR3 -0,19 0,034 4. TLR4 0,23 0,10 5. TLR5 0,28 0,06 6. TLR6 -0,22 0,10 7. TLR7 -0,39 0,001 8. TLR8 -0,14 0,17 9. TLR9 -0,03 0,73 10. TLR10 -0,30 0,003 Также был проведен корреляционный анализ между экспрессией TLR 110 и наличием заболеваний у новорожденного (табл. 77). Выявлена отрицательная обратная корреляционная связь между реализацией ВУИ у новорожденного и экспрессией TLR6 (R=-0,19; p<0,05), TLR9 (R=-0,21; p<0,05) и TLR10 (R=-0,34;; p<0,05). Также отрицательная обратная связь отмечалась между гипоксической энцефалопатией и экспрессией TLR3 (R=-0,28;; p<0,05) и TLR7 (R=-0,28; p<0,05). Отсутствие заболеваний у новорожденных, напротив, имело слабую положительную корреляционную связь с экспрессией ряда TLR в цервикальном канале матери, в частности, с TLR3 (R=0,27; p<0,05), TLR6 (R=0,18;; p<0,05) и TLR10 (R=0,25; p<0,05). 160 Таблица 77 Корреляция между экспрессией TLR в цервикальном канале и заболеваниями новорожденных (n=85), бисериальная корреляция Обвитие Признак Здоровый новорожденный Реализация Гипоксическая ВУИ энцефалопатия СЗРП пуповины I-II вокруг ст. шеи плода TLR1 -0,11 0,05 -0,04 0,14 0,24 TLR2 -0,07 -0,12 0,06 0,03 0,15 TLR3 0,27* -0,1 -0,28* 0,09 0,11 TLR4 -0,12 0,01 0,05 0,14 -0,04 TLR5 -0,14 0,04 0,11 -0,11 0,02 TLR6 0,18* -0,19* -0,14 0,02 0,08 TLR7 0,17 -0,16 -0,28* 0,01 0,14 TLR8 0,03 0,01 0,21 -0,02 0,008 TLR9 -0,16 -0,21* 0,06 0,02 -0,1 TLR10 0,25* -0,34* -0,17 -0,02 0,13 * - p<0,05 Была исследована экспрессия TLR 1-10 и белков их сигнального пути на 3 сутки послеродового периода у пациенток с развившимся эндометритом (III группа) и с неосложненным послеродовым периодом (IV группа) (табл. 78). В группе пациенток с послеродовым эндометритом (III) не было отмечено достоверных различий в экспрессии мРНК TLR1 и TLR2 в цервикальном канале в сравнении с пациентками контрольной группы (IV). Однако у них наблюдалась в 4 раза более низкая экспрессия мРНК TLR4 и в 6 раз более низкая экспрессия мРНКTLR5. 161 Таблица 78 Экспрессия TLR в эпителии цервикального канала у пациенток с послеродовым эндометритом и в контроле [Me(25%;75%)] № Гены Пациентки с эндометритом , III Контрольная группа, (n=21) IV(n=64) 1. TLR1 1,76 (0,43; 5,82 ) 0,77 (0,14; 11,27) 2. TLR2 4,69 (0,47; 19,23) 2,77 (0,41; 35,38) 3. TLR3 0,002 (0,001; 0,056) 0,003 (0,001; 0,039) 4. TLR4 0,12 (0,04; 0,52) 0,49 (0,07; 1,05)* 5. TLR5 0,027 (0,006; 0,103) 0,164 (0,022; 0,391)* 6. TLR6 0,0047 (0,0009; 0,0219) 0,012 (0,003; 0,088) 7. TLR7 0,000006(0,000001; 0,000030) 0,000007 (0,000002; п/п 0,000013) 8. TLR8 0,00001 (0,00001; 0,00030) 0,000014 (0,000002; 0,00024) 9. TLR9 5,13 (0,58; 62,24) 5,01 (1,69; 24,76) 10. TLR10 0,000005 (0,000002; 0,000070) 0,000003 (0,000001; 0,00001) 11. NF-kB 0,00015 (0,00001; 0,00108) 0,00358 (0,00017; 0,00097)* 12. MyD88 0,0000001 (0,0000001; 0,000001) 0,000002 (0,000001; 0,00001)* * - p<0,05; **-p<0,01 Для того, чтобы оценить влияние снижения экспрессии мРНКTLR4 и TLR5 на другие звенья врожденного иммунитета, определяли экспрессию мРНК белков MyD88-зависимого сигнального пути. Было выявлено, что у 162 пациенток с послеродовым эндометритом уровень экспрессии мРНКNF-kB был в 24 раза ниже, а мРНКMyD88 – в 20 раз ниже, чем в группе контроля. Между уровнем экспрессии мРНКMyD88 и мРНКNF-kB наблюдалась умеренная корреляционная связь (R=0,42, p<0,05). Таким образом, инфекционно-воспалительные осложнения у матери и новорожденного в большинстве случаев развиваются в связи со снижением экспрессии TLR, преимущественно активируемых бактериальными лигандами или двухцепочечной РНК вирусов. Сниженная экспрессия TLR коррелирует с увеличением бактериальной обсемененности женских половых путей. Это ставит вопрос о необходимости коррекции экспрессииTLR с помощью специфических лигандов, что может способствовать профилактике инфекционно-воспалительных осложнений в акушерстве. 163 ГЛАВА 6. АЛГОРИТМ ВЕДЕНИЯ ПАЦИЕНТОК С ВЫСОКИМ РИСКОМ ПОСЛЕРОДОВЫХ ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ 6.1. Профилактика и лечение прослеродового эндометрита с помощью лигандов Толл-подобных рецепторов В связи со способностью нормальной микрофлоры стимулировать экспрессию TLR, лигандами которых являются бактериальные структуры, в частности, флагеллин, в качестве препарата для профилактики послеродового эндометрита был использован КП, содержащий лиофилизат ацидофильных лактобактерий (50 мг) и эстриол (30 мкг). Было установлено, что интравагинальное применение КП приводит к достоверному снижению количества пациенток, половые пути которых были контаминированы эпидермальным стафилококком (61,76±8,33% до лечения и 38,24±8,33% после лечения, p<0,05). Частота выявления других аэробных микроорганизмов не имела достоверных различий у пациенток с эндометритом и в контроле (рис. 13, прил. 6). Количество женщин, у которых выявлялись нормальные представители микробной флоры - лакто- и бифидобактерии, на фоне применения КП имело тенденцию к увеличению, которое, однако, не было достоверным (р>0,05) (рис. 14). 164 70,00 60,00 % 50,00 40,00 до лечения 30,00 после лечения 20,00 10,00 Рис. 13. Частота E. co En li te ro P ba ro te ct us er cl oa ce Ac ae in et ob ac te r St .e pi de rm id is* St .a ur En eu te s ro co cc us St r. Kl vir eb id sie an s lla pn Co eu ry ne m . ba ct er iu m 0,00 выявления аэробных условно-патогенных микроорганизмов до и после применения КП, содержащего лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол (n=34) (* - p<0,05). 100 90 80 70 % 60 до лечения 50 после лечения 40 30 20 10 0 Lactobacillus Bifidobacterium Рис. 14. Частота выявления лакто- и бифидобактерий на фоне применения КП, содержащего лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол (n=34). 165 На фоне интравагинальной терапии КП наблюдалась элиминация из влагалищного биотопа анаэробных условно-патогенных микроорганизмов – пептококков (11,76±5,53% до лечения и полная элиминация после лечения, p<0,05) (рис. 15). 14,00 12,00 10,00 до лечения 6,00 после лечения % 8,00 4,00 2,00 0,00 Peptococcus* Bacteroides Clostridium Candida albicans Рис. 15. Частота выявления анаэробных бактерий и дрожжеподобных грибов до и после применения КП, содержащего лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол (n=34) (* - p<0,05). Был также проведен анализ бактериальной обсемененности по методу Коха до и после использования КП. Было установлено, что наблюдалось снижение концентрации основных условно-патогенных микроорганизмов – эпидермального и золотистого стафилококков, клебсиеллы, кишечной палочки, пептококка - на 2-3 порядка. Таким образом, КП, содержащий лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол, способствует элиминации условно-патогенных 166 аэробных и анаэробных микроорганизмов из половых путей, а также уменьшает бактериальную обсемененность. После интравагинального применения КП, содержащего лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол, наблюдалось достверное увеличение продукции TLR5 и TLR10 (табл. 79). Уровни экспрессии TLR1, TLR2, TLR4 и TLR9 достоверно не изменялись. После профилактики КП во время беременности с последующим назначением антибактериальной терапии в послеродовом периоде только у одной пациентки (2,9±2,9%) развился послеродовый эндометрит. Данный факт может свидетельствовать о возможном протективном действии препаратов эубиотиков при акушерской инфекционной патологии. Таблица 79 Особенности экспрессии TLR, лигандами которых являются бактериальные структуры, до и после применения КП, содержащего лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол [Me(25%;75%)] № Гены п/п До применения КП После применения (n=34) КП (n=34) 1. TLR1 0,0001 (0,00086; 0,0260) 0,0002 (0,00001; 0,00080) 2. TLR2 1,37 (0,32; 3,24) 1,06 (0,10; 7,11) 3. TLR4 0,329560 (0,039145; 0,243948 (0,009099; 0,257920) 0,158219) 4. TLR5 0,0021 (0,00086; 0,0260) 0,0080 (0,0006; 0,0480)* 5. TLR9 5,87 (1,07; 16,91) 12,77 (4,65; 40,50) 6. TLR10 6,39 (0,79; 26,91) 180,70 (20,85; 615,23)* * - p<0,05 167 6.2. Алгоритм ведения пациенток в зависимости от уровня экспрессии Толл-подобных рецепторов Следующей задачей исследования было создание способа прогнозирования ГСЗ в послеродовом периоде в зависимости от уровня экспрессии TLR, пригодного для применения в условиях стационара и алгоритма ведения пациенток, угрожаемых по развитию послеродовых ГСЗ. Техническим результатом использования данного способа является получение критериев оценки риска развития послеродового эндометрита, которые позволяют определить клинический прогноз и тактику ведения женщины в послеродовом периоде и снизить экономические затраты за счет уменьшения количества койко-дней пребывания пациенток в послеродовом отделении. В предыдущих главах было показано, что у пациенток с послеродовым эндометритом наблюдается снижение экспрессии мРНК сигнальных рецепторов врожденного иммунитета, в частности, TLR4, TLR5 и NF-kB. Такая же закономерность прослеживается и у пациенток на поздних сроках беременности. Следовательно, экспрессию мРНК TLR4, TLR5 и NF-kB на поздних сроках беременности можно использовать для прогноза развития послеродового эндометрита. В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования развития послеродового эндометрита (табл. 80), основанный на определении экспрессии TLR4, TLR5 и NF-kB, включающий: -выделение РНК из эпителиальных клеток цервикального канала у женщин на поздних сроках беременности или на 3 сутки после родов;; -обратную транскрипцию с получением кДНК;; -количественую полимеразную цепную реакцию;; 168 -прогнозирование развития послеродового эндометрита на основании снижения экспрессии TLR5 и NF-kB ниже нормальных значений. Новизна способа заключается в том, что в настоящее время не известна возможность прогнозирования развития послеродового эндометрита на основании определения экспрессии TLR4, TLR5 и нуклеарного фактора-kB. Таблица 80 Алгоритм ведения пациенток в зависимости от уровня экспрессии TLR Определение экспрессии TLR4, TLR 5 и NF-kB Беременность 38-41 нед. 3 сутки после родов Экспрессия TLR4<1,24 TLR 5 < 0,016 NF-kB< 0,000234 Экспрессия TLR4>1,24 TLR 5 > 0,016 NF-kB> 0,000234 Комплексная терапия с использованием эубиотиков интравагинально 1р/д 6 дней Прогнозируется нормальное течение послеродового периода Экспрессия TLR4<0,52 TLR 5 < 0,103 NF-kB< 0,00108 Прогнозируется развитие послеродового эндометрита, антибактериальная терапия в соответствии с результатами бактериологического исследования Экспрессия TLR4>0,52 TLR 5 > 0,103 NF-kB> 0,00108 Прогнозируется нормальное течение послеродового периода При снижении экспрессии одного или более показателя (TLR4<1,24, TLR 5<0,016, NF-kB<0,000234) в эпителии цервикального канала на поздних сроках беременности женщина может быть отнесена к группе высокого риска по развитию послеродовых ГСЗ. Во время беременности ей показано назначение интравагинальной терапии КП, содержащим лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол,по 1 свече 1 раз в сутки в течение 6 дней. При экспрессии TLR4>1,24, TLR5>0,016, NF-kB>0,000234 прогнозируется нормальное течение послеродового периода. 169 На 3 сутки после родов при снижениии одного или более показателя (TLR4<0,52, TLR5<0,103, NF-kB<0,00108) прогнозируется развитие послеродового эндометрита и целесообразно назначение антибактериальной терапии в соответствии с результатами бактериологического исследования. При величине экспрессии TLR4>0,52, TLR5>0,103, NF-kB>0,00108 прогнозируется нормальное течение послеродового периода. Была проанализирована эффективность использования данного способа прогнозирования послеродового эндометрита во время беременности по сравнению с его прогнозированием на основании ранее предложенных клинических данных. Среди 85 беременных из группы высокой степени инфекционного риска, выделенных на основании анамнестических, клинических данных и результатов лабораторных и инструментальных методов исследования, послеродовый эндометрит развился у 21 пациентки (24,71±4,68%). У 31 пациентки от общего количества беременных группы высокого инфекционного риска наблюдалось снижение экспрессии TLR4, TLR5 и NF-kB ниже нормальных значений. Из них послеродовый эндометрит развился у 21 пациентки (67,74±8,40%), что было достоверно выше, чем при использовании только клинических данных (p<0,01). Таким образом, предлагаемый метод позволяет повысить эффективность прогнозирования послеродового эндометрита на 43,03%. Эффективность лечения оценивали на основании сравнения групп высокой степени инфекционного риска III и IV (n=85), не получавших КП, содержащий лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол, с группой V (n=34), которой проводилась комплексная профилактика с использованием интравагинальных эубиотиков. После профилактики КП в послеродовом периоде только у одной пациентки (2,9±2,9%) развился послеродовый эндометрит, в то время как из 85 пациенток группы сравнения (III и IV группа) 170 эндометрит развился у 21 женщины (24,7±4,7%) (p<0,05). Таким образом, использование КП, содержащего лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол, в профилактике послеродовых ГСЗ у пациенток высокой степени инфекционного риска позволяет снизить частоту развития послеродового эндометрита с 24,7±4,7% до 2,9±2,9% (на 21,8%). 171 ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ С целью оценки роли социально-биологических, клинических, микробиологических и иммунных факторов в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков было обследовано 114 пациенток на сроке беременности 6-10 недель, из них 57 - с самопроизвольными выкидышами на сроке 6-10 недель (основная группа) и 57 женщин с беременностью того же срока и с низкой степенью инфекционного риска, которым был произведен искусственный аборт по желанию женщины (контрольная группа). Длительность госпитализации в основной группе была в 3,5 раза больше, чем в контроле, что предусмотрено стандартами медицинской помощи для дополнительного обследования женщин с целью уточнения причины самопроизвольного выкидыша. Было установлено, что среди пациенток с невынашиванием беременности преобладали женщины с высшим образованием, в то время как в группе контроля – со средним. Данный факт, скорее, характеризует особенность пациенток группы контроля, а не основной группы. Женщины с высшим образованием чаще используют контрацептивы, поэтому реже прибегают к искусственному прерыванию беременности [94]. Большинство женщин основной группы состояли в браке, чем достоверно отличались от пациенток из группы контроля. Полученные данные согласуются с результатами других исследований, согласно которым, в когорте женщин 3039 лет наименьшее количество абортов наблюдается у женщин с высшим образованием, состоящих в браке [30]. Исходя из данных акушерско-гинекологического анамнеза было установлено, что характер менструальной функции у пациенток обеих групп достоверно не отличался. Однако пациентки с самопроизвольными выкидышами отличались достоверно более поздним началом половой жизни, 172 чем в контрольной группе. По-видимому, это в большей степени характеризует особенности полового поведения контрольной группы. Общее количество беременностей в основной группе и группе контроля достоверно не отличалось. Однако у пациенток основной группы в анамнезе было достоверно меньшее число родов и абортов по сравнению сконтрольной группой. Количество же самопроизвольных выкидышей в анамнезе у женщин основной группы, напротив, было значительно выше, чем в контроле. У большинства женщин основной группы (66,67±6,24%) данное самопроизвольное прерывание беременности было вторым и более, что позволяет говорить о наличии привычного невынашивания у этих пациенток [24, 101]. Известно, что при наличии привычного невынашивания в анамнезе вероятность самопроизвольного выкидыша составлет около 35%. В то же время, роды в анамнезе являются прогностически благоприятным фактором [115]. У пациенток основной и контрольной группы в анамнезе был выявлен ряд гинекологических заболеваний, однако различия между обеими группами по отдельным нозологическим формам были недостоверными. Тем не менее, доля пациенток основной группы, у которых в анамнезе не было гинекологических заболеваний, была достоверно ниже, чем в контрольной, что позволяет рассматривать наличие любых гинекологических заболеваний как дополнительный фактор риска невынашивания беременности. Это подтвержается данными литературы, согласно которым, у пациенток с невынашиванием беременности гинекологические заболевания наблюдаются в 2-3 раза чаще [18]. Большинство видов экстрагенитальных заболеваний с одинаковой частотой выявлялось у пациенток основной и контрольной групп, за исключением аллергических реакций на препараты, которые достоверно чаще встречались в основной группе по сравнению с группой контроля. В последних исследованиях было показано, что существует взаимосвязь между степенью 173 тяжести аллергических реакций, в частности, бронхиальной астмы, и уровнем экспрессии ТLR. Экспрессия TLR1, 2, 4, 7 и 8 на моноцитах периферической крови возрастает у пациентов с частыми обострениями астматического процесса [315]. Гиперактивация TLR, описанная далее, у пациентов с атопическими реакциями может способствовать запуску воспалительного каскада и прерыванию беременности. Были проанализированы результаты клинического обследования у пациенток обеих групп. Согласно данным литературы, железодефицитная анемия является одним из факторов риска невынашивания беременности, что связано с развитием тканевой гипоксии [11, 33, 38]. В общем анализе крови у женщин с самопроизвольным прерыванием беременности отмечался достоверно более низкий уровень эритроцитов (на 0,2*1012/л.) и гемоглобина (на 6,6 г/л) по сравнению с группой контроля, что подтверждается данными литературы. Кроме того, более низкие показатели уровня гемоглобина и эритроцитов могут быть следствием кровопотери у пациенток с самопроизвольными выкидышами. Количество лейкоцитов и тромбоцитов, а также состав лейкоформулы у пациенток обеих групп достоверно не отличались. Были проанализированы данные коагулограммы и установлено, что у пациенток с самопроизвольными выкидышами протромбиновый индекс был достоверно выше в среднем на 10%, чем в контроле. Хотя это не сопровождалось изменениями других показателей коагулограммы, повышение протромбинового индекса может рассматриваться как тенденция к гиперкоагуляции в основной группе. Согласно данным литературы, первичная и вторичная тромбофилия могут быть причинами невынашивания беременности ранних и поздних сроков [84, 118, 126]. Пациенткам основной и контрольной групп было проведено гистологическое исследование соскоба из полости матки. Было установлено, 174 что более чем в половине случаев у пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности наблюдались признаки воспаления в эндометрии и трофобласте, в то время как в контрольной группе они наблюдались только у каждой пятой женщины. Это подтверждается данными литературы, согласно которым воспалительные процессы в эндометрии занимают одно из ведущих мест в патогенезе невынашивания беременности [42, 122, 237]. Дистрофические изменения в децидуальной ткани у женщин с невынашиванием наблюдались в 10 раз чаще, чем в группе контроля, что также сопоставимо с данными литературы [63]. Кроме того, в основной группе наблюдался тромбоз сосудов и очаги некроза в децидуальной ткани, а также гиалиноз сосудов децидуальной ткани. У пациенток с прогрессирующей беременностью раннего срока признаки воспаления в трофобласте наблюдались только в одном случае из пяти. По данным бактериоскопического исследования было установлено, что палочковая флора с одинаковой частотой встречалась у пациенток с невынашиванием и в контрольной группе. Однако у пациенток с самопроизвольными выкидышами кокковая флора выявлялась в 4 раза чаще по сравнению с контролем, в то время как в группе контроля достоверно чаще встречалась смешанная флора. У пациенток обеих групп не было выявлено достоверных различий числа лейкоцитов и эпителиоцитов в поле зрения. В современной литературе описаны особенности микробиоценоза женских половых путей у пациенток с невынашиванием беременности в I триместре. Так, Т.Н. Савченко с соавт. (2008, 2012) показали, что у беременных с невынашиванием по сравнению со здоровыми пациентками имели место дисбиозы II и III степени, характеризующиеся развитием дисбактериоза или вагинита [60, 64, 93]. У пациенток с невынашиванием беременности в 64% случаев наблюдается повышенная бактериальная обсемененность при бактериологическом исследовании (Пересада О.А. с соавт., 2010), чаще 175 выявляются представители кокковой микрофлоры [69]. Л.И. Мальцева (2010) отмечает, что в последние годы отмечается изменение этиологической структуры инфекционной заболеваемости у женщин с заменой грамотрицательной микробной флоры на грамположительную кокковую [58]. Характерно, что наряду со стафилококками определяющую роль стал играть стрептококк-Д — энтерококк, резистентный даже к антибиотикам резерва. Стабильно удерживают свои позиции среди этиологических факторов воспалительных заболеваний неспорообразующие анаэробы (пептококки, пептострептококки, бактероиды, фузобактерии, вейлонеллы и др.), а их выявление по-прежнему остается непреодолимой трудностью для практического здравоохранения. Не было выявлено достоверных различий между пациентками основной и контрольной группы в выявлении возбудителей ИППП и условно-патогенных микроорганизмов. Анализ иммунного статуса у пациенток с самопроизвольными выкидышами и в группе контроля выявил, что экспрессия ряда TLR в эпителии цервикального канала у пациенток с самопроизвольными выкидышами была выше, чем в группе контроля. Так, у пациенток с самопроизвольными выкидышами наблюдалась достоверно более высокая по сравнению с контролем экспрессия мРНК TLR1, а также TLR2. Лигандами этих TLR являются липопептиды и липотейхоевая кислота грамположительных бактерий, белки теплового шока хозяина 70 (HsP70) и зимозан грибов. Это сопровождалось достоверно более высокой экспрессией в основной группе TLR10, лиганд для которого неизвестен, однако, предположительно, является структурой бактериальной природы. Наблюдалось также увеличение экспрессии мРНК TLR4, лигандом которого являются липополисахариды грамположительных бактерий, а также фибриноген, гепаринсульфатные фрагменты и гиалуроновая кислота хозяина. 176 Однако экспрессия TLR5, активируемого флагеллином, достоверно не изменялась. Достоверных различий экспрессии мРНК TLR6 у пациенток обеих групп также не наблюдалось. Также была проанализирована экспрессия TLR, лигандами которых являются нуклеиновые кислоты – TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9. Достоверных различий в экспрессии этих рецепторов у пациенток с невынашиванием и в контроле отмечено не было. Интересно, что в целом в эпителии цервикального канала наблюдалось усиление экспрессии TLR, активируемых бактериальными лигандами. Полученные данные соотносятся с данными литературы, согласно которым повышенная экспрессия TLR, преимущественно активируемых бактериальными лигандами, у различных видов млекопитающих может играть роль в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков [57,148, 354]. Однако, эти данные касались в основном увеличения экспрессии TLR в эндометрии. Исследования О.В. Макарова с соавт. (2008) показали, что во втором и третьем триместре преждевременные роды достоверно чаще происходят в тех случаях, когда у пациенток наблюдается увеличение экспрессии TLR2 и TLR4 в цервикальном канале от 2 до 5 раз [117]. На моделях животных было показано, что индукция самопроизвольных выкидышей происходит через активацию TLR4, которая запускается липополисахаридами грамотрицательных бактерий [211, 260]. Введение липополисахаридов также увеличивает содержание в сыворотке крови матери провоспалительных цитокинов - фактора некроза опухоли-α (TNF-α), IL-6 и IL1α [265], что может влиять на системный и местный иммунный ответ. Активация NF-kB, вызванная стимуляцией TLR, может приводить к увеличению синтеза циклооксигеназы (COX-2) и, как следствие, – выработке простагландинов [206, 250, 254]. По-видимому, активация экспрессии TLR, 177 лигандами которых являются бактериальные структуры, способствует местному синтезу простагландинов вследствие активации NF-kB преимущественно по MyD88-зависимому пути [215]. В других работах было показано, что активация TLR4 способствует увеличению экспрессии одновременное действие TLR2, что позволяет предположить, что нескольких возбудителей способно вызвать избыточный иммунный ответ [184]. По-видимому, гиперактивация TLR1, TLR2, TLR4 и TLR10 способствует синергичной стимуляции выработки провоспалительных цитокинов и индукции воспалительной реакции, что приводит к отторжению плодного яйца и самопроизвольному выкидышу. Увеличение в эпителии цервикального канала экспрессии TLR, активируемых бактериальными лигандами, может свидетельствовать о том, что именно бактериальная флора нижних отделов половых путей, а не вирусы, играют роль в гиперактивации активации иммунного ответа в эпителии цервикального канала. Был проведен корреляционный анализ экспрессии мРНК различных Толл-подобных рецепторов в цервикальном канале в общей выборке. Отмечалась достоверная сильная корреляционная связь между уровнем экспрессии мРНК TLR1 и TLR2 (R=0,76;; p=0,000028). Это соотносится с данными литературы, согласно которым TLR1 и TLR2 формируют гетеродимерный комплекс, что необходимо для распознавания триацетилированных липопептидов [219]. Наблюдалась умеренная достоверная корреляция между экспрессией мРНК TLR1 и TLR10 (R=0,51;; p=0,009) и TLR2 и TLR10 (R=0,45; p=0,0003). Полученные данные подтверждают данные литературы, согласно которым TLR10 образует гетеродимерный комплекс с TLR1иTLR2 [213]. Филогенетический анализ выявил, что TLR10 наиболее сходен с TLR1 и TLR6, которые активируются в кооперации с TLR2 [191]. Y. Guanetal. (2010) показали, 178 что TLR10 для распознавания лигандов требуется TLR2, однако его внутриклеточный сигнальный путь отличается от других ассоциированных с TLR2 рецепторов [214]. Среди рецепторов, лигандами которых являются бактериальные структуры, была выявлена также умеренная взаимосвязь между экспрессией мРНК TLR1 и TLR4 (R=0,39; p=0,049). Экспрессия мРНК TLR5, лигандом которого является флагеллин, не имела достоверной корреляции ни с одним из Толл-подобных рецепторов. Среди рецепторов, лигандами которых являются нуклеиновые кислоты, отмечалась высокодостоверная умеренная положительная корреляция экспрессии мРНК TLR3 и TLR2 (R=0,35;; p=0,006) и TLR3 и TLR10 (R=0,43;; p=0,0001). Также наблюдалась достоверная умеренная корреляционная связь TLR7, лигандом которого является одноцепочечная РНК, с TLR10 (R=0,32;; p=0,006). Не было выявлено достоверной корреляции TLR с TLR8. В литературе не было обнаружено объяснений данных корреляционных связей. Однако обращает на себя внимание тот факт, что корреляционные связи между TLR одной локализации (эпителий цервикального канала) были положительными во всех случаях. Корреляция между экспрессией TLR, активируемых вирусными и бактериальными лигандами, также была положительной. Был произведен корреляционный анализ экспрессии TLR в основной и контрольной группах, и установлено, что в группе с самопроизвольными выкидышами наблюдается меньше корреляционных взаимосвязей, чем в контрольной группе. Была также проанализирована взаимосвязь экспрессии мРНК TLR с данными акушерско-гинекологического анамнеза. Отмечалась достоверная положительная корреляционная связь между количеством неразвивающихся беременностей в анамнезе и экспрессией TLR1(R=0,52; p=0,007), TLR2 (R=0,41; 179 p=0,001) и TLR10 (R=0,39;; p=0,0006), лигандами которых являются бактериальные структуры. Экспрессия мРНК TLR6 имела умеренную достоверную корреляционную связь с количеством выкидышей в анамнезе (R=0,33;; p=0,043). Также наблюдалась положительная корреляция между данным признаком и экспрессией TLR7 (лиганд – одноцепочечная РНК) (R=0,30;; p=0,011). Данные результаты еще раз доказывают роль гиперактивации вышеуказанных типов TLR в патогенезе самопроизвольных выкидышей. При этом более выраженная корреляция наблюдается между количеством самопроизвольных прерываний беременности и экспрессией в цервикальном канале TLR, активируемых бактериальными лигандами. Отмечалась достоверная отрицательная корреляционная обратная связь уровня экспрессии TLR1 и TLR2 в общей выборке в зависимости от срока беременности (R=-0,51;; p=0,009 и R=-0,29;; p=0,026 соответственно). В основной и контрольной группах по отдельности корреляционной зависимости между сроком прерывания беременности и уровнем экспрессии TLR выявлено не было. Снижение экспрессии TLR с увеличением гестационного срока косвенно подтверждает гипотезу, выдвинутую K. Koga et al. (2009), согласно которой в первом триместре гестации наблюдается сдвиг в сторону провоспалительных реакций, который во втором триместре сменяется развитием иммунной толерантности [353]. Интересно, что вес пациенток и в основной, и в контрольной группах умеренно коррелировал с уровнем экспрессии TLR3, а контроле – также с TLR2 и TLR7. И хотя, по данным литературы, избыточный вес коррелирует с увеличением преимущественно с экспрессией TLR2 и TLR4 [330, 305], повышенная экспрессия TLR3 также может приводить к ожирению и нарушению толерантности к глюкозе [259]. Проведенный корреляционный анализ показал, что экспрессия TLR коррелировала с показателями лейкоформулы. Так, была выявлена сильная 180 отрицательная обратная связь между общим количеством лейкоцитов и уровнем экспрессии мРНК TLR1. Данные литературы о взаимосвязи количества лейкоцитов и экспрессией TLR1 отсутствуют. Экспрессия TLR6 имела положительную умеренную связь с количеством палочкоядерных нейтрофилов (R=0,49;; p=0,023). Обратная закономерность наблюдалась для палочкоядерных нейтрофилов и экспрессии рецепторов TLR3 и TLR8 (R=-0,052;; p=0,001 и R=-0,54;; p=0,02 соответственно). По-видимому, прямая взаимосвязь наблюдалась между палочкоядерными нейтрофилами (сдвиг лейкоформулы влево) и TLR6, активируемым бактериальными лигандами. Так как для вирусных инфекций характерен сдвиг лейкоформулы вправо (лимфоцитоз), то экспрессия рецепторов, активируемых вирусными лигандами (TLR3 и TLR8) имела обратную корреляционную зависимость с количеством палочкоядерных нейтрофилов. Количество сегментоядерных нейтрофилов имело умеренную обратную корреляционную взаимосвязь с TLR2 (R=-0,36;; p=0,04), что также не описано в литературе. Уровень TLR10 коррелировал с количеством моноцитов в периферической крови (R=0,43;; p=0,005). Лиганд и клетки, экспрессирующие TLR10, неизвестны [147, 262], однако предположительно он активируется структурами бактериальной природы. Вероятно, он может экспрессироваться на клетках макрофагально-моноцитарного ряда. Отсутствие корреляции с уровнем экспрессии TLR количества эритроцитов и тромбоцитов, а также уровня гемоглобина можно считать закономерным. Не было выявлено корреляционной взаимосвязи между экспрессией мРНК TLR и показателями коагулограммы. Также было проведено исследование экспрессии TLR в эндометрии у пациенток с самопроизвольными выкидышами и в контроле и проведен корреляционный анализ с их экспрессией в цервикальном канале. Было 181 установлено, что в эндометрии, в отличие от шейки матки, наблюдалось снижение экспрессии ряда TLR. В частности, экспрессия мРНК TLR4E в эндометрии у пациенток с самопроизвольными выкидышами была в 1,5 раза ниже, чем в группе контроля. Это сопровождалось снижением более чем в 100 раз экспрессии в эндометрии другого TLR, активируемого бактериальными лигандами (липопротеинами, липотейхоевой кислотой, а также зимозаном грибов) – TLR6E. Также наблюдалось снижение почти в 2 раза экспрессии в эндометрии TLR8E, активируемого одноцепочечной РНК вирусов. Экспрессия в эндометрии TLR3E, активируемого двухцепочечной РНК, напротив, в основной группе была в 1,7 раза выше, чем группе контроля. Таким образом, экспрессия TLR в шейке матки и эндометрии у пациенток с невынашиванием имела разнонаправленный характер. В то время как в цервикальном канале наблюдалось ее увеличение, в эндометрии количество рецепторов, активируемых бактериальными лигандами, было снижено по сравнению с контролем. В то же время наблюдалось увеличение экспрессии мРНК TLR3. Данные об увеличении экспрессии TLR3 в эндометрии у пациенток с самопроизвольными выкидышами ранних сроков у человека получены впервые. TLR3 является рецептором, лигандом для которого служит двухцепочечная РНК вирусов, в частности, таких, как герпесвирус, папилломавирус и цитомегаловирус. Патогенетическая роль вирусной инфекции, особенно протекающей бессимптомно или субклинически, широко обсуждается в клинических работах. Это обсуждение касается в том числе индивидуальной чувствительности организма матери и плода к наличию вирусной инфекции и обусловленной этим тяжести заболевания, так само по себе наличие вирусной инфекции в полости матки еще не предполагает развития гестационных осложнений [278, 279]. Поэтому в настоящее время на мышах разрабатываются модели, на которых изучается влияние вирусной 182 инфекции на систему врожденного иммунитета, а также и на иммунный ответ на бактериальные антигены. В экспериментах на мышах было показано, что введение в полость матки полицитидиловой кислоты, являющейся лигандом для TLR3, приводит к преждевременным родам [245]. Было показано, что полицитидиловая кислота, являющаяся лигандом TLR3, у мышей индуцирует резорбцию и сингенных, и аллогенных эмбрионов [156]. Доказательством того, что резорбция эмбрионов происходит вследствие активации TLR3, является тот факт, что блокада TLR3 специфическими антителами отменяет влияние полицитидиловой кислоты на эмбрион [333]. Те же авторы позднее продемонстрировали, что полицитидиловая кислота на ранних сроках беременности активирует маточные натуральные киллеры, и, вероятнее всего, является причиной резорбции эмбрионов [333]. В экспериментах на мышах, инфицированных мышиным вирусом герпеса (MHV-68), было показано, что TLR3 способен запускать механизмы, контролирующие репликацию вируса, так как у нокаутированной линии мышей количество вирусных единиц было на порядок больше, чем у нормальной [359]. Там же было показано, что вирус простого герпеса требует усиленной активации TLR1 и TLR2 для своей репликации, что открывает возможности для использования антагонистов этих рецепторов в качестве ингибиторов вирусной репликации. Кроме того, по данным литературы, вирусная инфекция может влиять на исход бактериальной инфекции. В настоящее время иммунологические механизмы этого явления изучаются. Было показано, что у инфицированных мышиным герпесом беременных мышей, которым затем вводили липополисахарид, являющийся лигандом TLR4, как правило, наблюдалось прерывание беременности. В то же время, у неинфицированной герпесом контрольной группы при введении тех же доз липополисахаридов 183 беременность прогрессировала [275]. Кроме того, в работеK. Racicotetal. (2013) было показано, что наличие вирусной инфекции в эндоцервиксе способствует развитию восходящей бактериальной инфекции во время беременности [360]. Эти данные свидетельствуют о том, что вирусная инфекция во время беременности увеличивает риск ее прерывания в ответ на бактериальные лиганды. Косвенно этот факт также подтверждается многолетними клиническими наблюдениями особенностей течения вирусных инфекций. Так, во время пандемии гриппа 1918 года наблюдалась высокая частота потери беременности у заболевших женщин [128], а эпидемия 2008-2010 года, вызванная вирусом H1N1, приводила к высокой летальности у беременных [279]. В обоих случаях вышеуказанные осложнения были вызваны бактериальной инфекцией, что подтверждает роль вирусной инфекции в активации бактериальной флоры путем изменения местной иммунореактивности. Вероятно, активация экспрессии в эндометрии TLR3 способствует подавлению экспрессии TLR4 и, возможно, TLR6 и TLR8. Анализ экспрессии мРНК TLR1-10 в эндометрии выявил умеренные и сильные корреляционные взаимосвязи между большинством из них. Однако было установлено, что между экспрессией разноименных TLR в эндометрии и эпителии цервикального канала наблюдалась преимущественно отрицательная обратная связь. Не было выявлено достоверных корреляционных связей между экспрессией одноименных рецепторов в эпителии цервикального канала и эндометрии. Согласно данным литературы, различные ткани женской репродуктивной системы экспрессируют TLR в различной степени. Так, по данным P. Piolietal. (2004), полученным при исследовании эпителия женских половых путей, экспрессия TLR2 максимальна в цервикальном канале и маточных трубах, в то время как в эндометрии она достоверно ниже. Напротив, наибольшая 184 экспрессия TLR4 наблюдалась в верхних отделах женского репродуктивного тракта, прогрессивно снижаясь в нижних отделах половых путей [177]. Предположительно, снижение экспрессии TLR4 в нижних отделах половых путей в норме связано с необходимостью сниженной реакции на собственные условно-патогенные микроорганизмы [159]. По-видимому, в норме существует определенный порог чувствительности к бактериальным компонентам в нижних отделах половых путей, что помогает избежать избыточного воспаления. Поэтому гиперэкспрессия TLR в цервикальном канале на ранних сроках беременности может способствовать развитию избыточной воспалительной реакции. Обращает на себя внимание тот факт, что корреляционная взаимосвязь отрицательного характера прослеживалась преимущественно между группой TLR, активируемых бактериальными лигандами, и группой сигнальных рецепторов, лигандами которых являются вирусы и нуклеиновые кислоты. Был проведен корреляционный анализ взаимосвязи между уровнем экспрессии TLR и данными анамнеза, а также клинико-лабораторными данными. Было показано, что имелась слабая достоверная отрицательная обратная связь между количеством самопроизвольных выкидышей и экспрессией TLR3E в эндометрии (R=0,26;; p=0,005). Умеренная отрицательная корреляцонная связь была выявлена между экспрессией TLR6E и количеством выкидышей в анамнезе (R=0,30;; p=0,013). Полученные данные косвенно подтверждают роль увеличения экспрессии TLR3 и снижения экспрессии TLR6 в патогенезе невынашивания ранних сроков. Слабая достоверная отрицательная корреляционная связь наблюдалась между возрастом начала половой жизни и экспрессией TLR6E (R=-0,25; p=0,039). Напротив, положительная умеренная корреляционная связь наблюдалась между экспрессией TLR6E и количеством родов (R=0,32; p=0,009) 185 и слабая – абортов в анамнезе (R=0,25;; p=0,044). Данные результаты больше характеризуют группу контроля, у которой показатели TLR6E были в норме, но наблюдалось более раннее начало половой жизни, большее количество родов и абортов в анамнезе. Методом корреляционного анамнеза было установлено, что экспрессия TLR3E имела слабую положительную корреляционную связь с количеством эозинофилов (R=0,28;; p=0,04). В литературе отсутствуют данные о взаимосвязи экспрессии TLR3 в женских половых путях и количества эозинофилов. Экспрессия TLR3 на эозинофилах изучалась преимущественно в бронхолегочной системе. Так, по данным исследования A. Manssonи L.O. Cardell(2008), выполненном на культуре клеток эозинофилов, было показано, что они экспрессируют все TLR, активируемые вирусными лигандами, в том числе и TLR3 [263]. В эксперименте на мышах было показано, что вирусы способны активировать эозинофилы именно за счет связывания с TLR3, а не TLR7 или TLR8, что может играть роль в патогенезе бронхиальной астмы [332]. Корреляционная связь повышенной экспрессии TLR3E с уровнем эозинофилов может косвенно свидетельствовать о запуске аллергических реакций и косвенно объясняет более высокую частоту их возникновения у пациенток основной группы, о чем было упомянуто выше. Кроме того, наблюдалась слабая положительная корреляционная связь экспрессии TLR6E с уровнем гемоглобина (R=0,27;; p=0,03). По-видимому, уровень оксигенации тканей может оказывать влияние на экспрессию TLR. Слабая отрицательная обратная связь наблюдалась между экспрессией TLR7E и количеством моноцитов (R=-0,29; p=0,03). Положительная умеренная корреляционная обратная связь наблюдалась между экспрессией TLR8E и количеством сегментоядерных нейтрофилов (R=0,42;; p=0,005) и отрицательная – с количеством лейкоцитов (R=-0,40; p=0,005). 186 Также отмечалась умеренная отрицательная обратная связь между экспрессией TLR4E и количеством палочкоядерных нейтрофилов (R=-0,35; p=0,01). Корреляционный анализ данных коагулограммы показал, что уровень фибриногена в крови имеет умеренную отрицательную корреляционную взаимосвязь с экспрессией TLR3E (R=-0,33;; p=0,02). У TLR1E наблюдалась положительная корреляционная связь с уровнем ПТИ (R=0,33;; p=0,02) и отрицательная – с уровнем МНО (R=-0,34;; p=0,02). Положительная умеренная корреляционная связь наблюдалась между уровнем TLR6E и МНО (R=0,41; p=0,04). Данные взаимодействия в литературе не описаны. Был также проведен корреляционный анализ взаимосвязей между экспрессией TLR в цервикальном канале и эндометрии и данными гистологического исследования содержимого полости матки. Экспрессия TLRE 1-10 в эндометрии не имела корреляционной связи с данными гистологического исследования. Установлено, что при гнойно-некротическом хориодецидуите имела место умеренная обратная корреляционная зависимость с уровнем экспрессии TLR3 (R=-0,31; p=0,04), TLR5 (R= -0,34; p=0,03), TLR6 (R=-0,45; p=0,03), TLR7 (R=-0,36;; p=0,02) и IDO (R=-0,45;; p=0,02) в цервикальном канале. В тех случаях, когда наблюдалось отсутствие патологических изменений в эндометрии, TLR6, напротив, имел умеренную положительную корреляционную связь с данными гистологического исследования (R=0,48; p=0,02). Это еще раз подтверждает факт, что нормальная экспрессия TLR6 в эндометрии может играть протективную роль и способствовать прогрессированию беременнности. Также обращал на себя внимание тот факт, что при тромбозе сосудов децидуальной оболочки наблюдалась положительная умеренная корреляционная связь с экспрессией в эндоцервиксе TLR5 (R=0,33;; p=0,04) и TLR7 (R=0,34;; p=0,03). Известно, что на тромбоцитах экспрессируются TLR7, 187 которые играют важную роль в активации тромбоцитарно-сосудистого звена гемостаза при наличии вирусной инфекции [292]. Полученные результаты еще раз подтверждают вовлеченность TLR7 в процессы тромбообразования в эндометрии. Так как, по данным литературы, формированию иммунологической толерантности способствует активация IDO, которая катализирует распад триптофана [241] и способствует супрессии Т-клеточного звена иммунитета, была изучена ее экспрессия у пациенток с самопроизвольными выкидышами. Было показано, что экспрессия мРНК IDO в цервикальном канале у пациенток с самопроизвольными выкидышами в 3 раза выше, чем у пациенток контрольной группы. Согласно данным литературы, повышение уровня IDO способствует формированию иммунологической толерантности к антигенам плодного яйца [309]. Поэтому повышение уровня IDO у пациенток с самопроизвольным выкидышем, по-видимому, является защитным механизмом, направленным на борьбу с внутриклеточными патогенами и способствующим супрессии клеточного звена иммунитета [221]. Между экспрессией мРНК IDO и TLR3 наблюдалась умеренная высокодостоверная положительная корреляционная связь (R=0,31; p=0,009). Это соотносится с данными литературы, согласно которым invitro экспрессия IDO в клетках трофобласта зависит от активации TLR3, приводит к повышению продукции γ-интерферона, являющегося индуктором синтеза IDO [352]. Так как лигандом для TLR3 является двухцепочечная РНК вирусов, то описанный механизм активации IDO характерен для вирусных инфекций [136, 224]. Однако, так как достоверных различий в экспрессии мРНК TLR3 в основной и контрольной группах не наблюдалось, можно предположить, что вышеуказанный механизм активации IDO во время беременности не является основным. 188 Поэтому было изучено влияние на экспрессию IDO Толл-подобных рецепторов, стимуляторами которых являются бактериальные лиганды – TLR1, TLR2 и TLR4. Показано, что экспрессия мРНК IDO достоверно коррелировала с уровнями TLR2 и TLR4. Также наблюдалась слабая, но достоверная корреляционная связь с TLR5. Экспрессия мРНК IDO также имела слабую достоверную корреляционную связь с TLR7, распознающим вирусную одноцепочечную РНК. В немногочисленных работах на культурах клеток было показано, что экспрессия IDO зависит от стимуляции TLR2 иTLR4. Так, в эксперименте на человеческих десневых фибробластах в культуре клеток была обнаружена возможность стимуляции экспрессии IDO лигандами TLR2, TLR4 и TLR5 [216]. M. Parketal. (2011) в работе на фибробластах показали возможность стимуляции синтеза IDO не только через активацию TLR3, но и TLR4, причем активация TLR4 происходит по MyD88-зависимому пути, который не приводит к синтезу γ-интерферона [273]. Взаимосвязь экспрессии IDO с TLR7 косвенно подтверждается последними данными литературы. Так, в работе A.E. Yeungetal. (2012) была показана возможность стимуляции флавивирусом экспрессии IDO через MyD88-зависимый путь. Известно, что связывание вирусов с TLR3 активирует MyD88-независимый путь. Кроме того, флавивирус является одноцепочечным РНК-содержащим вирусом, поэтому является лигандом для TLR7 и TLR8, которые запускают иммунный ответ через MyD88-независимый сигнальный путь [201]. Полученные данные свидетельствуют о возможности активации синтеза IDO лигандами TLR7. Однако корреляцию между экспрессией мРНК IDO и TLR, активируемых бактериальными лигандами, можно объяснить не только прямой стимуляцией экспрессии IDO через TLR2 и TLR4. Описан механизм стимуляции TLR3 вирусными лигандами, что приводит к повышению экспрессии IDO, которое, в 189 свою очередь, способствует снижению уровней IL-10 и TNF-α. В эксперименте на мышах повышение экспрессии IDO, индуцированное вирусом гриппа, приводило к развитию вторичной бактериальной пневмонии из-за иммуносупрессии [232]. Поэтому повышение экспрессии TLR1, TLR2, TLR4 и TLR10 может быть вторичным в ответ на увеличение бактериальной обсемененности. Кроме того, в эксперименте на мышах было показано, что вирусная инфекция плаценты приводит к повышению чувствительности к бактериальным лигандам, что предрасполагает к развитию преждевременных родов [358]. В механизм этого явления вовлечена система TLR. Была проанализирована взаимосвязь экспрессии мРНК IDO и клиникоанамнестических данных. Не было установлено корреляционной зависимости между экспрессией IDO и данными анамнеза (паритет, наличие гинекологической патологии), морфометрическими данными, результатами биохимического анализа крови, общего анализа крови и мочи, данными ПЦР, бактриоскопического и бактериологического исследования. Не было выявлено также корреляции между экспрессией IDO и данными бактериоскопического исследования. Однако была выявлена достоверная умеренная корреляционная зависимость между экспрессией IDO и уровнем фибриногена по данным коагулограммы (R=0,46;; p=0,03). Полученные данные о взаимосвязи экспрессии IDO с системой свертывания получены впервые. Уровень экспрессии IDOE у пациенток обеих групп достоверно не отличался. Уровень экспрессии IDOE в эндометрии не коррелировал с экспрессией IDO в эпителии цервикального канала. Экспрессия IDOE имела слабую достоверную обратную корреляционную связь с числом беременностей в анамнезе (R=-0,23;; p=0,01). В литературе соответствующих данных обнаружено не было. 190 Установлено, что экспрессия IDOE не коррелирует с экспрессией большинства TLR в цервикальном канале, за исключением TLR1, активируемых лигандами грамположительной флоры в цервикальном канале, с которым наблюдалась достоверная умеренная отрицательная обратная связь (R=-0,48;; p=0,014). По-видимому, снижение IDOE вследствие гиперактивации TLR1 в цервикальном канале может быть одним из механизмов, способствующих развитию невынашивания беременности. Корреляция между экспрессией IDOE и TLR в эндометрии была положительной. Положительная корреляционная зависимость наблюдалась и между экспрессией IDO и TLR в цервикальном канале, что было описано выше. Высокодостоверная умеренная корреляционная связь была установлена между экспрессией мРНК IDOE и TLR2E, TLR3E, TLR4E и TLR7E. Такие же закономерности между экспрессией IDO и TLR2, TLR3 и TLR4 и TLR7 были описаны выше и в эпителии цервикального канала, однако там корреляционные взаимодействия во всех случаях были слабыми. В отличие от эпителия цервикального канала, в эндометрии не было выявлено корреляционной зависимости между экспрессией IDOE и TLR5. Также был проведен анализ взаимосвязи экспрессии IDO в цервикальном канале и TLR в эндометрии. Было установлено, что все корреляционные взаимосвязи были отрицательными. Достоверная слабая отрицательная взаимосвязь была выявлена между IDO и TLR1E (R=-0,25;; p=0,03), а также и IDO и TLR3E (R=-0,29;; p=0,014). Взаимосвязи IDO и TLR1E аналогичны наблюдающимся между IDOE и TLR1. Интересно, что повышенная экспрессия TLR3E в эндометрии, по-видимому, способствует снижению IDO в цервикальном канале, хотя механизм этого явления не исследован. Так как в экспериментах на животных было показано, что экспрессия TLR может влиять на уровень простагландинов, предположительно вследствие влияния на их синтез и распад [176, 261], был проведен анализ экспрессии 191 мРНК гидроксипростагландиндегидрогеназы (HPDG), катализирующей деградацию простагландинов в тканях, и циклооксигеназы-2 (COX-2), которая стимулирует синтез простагландинов. Также была изучена экспрессия каспазы3, которая влияет на механизм запуска апопотоза трофобласта, и ее зависимость от экспрессии TLR. Было установлено, что экспрессия в цервикальном канале мРНК COX-2 и HPDG у пациенток обеих групп достоверно не отличалась. HPDG в цервикальном канале имела высокую достоверную корреляционную связь с уровнем экспрессии TLR5E в эндометрии (R=0,78; p=0,012). Наблюдалась сильная высокодостоверная корреляционная связь между экспрессией в эндоцервиксе COX-2 и TLR9 (R=0,89;; p=0,006). Других взаимосвязей экспрессии COX-2 в цервикальном канале и TLR отмечено не было. Таким образом, экспрессия и COX-2, и HPDG в цервикальном канале имела сильные достоверные корреляционные связи с TLR, активируемыми лигандами бактерий – флагеллином и неметилированной ДНК. Экспрессия мРНК HPDG в эндометрии (HPDGE) была достоверно выше у пациенток с самопроизвольными выкидышами по сравнению с группой контроля. При этом экспрессия мРНК COX-2 в эндометрии (COX-2E) достоверно не отличалась. Таким образом, на повышение местного синтеза простагландинов в эндометрии, которое может способствовать развитию самопроизвольного выкидыша, влияет не повышенный их синтез, а сниженный распад. Экспрессия мРНК HPDGE имела достоверную слабую положительную корреляционную связь с экспрессией мРНК TLR4 (R=0,27;; p=0,016). Эти данные соотносятся с данными литературы. H. WangandE. Hirsch (2003) показали, что внутриматочное введение убитой культуры кишечной палочки вызывает самопроизвольные выкидыши у мышей не столько за счет синтеза простагладинов, сколько за счет ингибирования распада HPDGE, которое является TLR4-зависимым [145]. Однако в этом же эксперименте наблюдалось 192 TLR4-индуцированное увеличение синтеза COX-2, которое не было столь значительным, как ингибирование HPDGE. Не было выявлено достоверных взаимосвязей уровня экспрессии HPDGE и других TLR в эндометрии и цервикальном канале. Экспрессия COX-2E имела слабую достоверную корреляционную связь с TLR1E в эндометрии (R=0,20;; p=0,049), активируемым бактериальными лигандами, что соотносится с данными литературы [192]. Кроме того, положительная умеренная корреляционная связь наблюдалась между экспрессией COX-2E и TLR9 в цервикальном канале, лигандом которого является неметилированная ДНК (R=0,52;; p=0,027). Таким образом, экспрессия COX-2 и в цервикальном канале, и в эндометрии была взаимосвязана с экспрессией TLR9 в цервикальном канале. Это соотносится с данными литературы, согласно которым TLR9 в различных тканях является одним из основных TLR, способных запускать синтез COX-2 [209, 339]. Для того, чтобы установить возможность активации синтеза каспазы и развития апоптоза в ответ на активацию TLR, была изучена экспрессия CASP3α и CASP-3β в женских половых путях. Экспрессия CASP-3α в цервикальном канале у пациенток обеих групп достоверно не отличалась. Было также показано, что транскрипционный вариант каспазы CASP-3β в женских половых путях не экспрессируется. Было установлено, что экспрессия CASP-3α в цервикальном канале умеренно коррелировала с экспрессией в эндоцервиксе TLR, активируемых бактериальными лигандами: TLR1 (R=0,52; p=0,02), TLR2 (R=0,49;; p=0,002) и TLR10 (R=0,43;; p=0,004). Экспрессия CASP-3α не имела достоверной взаимосвязи с экспрессией TLR в эндометрии. Это согласуется с данными литературы, согласно которым пептидогликан, активирующий TLR2, индуцирует апоптоз клеток трофобласта в гораздо большей степени, чем выработку цитокинов [178]. В культуре эпителиальных клеток также было 193 показано, что индуктор TLR4 паклитаксел также способен активировать синтез каспаз 3 и 7 [336]. Экспрессия мРНК CASP-3α в эндометрии (CASP-3αE) была в 200 раз выше у пациенток основной группы по сравнению с группой контроля. Наблюдалась достоверная умеренная отрицательная связь уровня CASP3αE с экспрессией TLR6 (R=-0,52; p=0,000057). По данным литературы, в эксперименте на мышах было показано, что апоптотический эффект наблюдается при стимуляции пептидогликаном гетеродимерного комплекса TLR1/TLR2, что приводит к активации каспазы-3, каспазы-8 и каспазы-9 через MyD88/FADD-зависимый путь, в то время как присутствие TLR6 может изменить тип ответа, что позволит избежать апоптоза и стимулировать выработку цитокинов через активацию NF-kB [338]. Так как, согласно полученным нами данным, у пациенток с невынашиванием беременности ранних сроков наблюдается снижение экспрессии TLR6E в эндометрии, то повышение у них экспрессии CASP-3α, по-видимому, возникает вследствие отсутствия его протективного эффекта. Чтобы оценить взаимосвязь экспрессии CASP-3α, COX-2 и HPDG между собой и с IDO в эндометрии и цервикальном канале, был проведен корреляционный анализ. В большинстве случаев экспрессия мРНК CASP-3α, COX-2 и HPDG в эндометрии и цервикальном канале не коррелировали между собой. Исключение составила только экспрессия COX-2 в эндоцервиксе и HPDGE в эндометрии, между которыми наблюдалась сильная отрицательная обратная связь (R=-0,73; p=0,036). Это позволяет предположить, что повышение экспрессии COX-2 в цервикальном канале способствует угнетению экспрессии HPDGE в эндометрии, что имеет однонаправленное действие – увеличение синтеза простагландинов и уменьшение их распада. Интересно, что между экспрессией COX-2E и HPDGE в эндометрии наблюдалась слабая достоверная прямая зависимость (R=0,25; 194 p=0,038). Возможно, это является защитным механизмом, стимулирующим в эндометрии распад простагландинов при их повышенном синтезе. Других достоверных корреляционных взаимосвязей экспрессии мРНК вышеуказанных ферментов выявлено не было. В цервикальном канале обращала на себя внимание сильная корреляционная зависимость между экспрессией IDO и ферментов, связанных с синтезом и распадом простагландинов – COX-2 (R=0,67;; p=0,012) и HPDG (R=0,63; p=0,047). Это соотносится с данными литературы, согласно которым сниженный уровень COX-2 способен уменьшать экспрессию IDO в культуре клеток лейкемии у человека [168]. Данных о взаимосвязи экспрессии IDO и HPDG в литературе не выявлено. Отрицательная умеренная корреляционная зависимость наблюдалась между экспрессией COX-2 в эндоцервиксе и IDOE в эндометрии (R=-0,58;; p=0,036), что можно расценивать как общую тенденцию отрицательных взаимосвязей между экспрессией факторов в эндометрии и цервикальном канале. Был проведен корреляционный анализ взаимосвязи результатов гистологического исследования и экспрессии мРНК CASP-3α, COX-2 и HPDG. Достоверных взаимосвязей экспрессии вышеуказанных ферментов с патологическими изменениями в эндометрии отмечено не было. Однако в случаях, когда патологические изменения в эндометрии отсутствовали, наблюдалась достоверная положительная умеренная корреляционная связь с экспрессией CASP-3α в эндоцервиксе (R=0,54;; p=0,006) и отрицательная – с экспрессией COX-2E в эндометрии (R=-0,33; p=0,02). Это может свидетельствовать о том, что в отсутствие ярко выраженного воспалительного процесса основную роль в отторжении плодного яйца играет активация апоптоза через CASP-3α, а не повышенный синтез простагландинов. Таким образом, у пациенток с самопроизвольными выкидышами ранних сроков наблюдается достоверное увеличение экспрессии в эпителии 195 цервикального канала мРНК TLR1, TLR2 и TLR4, лигандами которых являются структуры бактерий, что, вероятно, способствует гиперактивации системы врожденного иммунитета и отторжению плодного яйца. Это увеличение сопровождается возможно, активацией является синтеза компенсаторным индол-2,3-диоксигеназы, или способствует которое, избыточной иммуносупрессии Т-клеточного иммунитета. Однако не исключен механизм вторичной гиперактивации TLR в ответ на увеличение роста бактериальной флоры вследствие иммуносупрессии, вызванной избытком синтеза IDO. В эндометрии у пациенток с самопроизвольными выкидышами наблюдается активация экспрессии TLR3E, способствующая запуску цитокинового каскада. Это сопровождается снижением экспрессии TLR4E, TLR6E и TLR8E. По-видимому, снижение экспрессии TLR6E в эндометрии играет роль в активации CASP-3αE, способствующей апоптозу трофобласта. Кроме того, в эндометрии наблюдается снижение экспрессии HPDG, что, по-видимому, приводит к уменьшению распада простагландинов. Этот механизм также может играть роль в патогенезе самопроизвольных выкидышей. Таким образом, в цервикальном канале у пациенток с самопроизвольными выкидышами наблюдалось достоверное увеличение экспрессии TLR1, TLR2, TLR4 и TLR10, активируемых бактериальными лигандами. В эндометрии, напротив, увеличивалась экспрессия TLR3 с одновременным снижением TLR4, TLR8 и особенно значительно – TLR6, что приводило к запуску синтеза каспазы-3α, индуцирующей апоптоз трофобласта. Это сопровождалось снижением экспрессии в эндометрии HPDG, участвующего в деградации простагландинов. Вышеуказанные изменения играют важную роль в патогенезе невынашивания беременности ранних сроков. 196 Также были проанализированы особенности социально-биологического статуса беременных из группы высокого инфекционного риска, у части которых затем развился эндометрит. Так как у всех пациенток данной группы отмечалась высокая бактериальная обсемененность, это позволило оценить другие факторы, влияющие на развитие воспалительного процесса. Было установлено, что у пациенток из группы высокого инфекционного риска эндометрит достоверно чаще развивался у женщин с более низкой массой тела. В литературе описаны математические модели, в которых одной из переменных является масса тела человека, на основании чего может быть сделан прогноз развития инфекционного процесса. Большая вероятность возникновения инфекционного процесса у пациентов с низкой массой тела связана с более высокой антигенной нагрузкой на килограмм веса пациентки [92]. В родах у пациенток с развившимся впоследствии эндометритом наблюдалась достоверно большая кровопотеря, а также увеличение длительности третьего периода родов, что, видимо, было связано с нарушением отделения и выделения последа. Было проанализировано влияние особенностей оперативного родоразрешения на риск возникновения послеродового эндометрита. Установлено, что у пациенток с развившимся впоследствии послеродовым эндометритом, так же, как и после родов через естественные родовые пути, наблюдалась достоверно большая кровопотеря. Длительность операции у этих пациенток также была достоверно больше, чем в контроле. Полученные результаты подтверждаются литературными данными. Так, по мнению В.И.Краснопольского (2007), к интраоперационным факторам риска развития эндометрита относят патологическую кровопотерю, длительность операции более 1 ч, выполнение кесарева сечения в экстренном порядке [51]. 197 У этой группы пациенток также была проведена оценка клиниколабораторных данных. По данным эхографического исследования было выявлено, что у пациенток с эндометритом длина матки после родов была достоверно больше, чем у пациенток с неосложненным послеродовым периодом. В то же время все остальные размеры матки и ее полости не имели достоверных различий с группой контроля. Это еще раз подтверждает роль эхографического исследования только как вспомогательного метода в диагностике послеродового эндометрита. В общем анализе крови в послеродовом периоде у пациенток с эндометритом наблюдалось достоверное снижение количества лимфоцитов по сравнению с группой контроля, что согласуется с данными отечественных авторов, считающих лимфопению в послеродовом периоде прогностически неблагоприятным фактором [43]. Количество лейкоцитов в обеих группах не имело достоверных различий. При гистологическом исследовании плаценты у пациенток с эндометритом признаки децидуита и амниохориодецидуита наблюдались в 2,5 раза чаще, чем в контрольной группе. Полученные данные подтверждают правльность постановки диагноза послеродового эндометрита и отнесения пациенток в соответствующую группу. По данным литературы, для родильниц с послеродовым эндометритом характерны воспалительные изменения в эндометрии и плаценте по типу базального децидуита и хориоамнионита, что свидетельствует о гематогенном и восходящем пути инфицирования [21]. Длительность дородовой госпитализации в отделении патологии беременных у пациенток с эндометритом и без него достоверно не отличалась. У пациенток с эндометритом отмечалось достоверное увеличение сроков госпитализации в послеродовом отделении в среднем на 2 сутоккак после родов через естественные родовые пути , так и после кесарева сечения. Так как средняя стоимость койко-дня в Перинатальном центре Белгородской областной 198 клинической больницы Св. Иоасафа составляет 1850 рублей, то снижение прямых экономических затрат при разработке методов прогноза послеродовых эндометритов только для его стертых форм составит не менее 3700 рублей на каждый случай эндометрита. Снижение же косвенных экономических затрат, связанных с лечением репродуктивных осложнений в отдаленном периоде, будет еще более значительным. Согласно третьей задаче исследования, был выполнен анализ состояния микробиоценоза половых путей у беременных высокой степени инфекционного риска. В этой группе пациенток также не было выявлено достоверных различий по данным бактериоскопического исследования, с одинаковой частотой в обеих группах обнаруживались и возбудители ЗППП. Так как основными возбудителями послеродовых эндометритов являются условно-патогенные микроорганизмы, пациенткам обеих групп также было проведено бактериологическое исследование.Установлено, что ассоциации микроорганизмов (3 и более возбудителя) у пациенток с развившимся в дальнейшем эндометритом выделялись в 1,4 раза чаще, чем у женщин, не имевших осложнений в послеродовом периоде, а количество пациенток, у которых условно-патогенные микроорганизмы не обнаруживались, было достоверно выше в группе контроля. Это соотносится с данными литературы, согласно которым основными возбудителями послеродового эндометрита являются условно-патогенные микроорганизмы (ассоциации аэробов и анаэробов), являющиеся представителями нормальной микрофлоры половых путей женщин [124, 289]. Высокая вероятность развития послеродового эндометрита связана с феноменом «кооперативной чувствительности», или «чувства кворума» («quorumsensing») [17, 274]. Он заключается в том, что до начала инфекционного процесса группа микроорганизмов обменивается сигнальными 199 соединениями, активирующими запуск факторов патогенности. Это приводит к развитию инфекционного процесса. Установлено, что большинство условно-патогенных аэробных и анаэробных микроорганизмов с одинаковой частотой присутствовали в обеих группах. Однако частота выявления микроорганизмов рода StaphylococcusKlebsiella была достоверно выше у пациенток с развившимся впоследствии эндометритом. Стафилококк выделялся у пациенток основной группы в 2 раза чаще, а клебсиелла – в 20 чаще, чем в группе контроля. Эти данные частично коррелируют с результатами исследований, согласно которым отмечается тенденция к увеличению роли кокковой микрофлоры в патогенезе послеродового эндометрита [70]. Однако, один из классических грамотрицательных возбудителей – клебсиелла - продолжает занимать одно из лидирующих мест в патогенезе послеродового эндометрита. Анализ результатов бактериологического исследования анаэробной микрофлоры влагалища не выявил достоверных различий между основной и контрольной группой. Анаэробная флора не является основным этиологическим фактором развития послеродового эндометрита, занимая в его структуре от 10 до 15 процентов. У пациенток с послеродовым эндометритом в 2 случаях был выявлен Citrobacter. Известно, что цитробактер является одной из самых частых причин внутрибольничных ангиогенных инфекций и инфекций мочевыводящих путей. Он способен вызывать вспышки гастроэнтеритов и токсикоинфекций, внутрибольничные инфекции, менингиты, абсцессы мозга, урологические заболевания, гнойные инфекции и сепсис у детей и взрослых [164]. Повидимому, в данном случае имел место гематогенный путь распространения инфекции, так как обе пациентки страдали хроническим пиелонефритом. Факт выявления цитробактера при послеродовых эндометритах приводит к выводу, что в протокол бактериологического исследования в стационарах высокой степени риска целесообразно включить его выявление как возможного 200 возбудителя послеродовых эндометритов. Это связано с тем, что инфекция, вызванная цитробактером, не чувствительна к традиционно назначаемой в акушерских стационарах терапии. Так как цитробактер чувствителен к нитрофуранам и фторхинолонам, для пациенток, инфицированных этим возбудителем, необходим индивидуальный подбор антибактериальной терапии, возможно, с исключением грудного вскармливания (при терапии фторхинолонами). Проведен сравнительный анализ влияния количества возбудителя на риск возникновения послеродового эндометрита. Выявлено, что у пациенток с развившимся эндометритом на поздних сроках беременности бактериальная обсемененность клебсиеллой была на 5 порядков, а эпидермальным стафилококком – на 2 порядка выше, чем в группе контроля.У других видов микроорганизмов бактериальная обсеменность не влияла на развитие воспалительного процесса. Таким образом, уровень бактериальной обсемененности в большинстве случаев не является определяющим фактором развития воспалительного процесса. Следующей задачей исследования было определение границ нормальных величин экспрессии мРНК TLR1, TLR2, TLR4 и TLR5 эпителия шейки матки и эндометрия на доношенном сроке беременности и оценка экспрессии мРНК вышеуказанных рецепторов в качестве прогностического маркера послеродового эндометрита. В группе пациенток с послеродовым эндометритом (III) не было отмечено достоверных различий в экспрессии мРНК TLR1 и TLR2 в цервикальном канале в сравнении с пациентками контрольной группы (IV), однако отмечалось достоверное снижение экспрессии TLR4, лигандом которого являются липополисахариды грамотрицательных бактерий, и TLR5, лигандом которого является флагеллин. 201 Для того, чтобы оценить влияние снижения экспрессии мРНКTLR4 и TLR5 на другие звенья врожденного иммунитета, определяли экспрессию мРНК белков MyD88-зависимого сигнального пути. Выявлено, что у пациенток с послеродовым эндометритом уровень экспрессии мРНКNF-kB был достоверно ниже, чем в группе контроля. Те же закономерности экспрессии мРНКTLR4 и TLR5 и белков их сигнального пути выявлены и у беременных на поздних сроках гестации. По-видимому, снижение экспрессии TLR4 и TLR5 является одним из основных механизмов развития послеродового эндометрита. Так как для передачи сигнала с TLR4 и TLR5 служит MyD88-зависимый путь, то снижение уровня MyD88 и NF-kB у этих пациенток является закономерным. Снижение экспрессии NF-kB, по-видимому, приводит к уменьшению выработки провоспалительных цитокинов и антимикробных пептидов на поверхности слизистых, что может способствовать инвазии возбудителя даже при небольшом количестве патогена. Это соотносится с данными литературы. Так, было показано, что активация TLR4 играет протективную роль при гонорейной инфекции, модулируя ранний иммунный ответ и ограничивая бактериальную репликацию [303]. Данных о роли TLR в развитии послеродовых ГСЗ у женщин в отечественной и зарубежной литературе нет. В работах на коровах, однако, было выявлено, что введение убитой нагреванием Escherischiacoli или липополисахаридовв полость матки после родов приводит к TLR4опосредованному увеличению продукции фактора некроза опухоли-α, NOсинтазы, и простагландинов групп E и F [174, 193]. Также было показано, что способность TLR4 реагировать на липополисахариды, выражающаяся в достоверно большем синтезе фактора некроза опухоли-α, в большей степени наблюдалась в плацентарной ткани, полученной у пациенток, родивших самостоятельно, по сравнению с группой женщин после кесарева сечения [192]. 202 По-видимому, этот факт может иметь значение в патогенезе послеродовых эндометритов, которые чаще встречаются после оперативных родов. Другими авторами была показана роль TLR4 и TLR5 в развитии воспалительных процессов другой локализации. Так, T. Hawn et al. (2007) [138] в экспериментах на мышах, нокаутированных по TLR5, доказали, что отсутствие экспрессии этого рецептора способствует быстрому развитию и тяжелому течению пневмонии по сравнению с нормальной линией мышей, несмотря на одинаковое количество возбудителя. Это связано со снижением уровней провоспалительных цитокинов, в частности, фактора некроза опухолиα, вследствие отсутствия активации TLR5. Недостаточная экспрессия TLR4 также приводила к более тяжелому течению пневмонии неинфекционного генеза [335]. В другом эксперименте было установлено, что на 5-е сутки после трансуретрального введения Escherishiacoliу инфицированных мышей, нокаутированных по TLR5, бактериальная обсемененность почек и мочевого пузыря была достоверно выше, чем у контрольной дикой линии мышей. Это сопровождалось увеличением выработки цитокинов и хемокинов, более выраженными гистологическими признаками воспаления и снижением выживаемости [169]. Также у мышей этих линий высок риск развития кератита и пневмонии (в модели муковисцидоза) [334, 337]. Напротив, стимуляция экспрессии TLR5 путем местного введения флагеллина значительно уменьшает патологические изменения в тонком и толстом кишечнике и снижает смертность мышей в модели колита, вызванного Clostridiumdifficile [346]. Это связано не только с усилением местной иммунореактивности, но и с уменьшением апопотоза кишечных эпителиоцитов, что в совокупности значительно снижает возможность проникновения возбудителя через эпителиальный барьер. 203 При эндометрите была выявлена сильная значимая корреляция между уровнями мРНКTLR1 и TLR2 , что соответствует литературным данным [236]. TLR1 и TLR2 являются синергистами, связываясь с липопротеинами преимущественно грамположительных бактерий. Также выявлена сильная значимая корреляция этих рецепторов с NF-kB. Для вышеуказанных рецепторов MyD88-зависимый путь является основным, поэтому такого рода связь являтся закономерной [326]. Возможно, нарушение активации NF-kB через TLR4 и TLR5 по MyD88-зависимому сигнальному пути является одной из причин развития эндометрита. Проведен корреляционный анализ между концентрацией в цервикальной слизи условно-патогенных микроорганизмов и уровнем экспрессии TLRв цервикальном канале. Было установлено, что экспрессия большинства TLR имеет отрицательную корреляционную связь с концентрацией грамположительных и грамотрицательных бактерий, преимущественно умеренную или сильную. В литературе содержится очень мало сведений о возможной взаимосвязи влияния бактерий на TLR. Известно, что внутриклеточные TLR, в том числе TLR3, TLR7 и TLR8, способны реагировать не только на вирусные, но и на бактериальные лиганды [149]. Описано, что активация клеток Лангерганса, которые при дальнейшей их дифференцировке в дендритные клетки запускают как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ, происходит через TLR2 и TLR3 [207]. По-видимому, снижение экспрессии TLR3 на клетках Лангерганса снижает напряженность гуморального иммунного ответа, что способствует увеличению бактериальной обсемененности. Так как TLR7 и TLR8 способны активировать NF-kB по MyD88-зависимому, а TLR3 – по MyD88-независимому пути с последующей выработкой провоспалительных цитокинов [240], снижение их экспрессии может способствовать персистенции возбудителя вследствие снижения местной иммунореактивности. 204 Кроме того, наблюдалась достоверная отрицательная умеренная корреляционная связь между количеством дрожжеподобных грибов рода Candida и TLR2, TLR3, TLR6, TLR7, TLR9 и TLR10. Было показано, что для адекватного иммунного ответа на грибы рода Candida необходима выработка интерферонов I типа, которая является TLR7опосредованной [166]. Кроме того, V. Mulleretal. (2007) показали, что иммунный ответ против Candidaalbicans через NF-kB инициируется не столько путем активации TLR2 и TLR4, сколько через TLR3 [153]. TLR9 способен распознавать неметилированную ДНК Candida и также участвует в противогрибковом иммунном ответе [347]. Взаимосвязь TLR 10 с иммунным ответом против Candida остается малоизученной. На основании вышеизложенного можно предположить, что снижение экспрессии TLR3, TLR7, TLR9 и TLR10 приводит к неэффективному иммунному ответу на дрожжеподобные грибы рода Candida, что способствует увеличению их концентрации. Согласно задачам исследования, была проведена оценка концентрации уровней плацентарных гормонов (эстриола, прогестерона, плацентарного лактогена) на поздних сроках беременности и их корреляции с экспрессией TLRу женщин с развившимся впоследствии послеродовым эндометритом и в контрольной группе. Достоверных различий в концентрации плацентарных гормонов у пациенток обеих групп выявлено не было. Была выявлена положительная умеренная связь концентрации эстрадиола и плацентарного лактогена и TLR1, связано как с его протективным влиянием на развитие плацентарной недостаточности, так и с возможной зависимостью экспрессии TLR1 от срока беременности. По данным литературы, одной из основных причин стимуляции экспрессии TLR является нормальная микрофлора женских половых путей. Так, VisozoM. etal. (2009) показали, что лактобактерии способны стимулировать 205 экспрессию TLR2, TLR4 и TLR5 во влагалище и шейке матки [248]. Было также установлено, что при пероральном приеме эубиотиков на поздних сроках беременности наблюдается увеличение экспрессии TLR, стимулируемых бактериальными лигандами, в плаценте и кишечнике плода, что способствует снижению бактериальной обсемененности [302]. Кроме того, можно предположить, что одной из основных причин, способствующих снижению уровня TLR4 и TLR5 у родильниц, является исходно низкое содержание во влагалище лакто- и бифидобактерий. Лиганд TLR5 флагеллин является одним из перспективных компонентов для создания вакцин, стимулирующих антиинфекционный иммунитет слизистых [133]. Поэтому разрабатываемые вакцины на основе агонистов TLR в перспективе могут быть использованы для профилактики послеродовых ГСЗ. В настоящее время ведется дискуссия о причинах, способствующих снижению экспрессии TLR. Одной из вероятных причин этого явления считают длительное воздействие на TLR бактериальных эндотоксинов. Так, в ряде исследований было описано отсутствие иммунного ответа у моноцитов и нейтрофилов при длительной экспозиции эндотоксинов. Показано, что этот механизм реализуется через систему сигнальных рецепторов [186, 270, 282, 364]. Данный феномен носит название «эндотоксиновой толерантности». Кроме того, было показано, что нарушение экспрессии TLR способствует хронизации любых инфекционных процессов [329]. Напротив, у пациентов с циррозом печени исходно сниженный уровень TLR4 восстанавливается при терапии антибиотиками [183], что косвенно подтверждает эту гипотезу. Таким образом, у пациенток с послеродовым эндометритом наблюдается значительное снижение уровней TLR4 и TLR5, а также белков MyD88 и NF-kB, являющихся сигнальными путями от вышеуказанных рецепторов. Данная закономерность определяется и у беременных с высокой степенью риска развития послеродовых ГСЗ. По-видимому, снижение экспрессии TLR4 и TLR5 206 является одним из основных механизмов развития послеродового эндометрита. Так как для передачи сигнала с TLR4 и TLR5 служит MyD88-зависимый путь, то снижение уровня MyD88 и NF-kB у этих пациенток является ожидаемым. Снижение экспрессии NF-kB, по-видимому, приводит к уменьшению выработки провоспалительных цитокинов и антимикробных пептидов на поверхности слизистых, что может способствовать инвазии возбудителя даже при небольшом количестве патогена. Можно сделать вывод, что уровни экспрессии TLR4, TLR5 и NF-kB являются прогностически значимыми для развития послеродового эндометрита и могут быть использованы для его диагностики. Кроме того, стимуляция экспрессии TLR5 c помощью вакцин, содержащих его лиганд флагеллин, а также эубиотических препаратов также может быть использована для профилактики послеродового эндометрита у женщин на доношенном сроке беременности. У пациенток с низкой экспрессией вышеуказанных генов на сроке 40-41 неделя целесообразно назначение антибактериальной терапии с первых суток послеродового периода в связи с отсутствием возможности проведения полноценного курса терапии антибиотиками. В связи со способностью нормальной микрофлоры стимулировать экспрессию TLR, лигандами которых являются бактериальные структуры, с целью профилактики развития послеродового эндометрита в качестве коррекции экспрессии TLR был выбран препарат, содержащий лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол. В исследуемую группу были включены 34 пациентки на сроке беременности 38-40 недель, имеющие высокую степень риска развития инфекционных осложнений (внутриутробное инфицирование, отягощенный акушерский анамнез, многоводие и др.). Пациентки были ознакомлены с целью исследования, механизмом действия препарата, противопоказаниями для применения. Было получено согласие пациенток на применения препарата. 207 КП, содержащий лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол, вводили интравагинально, по 1 свече 1 раз в день в течение 6 дней. Экспрессию TLRоценивали по описанной выше методике до и после применения препарата. Было установлено, что после интравагинального применения КП, содержащего лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол, наблюдается достверное увеличение продукции TLR5 и TLR10. По данным литературы, основным лигандом лактобактерий, стимулирующим TLR5, является флагеллин [238]. Активация TLR5 приводит не только к выработке провоспалительных цитокинов и усилению неспецифического иммунного ответа, но и стимулирует выработку антител [200]. В то же время, лакотбактерии уменьшают образование нейтофильных ловушек, обладают антиоксидантным действием и, вследствие этого, предупреждают избыточное повреждение тканей в результате воспаления [301]. Стимуляция TLR10 лигандами лактобактерий описана впервые. В послеродовом периоде после лечения КП только у одной пациентки (2,9±2,9%) развился послеродовый эндометрит. Данный факт может свидетельствовать о возможном протективном действии препаратов эубиотиков при акушерской инфекционной патологии. Это свидетельствует о целесообразности профилактики послеродового эндометрита препаратами эубиотиков для интравагинального введения. *** Таким образом, роль TLR в патогенезе инфекционно-воспалительных осложнений гестации не вызывает сомнения. Универсальным механизмом, способствующим индукции воспалительного процесса, является снижение экспрессии TLR, лигандами которых являются бактериальные структуры. Уменьшение экспрессии TLR приводит к индукции апоптоза, снижению распада простагландинов, увеличению бактериальной обсемененности 208 вследстие снижения продукции ключевого стимулятора синтеза провоспалительных цитокинов – NF-kB. Одним из стимуляторов экспрессии TLR являются представители нормальной микрофлоры женских половых путей – лактобактерии. Описан новый механизм протективного действия лактобактерий – индукция экспрессии TLR5 и TLR10 в эпителии женского репродуктивного тракта, что способствует поддержанию напряженности местного иммунного ответа. Показано, что прогнозирование развития и самопроизвольных выкидышей, и послеродовых гнойно-септических осложнений на основании только клинических данных малоинформативно. Гистологическое исследование, обладающее большой диагностической ценностью, не может быть использовано в качестве прогностического метода, так как выполняетсяpostfactum. Экспрессия же TLR позволяет спрогнозировать развитие данных осложнений на доклинической стадии, что особенно важно на амбулаторном этапе и в условиях ранней выписки женщины из стационара. Разработанный комплекс мер профилактики и ранней диагностики осложнений позволит снизить частоту развития этой группы заболеваний, тем самым способствуя сохранению репродуктивного здоровья женщины. 209 ВЫВОДЫ 1. В Белгородской области частота выкидышей на сроке до 12 недель среди всех женщин, находившихся на учете в женских консультациях, имеет тенденцию к росту до 1,1-1,3% в год (в 2010 – 2013 гг). Частота выкидышей на сроке от 12 до 21 недели беременности увеличивается ежегодно до 0,13%. Частота послеродовых эндометритов увеличивается на 0,2-0,3 ‰ в год. 2. Социально-биологическими факторами риска невынашивания беременности инфекционного генеза являются: самопроизвольные прерывания беременности в анамнезе, аллергические реакции на медпрепараты. Факторами риска развития послеродового эндометрита являются низкая масса тела пациентки, удлинение III периода родов, увеличение длительности кесарева сечения (в среднем - на 22 мин.) и объема кровопотери (при оперативном родоразрешении - в среднем на 100 мл, в родах через естественные родовые пути – на 45 мл). 3. У пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности ранних сроков инфекционного генеза микробиоценоз половых путей характеризуется преобладанием кокковой флоры (35,1±6,3% против 8,8±3,8% в контроле). У 59,65±6,50% пациенток с невынашиванием беременности ранних сроков наблюдаются признаки хориодецидуита в эндометрии и трофобласте. Наиболее значимым этиологическим фактором инфекционно-воспалительных осложнений заболеваний женских половых органов послеродового периода является неспецифическая микрофлора половых путей: эпидермальный стафилококк, выявляемый в 1,7 раза чаще, чем при неосложненном течении пуэрперия, и клебсиелла, выявляемая в 21 раз чаще. При гистологическом исследовании плаценты у 71,43±9,86% пациенток с эндометритом наблюдаются признаки хориодецидуита и амниохориодецидуита. 210 4. Развитие инфекционно-воспалительных осложнений во время беременности и послеродовом периоде связано с состоянием сигнальных рецепторов системы врожденного иммунитета (TLR). 5. В патогенезе самопроизвольных выкидышей ранних сроков важное значение играет избыточная индукция иммунного ответа, которая реализуется в виде повышения экспрессии сигнальных рецепторов системы врожденного иммунитета. У пациенток с невынашиванием установлено увеличение экспрессии мРНК TLR1 (в 50 раз), TLR2 (в 11 раз), TLR4 (в 7 раз) и TLR10 (в 21 раз). Это сопровождается увеличением экспрессии IDO (в 2,9 раза). В эндометрии у пациенток с самопроизвольными выкидышами происходит стимуляция экспрессии TLR3 (в 1,65 раза) с одновременным снижением TLR4 (в 1,5 раза), TLR6 (в 115 раз) и TLR8 (в 1,85 раза). В эндометрии у женщин с невынашиванием наблюдается снижение в 3,6 раза экспрессии мРНК фермента, обеспечивающего распад простагландинов – HPDG, при нормальной экспрессии COX-2, увеличение в 6,5 раза экспрессии мРНК фермента апоптоза CASP-3α, имеющей обратную корреляционную связь с экспрессией мРНК TLR6 (R=-0,52; p=0,000057). 6. В патогенезе послеродового эндометрита важную роль играет снижение местной иммунореактивности, обеспечивающее активацию собственной условно-патогенной флоры. У пациенток, угрожаемых по развитию послеродового эндометрита, на поздних сроках беременности отмечается уменьшение экспрессии TLR4 (в 3,4 раза), TLR5 (в 28 раз) и NF-kB (в 20 раз). Снижение экспрессии TLR 3-10 в цервикальном канале приводит к увеличению бактериальной обсемененности женских половых путей. 7. Назначение эубиотиков приводит к уменьшению бактериальной обсемененности условно-патогенными микроорганизмами, способствует увеличению экспрессии TLR5 (в 3,9 раза) и TLR10 (в 28,3 раза), что снижает риск возникновения послеродового эндометрита. 211 8. позволяет Предлагаемый способ профилактики послеродового эндометрита повысить эффективность прогнозирования послеродового эндометрита с 24,7% до 67,7% (на 43,03%). Способ, основанный на комплексной терапии с интравагинальным введением эубиотиков, снижает частоту его возникновения с 24,7±4,7% до 2,9±2,9% (на 21,8%). 212 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. С целью прогноза развития невынашивания беременности ранних сроков у пациенток высокой степени риска (невынашивание в анамнезе) рекомендуется использовать способ, заключающийся в определении экспрессии COX-2 и CASP-3α в эпителии цервикального канала на сроке беременности 6-10 недель. Информативность способа составляет 91,2%. Вероятность самопроизвольного прерывания беременности рассчитывают по предложенной формуле: Y= a1x1+a2x2+C, где а – коэффициенты из таблицы 81, x – значение признака, c – константа, y – значение, по которому мы можем отнести женщину в одну или другую группу. Таблица 81 Информативные признаки и их коэффициенты дискриминантного сравнительного анализа при самопроизвольных выкидышах и прогрессирующей беременности раннего срока для COX-2 и CASP-3α, N=114, F (2,5)=231,97 p<0,00001 Коэффициенты признака Признак F- N=114 критерий р-уровень Самопроизвольное прерывание беременности Прогрессирующая беременность CASP-3α 267,8731 0,000016 155,7550 3007,030 COX-2 83,3752 0,000264 27,2986 533,609 -0,8383 -207,714 Constant Вероятность возникновения самопроизвольного прерывания беременности вычисляется по формуле: P=ey/1+ey 213 2. Беременных на сроке 38-39 недель из группы риска развития инфекционно-воспалительных осложнений и всех пациенток на 3 сутки послеродового периода рекомендуется обследовать разработанным способом определения экспрессии TRL4, TLR5 и белка их сигнального пути NF-kB. Экспрессию вышеуказанных факторов оценивают в эпителии цервикального канала. При снижении экспрессии одного или более показателя (TLR4<1,24, TLR5<0,016, NF-kB<0,000234) в эпителии цервикального канала на поздних сроках беременности женщину относят к группе высокого риска по развитию ГСЗ, поэтому ей назначается комплексная терапия с интравагинальным введением эубиотиков. При экспрессии TLR4>1,24, TLR5>0,016, NF- kB>0,000234 прогнозируется нормальное течение послеродового периода. На 3 сутки после родов при величине экспрессии TLR4<0,52, TLR5<0,103, NFkB<0,00108 прогнозируется развитие послеродового эндометрита и целесообразно назначение антибактериальной терапии в соответствии с результатами бактериологического исследования. При величине экспрессии TLR4>0,52, TLR5>0,103, NF-kB>0,00108 прогнозируется нормальное течение послеродового периода. 3. С целью коррекции экспрессии TLR4, TLR5 и NF-kB у беременных, угрожаемых по развитию послеродового эндометрита, необходимо использовать интравагинальные эубиотики. На сроке 38-39 недель при выявлении высокого риска послеродовых ГСЗ назначают КП, содержащий лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол, по 1 свече в сутки в течение 6 дней в сочетании с антибактериальной терапией в послеродовом периоде. При сниженной экспрессии TLR4, TLR5 и NF-kB в послеродовом периоде целесообразно назначение антибактериальной терапии в стандартном режиме в соответствии с результатами бактериологического исследования. 214 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абрамченко, В. В. Послеродовый эндометрит и субинволюция матки / В. В. Абрамченко. – Санкт-Петербург : Элби, 2008. – 240 с. 2. Айламазян, Э. К. Акушерство : учебник для мед. вузов / Э. К. Айламазян. – Санкт-Петербург : Спецлит, 2010. – 552 с. 3. Акушерство : курс лекций : учебное пособие / под ред. А. Н. Стрижакова, А. И. Давыдова. – Москва : Гэотар-Медиа, 2009. – 456 с. 4. Акушерство : национальное руководство / Э. К. Айламазян [и др.]. – Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 763 с. 5. Аль-Халаф Салах Еддин Послеродовый эндометрит : оптимизация лечения / Аль-Халаф Салах Еддин, А. Н. Кутеко, Н. В. Стрижова // Акушерство и гинекология. – 2002. – № 1. – С. 16–19. 6. Анализ факторов риска развития гнойно-септических осложнений у пациенток после самостоятельных и оперативных родов / И. Н. Коротких [и др.] // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. – 2011. – Т. 10, № 2. – С. 349–354. 7. Анохова, Л. И. Прогностическое значение содержания белков острой фазы в развитии послеродового эндометрита / Л. И. Анохова, А. В. Патеюк, Э. Д. Загородняя // Клиническая лабораторная диагностика. – 2012. – № 7. – С. 13– 14. 8. Антибиотикопрофилактика при операции кесарево сечение / Г. Сухих [и др.] // Врач. – 2011. – № 1. – С. 3–6. 9. Афиногенова, А. Г. Микробные биопленки ран: состояние вопроса / А. Г. Афиногенова, Е. Н. Даровская // Травматология и ортопедия России. – 2011. – № 3. – С. 119–125. 215 10.Ахматова, Н. К. Врожденный иммунитет: противоопухолевый и противоинфекционный / Н. К. Ахматова, М. В. Киселевский. – Москва : Практическая медицина, 2008. – 255 с. 11.Баев, О. Р. Профилактика железодефицита у беременных – основа лечения анемии и ассоциированных осложнений беременности / О. Р. Баев, П. В. Буданов, М. В. Рыбин // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2006. – Т. 5, № 4. – С. 89–92. 12.Балушкина, А. А. Антимикробная профилактика инфекционных осложнений кесарева сечения / А. А. Балушкина, В. Л. Тютюнник // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2011. – № 6. – С. 59–64. 13.Бартельс,А. В. Послеродовые инфекционные заболевания / А. В. Бартельс. – Москва : Медицина, 1973. – 226 с. 14.Басиладзе, Е. Н. Клинико-иммунологические критерии пуэрперия у родильниц с высоким инфекционным риском / Е. Н. Басиладзе, Н. В. Орджоникидзе, Л. В. Ванько // Проблемы репродукции. – 2011. – № 2. – С. 96– 99. 15.Басиладзе, Е. Н. Послеродовые инфекции: патогенез, диагностика, лечение / Е. Н. Басиладзе // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2008. – № 5 (7). – С. 68–72. 16.Беда, Ю. В. К вопросу пуэрперальных осложнений / Ю. В. Беда // Медицинский альманах. – 2009. – № 2. – С. 85–87. 17.Бухарин, О. В. Симбиотические взаимоотношения микроорганизмов при инфекции / О. В. Бухарин // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2013. – № 1. – С. 93–97. 18.Буштырева, И. О. Влияние гинекологической и экстрагенитальной патологии на функциональную активность эндометрия при самопроизвольном аборте, неразвивающейся и физиологической беременности в I триместре / 216 И. О. Буштырева, Н. Б. Лаура, М. В. Левченко // Кубанский научный медицинский вестник. – 2009. – № 9. – С. 11–14. 19.Буянова, С. Н. Особенности клинического течения эндомиометрита после кесарева сечения и его исходы / С. Н. Буянова, Н. А. Щукина, Н. В. Пучкова // Рос. вестн. акушера-гинеколога. – 2012. – № 5. – С. 84–88. 20.Вартанян, С. М. Ранняя комплексная диагностика послеродового эндометрита в акушерском стационаре обсервационного профиля / С. М. Вартанян, О. К. Федорович // Кубанский науч. мед. вестн. – 2007. – № 1-2. – С. 31–35. 21.Вербицкая, М.С. Патоморфологическое исследование последа у родильниц с послеродовым эндометритом / М. С. Вербицкая // Медицинский журнал. - 2011. - №: 1. - С. 36-39. 22.Возможности использования новых ультразвуковых технологий в диагностике послеродовых осложнений / Л. С. Логутова [и др.] // Рос. вестн. акушера-гинеколога. – 2007. – № 5. – С. 24–30. 23.Возможность ранней диагностики послеродовых гнойно-септических осложнений с использованием хроматографии и масс-спектрометрического анализа / Н. М. Подзолкова [и др.] // Мать и дитя : материалы 8-го Всерос. науч. форума, г. Москва, 3-6 окт. 2006 г. – Москва, 2006. – С. 203–204. 24.Воропаева, Е. Е. Самопроизвольный аборт : патоморфоз, этиология, патогенез, клинико-морфологическая характеристика, реабилитация : дис… дра мед. наук / Воропаева Екатерина Евгеньевна. – Челябинск, 2011. – 463 с. 25.Воскресенский, С. Л. Течение послеродового периода у женщин с индуцированными родами / С. Л. Воскресенский, И. Г. Шорох, Е. Н. Грудницкая // Репродуктивное здоровье Восточная Европа. – 2012. – № 2. – С. 47–51. 217 26.Галимов, А. И. Инфекционно-воспалительные осложнения после экстренного кесарева сечения и принципы их профилактики / А. И. Галимов // Мед. вестн. Башкортостана. – 2010. – Т. 5, № 3. – С. 48–50. 27.Генитальные микоплазмы в структуре оппортунистических инфекций влагалища и шейки матки у беременных / А. П. Никонов [и др.] // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2010. – Т. 9, № 5. – С. 5–9. 28.Государственная политика в области охраны здоровья матери и ребенка – долгосрочные перспективы развития / Г. Т. Сухих [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2013. – № 5. – С. 4–9. 29.Гребенкин, Б. Е. Определение прогноза послеродовых гнойносептических заболеваний / Б. Е. Гребенкин, Н. В. Устюжанина // Медицинский альманах. – 2010. – № 4. – С. 182–184. 30.Денисов, Б. П. Аборты в России : (по материалам выборочного исследования) / Б. П. Денисов, В. И. Сакевич // Доказательная медицина и клиническая эпидемиология. – 2009. – Т. 2, № 2. – С. 32–37. 31.Диагностическое значение прокальцитонина у больных с послеродовыми гнойно-септическими осложнениями / В. Н. Французов [и др.] // Рос. мед. журн. – 2011. – № 5. – С. 28–31. 32. Ефимов, Б. А. Современные методы оценки качественных и количественных показателей микрофлоры кишечника и влагалища / Б. А. Ефимов, Л. И. Кафарская, В. М. Коршунов // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2004. – № 4. – С. 72–78. 33.Железодефицитная анемия у беременных / Г. Н Гороховская [и др.] // Трудный пациент. – 2007. – № 9. – С. 24–26. 34.Заикина, А. И. Лабораторный практикум по общей микробиологии / А. И. Заикина. – Москва : РХТУ, 1984. – 40 с. 35.Заривчацкий, М. Ф. Эфферентная терапия в клинической практике : монография / М. Ф. Заривчацкий [и др.] ;; М-во здравоохранения и социального 218 развития Рос. Федерации, ГОУ ВПО «Пермская гос. мед. акад.», ГОУ ВПО «Ижевская гос. мед. акад.». – Пермь : Пермская гос. мед. акад. ;; Ижевск : Ижевская гос. мед. акад., 2009. – 240 с. 36.Захарова, Ю. А. Ведущие факторы развития внутрибольничных гнойно-септических инфекций в акушерских стационарах / Ю. А. Захарова, А. Н. Николаева, И. В. Фельдблюм // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2007. – № 6. – С. 72–75. 37.Значение определения уровня эндотоксина при послеродовых инфекционных осложнениях / С. В. Вдовин [и др.] // Мать и дитя : материалы 8го Всерос. науч. форума, г. Москва, 3-6 окт. 2006 г. – Москва, 2006. – С. 61. 38.Извекова, Е. В. Влияние дефицита железа на течение беременности и состояние новорожденных / Е. В. Извекова // Успехи современного естествознания. – 2008. – № 2. – С. 82–83. 39.Инфекции в акушерстве и гинекологии / под ред. О. В. Макарова, В. А. Алешкина, Т. Н. Савченко. – Москва : Медпресс, 2007. – 464 с. 40.Исходы лечения родильниц с осложненными формами послеродовых гнойно-септических заболеваний / О. К. Федорович [и др.] // Кубанский науч. мед. вестн. – 2010. – № 3/4. – С. 187–193. 41.Кадыков, А. М. Функциональная активность нейтрофилов как критерий эффективности медикаментозной профилактики развития инфекционно-воспалительных осложнений у беременных / А. М. Кадыков // Астраханский мед. журн. – 2011. – Т. 6, № 1. – С. 144–147. 42.Казачков, Е. Л. Морфофункциональная характеристика ремоделирования слизистой оболочки матки при невынашивании беременности инфекционно-воспалительного генеза / Е. Л. Казачков, Е. Е. Воропаева, Э. А. Казачкова // Уральский мед. журн. – 2009. – № 4. – С. 41–44. 219 43.Клинико-иммунологические особенности родильниц с послеродовым эндометритом / Б. Л. Гуртовой [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2006. – № 1. – С. 30–34. 44.Клинико-микробиологические особенности пуэрперального эндометрита, диагностика и лечение / В. С. Горин [и др.] // Сибирский мед. журн. – 2011. – Т. 101, № 2. – С. 9–16. 45.Клинические и лечебные особенности хронического эндометрита / О. А. Пересада [и др.] // Охрана материнства и детства. – 2010. – № 1. – С. 65–68. 46.Ковалева, Ю. В. Роль патологии эндометрия в структуре причин невынашивания беременности / Ю. В. Ковалева // Бюллетень ФЦСКЭ им. В. А. Алмазова. – 2010. – № 6. – С. 46–47. 47.Кокшарова, О. А. Бактерии и феноптоз / О. А. Кокшарова // Биохимия. – 2013. – Т. 78, № 9. – С. 1229–1238. 48.Коробков, Н. А. Диагностика морфофункционального состояния матки при послеродовой субинволюции : автореф. дис. … канд. мед. наук / Коробков Николай Александрович. – Санкт-Петербург, 2006. – 24 с. 49.Костин, И. Н. Резервы снижения репродуктивных потерь в Российской Федерации : автореф. дис. … д-ра мед. наук / Костин Игорь Николаевич. – Москва : РУДН, 2012. – 49 с. 50.Краснопольский, В. И. Акушерский сепсис как репродуктивная проблема / В. И. Краснопольский, С. Н. Буянова, Н. А. Щукина // Акушерство и гинекология. – 2007. – № 3. – С. 38–42. 51.Краснопольский, В. И. Гнойно-септические осложнения в акушерстве и гинекологии: патогенез, диагностика и лечебная тактика / В. И. Краснопольский, С. Н. Буянова, Н. А. Щукина // Рос. вестн. акушерагинеколога. – 2007. – № 5. – С.76–81. 220 52.Кулаков, В. И. Руководство по оперативной гинекологии / В. И. Кулаков, Н. Д. Селезнева, С. Е. Белоглазова. – Москва : Мединформагентство. – 2006. – 456 с. 53.Куперт, М. А. Эндометрит после родов (группы риска, особенности клиники и диагностики) / М. А. Куперт, П. В. Солодун, А. Ф. Куперт // Рос. вестн. акушера-гинеколога. – 2003. – № 4. – С. 42–46. 54.Кучеренко, М. А. Современные подходы к диагностике и лечению послеродовых инфекционных заболеваний / М. А. Кучеренко // Журн. акушерства и женских болезней. – 2011. – № 3. – С. 98–101. 55.Лебеденко, Е. Ю. Резервы снижения материнской смертности на современном этапе : автореф. дис. ... д-ра мед. наук / Лебеденко Елизавета Юрьевна. – Ростов-на-Дону, 2010. – 45 с. 56. Ломова, Н. А. Синдром системного воспалительного ответа / Н. А. Ломова, Н. В. Орджоникидзе, Л. В. Ванько // Акушерство и гинекология. – 2012. – № 1. – С. 23–27. 57.Макаров, О. В. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет / О. В. Макаров, Л. В. Ковальчук, Л. В. Ганковская. – Москва : Гэотар-медиа, 2007. – 176 с. 58.Мальцева, Л. И. Современные проблемы инфекционной патологии в акушерстве и гинекологии / Л. И. Мальцева // Практическая медицина. – 2010. – № 41. – С. 20–23. 59.Место абдоминального и влагалищного оперативного родоразрешения в современном акушерстве : реальность и перспективы / В. И. Краснопольский [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2012. – № 1. – С. 4–8. 60.Микробиологические и иммунологические особенности биотопов слизистых оболочек генитального и пищеварительного трактов при невынашивании беременности в I триместре / Т. Н. Савченко [и др.] // Рос. мед. журн. – 2008. – № 4. – С. 27–30. 221 61.Можейко, Л. Ф. Послеродовый эндометрит – современный взгляд на проблему / Л. Ф. Можейко, М. С. Вербицкая // Охрана материнства и детства. – 2009. – № 2. – С. 105–106. 62. Момот, А. П. Эволюция представлений о тромбофилии и ее роли в проблемах репродукции человека / А. П. Момот, И. А. Тараненко, Л. П. Цывкина // Акушерство и гинекология. – 2013. – № 2. – С.4–9. 63. Нартаева, А. Е. Морфологическая характеристика соскобов эндометрия при прерванной беременности [Электронный ресурс] / А. Е. Нартаева, А. Б. Усманова, М. А. Нуралиева // Вестник КазНМУ. – 2013. – № 3. – Режим доступа: http://kaznmu/kz/ress/2013/03/18/морфологическая- характеристика-соск/. – (02.05.2014). 64.Нарушение микробиоценоза влагалища как фактор невынашивания беременности / Т. Н. Савченко [и др.] // Лечение и профилактика. – 2012. – № 1. – С. 39–43. 65.Наумкин, Н. Н. Ранняя диагностика и профилактика субинволюции послеродовой матки / Н. Н. Наумкин, А. Н. Иванян, Т. И. Смирнова // Вестн. новых мед. технологий. – 2008. – Т. XV, № 2. – С.46–48. 66.Некоторые актуальные вопросы акушерства / Г. М. Савельева [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2006. – № 3. – С. 3–6. 67.Некоторые аспекты этиологии и патогенеза эмбриональных потерь в I триместре гестации / Ю. Э. Доброхотова [и др.] // Рос. вестн. акушерагинеколога. – 2008. – Т. 8, № 5. – С. 15–19. 68.Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений : приказ Минздрава СССР от 22 апр. 1985 г. № 535 // КонсультантПлюс : Документы СССР : справочная правовая система [Электронный ресурс]. 222 69.Овчарук, Э. А. Бактериологическая и гистологическая диагностика хронического эндометрита при бесплодии / Э. А. Овчарук, К. А. Хадарцева // Вестн. новых мед. технологий. – 2010. – № 41. – С. 20–23. 70.Оптимизация диагностики и лечения послеродового эндометрита / В. С. Горин [и др.] // Рос. вестн. акушера-гинеколога. – 2009. – № 1. – С. 21–29. 71.Осложнения пуэрперия в современных условиях и способы их доклинической диагностики / С. В. Новикова [и др.] // Рос. вестн. акушерагинеколога. – 2007. – № 5. – С. 56–59. 72.Осложненное течение пуэрперия : ранние критерии диагностики / С. В. Новикова [и др.] // Мать и дитя : материалы 10-го Всерос. науч. форума, г. Москва, 29 сент.–2 окт. 2009. – Москва, 2009. – С. 148. 73.Особенности восстановления влагалищного микробиоценоза у родильниц после естественных родов и оперативного родоразрешения / Ж. Ю. Колесаева [и др.] // Журн. акушерства и женских болезней. – 2009. – № 3. – С. 25–31. 74.Особенности послеродовых гнойно-септических заболеваний и подходы к формированию групп риска в современных условиях / В. Е. Радзинский [и др.] // Вестн. Рос. ун-та дружбы народов. Сер. Медицина – 2008. – № 1. – С. 5–11. 75.Персистентные вирусные инфекции и факторы, способствующие их активации, у женщин с привычным невынашиванием беременности / Т. И. Коноплева [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2006. – № 5. – С. 17–20. 76.Послание Президента Владимира Путина Федеральному Собранию РФ : Послание Президента РФ Федеральному Собранию от 12 дек. 2012 г. // Российская газета. – 2012. – 13 дек. 77.Послание Президента РФ Владимира Путина Федеральному Собранию : Послание Президента РФ Федеральному Собранию от 12 дек. 2013 г. // Российская газета. – 2013. – 13 дек. 223 78.Послание Президента РФ Дмитрия Медведева Федеральному Собранию Российской Федерации : Послание Президента РФ Федеральному Собранию от 12 нояб. 2009 г. // Российская газета. – 2009. – 13 нояб. 79.Послание Президента РФ Дмитрия Медведева Федеральному Собранию Российской Федерации : Послание Президента РФ Федеральному Собранию от 30 нояб. 2010 г. // Российская газета. – 2010. – 1 дек. 80.Послание Президента РФ Федеральному Собранию : Послание Президента РФ Федеральному Собранию от 22 дек. 2011 г. // Российская газета. – 2011. – 23 дек. 81.Причины и технология анализа репродуктивных потерь / под ред. О. Г. Фроловой, Г. М. Бурдули. – Москва : Триада-Х, 2008. – 128 с. 82.Прогностическое значение экспрессии генов молекул врожденного иммунитета (TLR2, TLR4 и HBD1) при невынашивании беременности / И. В. Бахарева [и др.] // Лечащий врач. – 2012. – № 9. – С. 84–89. 83.Профилактика послеродовых гнойно-воспалительных заболеваний / В. С. Горин [и др.] // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2011. – Т. 10, № 1. – С. 67–74. 84.Пшеничникова, Е. Б. Роль тромбофилии в развитии акушерской патологии у женщин с метаболическим синдромом / Е. Б. Пшеничникова, Т. Б. Пшеничникова, А. Д. Макацария // Акушерство и гинекология. – 2006. – № 4. – С. 15–19. 85.Радзинский, В. Е. Неразвивающаяся беременность / В. Е. Радзинский, В. И. Димитрова, И. Ю. Майскова. – Москва : Гэотар-медиа, 2009. – 208 с. 86.Ранние сроки беременности / под ред. В. Е. Радзинского, А. А. Оразмурадова. – Москва : Мединформагентство, 2005. – 448 с. 87.Репина, М. А. Сепсис: размышления в связи с материнской смертностью / М. А. Репина // Журнал акушерства и женских болезней. – 2005. – № 3. – С. 74–82. 224 88.Репродуктивные проблемы оперированной матки / В. И. Краснопольский [и др.] // Рос. вестн. акушера-гинеколога. – 2013. – Т. 13, № 1. – С. 78–81. 89.Роль иммунной системы в патогенезе гнойно-воспалительных заболеваний пуэрперия / В. С. Горин [и др.] // Сибирский мед. журн. – 2012. – Т. 108, № 1. – С. 5–10. 90.Роль Толл-подобных рецепторов и дефенсинов в противомикробной защите урогенитального тракта женщин / О. А.Ганковская [и др.] // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2008. – № 1. – С. 46–50. 91.Романовская, В. В. Прогностическое значение компонентов врожденного иммунитета (TLR2, TLR4 и HBD1) у беременных с высоким риском реализации внутриутробной инфекции : автореф. дис. … канд. мед. наук / Романовская Валентина Валерьевна. – Москва, 2009. – 20 с. 92.Руднев, С. Г. Моделирование развития Т-системы иммунитета и оценка Т-системы распределения ресурсов / С. Г. Руднев, А. А. Романюха, А. И. Яшин // Математическое моделирование. – 2007. – Т. 19, № 11. – С. 25–42. 93.Савченко, Т. Н. Роль нарушений микробиоценоза слизистых оболочек генитального и пищеварительного трактов в невынашивании беременности / Т. Н. Савченко // Вестн. Рос. гос. мед. ун-та. – 2008. – № 5. – С. 21–25. 94.Сакевич, В. И. Особенности внутрисемейного контроля рождаемости в России / В. И. Сакевич // Родители и дети, мужчины и женщины в семье и обществе : сб. аналит. ст. / под ред. С. В. Захарова, Т. М. Малевой, О. В. Синявской. – Москва, 2009. – Вып. 2 – С. 119–138. 95.Селихова, М. С. Особенности содержания эндотоксина и уровня провоспалительных цитокинов у родильниц с физиологическим и осложненным течением послеродового периода / М. С. Селихова // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. – 2006. – № 4. – С. 821–824. 225 96.Сельков, С. А. Механизмы иммунорегуляции развития плаценты / С. А. Сельков, О. В. Павлов, Д. И. Соколов // Журн. акушерства и женских болезней. – 2011. – Т. 60, № 3. – С. 136–140. 97.Серов, В. Н. Неотложная помощь в акушерстве и гинекологии / В. Н. Серов. – Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 256 с. 98.Серов, В. Н. Профилактика материнской смертности / В. Н. Серов // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 7-1. – С. 4–10. 99.Серов, В. Н. Пути снижения акушерской патологии / В. Н. Серов // Акушерство и гинекология. – 2007. – № 5. – С. 8–12. 100. Серова, О. Ф. Лечение пациенток с хроническим эндометритом перед проведением экстракорпорального оплодотворения / О. Ф. Серова, Н. В. Зароченцева, М. В. Капустина // Рос. вестн. акушера-гинеколога. – 2008. – № 5. – С. 54–58. 101. Сидельникова, В. М. Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием : метод. пособия и клинические протоколы / В. М. Сидельникова. – Москва : Медпресс-информ, 2010. – 224 с. 102. Сидорова, И. С. Послеродовые гнойно-воспалительные заболевания / И. С. Сидорова, И. О. Макаров, С. А. Леваков. – Москва : Мединформагентство, 2006. – 128 с. 103. Сидорова, И. С. Физиология и патология родовой деятельности : учебник / И. С. Сидорова. – Москва : Мединформагентство, 2006. – 240 с. 104. Синдром системной воспалительной реакции у родильниц с осложненным течением пуэрперия / В. А. Ананьева [и др.] // Вестн. Рос. воен.мед. акад. – 2011. – № 3. – С. 49–52. 105. Смолянова, Г. Г. Современная ПЦР-лаборатория / Г. Г. Смолянова // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, Клиническая медицина. – 2010. – Т. 8, № 4. – С. 208–209. 226 106. Современные принципы прегравидарной подготовки и ведения беременности у женщин с воспалительными заболеваниями репродуктивной системы / Т. Ю. Пестрикова [и др.] // Дальневосточный мед. журн. – 2010. – № 3. – С. 28–31. 107. Состояние интерферонового статуса и оценка профилактической эффективности кипферона у родильниц с высоким риском послеродовых осложнений / Е. Н. Басиладзе [и др.] // Мать и дитя : материалы 10-го Всерос. науч. форума, г. Москва, 28 сент.–1 окт. 2007 г. – Москва, 2008. – С. 20–21. 108. Стрижаков, А. Н. Акушерство : курс лекций / А. Н. Стрижаков, А. И. Давыдова. – Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 456 с. 109. Стрижова, Н. В. Сходство и различия субинволюции матки и послеродового эндометрита / Н. В. Стрижова, А. Н. Кутеко, А. С. Гавриленко // Акушерство и гинекология. – 2005. – № 1. – С. 30–34. 110. Сулакшин, С. С. Корреляционный факторный анализ российского демографического кризиса / С. С. Сулакшин // Власть. – 2007. – № 1. – С. 16–28. 111. Суханова, Л. П. Родовспоможение в России – состояние, тенденции развития, пути совершенствования / Л. П. Суханова, С. А. Леонов // Социальные аспекты здоровья населения. – 2010. – Т. 14, № 2. – С. 15–22. 112. Сухих, Г. Т. Иммунные факторы в этиологии и патогенезе осложнений беременности / Г. Т. Сухих, Л. В. Ванько // Акушерство и гинекология. – 2012. – № 1. – С. 123–136. 113. Сухих, Г. Т. Уровень провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и лохиях у родильниц после самопроизвольных родов / Г. Т. Сухих, Т. А. Федорова, Н. В. Орджоникидзе // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2005. – № 2. – С. 56–58. 114. Тетруашвили, Н. К. Программа обследования и предгестационой подготовки пациенток с привычным выкидышем : клиническая лекция / Н. К. 227 Тетруашвили, А. А. Агаджанова // Акушерство и гинекология. – 2012. – № 6. – С. 87–91. 115. Тетруашвили, Н. К. Ранние потери беременности (иммунологические аспекты, пути профилактики и терапии) : дис. … д-ра мед. наук / Тетруашвили Нана Картлосовна. – Москва, 2008. – 376 с. 116. Титченко, Ю. П. Современные аспекты ультразвуковой диагностики осложнений в послеродовом периоде / Ю. П. Титченко, Л. С. Логутова, И. В. Климова // Рос. вестн. акушера-гинеколога. – 2006. – № 3. – С. 22–25. 117. Толл-подобные рецепторы в генезе не вынашивания / О. В. Макаров [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2008. – № 2. – С. 22–28. 118. Тромбофилия и потеря беременности / С. С. Мондоева [и др.] // Тромбоз, гемостаз и реология. – 2009. – № 3. – С. 21–28. 119. Узлова, Т. В. Иммунологическое бесплодие: проблемы и возможности / Т. В. Узлова, Е. К. Лейхнер, О. В. Маркина // Вестн. Юж.-Урал. ун-та. Сер. Образование, здравоохранение, физическая культура. – 2011. – № 26. – С. 100–103. 120. Федорова, Ж. П. Проблема послеродовых инфекционно- воспалительных заболеваний и значение ее решения для улучшения состояния материнского здоровья / Ж. П. Федорова, Н. К. Минуллина // Общественное здоровье и здравоохранение. – 2011. – № 1. – С. 28–33. 121. Фролова, О. Г. Материнская смертность после оперативного родоразрешения / О. Г. Фролова, Г. М. Бурдули, Н. А. Дурасова // Мать и дитя : материалы 9-го Всерос. науч. форума, г. Москва, 2–5 окт. 2007 г. – Москва, 2007. – С. 278–279. 122. Хронический эндометрит в генезе невынашивания беременности / Д. Ю. Айрапетов [и др.] // Мать и дитя в Кузбассе. – 2012. – Т. 1, № 1. – С. 77– 83. 228 123. Черемискин, В. П. Новые пути в диагностике послеродовых гнойносептических заболеваний / В. П. Черемискин // Вестн. Уральской мед. академической науки. – 2010. – № 30. – С. 103–104. 124. Шляпников, М. Е. Этиотропная терапия послеродового эндометрита / М. Е. Шляпников, К. Н. Арутюнян // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2007. – № 2. – С. 48–53. 125. Экономический ущерб от ведущих внутрибольничных гнойносептических инфекций новорожденных и родильниц / Н. И. Маркович [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2010. – № 4. – С. 26–29. 126. Этиологические аспекты репродуктивных потерь в ранние сроки беременности / Ю. И. Тирская [и др.] // Омский науч. вестн.Сер. Ресурсы Земли. Человек. – 2010. – № 1. – С. 149–152. 127. Эфферентная терапия в комплексном лечении послеродового эндометрита / М. Л. Черненкова [и др.] // Фундаментальная медицина. – 2013. – № 9. – С. 1164–1167. 128. 1918 pandemic influenza and pneumonia in a large civil hospital / J. V. Nuzum, I. Pilot, F. H. Stangl, B. E. Bonar // IMJ Ill. Med. J. – 1976. – Vol. 150. – P. 612–616. 129. A human homologue of the drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity / R. Medzhitov, P. Preston-Hurlburt, Jr. C. A. Janeway // Nature. – 1997. – Vol. 388. – P. 394–397. 130. A new model for inflammation-induced preterm birth: the role of platelet-activating factor and Toll-like receptor-4 / M. A. Elovitz, Z. Wang, E. K. Chien [et al.] // Am. J. Pathol. – 2003. – Vol. 163. – P. 2103–2111. 131. A role for TLRs in the regulation of immune cell migration by first trimester trophoblast cells / V. M. Abrahams, I. Visintin, P. B.Aldo [et al.] // J. Immunol. – 2005. – Vol. 175. – P. 8096–8104. 229 132. Abrahams,V. M. Toll-like receptors and their role in the trophoblast /V. M. Abrahams, G. Mor// Placenta. – 2005. – Vol.26. – P.540–547. 133. Activation of innate immunity, inflammation, and potentiation of DNA vaccination through mammalian expression of the TLR5 agonist flagellin / S. Applequist, S. Rollman, M. Wareing [et al.] // J. Immunol. – 2005. – Vol. 175. – P. 3882–3891. 134. Activation of Toll-like receptor 5 decreases the attachment of human trophoblast cells to endometrial cells in vitro / W. Aboussahoud, C. Bruce, S. Elliott, A. Fazeli // Hum. Reprod. – 2010. – Vol. 25. – P. 2217–2228. 135. Activation of toll-like receptors 2 or 3 and preterm delivery in the mouse / V. Ilievski, S. J. Lu, E. Hirsch // Reproductive Sciences. – 2007. – Vol. 14. – P. 315–320. 136. Adams, O. Role of Indoleamine-2, 3-Dioxygenase in Alpha/Beta and Gamma Interferon-Mediated Antiviral Effects against Herpes Simplex Virus Infections / O. Adams, C.Becken, C.Oberdorfer [et al.] // J. Virol. – 2004. – Vol. 78. – P. 2632–2636. 137. Adverse reproductive outcomes in urban women with adeno-associated virus-2 infections in early pregnancy / F. Arechavaleta-Velasco, L. Gomez, Y. Ma [et al.] // Hum. Reprod. – 2008. – Vol. 23. – P. 29–36. 138. Altered inflammatory responses in TLR5-deficient mice, infected with Legionella pneumophila / T. Hawn, W. Berrington, I. Smith [et al.] // J. Immunol. – 2007. – Vol. 179. – P. 6981–6987. 139. Antiphospholipid antibodies induce a pro-inflammatory response in first trimester trophoblast via the TLR4 / MyD88 pathway / M. J. Mulla, J. J. Brosens, L. W. Chamley // Am J Reprod Immunol. – 2009. – Vol. 62. – P. 96–111. 140. Antiphospholipid syndrome dilemmas still to be solved: 2008 status / Y. Shoenfield, P. Meroni, R. Cervera // Ann Rheum Dis. – 2008. – Vol. 67. – P. 438– 442. 230 141. Antiviral responses induced by the TLR3 pathway / M. Matsumoto, H. Oshiumi, T. Seya // Reviews in Medical Virology. – 2011. – Vol. 21, Iss. 2. – P.67–77. 142. Argaval, V. Intrauterine infection and preterm labor/ V. Argaval, E. Hirsch // Semin Fetal Neonatal Med. – 2012. – Vol. 17. – P. 12–19. 143. Aronoff, D. M. Postpartum invasive group A streptococcal disease in the modern era / D. M. Aronoff, A. Z. Mulla // Infect. Dis. Obstet. Gyn. – 2008. – 31 Dec. – P. 199–205. 144. Bacterial Modulation of Human Fetal Membrane Toll-like Receptor Expression / V. M. Abrahams, J. A. Potter, G. Bhat, R. P. Morgan [et al.] // Am J Reprod Immunol. – 2013. – Jan. – P. 33–69. 145. Bacterially-induced preterm labor and regulation of prostaglandinmetabolizing enzyme expression in mice: the role of toll-like receptor 4 / H. Wang, E. Hirsch // Biology of Reproduction. – 2003. – Vol. 69. – P. 1957–1963. 146. Barton, G. R. Severe sepsis andseptic shock in pregnancy / G. R. Barton, B. M. Sibai // Obstet. Gynecol. – 2012. – Vol. 120. – P. 689–706. 147. Beutler, B. TLRs and innate immunity / B. Beutler // Blood. – 2009. – Vol. 113. – P. 1399–1407. 148. Bihl, F. Overexpression of Toll-like receptor 4 amplifies the host response to lipopolysaccharide and provides a survival advantage in transgenic mice / F. Bihl, L. Salez, M. Beaubier [et al.] // J. Immunol. – 2003. – Vol. 15, №170. – P. 6141–6150. 149. Blasius, A. L. Intracellular toll-like receptors / A. L. Blasius, B. Beutler // Immunity. – 2010. – Vol. 32. – P. 305–315. 150. Bowie, A.G. The role of Toll-like receptors in the host response to viruses / A.G.Bowie, I.R. Haga // Mol. Immunology.– 2005. – Vol. 42, №8. – P.859– 867. 231 151. Cakmak, H. Implantation failure: molecular and clinical treatment / H. Cakmak, H. S. Taylor // Hum. Reprod. Update. – 2011. – Vol. 17. – P. 242–253. 152. Canavan, T. P. Innate immune function of the human decidual cell at the maternal-fetal interface / T. P. Canavan, H. N. Simhan // J. Reprod. Immunol. – 2007 – Vol. 74. – P. 46–52. 153. Candida albicans Triggers Activation of Distinct Signaling Pathways to Establish a Proinflammatory Gene Expression Program in Primary Human Endothelial Cells / V. Muller, D. Viemann, M. Schmidt [et al.] // J. Immunol. –2007. – Vol. 179. – P. 8435–8445. 154. Carp, H. J. A. Recurrent pregnancy loss: causes, controversies and treatment / H. J. A. Carp // London : UK, 2007. – 290 p. 155. Carp. H. A. Systematic review of dydrogesterone for treatment of threatened miscarriage / H. A. Carp // Gynecol. Endocrinol. – 2012. – Vol. 28. – P. 938–990. 156. CD200+ CK7+ trophoblasts in a poly (I: C)-induced embryo resorption model / Y. Lin, Y. Zeng, J. Di, S. Murine Zeng // Reproduction. – 2005. – Vol. 130. – P. 529–537. 157. Cell typespecific expression and function of toll-like receptors 2 and 4 in human placenta: implications in fetal infection. / Y. Ma, G. Krikun, V. M. Abrahams, G. Mor, S. Guller // Placenta. – 2007. – Vol. 28. – P. 1024–1031. 158. Characterization of the macrophage-stimulating activity from Ureaplasma urealyticum / M. R. Peltier, A. J. Freeman, H. H. Mu, B. C. Cole // American Journal of Reproductive Immunology. – 2007. – Vol. 57, № 3. – P. 186– 192. 159. Characterization of Toll-like receptors in the female reproductive tract inhumans / A. Fazeli, C. Bruce, D. O. Anumba // Hum. Reprod. – 2005. – Vol. 20. – P. 1372–1378. 232 160. Chlamydia heat shock protein 60 induces trophoblast apoptosis through TLR4 / O. Equils, D. Lu, M. Gatter [et al.] // J. Immunol. – 2006. – Vol.177. – P. 1257–1263. 161. Chlamydia trachomatis-associated tubal factor subfertility: immunogenetic aspects and serological screening/ J.E.Den Hartog, S.A.Morre, J.A.Land // Hum. Reprod. Update. – 2006. – Vol. 12, № 6. – P. 719–730. 162. Chomchinsky, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocionate-phenol-chloroform extraction. / P.Chomchinsky, N.Saccini // Annal. Biochem. – 1987. – Vol.162 (1) – P. 156–159. 163. Chronic endometritis is a frequent finding in women with recurrent implantation failure after in vitro fertilization /E.B.Johnston-MacAnanny, J. Hartnett, L. L. Engmann, J. C. Nulsen, M. M. Sanders, C. A. Benadiva // Fertil Steril. – 2010. – Vol. 93(2). – P. 437–441. 164. Citrobacter peritonitis: two cases and review of the literature/ M. Gursu, Z. Aydin, F. Pehlivanoglu [et al.] // Perit. Dial. Int. – 2011. – Vol. 31. – P. 409–411. 165. Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells / C. Roshick, H. Wood, H. D. Caldwell, G. McClarty // Infect. Immun. – 2006. – Vol. 74. – P. 225–238. 166. Conventional Dendritic Cells Mount a Type I IFN Response against Candida spp. Requiring Novel Phagosomal TLR7-Mediated IFN-β Signalin / C. Buorgeois, O. Majer, I. Frohner [et al.] // J. Immunol. – 2011. – Vol. 186. – P. 3104–3112. 167. Co-occurrence of Trichomonas vaginalis and bacterial vaginosis and vaginal shedding of HIV-1 RNA / D. R. Fastring, A. Amedee, M. Gatski [et al.] // Sex Transm Dis. – 2014. – Vol. 41. – P. 173–179. 168. COX-2 Inhibition Suppresses the Interferon- -Induced Expression of Indoleamine-2,3-Dioxygenase (IDO) in Human Leukemia Cell Lines / M. G. 233 Iachininoto, E. R. Nuzzolo, A. D. Maggio, G. Bonanno [et al.] // Blood (ASH Annual Meeting Abstracts). – 2008. – Vol. 112. – P. 1623. 169. Cutting Edge:Tlr5–/–Mice Are More Susceptible toEscherichia coli Urinary Tract Infection / E.Andersen-Nissen, T. R. Hawn, K. D. Smith [et al.] // J. Immunol.– 2007. – Vol. 178. – P. 4717–4720. 170. Cutting-edge report: TLR10 plays a role in mediating bacterial peptidoglycan-induced trophoblast apoptosis / M. J. Mulla, K. Myrtolli, S. Tadesse, N. L. Stanwood [et al.] // Am J Reprod Immunol. – 2013. – Vol. 69(5). – P. 449–453. 171. Darville, T. Pathogenesis of Genital Tract Disease Due to Chlamydia trachomatis / T. Darville, T. J. Hiltke // J Infect Dis. – 2010. – Vol. 201 (Sup. 2). – S.114–125. 172. Decidual Macrophages Are Significantly Increased in Spontaneous Miscarriages and Over-Express FasL: A Potential Role for Macrophages in Trophoblast Apoptosis / S. Guenther, T. Vrekoussis, S. Heublein [et al.] // Int J Mol Sci. – 2012. – Vol. 13(7). – P. 9069–9080. 173. Decreased survival of newborn neurons in the dorsal hippocampus after neonatal LPS exposure in mice / K. Jarlestedt, A. S. Naylor, J. Dean, H. Hagberg [et al.] // Neuroscience. – 2013. – Vol. 253. – P. 21–28. 174. Defining postpartum uterine disease and the mechanisms of infection and immunity in the female reproductive tract in cattle / M. Sheldon, J. Cronin, L. Goetze [et al.] // Biology of Reproduction. – 2009. – Vol. 81, № 6. – P. 1025– 1032. 175. Detection of Ureaplasmas by the polymerase chain reaction in the amniotic fluid of patients with cervical insufficiency / K. J. Oh, S. E. Lee, H. Jung, G. Kim, R. Romero // J Perin Med. – 2010. – Vol. 38, № 3. – P. 261–268. 176. Differential COX-2 induction by viral and bacterial PAMPs: Consequences for cytokine and interferon responses and implications for anti-viral 234 COX-2 directed therapies / N. S. Kirkby, A. K. Zaiss, W. R. Wright, J. Jiao, M. V. Chan // Biochem Biophys Res Commun. – 2013. – Vol. 23, № 438. – P. 249–256. 177. Differential Expression of Toll-Like Receptors 2 and 4 in Tissues of the Human Female Reproductive Tract / P. Pioli A., E. Amiel, T. Shaefer, J. Connoly // Infect. Immun. – 2004. – Vol. 72. – P. 5799–5806. 178. Divergent trophoblast responses to bacterial products mediated by TLRs / V. M. Abrahams, P. Bole-Aldo, Y. M. Kim [et al.] // J. Immunol. – 2004. – Vol. 173. – P. 4286–4296. 179. Do host genetic traits in the bacterial sensing system play a role in the development of Chlamydia trachomatis-associated tubal pathology in subfertile women? / J. E.Den Hartog, S.Ouburg, J. A. Land [et al.] // BMC Infectious Diseases. – 2006. – № 6. – P. 122. 180. Doherty, M. T. TB or not TB: that is the question – does TLR signaling hold the answer ? / M. T. Doherty, M. Aridity // Clin Ivest. – 2004. – Vol. 114 (12). – P. 1699–1703. 181. Down-regulation of Toll-like receptor 4 is related to the tolerance to lipopolysaccharide in rat alveolar macrophages / D. M. Zhang, Y. W. Li, B. L. Mao, G. S. Qian // Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. – 2003. – Vol. 26. – P. 411–414. 182. Drawz, S. Three Decades of β-Lactamase Inhibitors / S. Drawz, R. Bonomo // Clin. Microbiol. Rev. –2010. – Vol. 23. – P. 160–201. 183. Effects of antibiotics on expression and function of Toll-like receptors 2 and 4 on mononuclear cells in patients with advanced cirrhosis / A. G. Testro, P. J. Gow, P. W. Angus, S. Wongseelashote // J. Hepatol. – 2010. – Vol. 52(2). – P. 199– 205. 184. Elovitz, M. A. Can medroxyprogesterone acetate alter Toll-like receptor expression in a mouse model of intrauterine inflammation? / M. A. Elovitz, C. Mrinalini // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2005. – Vol. 193. – P. 1149–1155. 235 185. Endometrial inflammation and effect on implantation improvement and pregnancy outcome / I. Granot, Y. Gnainsky, N. Dekel // Reproduction. – 2012. – Vol. 144, № 6. – P. 661–668. 186. Endotoxin-induced chorioamnionitis modulates innate immunity of monocytes in preterm sheep / B. W. Kramer, M. Ikegami, T. J. Moss [et al.] // Am J Respir Crit Care Med. – 2005. – Vol. 171. – P. 73–77. 187. Enhanced Indoleamine-2, 3-Dioxygenase Activity in Patients with Severe Sepsis and Septic Shock / P. Tattevin, D. Monnier, O. Tribut, J. Dulong //The Journal of Infectious Disease. –2010. – Vol. 201. – P. 956–966. 188. Epidemiology of Invasive Streptococcus pyogenes Infections in France in 2007 / A. Lepoutre, A. Doloy, P. Bidet [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2011. – № 49. – P. 4094–4100. 189. Establishment of dorso-ventral polarity in the Drosophila embryo: the induction of polarity by the Toll-genes product / K. V.Anderson, L.Bokla, C. Nusslein-Volhard // Cell. – 1985. – Vol. 42. – P. 791–798. 190. Evidence for the presence of Toll-like receptor 4 system in the human endometrium./ T.Hirata, Y.Osuga, Y.Hirota [et al.] // J Clin Endocrinol Metab. – 2005. – Vol. 90. – P. 548–556. 191. Evolution of the chicken Toll-like receptor gene family: a story of gene gain and gene loss / N. D. Temperley, S. Berlin, I. R. Paton, D. K. Griffin, D. W. Burt // BMC Genomics. – 2008. – Vol. 9. – P. 1703–1715. 192. Expression and activity of Toll-like receptors 1–9 in the human term placenta and changes associated with labor at term / S.Patni, L.Wynen, A.Seager [et al.] // Biol Reprod. – 2009. – Vol. 80, № 2. – P. 243–248. 193. Expression and function of Toll-like receptor 4 in the endometrial cells of the uterus / S. Herath, D. P. Fischer, D. Werling [et al.] // Endocrinology. – 2006. – Vol. 147. – P. 562–570. 236 194. Expression and subcellular localization of TLR-4 in term and first trimester human placenta / E. C. Beijar, C. Mallard, T. L. Powell // Placenta. – 2006. – Vol. 27. – P. 322–326. 195. Expression of indoleamine 2, 3-dioxygenase 1 in the vascular endothelium at both sides of the feto-maternal interface / P. Sedlmayr, M. Gauster, D. Fuchs, I. Lang // J Repr Immun. – 2011. – Vol. 90, Iss. 2. – P. 164. 196. Expression of toll-like receptors 2, 3, 4, and 9 genes in the human endometrium during the menstrual cycle / T. Hirata, Y. Osuga, K. Hamasaki [et al.] // J Reprod Immunol. – 2007. – Vol. 74. – P. 53–60. 197. Expression of Toll-like receptors in the human decidua / G. Krikun, C. J. Lockwood, V. M. Abrahams, G. Mor, M. Paidas, S. Guller // Histol Histopathol. – 2007. – Vol. 22. – P. 847–854. 198. Fairchild, K. Early-onset neonatal sepsis / K. Fairchild, R. Polin // Clinical Perinatology. – 2010. – Vol. 37, № 2. – P. 307–534. 199. Fallarino, F. Using an ancient tool for igniting and propagating immune tolerance: IDO as an inducer and amplifier of regulatory T-cell functions / F. Fallarino, U. Grohmann // Current Medicinal Chemistry. – 2011. – Vol. 18, №15. – P. 2215–2221. 200. Flagellin Induces Antibody Responses through a TLR5- and Inflammasome-Independent Pathway / A. H. López-Yglesias, Zhao Х. Xiaodan, E. K. Quarles, M. Lai [et al] // J. Immunol. – 2014. – Vol. 192. – P. 1587–1596. 201. Flavivirus infection induces indoleamine-2, 3-dioxygenase in human monocyte-derived macrophages via tumor necrosis factor and NF- B. / A. Yeung, Wei Wu, M. Freewan [et al.] // J. Leukoc. Biol. – 2012. – Vol. 91. – P. 657–666. 202. Freed, E. O. Antiviral innate immunity: ed. Overview / E. O. Freed, M. Jr. Gale // J Mol Biol. – 2014. – Vol. 20, № 426 (6). – P. 1129–1132. 237 203. Frequency and treatment of methicillin resistant Staphylococcus aureus in obstetric and gynaecological sepsis / I. J. Butt, S. Khan, S. Butt, S. Bhutta // J Coll Physicians Surg Pak. – 2013. – Vol. 23(10). – P. 708–710. 204. Functional expression of pattern recognition receptors in tissues of the human female reproductive tract [Electronic resource] / K. M. Hart, A. J. Murphy, K. T. Barrett, C. R. Wira, M. P. A Guyre, P. A. Pioli // J Reprod Immunol. – 2009. – Jun. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19406482. 205. Functions of natural killer cells / E. Vivier, E. Tomasello, M. Baratin, T. Walzer, S. Ugolini // Nat Immunol. – 2008. – Vol. 9. – P. 503–510. 206. GF Induction of cyclooxygenase (COX)-2 in human vaginal epithelial cells in response to TLR ligands and TNF-α / T. Joseph, I. A. Zalenskaya, N. Yousefieh, S. D. Schriver, L. C. Cote, N. Chandra // Am J Reprod Immunol. – 2012. – Vol. 67(6). – P. 482–490. 207. Gram-positive bacteria enhance HIV-1 susceptibility in Langerhans cells, but not in dendritic cells, via Toll-like receptor activation / Y. Ogawa, T. Kawamura, T. Kimura [et al.] // Blood. – 2009. – Vol. 113. – P. 5157–5166. 208. Hall-Stoodley, L. Evolving concepts in biofilm infections / L. HallStoodley, P. Stoodley // Cell Microbiol. – 2009. – Vol. 11, № 7. – P. 1034–1043. 209. Helicobacter pylori-Induced Invasion and Angiogenesis of Gastric Cells Is Mediated by Cyclooxygenase-2 Induction through TLR2/TLR9 and Promoter Regulation / Y. J.Chang, M. S.Wu, J. T. Lin [et al.] // J. Immunol. – 2005. – Vol. 175. – P. 8242–8252. 210. Herpes simplex virus infection in pregnancy and in neonate: status of art of epidemiology, diagnosis, therapy and prevention / E. Anzivino, D. Fioriti, M. Mischitelli [et al.] // Virology journal. – 2009. – № 6. – P. 40. 211. Human Fetal Membranes Generate Distinct Cytokine Profiles in Response to Bacterial Toll-like Receptor and Nod-like Receptor Agonists / M. 238 Hoang, J. A. Potter, S. M. Gysler, C. S. Han // Biology of Reproduction. – 2014. – Vol. 26. – P. 520–527. 212. Human oviductal epithelial cells express Toll-like receptor 3 and respond to double-stranded RNA: Fallopian tube-specific mucosal immunity against viral infection / K. Nasu, H. Itoh, A. Yuge, M. Nishida, H. Narahara // Hum. Reprod. – 2007. –Vol. 22. – P. 356–361. 213. Human TLR10 Is a Functional Receptor, Expressed by B Cells and Plasmacytoid Dendritic Cells, Which Activates Gene Transcription through MyD88 / U. Hazan, C. Chaffois, C. Gaillard, V. Sauliner //The Journal of Immunology. – 2005. – Vol. 174, № 5. – P. 2942–2950. 214. Human TLRs 10 and 1 share common mechanisms of innate immune sensing but not signaling / Y. Guan, D. Ranoa, S. Jiang, S. Mutha // J. Immunol. – 2010. – Vol. 184. – P. 5094–5103. 215. Human Trophoblast Cells Modulate Endometrial Cells Nuclear Factor κB Response to Flagellin In Vitro [Electronic resource] / I. Caballero, S. A. Ghareeb, S. Basatvat, J. A. Sánchez-López [et al] // PLoS ONE. – 2013. – № 1. – Mode of access: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0039441. 216. IL-8 and IDO Expression by Human Gingival Fibroblasts via TLRs / R. Mahanonda, N. Sa-Ard-Iam, P. Montreekachon, A. Pimkhaokham // J. Immunol. – 2007. – Vol. 178. – P. 1151–1157. 217. Ilievski, V. Synergy between viral and bacterial toll-like receptors leads to amplification of inflammatory responses and preterm labor in the mouse / V. Ilievski, E. Hirsch // Biol Reprod. – 2010. – Vol. 83(5). – P. 767–773. 218. Ilievsky, V. Synergy Between Viral and Bacterial Toll-Like Receptors Leads to Amplification of Inflammatory Responses and Preterm Labor in the Mouse / V. Ilievsky, E. Hirsh // Biol Reprod. – 2010. – Vol. 83. – P. 767–773. 239 219. Importance of extra- and intracellular domains of TLR1 and TLR2 in NF B signaling / F.Sandor, E.Latz, F.Re, L.Mandell, G.Repik // J. Cell Biol. – 2003. – Vol. 162. – P. 1099–1110. 220. Importance of Vaginal Microbes in Reproductive Health / J. Li, J. McCormick, A. Bocking, G. Reid // Reproductive Sciences. – 2012. – Vol. 19. – P. 235–242. 221. Indoleamine 2, 3-dioxygenase levels at the normal and recurrent spontaneous abortion fetal–maternal interface / Y. Ban, Y. Chang, B. Dong, B. Kong, X. Qu // Joun Int Med Res. – 2013. – Vol. 41, № 4. – P. 1135–1149. 222. Indoleamine 2,3-dioxygenase, an emerging target for anti-cancer therapy / X. Liu, R. C. Newton, S. M. Friedman, P. A. Scherle // Current Cancer Drug Targets. – 2009. – Vol. 9. – P. 938–952. 223. Indoleamine-2,3-dioxigenase – from tolerance during pregnancy to cancer / E. Alegre, A.Díaz, A.Sofía López, M. Úriz // Inmunología. – Vol. 24, №4. – 2005. – P. 362–369. 224. Indoleamine-2,3-Dioxygenase Mediates the Antiviral Effect of Gamma Interferon against Hepatitis B Virus in Human Hepatocyte-Derived Cells / R.Mao, J.Zhang, D.Jiang, D.Cai, J. M. Levy // J. Virol. –2011. – Vol. 85. – P. 1048–1057. 225. Infectious origin of the antiphospholipid syndrome / Y. Shoenfild, M. Blank, R. Cervera, J. Font // Ann Rheum Dis. – 2006. – Vol. 65. – P. 2–6. 226. Inflammation and Implantation / N.Dekel, Y.Gnainsky, I. Granot [et al.] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2010. – Vol. 63(1). – P. 17–21. 227. Inflammation and pregnancy / J. R. Challis, C. J. Lockwood, L. Myatt [et al.] // Reprod. Sci. – 2009. – Vol. 16. – P. 206–215. 228. Inflammation and pregnancy : the role of the immune system at the implantation site / G. Mor, I. Cardenas, V. Abrahams, S. Guller // Ann N Y Acad Sci. – 2011. – Vol. 1221. – P. 80–87. 240 229. Inflammation in Reproductive Disorders / G. Weiss, L. T. Goldsmith, R. N. Taylor, D. Bellet, H. S. Taylor // Repr Sc. – 2009. – Vol. 16. – P. 216–229. 230. Inflammation: a link between endometriosis and preterm birth / F. Petraglia, F. Arcuri, D. de Ziegler, C. Chapron // Fertil Steril. – 2012. – Vol. 98. – P. 36–40. 231. Inflammatory pathways in female reproductive health and disease / H. N. Jabbour, J. S. Kurt, R. D. Catalano, J. E. Norman // Reproduction. – 2009. – Vol. 138. – P. 903–919. 232. Influenza-Induced Expression of Indoleamine-2, 3-Dioxygenase Enhances Interleukin-10 Production and Bacterial Outgrowth during Secondary Pneumococcal Pneumonia / K. F. Van der Sluijs, M. Nijhuis, J. H. M. Levels, S. Florquin [et al.] // The Journal of Infectious Disease. – 2006. – Vol. 193. – P. 214– 222. 233. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections / D. K. Hickey, M. V. Patel, J. V. Fahey, C. R. Wira // J Reprod Immunol. – 2011. – Vol. 88. – P. 185–194. 234. Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA / S. S. Diebold, T. Kashino, H. Hemmi [et al.] // Science. – 2004. – Vol. 303, № 5663. – P. 1529–1531. 235. Innate Immune function by Toll-like receptors : Distinct Responses in Newborns and the Elderly / T. R. Kollman, O. Levy, R. R. Montgomery // Immunity. – 2012. – № 16. – P. 771–783. 236. Innate immunity and disorders of female reproductive tract / A. Horne, S. Stock, A. King // Reproduction. – 2008. – Vol. 135. – P. 739–749. 237. Investigation of systemic inflammatory response in first trimester pregnancy failure / J. Calleja-Agius, E. Jauniaux, A. R. Pizzey [at al.] // Hum. Reprod. – 2012. – Vol. 27. – P. 349–357. 241 238. Kajikawa, A. Innate and acquired immune responses induced by recombinant Lactobacillus casei displaying flagellin-fusion antigen on the cellsurface / A. Kajikawa, S. Igimi // Vaccine. – 2010. – Vol. 28 (19). – P. 3409–3415. 239. Karsnitz, D. B. Puerperal infections of the genital tract : a clinical review / D. B. Karsnitz // J Midwifery Womens Health. – 2013. – Vol. 58. – P. 632–642. 240. Kawai, T. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors / T. Kawai, S. Akira // Nat. Immunol. – 2010. – Vol. 11. – P. 373–384. 241. King, N. Molecules in focus: indoleamine-2, 3-dioxygenase / N. King, S. Thomas // The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. – 2007. – Vol. 39, Iss. 12. – P. 2167–2172. 242. Kitaya, K. Immunohistochemistrical and Clinicopathological Characterization of Chronic Endometritis / K. Kitaya, T. Yasuo // Am J Repr Immun. – 2011. – Vol. 66, Iss. 5. – P. 410–415. 243. Kitaya, K. Prevalence of chronic endometritis in recurrent miscarriages / K. Kitaya // Fertil Steril. – 2011. – Vol. 95. – P. 1156–1158. 244. Kochar, P. K. Reproductive outcome of couples with reccurent miscarriage and balanced chromosomal abnormalities / P. K. Kochar, P. Ghosh // J. Obstet. Gynaecol. Res. – 2013. – № 39. – P. 113–120. 245. Koga, K. Review Article: Expression and Function of Toll-Like Receptors at the Maternal – Fetal Interface / K. Koga, G. Moor // Repr Sc. – 2008. – Vol. 15. – P. 231–242. 246. Koga, K. Toll-like receptors at the maternal-fetal interface in normal pregnancy and pregnancy disorders / K. Koga, G. Moor // Am J Reprod Immunol. – 2010. – Vol. 63. – P. 587–600. 247. Kramer, H. M. Maternal mortality and severe morbidity from sepsis in the Netherlands / H. M. Kramer // Acta Obstet Gynecol Scand. – 2009. – Vol. 88. – P. 647–653. 242 248. Lactobacilli stimulate the innate immune response and modulate the TLR expression of HT29 intestinal epithelial cells in vitro / P. M. G. Vizoso, M. R. Gómez, S. Seifert [et al.] // Int. J. of Food Microbiol. – 2009. – Vol. 133, Iss. 1-2. – P. 86–93. 249. Lange, M. J. The Importance of TLR3 Expression and Hormonal Regulation of TLR3-Induced Immune Responses in the Human Endometrium / M. J. Lange, M. L. Misfeldt // Current Immunology Reviews. – 2009. – Vol. 5, Issue 3. – P. 215–226. 250. Lappas M. Nuclear factor-kB mediates placental growth factor, induced pro-labour mediators in human placenta / M. Lappas // Mol. Hum. Reprod. – 2012. – Vol. 18. – P. 354–361. 251. Larsen, B. Mycoplasma, Ureaplasma, and Adverse Pregnancy Outcomes: A Fresh Look [Electronic resource] / B. Larsen, J. Hwang // Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology. – Vol. 2010. – Mode of access : http://www.hindawi.com/journals/idog/2010/521921/. 252. Lassi, Z. Community-based intervention packages for reducing maternal and neonatal morbidity and mortality and improving neonatal outcomes / Z. Lassi, B. A. Haider, Z. A. Bhutta // Editorial Group: Cochrane Pregnancy and Childbirth Group Published Online: 10 Nov. 2010 Assessed as up-to-date: 11 Jul. 2010 DOI: 10.1002/14651858.CD007754.pub2 253. Life on arginine for Mycoplasma hominis: clues from its minimal genome and comparison with other human urogenital mycoplasmas [Electronic resource] / S. Pereyre, P. Sirand-Pugnet, L. Beven [et al.] // PLoS Genetics. – 2009. – Vol. 5, № 10. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2751442/. 254. Lindström T. M. The role of nuclear factor kappa B in human labour / T. M. Lindström, P. Bennett //Reproduction. – 2005. – Vol. 130. – P. 569–581. 243 255. Lipoteichoic acid induces preterm delivery in mice. / S. Kajikawa, N. Kaga, Y. Futamura, C. Kakinuma, Y. Shibutani // J. Pharmacol Toxicol Methods. – 1998. – Vol. 39. – P. 147–154. 256. Local Activation of Uterine Toll-Like Receptor 2 and 2/6 Decreases Embryo Implantation and Affects Uterine Receptivity in Mice [Electronic resource] / J. A. SanchezLopez, I. Caballero, M. Montazeri, N. Maslehat [at al.] // Biol Reprod. – 2014. – 12 mar. – Mode of access: http://www.researchgate.net/publication/260758344_Local_Activation_of_Uterine_TollLike_Receptor_2_and_26_Decreases_Embryo_Implantation_and_Affects_Uterine_Receptivit y_in_Mice. 257. Localisation of indoleamine 2, 3-dioxygenase and kynurenine hydroxylase in the human placenta and decidua: implications for role of the kynurenine pathway in pregnancy / P. Ligam, U. Manuelpillai, E. M. Wallace, D. Walker // Placenta. – 2005. – Vol. 26. – P. 498–504. 258. Localization of TLR2 and MyD88 to Chlamydia trachomatis inclusions. Evidence for signaling by intracellular TLR2 during infection with an obligate intracellular pathogen / C. M. O’Connell, I. A Ionova, A. J. Quayle, A. Visintin, R. R. Ingalls // J Biol Chem. – 2006. – Vol. 281. – P. 1652–1659. 259. Loss of toll-like receptor 3 function improves glucose tolerance and reduces liver steatosis in obese mice / L. H. Wu, C. C. Huang, S. Adhikarakunnathu, L. R. San Mateo [et al.] // Metabolism. – 2012. – Vol. 61. – P. 1633–1645. 260. LPS-induced murine abortions require C5 but not C3, and are prevented by upregulating expression of the CD200 tolerance signaling molecule / G. Yu, Y. Sun, K. Foerster, J. Manuel, H. Molina [et al.] // Am J Reprod Immunol. – 2008. – Vol. 60. – P.135–140. 261. Macrophage-activating lipopeptide-2 induces cyclooxygenase-2 and prostaglandin E(2) via toll-like receptor 2 in human placental trophoblast cells / 244 M. Mitsunari, S. Yoshida, T. Shoji [et al.] // J Reprod Immunol. – 2006. – Vol. 72. – P. 46–59. 262. Mann, D. L. The Emerging Role of Innate Immunity in the Heart and Vascular System: For Whom the Cell Tolls / D. L. Mann // Circ. Res. – 2011. – Vol. 108. – P. 1133–1145. 263. Mansson, A. Activation of eosinophils via Toll-like receptor (TLR) 3, TLR7 and TLR9: link between viral infection and asthma? / A. Mansson, L. O. Cardell // Eur. Respir. Rev. – 2008. – Vol. 17. – P. 46–48. 264. Maternal sepsis: epidemiology, etiology and outcome / J. Van Dillen [et al.] // Curr Opin Infect Dis. – 2010. – Vol. 23. – P. 249–254. 265. Mechanism of acute fetal cardiovascular depression after maternal inflammatory challenge in mouse / S. Rounioja, J. Rasanen, M. Ojaniemi, V. Glumoff [et al.] // Am J Pathol. – 2005. – Vol. 166. – P. 1585–1592. 266. Mechanisms regulating the expression of indoleamine-2,3-dioxygenase during decidualization of human endometrium / Y. Kudo, T. Hara, T. Katsuki, A. Toyofuku [et al.] // Hum. Reprod. – 2004. – Vol. 19. – P. 1222–1230. 267. Medzhitov, R. Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system / R. Medzhitov, C. A. Jr. Janeway // Science. – 2002. – Vol. 296. – P. 298–300. 268. Menstrual Cycle Influences Toll-Like Receptor Responses / U. Dennison, D. P.·McKernan, P. Scully [at al.] // Neuroimmunomodulation. – 2012. – Vol. 19. – P. 171–179. 269. Menstrual cycle-dependent changes of Toll-like receptors in endometrium / R. Aflatoonian, E. Tuckerman, S. L. Elliott [et al.] // Hum. Reprod. – 2007. – Vol. 22. – P. 586–593. 270. MicroRNA in TLR signaling and endotoxin tolerance / M. A. Nahid, M. Satoh, E. K. L. Chan // Cell Mol Immunol. – 2011. – Vol. 8. – P. 388–403. 245 271. Mortality in human sepsis is associated with downregulation of Toll-like receptor 2 and CD14 expression on blood monocytes / B. Schaaf, K. Luitjens, T. Goldmann, T. van Bremen [et al.] // Diagn Pathol. – 2009. – Vol. 16. – P. 4–12. 272. Mosser, D. M. Exploring the full spectrum of macrophage activation / D. M. Mosser, J. P. Edwards // Nat Rev Immunol. – 2008. – Vol. 8. – P. 958–969. 273. Myeloid differentiation primary response protein 88 blockade upregulates indoleamine-2,3-dioxygenase expression in rheumatoid synovial fibroblasts / M. K. Park, H. J. Oh, Y. M. Heo [at al.] // Exp Mol Med. – 2011. – Vol. 43. – P. 446–454. 274. Naik, V. Quorum sensing: a non-conventional target for antibiotic discovery / V. Naik, G. Mahajan // Nat Prod Commun. – 2013. – Oct ; 8. – P. 1455– 1458. 275. Nansen, A. Viral infection causes rapid sensitization to lipopolysaccharide: central role of IFN-alpha beta / A. Nansen, A. R. Thompsen // J. Immunol. – 2002. – Vol. 166. – P. 982–988. 276. Nasu, K. Pattern recognition via Toll-like receptor system in the human female reproductive tract [Electronic resource] / K. Nasu, H. Nahara // Mediators and Inflammation. – 2010. – ID 976024. – 12 p. – Mode of access: http://www.hindawi.com/journals/mi/2010/976024/. 277. Nathan, C. Nonresolving inflammation / C. Nathan, A. Ding // Cell. – 2010. – Vol. 140. – P. 871–882. 278. New Insights into the Relationship between Viral Infection and Pregnancy Complications / J. Y. Kwon, R. Romero, G. Mor // Biochem Biophys Res Commun. – 2013. – Vol. 23, № 438. – P. 249–256. 279. Novel Influenza A (H1N1) Pregnancy Working Group: H1N1 2009 influenza virus infection during pregnancy in the USA / D. J. Jamienson, M. A. Honein, S. A. Ramussen, J. L. Williams [et al.] // Lancet. – 2009. – Vol. 374. – P. 451–458. 246 280. Obstetric and vascular APS: Same autoantibodies but different diseases? / P. L Meroni, E. Raschi, C. Grossi, F. Pregnolato [et al.] // Lupus. – 2012. – Vol. 21. – P. 708–710. 281. Obstetric near-miss and maternal mortality in maternity university hospital, Damascus, Syria: a retrospective study / Y. Almerie, M. Almerie, H. Matar [et al.] // BMC Pregnancy and Childbirth. – 2010. – Vol. 10, № 65. – P. 2–7. 282. Oral mucosal endotoxin tolerance induction in chronic periodontitis / M. Muthukuru, R. Jotwani, C. W. Cutler // Infect Immun. – 2005. – Vol. 73. – P. 687– 694. 283. Ortel, T. L. Antiphosphlipid syndrome: laboratory testing and diagnostic strategies / T. L. Ortel // Am J Hematol. – 2012. – Vol. 87, Suppl. 1. – P. 75– 81. 284. Overexpression of indoleamine 2, 3-dioxygenase in human endometrial carcinoma cells induces rapid tumor growth in a mouse xenograft model / N. Yoshida, K. Ino, Y. Ishida [et al.] // Clin. Cancer Res. – 2008. – Vol. 14. – P. 7251–7259. 285. Paternal factors in spontaneous first trimester miscarriage / R. Jaleel, A. Khan // Pak J Med Sci. – 2013. – Vol. 29. – P. 748–52. 286. Pathogen recognition in the human female reproductive tract: expression of intracellular cytosolic sensors NOD1, NOD2, RIG-1, and MDA5 and response to HIV-1 and Neisseria gonorrhea / M. Ghosh, Z. Shen, J. V. Fahey, S. G. Crist [et al.] // Am J Reprod Immunol. – 2013. – Vol. 69. – P. 41–51. 287. Peptidoglycan induces necrosis and regulates cytokine production in murine trophoblast stem cells / J. A. Rose, M. M. Rabenhold, D. S. Parast, D. S. Milstone [et al.] // Am J Reprod Immunol. – 2011. – Vol. 66. – P. 209–222. 288. Peripartum bacteremia in the era of group B streptococcus prophylaxis / A. Cape, R. E. Tuomala, C. Taylor, K. M. Puopolo // Obstet Gynecol. – 2013. – Vol. 121 (4). – P. 812–818. 247 289. Peripartum bacteremia in the era of group B streptococcus prophylaxis / A. Cape, R. E. Tuomala, C. Taylor, K. M. Puopolo // Obstet Gynecol. – 2013. – Vol. 121. – P. 812–818. 290. Pfaffl, M. V. Relative quantification in book: Real Time PCR / M. V. Pfaffl // Int. University Line. – 2002. – P. 63–82. 291. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood / S.R. Clark, A.C. Ma, S. A. Tavener [et al.] // Nat Med. – 2007. – Vol. 13. – P. 463–469. 292. Platelet-TLR7 mediates host survival and platelet count during viral infection in the absence of platelet-dependent thrombosis [Electronic resource] / M. Koupenova, O. Vitseva, C. R. MacKay, L. Beaulieu [et al.] // Blood. – 2014. – 22 apr. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24755410. 293. Poly(I:C)-induced protection of neonatal mice against intestinal Cryptosporidium parvum infection requires an additional TLR5 signal provided by the gut flora [Electronic resource] / L. Lantier, F. Drouet, W. Guesdon, R. Mancassola, C. Metton, R. Lo-Man, C. Werts, F. Laurent, S. Lacroix-Lamandé // J Infect Dis. – 2014. – Feb. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24014881. 294. Postpartum culture negative endocarditis: a case report and review of the current guidelines [Electronic resource] / O. F. Ali, N. Ratnaraja, N. Nathani [et al.] // BMJ Case Reports. – 2011. – 4 okt. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22679146 295. Postpartum culture negative endocarditis: case report and review of the current guidelines / O. Ali, N. Ratnaraja, M. Bhabra [et al.] // BMJ. – 2011. – Vol. 4. – P. 2011. 296. Postpartum infections: occurrence, healthcare contacts and association with breastfeeding / P. I. Ahnfeldt-Mollerup, L .K. Petersen, J.Kragstrup, R. D.Christensen, B. Sorensen // Acta Obstet Gynecol Scand. – 2012. – Vol. 91. – 248 P.1440–1444. 297. Post-partum surgical wound infections: incidence after caesarian section in an Italian hospital / L. Charrier, P. Serafini, A. Ribatti [et al.] // J. Prev. Med. Hyg. – 2009. – Vol. 50. – P. 159–163. 298. Potential role of toll-like receptor 3 in a murine model of polyinosinicpolycytidylic acid-induced embryo resorption /Y. Lin, Y. Zeng, S. Zeng, T. Wang // Fertil Steril. – 2006. – Vol. 85. – P. 1125–1129. 299. Pregnancy outcome after age 40 and risk of low birth weight / C. Tabcharoen, S. Pinjaroen, C. Suwanrath, O. Krisanapan // Journal of Obstetrics and Gynaecology. – 2009. – № 29. – P. 378–383. 300. Pregnancy, indoleamine 2, 3-dioxygenase (IDO) and Chlamydia abortion: An unresolved paradox / G. Entrican, S. Wattegedera, M. Rocchi [et al.] // Vet Microbiol. – 2009. – Vol. 135, №1. – P. 98–102. 301. Probiotic Lactobacillus rhamnosus Inhibits the Formation of Neutrophil Extracellular Traps / L. Vong, R. J. Lorentz, A. Assa, M. Glogauer, P. Sherman // J. Immunol. – 2014. – Vol. 192. – P. 1870–1877. 302. Probiotics Modulate Host-Microbe Interaction in the Placenta and Fetal Gut: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial / S. Rautava, M. C. Collado, S. Salminen, E. Isolauri // Neonatology. – 2012. – Vol. 102. – P. 178–184. 303. Protective Role of Toll-like Receptor 4 in Experimental Gonococcal Infection of Female Mice /M. Packiam,H. Wu, S.J. Veit, N. Mavrogiorgos [et al.] // Mucosal Immunol. – 2012. – Vol. 5. – P. 19–29. 304. Puerperal sepsis – still a major threat for parturient / S. Shamshad, A. Shamster, B. Rauf // J Ayub Med Coll Abbottabad. – 2010. – Vol. 22. – P. 18–21. 305. Receptor for Advanced Glycation End Products Regulates Adipocyte Hypertrophy and Insulin Sensitivity in Mice: Involvement of Toll-Like Receptor 2 [Electronic resource] / M. Monden, H. Koyama, Y. Otsuka, T. Morioka [et al.] // 249 Diabetes. – 2012. – 25 Sep. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23011593. 306. Recurrent miscarriage and autoimmunity / A. S. Bansal, B. Bajardeen, H. Shehata, M. Y. Thum // Expert Rev.Clin. Immunol. – 2011, № 7. – P. 37–44. 307. Regulation of dendritic cell recruitmentby chemokines / C. Caux, B. Vanbervliet, C. Massacrier [et al.] // Transplantation. – 2002. – № 73. – P7–11. 308. Regulation of interleukin-10 gene expression in macrophages engulfing apoptotic cells / Y. Zhang, H. J. Kim, S. Yamamoto, X. Kang, X. Ma // J Interferon Cytokine Res. – 2010. – Vol. 30. – P. 113–122. 309. Regulation of tryptophan 2, 3-dioxygenase by HOXA10 enhances embryo viability through serotonin signaling / L. F. Doherty, H. E. Kwon, H. S. Taylor // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. – 2011. – Vol. 300. – P. 86–93. 310. Regulatory T cells and the immune pathogenesis of prenatal infection / J. H. Rowe, J. M. Ertelt, L. Xin, S. S. Way // Reproduction. – 2013. – Vol. 21, № 146. – P. 191–203. 311. Role of the innate immunity in female reproductive tract [Electronic resource] / F. Amjadi, E. Salehi, M. Mehdizadeh, R. Aflatoonian // Adv Biomed Res. – 2014. – Jan 9. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3928842/. 312. Salmon, J. E. Pathogenic role of antiphospholipid antibodies / J. E. Salmon, P. G. de Groot // Lupus. – 2008. – Vol. 17. – P. 405–411. 313. Serious and life-threatening pregnancy-related infections: opportunities to reduce the global burden [Electronic resource] / C. A. Gravett, M. G. Gravett, E. T. Martin, J. D. Bernson [et al.] // PLoS Med. – 2012. – Vol. 9. – Mode of access: http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed.1001 324/. 314. Sonnex, C. Toll-like receptors and genital tract infection / C. Sonnex // Int J STD – AIDS. – 2010. – Vol. 21. – P. 153–157. 250 315. Stronger Toll-like receptor 1/2, 4, and 7/8 but less 9 responses in peripheral blood mononuclear cells in non-infectious exacerbated asthmatic children [Electronic resource] / W. I. Lee, T. C. Yao, K.W. Yeh, L. C. Chen [et al.] // Immunobiology. – 2012. – 22 May. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22727330. 316. Studying the immunosuppressive role of indoleamine 2, 3-dioxygenase: tryptophan metabolites suppress rat allogeneic T-cell responsesin vitro andin vivo / T. M.Bauer, L. P.Jiga, J. J. Chuang [et al.] // Transplant. International. – 2005. – Vol. 18,Iss. 1. – P. 95–100. 317. Susceptibility of human female primary genital epithelial cells to herpes simplex virus, type-2 and the effect of TLR3 ligand and sex hormones on infection. / E. M.MacDonald, A. Savoy, A. Gillgrass [et al.] //Biol Reprod. – 2007. – № 77. – P. 1049–1059. 318. Synergic activation of toll-like receptor (TLR) 2/6 and 9 in response to Ureaplasma parvum & urealyticum in human amniotic epithelial cells [Electronic resource] / M. Triantafilou , B. De Glanville, A. F. Aboklaish, O. B. Spiller, S. Kotecha, K. Triantafilou // PLoS One. – 2013. – 12 Apr. –Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23593431 319. System biology approaches to Toll-like receptor signaling / A. Vandenbon, S. Teraguchi, S. Akira, K. Takeda, D. M. Sandley // Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. – 2012. – № 4. – P. 497–507. 320. The Lip lipoprotein from Neisseria gonorrhoeae stimulates cytokine release and NF-kB activation in epithelial cells in a Toll-like receptor 2-dependent manner / P. L Fisette, S. Ram, J. M. Andersen, W. Guo, Robin R. Ingalls // Journ. Of Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, №. 47. – P. 46252–46260. 321. The MIQE Guidelines: Minimum information for publication of quantitive Real-Time PCR experiments / S. Bustin, V. Benes, G. Garson [et al.] // Clin. Chem. – 2009. – № 55. – Vol. 4. – P. 611–622. 251 322. The reliability of the histological diagnosis of endometritis in asymptomatic IVF cases: a multicenter observer study /J. C. Kasius, F. J. Broekmans, D. M. Sie-Go, C. Bourgain [et al.] // Hum Reprod. – 2012. – Vol. 27. – P. 153–158. 323. The role of dendritic cells in driving genital tract inflammation and HIV transmission risk: are there opportunities to intervene? [Electronic resource] / M. Shey, N. J. Garett, L. R. McKinnon, J. Pasmore // Innate Immunity. – 2013. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24282122. 324. The role of indoleamine 2, 3-dioxygenase in the induction of immune tolerance: focus on hematology / A. Curti, S. Trabanelli, V.Salvestrini [et al.] // Blood. – 2009. –Vol. 113, № 11. – P. 2394–2401. 325. The role of inflammation and infection in preterm birth / R. Romero, J. Espinoza, L. F. Goncalves, J. P. Kusanovic, L. Friel, S. Hassan // Semin Reprod Med. – 2007. – Vol. 25. – P. 21–39. 326. The Role of TLR2 in Infection and Immunity / L. Oliveira-Nascimento, P. Massari, L. M. Wetzler // Front Immunol. – 2012. – Vol. 3. – P. 1–17. 327. The Role of Toll Like Receptors in Pregnancy / E. Amirchaghmaghi, S. A. Taghavi, F. Shapouri, S. Saeidi [et al] // Int J Fertil Steril. – 2013. – 7 Oct. – P. 147–154. 328. The role of Toll-like receptors in pregnancy / E. Amirchahmahi, S. A. Taghavi, F. Shapouri, S. Saeidi [et al.] // Int J Fertil Steril – 2013. – № 7. – P. 147–154. 329. Time-course of Toll-like receptor 2 expression, as a predictor of recurrence in patients with bacterial infectious diseases / K. Orihara, K. Nagata, S. Hamasaki, R. Oba, H. Hirai, S. Ishida [et al.] //Clin Exp Immunol. – 2007. – Vol. 148. – P. 260–270. 330. TLR Signalling and Adapter Utilization in Primary Human In vitro Differentiated Adipocytes / C. Brenner, R. E. Simmonds, S. Wood [et al.] // Scand. J. Immunol. – 2012. – Vol. 76. – P. 359–370. 252 331. TLR2 Is One of the Endothelial Receptors for β2-Glycoprotein I / E. Alard, G. Gaillard, C. Daridon [et al.] // J. Immunol. – 2010. – Vol. 185. – P. 1550– 1557. 332. TLR3 but Not TLR7/8 Ligand Induces Allergic Sensitization to Inhaled Allergen / S. Reuter, N. Dehzad, H. Martin, L. Bohm [et al.] // J. Immunol. – 2012. – Vol. 188. – P. 5123–5131. 333. TLR3-involved modulation of pregnancy tolerance in double-stranded RNA-stimulated NOD/SCID mice / Y. Lin, Z. Liang, Y. Chen, Y. Zeng // J Immunol. – 2006. – Vol. 176. – P. 4147–4154. 334. TLR4 and TLR5on Corneal Macrophages RegulatePseudomonas aeruginosa keratitis by Signaling through MyD88-Dependent and -Independent Pathways / Y. Sun, M. Karmakar, S. Roy [et al.] // J. Immunol. – 2010. – Vol. 185. – P. 4272–4283. 335. TLR4 Is a Negative Regulator in Noninfectious Lung Inflammation / H. Zhao, S. W. Leu, L. Shi [et al.] // J. Immunol. – May 2010. – Vol. 184. – P. 5308– 5314. 336. TLR-4 Signaling Promotes Tumor Growth and Paclitaxel Chemoresistance in Ovarian Cancer / M. G. Kelly, A. B. Alvero, R. Chen, D. A. Silasi, V. Abrahams [et al.] // Cancer Res. – 2006. – Vol. 66. – P. 3859 –3868. 337. TLR5 as an Anti-Inflammatory Target and Modifier Gene in Cystic Fibrosis. / C. J. Blohmke, J. Park, A. F. Hirschfeld [et al.] // J. Immunol. – 2010. – Vol. 185, № 12. – P. 7731–7738. 338. TLR6 modulates first trimester trophoblast responses to peptydoglycan / V. M. Abrahams, P. B. Aldo, S. P. Murphy [et al.] // J. Immunol. – 2008. – Vol. 180. – P. 6035–6043. 339. TLR9 is dispensable for intestinal ischemia/reperfusion-induced tissue damage / E. A. Slone, M. R. Pope, M. Roth, R. Welti, S. D. Fleming // Am J Clin Exp Immunol. – 2012. – Vol. 1. – P.124–135. 253 340. TLRs, macrophages, and NK cells: our understandings of their functions in uterus and ovary / Z. Yang, B. Kong, D. M. Mosser, X. Zhang // Int Immunoph. – 2011. – Vol. 11. – P. 1442–1450. 341. Toll-like receptor 10 is involved in induction of innate immune responses to influenza virus infection / S. M. Lee, K. H. Kok, M. Jaume, T. K. Cheung [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2014. – Vol. 111. – P. 3793– 3798. 342. Toll-Like Receptor 2-Dependent Activity of Native Major Outer Membrane Protein Proteosomes of Chlamydia trachomatis / P. Massaria, D. N. Toussia, D. F. Tifreab, L. M. Mazab // Infect. Immun. – 2013. – Vol. 81, №1. – P. 303–310. 343. Toll-like receptor 3 agonist induces impairment of uterine vascular remodeling and fetal losses in CBA x DBA/2 mice / J. Zhang, H. Wei, D. Wu, Z. Tian // Journal of Reproductive Immunology. – 2007. – Vol. 74. – P. 61–67. 344. Toll-like receptor 4 expression in decidual cells and interstitial trophoblasts across human pregnancy / F. Schatz, U. A. Kayisli, E. Vatandaslar, N. Ocak [et al.] // Am J Repr Immun. – 2012. – Vol. 68. – P.146–153. 345. Toll-Like Receptor 5 Stimulation Protects Mice from Acute Clostridium difficile Colitis / I. Jarchum, M. Liu, L. Lipuma [et al.] // Infection and immunity. – Apr. 2011. – Vol. 79, № 4. – P. 1498–1503. 346. Toll-Like Receptor 5 Stimulation Protects Mice from Acute Clostridium difficile Colitis / I. Jarchum, M. Liu, L. Lipuma [et al.] // Infection and immunity. – Apr. 2011. – Vol. 79, № 4. – P. 1498–1503. 347. Toll-Like Receptor 9-Dependent Activation of Myeloid Dendritic Cells by Deoxynucleic Acids from Candida albicans / A. Miyazato, K. Nakamura, N. Yamamoto [et al.] // Infect. Immun. – 2009. – Vol. 77. – P. 3056 – 3064. 348. Toll-like receptor agonists: a patent review (2011–2013) / W. M. Hussein, T. Y. Liu, M. Skwarczynski, I. Toth // Expert Opin Ther Pat. – 2014. – 24 Apr. (4). – P. 453–470. 254 349. Toll-like receptor and antiphospholipid mediated thrombosis: in vivo studies / S.S. Pierangeli, M. E. Vega-Ostertag, E. Raschi [et al.] // Ann Rheum Dis. – 2007. – Vol. 66. – P. 1327–1333. 350. Toll-like receptor recognizes bacterial DNA/ H. A. Hemmi, O. Takeushi, T. Kawai [et al.] // Nature. – 2000. –Vol. 410, № 6813. – P. 740–745. 351. Toll-like receptor-2 expression in normal and pathologic human placenta / E. Rindsjo, U. Holmlund, E. Sverremark-Ekstrom, N. Papadogiannakis [et al.] // Human Pathology. – 2007. –Vol. 38. – P. 468–473. 352. Toll-Like Receptor-3 Ligation-Induced Indoleamine 2, 3-Dioxygenase Expression in Human Trophoblasts / B. Wang, K. Koga, Y. Osuga, I. Cardenas [et al.] // Endocrinology. – 2011. – Vol. 152. – P. 4984–4992. 353. Toll-like receptors and pregnancy : Trophoblast as modulator of the immune response / K. Koga, P. B. Aldo, G. Mor // J. Obstet. Gynaecol. Res. – 2009. – Vol. 35, № 2. – P. 191–202. 354. Transcription of pattern recognition receptors and abortive agents induced chemokines in the bovine pregnant uterus / A. P. Silva, E. A. Costa, A. A. Macedo, T. M. Martins [et al.] // Vet Immunol Immunopathol. – 2012. – Vol. 15. – Vol. 145. – P. 248–256. 355. Trichomonas vaginalis lipopeptidogycan triggers a selective upregulation of cytokines by human female reproductive tract epithelial cells / R. Fichorova, R. Tifonova, R. Gilbert // Infection and Immunity. – 2006. – Oct. – P. 5773–5779. 356. United Nations General Assembly. United Nations Millennium Declaration. A/RES/55/2. 1-9-2000. UN General Assembly, 55th session, agenda item 60(b). 357. Vaginal preparation with antiseptic solution before cesarean section for preventing postoperative infections [Electronic resource] / D. M. Haas, S. Morgan, K. 255 Contreras // Cochrane Database Syst Rev. – 2013. – 31 Jan. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20238357. 358. Viral Infection of the Placenta Leads to Fetal Inflammation and Sensitization to Bacterial Products Predisposing to Preterm Labor / I. Cardenas, R. Means, P. Aldo, K. Koga [et al.] // J. Immunol. – Jul 2010. – Vol. 185. – P. 1248– 1257. 359. Viral infection of the placenta leads to fetal inflammation and sensitization to bacterial products predisponding to preterm labor / R. Means, P. Aldo, K. Koga, S. M. Lang [et al.] // The Journal of Immunology. – 2010. – Vol. 185, № 2. – P. 1248–1257. 360. Viral infection of the pregnant cervix predisposes to ascending bacterial infection / K. Racicot, I. Cardenas, V. Wünsche, P. Aldo, S. Guller, R. E. Means, R. Romero, G. Mor // J Immunol. – 2013. – 15 Jul. – P. 934–941. 361. Viral piracy: HIV-1 targets dendritic cells for transmission / A. N. Lekkerkerker, Y. van Kooyk, T. B. Geijtenbeek // Curr. HIV Res. – 2006. – № 4. – P. 169–176. 362. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. Trends in maternal mortality : 1990 to 2010 // Geneva: World Health Organization. – 2012. – 60 p. 363. Wilson J. F. Vaginitis and cervicitis / Wilson J. F.// Ann Intern Med. – 2009. – Vol. 151 (ITC3-1). 364. Yersinia V antigen induces both TLR homo- and heterotolerance in an IL-10-involving manner / D. Reithmeier-Rost, S. Bierschenk, N. Filippova [et al.] // Cell Immunol. – 2004. – Vol. 231. – P. 63–74. 256 ПРИЛОЖЕНИЯ 257 ПРИЛОЖЕНИЕ 1. ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПАЦИЕНТА И ФОРМА ИНФОРМИРОВАННОГО СОГЛАСИЯ Название исследования: ПРОГНОЗИРОВАНИЕ, РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА И ОБОСНОВАНИЕ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЛОВЫХ ОРГАНОВ ЖЕНЩИНЫ ВО ВРЕМЯ БЕРЕМЕННОСТИ, РОДОВ И ПУЭРПЕРИЯ Уважаемый пациент, Мы считаем, что Вы - подходящий пациент для вышеупомянутого клинического исследования, и хотели бы спросить Вас, не желаете ли Вы принять участие в нем. Ниже приведена информация об исследовании, которая предназначена для того, чтобы помочь Вам принять решение об участии в нем. Ваш доктор обеспечит Вас детальной информацией относительно того, зачем выполняется данное клиническое исследование, и в чем оно заключается.Пожалуйста, убедитесь, что Вы понимаете, зачем и как будет выполнено клиническое исследование, и какие обследования при этом будут выполняться. Не стесняйтесь уточнять у Вашего доктора непонятные для Вас вопросы, спрашивайте его, если Вы хотите получить дополнительную информацию. Он будет помогать Вам. Вся необходимая информация содержится в этой Форме информированного согласия, которая будет выдана Вам на руки. Вам будет предоставлено достаточное количество времени, чтобы принять решение. Вы можете прочитать информацию для пациента в свободное время и записать любые вопросы. Врач будет отвечать на Ваши вопросы, пока все вопросы не будут исчерпаны. Если Вы не желаете участвовать, Ваше решение не отразится на дальнейшем лечении. Если Вы желаете участвовать, то это решение должно быть добровольным. Важно, чтобы Вы дали Ваше согласие на участие в исследовании в письменной форме.Подписав и поставив дату под подписью, Вы подтверждаете, что Вы поняли, зачем и как будет выполняться клиническое исследование, и что Вы знаете предъявляемые к Вам требования и понимаете Ваши права.Вы можете отозвать ваше согласие в любой момент, без объяснения причин.Вам будет выдан подписанный оригинал формы информированного согласия. 1 ЗАЧЕМ И КАК ВЫПОЛНЯЕТСЯ КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ? Клинические исследования необходимы, чтобы получить или расширить знания относительно причин и механизмов развития заболеваний, а также эффективности лекарственных средств, которые уже были зарегистрированы и сертифицированы в России. Согласно закону, прежде, чем новый препарат будет зарегистрирован, он должен пройти клинические исследования. Разработка новых препаратов и их клинические исследования регулируются законом (Национальный Закон о лекарственных препаратах), исследования проводятся в соответствии с общепризнанными международными рекомендациями (рекомендации IСH-GСР) и этическими принципами (Хельсинкская декларация). Проведение данного клинического исследования было запланировано в соответствии с этими инструкциями и одобрено независимыми властями. Рассматривавший возможность проведения данного исследования Этический комитет письменно одобрил содержание этого информационного листа и формы информированного согласия. 258 2 ЗАЧЕМ ПРОВОДИТСЯ ДАННОЕ КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ? 2.1 Медицинские данные и цель исследования Целью работы является изучение влияния различных факторов на возникновение самопроизвольных выкидышей, осложнений беременности и послеродового периода и, на основе полученных данных, разработка способов прогнозирования развития данных состояний, а также профилактики послеродового эндометрита с применением препарата КП, содержащего лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол. 2.2 Планируемое число участвующих в исследовании пациентов В данном исследовании примут участие приблизительно 200 беременных в возрасте от 18 до 40 лет, которые будут обследованы на ранних, поздних сроках беременности и в течение 3-х суток после родов. 2.3 Сколько длится мое участие в этом исследовании? Ваше участие в исследовании длится на протяжении времени госпитализации в гинекологический или акушерский стационар. В ЧЕМ СОСТОИТ ВЫГОДА ДЛЯ МЕНЯ? Результаты этого клинического исследования могут помочь найти в будущем пути прогнозирования невынашивания беременности ранних сроков, а также послеродовых гнойносептических осложнений, которые представляют большую проблему в акушерстве и гинекологии. Если вам будет назначен препарат, Вы можете получить выгоду от участия в исследовании, заключающуюся в улучшении влагалищного микробиоценоза. Однако, ожидаемый эффект исследуемого препарата не может быть гарантированным. КАКАЯ ИНФОРМАЦИЯ БУДЕТ МНЕ ПРЕДОСТАВЛЕНА? Вы можете быть уверены в том, что Ваш врач немедленно предоставит Вам всю новую информацию относительно исследования и (если вы будете включены в соответствующую группу) исследуемого препарата, которая может оказаться важной для Вас. При этом у вас будет получено согласие на продолжение участия в исследовании. КОМУ БУДУТ ПЕРЕДАНЫ МОИ ДАННЫЕ? Все данные, имеющие к Вам отношение, будут рассматриваться как абсолютно конфиденциальные, кроме этого будут соблюдаться все правила защиты данных. Если Вы решите больше не принимать участие в исследовании, Вы должны согласиться с тем, что не можете ограничить использование Ваших данных, полученных в ходе исследования. Подписывая форму информированного согласия, Вы соглашаетесь на то, что Ваши анкетные данные, зарегистрированные во время участия в этом клиническом исследовании, особенно касающиеся вашего заболевания, даты рождения и пола, будут: • Зарегистрированы, храниться в компьютерах и обрабатываться, • Передаваться анонимно для проверки (то есть, без указания Вашей фамилии и адреса;; данные будут содержать только Ваши инициалы, пол и дату рождения). 259 МОГУ ЛИ Я ИЛИ КТО-ЛИБО ДРУГОЙ ОСТАНОВИТЬ ИЛИ ЗАКОНЧИТЬ КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РАНЕЕ ЗАПЛАНИРОВАННОГО СРОКА ? Ваше участие в этом исследовании добровольно. Ваш отказ от участия в этом исследовании не отразится на Вашем дальнейшем медицинском обслуживании или Ваших правах пациента. Вы имеете право выйти из исследования в любой момент, по любой причине, без уведомления и без какого-либо ущерба. Пожалуйста, информируйте Вашего доктора, если причиной Вашего исключения из исследования является нежелательное явление или побочный эффект препарата, это позволит защитить других пациентов, принимающих участие в этом клиническом исследовании. Прежде, чем Вы подпишите эту форму согласия, пожалуйста, выясните любые, интересующие Вас вопросы по исследованию. Вне зависимости от времени Вашего исключения из исследования, для Вашей собственной безопасности или безопасности других людей, принимающих участие в исследовании, Вас попросят пройти заключительное обследование. Если появится новая информация, которая может повлиять на Вашу готовность пр одолжить участие в клиническом исследовании, Вы будете незамедлительно уведомлены о ней. ОПЛАТА И ВОЗМЕЩЕНИЯ Если вы принимаете участие в данном исследовании, Вы не получите никакой оплаты или вознаграждения любым из способов. Вы также не будете оплачивать исследуемые препараты или какие-либо процедуры, связанные с Вашим участием в исследовании. КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ При возникновении неотложных ситуаций Вы можете связаться (24 часа в сутки): Имя ______________________________ Адресу: ______________________________ Телефон: ______________________________ 260 14 ФОРМА СОГЛАСИЯ 14.1 Декларация исследователя или его заместителей Настоящим я заявляю, что я полностью в устной форме информировал пациента: Номер пациента: Имя пациента (печатными буквами): ___________________________ о характере, значении и смысле проведения вышеупомянутого клинического исследования. Исследователь или его заместитель Подпись Место / дата (от руки) Имя (печатными буквами) 14.2 Заявление пациента Доктор _____________________________ дал разъяснения в понятных Мне выражениях относительно проводимого исследования и (в случае включения в соответствующую группу) исследуемого препарата, возможных эффектах и рисках, целях выполнения данного клинического исследования, его назначении. Я прочитал и понял текст Информационного листа пациента и Формы согласия, и добровольно объявляю о своей готовности принять участие в вышеупомянутом клиническом исследовании. Я буду следовать необходимым для выполнения клинического исследования инструкциями врача, но оставляю за собой право в любое время отказаться от участия, понимая, что это не повлечет за собой возникновения неудобств и потери выгоды от лечения. Я согласен с тем, что мои личные данные, полученные во время участия в этом клиническом исследовании, особенно касающиеся моего заболевания, даты рождения и пола, и инициалов будут фиксироваться и храниться в компьютерах анонимно. мои анонимные данные, т.е., без указания имени и адреса, будут переданы для научной обработки результатов клинического исследования и для проведения дальнейших научных изысканий. Я получил от доктора подписанный и датированный оригинал информации для пациента и формы информированного согласия на руки. _____________________ Пациент – Имя Подпись Место (печатными буквами) Дата (от руки) 261 Приложение 2 Анкета (самопроизвольные выкидыши) Паспортная часть. Группа исследуемых ______________ № п/п________. № истории ________ Дата поступления_______ Койко-день. ___________ Ф.И.О .________________________________. Возр. ______ Отделение _________________ Адрес ________________________________________________ Тел ____________________ Профессия __________________________ Образование _______________________________ Характер питания__________________ Доход на члена семьи ________________ Вес_____ Рост ______ Группа крови ________ Резус факт________ Размеры таза ______ ________ ________ ________ Акушерско-гинекологический анамнез. Сколько беременностей_____ Сколько родов ____ Абортов ____ Выкидышей _____ Внематочных ____ Замерших_____ Осложнения абортов_____________________________ Причина выкидыша___________________ Гинекол. Пат. __________________________________________________________________________ ._____________________________________________________________________________________ Длительность заболеваний _______________________________________________________________ Какие виды лечения: консервативные ____________________________________________________ Оперативные __________________________________________________________________________ Menarche ________. Цикл: регулярный - да, нет, по сколько ______, через _____ Умеренность - да, нет. Обильность – да, нет, Болезненность - да, нет. Начало половой жизни ________. Число половых партнеров _________ В браке да, нет. ИППП – были, не были. Какие ________________________. Сколько раз _______ Чем лечили __________________________________________________________________________ .____________________________________________________________________________________ .______________________________________________________________________________________ .Другое_______________________________________________________________________________ .______________________________________________________________________________________ .______________________________________________________________________________________ .______________________________________________________________________________________ Соматический анамнез. Детские инфекции ___________________________________________________________________ Простудные заболевания _______________________________ Как часто ______________________ Экстрагенит. Пат._____________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________ Аллергии____________________ Операции ______________________Наследственность_________ Объективное исследование Влагалищное исследование Длина ш/матки______, эрозия шейки ____________ размеры матки________, положение матки _____________, своды _____________, спаечный процесс_______, еще _________________________________________________________________ Придатки справа _____________________________________________________________________ Придатки слева ______________________________________________________________________. Характер выделений _________________________________________________________________ УЗИ: матка______х_____х_____, эндометрий ____________Закл:______________________________ 262 ______________________________________________________________________________________. Температура тела ___________ Молочные железы_____________________________________________________________________ Лабораторные данные: ОАК: Эр____Hb_____ЦП____Лей_____С____П____Б_____Э____М_____Тромбоциты__________ ОАМ: Пл ________ Бел ______Лей______Эр_____. Б/х: Бел______Бил______Глю______Креат______ Коагулограмма: Сверт_______Кровоточ_______Фибрг____ПТИ____АЧТВ _______МНО__________ Мазок из влагалища: Лейкоц____, Эпит_____, Флора_____, Gn____, Trih____ Степень чистоты_____ Протокол операции. Вид __________________________________________________________________ Наркоз ___________________. Длительность ____________ ._________________________________________________________________________________________ ._________________________________________________________________________________________ ._________________________________________________________________________________________ Диагноз после операции __________________________________________________________________ ._________________________________________________________________________________________ Осложнения после операции _________________________________________________________________ ._________________________________________________________________________________________ Гистология___________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ Бакпосев из цервикального канала Мазок на специнфекции (ПИФ) ПЦР на специнфекции ИФА на специнфекции Иммунограмма TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 263 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 CASP-3 альфа IDO HPDG COX-2 264 Приложение 3 АНКЕТА ГСЗ Паспортная часть. №________. № истории родов ________ Дата поступления_______ Койко-день. ___________ Ф.И.О .________________________________. Возр. ______ Отделение _________________ Адрес ________________________________________________ Тел ____________________ Профессия __________________________ Образование _______________________________ Акушерско-гинекологический анамнез. Котор бер._____ Котор. роды ____ I роды в ______году, мальчик/девочка, вес___________, Осложн. ___________________________ II роды в ______году, мальчик/девочка, вес___________, Осложн. ___________________________ III роды в ______году, мальчик/девочка, вес___________, Осложн. ___________________________ IV роды в ______году, мальчик/девочка, вес___________, Осложн. ___________________________ Абор ____ Вык _____ Внем ____ Замер_____ Осложнения абортов_____________________________ Причина выкидыша___________________ Гинекол. Пат. __________________________________________________________________________ Соматический анамнез. Экстрагенит. Пат._____________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________ Аллергии____________________ Операции ______________________Наследственность_________ Течение данной беременности Патология 1-ой пол бер. _________________________________________________________________ Патология 2-ой пол бер. ________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________ Прибавка веса ________ УЗИ(1): Срок беремен._______ ________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________. УЗИ (2): Срок беремен._______ _______________________________________________________________________________________ УЗИ (3): Срок беремен._______ ________________________________ УЗИ на доношенном сроке: ______________________________________________________ Допплер _______________________________________________________________________________ 265 _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________. ЗППП ________________________________________________________________________________ Лечение (срок беременности и препараты)_________________________________________________ Данные обследования Вес _______ Рост ________ Таз: Sp _____ Kr ______ Tr _______ Cd _______ ОЖ__________ВДМ ____________________ Гр. Крови____Rh______ Роды Через естественные родовые пути Срок ______ Длительность родов: общая___________ 1_________2_________3________ Безводный период______________ Количество вод_________________ Цвет вод________________________ Аномалии родовой деятельности______________ Лечение в родах(1)________________________ ._______________________________________ ________________________________________ Кровопотеря __________ Операции_______________________________ Кесарево сечение Экстренное/плановое В родах_____________час. Длительность операции: ____________ Извлечение на ___________мин. Безводный период__________________ Количество вод_________________ Цвет вод________________________ Лечение в родах(если была в родах)___________ __________________________________________ Кровопотеря _________ Диагноз после родов Послеродовый период. Осложнения_____________________________________________________________________ Проводимая терапия________________________________________________________________ Антибиотики_______________________________________________________________________ УЗИ после родов: матка______х_____х_____, полость ____________Закл:___________________ Температура тела после родов___________1 сут_______3 сут________4 сут__________5 сут_______ Молочные железы_____________Лактация_________Послеоперационный шов__________________ Выписана/переведена на ______________________сутки Ребенок Оценка по Апгар_______________ доношенный/недоношенный живой/мертвый пол______Вес______Рост_____Голова______Грудь_____ Hb_____Бил_______ Пороки ______________________________Травма_______________________ ст.тяжести___________ Крик___________________Тонус__________________________Рефлексы________________________ ИВЛ_________, Длительность ___________________сутки. Диагноз:__________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ Исход: ____________________________ 266 Послеродовый период. Осложнения_____________________________________________________________________ Проводимая терапия________________________________________________________________ Антибиотики_______________________________________________________________________ УЗИ после родов: матка______х_____х_____, полость ____________Закл:___________________ Температура тела после родов___________1 сут_______3 сут________4 сут__________5 сут_______ Молочные железы_____________Лактация_________Послеоперационный шов__________________ Выписана/переведена на ______________________сутки Лабораторные данные: Наименование анализа Общий анализ крови Эр Hb Leu п/я с/я лим моно Tr Общий анализ мочи Белок Leu Эп Коагулограмма МНО Фибриноген АЧТВ ТВ Биохимический анализ крови До родов После родов Мазок на флору Бакпосев из цервикального канала Мазок на специнфекции (ПИФ) ИФА на специнфекции ИФА на половые гормоны Плацентарный лактоген Эстриол Прогестерон TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 267 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 NF-kB MyD88 Гистологическое исследование последа ХХХХХХХХХХХХХ 268 Приложение 4. Частота самопроизвольного прерывания беременности на сроке до 22 нед. среди всех беременных, состоявших на учете в женской консультации в 2010-2012 гг., критерий Стьюдента. № п/п Срок самопроизвольного прерывания беременности 2010 2011 2012 2013 Р 2010 - 2011 Р 2011-2012 Р 2010-2012 Р 2012-2013 1. До 12 недель, % 5,50±0,17 5,18±0,17 6,85±0,18 7,10±0,18 0,08 0,008 0,002 0,01 2. 12-21 неделя, % 0,79±0,07 0,83±0,07 1,00±0,07 1,1±0,08 0,31 0,01 0,005 0,04 269 Приложение 5. Данные бактериологического исследования у пациенток с послеродовым эндометритом и в контроле, критерий Стьюдента. № Наименование п/п Staphylococcus, %, изних 1. Staphylococcusaureus, % Беременность высокой степени инфекционного риска (n=85) Развившийся Нормальный впоследствии послеродовый эндометрит период (IV), n=64 (III), n=21 45,31±6,22 80,95±8,57* 19,05±8,57 7,81±3,35 61,90±10,60* 4,76±4,65 37,50±6,05 6,25±3,03 2. Staphylococcusepidermidis, % Streptococcus, % 3. 4. Enterococcus, % Acinetobacter, % 9,52±6,41 9,52±6,41 14,06±4,35 4,69±2,64 5. Escherichia coli, % 23,81±9,29 20,31±5,03 6. Corynebacterium, % 4,76±4,65 9,38±3,64 7. Klebsiella, % 33,33±10,29* 1,56±1,55 8. Pseudomonas aeruginosa, % - - 9. Proteus, % 14,29±7,64 3,13±2,17 23,81±9,29 18,75±4,88 - 1,56±1,55 12. Citrobacter, % 13. Clostridium, % 14. Peptococcus, % 9,52±6,41 9,52±6,41 9,52±6,41 12,50±4,13 23,44±5,30 15. Bacteroides, % 16. Candida, % 14,29±7,64 14,29±7,64 21,88±5,17 14,06±4,35 10. Enterobactercloacae, % 11. Propionobacter, % *- p<0,05 270 Приложение 6. Особенности микробиоценоза половых путей на поздних сроках беременности на фоне примененКП, содержащим лиофилизат ацидофильных лактобактерий и эстриол. Ешь 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Наименование Lactobacillus,% Bifidobacterium, % Staphylococcus aureus, % Staphylococcus epidermidis, % Streptococcus, % Enterococcus, % Acinetobacter, % Escherichia coli, % 9. Corynebacterium, % 10. Klebsiella, % 11. Proteus, % 12. Enterobacter cloacae, % 13. Clostridium, % 14. Peptococcus, % 15. Bacteroides, % 16. Candida, % * - p<0,05 Беременность высокой степени инфекционного риска (n=34) До использования После использования КП КП (P±p%) (P±p%) 88,2±5,5 91,2±4,9 58,8±8,44 67,7±8,0 17,7±6,5 14,7±6,1 61,8±8,3* 38,2±8,3 2,9±2,9 0,00±0,00 20,6±6,9 5,9±4,0 11,8±5,5 2,9±2,9 14,7±6,1 17,7±6,5 2,9±2,9 2,9±2,9 2,9±2,9 0,00±0,00 0,00±0,00 2,9±2,9 5,9±4,0 2,9±2,9 11,8±5,5* 2,9±2,9 5,9±4,0 0,00±0,00 2,9±2,9 0,00±0,00 0,00±0,00 2,9±2,9 271
